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II. Investigación Traslacional
MEDICINA REGENERATIVA DE LA SUPERFICIE OCULAR
Investigador Principal:
Dr. Álvaro Meana Infiesta.
Coordinador del Grupo e Investigador Principal. Doctor en Medicina. Investigador experto en Trasplantes de Tejidos y Terapias Avanzadas. Director del Banco de Tejidos del Centro Comunitario de Sangre y Tejidos de Asturias.
Dra. Natalia Vázquez Moreno.
Licenciada en Biología por la Universidad de Oviedo. Suficiencia Investigadora. Programa de Doctorado de Biología Funcional y Clínica. Departamento de Biología Funcional. Universidad de Oviedo. Actualmente desarrolla su actividad como investigadora postdoctoral en la Unidad de Medicina Regenerativa de la Superficie Ocular de la Fundación de Investigación Oftalmológica.
Prof. Jesús Merayo Lloves.
Director del IUFV. Doctor en Medicina y Médico Especialista en Oftalmología. Alta especialidad (Fellowship) en Inmunología Ocular y Uveítis (Universidad de Harvard, USA) y Cirugía Refractiva (FOSCAL-UNAB, Colombia). Diplomatura en Óptica y Optometría (USPCEU, Madrid) y Máster en Dirección de Empresas (EAP. Madrid). Investigador experto en superficie e inflamación ocular. Tiene más de 445 publicaciones y un índice H 44. Es Catedrático de Oftamología de la Universidad de Oviedo.
Equipo Investigador:
Laboratorio:
Dr. Álvaro Meana PI, LC, FIO, CCST. Dra. Natalia Vázquez PhD, FIO. D. Manuel Chacón PreD, FIO. Dña. Mairobi Persinal PreD, IOFV. D. Sergio Alonso Alonso PreD, FIO.
Clínicos:
Dr. José F. Alfonso PI, UO, IOFV. Dra. Begoña Baamonde PhD, UO, HUCA. Dr. Carlos Lisa PhD, IOFV. Dr. Luis Fernández-Vega Cueto PhD, IOFV, HUCA, UO. Dña. Belén Alfonso PreD, IOFV. Dña. Silvia Berisa PreD, IOFV. Dña. Lucía Grandio PreD, IOFV.
PRESENTACIÓN
El principal reto de investigación del grupo de Medicina Regenerativa de la Superficie Ocular consiste en ofrecer nuevas soluciones terapéuticas a las necesidades clínicas no cubiertas en oftalmología. Una de las principales necesidades radica en la escasez de tejido proveniente de donaciones, el cual no es suficiente para cubrir con la actual demanda clínica. Es por ello, que el equipo de investigación está enfocado hacia el desarrollo de nuevos tejidos artificiales que puedan suplir el actual déficit de donantes, concretamente con el desarrollo de lamelas corneales anteriores y posteriores. Este carácter transversal característico del grupo de Medicina Regenerativa de la Superficie Ocular nos permite traducir hacia los pacientes nuestra experiencia preclínica mediante nuevas soluciones innovadoras basadas en tejidos humanos artificiales y herramientas de medicina personalizada. A continuación, se encuentran resumidos los principales resultados obtenidos durante el año 2021.
PROYECTO I: DESARROLLO DE UN SISTEMA DE CULTIVO AUTÓLOGO PARA EL TRATAMIENTO DE LA INSUFICIENCIA LÍMBICA BILATERAL (AUTOCELL)
Resumen:
El proyecto AUTOCELL es un proyecto encaminado al tratamiento autólogo de las insuficiencias límbicas bilaterales. La insuficiencia límbica es una patología compleja, con una etiología multifactorial, en la cual la córnea
pierde parcial o totalmente su capacidad regenerativa, debido a que las células responsables de la regeneración del epitelio corneal (células limbares) pierden su función. Esto conlleva la aparición de defectos epiteliales permanentes, la pérdida de visión debido a la conjuntivalización de la córnea y en las fases terminales causa ceguera.
Se trata de una patología con limitadas opciones terapéuticas, ya que las técnicas quirúrgicas convencionales, como el trasplante penetrante o el trasplante de injertos de limbo autólogo o alogénico no constituyen un tratamiento eficaz. Sin embargo, la expansión de células limbares in vitro se ha mostrado como una alternativa prometedora a las técnicas quirúrgicas convencionales, para el tratamiento de las insuficiencias límbicas unilaterales (el paciente tiene un solo ojo afectado). En el caso de las insuficiencias límbicas bilaterales (el paciente tiene los dos ojos afectados), se imposibilita la obtención de una biopsia autóloga de tejido limbar sano para llevar a cabo la expansión in vitro de las células limbares, lo cual implica la utilización de tejido limbar de donante cadavérico, cuyo ratio de éxito está limitado por el riesgo de rechazo y requiere de una inmunosupresión sistémica. En los últimos años, ha aumentado el interés por la búsqueda de poblaciones celulares autólogas alternativas, que puedan reemplazar a las células limbares alogénicas, en los casos de insuficiencias límbicas bilaterales. Entre los candidatos para el tratamiento de la insuficiencia límbica bilateral, están el epitelio de la mucosa oral y las células madre mesenquimales, que han demostrado un gran potencial para su uso en la Medicina Regenerativa del epitelio corneal.
El grupo de Medicina Regenerativa, ha demostrado su interés en el abordaje terapéutico de las distintas versiones de la insuficiencia límbica, llevando a cabo en los últimos años, investigaciones enfocadas en el desarrollo de tratamientos autólogos tanto para las insuficiencias límbicas unilaterales como para las bilaterales.
En el primer abordaje, se ha observado que la expansión in vitro de células madre limbares, utilizando el Plasma Rico en Factores de Crecimiento (PRGF), como único suplemento del medio de cultivo de las células limbares y para realizar las membranas sobre las que se cultivan dichas células, presentaba efectos terapéuticos en quemaduras precursoras de esta enfermedad.
Posteriormente, se comenzó la puesta a punto del cultivo de las células madre mesenquimales y las células epiteliales de mucosa oral, con la misma metodología de cultivo empleada para el cultivo de las células madre limbares. Asimismo, se llevó a cabo su caracterización fenotípica.
A continuación, se inició el estudio in vivo del trasplante de células madre mesenquimales y células madre epiteliales de mucosa oral con PRGF como adyuvante para el tratamiento de insuficiencias límbicas originadas por causticación corneal con un álcali evaluando sus resultados mediante distintas técnicas de estudio morfológico y biomolecular y comparándolos con dos grupos control tratados sin células madre.
El resultado más relevante de este estudio fue que el trasplante con células madre epiteliales o mesenquimales evitó la progresión de la patología, restableciendo la homeostasia del epitelio corneal. A diferencia de los grupos controles, en los que se observó que el traumatismo de la superficie ocular por álcali en conejos no remite con tratamiento farmacológico y sin células madre, ya que se vio que las lesiones progresaron hacia una insuficiencia límbica cuya manifestación clínica más relevante fue el defecto epitelial remanente seguido de la conjuntivalización.
PROYECTO II: CÉLULAS ENDOTELIALES CORNEALES HUMANAS COMO BASE PARA EL DESARROLLO DE TERAPIAS CELULARES: TRATAMIENTO ADYUVANTE A LAS ENDOQUERATOPRÓTESIS EN LAS CEGUERAS CORNEALES NO APTAS PARA TRASPLANTE
Resumen:
La finalidad del presente proyecto, es desarrollar una Terapia Celular para el tratamiento de la insuficiencia endotelial en los pacientes que son intervenidos con queratoprótesis, utilizando como fuente celular tejidos que habitualmente son descartados por los bancos de tejidos.
Las enfermedades del endotelio corneal, tienen su origen en una disminución en el número o en la función de las células endoteliales corneales, las cuales forman una monocapa entre la córnea y el humor acuoso, manteniendo la transparencia corneal a través de una función barrera y una función de bomba metabólica activa. Cualquier pérdida o daño de las células endoteliales, resulta en un edema que impide el correcto paso y enfoque de la luz, lo cual deriva en una alteración de la visión y requiere de la realización de un trasplante endotelial en cualquiera de sus variantes.
Pese al éxito de la mayoría de los trasplantes realizados, en los que los pacientes recuperan rápidamente la agudeza visual, existen algunos pacientes que no responden a los trasplantes convencionales o en los que esta repuesta es de una duración muy limitada, existiendo también otros pacientes en los que la cirugía está contraindicada (patologías oculares previas como glaucoma, lesiones retinianas, intervenciones quirúrgicas múltiples sobre el globo ocular). Una de las técnicas empleadas en estos casos, es la colocación de una prótesis en la córnea. La prótesis es una lente artificial transparente (vidrio, borosilicato, metacrilato…) por la que pueda pasar la luz y llegar a la retina. Existen diferentes modelos de prótesis, las cuales sólo consiguen una mejora de la agudeza visual limitada, pero que permiten aumentar la calidad de vida de algunos pacientes. Los grandes problemas de las queratoprótesis son la infección y la subluxación, consecuencia ambas de la cirugía abierta y de la mala integración entre la córnea y el material protésico.
En el Instituto Oftalmológico Fernández-Vega (IOFV), en colaboración con la empresa AJL, se ha diseñado y patentado un nuevo modelo de queratoprótesis, basado en el concepto de trasplante corneal protegido, desarrollado previamente en el IOFV, que consiste en un trasplante corneal de espesor completo sobre una córnea receptora
en la que se deja sin retirar una delgada capa de estroma, la membrana de Descemet y el endotelio. Este trasplante crea una pseudocámara delante de la verdadera cámara anterior del globo ocular. El resultado, es un trasplante en el que no es necesario la apertura completa del globo ocular con lo que se consigue una cirugía cerrada, sin riesgo de infección, colocándose la queratoprótesis de metacrilato patentada en el interior de la pseudocámara para mantener este espacio abierto. La queratoprótesis desarrollada, ha sido empleada en más de 20 pacientes, tiene marcado CE y puede revolucionar la cirugía y el pronóstico de las córneas en las que el trasplante convencional está contraindicado ya que en el ensayo clínico realizado los resultados obtenidos han sido muy satisfactorios.
Sin embargo, se ha puesto de manifiesto en algunos pacientes, que existe una pérdida progresiva de las células endoteliales de la córnea trasplantada. Esta pérdida, que es un fenómeno normal en todos los trasplantes, en este caso se ve acelerada debido a la baja nutrición que recibe la córnea al estar trasplantada sobre una pseudocámara y no directamente en la cámara anterior. Como consecuencia, cuando la densidad de las células endoteliales se reduce por debajo de un número crítico (aproximadamente 500 células/mm2) la córnea se edematiza y pierde su transparencia.
El objetivo del presente proyecto es utilizar las células endoteliales de las córneas con bajo recuento endotelial que son descartadas, junto con los anillos esclerocorneales que también se descartan de manera habitual durante la realización de las queratoplastias, para su inyección en el interior de la pseudocámara y que los pacientes recuperen la función del endotelio corneal.
Para ello, se han obtenido cultivos de células endoteliales corneales a partir de los tejidos descartados, utilizando en una primera fase las técnicas de cultivo convencional, y simulando, en una segunda fase, las técnicas de Terapia Celular. Los cultivos obtenidos, han sido caracterizados, en ambos casos, mediante técnicas de microscopía de contraste, mostrando las células endoteliales una morfología hexagonal similar a las del endotelio nativo; mediante microscopía de inmunofluorescencia, mostrando expresión fenotípica positiva para los marcadores característicos del endotelio corneal, la ZO-1, la bomba Na+/K+-ATPasa, la conexina-43 y la vimentina; mediante la realización de una qPCR, mostrando una expresión génica, de los marcadores anteriormente mencionados, menor en los cultivos obtenidos que en el endotelio nativo, pero sin existir diferencias estadísticamente significativas en el nivel de expresión génica de estos marcadores entre los cultivos obtenidos de los diferentes tejidos descartados; y mediante técnicas que analizan la Resistencia Eléctrica Trans-endotelial (TER), que permiten demostrar la integridad de las uniones tight junctions, y por tanto de la existencia de la función barrera endotelial en los cultivos obtenidos. Posteriormente, se han obtenido cultivos de células endoteliales corneales en un medio de cultivo libre de factores xenógenicos, con el fin de facilitar la traslación clínica de los resultados, siendo caracterizados con las mismas técnicas descritas anteriormente. Por último, se ha desarrollado un modelo in vitro de insuficiencia endotelial, en el que una córnea descartada, a la que previamente se ha realizado una descemetorrexis, se sitúa en una cámara de Barrow conectada a un manómetro en U con el que se simula la presión intraocular humana. El modelo in vitro desarrollado, permitirá estudiar la eficacia terapéutica de la Terapia Celular desarrollada, evitando la utilización de modelos animales.
PROYECTO III: DESARROLLO DE ADHESIVOS TISULARES AUTÓLOGOS
Resumen:
En el IOFV se realizan unas 9.000 cirugías oculares al año, de las cuales un 30 % son cirugías de superficie ocular. Por lo general, la sutura es el método de fijación más ampliamente empleado por rutina en cirugía. Sin embargo, el empleo de sutura en oftalmología presenta una serie de complicaciones frecuentes: inflamación, hemorragia y dolor neuropático o nociceptivo. No obstante, actualmente en oftalmología, se está combinando el uso de sutura con adhesivos tisulares humanos de marcas comerciales lo cual permite reducir el dolor, la inflamación y la hemorragia. Los adhesivos que están teniendo mayor impacto se preparan a partir de plasma humano, pero, son pocos los que consiguen alcanzar la capacidad de adhesión de los adhesivos comercializados.
Este trabajo ha logrado desarrollar un adhesivo tisular humano de fibrina con una fuerza de adhesión suficiente (hasta 3,1 ± 0,5 kPa) para suponer una potencial alternativa a otros adhesivos de fibrina de marcas comerciales de uso oftalmológico (5,4 ± 0,6 kPa). Además, durante el estudio preclínico de las dos fórmulas de adhesivo tisular humano se ha observado una buena capacidad de adhesión sobre los tejidos de la superficie ocular, sin dehiscencias posteriores y con ausencia de toxicidad e irritabilidad ocular de acuerdo con los estudios morfológicos.
En resumen, se han diseñado dos fórmulas de adhesivo tisular humano, que pueden ser preparados de forma autóloga a partir de la sangre humana en menos de 60 min. Se trata de procedimientos sencillos, que se puede realizar empleando productos con seguridad de calidad farmacopea para producir un material seguro, accesible y de bajo coste. Actualmente, se está realizando el estudio morfológico y biomolecular de los resultados recogidos de los estudios preclínicos en modelos in vivo. Asimismo, se están estudiando las propiedades de adhesión de las formulaciones del adhesivo tisular humano mediante la técnica de tensiometría.
PROYECTO IV: PRE-VALIDACIÓN DE EPITELIOS HUMANOS RECONSTRUIDOS PARA SU UTILIZACIÓN COMO MÉTODO ALTERNATIVO A LA EXPERIMENTACIÓN ANIMAL EN LA EVALUACIÓN DE LOS PELIGROS PARA LA SALUD HUMANA DE LOS PRODUCTOS QUÍMICOS (SAFECHEM)
Resumen:
El proyecto SAFECHEM pretende desarrollar una metodología de evaluación acorde a las exigencias de la Organización para la Cooperación y Desarrollo Económicos (OECD) para la evaluación de productos químicos en mo-
delos de epitelio corneal reconstruido y epidermis reconstruida, así como desarrollar nuevos modelos de epitelio reconstruido de notable interés en toxicología y con ello, establecer las bases de nuevos métodos alternativos a la experimentación animal en la evaluación de los peligros para la salud humana de productos químicos.
En este trabajo, se han desarrollado modelos de epitelio corneal reconstruido que se han utilizado para estudiar el potencial irritante de productos químicos de aplicación tópica. Para ello, se evaluaron 30 productos químicos de referencia por duplicado en 3 lotes de tejido reconstruido. Brevemente, el protocolo consistió en la colocación de los modelos en placas de 12 pocillos con 500 µL de medio de cultivo en la parte basal y la exposición por duplicado, por la parte apical y durante 30 minutos para los compuestos líquidos (100 µL) y 6 horas para los compuestos sólidos (100 mg) de las sustancias a evaluar, con el objetivo de detectar sustancias causantes de irritación o daño ocular severo (OECD TG 492). Como control negativo se empleó agua destilada y como control positivo se utiliza Metil Acetato (CAS: 79-20-9). Tras los periodos de exposición, los compuestos aplicados son retirados por decantación y los modelos son lavados en solución salina tamponada. Seguidamente los modelos son sometidos a un post-lavado durante 12 minutos en medio de cultivo a temperatura ambiente y finalmente incubados a 37 °C en una etapa de post-incubación en medio de cultivo durante 2 horas para los compuestos líquidos y 18 horas para los compuestos sólidos. Finalmente y tras el periodo de post-incubación, los modelos fueron incubados durante tres horas en una solución de MTT a 0,5 mg/mL. El MTT es una sal amarillenta de tetrazolio que es reducida a un precipitado azulado de formazán por la succinato deshidrogenasa mitocondrial de las células viables. El precipitado de formazán se extrajo durante 15 minutos con una solución de DMSO (1.000 µL) y fue cuantificado espectrométricamente a una longitud de onda de 570 nm. El % de viabilidad celular fue calculado en relación a los valores del control negativo y las sustancias aplicadas se clasificaron como No-Irritante (Categoría EU/CPL: No categoría) en aquellos modelos que presenten una viabilidad porcentual superior al 60 %. Si la sustancia evaluada disminuye la viabilidad celular hasta un límite de 60 % o inferior, el compuesto se clasificará como Irritante/Daño severo (Categoría EU/ CPL: Categoría 1 o 2).
Los resultados obtenidos mostraron una concordancia en la clasificación para cada compuesto en todos los lotes evaluados, estableciendo una reproducibilidad intralaboratorio del 100%. Por otro lado, en cuanto a la capacidad predictiva, se obtuvo una especificidad (capacidad de detección de no irritantes) del 60%, una sensibilidad (capacidad de detección de irritantes) del 93% y una precisión del 76%. Con todo ello, el modelo desarrollado cumple con los actuales requerimientos y estándares para ser utilizado como método alternativo para la evaluación del daño ocular severo/irritación ocular.
Resumen:
El proyecto producción de córneas artificiales en mini-salas blancas ha consistido en el desarrollo de un prototipo de instalación no convencional (mini-sala blanca) para la fabricación de un Medicamento de Terapia Avanzada para el tratamiento de la insuficiencia límbica o déficit limbar, que consiste en la expansión ex vivo de células madre limbocorneales alogénicas, utilizando Plasma Rico en Factores de Crecimiento (PRGF) como único suplemento del medio de cultivo, y como scaffold o soporte para poder cultivar y trasplantar las células madre limbares. Los Medicamentos de Terapias Avanzadas representan una nueva categoría de fármacos con un amplio potencial terapéutico para el tratamiento de diferentes tipos de enfermedades. Los Medicamentos de Terapias Avanzadas se enfrentan a retos continuos, no sólo desde el punto de vista clínico para el tratamiento de las distintas patologías para las que se desarrollan, sino también desde el punto de vista tecnológico, ya que suponen el desarrollo de sistemas innovadores para la producción de medicamentos seguros y efectivos.
Desde el año 2017, la normativa europea para la fabricación de los Medicamentos de Terapia Avanzada, exige que estos se fabriquen según las Normas de Correcta Fabricación, debiendo de realizarse su producción en condiciones similares a la fabricación de los fármacos convencionales (salas blancas). Esto hace que muchas empresas que tienen sus procesos de fabricación bien establecidos, se encuentren con el enorme desafío a la hora de llevar a cabo la comercialización de sus Medicamentos de Terapia Avanzada, de tener que llevar a cabo un cambio en la infraestructura de su laboratorio y de tener que adaptar su procedimiento productivo a la normativa legal vigente, siendo todo ello económicamente rentable.
Cumplir la regulación impuesta a los Medicamentos de Terapia Avanzada con los sistemas convencionales de producción, ha implicado que, a pesar del gran número de ensayos clínicos existentes, sólo dos de ellos, Holoclar® y Luxturna®, hayan recibido la aprobación de la Agencia Europea del Medicamento (EMA), posiblemente por los enormes desafíos relacionados con la fabricación que se tienen que superar con su fabricación.
En este sentido, nuestro grupo de investigación viene desarrollando proyectos de investigación condicionados por la búsqueda de tratamientos eficaces para patologías oculares que tienen malas soluciones terapéuticas, como es el caso del déficit limbar, pero buscando modelos de producción que inciden en el desarrollo de medicamentos personalizados a un coste razonable.
Para ello, se ha diseñado, construido, y cualificado una mini-sala blanca, reduciendo de este modo los costes de diseño, construcción y mantenimiento, respecto a una sala blanca convencional y se ha redactado todo el Sistema de Calidad Farmacéutico de acuerdo al Real Decreto 477/2014 y las Normas de Correcta Fabricación. Asimismo, se ha realizado una validación prospectiva de la producción, mediante la realización de tres lotes consecutivos del Medicamento de Terapia Avanzada desarrollado, demostrándose que la producción mantenía los mismos estándares de calidad y seguridad que si se realizase en una sala convencional, y se ha realizado la Memoria Técnica para poder obtener la autorización para la fabricación del Medicamento de Terapia Avanzada desarrollado dentro de la mini-sala blanca, lo que permitiría tratar a los pacientes afectados por el déficit limbar.
