Revista avft 4 2010 by felipe espino

Contenido

La regulación del transportador de colina de alta afinidad dependiente de AMPc/PKA no es mediada por dopamina en neuronas de retina cAMP/PKA - dependent regulation of the high affinity choline transporter is not mediated by dopamine in retinal neurons José L. Garay; William J. López H.; Elis A. Mosquera F.; José D. Subiela H.; Nelson E. Loureiro D S.

Modificaciones en los marcadores enzimáticos hepáticos promovidos por veneno de ejemplares jóvenes de crotalus DURISSUS CUMANENSIS Modifications in the enzymatic liver markers promoted by the venom of joung cotralus DURISSUS CUMANENSIS José Rugby Noriega Alvarado, Roberth Gabriel Marín Barico, José Antonio Mendoza, Carmen del Rosario Álvarez Yépez, Alexander Antonio Mogollón Saldivia, Mirleny del Carmen Pérez-Urrieta, Yaritza Salas.

Índice de autores 2010

Institución publicadora Sociedad Venezolana de Farmacología y de Farmacología Clínica y Terapéutica Dirección: Escuela de Medicina José María Vargas, Cátedra de Farmacología, piso 3, Esquina Pirineos, San José. Caracas - Venezuela. Telfs.:(0212)5619871 - (0414)1361811 (0414) 3805405 Fax: (0212)3214385 www.revistaavft.com e-mail: revista.avft@gmail.com Objetivos de la revista Promover la productividad científica tanto de la comunidad nacional como internacional en los campos de farmacología en general, fisiología, fisiopatología e inmunología; la divulgación de artículos científicos y tecnológicos originales y artículos de revisión por invitación del Comité Editorial. Áreas de interés de la revista Archivos Venezolanos de Farmacología y Terapéutica pública artículos originales y de revisión, dedicados a los estudios de las drogas en el hombre así como de algunos estudios relacionados con las drogas en los animales, las evaluaciones de drogas nuevas, métodos de investigación, efectos tóxicos en los animales y en el hombre. Igualmente, publica trabajos originales y de revisión en el área de la Farmacología Clínica y Terapéutica, Fisiología y Fisiopatología. Historia de la revista Archivos Venezolanos de Farmacología y Terapéutica nació en 1982 como una necesidad de tener en Venezuela y Latinoamérica de una revista científica que publique la investigación farmacológica básica y clínica de nuestro país y América Latina, así como la investigación en otras ciencias básicas como Bioquímica, Fisiología, Fisiopatología e Inmunología. Simultáneamente con su creación, también se fundo la Sociedad Interamericana de Farmacología Clínica y Terapéutica y la Sociedad Venezolana de Farmacología y Terapéutica, inmediatamente AVFT se convirtió en el Órgano Oficial de las Sociedades Venezolanas de Farmacología y de Farmacología Clínica y Terapéutica. Se solicito la indización en el Index Médico Latinoamericano y luego AVFT fue seleccionada en los Índices Extramed de la Organización Mundial de la Salud y en el Latinoamericano de Revistas Científicas de la Universidad Autónoma de México. Desde hace una década el FONACIT y el CDCH la apoyan económicamente y la han seleccionada en el Núcleo de Revistas del FONACIT. El FONACIT considera a AVFT como una de las revistas científicas venezolanas arbitradas con contenido más original y de mayor interés. Algunos investigadores connotados como Marcelo Alfonzo, ltala Lippo de Becemberg, Alicia Ponte Sucre, Anita Israel, Luigi Cubeddu, etc. han escogido a AVFT para publicar sus hallazgos básicos

y clínicos por su arbitraje, difusión e indización. Actualmente se ha remozado el Comité Editorial y los formatos adecuándolos a las exigencias de índices internacionales como el SCI, Excerpta Medica y Current Contents. A partir de 2002 AVFT se publicará cuatrimestralmente dado la mayor demanda científica. AVFT tradicionalmente ha publicado las reuniones anuales de Farmacología, ASOVAC, Facultad de Farmacia, del Instituto de Medicina Experimental y de Congresos de Farmacología organizados en nuestro país. Periodicidad Archivos Venezolanos de Farmacología y Terapéutica es una publicación semestral con 2 números al año. Título abreviado: AVFT INDIZADA EN: 1) LIVECS (Literatura Venezolana de Ciencias de la Salud) 2) LILACS (Literatura Latinoamericana y del Caribe en Ciencias de la Salud) 3) Índice de Revistas Latinoamericanas en Ciencias (Universidad Nacional Autónoma de México) 4) BIREME 5) LATINDEX 6) SCIELO 7) REDALYC Copyright Sociedad Venezolana de Farmacología y de Farmacología Clínica y Terapéutica. Derechos reservados. Queda prohibida la reproducción total o parcial de todo el material contenido en la revista sin el consentimiento por escrito del editor en jefe. Patrocinadores Esta revista se financia gracias a los aportes que ofrecen el Fondo Nacional de Ciencia y Tecnología (FONACIT), y Consejo de Desarrollo Científico y Humanístico de la UCV (CDCH). Editor en Jefe Dr. Manuel Velasco Editor Ejecutivo Dr. Freddy Contreras Editor Emeritus Dr. Augusto Campos Editores Asociados Dr. Alfonzo Marcelo Dr. Bermúdez Valmore Dr. Cano Clímaco Dr. Cubeddu Luigi Dr. Magaldi Luís Dra. Mathison Yaira Lic. Ortiz Holger Dra. Salazar Mariselis Dra. Sosa Amparo Dra. Stern de Israel, Anita Comité Editorial Abadi Isaac (Venezuela) Acquatella Harry (Venezuela) Alcocer Luís (Méjico) Alfieri Anita (Venezuela) Arciniegas Enrique (Venezuela)

Bermúdez Fernando (Venezuela) Bianco Nicolás (Venezuela) Bravo Laura (Cuba) Bonilla Jairo (Colombia) Cabezas Gloria A. (Venezuela) Carmona Oswaldo (Venezuela) Carvajal Ana (Venezuela) Correa Maria Fernanda (Venezuela) Crippa Giuseppe (Italia) De Santis Juan (Venezuela) Di Prisco María C. (Venezuela) Dujovne Carlos A. (Estados Unidos) Fouillioux Christian (Venezuela) Fuenmayor Luis (Venezuela) Gómez Héctor J. (Estados Unidos) Gómez Juanita (Venezuela) Hernández Pieretti Otto (Venezuela) Israili Zafar (Estados Unidos) Lares Mary (Venezuela) Lechin Fuad (Venezuela) Levenson Jaime (Francia) Lynch Neil (Australia) Manfredi Roberto (Italia) Malka Samuel (Venezuela) Martínez Antonio Dalessandro (Venezuela) Mc Lean A.E.M. (Inglaterra) McNay John L. (Estados Unidos) Mederos Lilian (Cuba) Mejías Enrique J. (Venezuela) Meza Carolina (Venezuela) Moncada Salvador (Reino Unido) Moreno Alejandra (Mexico) Naranjo Claudio A. (Canadá) Ponte-Sucre Alicia (Venezuela) Prichard B.N.C. (Inglaterra) Ram Venkata (Estados Unidos) Ramos Alexis (Venezuela) Rivera María (Venezuela) Rodríguez R. Miguel A. (Venezuela) Salazar Margarita (Venezuela) Souki Aida (Venezuela) Urbina Adalberto (Venezuela)

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Instrucciones a los Autores

Alcance y política editorial La Revista Archivos Venezolanos de Farmacología y Terapéutica es una publicación biomédica periódica, arbitrada, de aparición semestral, destinada a promover la productividad científica de la comunidad nacional e internacional en todas las áreas de Ciencias de la Salud y Educación en Salud; la divulgación de artículos científicos y tecnológicos originales y artículos de revisión por invitación del Cómité Editorial. Está basada en la existencia de un Comité de Redacción, consistente en un Editor-Director, Editores asociados principales y Comisión Editorial y Redactora. Los manuscritos que publica pueden ser de autores nacionales o extranjeros, residentes o no en Venezuela, en castellano (con resumen en idioma inglés y castellano) y deben ser remitidos a la Redacción de la Revista. Los manuscritos deben ser trabajos inéditos. Su aceptación por el comité de redacción implica que no ha sido publicado ni está en proceso de publicación en otra revista, en forma parcial o total. El manuscrito debe ir acompañado de una carta solicitud firmada por el autor principal y el resto de los autores responsables del mismo. En caso de ser aceptado, el Comité de Redacción no se hace responsable con el contenido expresado en el trabajo publicado. Aquellos que no se acojan a las condiciones indicadas, que sean rechazados por lo menos por dos árbitros que dictaminen sobre su calidad y contenido, y que no cumplan con las instrucciones a los autores señalados en otro aparte, no serán publicados y devueltos en consecuencia a los autores.

a. Página del título.

Forma de preparación de los manuscritos Para la publicación de trabajos científicos en la Revista Archivos Venezolanos de Farmacología y Terapéutica, los mismos estarán de acuerdo con los requisitos originales para su publicación en Revistas Biomédicas, según el Comité Internacional de Editores de Revistas Biomédicas (Annal of Internal Medicine 2006:126(1):36-47). Además, los editores asumen que los autores de los artículos conocen y han aplicado en sus estudios la ética de experimentación (Declaración de Helsinki). A tales efectos, los manuscritos deben seguir las instrucciones siguientes:

c. El nombre del departamento(s) o instituciones a quienes se les atribuye el trabajo.

1. Mecanografiar original a doble espacio en idioma español, papel Bond blanco, 216 x 279 mm (tamaño carta) con márgenes por lo menos de 25 mm, en una sola cara del papel. Usar doble espacio en todo el original. Su longitud no debe exceder las 10 páginas, excluyendo el espacio destinado a figuras y leyendas (4-5) y tablas (4-5). 2. Cada uno de los componentes del original deberán comenzar en página aparte, en la secuencia siguiente:

b. Resumen y palabras claves. Se recomienda a los autores de los artículos al colocar las palabras clave utilicen el DECS (Descriptores en Ciencias de la Salud) que puede ser consultado en la siguiente dirección: http.//decs. bvs.br c. Texto. d. Agradecimientos. e. Referencias. f. Tablas: cada una de las tablas en páginas apartes, completas, con título y llamadas al pie de la tabla. g. Para la leyenda de las ilustraciones: use una hoja de papel distinta para comenzar cada sección. Enumere las páginas correlativamente empezando por el título. El número de la página deberá colocarse en el ángulo superior izquierdo de la misma. 3. La página del título deberá contener: 3.1. Título del artículo, conciso pero informativo. a. Corto encabezamiento de página, no mayor de cuarenta caracteres (contando letras y espacios) como pie de página, en la página del titulo con su respectiva identificación. b. Primer nombre de pila, segundo nombre de pila y apellido (con una llamada para identificar al pie de página el más alto grado académico que ostenta y lugar actual donde desempeña sus tareas el(los) autores.

d. Nombre y dirección electrónica del autor a quien se le puede solicitar separatas o aclaratorias en relación con el manuscrito. e. La fuente que ha permitido auspiciar con ayuda económica: equipos, medicamentos o todo el conjunto. f. Debe colocarse la fecha en la cual fue consignado el manuscrito para la publicación. 4. La segunda página contiene un resumen en español y su versión en inglés, cada uno de los cuales tendrá un máximo de 150 palabras. En ambos textos se condensan: propósitos de la investigación, estudio, método empleado, resultados (datos específicos, significados estadísticos si fuese posible) y conclusiones. Favor hacer énfasis en los aspectos nuevos e importantes del estudio o de las observaciones. Inmediatamente después del resumen, proporcionar o identificar como tales: 3-10 palabras claves o frases cortas que ayuden a los indexadores

en la construcción de índices cruzados de su artículo y que puedan publicarse con el resumen, utilice los términos del encabezamiento temático (Medical Subject Heading) del Index Medicus, cuando sea posible. 5. En cuanto al texto, generalmente debe dividirse en: introducción, materiales y método, resultados y discusión. 6. Agradecimientos, sólo a las personas que han hecho contribuciones reales al estudio. 7. Las citas de los trabajos consultados seguirán los requisitos de uniformidad para manuscritos presentados a revistas Biomédicas, versión publicada en: Annal of Internal Medicine 2006; 126(1): 36-47. www.icmje.com. No se aceptarán trabajos que no se ajusten a las normas. 8. Tablas: En hoja aparte cada tabla, mecanografiada a doble espacio; no presentar tablas fotográficas; enumere las tablas correlativamente y proporcione un título breve para cada una; dé a cada columna un encabezamiento corto o abreviado; coloque material explicativo en notas al pie de la tabla y no en el encabezamiento; explique en notas al pie de la tabla las abreviaturas no estandarizadas usadas en cada tabla; identifique claramente las medidas estadísticas de las variables tales como desviación estándar y error estándar de la medida; no use líneas horizontales ni verticales: citar cada tabla en orden correlativo dentro del texto; citar la fuente de información al pie de la tabla si ésta no es original. 9. Ilustraciones: Deben ser de buena calidad; entregarlas separadas; las fotos, en papel brillante con fondo blanco, generalmente 9 x 12 cm. Las fotografías de especímenes anatómicos, o las de lesiones o de personas, deberán tener suficiente nitidez como para identificar claramente todos los detalles importantes. En caso de tratarse de fotos en colores, los gastos de su impresión correrán a cargo del autore(s) del trabajo. Lo mismo sucederá con las figuras que superen el número de cuatro. Todas las figuras deberán llevar un rótulo engomado en el reverso y en la parte superior de la ilustración indicando número de la figura, apellidos y nombres de los autores. No escribir en la parte posterior de la figura. Si usa fotografía de personas, trate de que ésta no sea identificable o acompañarla de autorización escrita de la misma. Las leyendas de las ilustraciones deben ser mecanografiadas a doble espacio en página aparte y usar el número que corresponde a cada ilustración. Cuando se usen símbolos y fechas, números o letras para identificar partes en las ilustraciones, identifíquelas y explíquelas claramente cada una en la leyenda. Si se trata de microfotografía, explique la escala e identifique el método de coloración. 10. Envíe un original y dos copias impresas en un sobre de papel grueso, incluyendo copias fotográficas y figuras entre cartones para evitar que se doblen, simultáneamente envíe una versión electrónica en CD o a través del e-mail: revista. avft@gmail.com, indicando el programa de archivo. Las fotografías deben venir en sobre aparte. Los originales deben acompañarse de una carta de presentación del autor en la que se responsabiliza de la correspondencia en relación a los originales. En ella debe declarar que conoce los originales y han sido aprobados por todos los autores; el tipo de artí-

culo presentado, información sobre la no publicación anterior en otra revista, congresos donde ha sido presentado y si se ha usado como trabajo de ascenso. Acuerdo a asumir los costos de su impresión en caso de fotos a color, autorización para reproducir el material ya publicado o ilustraciones que identifiquen a personas. 11. Los artículos a publicarse, pueden ser: originales, revisiones, casos clínicos, y cartas al editor. 12. Cuando se refiere a originales, queda entendido que no se enviará artículo sobre un trabajo que haya sido publicado o que haya sido aceptado para su publicación en alguna parte. 13. Todos los trabajos serán consultados por lo menos por dos árbitros en la especialidad respectiva. 14. La Revista Archivos Venezolanos de Farmacología y Terapéutica, no se hace solidaria con las opiniones personales expresadas por los autores en sus trabajos, ni se responsabiliza por el estado en el que está redactado cada texto. 15. Todos los aspectos no previstos por el presente reglamento serán resueltos por el Comité Editorial de la Revista. 16. La revista apoya las políticas para registro de ensayos clínicos de la Organización Mundial de la Salud (OMS) y del International Committee of Medical Journall Editors (ICMJE), reconociendo la importancia de esas iniciativas pera el registro y divulgación internacional de Información sobre estudios clínicos, en acceso abierto. En consecuencia, solamente se aceptarán para publicación, a partir de 2007, los artículos de investigaciones clínicas que hayan recibido un número de identificación en uno de los Registros de Ensayo Clínicos validados por los criterios establecidos por OMS e ICMJE, cuyas direcciones están disponibles en el sitio del ICMJE. El número de Identificación se deberá registrar al final del resumen.

Editorial Archivos Venezolanos de Farmacología y Terapéutica publica su cuarto y último número del año 2010. Este año se aumento el número de ediciones a cuatro porque hubo mayor cantidad de manuscritos que llegaron a nuestra editorial. Cada día AVFT es seleccionada como una revista de gran prestigio entre los científicos latinoamericanos y del resto del mundo; nos llegan manuscritos de excelente calidad de Italia, México, Cuba, Argentina, etc y de nuestro país manuscritos de ciencias básicas lo cual nos llena de enorme orgullo. Redalyc ha renovado su indexación a AVFT y FONACIT califico nuestra revista como la mejor revista biomédica del país. Por ello hemos decidido ampliar el número de ediciones a trimestrales para dar mayor alcance a nuestra revista.

Dr. Manuel Velasco Editor en Jefe

Efecto del Albendazol en ratas Long Evans gestantes e infectadas con T. spiralis Albendazol effect in Long Evans Rats pregnant and infected with T. spiralis Chávez Guajardo Elsa Gabriela.1, Morales Vallarta Mario R.1, Saldivar Elías Sergio J.2, Reveles Hernández R. Gabriela.2. Muñoz E. José Jesús,3 Moreno García María Alejandra.2 1 Facultad Ciencias Biológicas Universidad Autónoma de Nuevo León; 2U. A. Biología Experimental. 3U. A. Odontología Universidad Autónoma de Zacatecas. e-mail elsagaby.chg@gmail.com

Aceptado: 15/09/2010

Resumen

Abstract

El Albendazol es el antihelmíntico de primera elección para varias parasitosis, entre ellas la Trichinellosis, sin embargo, el tiempo de tratamiento debe ser por periodos prolongados. El objetivo del trabajo fue determinar el efecto de este medicamento sobre ratas Long Evans gestantes e infectadas con T. spiralis. Se sincronizaron las ratas para gestarlas e infectarlas, el tratamiento fue de uno a catorce días, se utilizó la técnica de Hematoxilina-Eosina para evaluar el efecto sobre el hígado y el aparato reproductor, se determino el número de crías por tratamiento y las características de las crías obtenidas, los resultados indican una degeneración de los tejidos conforme aumenta el tiempo de tratamiento además se observa que el numero de crías es afectado directamente al aumentar el tiempo de tratamiento.

The Albendazol is the antihelmintic of first election for several parasitism, among them trichinellosis, nevertheless, the time of treatment must be per prolonged periods. The aim of this work was to determine the effect of this medicine on Long rats Evans pregnant and infected with T. spiralis. We synchronize the rats to develop them and to infect them, the treatment went of one to fourteen days, used the Hematoxilina-Eosin technique to verify the effect on the liver and the reproductive apparatus and verified the number of young for each treatment and if correspondence between the obtained characteristics of the reproductive apparatus and young existed, the results indicate a degeneration of weaves as increases the time of treatment in addition is observed that I number of young is directly affected when increasing the treatment.

Archivos Venezolanos de Farmacología y Terapéutica Volumen 29, número 4, 2010

Recibido: 18/07/2010

Albendazol, Tratamiento, Gestación, T. spiralis. 60

Introducción Albendazol es un antihelmíntico de amplio espectro de administración oral, el nombre químico es metil-5-(propiltio)-2bencimidazolcarbamato, su fórmula molecular es C12H15N3O2S, su peso molecular es 265.34. Es un polvo blanco a blanquecino, soluble en dimetilsulfóxido, ácidos fuertes y bases fuertes, ligeramente soluble en metanol, cloroformo, acetato de etilo y acetonitrilo, es prácticamente insoluble en agua1. Albendazol ejerce su efecto antihelmíntico, inhibiendo la polimerización de la tubulina y por tanto, disminuye los niveles energéticos hasta que estos llegan a ser insuficientes para la sobrevivencia de los parásitos. De este modo, albendazol inicialmente inmoviliza y después causa la muerte a los helmintos susceptibles1. Ahora bien el agente causal de la enfermedad parasitaria llamada Trichinellosis es el nematodo Trichinella spiralis, este parásito afecta a una gran variedad de mamíferos princi-

palmente carnívoros, el ser humano también es susceptible de contraer la infección y la causa principal es el consumo de carne cruda o cocida de manera deficiente procedente de animales infectados con el parásito. Esta parasitosis es considerada zoonosis endémica y de distribución mundial, en México la causa principal de infección se asocia con el consumo de carne de cerdo infectada con la Larva Infectarte (LI) de T. spiralis. Zacatecas es considerado zona endémica desde 19763. La infección típicamente cursa con dolor abdominal, diarrea, fiebre, mialgias, artralgias, anorexia y edema periorbital, su intensidad suele ser leve o moderada5. Debido a la aparente baja prevalencia de esta parasitosis, a la aparente inespecificidad y escasa importancia clínica de los síntomas y signos mencionados, en un número no cuantificado de casos que se llegan a presentar, el diagnóstico erróneamente se orienta a una fiebre tifoidea o algún otro padecimiento más común; o

bien, el paciente no acude a consulta y por tanto, la infección no es diagnosticada. Prueba de ello podría ser el hecho de que muchas infecciones causadas por T. spiralis solo han podido ser detectadas en estudios post mortem. Esto sugiere que la información actual de la Trichinellosis humana no refleja la situación epidemiológica de esta enfermedad parasitaria en México6 De aquí la importancia de seguir estudiando esta parasitosis y en este caso en particular se analiza el tratamiento con un antihelmíntico de uso común como es el Albendazol ha diferentes tiempos de tratamiento, hasta el momento considerado uno de los más efectivos contra la parasitosis, sin embargo con efectos adversos para la madre y el producto o cría hasta ahora no conocidos en su totalidad. Consideramos analizar los efectos que el tratamiento pueda causar, debido a los períodos de tiempo de tratamiento y concentración del antihelmíntico hasta el momento recomendados pero que a la vez los daños orgánicos que ocurren desconocidos. Material y métodos

Técnica de micronúcleos para verificar si existen alteraciones genotípicas, se realizó la técnica de hematoxilina-eosina para observar tejido de hígado y aparato reproductor en las ratas adultas. Para verificar la Infección y la efectividad del tratamiento en la madre se aplicaron las técnicas directas de digestión artificial para evaluar carga parasitaria y observación directa al microscopio y la técnica indirecta de MIDD. Técnicas empleadas: Para reproducir el ciclo biológico de T. spiralis: La fuente de LI para las diferentes pruebas en el presente estudio fueron a partir de la cepa que se ha conservando en diferentes modelos experimentales en el Bioterio de la Unidad Académica de Biología Experimental, desde el primer brote de Trichinellosis reportado en el Estado de Zacatecas, en Laguna del Carretero, en el municipio de Villanueva en 19767. Los animales utilizados tanto para preparar el inóculo, así como los empleados para experimentación fueron proporcionados por el Bioterio de la misma institución, la cual pertenece a la Universidad Autónoma de Zacatecas México.

Del modelo experimental utilizado. 90 Ratas de dos meses y medio de edad de la cepa Long Evans. Los animales se mantuvieron en condiciones constantes de temperatura y luz, con acceso libre a alimento y agua dentro del Bioterio de la Unidad Académica de Biología Experimental (UABE) de la UAZ, fueron divididas en cuatro grupos de los cuales tres fueron de diez animales y uno de 50 animales. Para sincronizar a los animales a gestación las ratas hembras en etapa de estro o pro-estro fueron cruzadas con un macho sano. Se realizaron frotis vaginales para la detección del estro y el posible día de la monta de acuerdo a la metodología propuesta por López en 2002. 61

La infección (500 LI de T. Spiralis vía oral) de los animales también fue sincronizada con la gestación y los tratamientos. Grupo 1 Al termino de la gestación se evaluó el número de crías obtenidas y características físicas, técnicas directas (toma de muestra de tejido, hígado y aparato reproductor) e indirectas (estudio inmunológico) Grupo 2 Hembras adultas se sacrificaron a las 4 semanas para evaluación de carga parasitaria y respuesta inmune, metodología igual al grupo uno por medio de las técnicas directas (CP y DA) e indirectas (MIDD). Grupo 3 Hembras gestantes e infectadas. Se evaluó el número de crías y sus características físicas así mismo se aplicaron técnicas directas e indirectas, se tomo tejido de hígado y aparato reproductor para realizar estudio histológico mediante la técnica de H-E. Grupo 4 Hembras gestantes, infectadas y tratadas (TX) con el medicamento por 1, 3, 5, 7, 10, 14 días fueron sacrificadas a los 30 días después de cada tratamiento se verificaron las características fenotípicas de las crías obtenidas y se realizó

Se obtuvo carne infectada de los músculos de ratas infectadas, posteriormente se analizó la carga parasitaria mediante la técnica de compresión en placa, se llevó a cabo el conteo de larvas para así obtener el tamaño de muestra (en peso) con el que se infectó al modelo de experimentación. Para verificar la infección (presencia del parásito) se utilizaron las siguientes técnicas: Se obtuvieron muestras de tejido del modelo experimental y se aplicaron las siguientes técnicas: Técnica de compresión en placa (CP). Al sacrificio del modelo experimental (ratas Long Evans) se obtuvo la carne de los tejidos, se realizó una mezcla homogénea de los tejidos de diafragma, macetero, lengua, pierna, se observó 0.5 g de la muestra, se colocó en una laminilla de vidrio con otra laminilla se comprimió, se observó al microscopio de luz con objetivo 10X8. Verificando así la presencia o ausencia de LI en músculo estriado. Técnica de digestión artificial (DA). El proceso se lleva a cabo a 37º C por 24 horas según el método descrito por Del Río y colaboradores en 1986 con algunas modificaciones, donde se colocaron 60 g de tejido infectado triturado, en un tamiz de tul, en forma de saco; suspendido en una solución al 0.03% de pepsina (SIGMA) (10,000 U) y HCl (ANALYTYKA) al 37% (0.2M) en un litro de agua destilada en un embudo de separación; transcurridas las 24 horas se procede a separar las LI que se depositaron en el fondo del embudo de separación9. Para modelos experimentales guientes técnicas:

vivos

utilizamos

las

si-

Se obtiene suero de los animales mediante la extracción de sangre y posteriormente aplicamos las siguientes técnicas:

Micro Inmuno Difusión Doble (MIDD).

Resultados

Se elaboró un gel de bactoagar (DIFCO) al 1% en solución Buffer de fosfatos (Fosfato de Sodio Mono y Dibásico ANALYTYKA) (PBS) con 0.01 g de azida de sodio; se coloca 4.5 ml de la solución liquida (50°C) sobre una laminilla de vidrio, una vez en forma sólida, se procedió a formar la roseta, a una distancia de 0.5 cm. entre pozo y pozo, se colocó el antígeno soluble total en una cantidad de 10 μL (9 μg ) en el centro y en torno a éste los sueros problema, ocupando siempre un suero control positivo y un negativo, se dejó a temperatura ambiente en cámara húmeda de 24 a 48 horas hasta la presencia de líneas de precipitación entre el suero control positivo y el antígeno10.

Grupo 1. Control gestante con el suero obtenido se realizó MIDD resultando negativa, de los frotis vaginales se observaron espermatozoides y se dio seguimiento al desarrollo de la gestación resultando partos con un promedio de 10 crías con un promedio en peso de 5.2 gramos y longitud de 6.4 cm. (Figura 1). Al sacrificio se tomó muestra de hígado el mostro su coloración marrón característica y conformación lisa y cuernos uterinos y el análisis macroscópico mostró características normales de ambos uterinos se encontraron irrigados, su consistencia era laxa y a la vez firme, su coloración rosada su extensión de alrededor de 2.30 cm. Figura 1

Se inicia su obtención con la digestión artificial, posterior de la obtención de las LI se someten a varios lavados con solución buffer de fosfatos (PBS), se separa el paquete larvario se adiciona nitrógeno liquido y se tritura. Una vez rotas las larvas se centrifuga, el sobrenadante obtenido contiene el antígeno soluble total (AST) de T. spiralis al cual se le realizó determinación de proteínas por el método de Bradford mismo que se usa como antígeno para las diferentes pruebas inmunológicas en el modelo experimental murino11. Para determinar el efecto del ABZ en la siguiente técnica:

las ratas se utilizó

Tinción Hematoxilina–Eosina. Se tomaron las muestras de hígado y cuernos uterinos de rata, controles y tratamiento. Se fijaron los tejidos en formol amortiguado al 10% por 24-48 horas. Posteriormente se pasaron a alcohol etílico al 70% para su procesamiento automático por aproximadamente 12 horas en dos pasos de OH al 70%, OH al 80%, OH al 96%, OH al 100% y xilol. De éste último paso se sacaron las muestras y se embebieron en parafina formando bloques de soporte para la realización de cortes histológicos de 5-8μm de espesor en un microtomo Leica Modelo 820. Los cortes se colocaron en un baño de flotación a 50°C y se levantaron en un portaobjetos para dejarse secar, desparafinarse por una hora en una estufa y pasar al proceso de tinción con la técnica Hematoxilina y Eosina según el criterio de Viloria (2000). Micronúcleos Se realizó la técnica in Vivo, se sacrificó a la rata, se le extrajo el fémur de ambas extremidades, se limpiaron con solución salina, se cortaron ambas extremidades, se extrajo la médula ósea recolectándola en un tubo cónico con suero fetal bovino (INVITROGEN) y heparina, se llevó a cabo la resuspensión del contenido, se centrifugó por diez minutos a 1500 rpm, se decantó el sobrenadante y se procedió a realizar los frotis en laminillas de vidrio previamente marcadas, se fijaron a temperatura ambiente y se tiñeron con el colorante naranja de acridina. El conteo de células se llevó a cabo con el microscopio de fluorescencia con el objetivo a 100X.

Fig. 1 A) Espermatozoides resultado del frotis vaginal, se observan con microscopio de luz X100, B) rata control sana gestante con 11 crías.

Grupo 2. Hembras infectadas con T. spiralis, al sacrificarlas se recuperó músculo y se sometió a las técnicas de compresión en placa y digestión artificial, resultando positivas. Se aplicó MIDD resultando en todos los casos líneas de precipitación lo que indica interacción Ag-Ac (Figura 2). Figura 2

Archivos Venezolanos de Farmacología y Terapéutica Volumen 29, número 4, 2010

Obtención del antígeno soluble total de T. spiralis.

62 Fig. 2 A) compresión de tejido donde se observan LI de T. spiralis observadas al microscopio de luz con el objetivo de x100.B) LI obtenidas de digestión artificial. C) MIDD donde se observa un precipitado característico de la reacción Ag-Ac.

Grupo 3. Hembras gestantes e infectadas, al detectar presencia de Espermatozoides se infectaron con T. spiralis se dio seguimiento al desarrollo de la gestación resultando un promedio de 2 crías, con un promedio en peso de 4.5 gr. y 5.2 cm. de longitud. De las características de extremidades y cabeza no se observó ninguna alteración. Grupo 4. Hembras gestantes, infectadas y tratadas con Albendazol (ABZ) se procedió de la misma forma que el grupo cuatro y 24 h después de la infección inició el tratamiento con ABZ. Se dio seguimiento al desarrollo de la gestación. Resultando: Grupo 4.1 con 1 día de Tx. ABZ. Se obtuvieron Partos con un promedio de 4 Crías con un promedio en peso de 4.8gr. y 5.3cm de longitud. 30 días posteriores a la infección se sacrificaron las madres se obtuvieron tejidos (lengua, macetero, pierna y diafragma)

resultado estas con presencia de LI de T. spiralis. Se extrajeron cuernos uterinos e hígado y se sometieron a examen macroscópico resultando con variabilidad de características morfológicas como es el caso de protuberancias. (Figura 3). Figura 3

fueron sacrificadas, se recolectaron las distintas muestras de tejidos para llevar a cabo técnicas directas, resultando negativas. También se extrajeron los cuernos uterinos observándose varias anomalías morfológicas en análisis macroscópico (figura 6). Figura 6

Fig. 3. A) parte interna de cuerno uterino donde se observan protuberancias que corresponde a posibles productos no viables. B) LI en músculo de rata con 1dia de Tx con ABZ observadas al microscopio de luz a x100.

Grupo 4.2 con 3 días de Tx ABZ. Se obtuvo como resultado de los partos un promedio de 2 crías con un promedio en peso 6.2 gr. y longitud 6.7cm. al seguimiento de los productos se observaron alteraciones fenotípicas de cabeza y extremidades solo en algunas de las crías que es importante mencionar que a los primeros días de desarrollo no se identificaron (Figura 4). Se sacrificaron las ratas se analizaron tejidos (lengua, diafragma, masetero y pierna) por técnicas directas CP y DA resultando ambas negativas a la presencia de LI de T. spiralis; se extrajeron los cuernos uterinos e hígado en los cuales por análisis macroscópico se observaron anomalías en el tejido de los cuernos uterinos (figura 5).

En el grupo 4.5 de 10 días de Tx no se obtuvieron crías, sin embargo en el grupo 4.6 con 14 días de Tx se obtuvieron crías pero todas muertas, con distintas alteraciones morfológicas, de igual manera se extrajeron los cuernos uterinos observándose también con alteraciones (figura 7). Figura 7

Figura 4

63 Fig.4 A) crías del grupo con 3 días de Tx de ABZ. B) cría del grupo con 3 días de Tx de ABZ, donde se observan alteraciones en el tamaño de cabeza y extremidades.

Figura 5

Fig. 5 A) parte interna de un extremo del cuerno uterino con algunos gránulos microscopio estereoscopio. En B) observamos cuernos uterinos con poca irrigación.

Grupo 4.3 con 5 días de Tx con ABZ. No se obtuvo ninguna cría, al término del período de gestación se extrajo aparato reproductor resultando alteraciones macroscópicas diversas como lo es tamaño, irrigación y la consistencia, que era muy rígida con respecto al control. La digestión artificial y compresión en placa de los tejidos de elección de T. spiralis resultaron todos negativos. Grupo 4.4 con 7días de Tx con ABZ. Se obtuvieron partos con un promedio de 1 cría y con un promedio en peso 5.1gr y 5.2cm de longitud, las ratas donde no se obtuvieron crías

Tinción con Hematoxilina-Eosina De Hígado y aparato reproductor se obtuvieron resultados en donde observamos la alteración de ambos tejidos conforme aumenta el tiempo de tratamiento, con agrandamiento y espaciado anormal en folículos ováricos y degeneración

completa de los mismos (fig. 8); pérdida de la definición de cuernos uterinos (fig. 9); alteración en forma y tamaño en los núcleos de las láminas hepáticas (fig. 10); con degeneración del hígado con modificaciones en el citoplasma y espacio perisinusoidal (fig. 11).

Figura 10

Fig.10 A) Corte de hígado de rata sana teñido con hematoxilina eosina donde se observan láminas hepáticas de forma definida, los núcleos de tamaño normal (negro), sinusoides y espacio perisinusoidal bien definido (Azul). B) tejido de hígado de rata sometido a un día de Tx con ABZ. Se observa el ligero crecimiento de los sinusoides. C) Tejido de rata sometido a 3 días de Tx con ABZ las láminas hepáticas se observan con pérdida de forma, los núcleos de éstas se observan disminuidos de tamaño (negro) y los espacios perisinusoidales son de mayor tamaño con respecto al control. (Azul) D) Tejido de hígado de rata sometida a 5 días Tx con ABZ las láminas hepáticas carecen de contorno definido. Todos a x200)

Figura 11

Fig. 8. A) Corte de cuernos uterinos de rata sana teñida con Hematoxilina–Eosina donde se observan los folículos ováricos bien definidos (flecha) así como el espacio entre estos. B). Tejido de cuernos uterinos de una rata con un día de Tx con ABZ, se observa el agrandamiento de los folículos ováricos se empieza a notar también un espaciado anormal en el tejido (flechas). C) Tejido con tres días de tratamiento se observa la degeneración de los folículos ováricos e inicia la aparición de fibras de colágena (azul). D) Tejido ovárico de rata sometida a 5 días de tratamiento donde se nota la degeneración completa de los folículos ováricos (Flecha). Todos a x200 en microscopio óptico Leica.

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Figura 8

Figura 9 Fig.11. A) corte de hígado de rata control sano teñido con Hematoxilina- Eosina. B) Tejido de rata sometida a 7 días de Tx con ABZ. Nótese la modificación en los núcleos de las láminas hepáticas. C) Tejido de rata sometida a 10 días de Tx con ABZ se observa la degeneración de las láminas hepáticas así como sus núcleos, los sinusoides se notan de tamaño más grande. D) Tejido de rata sometida a 14 días de Tx con ABZ las láminas hepáticas ya no están definidas, los núcleos están modificados así como el citoplasma y el espacio perisinusoidal muy modificado.

Análisis de Micronúcleos Se llevó a cabo la técnica descrita en la metodología para la obtención de micronúcleos (fig. 12) con la siguiente relación (tabla I): Tabla I. micronúcleos células Polycromáticas

en crías de ratas Long Evans por mil

Rata/Tratamiento

Micronúcleos/1000 eritrocitos polycromáticos

1 control sano 2 infectado TX 1 día TX 3dias TX 7 días

2/1000 3/1000 5/1000 3/1000 6/1000

El resultado preliminar del análisis muestra de acuerdo a la proporción obtenida de micronúcleos sobre mil eritrocitos polycromáticos que el medicamento no tiene efecto mutagénico sobre los animales evaluados. También se obtuvo por esta misma técnica la siguiente proporción de células (Tabla II): Tabla II proporción de eritrocitos normocromático sobre polycromáticos Eritrocitos Rata/Tratamiento normocromático/polycromáticos 1 control sano 1000/100 2 infectado 1000/340 TX 1 día 1000/400 TX 3dias 1000/400 TX 7 días 1000/700

Conclusiones El Albendazol es efectivo contra la infección a nivel intestinal a partir de los tres días de tratamiento, la infección tiene efecto directo negativo sobre el número de crías al igual que el tratamiento. Las características fenotípicas en las crías nos indican que el uso de este medicamento produce alteraciones que no permiten la supervivencia de las crías, así como daños severos en la madre tanto en el hígado como en el aparato reproductor, por lo que no se recomienda el uso prolongado de este medicamento. Para que el estudio de micronúcleos sea significativo se deben utilizar por lo menos cuatro animales de cada grupo experimental por lo que se acepta que éste resultado es preliminar. Referencias 1. S.S.A. Catálogo de Medicamentos Genéricos Intercambiables para farmacias y público en general al 3 de agosto de 2007.

65 2. Diccionario de Especialidades Farmacéuticas. Thomson PLM ed. 2004. 3. Fragoso R, Tavizón P, Villacaña F H. 1981. Un brote de Triquinelosis en Laguna de Carretero, Zacatecas. Salud Pública. México. XXIII: 25-41. 4. Moreno G, Vacio De La T, Reveles H, Muñoz E. 2001. Epidemiologíade T. spiralis en el estado de Zacatecas, México. J Brasil Patol. 37: 25. 5. Walsh DS, Jongsakul K, Watt G. 2001. Hand rash in trichinellosis. Clin. Exp. Dermatol. 26(3): 272-3 6. De la Rosa J. L., Gómez A, Tinoco I. y Mendoza R. 2003.El síndrome Febril y su relación con la Trichinellosis Humana. Sistema nacional de vigilancia epidemiológica no.50, Vol.20. 7. López Gutiérrez Julián 2002. Detección de anticuerpos anti T. spiralis en productos de madres infectadas con Trichinella spiralis en modelo experimental murino (Rattus norvergicus Long Evans). TESIS U. A. de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Universidad Autónoma de Zacatecas pp 20-22 Zacatecas Mex. 8. Chávez Guajardo, Elsa Gabriela; Saldivar Elías, Sergio; Muñoz Escobedo, José Jesús; Moreno García, María Alejandra. 2006. Ttrichinellosis una zoonosis vigente. Revista Electrónica de Veterinaria REDVET ® Vol. VII, nº 06, Junio, Veterinaria.org ® - Comunidad Virtual

Veterinaria.org® - Veterinaria Organización S.L.® España. Mensual. Disponible en: http://www.veterinaria.org/revistas/redvet 9. Rossignol J. F. y Coulaud J. P. 1983. Evaluation de albendazole in Europa, West the Africa and Asia as a single dose anthielmintic: report 1455 patients, Summary of Clinical Trials Worlwide, p:24- 25 10. Del Río A., y Herrera D. R. 1986. Triquinosis experimental: Extracción de antígenos y procedimientos para detectar anticuerpos. Archivos de Investigación Médica. México.17:359-367. 11. Oucherlony O. Diffusion in gel method. 1958. For immunochemical analysis in Progress Allergy. ed. Kellos, P. Basel. New York. Vol5. p123. 12. Muñoz E.JJ., Saldivar E.S., Reveles H.R.G., Muñoz M.Y, Moreno G.M.A. 2007. Características de la célula nodriza en diferentes modelos experimentales infectados con Trichinella spiralis. RED VET. Vol. VIII, No. 1. 1-12. 13. Viloria Calvo Mario J. 2000. Manual de Laboratorio de Histología practica no. 2 preparación de tejidos muertos. Técnica histológica pp 11-14. Ed. MC Graw Hill

La regulación del transportador de colina de alta afinidad dependiente de AMPc/PKA no es mediada por dopamina en neuronas de retina José L. Garay* +; William J. López H.*; Elis A. Mosquera F.*; José D. Subiela H.*; Nelson E. Loureiro D S.* ++ *Laboratorio de Fisiología Celular. Unidad de Investigaciones de Fisiología. Decanato de Ciencias de la Salud. Universidad Centroccidental “Lisandro Alvarado”. Barquisimeto-Venezuela. + M.Sc ++ PhD Correspondencia: Dr. José Garay, Universidad Centroccidental “Lisandro Alvarado” Decanato de Ciencias de la Salud. Laboratorio de Fisiología Celular. Unidad de Investigaciones de Fisiología. Av. Libertador junto al HCUAMP. CP: 3002. Barquisimeto-Venezuela. Email: jgaray@ucla.edu.ve

Recibido: 09/07/2010

Aceptado: 15/09/2010

Resumen

Abstract

La actividad del transportador de colina de alta afinidad (HAChT) es considerado el paso limitante en la síntesis de acetilcolina (ACh) en el terminal colinérgico. Estudios recientes muestran que el HAChT contiene residuos de serina y treonina consensuales para la fosforilación por proteína kinasa A (PKA). Usando neuronas de retina de embrión de pollo se evaluó el efecto del segundo mensajero AMPc sobre la actividad del HAChT. El aumento de los niveles intracelulares de AMPc a través de la inhibición de la fosfodiesterasa, activación de la adenilato ciclasa o usando un análogo de AMPc resistente a la fosfodiesterasa disminuyó la actividad del HAChT entre 29 y 69%. Por otra parte, la activación de receptores de dopamina tipo-D1 aumenta los niveles de AMPc intracelular y activa PKA, sin embargo, el tratamiento con dopamina o con antagonistas de los receptores dopaminergicos D1 o D2 no induce cambios en la actividad del transportador.

The high affinity choline transporter (HAChT) activity is considered to be the rate-limiting step in acetylcholine (ACh) synthesis in the cholinergic terminal. Recent studies show that HAChT contains consensus serine and threonine residues for protein kinase A (PKA) phosphorylation. Using chick retinal neurons evaluated the effects of the second messenger cAMP on the HAChT activity. The increase of the intracellular cAMP levels through phosphodiesterase inhibition, adenilatecyclase activation or using a phosphodiesterase-resistant cAMP analog decreased HAChT activity between 29 and 69%. Moreover, the activation of dopamine D1-type receptors increase the intracellular cAMP levels and activates PKA, however, the treatment with dopamine D1 or D2 receptor antagonists does not induce changes on transporter activity. Key words: High affinity choline transporter, protein kinase A, dopamine.

Palabras claves: Transportador de colina de alta afinidad, proteína kinasa A, dopamina.

Introducción El sistema colinérgico regula una gran variedad de mecanismos fisiológicos como memoria, aprendizaje, control motor, estados emocionales y el sueño. Sin embargo, también está involucrado en alteraciones del sistema nervioso central como

la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson. Las interacciones del sistema colinérgico con otros sistemas de neurotransmisores parecen estar relacionadas con estos eventos fisiológicos y fisiopatológicos, y su estudio

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cAMP/PKA - dependent regulation of the high affinity choline transporter is not mediated by dopamine in retinal neurons

puede estar vinculado al descubrimiento de nuevos blancos farmacológicos y aplicaciones terapéuticas (Hans C. Fibiger, 1991; S. A. Talanov, 2005). La síntesis de ACh depende directamente de la disponibilidad de colina (Yammamura y Snyder, 1978; Jope, 1979; Jope y Jenden, 1980; Blustajn y Wurtman, 1983). En las neuronas colinérgicas, la colina es captada por el HAChT, el cual está localizado en los terminales presinápticos. La captación de colina a través del HAChT es dependiente de los iones Na+ y Cl-, sensible a hemicolinio-3 (HC-3), y es considerada el paso limitante en la síntesis de ACh (Okuda T. y Haga T. 2000; Okuda T., et al. 2000; Okuda T. y Haga T. 2003; Ferguson S M., y Blakely R D. 2004). El clonaje molecular del HAChT (Apparsundarams, et al. 2000, Apparsundarams, et al. 2001) permitió identificar la presencia de sitios consensuales para su fosforilación por PKA, sugiriendo la posibilidad que la fosforilación inducida por PKA esté involucrada en la regulación de la actividad del HAChT (Riveiro F M., et al., 2006). Recientemente, se ha demostrado que el HAChT es una fosfoproteína que sufre una rápida distribución entre el compartimiento endosómico y la membrana plasmática en respuesta a los cambios en la actividad de PKC y proteínas fosfatasas 1/2A (Gates J., et al. 2004). Otras evidencias confirman que el HAChT se localiza en diferentes grupos de vesículas y que su densidad en la membrana plasmática aumenta por estímulos que desencadenan la liberación de ACh (Ferguson SM., et al. 2003). Estos hallazgos han supuesto la consideración de un nuevo rol de las vesículas sinápticas en la homeostasis del neurotransmisor (Ferguson SM., et al. 2004).

En la actualidad no existen evidencias de la regulación de la dopamina sobre el terminal colinérgico, sin embargo, la dopamina es capaz de activar la adenilato ciclasa a través de los receptores dopaminérgicos tipo-D1 y de inhibirla a través de los receptores tipo-D2 en retina de embrión de pollo a partir del séptimo día del periodo embrionario (E7) (De Mello F G. 1978; DeMello Mc., et al. 1982; DeMello Mc y DeMello F G. 1985; Marques V A L y DeMello F G. 1990; Guimaraes M Z., et al. 2001). En el presente trabajo, se utilizaron cultivos celulares de retina de embrión de pollo (tipo monocapa densa) como modelo biológico ya que bajo condiciones apropiadas pueden desarrollar muchas de las propiedades de retinas intactas incluyendo la presencia de diversos marcadores colinérgicos y dopaminérgicos de relevancia para este estudio (Baugman R y Bader C. 1977; Torrão A y Britto L. 2002). En estos cultivos celulares se procedió a cuantificar la actividad del HAChT en presencia de dopamina y otras sustancias (neurotransmisores o no) para evaluar la influencia de la vía de señalización AMPc/PKA sobre la actividad del transportador.

Materiales y métodos Reactivos: [3H]-Colina (75 Ci/mmol) New England Nuclear, Boston, MA, USA. Dopamina, forskolina, IBMX (3-isobutil-1metilxanthina), pargilina, minimal essential medium (MEM), raclopride, (+)-SCH-23390 (R-(+)-7-cloro-8-hidroxi-3-metil-fenil-2,3,4,5-tetrahidro- H-3-benzazepina hidrocloruro), Sp-AMPc (Sp-adenosina 3´, 5´, hidrogenofosforotioato trietilamonio) y eserina; Sigma (St. Louis, MO, USA). Tripsina (Gibco, Paisley UK), suero fetal bovino (Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA, USA), Hemicolinio-3 (HC-3) (ICN, Aurora, USA). Cultivos celulares: Se disecaron retinas de embriones de pollo de 8 días (E8) (raza Isa Brown) bajo condiciones de esterilidad, siguiendo la metodología previamente descrita por De Mello, et al. 1990, y posteriormente sometidas a digestión enzimática con tripsina (0.05% en solución isotónica de Hanks libre de calcio y magnesio, 10 minutos, 37°C), seguidamente el tejido se centrifugó a 500g por 60 segundos, el sobrenadante se descartó y las células fueron resuspendidas en el medio de cultivo (10-15*106 células por ml de medio). La disociación final se realizó mecánicamente pipeteando la suspensión diez veces. Las células se emplataron en cápsulas de Petri de 35 mm en medio de cultivo. Los cultivos celulares se mantuvieron en incubador a 37°C al 5% CO2 y saturado de vapor de agua. El primer cambio de medio se llevó a cabo 24 horas después de la realización del cultivo, sucesivamente se procedió a sustituirlo cada 48 horas hasta el momento de su empleo en los experimentos. Captación de [3H]-Colina: Las células se incubaron en MEM con 50 μM de eserina a 37°C, el volumen final fue en todos los casos de 1 ml y la concentración final de colina en el medio es de 7,16 μM. Independientemente del tratamiento dado a las células, se procedió a añadir 0.1 μCi de [3H]-Colina por 30 minutos en presencia y en ausencia de 50 μM de HC-3. Seguidamente se procedió a lavar las placas 5 veces con 2 ml de solución isotónica de Hanks libre de calcio y magnesio con 50 μM de eserina a pH y osmolaridad fisiológicos para eliminar cualquier excedente de radiactividad extracelular. Se cosecharon las células en agua pentadestilada induciendo la ruptura de las células mediante shock osmótico y se sometieron a tres ciclos de congelamiento/descongelamiento. Finalmente el lisado celular fue centrifugado y la radioactividad en el sobrenadante se determinó mediante un contador de líquido de centelleo. La captación específica de colina se calculó como el total de colina captada menos la colina captada en presencia de HC-3. Las proteínas en el pellet fueron determinadas usando el método de Lowry, et al. 1951, y los resultados se expresaron en pmol de colina captada por miligramo de proteína por minuto (pmol/mg/min). Análisis de datos: Los resultados están expresados como la media ± error estándar, en algunos casos se presentan como porcentaje con respecto al control. Valores de 5 experimentos independientes fueron analizados mediante la prueba t

Figura 1

Resultados Efecto del aumento de AMPc intracelular sobre la actividad del HAChT: Con la finalidad de evaluar el efecto de la vía de señalización mediada por AMPc/PKA sobre la actividad del HAChT, se trataron los cultivos celulares con varios compuestos capaces de modularla. Primeramente los cultivos se trataron con 500 μM de IBMX por 10 minutos antes de medir la actividad del HAChT lo que produjo una reducción significativa de la captación de colina (Fig. 1), (aproximadamente 32%, P<0.0005). Seguidamente se procedió a evaluar la actividad del HAChT en cultivos celulares tratados con 100 μM de Sp-AMPc (análogo de AMPc resistente a la acción de la fosfodiesterasa) por 45 minutos según lo descrito previamente por Gallo G., et al. 2002, evidenciándose una reducción de la captación de colina del 29% con respecto al control (P<0.005) (Fig. 2). Finalmente los cultivos fueron tratados con 40 μM de forskolina (Lankford L., et al. 1988), y 500 μM de IBMX por 30 minutos obteniéndose un porcentaje de inhibición de 69% con respecto al control (P<0.0005) y duplicando el efecto observado anteriormente con el IBMX 500 μM (Fig. 3). Estos resultados en conjunto sugieren entonces que el incremento de los niveles intracelulares de AMPc reduce la captación de colina mediada por el HAChT en cultivos celulares de retina de embrión de pollo, hallazgo nunca antes reportado en la literatura. La dopamina no está involucrada en la regulación de la actividad del HAChT: Para determinar la influencia de la dopamina sobre la actividad del HAChT, dada su demostrada importancia como factor trófico, control del ciclo circadiano, supervivencia celular, adaptación a la luz y uno de los sistemas de neurotransmisión presentes en retina capaz de modificar los niveles intracelulares de AMPc (DeMello M.C. F., et al. 1982, Nowak JZ., et al. 1991; Nir I., et al. 2001; Doyle SE., et al. 2002; Witkosky P. 2004) los cultivos celulares fueron incubados con 100 μM de dopamina y 500 μM de IBMX por 60 minutos (Lankford K., et al. 1988; DeMello M.C. F., et al. 1982). Con la finalidad de descartar la posible degradación enzimática o la inactivación oxidativa de la dopamina, todos los experimentos se llevaron a cabo en presencia de 100 μM de pargilina y 100 μM de ácido ascórbico. La actividad del HAChT en los cultivos tratados con IBMX y dopamina se redujo significativamente con respecto al control (Fig. 4) (aproximadamente 34%, P<0.0001).

Efecto de IBMX sobre la actividad del HAChT. Los cultivos celulares fueron incubados con 100 μM de IBMX evidenciándose una disminución significativa de la actividad del HAChT. La actividad del HAChT se expresa en pmol de colina/mg proteína/min. Los datos se presentan como la media ± error estándar, valores de cinco experimentos evaluados por triplicado. (**): P<0.0005.

Efecto del análogo de Figura 2 AMPc resistente a la acción de la fosfodiesterasa sobre la actividad del HAChT. Los cultivos celulares fueron incubados con 100 μM Sp-AMPc evidenciándose una disminución significativa de la actividad del HAChT. La actividad del HAChT se expresa en pmol de colina/mg proteína/min. Los datos se presentan como la media ± error estándar, valores de cinco experimentos evaluados por triplicado. (*): P<0.005.

Figura 3

Efecto de IBMX y forskolina sobre la actividad del HAChT. Los cultivos celulares fueron incubados con 40 μM de forskolina y 500 μM de IBMX evidenciándose una disminución significativa de la actividad del HAChT. La actividad del HAChT se expresa en pmol de colina/mg proteína/min. Los datos se presentan como la media ± error estándar, valores de cinco experimentos evaluados por triplicado. (**): P<0.0005.

Efecto de la dopamina e Figura 4 IBMX sobre la actividad del HAChT. Los cultivos celulares fueron incubados con 100 μM de dopamina y 500 μM de IBMX evidenciándose una disminución significativa de la actividad del HAChT. La actividad del HAChT se expresa en pmol de colina/mg proteína/min. Los datos se presentan como la media ± error estándar, valores de cinco experimentos evaluados por triplicado. (*): P<0.0001.

Posteriormente se procedió a evaluar la posible dosis dependencia de dicho efecto, para lo cual, los cultivos celulares se trataron con concentraciones crecientes de dopamina (10, 20, 50 y 100 μM) y 500 μM de IBMX en todos los casos. Estos experimentos confirmaron el efecto inhibidor de la dopamina y el IBMX pero no revelaron respuesta dosis-dependiente para este efecto inhibidor (Fig. 5). En vista de la ausencia de

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de student o ANOVA de una vía (utilizando la prueba de Bonferroni como test post hoc). La significancia estadística se estableció con un valor de P<0.05.

dosis dependencia, dado que se ha descrito que el aumento de los niveles intracelulares de AMPc en respuesta a la dopamina ocurre de manera dosis-dependiente en retinas de embrión de pollo (DeMello M. C. F. et al. 1982), se procedió a determinar la actividad del HAChT en cultivos tratados con 100 μM de dopamina y 500 μM de IBMX en presencia de un antagonista de los receptores dopaminérgicos tipo-D1 (1 μM de (+)-SCH23390, 30 minutos) como descrito previamente por DoNascimento J., et al. 1998. Figura 5

Efecto de concentraciones crecientes de dopamina sobre la actividad del HAChT. Los cultivos celulares fueron incubados con concentraciones crecientes de dopamina en presencia de 500 μM de IBMX en todos los casos, no se encontró diferencia significativas entre los grupos (P=NS). La actividad del HAChT se expresa en pmol de colina/mg proteína/min. Los datos se presentan como la media ± error estándar, valores de cinco experimentos evaluados por triplicado.

Debido a que el bloqueo del receptor dopaminérgico tipo-D1 falló al modificar el efecto inhibitorio del tratamiento con dopamina e IBMX (ni potenciándolo ni revirtiéndolo) (Fig. 6), se procedió a evaluar el posible efecto de la dopamina endógena sobre la actividad basal del HAChT, a través de los receptores dopaminérgicos tipo-D1 y D2. Para tal propósito se midió la actividad del HAChT en cultivos tratados solamente con antagonistas dopaminérgicos D1 (1 μM de (+)-SCH23390) o D2 (2 μM de Raclopride, Guimaraes M. Z. P., et al. 2001), encontrándose que estos tratamientos no modificaron de modo alguno la actividad del transportador (Fig. 7). 69

Efecto del antagonista Figura 6 dopaminérgico D1 (+)SCH23390 sobre la actividad del HAChT. Los cultivos celulares fueron incubados con 100 μM de dopamina y 500 μM de IBMX en presencia y ausencia de 1 μM de (+)SCH23390. La captación de colina disminuyó de manera significativa en presencia de dopamina e IBMX pero este efecto inhibitorio no se modificó posterior a la incorporación de (+)-SCH23390 (P=NS). La actividad del HAChT se expresa en pmol de colina/mg proteína/min. Los datos se presentan como la media ± error estándar, valores de cinco experimentos evaluados por triplicado.

Figura 7

Efecto de la dopamina endógena sobre la actividad del HAChT. Los cultivos celulares fueron incubados con antagonistas dopaminérgicos D1 y D2 (SCH23390 y Raclopride respectivamente), no se evidenció una diferencia significativa entre los tres grupos (P=NS). La actividad del HAChT se expresa en pmol de colina/mg proteína/min. Los datos se presentan como la media ± error estándar, valores de cinco experimentos evaluados por triplicado.

En conjunto, estos resultados sugieren que la dopamina no tiene ningún efecto sobre la captación de colina mediada por el HAChT en retinas de embrión de pollo, ni es responsable de una regulación tónica o basal del mismo, siendo el efecto inhibidor evidenciado debido al tratamiento concomitante con IBMX. Discusión Varios grupos de investigadores han propuesto diversos mecanismos de regulación del transportador de colina de alta afinidad (Guyenet et al., 1973; Barker, 1976; Murrin y Kuhar, 1976; Roskoski 1978; Sherman et al., 1978; o´Regan y collier, 1981; Lowestein y Coyle, 1986; Cancela et al., 1995; Issa et al., 1996; Cooke Rylett, 1997; Ferguson et al., 2003 Gates J., et al., 2004), sin embargo, se conoce poco acerca de la regulación del transportador por parte de la vía de señalización AMPc/PKA. En el presente trabajo se demostró que el aumento de los niveles intracelulares de AMPc disminuye de manera significativa la actividad del HAChT en retinas de embrión de pollo, en contraste con los resultados contradictorios de otros investigadores usando otros modelos biológicos (Issa et al., 1996; Volgelsberg, et al., 1997). De particular interés resulta el hallazgo que el tratamiento con dopamina no es capaz de disminuir la actividad del HAChT. El hecho que la dopamina puede aumentar los niveles de AMPc intracelular desde momentos tempranos del período embrionario en retinas de embrión de pollo, a través de receptores dopaminérgicos tipo-D1 (Marques A y Garcia DeMello F.1990) y dado que en este modelo biológico las células amácrinas son las neuronas colinérgicas (Baughman R. y Bader C., 1977), queda demostrado que las mismas, en cuanto a la actividad del HAChT no pueden ser reguladas por neuronas dopaminérgicas. Por otra parte, un hallazgo relevante en este estudio es la magnitud de la reducción de la actividad del HAChT en comparación con la obtenida por Gates J., et al. 2004, donde encontraron una reducción del 30% a través de la activación de PKC mediante ésteres de forbol. En el presente estudio utilizando forskolina e IBMX se obtuvo una reducción de la actividad del HAChT cercana al 70%, sin evidencia alguna de daño o muerte celular, esta diferencia notable en cuanto

Un estudio reciente reveló que la vía de señalización mediada por AMPc induce una “Downregulation” del ARNm del HAChT en la línea celular colinérgica NSC-19 (Brock et al. 2007), sin embargo, los autores no evaluaron la actividad del transportador, por lo que sus resultados no permiten deducir la regulación sobre la captación de colina, pudiendo interpretarse estos hallazgos, como efectos “a largo plazo” del AMPc sobre la regulación del terminal colinérgico. Además, en el presente trabajo se establece que el AMPc es capaz de regular de manera inmediata la actividad del terminal colinérgico y más específicamente la síntesis de acetilcolina mediante la disminución de la actividad del HAChT, posiblemente por endocitosis clatrina-dependiente (Ribeiro, F M. et al. 2003, Ribeiro, F M et al. 2005) En conclusión, estos resultados sugieren la regulación de la actividad del HAChT por la vía de señalización AMPc/PKA. Por su parte, el hallazgo que los cultivos celulares tratados con dopamina no mostraron ningún efecto sobre la actividad del HAChT, no excluye la posibilidad que esta pueda actuar como una sustancia reguladora en otras regiones del sistema nervioso central. Se considera que deben ser evaluados otros sistemas de neurotransmisión para obtener información adicional sobre la regulación heteróloga del terminal colinérgico. Agradecimientos: Al CDCHT de la Universidad Centroccidental Lisandro Alvarado por haber financiado este proyecto bajo el 011-ME-2001.

Jope RS. High affinity choline transport and acetylCoA production in brain and their roles in the regulation of acetylcholine synthesis. Brain Res. 1979; 180:313-344.

Jope RS and Jenden DJ. The utilization of choline and acetyl coenzyme A for the synthesis of acetylcholine. J Neurochem. 1980; 35:318-325.

Blusztajn JK and Wurtman RJ. Choline and cholinergic neurons. Science. 1983; 221:614-620.

Okuda T and Haga T. Functional characterization of the human highaffinity choline transporter. FEBS Lett. 2000; 484:92-97.

Okuda T, Haga T, Kanai Y, Endou H, Ishihara T and Katsuri I. Identification and characterization of the high-affinity choline transporter. Nat Neurosci. 2000; 3:120-125 29

Okuda T and Haga T. High-affinity choline transporter. Neurochem Res. 2003; 28:483-488.

10.

Ferguson SM and Blakely RD. The choline transporter resurfaces: new roles for synaptic vesicles? Mol Interven. 2004; 4:22-37.

11.

Apparsundaram S, Ferguson SM, George AL, Jr. and Blakely RD. Molecular cloning of a human, hemicholinium-3-sensitive choline transporter. Biochem Biophys Res Commun. 2000; 276:862-867.

12.

Apparsundaram S, Ferguson SM and Blakely RD. Molecular cloning and characterization of a murine hemicholinium-3-sensitive choline transporter. Biochem Soc Trans. 2001; 29:711-716.

13.

Fabiola M. Ribeiro, Stefanie A. G. Black, Vania F. Prado, R. Jane Rylett, Stephen S. G. Ferguson y Marco A. M. Prado. The ‘‘ins’’ and ‘‘outs’’ of the high affinity choline transporter CHT. J. Neurochem. 2006; 97:1-12.

14.

Gates J., Jr., Ferguson Shawn M., Blakely D. Randy, Apparsundaram Subbu. Regulation of Choline Transporter Surface Expression and Phosphorylation by Protein Kinase C and Protein Phosphatase 1/2A. J Pharmacol Exp Ther. 2004; 310(2):536-45.

15.

Shawn M. Ferguson, Valentina Savchenko, Subbu Apparsundaram, Melissa Zwick, Jane Wright, Craig J. Heilman, Hong Yi, Allan I. Levey, and Randy D. Blakely.Vesicular localization and activity-dependent trafficcking of presynaptic choline transporters. J Neuroscience. 2003; 23(30):9697-709.

16.

De Mello FG. The ontogeny of dopamine-dependent increase of adenosine 3’,5’-cyclic monophosphate in the chick retina. J Neurochem. 1978; 31: 1049-1053.

17.

De Mello MC, Ventura AL, Paes de Carvalho R, Klein WL, De Mello FG. Regulation of dopamine- and adenosine-dependent adenylate cyclase systems of chicken embryo retina cells in culture. Proc Natl Acad Sci U S A. 1982; 79(18):5708-12.

18.

De Mello MC, De Mello FG. Topographical organization of the dopamine-dependent adenylate ciclase of the chick embryo retina. Brain Res. 1985; 328(1):59-63.

19.

DeMello FG, DeMello MC, Hudson R, Klein WL. Selective expression of factors preventing cholinergic dedifferentiation. J Neurochem. 1990; 54(3):886-92.

20.

Guimarães MZ, Hokoç JN, Duvoisin R, Reis RA, De Mello FG. Dopaminergic retinal cell differentiation in culture: modulation by forskolin and dopamine. Eur J Neurosci. 2001; 13(10):1931-7.

21.

Baughman R., Bader C. Biochemical characterization and cellular localization of the cholinergic system in the chicken retina. 1977; 138(3): 469-485.

22.

Torrao AS, Brito LR. Neurotransmitter regulation of neural development: Acetylcholine and nicotinic receptors. An Aca Bras Cienc. 2002; 74(3): 453-461.

Referencias 1.

Hans C. Fibiger. Dopaminergic-Cholinergic Interactions in the Striatum. The Japanese Journal of Psychiatry and Neurology. 1991; 45.

S. A. Talanov, N. N. Oleshko, M. N. Tkachenko, and V. F. Sagach. Interaction between Dopaminergic and Cholinergic Systems under Conditions of Deficiency of Mesencephalo-Striatal Dopamine in Rats. Neurophysiology. 2005; 37: 403-406.

Yamamura, H.I. and Snyder, S.H. High-affinity transport of choline into synaptosomes of rat brain. J. Neurochem. 1973; 21:1355–1374.

Archivos Venezolanos de Farmacología y Terapéutica Volumen 29, número 4, 2010

a la capacidad de inhibir mediante la inducción de proteínas serina-treonina kinasas con respecto a lo obtenido por Gates J., et al. 2004 no puede atribuirse a la diferencia en el modelo biológico empleado pues según lo descrito previamente por Garay et al. 2006 se obtuvo una disminución de la actividad del HAChT cercana al 30% usando ésteres de forbol en retinas de embrión de pollo. Esto permite plantear una regulación conjunta de la actividad del HAChT tanto por la fosforilación mediada por PKA como por PKC, esta hipótesis se ve reforzada por el hecho que Gates J., et al. 2004 al emplear en su modelo biológico Staurosporina (inhibidor de PKC) no obtuvieron cambios en la Vmax y la densidad en la membrana del HAChT, por otra parte usando acido okadaico y calyculin A (inhibidores de PP1/PP2A) obtuvieron reducciones de dichos parámetros similares a los obtenidos con ésteres de forbol. Estos hallazgos en conjunto refieren la presencia de un mecanismo de regulación tónica de fosforilación independiente de PKC.

23.

Lowry 0. H., Rosebrough N. J., Farr A. L., and Randall R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 1951; 193; 265-275.

35.

Sherman KA, Zigmond MJ and Hanin I. High affinity choline uptake in striatum and hippocampus: differential effects of treatments which release acetylcholine. Life Sci. 1978; 23:1863-1870.

24.

Lankford KL, DeMello FG, Klein WL. D1-type dopamine receptors inhibit growth cone motility in cultured retina neurons: evidence that neurotransmitters act as morphogenic growth regulators in the developing central nervous system. Proc Natl Acad Sci U S A. 1988; 85(12):4567-4571.

36.

Lowenstein PR and Coyle JT. Rapid regulation of [3H]hemicholinium-3 binding sites in the rat brain. Brain Res. 1986; 381:191-194.

37.

Cancela JM, Bertrand N and Beley A. Involvement of cAMP in the regulation of high affinity choline uptake by rat brain synaptosomes. Biochem Biophys Res Commun. 1995; 213:944-949.

38.

Nowak JZ, Sek B, Schorderet M. Dark-induced supersensitivity of dopamine D-1 and D-2 receptors in rat retina. Neuroreport 1991; 2: 429–432.

Issa AM, Gauthier S and Collier B. Effects of the phosphatase inhibitors calyculin A and okadaic acid on acetylcholine synthesis and content of rat hippocampal formation. J Neurochem. 1996; 66:19241932.

39.

Nir I, Haque R, Iuvone PM. Regulation of cAMP by light and dopamine receptors is dysfunctional in photoreceptors of dystrophic retinal degeneration slow (rds) mice. Exp Eye Res 2001; 73: 265–272.

Cooke LJ and Rylett RJ. Inhibitors of serine/threonine phosphatases increase membrane-bound choline acetyltransferase activity and enhance acetylcholine synthesis. Brain Res. 1997; 751:232-238.

40.

Marques V. A. L y DeMello F. G. D1 dopamine receptor in neurite regions of embryonic and differentiated retina are highly coupled to adenylate ciclase in the embryonic but not in the mature tissue. Brain Res. 1990; 530(2): 301-308.

25.

26.

27.

Doyle SE, McIvor WE, Menaker M. Circadian rhythmicity in dopamine content of mammalian retina: role of the photoreceptors. J Neurochem 2002; 83: 211–219.

28.

Witkovsky P. Dopamine and retinal function. Documenta ophthalmologica 2004; 108: 17-40.

29.

Do Nascimento JL, Kubrusly RC, Reis RA, De Mello MC, De Mello FG. Atypical effect of dopamine in modulating the functional inhibition of NMDA receptors of cultured retina cells. Eur J Pharmacol. 1998; 343(1):103-10.

41.

Garay José, Mosquera Elis, Loureiro Nelson, Moreno José A. Efecto de los aminoácidos excitatorios sobre el transportador de colina de alta afinidad en cultivos celulares de retina embrionaria de pollo. Gaceta de ciencias veterinarias. 2006; 11 (2)

30.

Guimarães MZ, Hokoç JN, Duvoisin R, Reis RA, De Mello FG. Dopaminergic retinal cell differentiation in culture: modulation by forskolin and dopamine. Eur J Neurosci. 2001; 13(10):1931-7.

42.

Martina Brock, Ann-Christin Nickel, Beata Madziar, Jan Krysztof Blusztajn, and Brygida Berse. Differential regulation of the high affinity choline transporter and the cholinergic locus by cAMP signaling pathways. 2007; 1145: 1-10.

31.

Guyenet P, Lefresne P, Rossier J, Beaujouan JC and Glowinski J. Inhibition by hemicholinium-3 of (14C)acetylcholine synthesis and (3H)choline high-affinity uptake in rat striatal synaptosomes. Mol Pharmacol. 1973; 9:630-639.

43.

Ribeiro FM, Alves-Silva J, Volknandt W, Martins-Silva C, Mahmud H, Wilhelm A, Gomez MV, Rylett RJ, Ferguson SS, Prado VF and Prado MA. The hemicholinium-3 sensitive high affinity choline transporter is internalized by clathrin-mediated endocytosis and is present in endosomes and synaptic vesicles. J Neurochem. 2003; 87:136-146.

44.

Ribeiro F. M., Black S. A., Cregan S. P., Prado V. F., Prado M. A., Rylett R. J. and Ferguson S. S. Constitutive high-affinity choline transporter endocytosis is determined by a carboxyl-terminal tail dileucine motif. J. Neurochem. 2005; 94, 86–96.

32.

Barker LA. Modulation of synaptosomal high affinity choline transport. Life Sci. 1976; 18:725-731.

33.

Murrin LC and Kuhar MJ. Activation of high-affinity choline uptake in vitro by depolarizing agents. Mol Pharmacol. 1976; 12:1082-1090.

34.

Roskoski R, Jr. Acceleration of choline uptake after depolarizationinduced acetylcholine release in rat cortical synaptosomes. J Neurochem. 1978; 30:1357-1361.

Modificaciones en los marcadores enzimáticos hepáticos promovidos por veneno de ejemplares jóvenes de crotalus DURISSUS CUMANENSIS Modifications in the enzymatic liver markers promoted by the venom of joung cotralus DURISSUS CUMANENSIS *Área de Bioquímica, Decanato de Ciencias Veterinarias, Universidad Centroccidental “Lisandro Alvarado”, **Laboratorio de Toxicología, Decanato de Ciencias Veterinarias, Universidad Centroccidental “Lisandro Alvarado”, *** Laboratorio de Anatomía Histopatología del Decanato de Ciencias Veterinarias, Universidad Centroccidental “Lisandro Alvarado”. jnoriega@ucla.edu.ve Titulo corto: Marcadores enzimáticos hepáticos y C. d. cumanensis 1- TSU, 1- Médico Veterinario 2- Magíster3. Correspondencia a: José R. Noriega Alvarado, 0251-2592423, jnoriega@ucla.edu.ve. Este trabajo fue financiado por el Consejo de Desarrollo Científico y Humanístico de la Universidad Centroccidental “Lisandro Alvarado”, Proyecto N 017-Ve-2005.

Recibido: 25/05/2010

Aceptado: 13/09/2010

Resumen

Abstract

Se determinaron los cambios séricos de ALT, AST, FA, promovidos por veneno de ejemplares jóvenes Crotalus durissus cumanensis. Ratones Balb/C inoculados con 0,75 mg proteínas de veneno/kg vía intraperitoneal y controles con ssf. Se obtuvieron muestras a diferentes intervalos post-inyección (1, 3, 6, 12 y 24 h) determinándose los niveles séricos de: ALT, AST, y FA, posterior al sacrificio se tomaron muestras de hígado para la valoración histopatológica. Los valores de ATL, AST y FA se incrementaron significativamente, siendo más temprano el aumento de AST (1h) y más tardío el de la FA (24). El hallazgo histopatológico del tejido hepático revelo tumefacción celular severa, células de Kuffer activadas y necrosis coagulativa focal. El incremento de los marcadores enzimáticos ALT, AST, y FA, paralelo a los daños histológicos encontrados en este estudio, sugieren daño hepato-biliar, adicionalmente, los niveles séricos de AST podrían indicar daño al tejido muscular esquelético y/o cardíaco.

To determinate the effect of the venom of young Crotalus durissus cumanensis on levels of ALT, AST and AP, Balb/C mice were inoculated intraperitoneal with 0,75 mg/Kg of purified venom. Serum samples were obtained at different postinjection intervals (1, 3, 6, 12, 24h) and serum levels of ALT, AST and AP were determined. A significative difference (P ‹0,01) was observed in serum levels of ALT at 6h and at 24h post-venom injection, with a maximum of 587,64 U/L at 24 h, when compared with controls. In addition, AST shows a significative elevation between 1h and 12h post venom injection, with a maximum level of 2327 U/L at 3 h, while AP only showed significant differences at 24 h post-venom injection. These results suggest that the venom of young Crotalus durissus cumanensis induced liver-biliar injury, with a possible effect on skeletal muscle and/ or cardiac tissue. Key words: Crotalus, Liver injury, Alanin-amino transferase, Aspartate-amino transferase, Alkaline Phosphatase.

Palabras claves: Crotalus, daño hepático, Alanina-amino transfersasa, Aspartato amino-transferasa, fosfatasa alcalina.

Introducción El veneno de serpientes contiene proteínas con poderoso efecto farmacológico, clasificadas por su actividad proteolítica, hemolítica, citotóxica, miotóxica y neurotóxica1, las cuales constituyen del 90 al 95% del peso seco del veneno y son

responsables de sus efectos2. Las serpientes Crotalus durissus cumanensis y Crotalus durissus ruruima son dos subespecies de Crotalus en Venezuela3, su veneno contiene una mezcla compleja de enzimas, toxinas y péptidos, conocidos

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José Rugby Noriega Alvarado3 *, Roberth Gabriel Marín Barico2*, José Antonio Mendoza2**, Carmen del Rosario Álvarez Yépez1**, Alexander Antonio Mogollón Saldivia2**, Mirleny del Carmen Pérez-Urrieta3*, Yaritza Salas3 ***

como: crotamina y crotoxina de acción miotóxica, principalmente sobre las fibras esqueléticas tipo I4,5,6. La crotoxina (crotapotina y fosfolipasa A2) tiene acción neurotóxica6,7,8, giroxina y convulsina producen convulsiones, alteraciones circulatorias y respiratorias9,10 y una enzima parecida a la trombina que su actividad permanente hace incoagulable la sangre al agotar al fibrinógeno, con disminución del contaje plaquetario11,12. Son bien conocidos sus efectos locales y sistémicos en animales de experimentación13,14. Trabajos previos sugieren daño hepático por elevación de los niveles séricos de las enzimas: alanina-amino transferasa (ALT), aspartatoamino transferasa (AST) y fosfatasa alcalina (FA).15,16,17. Se ha observado que el veneno de ejemplares jóvenes de Crotalus tienen una alta toxicidad, debido a que contienen niveles elevados de crotoxina18,19, sin embargo, poco se conoce sobre los daños hepáticos producidos por ejemplares jóvenes. El objetivo de este estudio fue determinar las modificaciones en los marcadores enzimáticos hepáticos y el daño celular promovido por veneno de ejemplares jóvenes de Crotalus durissus cumanensis. Método

El estudio se realizó con pool de veneno obtenido por ordeño manual de ejemplares jóvenes de Crotalus durissus cumanensis mantenidos en cautiverio individualmente en el Laboratorio de Toxicología en un terrarium de vidrio de 40cm de largo x 40cm de ancho x 30cm de alto con tapa de madera y malla metálica, a una temperatura diurna de 30˚C y nocturna de 24˚C, todas las serpientes se alimentan una vez al mes con ratones cepa MNRI del Bioterio del DCV de la UCLA y se les administra agua ad libitum. Se utilizaron 50 ratones ratones Balb/C del Bioterio, del DCV-UCLA divididos en 5 grupos, subdivididos a su vez en: subgrupo experimental de 5 ratones inoculados con veneno vía intraperitoneal a dosis de 0,75 mg de proteínas de veneno/kg de peso en 50μl de NaCl 0,9%, 5 ratones (subgrupo control) inoculados con 50μl de NaCl 0,9%. Se realizó extracción de sangre de la vena caudal, a intervalos de 1, 3, 6, 12, y 24h post-inyección. Las muestras fueron centrifugadas a 800 g por 10 min., determinando los niveles séricos de: alanina-amino transferasa (ALT), aspartato-aminotransferasa (AST), fosfatasa alcalina (FA), mediante kit comercial (invelab®), analizadas en Star Fax (Ω Omega IV). Las muestras de hígado se obtuvieron a las 24 horas post inoculación, el material fue preservado con formol al 10% preparado en PBS a pH 7,3 y enviado al Laboratorio de Histopatología Animal del Decanato de Ciencias Veterinarias para su montaje, tinción y análisis basados en técnicas histológicas clásicas, con Hematoxilina-eosina. Análisis estadístico: Para determinar la validez estadística de los tratamientos, se aplicó la prueba t para muestras independientes, empleando para ello el programa estadístico SPSS 11,5 para Windows.

Resultado y discusión El grupo experimental no presentó diferencias significativas en los niveles séricos de ALT con respecto al grupo control a la 1h post-inyección (gráfico 1), sin embargo, presentó un aumento progresivo y altamente significativo (P< 0,01) desde las 6h hasta las 24h, con un máximo de 587,64 U/L a las 24h, representando un incremento del 857%. La ALT es una enzima específica para determinar daño del tejido hepático20, Estudios in vivo que han analizado este tópico han encontrado resultados similares al respecto15,16; Noriega y col.17 reportan niveles séricos de ALT inferiores a los encontrados en esta investigación en especies de Crotalus durissus cumanensis, donde se empleó la misma dosis de veneno pero de ejemplares adultos de Crotalus durissus cumanensis; sin embargo, también presentan un pico máximo a las 24 horas15, mientras que otras especies adultas como Bothrops asper y Bothrops alternatus, empleando dosis de veneno superiores a la utilizada en este estudio, la ALT tiene un pico máximo a las 9h pero con valores inferiores16. Esto pudiera indicar que el veneno de Crotalus durissus cumanensis de ejemplares jóvenes es más tóxico para el tejido hepático que el veneno de ejemplares adultos, así como de Bothrops. El gráfico 2 muestra un incremento altamente significativo (P < 0,01) de la AST del grupo experimental con respecto al control, desde la 1h hasta las 24h con un valor máximo de 2327 U/L a las 3h representando un aumento del 4.356%. La enzima AST está presente como isoenzima citosólica y mitocondrial en numerosos tejidos21. En este estudio, el veneno produjo un aumento en los niveles séricos de AST que es indicativo junto con ALT de un daño hepático, sin embargo, la AST puede aumentar también en respuesta a un daño muscular severo20. Investigaciones realizadas en la misma especie pero con ejemplares adultos de Crotalus durissus cumanensis, indican niveles séricos elevados de AST con un pico máximo a las 12h post-inyección17, siendo los valores reportados inferiores a los encontrados en este estudio. El veneno de ejemplares adultos de Crotalus durissus terrificus presentan picos máximos de AST a las 24h15, mientras que, ejemplares adultos de Bothrops asper y Bothrops alternatus su pico máximo de AST fue entre las 3-9h16, ambos valores son inferiores a los aquí encontrados, esto podría sugerir que el veneno de los ejemplares jóvenes es más tóxico. En el grupo experimental los niveles de la FA durante las primeras 12h permanecen estable, con respecto al control, con un aumento altamente significativo (P<0,01) a las 24h, del 622%. Poco se conoce sobre el efecto del veneno de Crotalus sp sobre la actividad de la FA, esta enzima presente principalmente en tejido hepático y óseo, su incremento patológico se debe mayormente a trastornos hepatobiliares22. Resultados similares describen aumentos en los niveles séricos de la FA entre las 12 y 24h post-inyección en ratones inoculados con veneno de ejemplares adultos de Crotalus durissus cumanensis17, igualmente, se ha descrito un aumento de FA entre las 24 y 48h después de la inyección intramuscular del

El estudio histopatológico realizado a las muestras de hígado a las 24 horas post inyección (Figura 4 y 5) revelo tumefacción celular severa, células de Kupffer activadas y necrosis coagulativa focal, lo cual evidencia junto con las determinaciones enzimáticas que el veneno de ejemplares jóvenes de Crotalus durissus cumanensis produce un daño agudo al tejido hepático. En estudios similares Acosta de Pérez y col.15 en envenenamientos experimentales en ratas con serpientes adultas de Crotalus durissus terrificus observaron congestión y dilatación de los vasos sanguíneos grandes del tejido hepático, hemosiderina en los vasos periféricos. Teiber y col.16 en ratas Wistar encontraron en las biopsias hepáticas a las 9 horas de exposición con el veneno de Bothrops altematus adultas, degeneración hidrópica difusa, comprometimiento de distintas aéreas del lobulillo, incluyendo zonas periportales mediozonales y centrololulillares; a las 24 horas la degeneración hidrópica fue de mayor intensidad, observándose menos grado de colestasis canalicular.

Gráfico 1

Las barras representan la media ± la desviación estándar, n = 5 ** P<0,01 Niveles séricos de la enzima alt en ratones balb/c inoculados con 0,75 mg/kg de veneno de ejemplares jóvenes de crotalus durissus cumanensis

Gráfico 2

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veneno de Crotalus durissus terrificus en caninos23, mientras que, el veneno crudo y fraccionado de Bungarus caeruleus aumenta los niveles séricos de FA en ratones24. El aumento en los niveles séricos de la FA encontrado en este estudio pudiera interpretarse como una colestasis intrahepática, sin embargo, es necesario realizar estudios complementarios, ya que, el veneno de Crotalus durissus cumanensis en vez de producir colestasis intrahepática, quizás induzca daño de las células de los canalículos biliares y no se debe descartar además, el daño que en forma simultánea podría experimentar el resto de los tejidos donde la FA está presente. El aumento en los niveles séricos de la FA es tardío y no paralelo en relación a las ALT y AST, por lo que es necesario incluir en las futuras investigaciones la detección de las isoformas para establecer cual tejido es afectado por la exposición al veneno de esta serpiente. El aumento en los niveles séricos de las enzimas ALT, AST y FA quizás puedan deberse a las modificaciones sobre la permeabilidad de la membrana celular hepática producida por la crotoxina de ejemplares jóvenes de Crotalus durissus cumanensis.

Las barras representan la media ± la desviación estándar, n = 5 ** P<0,01 Niveles séricos de la enzima ast (tgo) en ratones balb/c inoculados con 0,75 mg/kg de veneno de ejemplares jóvenes crotalus durissus cumanensis

74 Gráfico 3

Se concluye que el veneno de ejemplares jóvenes de Crotalus durissus cumanensis induce el incremento de los niveles séricos de la enzimas: ALT con un valor máximo a las 24h, de AST a las 3h y de FA a las 24h post-inyección, lo cual asociado a las alteraciones histológicas encontradas, sugieren daño al tejido hepato-biliar.

Las barras representan la media ± la desviación estándar, n = 5 ** P<0,01 Niveles séricos de la enzima fa en ratones balb/c inoculados con 0,75 mg/kg de veneno de ejemplares jóvenes crotalus durissus cumanensis

Figura 4

Cupo, P, Azevedo-Márquez, MM, Hering, SE. Acute myocardial infarction-like enzyme profile in human victims of C.durissus terrificus envenoming. Trans R Soc Trop Med Hyg 1990; 84:447-451.

Jorge, MT, Ribeiro, LA Acidentes por serpents peçonhentas do Brasil. Rev Assoc Med Bras 1990; 36:66-77.

Vital, BO. Pharmacology of crystalline crotoxin II. Neuromuscular blocking action. Mem Inst Butantan 1966; 33:981-992.

Feitosa, RFG, Melo, IMLA, Monteiro, HSA. Epidemiologia dos acidentes por serpentes no Estado do Ceará. Rev Soc Bras Med Trop 1997; 30: 295-301.

Vital, BO, Franceschi, JP, Waishich, E. Pharmacology of crystalline crotoxin. Tox Mem Inst Butantan. 1966; 33:973-80.

10. Vital, B O. Venenos ofídicos neurotóxicos. Rev Ass Med Brasil 1980; 26:212-218. 11. Amaral, CFS, Resende, NA, Peroda, TGM. Afibrinogenemia secundária a accidente ofídico crotálico. Ver Ins Méd Trop 1988; 30:28892. Corte histológico de hígado de ratón Balb/C inoculados con NaCl 0,5%, a las 24 horas post inyección. Hepatocito (1); sinusoide (2) y vena central (3); H-E (40X).

Figura 5

12. Barravieira, B. Acidentes por serpentes do gênero Crotalus. Arq Brás Méd 1960; 64:14-20. 13. Grillo, O, Scannone, H, Parra, N. Enzymatic activities and other characteristics of Crotalus durissus cumanensis venom. Toxicon 1974; 12: 297-302. 14. Pirela, R, Lopéz-Jonsthon, JC, Hernández, J. Caracterización toxinológica del veneno total de la serpiente de cascabel Crotalus durissus cumanensis (Viperidae) presente en la localidad de Porshoure, Guajira Venezolana. Rev Científ FCU-LUZ 2006; 16 (3):232-238. 15. Acosta de Pérez, O, Koscinczuk, P, Teibler, P, Ruiz, R, Sánchez, M, Maruñak, S, Mussart de Coppo, N. Intoxicación por veneno de Crotalus durissus terrificus (cascabel) en ratas. Acta toxicol Argent 1997; 5 (2):71-74. 16. Teibler P, Acosta de Pérez O, Maruñak, S, Ruiz, R, Koscinczuk, P, Sánchez, N. Mussart de Coppo, N. Lesiones locales y sistémicas inducidas por veneno de Bothrops alternatus (víbora de la cruz) de Argentina Acta toxicol Argent 1999; 7 (1):7-10.

Corte histológico de hígado de ratón Balb/C inoculado con 0,75 mg/kg de proteína de veneno de Crotalus durissus cumanensis a las 24 horas post inyección. Hepatocito tumefacto (1); célula de Kupffer (2); picnosis (3) y careorresis (4) indicativo de necrosis coagulativa focal (40x).

Noriega-Alvarado, J, Colmenarez, D, Mogollón, A, Márquez, N, Hernández, V, Pérez, M. Cambios séricos en las enzimas ALT, AST, FA, CK-TOTAL, y LDH inducidas por el veneno de Crotalus durissus cumanensis en ratones Balb/C. Rev Cientif FCV-LUZ. 2009; (4) 408-409.

Lomonte. B, Gené, JA, Gutierrez, JM, Cerdas, L. Estudio comparativo de los venenos de serpiente cascabel (Crotalus durissus durissus) de ejemplares adultos y recién nacidos. Toxicon 1983; 23: 379-384.

Gutierrez, JM., Dos Santos, MC., De Fatima-Furtado, M, Rojas G. Biochemical and Pharmacological similarities between the venoms of newborn Crotalus durissus durissus terrificus rattlesnake. Toxicon 1991; (29):10 1273-1277.

Limdi, JK, Hyde, GM. Evaluación de las Pruebas de Función Hepática Anormales. Postgraduate Medical Journal. 2003; 79 (932):307-312.

Nishimura, H, Yasaki, Y. Biochemical tests for diagnosis of acute miocardial infarction and stimation of infarct size. Nippon Rincho. 1994; 52: 755-759.

Agradecimientos: Al Laboratorio de Histopatología Animal del Decanato de Ciencias Veterinarias-UCLA. Este trabajo fue financiado por el Consejo de Desarrollo Científico y Humanístico de la Universidad Centroccidental “Lisandro Alvarado”, Proyectos Nº 017-VE-2005. Referencias 1.

Berger, B, Bhatti, A.R. Snake venom components and their crossreactivity: a review. Biochem Cell Biol 1971; 67: 597-601.

Bon, C. Snake venom & Pharmacopoeia. En: Bauchot, R.(1st ed). Snake A natural history. New York: Sterling Publ.1994.194-2093.

Hoge, AR Preliminary account on neotropical Crotalinae (Serpentes: Viperidae). Mem. Inst Butantan 1965; 32: 109-184.

Rosefeld, G, Kelen, EMA, Nudel, F. Hemolytic activities of animal venoms, classification in different types and activities. Mem Inst Butatan 1960; 30: 103-116.

22. Kachmar, J, Moss D. Enzymes. En: Tietz, N.W. Fundamentals of Clinical Chemistry.2nd Ed. Philadelphia:W.B. Saunders Company. 1976. 652-682. 23. De Sousa-E-Silva, MV, Tomy, SC, Tavares, FL, Navajas, L, Larsson, MH, Lucas, SR, Kogica, MM, Sano-Martins, IS. Hematological, haemostatic and clinical chemistry disturbances induced by Crotalus durissus terrificus snake venom in dogs. Hum Exp Toxicol 2003; 22(9):491-500. 24. Mirajkar, KK, More, S, Gadag, JR. Isolation and purification of a neurotoxin from Bungarus caeruleus (common Indian krait) venom: biochemical changes induced by the toxin in rats. J basic Clin Physiol Pharmacol 2005; 16(1):37-52.

Índice de autores 2010. Volumen 29

Capó de Paz B, Virginia, 2010; 29(2): 36 Contreras J., 2010; 29(1): 15 Coronado Raúl, 2010; 29(2): 26

Méndez G.; 2010; 29(1): 15 Mendoza José Antonio, 2010; 29(4): 72 Mogollón Saldivia Alexander A, 2010; 29(4): 72 Montoro Cardoso. Ernesto Hi; 2010; 29(2): 36 Morales Abelardo, 2010; 29(2): 26 Morales Vallarta Mario R., 2010; 29(2): 29; 29(4): 60 Moreno García, María A; 2010; 29(2): 29; 29(4): 60 Mosquera F Elis A.; 2010; 29(4): 66 Müller A., 2010; 29(1): 15 Muñoz E. José Jesús, 2010; 29(2): 29; 29(4): 60

Chávez Guajardo Elsa Gabriela, 2010; 29(2): 29; 29(4): 60

Noriega Alvarado José Rugby, 2010; 29(4): 72

Fernández CM, 2010; 29(2): 32; 29(3): 55

Octavio J; 2010; 29(1): 15

Garay José L.; 2010; 29(4): 66 García Francisco, 2010; 29(2): 26 González B. Gilberto Fleites, 2010; 29(2): 36 González Yibirín M., 2010; 29(1): 6, 10, 15

Pérez Elevina, 2010; 29(2): 20 Pérez-Urrieta Mirleny del Carmen, 2010; 29(4): 72 Perurena MR, 2010; 29(2): 32; 29(3): 55 Portillo M.; 2010; 29(1): 15

Illnait MT, 2010; 29(2): 32; 29(3): 55

Reveles Hernández R. Gabriela. 2010; 29(2): 29; 29(4): 60 Ricco V. 2010; 29(3): 44 Rivero Luís, 2010; 29(2): 26 76 Rodríguez Carlos; 2010; 29(2): 26 Rodríguez I, 2010; 29(2): 32; 29(3): 55

Bandera Tirado, Juan Francisco, 2010; 29(2): 36 Barreto Seachoque B. 2010; 29(1): 6, 10 Brito Sara; 2010; 29(2): 20

Jerez Puebla LE, 2010; 29(2): 32; 29(3): 55 Lares Mary, 2010; 29(2): 20 Latouche Orihana, 2010; 29(2): 26 Leal Luís, 2010; 29(2): 26 Lenin Cira; 2010; 29(2): 20 López H William J..; 2010; 29(4): 66 López Pedro, 2010; 29(2): 26 Loureiro D S Nelson E.. 2010; 29(4): 66 Manfredi Roberto; 2010; 29(1): 1; 29(3): 44 Marín Barico Roberth Gabriel, 2010; 29(4): 72 Martínez A. María Rosarys, 2010; 29(2): 36 Martínez G. 2010; 29(2): 32; 29(3): 55 Mederos Cuervo. Lilian María, 2010; 29(2): 36

Salas Yaritza. 2010; 29(4): 72 Saldivar Elías Sergio J., 2010; 29(2): 29; 29(4): 60 Sánchez Marta, 2010; 29(2): 26 Schroeder Mily, 2010; 29(2): 20 Subiela H.José D.; 2010; 29(4): 66 Valdés Alonso Lidunka, 2010; 29(2): 36 Valero Z; 2010; 29(1): 15 Virga C, 2010; 29(3): 44

Archivos Venezolanos de Farmacología y Terapéutica Volumen 29, número 4, 2010

Aguzzi A, 2010; 29(3): 44 Álvarez Yépez Carmen del Rosario, 2010; 29(4): 72