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CUADERNO DE PRÁCTICAS DE PCIT Alumna: Asignatura: Curso:

Gabriela Sánchez - ​mgabriela.sanrod@educa.jcyl.es PCIT → Procesamiento Citológico y Tisular 2º Anatomía Patológica y Citodiagnóstico

Gabriela Sánchez Cuaderno PCIT - 1ª Evaluación

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ÍNDICE: 26.10.2020 → INSERCIÓN O INCLUSIÓN EN PARAFINA

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27/28.10.2020

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→ TALLADO DE MUESTRAS

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04.11-2020

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→ MICROTOMO: DEVASTADO DE MUESTRAS

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09.11.2020 → INSERCIÓN O INCLUSIÓN EN PARAFINA

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10.11.2020

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→ MICROTOMO: DEVASTADO → CRIOSTATO O CRIOTOMO

9 9

11.11.2020

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→ INCLUSIÓN EN PARAFINA → MICROTOMO: CORTE DE LA MUESTRA → CRIOSTATO O CRIOTOMO

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13.11.2020

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→ PARAFINA

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16.11.2020 → MICROTOMO: CORTE DE LA MUESTRA

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26.10.2020 → INSERCIÓN O INCLUSIÓN EN PARAFINA Material y reactivos: Debe conocerse primero todo el material y reactivos necesarios, esta lista nombra y enumera -en las imágenes- los elementos más notorios de esta práctica: ​Parafinador (dispensador de parafina), pinzas -​al menos dos pares para ir intercambiándolas durante el procedimiento​-, cassettes, moldes, parafina, placa de refrigerio.

Procesamiento o pasos a seguir: Se toma la muestra en el ​cassette -guardadas en la parte derecha del parafinador-​ , se abre la tapa del cassette con las manos y se retira la tapa -sujetando la parte grande, que contiene la muestra, con las pinzas y tirando de la tapa hacia arriba con la mano izquierda, la tapa se desecha y se mantiene la muestra dentro de la caja del cassette en la placa caliente del parafinador-.

En la siguiente imágen se observan las muestras suspendidas en parafina caliente, y sobre la parte plástica del parafinador un cassette abierto que contiene una muestra de tamaño mediano-grande.

Se coge el molde más acorde con el tamaño de la muestra que tenemos -pequeño / mediano / grande- y se sitúa bajo el ​dispensador de parafina que contiene el parafinador; a continuación mientras lo sujetamos con la mano izquierda a cierta altura para que el goteo caiga de forma constante y no se formen burbujas en el fondo del molde -ya que esto derivaría en artefactos o dificultades a la hora de cortar la muestra- dispensamos parafina hasta que la base del molde quede levemente cubierta y la llevamos a la placa caliente del parafinador; ahí la situamos en horizontal en la parte central del molde y con las pinzas calientes -deberemos ir cambiando las pinzas, además existe en el parafinador una serie de porta pinzas cuyo objetivo es mantenerlas calientes, almacenarlas y sujetarlas- tomaremos la muestra que habíamos mantenido en el cassette y la situamos en el molde, apretando con las pinzas de forma que quede lo más pegada a la base posible, situamos la base del molde sobre la placa fría que contiene el dispensador de parafina para que solidifique la parte inferior de la parafina con la muestra en el lugar que deseamos colocarla -más adelante esta base será la parte superior de la muestra, la que tendremos que devastar-; rápidamente colocaremos el cassette sobre el molde y rellenaremos el mismo con más parafina -procurando que no se enfríe la muestra para evitar burbujas o dobles capas de parafina seca-; tras rellenar el cassette con el molde lo colocamos sobre la ​placa fría complementaria para que solidifique y lo dejamos reposar.

Tras un breve periodo de espera, podemos sacar la muestra pegada al cassette -mediante parafina- del molde, para ello sujetaremos el molde y le daremos unos golpes en su parte inferior sobre una superficie plana, de modo que queden separados el molde por un lado y el cassette con la muestra, ahora situada, en vez de dentro del mismo en su parte inferior y adherida con parafina sólida.

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Esta es la placa de frío externa al dispensador de parafina, se trata de una placa cuya base se encuentra refrigerada (en clase a -5ºC) cuyo objetivo es refrigerar la base de los moldes donde se incluye la muestra en parafina para enfriarlos de forma constante y homogénea, consiguiendo así un enfriamiento paulatino de la parafina para que durante el resto del procedimiento mantenga un estado óptimo de la inclusión de la muestra en la parafina.

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Selección de imágenes seriadas del proceso de inserción en parafina Elección del cassette

Elección del molde más acorde al tamaño de la muestra

Posicionamiento y orientación de la muestra → primero sobre la placa caliente y después sobre la fría para que solidifique la parafina

Apretar el cassette

Colocar el cassette sobre el molde

Dispensar más parafina para que solidifique junto al cassette y mantener la muestra identificada

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Verter parafina líquida en la base del molde

Situar el conjunto sobre la placa fría externa para poder seguir parafinando

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27/28.10.2020 → TALLADO DE MUESTRAS Material y reactivos: Dos pares de pinzas, bisturí desechable, campana de flujo laminar, pincel, tinta china y xilol, muestras fijadas en formol, cassettes nombrados, recipiente con formol para guardar los cassettes montados.

Procesamiento o pasos a seguir: Previo al tallado debe organizarse la campana, con todos los materiales y reactivos necesarios.

Los tejidos de los que vamos a sacar las muestras deben de estar previamente fijados en formol, y debemos comprobar que toda su totalidad ha sido fijada correctamente, de lo contrario, si las muestras no están bien fijadas el resto del proceso será inservible.

Cogeremos la muestra que deseamos tallar y la colocaremos sobre un papel para que escurra el formol sobrante, una vez escurrida, la sujetamos con las pinzas cortamos pequeños trozos -de menos de 0,5 cm de ancho- de manera que estos quepan en los cassettes; introducimos estas muestras cortadas en los cassettes, previamente identificados, y anotaremos de qué tipo de muestra se trata; una vez identificado el cassette, lo cogemos con las pinzas y la introducimos en el recipiente con formol -asegurándonos de que queda hundido-.

Repetimos el proceso 10 veces, una por cada cassette que tenemos, intentando no repetir muchos de los órganos o cogiendo diferentes partes de los órganos -por ejemplo: del pulmón cogemos una muestra de tráquea, y otra de órgano-.

Selección de imágenes explicativas En estas dos imágenes se observa cómo se corta un órgano, el corazón en concreto; se observa que el papel de filtro está humedecido, causa de haberlo escurrido sobre la parte central que es donde íbamos a tallar el órgano, pero también se observa otra sección de órgano, pulmón, que ya está escurriendo para la toma de la siguiente muestra. El recipiente de la derecha es donde se encuentran los órganos ya fijados en formol; y el recipiente de la derecha es donde se sitúan los cassettes con la muestra en formol hasta su procesamiento.

En la segunda imágen se observa el tamaño de la muestra tomada respecto al tamaño total del cassette, existen diferentes tamaños de cassettes, aunque en clase utilizamos unos universales.

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Aquí se puede observar una buena disposición de todos los materiales dentro de la campana para su óptima utilización

Selección de imágenes seriadas de un tallado de corazón

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04.11-2020 → MICROTOMO: DEVASTADO DE MUESTRAS Material y reactivos: Microtomo, muestras en cassettes, cuchillo o tijera, dos cuchillas para el microtomo, pinceles (uno de limpieza y uno para sujetar el corte).

Introduzco una imágen de un microtomo tipo MINOT para visualizar sus partes generales: Procesamiento o pasos a seguir: Previo al devastado y a cualquier actividad en la que se precise el uso del microtomo, debemos asegurarnos, de que está el seguro de la manivela derecha -​mecanismo de avance-​ echado, la cuchilla no está puesta, y su seguro de sujección (pestaña) está sin poner -para que no ceda con el paso del tiempo y del uso- y el cubrecuchillas está también puesto -seguro para no cortarte-.

Primero de todo debemos colocar la ​cuchilla de devastado en el portacuchillas del microtomo, para ello retiramos el seguro de la cuchilla -cubrecuchillas-, y con cuidado de no cortarnos, colocamos la cuchilla, apretamos la pestaña que la sujeta en su posición y colocamos el seguro para no cortarnos hasta que empezemos a devastar.

Cogemos el cassette con la muestra y con el cuchillo o tijera, retiramos la parafina que excede por los lados del cassette; una vez realizado este paso, vamos a colocar el cassette en el porta cassettes -​ portabloques-​ del microtomo, de forma que la punta del mismo quede orientada hacia el lado izquierdo del microtomo -esta elección es general para toda la clase, pero puede variar según laboratorios-.

Colocamos la orientación de la base del microtomo a 9º y la anclamos con su pestaña; situamos la ruleta de corte -​ selector del grosor de corte​- en 20 micras para devastar; por último antes de cortar, debemos centrar a ojo la cuchilla con la parte externa de la muestra del cassette, lo haremos con la manivela del lado izquierdo del microtomo -​ ruleta macro​-.

Una vez preparado el microtomo, retiramos el seguro de la cuchilla -cubrecuchillas- y comenzamos a girar la manivela de avance, que avanzará en cada vuelta las 20 micras que hemos seleccionado; a partir de aquí, giramos la manivela hasta que en los cortes que salgan se vea que abarca la totalidad de la muestra que queremos estudiar.

Repetiremos este proceso con tres muestras y después debemos dejar el microtomo limpio y en las mismas condiciones en las que lo hemos encontrado.

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09.11.2020 → INSERCIÓN O INCLUSIÓN EN PARAFINA Nos hemos dedicado, en diferentes grupos, a realizar diferentes tareas en el laboratorio, en mi grupo nos ha tocado la ​“inserción en parafina”​ de las 10 muestras que tallamos el otro día.

Hoy además he realizado parte del cuaderno que me quedaba por completar.

10.11.2020 → MICROTOMO: DEVASTADO En diferentes grupos hemos ido realizando diferentes tareas, la primera hora de hoy hemos vuelto a devastar,​ esta vez las 10 muestras que incluimos en parafina ayer.

→ CRIOSTATO O CRIOTOMO Al acabar de devastar mis muestras y sabiendo que hacía falta tallar más muestras para procesarlas y así tener más muestras con las que trabajar en clase, he encendido la campana extractora y me he dedicado a tallar más muestras.

Hoy con el criostato nos hemos dedicado a atender a la ​explicación de cómo funciona​, dónde está el freno de la manivela de avance, dónde se sitúa la muestra, cómo se cambia el grosor de corte con los botones de la parte que tiene automática, y cómo se pone “a 0” el contador de vueltas que se le ha dado a la manivela, hemos visto dónde está la pestaña que sujeta la cuchilla, aunque no hemos podido quitarla, porque al estar a temperaturas bajo 0º la calentaríamos y no se podría cortar con ella hasta que volviese a enfriarse; hemos visto el sistema anti rolling, aunque en el criostato de clase este sistema no funcione como debería.

[No tengo fotos de clase] Gabriela Sánchez Cuaderno PCIT - 1ª Evaluación

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11.11.2020 → INCLUSIÓN EN PARAFINA La primera hora hemos incluido varias muestras en parafina. Mientras lo hacían mis compañeras y hasta que ha llegado mi turno me he dedicado a realizar apuntes.

→ MICROTOMO: CORTE DE LA MUESTRA La ​preparación previa del microtomo es similar a la realizada los días anteriores para el devastado, la diferencia consiste en que para el corte debemos coger 4 portaobjetos, y encender los baños de flotación para que estén calientes cuando vayamos a cortar; por último, debemos asegurarnos a qué grosor de corte se encuentra la ruleta del microtomo, pues debemos cortar entre 4 y 6 micras de grosor.

Como las muestras ya están devastadas podemos proceder a cortar las muestras, para ello colocamos una ​cuchilla nueva o en buen estado ya que son muy sensibles y frágiles, y el mal estado de una cuchilla puede llevar a observar artefactos a la hora de visualizar la muestra al microscopio.

El procedimiento de “​corte”​ es el mismo que el de devastado, pero en este caso debemos tratar de sacar tiras continuas para después situarlas en el baño de flotación -a una temperatura de 50ºC → debe ser siempre menor de 60ºC porque a esa temperatura se fusiona la parafina-, donde podremos separar los cortes que consideremos que se encuentran en mejores condiciones para elegirlo, se separan cuidadosamente los cortes elegidos, y después procedemos a “​pescarlos”​ con el portaobjetos para su posterior procesado hasta su observación al microscopio.

Selección de imágenes explicativas Obtención de la tira

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Imágenes del baño de flotación: se observan portas ya montados y restos de la tira en flotación

→ CRIOSTATO O CRIOTOMO La tercera hora de hoy nos hemos dedicado a manejar el criostato, hemos visto cómo preparar la muestra “en fresco” con OCT para congelarla y conservarla al meterla en la parte de almacenaje de muestras del criostato.

Hemos querido dedicarnos a cortar, pero apenas nos ha sido posible porque la cuchilla no cortaba bien, al final y a base de probar hemos conseguido realizar unos cuantos cortes, pero habiendo movido la cuchilla hacia la izquierda para cortar con una parte que no estuviera tan desgastada, aún así para que los cortes no se enrrollasen sobre sí mismos hemos descubierto que haciendo dos devastados antes de probar a cortar a 4 micras era la forma más fácil de poder lograr los cortes con el criostato; en este equipo, debemos utilizar pinceles -que siempre debe estar dentro del criostato para mantener su temperatura- para sujetar el corte, y justo antes de terminar de cortar la muestra -cuando estamos cortando ya el final del bloque de OCT- colocamos la parte superior del porta (previamente marcado) sobre el corte que hemos realizado, de esta forma se adhiere por impronta.

13.11.2020 → PARAFINA Hoy hemos parafinado, el objetivo que tenemos ahora es, a la hora de parafinar, colocar, situar y orientar bien las muestras dentro del molde para que al realizar los cortes la muestra se encuentre bien situada, centrada y orientada.

El tiempo que no he parafinado he estado haciendo apuntes.

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16.11.2020 → MICROTOMO: CORTE DE LA MUESTRA Hoy me ha tocado cortar al microtomo y pescar las muestras la primera hora; esta hora me he dado cuenta de que había más cosas que preparar antes de empezar a cortar con el microtomo, otros días no me habré dado cuenta de apuntarlo porque no me ha tocado prepararlo a mi: Antes de todo el proceso de corte debemos asegurarnos que las muestras que vamos a cortar están lo suficientemente frías para que el corte sea óptimo; para ello en el laboratorio contamos con bloques de hielo para situar las muestras que vamos a usar de forma que la parte superior se encuentre en contacto con el hielo, pero no de forma directa puesto que el contacto con agua puede desembocar en futuros artefactos, para evitar esto colocamos un papel film sobre el hielo para que las muestras no entren en contacto directo; además para enfriar la muestra durante el corte -se calienta por la temperatura ambiente y por la fricción constante con la cuchilla- contamos con unos hielos artificiales que enfrían pero no se derriten.

Las otras dos horas, aprovechando que no tenía prácticas de PCIT, he aprovechado para ir a clase de CIGI de 1º.

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