Chiarire la biosintesi e la funzione fisiologica dei diidrocalconi utilizzando la diversità della mela

I diidrocalconi (DHC) sono polifenoli bioattivi presenti in diversi tessuti del melo. I DHC potrebbero agire come filtri UV nelle foglie, essere potenti antiossidanti cellulari, oppure svolgere un ruolo nella resistenza ai patogeni. Tuttavia le prove sulle sue precise funzioni in planta sono ancora sfuggenti e dibattute tra gli scienziati. I percorsi biosintetici che portano alla formazione di DHC sono ancora solo parzialmente chiariti, ma hanno fornito la base per l’ingegneria genetica dei passaggi chiave del percorso che ha portato alla creazione di una serie di linee di mele transgeniche.

La florizina (Pz) è il DHC più abbondante nella mela, che deriva dall’azione di una chiave UDP-2′-O-glucosiltransferasi (MdPGT1). È stata condotta la valutazione simultanea degli effet- ti del targeting di MdPGT1 mediante transgenesi convenzionale e modifica del genoma mediata da CRISPR/ Cas9. Le linee “knockdown” hanno mostrato una caratteristica compromissione della crescita delle piante e della morfologia delle foglie, mentre le linee modificate dal genoma hanno mostrato una crescita normale nonostante una riduzione del Pz fogliare. Abbiamo identificato geni e processi di differenziamento modulati in linee stentate e modificate dal genoma, inclusi i geni coinvolti nella segnalazione dei fitormoni. La profilazione dei fitormoni ha rivelato che l’acido salicilico e l’acido jasmonico erano aumentati nelle linee nane, mentre l’auxina e l’acido abscissico non mostravano alcuna correlazione con il fenotipo di crescita. Inoltre, i brassi- nosteroidi erano comunemente sovra regolati, mentre la gibberellina GA4 era distintamente alterata, mostrando una forte diminuzione delle linee di knockdown. Questi risultati suggeriscono che una modulazione differenziale dei fitormoni può essere coinvolta negli effetti contrastanti sulla crescita in seguito alla riduzione di Pz e illustrano come l’editing del genoma CRISPR/Cas9 può essere applicato per sezionare il contributo dei geni coinvolti nella biosintesi di Pz nella mela.

La sieboldina (Sb) è stata trovata in alcune specie selvatiche di Malus. Il primo passo verso la biosintesi di Sb è stato chiarito dall’analisi di tra - scrittomi e da un assemblaggio di trascrittomi de novo per identificare due 3-idrossilasi. Abbiamo valutato l’attività in vivo di presunti candidati alla produzione di 3-idrossifloretina e Sb mediante produzione de novo nel lievito modello. Abbiamo scoperto che le proteine CYP98A delle accessioni di Malus selvatico erano in grado di produrre 3-idrossifloretina, portando infine all’accumulo di Sb mediante co-espressione con PGT2. Nel loro insieme, si è documentata la prima prova di un enzima che produce Sb in vivo che potrebbe essere coinvolto nella fase chiave di idrossilazione verso la sintesi di Sb nelle specie Malus