Casos de estudio y aplicaciones en ecología microbiana (1a ed.) by Programa Gestión de Proyectos, Universidad Nacional de Colombia.

ISBN: 978-958-783-224-2

CASOS DE

ESTUDIO

Y APLICACIONES EN

ECOLOGÍA

MICROBIANA

María Angélica Leal Leal Jimena Sánchez Nieves Yih Wen Fung

Editoras

Apoyan Facultad de Ciencias Dirección de Bienestar Programa Gestión de Proyectos Sede Bogotá

Casos de estudio y aplicaciones en ecología microbiana Primera Edición, noviembre, 2017 ISBN 978-958-783-224-2 Universidad Nacional de Colombia Facultad de Ciencias Sede Bogotá

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@PGPunal issuu.com/gestiondeproyectos COMITÉ EDITORIAL Grupo de Investigación Asociado Fisiología del Estrés y Biodiversidad en Los textos presentados en la siguiente publicación expresan la opinión de sus respectivos autores y la Universidad Nacional de Colombia no se compromete directamente con la opinión que estos pueden suscitar.

Plantas y Microorganismos Directora Grupo de Investigación Luz Marina Melgarejo Editoras María Angélica Leal Leal Jimena Sánchez Nieves

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Esta obra deberá ser citada del siguiente modo:

Diana C. Luque V. (PGP)

Autores capítulo. (2017). Nombre del capítulo. En:

Diseño y Diagramación

Leal, M., Sánchez, J. & Fung, Y. Casos de estudio y aplicaciones en ecología microbiana. Bogotá, Colombia: Universidad Nacional de Colombia.

Nicole Angie Calderón Castañeda (PGP) Impresión GRACOM Gráficas Comerciales

Editoras María Angélica Leal Leal Bióloga. Maestría Ciencias Biología (En Curso). Coordinadora grupo de Astrobiología Universidad Nacional de Colombia. Jimena Sánchez Nieves Bacterióloga. M.Sc. Microbiología. Candidata Ph.D. ciencias Agrarias. Docente Asociada, dedicación exclusiva, departamento de Biología. Facultad de Ciencias. Universidad Nacional de Colombia. Yih Wen Fung Microbióloga Industrial. M.Sc.. Microbiología. Docente departamento de Biología, Facultad de Ciencias. Universidad Nacional de Colombia. Evaluadoras Liliana Figueroa Bióloga. Especialista en docencia de la biología de la Universidad Javeriana. Especialista en docencia mediada por las TIC de la Universidad San Buenaventura Magister en ciencias agrarias con énfasis en Suelos y Aguas de la Universidad Nacional de Colombia. Nataly Ramirez Bacterióloga del colegio mayor de Cundinamarca. Maestría en diseño y gestión de procesos de la Universidad de la Sabana (en curso)

contenido

6 Agradecimientos

7 Presentaciรณn

9 Microorganismos, biorremediaciรณn/ biodegradaciรณn: generalidades y aplicaciones

37 Aspectos generales sobre microorganismos endĂłfitos y epĂfitos: casos de estudio

57 Microorganismos en ambientes extremos: el desierto como caso de estudio

77 Diversidad molecular de microorganismos del suelo: estudio caso de microorganismos de manglar

97 Uso de microorganismos entomopatĂłgenos para el control de insectos-plaga

Agradecemos al Programa de Gestión de Proyectos de la Universidad Nacional de Colombia, pues ha sido un apoyo para la publicación de este libro, especialmente Elizabeth Moreno. A Bienestar de la Facultad de Ciencias; al profesor Luis Fernando Ospina por permitirnos llevar a cabo este proyecto. A la diseñadora Nicole Calderón quien hizo posible que este libro sea el producto final que es hoy. A Diana Consuelo Luque Villegas, correctora de estilo, quien hizo su mejor esfuerzo para que el libro tuviera la coherencia adecuada para nuestros lectores. A la Universidad Nacional de Colombia que nos ha formado, y a cada una de las Facultades, Departamentos y docentes que nos han construido en el camino de la academia. A nuestras familias y amigos por apoyar esta iniciativa.

AGRADECIMIENTOS

María Angélica Leal Leal, Jimena Sánchez Nieves y Yih Wen Fung Editoras

Lector: Casos de estudio y aplicaciones en ecología microbiana es el resultado del arduo trabajo del equipo de investigadores y estudiantes que conforman el grupo de Ecología Microbiana; así como las recopilaciones hechas con los años y difundidas dentro del grupo en las actividades propias de la discusión y el hacer ciencia. En pro de conducirlo a esta área del conocimiento, este libro, al consolidarse como la segunda publicación del grupo, espera poner en conocimiento una parte del amplio espectro de aplicaciones de los microorganismos en relación con su entorno, y dirige a todo lector interesado en este campo a las diferentes líneas de la investigación. El texto que ahora tiene en sus manos, si bien no abarca una gran extensión de temas, sí busca dar una mirada integral a los que aquí se presentan. Este es un libro recomendado para personas con un conocimiento y trabajo previo en ciencias biológicas, particularmente, microbiología; sin embargo, es nuestro deseo que las personas que se inician en el estudio de los microorganismos encuentren, en este material, una ruta para sus futuros trabajos. Esperamos que usted, estimado lector, pueda observar el trabajo que ha venido desarrollando nuestro grupo no solo en materia de resultados académicos sino también de formación de talento humano, ya que este último es el que permite que, hoy en día, Ud. cuente con este ejemplar en sus manos. Queremos resaltar el apoyo brindado por científicos con una amplia experiencia en sus áreas específicas, lo que manifiesta nuestro compromiso con la calidad en nuestro trabajo y el avance de la ciencia en nuestro país. Esperamos que disfrute este libro y que sea de gran provecho.

P R E S E N TAC I Ó N

Gracias por leernos.

MICROORGANISMOS, B IO R R E M EDI A CI Ó N / B IODE G R A D A CI Ó N : G ENE R A L ID A DE S Y A P L IC A CIONE S

1 Microbióloga Industrial. M.Sc.. Microbiología. Docente departamento de Biología, Facultad de Ciencias. Universidad Nacional de Colombia. 2 Bacterióloga. M.Sc. Microbiología. Candidata Ph.D. Ciencias Agropecuarias. Docente departamento de Biología. Facultad de Ciencias. Universidad Nacional de Colombia. 3 Tecnólogo Química Industrial. Técnico de apoyo Laboratorio de Microbiología. Departamento de Biología, Facultad de Ciencias. Universidad Nacional de Colombia. 4. Bióloga. Candidata M.Sc. Biología. Departamento de Biología. Facultad de Ciencias. Universidad Nacional de Colombia. Coordinadora Grupo Astrobiología Universidad Nacional de Colombia. 5 Biólogo. M.Sc. Microbiología. Docente Universidad Militar Nueva Granada. Cajicá. Colombia. 6 Bacterióloga. Candidata M.Sc. Microbiología. Posgrado Interfacultades Microbiología. Universidad Nacional de Colombia. 7 Bióloga. M.Sc. Medio Ambiente y Desarrollo. Universidad Nacional de Colombia. 8 Estudiante pregrado. Departamento de Biología. Facultad de Ciencias. Universidad Nacional de Colombia. 9 Bióloga. M.Sc. Microbiología. Docente Universidad Militar Nueva Granada. Cajicá. Colombia. 10 Estudiante pregrado. Facultad Ciencias Agrarias. Universidad Nacional de Colombia.

Fung, Yih Wen1 Sánchez, Jimena2 Ruíz, Elkin3 Leal, María4 Rivera, Hugo5 Torres, Johanna6 Boada, Luisa7 Córdoba, Paula8 Guevara, Camilo8 Hoyos, Ivanna8 Pulido, Marlon8 Sáenz, Andrés8 Miñana, Silvia8 Orozco, María9 Mejía, Jairo10

1. Introducción El desarrollo sostenible requiere de un continuo desarrollo y manejo ambiental, así como de la constante búsqueda de tecnologías verdes para tratar un amplio rango de hábitats acuáticos y terrestres contaminados por la aumentada intervención antrópica. La biorremediación es una herramienta que permite el tratamiento de residuos con miras a conservar el medio ambiente mediante la degradación de compuestos contaminantes, empleando la actividad microbiana natural mediada por diferentes consorcios de microorganismos (Juwarkar, Singh, & Mudhoo, 2010). El suelo es uno de los recursos de mayor importancia para la sostenibilidad y supervivencia de los seres vivos; no obstante, su degradación, ocasionada por contaminación premeditada o accidental a partir de fuentes industriales, por salinización, anegamiento, entre otros, es un tópico de gran preocupación, ya que se genera pérdida de su fertilidad debido a cambios irremplazables en sus características o en las comunidades de organismos nativos. Se considera que, principalmente, las bacterias y los hongos son recicladores capaces de transformar compuestos químicos naturales y sintéticos en fuentes de energía y materia prima para su propio crecimiento, lo que implica que los procesos biológicos suplementan los procesos de remediación químicos y físicos, de tal forma que la biorremediación resulta ser de gran importancia para la descontaminación de suelos afectados a nivel mundial (Juwarkar et al., 2010). Por ejemplo, los problemas ambientales potenciales, que están ligados a la actividad agropecuaria, son de diversa índole y corresponden, principalmente, a la contaminación por uso de fertilizantes, plaguicidas y por residuos de origen animal (en el caso de producción animal confinada a espacios reducidos). Adicionalmente, la degradación del suelo se puede ver reflejada en la pérdida de materia orgánica, nutrientes, erosión y pérdida de diversidad. Los ecosistemas se encuentran conectados regionalmente por diversos mecanismos, los cuales incluyen el transporte de materiales y energía a través de largas distancias, además del movimiento migratorio y de dispersión de organismos. Como resultado, es frecuente que lo que suceda en un ecosistema repercuta en otro. Muchos efectos ambientales de la actividad agropecuaria son poco significativos a escala de predio, pero al ser sumados pueden tener repercusiones en otros ecosistemas como lagunas o estuarios, o en componentes de índole regional o global como el agua subsuperficial o la atmósfera (Oesterheld, 2008). En este contexto, la biodiversidad microbiana, así como la determinación de actividades enzimáticas del suelo, son parámetros biológicos usados con diferentes propósitos como indicadores de productividad, como medida indirecta de la biomasa microbiana y como indicador potencial del suelo para descomponer distintos materiales orgánicos (compost, residuos orgánicos, lodos activados, etc.), como indicadores de posible contaminación con metales pesados o plaguicidas, entre otros; por lo tanto, parámetros que describen

MICROORGANISMOS, BIORREMEDIACIÓN/BIODEGRADACIÓN: GENERALIDADES Y APLICACIONES

funciones, cantidad y diversidad de microorganismos del suelo son usados como indicadores biológicos de la salud y calidad del suelo (Anacona, 2008). Infortunadamente, un gran número de sistemas agrícolas tropicales son insostenibles debido, principalmente, a la degradación física del suelo, la generalizada erosión y la carencia de un reabastecimiento de nutrientes causado por las cosechas de cultivos, las fuertes lluvias y la rápida descomposición de la materia orgánica (Uribe et al., 2010). Se han desarrollado estrategias de biorremediación para el tratamiento de suelos contaminados, empleando microorganismos naturales y modificados genéticamente. La selección de la estrategia más apropiada de tratamiento, para ser aplicada en un sitio específico, debe considerar aspectos fundamentales tales como: factibilidad que la sustancia contaminante sea biotransformada en un compuesto menos tóxico, biodisponibilidad de la misma para los microorganismos y viabilidad para la optimización de los bioprocesos (Dua, Singh, Sethunathan & Johri, 2002).

2. Aspectos generales sobre algunos microorganismos y procesos de biorremediación/biodegradación Es importante establecer algunos conceptos (Hoyle & Arthur, 2000) relacionados con la diferencia entre biorremediación (adición de materiales en ambientes contaminados para producir una aceleración del proceso natural de biodegradación) y biodegradación (proceso natural mediante el cual los microorganismos efectúan biotransformación de compuestos parentales en metabolitos, mediante mineralización). Según Vidali (2001), dentro de las condiciones más relevantes que afectan la degradación microbiana de xenobióticos se encuentran la humedad, el pH y el tipo de suelo, el contenido de nutrientes para favorecer el crecimiento microbiano, la temperatura, la presencia de compuestos contaminantes no demasiado tóxicos y la presencia de metales pesados. Se han empleado diversas técnicas en biorremediación, dependiendo del grado de saturación y aireación de un área. Las técnicas in situ (bioventilación, biodegradación inducida, biosparging, bioaumentación, atenuación natural) son aquellas que se aplican al suelo y aguas subterráneas con mínima perturbación del sitio, en tanto que las técnicas ex situ (landfarming, compostaje, biopilas) se aplican cuando estos han sido removidos de su ubicación original por excavación o bombeo. Adicionalmente, Vidali (2001) menciona que dentro de las ventajas que ofrece el proceso de biorremediación se destaca que: Es un proceso natural, por tanto, es percibida públicamente como un proceso para tratamiento de desechos aceptable para materiales contaminados, incluyendo el suelo, ya que los microorganismos degradadores aumentan su población cuando está presente el contaminante, y la disminuyen cuando este desaparece; los residuos del tratamiento son, a menudo, inofensivos e incluyen (CO2, agua y biomasa celular); en lugar de transferir material contaminado de un ambiente a otro, por ejemplo, del suelo al aire o al agua, dicho proceso permite lograr la

degradación completa de los contaminantes objetivo; la biorremediación es mucho menos costosa que otras tecnologías usadas para la limpieza de sustancias contaminantes. Dentro de las desventajas de la biorremediación, se consideran los siguientes aspectos: las técnicas se limitan solo a aquellos compuestos que son biodegradables. No todas las moléculas son susceptibles de degradación completa y rápida; se pueden presentar casos donde los productos de degradación sean más persistentes o, incluso, más tóxicos que el compuesto original; los procesos biológicos son muy específicos; es difícil extrapolar condiciones de laboratorio o escala piloto a operaciones a gran escala; no hay tecnologías eficaces para biorremediación en sitios donde hay mezclas complejas de contaminantes que no están uniformemente distribuidas en el ambiente o están en diferente fase (vapor, líquido, sólido); la biorremediación toma un tiempo más largo que otras tecnologías, como la excavación y remoción de suelo o incineración; no hay claridad respecto a los criterios aceptables de desempeño del proceso. El procedimiento de degradación microbiana de un compuesto xenobiótico se lleva a cabo en un tiempo determinado, lo que permite su fácil y eficaz aplicación, sin que se presenten posibles efectos adversos para el ambiente con su utilización, ya que se trabaja con los microorganismos que normalmente ya están presentes (autóctonos). Los microorganismos pueden degradar multitud de compuestos, tales como cloruro de etileno, PCB, gasolina, derivados del petróleo, compuestos con dos y tres grupos nitro, herbicidas nitrogenados y trinitrotolueno, hidrocarburos policlorados (incluyendo pentaclorofenol), tetracloroetileno, dicloroetileno y cloruro de vinilo, entre otros, bajo condiciones distintas. En la biodegradación, los microorganismos usualmente implicados son principalmente bacterias, aunque esta también puede ser efectuada por hongos, bacterias filamentosas ramificadas (actinomycetes) y algas, las cuales pueden degradar los compuestos tóxicos en productos secundarios no tóxicos (Valencia et al., 2002). En términos generales, los microorganismos biodegradadores se pueden subdividir en los siguientes grupos (Vidali, 2001): Aeróbicos (se ha destacado el papel de los géneros Pseudomonas, Alcaligenes, Sphingomonas, Rhodococcus y Mycobacterium en la degradación de plaguicidas e hidrocarburos, compuestos alcanos y poliaromáticos, en donde pueden usar los compuestos contaminantes como única fuente de carbono y energía); anaeróbicos (con aplicaciones en la degradación de bifenilos policlorados (PCB) en sedimentos de río, decloración del solvente tricloroetileno y cloroformo); hongos ligninolíticos (como los Phanaerochaete chrysosporium que tienen la habilidad de degradar un rango extremadamente diverso de contaminantes ambientales, e incluyen paja, aserrín o tusa de mazorca); metilotrofos (con la participación de la enzima metano monooxigenasa que es activa contra un amplio rango de compuestos, incluyendo compuestos alifáticos clorados tricloroetileno y 1,2-dicloroetano).

MICROORGANISMOS, BIORREMEDIACIÓN/BIODEGRADACIÓN: GENERALIDADES Y APLICACIONES

La presencia de plaguicidas biodegradables en ecosistemas naturales puede ocasionar la proliferación de carga microbiana activa, capaz de incrementar el índice de descomposición de estos; no obstante, eso no garantiza su transformación a formas más simples y menos tóxicas. Por lo tanto, para que la biodegradación sea un proceso efectivo, los microorganismos deben atacar enzimáticamente los contaminantes, convirtiéndolos en compuestos inocuos (Maroto & Rogel, 2000). Algunos autores (Hoyle & Arthur, 2000) plantean que la biotransformación se efectúa, principalmente, mediante mecanismos de catabolismo (rompimiento enzimático de los enlaces de las moléculas del plaguicida para obtener energía y/o fuente de carbono o nitrógeno), cometabolismo (el microorganismo que crece sobre un sustrato produce enzimas que, adicionalmente, degradan un segundo compuesto) y excreción de enzimas extracelulares (digestión microbiana de compuestos complejos). Igualmente, existen tres formas de abarcar la degradación microbiana; estas difieren entre sí, según el tipo de enzimas que implementen, los productos metabólicos finales y, las transformaciones químicas que sufran las moléculas iniciales, considerando sus rutas metabólicas en sincronía o no con otras: 1. Mineralización: es la transformación completa del sustrato a moléculas que entrarán primero al metabolismo central, antes de conllevar a un rompimiento completo de los metabolitos a productos finales inorgánicos como el agua y el dióxido de carbono (CO2). Estas reacciones determinan la generación de energía y las moléculas de carbón útiles para procesos de crecimiento y reproducción microbiana, con un condicionante ambiental (ej. PAH). 2. Co-transformación metabólica: es la utilización de sustratos de crecimiento o esenciales, simultáneamente, con sustratos de no crecimiento o, también denominados fortuitos. 3. Oxidación no específica: es la utilización de enzimas dioxigenasas multicomponente y otras oxigenasas, las cuales, en primera instancia requieren del elemento oxígeno para activarse y, posteriormente, insertarse dentro del sustrato (ej. PAH). En particular, el cometabolismo ha sido reportado como una estrategia de biomineralización de compuestos químicamente complejos y no necesariamente involucra una sola clase o especie de microorganismo, puesto que la biodegradación parcial de alguna molécula compleja, conlleva a la formación de metabolitos intermediarios, los cuales pueden resultar nocivos para otros microorganismos. Por ello, estos intermediarios desaparecerán eventualmente, hasta que algún microorganismo diferente lo haga; esta es una razón de por qué los consorcios microbianos son más efectivos en la biomineralización, que solo un microorganismo (Nzila, 2013; Waigi et al., 2015). Por lo anterior, es importante describir cuáles son los mecanismos que determinan el cometabolismo. En las bacterias, las reacciones cometabólicas suceden

por las enzimas oxigenasas microbianas, por ejemplo: metano mono oxigenasa (MMO, por sus siglas en inglés), tolueno mono y di oxigenasa, amonio mono oxigenasa, bifenil oxigenasa, entre otras. La MMO ha sido la más estudiada y posee dos formas: i. La forma soluble (sMMO), asociada al citoplasma de unos pocos metanótrofos, y ii. La forma particulada (pMMO), presente en la membrana celular de la mayoría de los metanótrofos. Las enzimas MMO han mostrado tener una especificidad de amplio espectro, lo cual, implica que pueden oxidar a más de 300 compuestos diferentes a su sustrato natural (metano). En términos mecanicístas, cualquiera de las mono o di oxigenasas inician este proceso por la conversión del contaminante aromático a intermediarios dihidroxiaromáticos. Luego, las intradiol o extradiol oxigenasas rompen un anillo, usando oxígeno, entre los grupos hidroxilo (clivaje meta) o proximales a uno de los dos grupos hidroxilos (clivaje orto). Los productos obtenidos son encaminados a transformaciones adicionales, antes de entrar al ciclo de Krebs. Estas vías catabólicas han sido agrupadas en clivajes peripheral (o via superior) y ring (o via menor). Los primeros pasos de la transformación de compuestos mono y di aromáticos (tales como: fenol, tolueno y naftaleno, entre otros), usualmente, conllevan a la formación de catecol, protocatecuato, gentisato, los cuales, más adelante, serán clivados y transformados como intermediarios del ciclo de Krebs. Para el caso de aromáticos policíclicos (con más de tres anillos), primero, ellos son transformados a moléculas pequeñas más simples y, luego, siguen las rutas ya descritas (compuestos mono y di aromáticos), hasta que sean transformados en intermediarios del ciclo de Krebs (Nzila, 2013). De otro lado, en cuanto al metabolismo de moléculas cloradas, estas siguen las mismas rutas de las mono y di oxigenasas ya mencionadas. En términos generales, estas moléculas tienen baja especificidad por moléculas cloradas; sin embargo, esta limitación es superada con la expresión de altos niveles de las enzimas (ello debido a la acumulación de biomasa, la cual es producto de la asimilación de los sustratos de crecimiento). En ese sentido, las moléculas que tienen un bajo número de átomos de cloro (menos de cinco), son más susceptibles al ataque de esas enzimas, en contraste con las moléculas con más anillos de cloro, las cuales, son más recalcitrantes a la oxidación de tales enzimas (Nzila, 2013). En relación con los hongos, se efectúan procesos de degradación para la obtención de alimento y pueden ser saprófitos, simbióticos y parásitos (Boa, 2005). Como organismos heterótrofos, los hongos obtienen los nutrientes por absorción, tienen un metabolismo quimioheterótrofo, obteniendo la energía y el carbono de compuestos orgánicos; calificándolos como los descomponedores por excelencia (Potón et al., 2002). Es así como participan en los ciclos naturales de reciclado del carbono y otros elementos presentes en la naturaleza. La capacidad de degradación se le atribuye a los mecanismos de acción que estos organismos poseen, un pool enzimático (exoenzimas) particular no solo degrada materia orgánica (MO) sino que es, en la actualidad, una herramienta estratégica en los procesos de degradación de compuestos con-

MICROORGANISMOS, BIORREMEDIACIÓN/BIODEGRADACIÓN: GENERALIDADES Y APLICACIONES

taminantes. En este apartado, se revisarán algunos ejemplos de los mecanismos de acción para la biodegradación de estos microorganismos, según una clasificación con implicaciones no taxonómicas, pero comúnmente utilizada: micromicetos y macromicetos. Los hongos denominados micromicetos son aquellos que no suelen observarse a simple vista, suelen ser anamorfos (fase asexual) y no están relacionados con una clasificación taxonómica concreta o real. En la biodegradación, estos hongos son muy importantes ya que, aunque no sean fácilmente observables, pueden encontrarse en cualquier ecosistema tanto terrestre como acuático. A nivel de los ecosistemas acuáticos, los hongos que pertenecen a la división Chytridiomycota (que también suelen ser considerados erróneamente como protistas) son los preponderantes saprótrofos de material alóctono de aguas epicontinentales y océanos, además de utilizar como sustrato algas ya en descomposición. Dentro de este material alóctono, se encuentra el polen y diversos materiales vegetales que se encuentran en las laderas de ríos y lagos (Dix & Webster, 1995). Los mecanismos en los que estos hongos realizan descomposición de la materia orgánica (MO) aún no se han estudiado en profundidad; sin embargo, como muchos microorganismos, por ejemplo algunos oomycetes y varios grupos de bacterias, se puede ver que los chytridios presentan una enzima especial diferente a las presentes en otras eucariotas en el proceso de la glucólisis, llamada enzima acetato quinasa, la cual permite obtener acetil-CoA, gracias a la fosforilación del acetato gracias a ATP (IngramSmith, Martin & Smith, 2006). El que los hongos acuáticos puedan degradar la MO en los sistemas acuáticos los hace muy importantes, ya que, a diferencia de muchos otros grupos de hongos, son residentes de estos ecosistemas, en vez de ser transitorios o verse incapacitados de proliferar en este ambiente por la fuerte condición de anaerobiosis (Dix & Webster, 1995). Esto tiene diversas aplicaciones en la recuperación de ecosistemas acuáticos, pudiendo ser una solución a la eutrofización de lagos, puesto que, a medida que aumenta el número de algas, puede darse un exceso de materia orgánica a ser degradada, además de que muchos de los chytridios son parásitos de algas, como lo es el ampliamente estudiado ejemplo de las diatomeas del género Asterionella, las cuales son afectadas por el hongo Rhizophydium planktonicum (Dix & Webster, 1995). Cuando se habla de los micromicetos en ambientes terrestres, se suele pensar principalmente, en los anamorfos, específicamente, del filo Ascomycota, lo que, anteriormente, se conocía como Deuteromycota (Mims & Alexopoulus, 1985). Estos hongos se encuentran en cualquier ecosistema y, al tener reproducción asexual, les asegura una dispersión más eficiente para colonizar nuevos ambientes. Las enzimas que estos hongos utilizan para degradar la MO son muy diversas, pero en géneros tan comunes como Cladosporium, Alternaria y Penicillium, los cuales son relativamente fáciles de observar en muestras ambientales. Uno de los sustratos que se asocian con la MO son los residuos vegetales, porque estos se encuentran llenos de energía lista para

ser utilizada. Se ha reportado (Baldrian et al., 2011) que enzimas celulolíticas como la celobiohidrolasa y la β-glucosidasa, y enzimas quitinolíticas como la quitobiosidasa y la N-acetilglucosaminidasa. A pesar de lo anterior, curiosamente, la actividad enzimática de estos hongos a la que se encuentra sujeta la hemicelulosa no parece ser tan abundante como la de la quitina y la celulosa (Baldrian et al., 2011). Esto muestra que puede que haya muchos hongos que tengan un pool enzimático muy similar; sin embargo, dependiendo del sustrato, también podrá variar su respuesta. Por ejemplo, como ya fue mencionado, hongos del género Penicillium pueden degradar la celulosa y otros polímeros; mas, algunas especies como Penicillium purpurogenum pueden degradar la queratina, siendo de gran utilidad para el ciclo de los nutrientes en el ecosistema, ya que la queratina es la proteína animal más abundante (Nwadiaro et al., 2015), sin contar, la cantidad de residuos de origen animal que podrían reducirse con el uso de estos microorganismos. En cuanto a los macromicetos, estos corresponden al segundo grupo que se desea mencionar dentro del reino Fungi, siendo este grupo el de mayor número de especies conocidas, ya que, aquí, se encuentran hongos del filo Basidiomycota y Ascomycota [64000 especies, aproximadamente, solo para filo Basidiomycota (Mueller et al., 2007)]. Este grupo se caracteriza por poseer un carpóforo completamente visible al ojo humano; en su mayoría, son hongos saprófitos, caracterizados, también, por asociarse con plantas en procesos de simbiosis, conocidos como ectomicorrizas. La manera de obtener el alimento es, para estos hongos, la clave de la degradación de algunos compuestos potencialmente contaminantes. Al poseer características saprófitas, algunos de estos hongos tienen la capacidad de degradar, específicamente, compuestos con base en el carbono, cualidad que se le atribuye a la degradación exoenzimática de la lignina y la celulosa, mecanismos de acción fundamentales para el entendimiento del cómo de la degradación de compuestos complejos (Castillo-Rodríguez, 2005). De acuerdo con la literatura, los mecanismos de acción de los macromicetos no son específicos, esto permite que posean la capacidad de adaptarse y degradar compuestos que, a nivel químico, son similares a la lignina y a la celulosa. Por lo anterior, de acuerdo con el tipo de degradación de la MO, se han clasificado los hongos por el tipo de maderas que pueden degradar. Los tres tipos básicos de pudrición (degradación) son: pudrición blanca, pudrición parda o castaña y pudrición blanda (Luley, 2006; Murace et al., 2010). La pudrición blanca se le atribuye a los hongos del filo basidiomycota, los cuales tienen la capacidad de degradar, en primer lugar, la lignina, para acceder a la celulosa, su sustrato principal; la acción enzimática cambia el color marrón de los troncos a uno más claro, observándose de color blanco. Este cambio de color evidencia la degradación de la lignina, dado que ella exhibe de manera natural un color oscuro. A nivel químico, la degradación de estos compuestos se realiza a través de tres mecanismos principales:

MICROORGANISMOS, BIORREMEDIACIÓN/BIODEGRADACIÓN: GENERALIDADES Y APLICACIONES

1. Sistema de degradación de lignina (SDL): se caracteriza por actuar de manera extracelular, se vinculan hemoproteínas conocidas como peroxidasas específicamente lignino peroxidasa (LiP) y manganeso peroxidasa (MnP), enzimas productores de peróxidos como las glioxal oxidasa y aryl alcohol oxidasa, lacasas, compuestos como alcoholes y ácidos orgánicos. el conjunto de estos compuestos realiza ataques de tipo oxidativo a los compuestos orgánicos formando compuestos de menor complejidad, radicales libres biodisponibles para ser degradados por otros organismos presentes en el medio; 2. Fase I del metabolismo: igual que el SDL, se caracteriza por ser un mecanismo de tipo oxidativo, hacen parte las enzimas citocromo P-450 monooxigenasas, las cuales se encargan de incluir en los compuestos a degradar, un átomo de oxígeno, dando como resultado la formación de un epóxido y agua, facilitando la disponibilidad para la degradación de los compuestos resultantes. 3. Fase II del metabolismo: a diferencia de los dos anteriores, este tipo de mecanismo es de tipo reductivo, las enzimas catalizan reacciones de conjugación, adicionando al sustrato compuestos como el glutatión o derivados del azúcar, con el fin de hacerlos más solubles en agua y, así como en los demás mecanismos, reducir la complejidad de degradación de los compuestos. Las enzimas mediadoras de estas reacciones son, entre otras, la glutatión-transferasa, la sulfotransferasa y la glucosil-transferasa. Este tipo de mecanismo fue descubierto recientemente, como resultado de las pruebas de degradación de compuestos xenobióticos específicamente (Luley, 2006; Quintero-Díaz, 2011). La pudrición marrón o castaña se caracteriza por la degradación de celulosa y hemicelulosa, los organismos causantes de esta degradación, exponen la celulosa y la hemicelulosa, debilitando químicamente la capa de lignina, sin degradarla. Este tipo de pudrición, al igual que la pudrición blanca, se da por hongos basidiomicetes. Con relación a las enzimas, las encargadas de originar dicha degradación poseen una estructura relativamente grande, en comparación con la estructura de la pared celular de la madera, lo que conlleva a utilizar sistemas no enzimáticos con base en hierro y peróxido de hidrógeno en las primeras fases de descomposición. La acción que ejerce las enzimas sobre la celulosa se describe, básicamente, como un rompimiento de la molécula en varios puntos (Luley, 2006; Calaza, 2007). La pudrición blanda, a diferencia de la pudrición blanca y marrón, es realizada, en su mayoría, por hongos del filo ascomycota; su ataque enzimático se da a nivel de la celulosa y se presenta antes de la pudrición blanca y marrón. El proceso de degradación de la celulosa se conoce como celulosis y consiste en la hidrólisis de la celulosa a través de tres (03) enzimas particulares: i. Endoglucanasa (CMcasa): ataca en los enlaces β 1-4 de la celulosa, formando fragmentos de oligosacáridos solubles; ii. Exoglucanasa (avicelasa): separa el

disacárido celobiosa desde los extremos de la molécula y iii. Glucosidasa (celubiasa): hidroliza la celobiosa formando glucosa la cual es más fácil de degradar (Ramírez & Coha, 2003; Cruz, Castellanos & Argüello, 2009). Si bien se clasifican los hongos de acuerdo con el tipo de pudrición que exhiben, no son excluyentes una de la otra; es por esto que se pueden encontrar, en la naturaleza, hongos que pueden degradar tanto lignina como celulosa y hemicelulosa. Estos sistemas o mecanismos de degradación son utilizados como medios para la obtención de energía y carbono; sin embargo, como se mencionó con los hongos de pudrición blanca, su mecanismo de degradación es funcional en cuanto a la degradación de compuestos xenobióticos y/o contaminantes. Luego de la segunda revolución industrial se elevaron de manera exponencial las emisiones de contaminantes al ambiente, causando deterioro acelerado de elementos de la naturaleza, alteración de ciclos biológicos y geoquímicos, pérdida de hábitats, entre otros. La concientización de estos efectos demandó, de los gobiernos, soluciones a estos problemas a fin de mitigar los efectos de la contaminación (tratados internacionales). Una de las alternativas que entrega la naturaleza es precisamente el papel de los hongos dentro del sistema, dado que su capacidad degradadora juega un papel fundamental en la descontaminación de ecosistemas tanto terrestres como acuáticos. Estudios muestran que los hongos son vitales en los procesos de bioacumulación de metales pesados (producto de procesos productivos como la minería); metales como el cadmio, mercurio, cobre, zinc, entre otros son captados por los hongos y bioacumulados, dentro de los cuales se destacan: Agaricus macrosporus, como mayor representante bioacumulando cadmio; Boletus pinophillus para el mercurio; Coprinus comatus para el plomo; Lepista nuda y Macrolepiota procera para el cobre; Calvatia utriformis y Lactarius deliciosus para el zinc (Alonso et al.,2004). Sin embargo, no solo son los metales pesados los que pueden ser diana de los hongos, como ya se ha mencionado, compuestos como los hidrocarburos, residuos textiles, residuos agroindustriales y plásticos, entre otros, funcionan en estos casos como sustratos degradables por estos organismos; ejemplos como la acción de Pleurotus sp. sobre hidrocarburos y compuestos agroindustriales, Chrysosporium sp. sobre plaguicidas y, en general, los hongos de pudrición blanca sobre estos compuestos ponen a disposición una alternativa biotecnológica efectiva y limpia para contrarrestar los efectos de la producción de bienes y servicios (Castillo-Rodríguez, 2005; Quintero-Díaz, 2011).

3. Generalidades sobre la biorremediación con microorganismos en minería de oro Actualmente, la explotación de oro es un eje importante en la economía de Colombia y, con las políticas públicas que fomentan esta actividad, se espera un incremento en el número de minas. No obstante, el incremento de la actividad minera llevaría consigo un aumento en la descarga, en cuerpos de agua, de residuos de la explotación, como el cianuro o metales pesados. Desde hace varios

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años se han implementado diferentes técnicas de mitigación de estos contaminantes en la industria, ya sea de manera natural o con ayuda del hombre. En la actualidad, la biorremediación se postula como una buena alternativa en la degradación de cianuro debido a sus bajos costos de operación, su efectividad en la disminución y remoción de sustancias tóxicas, y su bajo impacto en el ambiente. Asimismo, se han identificado varios microorganismos, tanto bacterias como hongos, con distintas rutas metabólicas, las cuales les permiten utilizar el cianuro como fuente de carbono y nitrógeno, por lo que pueden resultar útiles en el proceso de biorremediación. Finalmente, en Colombia son pocas las investigaciones en este tema; no obstante, esta técnica representa una excelente salida a las problemáticas asociadas a los malos procedimientos de manejo de residuos, como la minería ilegal, o para el saneamiento de aguas contaminadas.

4. Generalidades del proceso de extracción de oro La minera aurífera es una actividad industrial, la cual genera un impacto significativo tanto a nivel macroeconómico como en la economía local de Colombia y constituye una fuente de empleo importante. Adicionalmente, este sector es componente fundamental en las exportaciones colombianas, representando el 21,3% para el año 2011 (Cárdenas-Reina, 2008). De igual forma, según se evidencia en el Plan Nacional de Desarrollo actual del país, la minería es uno de los principales ejes de la economía (Departamento Nacional de Planeación, 2014). Durante los últimos años, la minería ha ganado participación dentro de la actividad económica del país (Escobar & Martínez, 2014) de tal forma que, para el año 2014, Colombia tuvo una producción de oro de 57,0 toneladas, solo detrás de Perú, México y Brasil, siendo Antioquia el departamento con mayor producción minera, representado en mayor área de explotación (García-Jacome, 1978). El oro es caracterizado y adquiere su valor comercial debido a la baja reactividad química que presenta, razón por la cual se requiere de agentes complejantes, como el cianuro y el mercurio, para los procesos de extracción (Echeverry, 2015). El proceso para la disolución del oro utilizado, principalmente a nivel industrial, es la lixiviación con cianuro. Debido a sus bajos costos y a su alto rendimiento en la extracción, este método es empleado en aproximadamente el 90% de las minas a nivel mundial, en altas cantidades (Akcil, 2003). El oro disuelto asociado a cianuro es usualmente recuperado con carbón activado mediante métodos como carbón en pulpa (CIP), carbón en lixiviación (CIL), entre otros (Llorente-Gómez, 1991). El proceso de amalgamación con mercurio es mayoritariamente empleado de forma artesanal, debido a la sencilla recuperación del metal en relación con la lixiviación, puesto que puede ser recuperado incluso mediante el calentamiento de la amalgama (Unidad de Planeación Minero Energética, 2007); empero, es poco utilizado a nivel industrial debido a sus bajos rendimientos en comparación con la lixiviación.

5. Residuos generados en el proceso de extracción de oro Después de la extracción y purificación del oro, se obtienen materiales del tamaño de arena y limo en forma de lodo, así como aguas de lavado estériles, con residuos de metales pesados como mercurio y compuestos como el cianuro (Sánchez, 2000). Estos desechos, en muchos casos, como en el de la minería ilegal, son vertidos al ambiente, generando una afectación directa. De forma paralela, en algunas industrias, al final del proceso de extracción, las aguas de relave y estos materiales son generalmente depositados en presas, donde se realiza el proceso de mitigación y disminución de las concentraciones de estos contaminantes antes de que se liberen al medio ambiente. Actualmente, cada empresa de concesión minera está en la obligación de poseer planes específicos de manejo de agua de relave, en donde consideran la estabilidad física y química de la presa o del método de contención utilizado desde el inicio de la descarga, durante toda la vida operativa de la mina, e incluso después del cierre de la misma (Organización Panamericana de la Salud, 2016).

6. Sistemas de manejo de residuos Hoy en día, existen varias metodologías con las cuales la industria reduce la concentración de metales pesados y compuestos estériles, como cianuro. Con relación al cianuro, existen vías de tratamiento, tales como la degradación natural y la intervención humana. La atenuación natural consiste en la volatilización, con posteriores transformaciones atmosféricas, hacia compuestos inocuos, este proceso suele estar mediado por exposición a la luz o a la precipitación, o puede ocurrir por el metabolismo de microorganismos del suelo, absorción por minerales, carbono orgánico o arcillas presentes en el relave. En cuanto a los procesos mediados por el hombre, se encuentran algunas estrategias patentadas y estandarizadas, como la oxidación química con SO2/ aire, el proceso de tratamiento con H2O2 o el proceso de cloración alcalina (Logsdon, Hagelstein, & Mudder, 1999). La oxidación con SO2 provoca la precipitación del cianuro acomplejado, este puede aplicarse a los lodos directamente y la reacción es rápida. El peróxido de hidrógeno permite la precipitación de complejos de hidróxidos metálicos, y convierte al cianuro en amonio y carbonatos (Remus, Aguado-Monsonet, Roudier, & Delgado-Sancho, 2013). Actualmente, un compuesto muy utilizado para el tratamiento es el ácido de caro, el cual actúa de manera muy parecida a como lo hace el peróxido de hidrogeno, pero acompañado con ácido sulfúrico, lo que acelera la oxidación (Gaviria & Meza, 2006), este agente también se emplea como compuesto oxidante para descomponer el cianuro en solución.

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7. Problemas asociados a reactivos y residuos del proceso de extracción

Como se ha visto anteriormente, dependiendo del grado de tecnificación del proceso de extracción del oro se pueden producir distintos contaminantes. En la minería artesanal de pequeña escala (ASGM, por sus siglas en inglés), el más importante es el mercurio (Pinedo-Hernández, Marrugo-Negrete, & Díez, 2015); mientras que el cianuro, utilizado como el principal elemento del proceso de lixiviado en el 90% de la producción mundial, es considerado como el principal contaminante en procesos de extracción de mediana y gran escala (Johnson, 2015). Tanto el cianuro como el mercurio pueden tener efectos negativos directos e indirectos en la salud humana y afectar a los ecosistemas donde son liberados. En primer lugar, las mayores emisiones de mercurio son causadas por la ASGM, con casi 727 toneladas anuales, lo que representa el 33% de todas las emisiones de origen antrópico [United Nations Environment Programme (UNEP), 2013]. Durante el proceso de extracción de oro, se calienta la amalgama para separarlo del mercurio; entonces, los vapores de mercurio pueden depositarse en el suelo o en el sedimento de cuerpos de agua como lagos, ríos e incluso el mar [World Health Organization (WHO), 2013]. Una vez allí, es transformado en metilmercurio (MeHg) por bacterias reductoras de sulfato, como Desulfovibrio desulphuricans, y bacterias reductoras de hierro, como Geobacter sulphurreducens (Hu et al. 2013). El MeHg puede ser absorbido por fitoplancton e ingerido por zooplancton y peces, acumulándose, así, a lo largo de la cadena alimenticia (WHO, 2013). Se ha encontrado que el MeHg puede comprometer la reproducción y el desarrollo embrionario de los peces, y causar cambios hormonales, degeneramiento motor y problemas reproductivos en mamíferos y aves piscívoras. También se ha visto reducción de la expresión del receptor de N-metil-D-aspartato (NMDA) en el cerebro de visones y osos polares, así como acumulación de Hg en el cerebro de belugas (Lozano et al., 2013). En los seres humanos, la exposición al mercurio ocurre por dos vías: puede ser inhalado, desde los vapores de amalgama, o puede ser ingerido, a través de los peces que lo han acumulado. En poblaciones cercanas a yacimientos de oro donde se utiliza el mercurio, se han encontrado altas concentraciones de mercurio en orina (de 50 a 100 μg de mercurio/g-creatinina). Además, se han identificado problemas neurológicos, disfunción renal y disfunciones autoinmunes en personas expuestas a mercurio en África, Asia y América del Sur (WHO, 2013). Al contrario de lo que ocurre con el mercurio, el cianuro utilizado en minería no se acumula en el cuerpo ni genera enfermedades crónicas. Además, dado que la radiación UV y el oxígeno gaseoso lo degradan en compuestos de carbono y nitrógeno, el cianuro no se acumula en el suelo, agua o aire (Kuyucak & Akcil, 2013). No obstante, es posible que altas concentraciones de cianuro resulten tóxicas dada su capacidad de unirse al hierro del grupo hemo, inhibiendo la actividad de la citocromo oxidasa c en la cadena respiratoria; además, se ha visto que el cianuro puede inhibir otras enzimas importantes, como: la catalasa, la peroxidasa, la succinato deshidrogenasa y la ácido ascórbico oxidasa (WHO, 2004).

Un estudio realizado en una comunidad ubicada en cercanías a un área de extracción de oro en Malasia encontró que la concentración de tiocianato en orina (usado como medida indirecta de la exposición al cianuro) era mayor que en los controles, y que en la comunidad existía una alta prevalencia de dolores de cabeza, mareos e irritación en piel y ojos (Hassan et al., 2015). Aparte del cianuro libre, durante el proceso de cianuración, se generan otros productos derivados de la degradación de este compuesto, como los complejos metálicos de cianuro, tiocinanato, nitrato y amoniaco, cada uno de ellos con un perfil de toxicidad específico (Nava-Alonso et al., 2007). En primer lugar, la acumulación de nitratos puede afectar los ecosistemas acuáticos al favorecer el florecimiento algal, reducir la cantidad de oxígeno disuelto y aumentar la mortalidad de los peces (Kuyucak & Akcil, 2013); mientras que, en los seres humanos, los efectos deletéreos de los nitratos sobre la salud se evidencian más profundamente en bebés, al generar metahemoglobinemia (o síndrome del bebé azul), la cual compromete su desarrollo al reducir la cantidad de oxígeno que llega a los tejidos (Sohail & Adeloju, 2016). En segundo lugar, la acumulación de tiocianato, que se produce por la reacción del cianuro con azufre durante la aireación o la lixivación, puede generar problemas de glándula tiroides en humanos (Kuyucak & Akcil, 2013), y si es tratado con cloro para eliminar el cianuro, puede producirse cloruro de cianógeno (CNCl), que es un gas altamente tóxico (Nava-Alonso et al., 2007). En tercer lugar, el amoniaco, producido durante la hidrólisis del cianato o la oxidación del cianuro (Nava-Alonso et al., 2007), genera mortalidad de peces al producir estrés oxidativo, inmunosupresión y degeneración hepática (Li et al., 2006). En mamíferos, el amoniaco genera daños hepáticos, desencadenando encefalopatías hepáticas, producto de acumulación de glutamina en el cerebro, que conlleva a la acumulación de agua en astrocitos, afectando la función neuronal (Aldridge, Tranah & Shawcross, 2015). Varios de estos problemas ecológicos y de salud podrían ser solucionados usando microorganismos que degraden estos compuestos químicos.

8. Microorganismos degradadores de cianuro en el proceso de extracción del cianuro A pesar de la alta toxicidad del cianuro para organismos vivos, algunos microorganismos son capaces de tolerar sus efectos tóxicos y, en algunos casos, incluso pueden integrarlo en su metabolismo como fuente de carbono y nitrógeno para convertirlo en compuestos inocuos. Esto permite el uso de dichos microorganismos para la degradación de cianuro de los desechos tóxicos industriales (tales como los producidos por la minería), una aplicación que tiene, además, otras ventajas: es un proceso amigable con el medio ambiente y de bajos costos operacionales, capaz de remover un amplio rango de compuestos cianúricos. Varias son las bacterias que han sido descritas como capaces de degradar el cianuro; particularmente comunes son las pertenecientes a los géneros Pseudomonas y Bacillus, aunque también se han descritos especies de los gé-

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neros Alcaligenes, Acinetobacter y Burkholderia. Además, se han aislado, caracterizado y probado bacterias degradadoras de cianuro para evaluar su potencial aplicación en biorremediación, donde las más estudiadas han sido las especies del género Pseudomonas, por su presencia en aguas de desecho de las minas o plantas industriales (Chen et al., 2005; Baxter & Cummings, 2006; Luque-Almagro et al., 2005a, 2005b, 2008, 2016; Naveen et al., 2011). Pseudomonas pseudoalcaligenes, por ejemplo, es capaz de crecer bajo condiciones alcalinas en medios y ambientes con cianuro, cianatos y diversos complejos metálicos de este compuesto, usándolos como fuente única de nitrógeno (Luque-Almagro et al., 2005a). Por un lado, estas especies tienen un crecimiento y acción biodegradadora óptima a un pH de 9,5 (Luque-Almagro, Moreno-Vivián & Roldán, 2016) y su efectividad está dada por la variedad de rutas metabólicas que integra el cianuro que utilizan (Gupta, Balomajumder & Agarwal, 2010). Por otro lado, el valor biotecnológico de P. pseudoalcaligenes se ve aumentado significativamente al considerarse que durante la biodegradación del cianuro en procesos industriales de joyería, ocurre una acumulación de polihidroxialcanoatos (PHA), bioplásticos con un prometedor futuro en aplicaciones biotecnológicas (Xi et al., 2016). Se destaca un estudio (Khamar, Makhdoumi-Kakhki & Mahmudy-Gharaie, 2015) en el que se aislaron bacterias de una balsa de residuos de una mina de oro de la provincia de Khorasan-Razavi en Irán, evaluando el efecto de varios factores como: el pH, la temperatura y el tamaño del inóculo en el proceso de remediación del cianuro. El resultado más interesante fue la caracterización del género de Halomonas (posiblemente H. daqingensis) que no se había reportado antes en la literatura. Otro resultado novedoso de esta investigación fue la descripción de una bacteria degradadora de cianuro, cuya secuencia del gen del ribosoma 16S es similar a la de Streptococcus lactarius, pero con diferencias lo suficientemente altas como para poder discutir que es un taxón nuevo. Al igual que con las Pseudomonas, dichos investigadores llegaron a la conclusión de que un pH de 9,5 optimiza la biodegradación del cianuro por parte de los géneros Halomonas y Streptococcus. Igualmente, encontraron que la remoción de cianuro se aumenta a temperaturas de 25°C, a tamaños de inóculos de 2,5%v/v y en co-cultivos de los dos géneros, debido a que Halomonas sp producía formamida como residuo de la biodegradación de cianuro; con esto, se puede concluir que estas bacterias siguen una ruta hidrolítica. Otras bacterias comúnmente halladas en la literatura son las del género Bacillus (Akcil & Mudder, 2003; Chen et al., 2005; Dubey & Holmes, 1995; Khamar et al., 2015; Mekuto et al., 2013). Se ha reportado (Mekuto et al., 2013) un consorcio del género Bacillus, aislado de aguas de desecho de una planta de galvanizado en Cape Town (Sudáfrica) que logró una eficiencia de degradación de cianuro del 90% a un pH de 9,5. Se sabe, además, qué especies de Bacillus logran esta degradación por medio de la cianuro dioxigenasa (B. pumillus) o la rhodanasa (B. subtilis y B. stearothermophilus).

De otro lado, Burkholderia cepacia es otra bacteria con gran potencial de biorremediación, reportando una eficiencia de degradación de cianuro del 80% a una temperatura de 30°C y un pH de 10 (Adjei & Ohta, 2000); no obstante, en presencia de Cu2+ o Fe2+ en una concentración de 1mM, el crecimiento y el potencial biodegradador se inhibieron. Un caso curioso es el de Klebsiella oxytoca, con reporte de eficiencias de degradación muy contrastantes, siendo en un caso del 99,9% (Chen et al., 2008) y en otro de apenas el 26% (Kao et al., 2003). Lo anterior, posiblemente, fue explicado porque mantuvieron las bacterias en condiciones aerobias, lo que inhibió la acción de la nitrogenasa, enzima usada por estos microorganismos para la metabolización del cianuro. Adicionalmente, otras bacterias descritas como biodegradadoras de cianuro son: Rhodococcus (Khamar et al., 2015; Nallapan et al., 2013), Arthrobacter (Gupta et al., 2010; Khamar et al, 2015), Brevibacterium imperialis (Ebbs, 2004; Cantarella et al., 2002), Corynebacterium (Gupta et al., 2010), Alcaligenes (Ingvorsen et al., 1991), Thiobacillus (Ebbs, 2004), Escherichia coli (Roshan et al., 2009), Agrobacterium (Roshan et al., 2009) y Flavobacterium (Roshan et al., 2009). Dentro de los hongos reportados como degradadores de cianuro se destacan los géneros Trichoderma y Fusarium (Ezzi & Lynch, 2005). Así como existe diversidad en los microorganismos degradadores de cianuro, existe también una amplia variedad en las rutas metabólicas que les permiten llegar a tal fin.

9. Bioquímica de la biodegradación de cianuro La biodegradación del cianuro se lleva a cabo por vías enzimáticas, cuyo éxito depende de diferentes variables ambientales, entre ellas: la concentración de cianuro en el medio extracelular, dado que, a altas concentraciones, se puede producir la degradación de enzimas importantes en el proceso (Baxter & Cumming, 2006). Por otro lado, la disponibilidad de nutrientes como el carbono y el oxígeno también es importante; esto se debe a que el carbono es un factor limitante en la degradación de complejos cianuro-metal, el cual podría evitar su biodegradación; mientras que el oxígeno es utilizado durante muchas de las vías de degradación conocidas (Ferguson et al., 2003). De igual forma, otro factor importante es la presencia de otros contaminantes que puedan afectar las poblaciones microbianas que llevan a cabo el proceso (Baxter & Cumming, 2006). En general, la naturaleza física del medio es de vital importancia, puesto que altera los procesos que afectan la disponibilidad de cianuro en el medio, estos: son absorción, desorción, difusión y disolución. Otros factores que afectan la tasa de degradación son la temperatura y el pH. Por un lado, las enzimas degradadoras de cianuro suelen ser producidas por organismos mesófilos. De igual forma, casi todas las enzimas tienen un pH óptimo entre 6 y 9; no obstante, se han registrado organismos capaces de realizar la degradación a un pH de 4 (Baxter & Cumming, 2006; Dash, Gaur & Balomajumder, 2009).

La biodegradación microbiana del cianuro puede ocurrir, en general, mediante cinco vías: oxidativa, reductiva, hidrolítica, de sustitución o transferencia, y de síntesis (ver tabla 1-1). Las primeras tres implican la conversión de cianuro en moléculas orgánicas o inorgánicas que, después, son convertidas a amonio, metano, CO2, ácido fórmico y ácido carboxílico. Las otras dos vías son para la asimilación del cianuro como fuente de carbono y nitrógeno. Cabe resaltar que los microrganismos pueden presentar más de una ruta de degradación del cianuro, como sucede en varias especies del género Pseudomonas (Gupta et al., 2010).

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Tabla 1-1. Vías de degradación del cianuro y enzimas involucradas.

Vía de degradación

Oxidativa

Enzimas involucradas

Ejemplos

Referencias

Cianuro dioxigenasa

P. putida

Granados (2014)

Cianuro monooxigenasa

E. coli

Harano et al. (1997)

Nitrogenasa

K. oxytoca

Dash et al. (2009)

Cianuro hidratasa

F. oxysporum

Gupta et al. (2010)

Nitrilo hidratasa

Arthrobacter sp.

Gupta et al. (2010)

Cianidasa

A. xylosoxidans, B. pumilus

Gupta et al. (2010)

Nitrilasa

Klebsiella ozaenae

Dubey & Holmes (1995)

Tiocianato hidrolasa

Thiobacillus thioparus

Katayama et al. (1998)

Rodanasa

E. coli, A. vinelandii, Thiobacillus sp., P. aeruginosa

Gupta et al. (2010)

3- mercaptopiruvato sulfotransferasa

E. coli

Spallarossa et al. (2004)

B-cianoalanina sintasa y

E. coli, Chromobacterium violaceum, B. megaterium

Gupta et al. (2010)

ácido y-ciano-aaminobutirico sintasa

C. violaceum

Dzombak et al. (2005)

Cianasa Reductiva

Hidrolítica

Transferencia /Sustitución

Síntesis

Fuente: Gupta, Balomajumder & Agarwal (2010).

9.1 Vía oxidativa Tres enzimas están involucradas en la conversión oxigenolítica del cianuro a dióxido de carbono y amonio, estas son: cianuro monooxigenasa, cianasa y cianuro dioxigenasa. Esta vía requiere de NADPH para catalizar la reacción (Gupta et al., 2010). Algunas bacterias como P. putida tienen la capacidad de degradar los compuestos de cianuro hasta CO2 y NH4, sin originar intermediarios por medio de la cianuro dioxigenasa (Deloya, 2012; Macías-Granados, 2014). Por el contrario, la cianuro monoxigenasa produce el ion cianato, el cual, posteriormente, será degradado por la cianasa hasta carbamato, el cual se hidroliza espontáneamente a amónico y dióxido de carbono, compuestos inocuos, en E. coli por ejemplo, la producción de esta enzima es inducida por sustrato y la enzima requiere bicarbonato como cofactor (Harano et al., 1997).

9.2 Vía reductiva Las vías reductivas para la degradación del cianuro son escasas y ocurren, por lo general, bajo condiciones anaeróbicas; son mediadas por la nitrogenasa, que produce la conversión de HCN a metano y amonio en un mecanismo de dos pasos (Gupta et al., 2010; Dash et al., 2009).

9.3 Vía hidrolítica Dentro de la vía hidrolítica, se han identificado cinco enzimas en diferentes sistemas microbianos: cianuro hidratasa, nitrilo hidratasa, tiocinato hidrolasa, nitrilasa y cianidasa. La enzima cianuro hidratasa convierte el cianuro en formamida (1), la cual es descompuesta a dióxido de carbono y amonio por la formamida hidratasa. Esta enzima se ha identificado, principalmente, en hongos; sin embargo, se tiene reporte de su presencia en bacterias del género Alcaligenes, donde funciona en conjunto con la amidasa y la cianuro hidrolasa, así como en P. fluorescens (Wang et al., 2011; Gupta et al., 2010). Se ha identificado potencial aplicación biotecnológica de hongos que presentan esta enzima (Basile et al., 2008). HCN + H2O ↔ HCONH2

(1)

La enzima nitrilo hidratasa degrada una amplia variedad de nitrilos, primordialmente de tipo alifáticos, produciendo amidas (2), la cual utiliza, como cofactores, el hierro o el cobalto y constituye una vía de degradación común en bacterias, aunque también se reporta su presencia en hongos, donde a veces también se encuentra junto con la amidasa, permitiendo la utilización de nitrilos alifáticos como fuente de nitrógeno y carbono (Gupta et al., 2010). R-C≡N + H2O → R-C(O)NH2

(2)

Finalmente, la cianidasa o cianuro dihidratasa convierte el cianuro en formato y amoniaco (3) y no requiere de cofactores. Por otro lado, la nitrilasa cataliza la hidrolisis de nitrilos, tanto alifáticos como aromáticos, a ácidos car-

boxílicos y amonio, sin la formación de intermediarios amida (4) (Dhillon et al., 1999). Por último, la tiocianato hidratasa cataliza la degradación de tiocianato, convirtiéndolo en sulfato y su amida correspondiente (Gupta et al., 2010). RCN + H2O ↔ RCOOH + NH3 (3) R-CN + 2 H2O = R-COOH + NH3 (4)

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9.4 Vías de sustitución transferencia

Las vías de sustitución/transferencia involucran asimilación de cianuro mediante su conversión a tiosulfato, ocasionando un aumento en el tamaño del microorganismo, debido a que representa una fuente de nitrógeno extra. Una de estas enzimas es la rodanasa, una tiosulfato sulfurotransferasa de distribución celular ubicua que cataliza la reacción, neutralizando la toxicidad del cianuro, convirtiéndolo en un producto menos nocivo (5) (Gupta et al., 2010). Tiosulfato + cianuro → sulfito + tiocianato

(5)

Esta enzima se encuentra ampliamente distribuida tanto en procariotas como E. coli, A. vinelandii, P. aeruginosa (Ezzi et al., 2003; Cipollone et al., 2004; Tabita y Silver, 1969; citados en Gupta et al., 2010), en hongos (Bowen et al., 1965) y mamíferos, debido a su capacidad de neutralizar el efecto tóxico de este compuesto; empero, su función fisiológica en los procariotas no se encuentra bien establecida. Otra enzima involucrada en este tipo de vía es la 3-mercaptopiruvato sulfuro transferasa, la cual convierte el 3-mercaptopiruvato a tiosulfato mediante dos reacciones, representadas en la ecuaciones 6 y 7, donde E es la enzima y S el sustrato (Gupta et al, 2010), además de estar involucrada en la detoxificación del cianuro (Ogata & Volini, 1990), se encuentra relacionada en el metabolismo del selenio y la vitamina B1, con localización ampliamente distribuida tanto en eucariotas, como Leishmania major, y procariotas, como E. coli (Williams et al., 2003; Spallarossa et al., 2004; citados en Gupta et al., 2010). HSCH2COCOO− +E ↔ CH2COCOO− +ES ES + CN ↔ E + SCN−

(6) (7)

9.5 Vías de asimilación Las vías de asimilación de cianuro se encuentran relacionadas con la β-cianoalanina, γ-ciano-β -amino butírico a partir del uso de residuos precursores de aminoácidos que reaccionan con cianuro para detoxificarlo. Una de estas es la β-cianoalanina sintasa, una enzima liasa, producida en gran cantidad durante el periodo de crecimiento activo microbiano y es la encargada de producir la reacción: L-cisteína + hidrogencianida à L-β cyanoalanina + hidrogensulfido (Nagahara, Ito & Minami, 1999).

Debido a la presencia de esta enzima, E. coli, C. violacium, B. megaterium, y otras especies (Dunnil & Fowden, 1965; Fowden & Bell, 1965; Goldschmidt et al., 1963; citado en Gupta et al., 2010) tienen la capacidad de convertir cianuro a β-cianoalanina que, posteriormente, se convierte en aminoácidos cuyos precursores pueden entran a la ruta de degradación del cianuro, generando un ciclo. La γ-ciano-α-acido amino butírico sintasa fue identificada como una enzima alternativa para la asimilación del compuesto (Gupta et al., 2010); aparentemente solo se encuentra en C. violaceum actuando como posible precursor para la síntesis de aminoácidos (Dzombak, Ghosh & Wong-Chong, 2005).

10. Aproximaciones experimentales en Colombia En Colombia, han sido pocas las investigaciones dedicadas a la caracterización de microorganismos degradadores de cianuro; sin embargo, vale la pena recalcar algunas aproximaciones experimentales en este tema, realizadas por investigadores nacionales. Por un lado, se ha reportado (Restrepo, Montoya & Muñoz, 2006) el aislamiento de P. fluorescens, de 6 plantas de beneficio de oro en Segovia (Antioquia); al evaluar su capacidad de degradar NaCN, encontraron que este microorganismo tenía una efectividad de biodegradación del 98% a concentraciones entre 100 y 500 ppm, lo que lo convierte en un candidato para el tratamiento de aguas residuales. A su vez, se han aislado tres consorcios de microorganismos de suelos provenientes de minas de oro en el municipio de Amalfí, Antioquia (Garcés et al., 2006), con porcentajes de biodegradación entre el 33% y el 53%. Por otro lado, existen investigaciones (Osorio, Márquez & Márquez, 2007) relacionadas con la caracterización morfológica, fisiológica y molecular de microorganismos acidófilos como Acidithiobacillus ferrooxidans y A. thiooxidans, aislados de drenajes ácidos en minas de oro artesanales del municipio de Marmata en Caldas; dichos autores indican que estos microorganismos tienen potencial en el proceso de bio-oxidación, que se presenta como un tratamiento en la extracción del oro que puede reducir la cantidad de cianuro usado durante la lixiviación. La investigación en microorganismos degradadores de cianuro resulta un campo interesante dada la gran variedad de organismos con esta capacidad, las múltiples vías metabólicas involucradas en este proceso, y esto, de la mano con el auge de la minería de oro en Colombia, puede ayudar a resolver los problemas ecológicos y las afectaciones en la salud humana relacionadas con el incorrecto manejo de estos residuos.

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ASPECTOS GENERALES S O B R E M IC R OO R G A NI S M O S END Ó F ITO S Y E P Í F ITO S : C A S O S DE E S T U DIO

1 Bacterióloga. M.Sc. Microbiología. Candidata Ph.D. Ciencias Agropecuarias. Docente departamento de Biología, Facultad de Ciencias. Universidad Nacional de Colombia. 2 Microbióloga Industrial. M.Sc.. Microbiología. Docente departamento de Biología Facultad de Ciencias. Universidad Nacional de Colombia. 3 Estudiante pregrado. Departamento de Biología. Facultad de Ciencias. Universidad Nacional de Colombia. 4 Bióloga. Candidata M.Sc. Biología. Departamento de Biología. Facultad de Ciencias. Universidad Nacional de Colombia. 5 Tecnólogo química industrial. Técnico de apoyo Laboratorio de Microbiología. Departamento de Biología. Facultad de Ciencias. Universidad Nacional de Colombia. 6 Ingeniero agrónomo. Facultad Ciencias Agrarias. Universidad Nacional de Colombia. 7 Biólogo. M.Sc. Microbiología. Ph.D. Biotecnología. Docente departamento de Biología. Facultad de Ciencias. Universidad Antonio Nariño.

Sánchez, Jimena1 Fung, Yih Wen2 Portillo, David3 Leal, María4 Ruíz, Elkin5 Pérez, Ricardo3 Navarro, Juan6 Vanegas, Javier7 Vivas, Daniel3 Fresneda, Samuel3 Lora, David3 Castillo, Luis3

1. Introducción El término endófito, etimológicamente, significa “dentro de la planta” y, en un principio, hacía referencia a cualquier organismo que colonizara el interior de los tejidos de las plantas; no obstante, Wilson (1995) fue quien restringió el término únicamente a microorganismos que no provocan daño aparente a la planta hospedera. En la actualidad, este término se refiere a bacterias, hongos, algas e insectos (Macías-Rubalcava et al., 2008), donde los hongos son los microorganismos que se han aislado con mayor frecuencia como endófitos (Kusari, Hertweck & Spiteller, 2012). Las primeras evidencias de asociación entre microorganismos endófitos y plantas se originaron de observaciones en tejidos y hojas fosilizadas; por lo cual, se puede inferir que la asociación planta-endófito pudo haber ocurrido junto con la aparición de las primeras plantas en la tierra (Strobel, 2003; Zhang, Song & Tan, 2006). Como resultado de esa larga asociación, es posible que algunos de estos microorganismos endófitos hayan adquirido un sistema genético para transferir información desde la planta hospedera a ellos, o viceversa. Las bacterias endófitas residen en tejidos de las plantas, principalmente en espacios intercelulares, raramente en espacios intracelulares y dentro de tejidos vasculares, sin causar síntomas de enfermedad en la planta (Hurek et al., 1994; Bell et al., 1995). Los microorganismos endófitos pueden tener diversas aplicaciones. La diversidad de bacterias endófitas representa apenas una pequeña fracción de la diversidad total existente en la naturaleza. Informaciones derivadas de estudios comparativos indican que apenas una pequeña fracción de los microorganismos en la naturaleza (entre 0,1% a 10%, dependiendo del hábitat) es cultivable mediante empleo de métodos microbiológicos convencionales (Randjard, Poly & Nazaret, 2000; Green & Bohannan, 2006). Comunidades de bacterias endófitas han sido aisladas de plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas comerciales, en especies de árboles forestales (Brooks et al., 1994; Cankar et al., 2005), frutales (Whitesides & Spotts, 1991; Vega et al., 2005; Lacava et al., 2006), plantas herbáceas como caña de azúcar (Jacobs, Bugbee, & Gabrielson, 1985), soya (KuklinskySobral et al., 2004) y orquídeas (Tsavkelova et al., 2007), entre otras.

2. Microorganismos endófitos y epífitos, y su relación con la producción de compuestos volátiles Las interacciones entre microorganismos vecinos, a través de la producción de metabolitos de pequeño tamaño, le permiten a los microorganismos responder y adaptarse a los cambios ambientales. El estudio de las interacciones intercelulares se ha centrado, principalmente, en metabolitos solubles; no obstante, los microorganismos también producen y liberan a su microambiente una amplia variedad de metabolitos secundarios volátiles, cuyas funciones ecológicas, por lo general, han sido pasadas por alto. Sin embargo, se sabe que los compuestos volátiles bacterianos contribuyen a diferentes interacciones entre reinos (animales, plantas, hongos y nematodos) (Audrain et al., 2015).

ASPECTOS GENERALES SOBRE MICROORGANISMOS ENDÓFITOS Y EPÍFITOS: CASOS DE ESTUDIO

Algunas bacterias, recientemente, han sido estudiadas como mediadoras en la producción de compuestos volátiles con función atrayente o repelente de insectos, algunas de estas [relacionadas con actividad promotora de crecimiento vegetal (PGPB, del inglés: Promoting Growth Plant Bacteria)] influyen en la activación de resistencia SAR (del inglés: Systemic Acquired Resistance) en plantas, generando compuestos volátiles en la planta, con función atrayente de insectos benéficos y repelente de insectos plaga u otros patógenos vegetales (Song & Ryu, 2013). Así mismo, se han estudiado otras bacterias endófitas, como generadoras de compuestos volátiles, las cuales repelen insectos plaga en determinadas plantas que ya han sido consumidas por estos, simulando un sistema de marcaje en las plantas o un tipo de advertencia que repele los insectos, tal como es el caso de la bacteria fastidiosa Candidatus liberibacter asociada con el psílido asiático (Diaphorina citri) en plantas de cítricos (Mann et al., 2012); este fenómeno ha sido estudiado en otros insectos en casos de herbivoría, donde se evidencia la pérdida de la función de herbivoría por la inoculación de micelio seco o extractos provenientes del crecimiento de hongos en plantas, demostrando la probable capacidad del insecto de detectar toxinas provenientes de cultivos fúngicos, lo que, a su vez, se demuestra en la baja incidencia de insectos herbívoros en plantas afectadas por microorganismos fitopatógenos (Carroll, 1991). Adicionalmente, se ha encontrado que algunas plantas, como la flor cadáver (Amorphophallus titanum), utilizan como estrategia para atracción de polinizadores (moscas y escarabajos), la expulsión de aromas fétidos, característicos de los cadáveres animales, cuyos aromas son provenientes, en su mayoría, de bacterias asociadas (Shirasu et al., 2010; Paczkowski & Schütz, 2011). Las sustancias químicas que producen las plantas se clasifican como compuestos primarios y secundarios (Grajales-Conesa, Meléndez-Ramírez & Cruz-López, 2011). Los primarios tienen diversas funciones vitales y los secundarios son importantes para la defensa, como el látex y las resinas (debido al contenido de sustancias tóxicas y/o repelentes) o para la atracción de polinizadores, como el aroma y el néctar de las flores, teniendo un papel importante en la reproducción (Grajales et al., 2011; Pichersky & Gershenzon, 2002; Heldt, 2005; Gershenzon & Dudareva, 2007; Pacini, Viegi & Franchi, 2008). Dentro de estos compuestos secundarios, los volátiles de los aromas florales constituyen una antigua e importante forma de comunicación entre las angiospermas con sus polinizadores, enemigos naturales y herbívoros (Knudsen & Tollsten, 1993; Dobson, 1994; Dobson & Bergström, 2000; Pichersky & Gershenzon, 2002; Piechulla & Pott, 2003; Raguso, 2008). Generalmente, los aromas florales están compuestos por mezclas de terpenos, derivados de ácidos grasos, compuestos aromáticos y otras sustancias emitidas por las flores (Pichersky & Gershenzon, 2002). La emisión o la secreción de metabolitos secundarios que inhiben o facilitan el crecimiento de bacterias pueden tener un impacto sobre la distribución de bacterias en diferentes partes de la planta (Bednarek & Osbourn, 2009), así como se

observa en la mayoría de las flores, donde la generación de diferentes tipos de sustancias por parte de la planta tienen un efecto antimicrobiano que restringe la microbiota existente en ellas (Krimm et al., 2005; Junker et al., 2011). Similares a las hojas, las flores ofrecen superficies colonizables, pero han recibido mucha menos atención debido a intereses en las repercusiones económicas y sociales graves, las cuales son causadas por microorganismos patógenos (Windels, 2000). En la actualidad, poco se conoce acerca de las bacterias que crecen en las flores de las plantas o sobre las que no tienen efectos perjudiciales obvios en la reproducción de las plantas (Vidaver & Lambrecht, 2004). Sin embargo, el néctar y exudados del estigma y el polen ofrecen excelentes medios de cultivo para los microorganismos (Brysch-Herzberg, 2004), y el sistema de polinizadores y otros mecanismos de difusión de polen, proporcionan las condiciones ideales para la dispersión de los microorganismos (Giles et al., 2005). En el estudio de Navarro (2015), se buscó la presencia de microorganismos (principalmente bacterias) cultivables, asociados a las flores de fresa con potencial actividad, como atrayentes de abejas que participan en la polinización del cultivo, ampliando el conocimiento de las interacciones entre plantas, microorganismos e insectos, que funcionen como posibles alternativas de manejo agronómico y que, a su vez, permitan incrementar el número de poblaciones de abejas polinizadoras asociadas al cultivo de fresa, a partir del uso de compuestos volátiles emitidos por los microorganismos, encontrando que existen levaduras con la capacidad de atraer insectos polinizadores (A. mellifera); posiblemente, debido a la producción de compuestos volátiles o algún tipo de señal olfativa. En este contexto, se podría pensar que la adaptación a condiciones de altas concentraciones de azúcares, facilita la permanencia, de manera eficiente, en nichos de flores y néctar de estas levaduras epifitas o de superficies de flor y que las abejas han aprendido a asociar la presencia de estas levaduras con fuentes de interés, como lo es el néctar o el polen. Finalmente, existen innumerables funciones ecológicas de estos metabolitos secundarios volátiles microbianos, los cuales contribuyen en diferentes relaciones entre organismos, incluso entre reinos y que aún se desconoce su importancia. Actualmente, en Colombia se están estudiando estas funciones, principalmente, en las relaciones benéficas, planta-microorganismo-insecto, debido a la importancia agrícola de estas interacciones (Navarro, 2015).

3. Microorganismos endófitos y epífitos, y su relación con herbivoría A lo largo de su historia evolutiva las plantas han desarrollado una gran cantidad de mecanismos para defenderse frente a sus depredadores, uno de estos ha sido el desarrollo de interacciones con otros organismos, especialmente, microorganismos hongos y bacterias (Rosenthal & Berebaum, 1992). Estos últimos han sido de gran importancia pues, gracias a ellos, las plantas han logrado colonizar diferentes ambientes sin importar lo difíciles que sean las condiciones.

ASPECTOS GENERALES SOBRE MICROORGANISMOS ENDÓFITOS Y EPÍFITOS: CASOS DE ESTUDIO

La interacción hongo-endófito-planta es una de las más exitosas e interesantes adaptaciones, ya que se tienen registros de presencia de hongos endófitos en plantas de bosques tropicales, boreales y templados, y, del mismo modo, la diversidad de hospederos también resulta ser extensa puesto que se presentan desde musgos hasta angiospermas (Arnold, 2007). Los hongos endófitos, usualmente, toman los nutrientes que necesitan de la planta hospedera y, en retribución, algunos de ellos desempeñan un papel mutualista induciendo su crecimiento y produciendo metabolitos secundarios con gran diversidad estructural que le brindan protección y resistencia a la planta (Sánchez-Fernández et al., 2013). La protección que el hongo le brinda a la planta puede ser contra factores bióticos (patógenos y herbívoros) y/o contra factores abióticos (estrés salino, térmico, presencia de metales, etc.) y puede darse mediante diferentes mecanismos de acción de hongos endófitos en defensa a herbivoría: (i) Directamente por la producción de metabolitos secundarios con actividad anti patogénica; (ii) indirectamente induciendo la expresión de mecanismos de defensa química y fisiológica del hospedero y (iii) en respuesta a la ocupación del nicho ecológico por otros organismos (Sánchez-Fernández et al., 2013). El primer mecanismo (de protección directa) se lleva a cabo por medio de la producción de enzimas y/o metabólicos secundarios por parte del hongo, los cuales han sido evidenciados en diferentes estudios (Strobel et al., 1996; Schulz et al., 2002), donde se demuestra que la producción de algunos compuestos con actividad biológica, como el taxol, eran producidos por ciertas especies de hongos del género Pestalotiopsis, los cuales eran hospedantes de especies arbóreas del género Taxus. Otro ejemplo de este mecanismo de defensa es la producción de compuestos orgánicos volátiles del hongo endófito Muscodor yucatanensis, aislado de Bursera simaruba (Burseraceae). Los extractos orgánicos derivados del medio de cultivo y del micelio de M. yucatanensis y, principalmente, la mezcla de los compuestos orgánicos volátiles que produce son letales para los fitopatógenos como Alternaria solani, Rhizoctonia sp., Phytophthora capsici y Phytophthora parasitica. Algunos de estos compuestos identificados son: octano, 2-pentilfurano, cariofileno, aromadendreno, derivados del naftaleno, entre otros. (Sánchez-Fernández et al., 2013). Al momento, se conocen aproximadamente 20.000 metabolitos con actividad biológica, aislados en plantas que provienen principalmente de microorganismos endófitos (RuizLuberiaga, 2012). El segundo mecanismo de protección (indirecto) consiste en la inducción o incremento de la expresión de mecanismos de defensa químicos o fisiológicos intrínsecos a la planta hospedera (Sánchez-Fernández et al., 2013). En un estudio realizado (Waller et al., 2005) sobre Piriformospora indica, un basidiomiceto endófito de una gran cantidad de plantas, se logró comprobar cómo la colonización de las raíces de diferentes monocotiledóneas, por dicho organismo, concedía una alta resistencia frente al estrés por salinidad e infeccio-

nes por hongos fitopatógenos, dado que inducia una mejor respuesta fisiológica de las plantas, aumentando la capacidad antioxidativa en comparación con los controles no colonizados. Asimismo, se demostró que la resistencia en la cebada (Hordeum vulgare, Poaceae) al ataque de microorganismos patógenos se debe a la colonización de las raíces por el hongo endófito Piriformospora indica. En las plantas inoculadas con el endófito e infectadas con los patógenos Fusarium culmorum KF 350 y Cochliobolus sativus, fue menor la pérdida de la biomasa y la severidad de la enfermedad causada por estos microorganismos. Dichos resultados se encuentran relacionados con la inducción de niveles más altos del antioxidante ascorbato, presente en las raíces y mediado por acción del endófito P. indica. Este antioxidante puede proteger a la hospedera de la muerte celular (Waller et al., 2005; Kageyama, Mandyam & Jumpponen, 2008). Por último, para el tercer mecanismo (ecológico), se llevan a cabo relaciones por ocupación del nicho ecológico, hiperparasitismo y predación (Herre et al., 2007; Gao, Dai & Liu, 2010). Este se puede evidenciar de forma clara en una cepa no patógena de Fusarium oxysporum, denominada Fo47, la cual inhibe al patógeno F. oxysporum f. sp. radicis-lycopersici y reduce los síntomas de la pudrición de la raíz en el tomate (Solanum lycopersicum, Solanaceae). La inoculación, en plantas de tomate de una carga de esporas 50 veces mayor que la del patógeno, asegura que las esporas de F. oxysporum Fo47 compitan con F. oxysporum f. sp. radicis-lycopersici por la misma fuente de carbono, lo que reduce la disponibilidad de nutrientes para este último microorganismo. Estas cepas del género Fusarium presentan estrategias similares de colonización. En consecuencia, F. oxysporum Fo47 puede ocupar y reducir el número de sitios adecuados para la fijación de esporas y la colonización del patógeno F. oxysporum f. sp. radicis-lycopersici, por lo que resulta en un menor número de lesiones sintomáticas (Bolwerk et al., 2005). Otros de los ejemplos a destacar son aquellos trabajos realizados en Poaceas por Clay (1993) y en coníferas por Petrini et al. (1991); estos demostraron que las plantas que estaban colonizadas por hongos endófitos presentaban una mejor resistencia frente a agentes fitopatógenos, gracias a la presencia de compuestos orgánicos que afectaban el crecimiento de otros microorganismos. En muchos casos, estos compuestos pueden ser toxinas, antibióticos e incluso antifúngicos, dado que poseen un amplio espectro de acción. En Colombia, la caracterización de especies endófitas ha sido un campo poco explorado (Medina, 2009); no obstante, ha habido un marcado interés por empezar a estudiar dichos organismos debido a la gran biodiversidad que posee el país y el potencial químico de este mismo. Por ejemplo, algunos de los estudios más relevantes (Prada et al., 2009; Gonzáles-Rocha, 2012) han estado encaminados a caracterizar, taxonómica y molecularmente, las poblaciones de hongos endófitos, estudiando el efecto de la herbivoría sobre la diversidad de las poblaciones de dichos organismos, y el aprovechamiento de estos como agentes para el biocontrol de insectos plaga.

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4. Microorganismos endófitos y epífitos y su relación con ambientes acuáticos

Dentro de los ambientes marinos y zonas intermareales se encuentran microorganismos endófitos y epifitos, tanto hongos como bacterias, asociados a macroalgas, pastos marinos y árboles de mangle; en algunos casos, se ha reportado que estos resultan vitales para el correcto desarrollo de su hospedero (Susilowati, Sabdono & Widowati, 2015; Janakidevi et al., 2013), pueden llegar a presentar actividad antimicrobiana, pueden producir compuestos antioxidantes (Pawar et al., 2015), y otros compuestos novedosos con potencial importancia en la industria. A continuación, se va a realizar una aproximación a cada uno de los ecosistemas en los que hay presencia de estos microorganismos y sus posibles aplicaciones.

4.1 Macroalgas El término macroalgas hace referencia a numerosas especies de algas multicelulares que incluyen las algas rojas, pardas y verdes. Las macroalgas abarcan buena parte de la producción primaria global (Armstrong, Rogerson & Leftley, 2000); además, poseen una gran importancia para la industria y el sector alimenticio (Cervigón et al., 1992). Estudios sobre la microbiota asociada se han conducido tanto en algas pardas como rojas y verdes, en géneros como Sargassum, Chaetomorpha, Eucheuma, Laminaria, Fucus, Gracillaria, Corticata, Hypnea, Geledium, Padina, Valoniopsis y Diginea, entre otros. La microbiota asociada a macroalgas está compuesta, principalmente, por bacterias epífitas, puesto que la superficie de las macroalgas provee protección y un ambiente rico en nutrientes ideal para el crecimiento bacteriano (Armstrong et al., 2000). Las comunidades de bacterias epífitas se han reportado esenciales para el desarrollo morfológico de macroalgas y bacterias con actividad antibacteriana; asimismo, se piensa que podrían proteger las algas, impidiendo la colonización de patógenos en su superficie (Janakidevi et al., 2013). Las bacterias epífitas más comunes incluyen miembros de Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Bacteroidetes y Cyanobacteria (Janakidevi et al., 2013), y algunas de estas bacterias muestran especificidad de hospedero (Strobel, 2003).

4.1.1 Bacterias asociadas a macroalgas con actividad antibacteriana Se ha reportado que estas bacterias, a menudo, producen compuestos bactericidas para mantener la relación entre comunidades epifitas y evitar la colonización de patógenos a la superficie del alga (Avendaño-Herrera, Lody & Riquelme, 2005). Algunos autores (Janakidevi et al., 2013) pusieron a prueba 126 aislamientos bacterianos procedentes de diversas macroalgas en busca de actividad antibacteriana contra patógenos humanos (E.coli, Staphylococcus sp., Klebsiella

pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Micrococcus sp. Salmonella sp. Vibrio cholerae, Shigella) y encontraron 10 aislamientos con producción de antibióticos, destacando bacterias de los géneros Pseudomonas, Pseudoalteromonas y Alteromonas como poseedoras de la mayor actividad antibacteriana. En otro estudio (Susilowati et al., 2015), se pusieron a prueba 23 cepas de bacterias epifitas, aisladas a partir de 3 especies de macroalgas del género Sargassum, contra 2 cepas resistentes a la meticilina de Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermidis, que se han reportado resistentes a la mayoría de antibióticos comerciales, en busca de actividad antibacteriana. De las 23 cepas originales 3 mostraron cierto rango de antibiosis contra una o ambas cepas patógenas, y una de ellas, identificada dentro del género Bacillus, mostró una zona de inhibición considerable ante ambas.

4.1.2 Bacterias asociadas a macroalgas como posible fuente de antioxidantes Los antioxidantes son biomoléculas capaces de retardar o prevenir el daño causado por, entre otros, los radicales libres al organismo. Se han reportado (Pawar et al., 2015) bacterias pigmentadas asociadas a diversas microalgas provenientes de la costa occidental de India, en busca de actividad antioxidante. De 36 cepas aisladas originalmente, el 55% mostraron poseer propiedades antioxidantes y de ellas P. koreensis, aislada a partir de macroalgas del género Sargassum, mostró la mayor actividad antioxidante.

4.2 Pastos marinos Los pastos marinos conforman el único grupo representante de las angiospermas que ha evolucionado de tierra firme al mar, soportando condiciones de estrés tan fuertes como la salinidad y la disponibilidad de nutrientes. Se trata de unas 57 especies de angiospermas (de las aproximadamente 250.000 existentes en toda la biosfera), agrupadas en doce géneros y cuatro familias (Kuo & Hartog, 2001). Este ecosistema contribuye con el ciclo de nutrientes, los cuales estabilizan los sedimentos y producen grandes cantidades de carbono orgánico, además de ser una fuente de alimento para tortugas, manatíes, estrellas de mar y especies de peces de interés comercial (Orth et al., 2006). Actualmente, hay certeza de la presencia de hongos y bacterias endófitas en estas plantas, y lo que no se ha podido reconocer es la existencia de hongos formadores de micorrizas arbusculares, o, por lo menos, en un estudio (Nielsen, Thingstrup & Wigand, 1999) efectuado en Zostera marina (L) y Thalassia testudinum (Banks y Soland ex Koenig), no se logró la identificación de este tipo de microorganismos. A pesar de tener este conocimiento, existen pocos trabajos en los cuales se haya abordado la diversidad de endófitos en estas plantas (Shoemaker & Wyllie-Echeverria, 2013). Devarajan y Suryanarayanan (2002) establecieron la presencia de hongos como Chaetomium globosum, Fusarium sp., Penicillium sp y muchos otros en los diferentes órganos de Halophila ovalis, una planta caracterizada por crecer en ecosiste-

ASPECTOS GENERALES SOBRE MICROORGANISMOS ENDÓFITOS Y EPÍFITOS: CASOS DE ESTUDIO

mas estuarinos (Waycott, McMahon & Laverty, 2014). Estudios recientes han demostrado la presencia de, aproximadamente, 26 tipos de endófitos en especies como Cymodea serrulata, Halodule beaudettei, Halodule uninervis, Syringodium sp. y Enhalus acoroides (Venkatachalam, Thirunavukkarasu & Suryanarayanana, 2015). Algunos autores (Garcias-Bornet et al., 2012) determinaron que la presencia de endófitos en Posodonia oceanica podría jugar un papel determinante en la fijación de nitrógeno y solubilización de fósforo para los procesos fisiológicos de la misma, adicional a esto que algunas de las secuencias moleculares encontradas en este estudio pertenecieron a bacterias desconocidas. Comúnmente, los microorganismos endófitos generan, para su hospedero, una protección contra insectos y patógenos. El 51% de todas las sustancias con actividad biológica han sido aisladas de hongos endófitos, estos generan metabolitos que son antimicrobianos, anticancerígenos, antifúngicos y de actividad enzimática (Strobel et al., 2004; Schulze et al., 2002; Stierle et al., 1993; Aly et al., 2010; Bhadury, 2006; Wiyakrutta, 2004, citados en Supaphon et al., 2013). Estudios en los que se ha evaluado el poder antimicrobiano de endófitos aislados de los géneros Cymodea, Halophila y Thalassia sobre bacterias de importancia clínica como Staphylococcus aureus, han presentado resultados positivos con la obtención de extractos fúngicos tan poderosos, que se han podido comparar con medicamentos como miconazol (Supapon et al., 2013), un producto de uso tópico, capaz de tratar la queratitis micótica (Garg et al., 2010, p. 226.). Los ecosistemas marinos son extremadamente ricos en diversidad y abundancia de gran cantidad de organismos, entre estos se encuentran aquellos que son capaces de crecer y desarrollarse, tomando como sustrato las plantas presentes; estos organismos son denominados epifitos. Los pastos marinos son ecosistemas que brindan excelentes fuentes de sustrato para estos organismos y son un componente fundamental de este tipo de ambientes (Borowitzka et al., 2007). Los epifitos asociados a los pastos marinos se encuentran representados fundamentalmente por cianobacterias, diatomeas, algas incrustantes y efímeras (Ballantine y Humm, 1975; Thursby y Davis, 1984; Novak, 1984 en Bologna & Heck, 1999). Los pastos marinos crecen en una amplia variedad de hábitats, los cuales van desde la zona intermareal hasta profundidades de 50m (Long, Coles & McKenzie, 1996). Las partes por encima del suelo de los pastos marinos ofrecen un sustrato temporal pero de renovación continua para el desarrollo de organismos epifitos (Borowitzka et al., 2007). Las praderas marinas son ecosistemas muy productivos, de los cuales gran parte de esta capacidad se atribuye a los organismos epifitos (Leliaert et al., 2001; Won et al., 2010, citado en Albis-Salas & Gavio, 2015); estos pueden llegar a representar hasta el 50% de la biomasa total por encima del sedimento de estos ecosistemas (Leliaert et al., 2001), la productividad primaria que otorgan los organismos epifitos han sido documentados en diversos estudios. En Florida, EE.UU., las algas epífitas aportaron 62%, 50% y 44% de la producción primaria para Syringodium filiforme, Thalassia testudinum y Halodule wrightii, respectivamente (Use et al., 1999, citado en Borowitzka et al., 2007). En Papúa Nueva Guinea, Heijs

(1984), citado en Borowitzka et al., 2007), se determinó que las algas epífitas sobre T. hemprichii contribuyen desde el 19% hasta el 37% de la producción primaria total; otros autores (Silberstein et al., 1986, citado en Borowitzka et al., 2007) demostraron que más del 60% de la tasa fotosintética máxima total de Posidonia australis en Cockburn Sound, Australia Occidental, podría atribuirse a la tasa fotosintética de los epifitos presentes. Una alta carga de organismos epifitos puede tener efectos contraproducentes para los pastos marinos; la resistencia hidrodinámica de estos puede aumentar, incrementando, así, el riesgo por pérdida de hojas por acción del oleaje o de las corrientes oceánicas (Hogarth, 2015). Otro de los efectos principales que tienen los epifitos sobre los pastos marinos se da en relación con la tasa fotosintética de estos últimos; las algas son recolectores de luz eficientes, reduciendo la cantidad de luz que llega a la hoja para la fotosíntesis (aunque posiblemente también pueden filtrar la radiación ultravioleta potencialmente peligrosa). La cubierta de epifitos sobre las hojas de los pastos marinos puede restringir la absorción de CO2, así como de nutrientes y minerales del agua circundante; un crecimiento excesivo de epifitos, restringe la luz, reduce la productividad y puede llegar a causar la muerte de los pastos (Silberstein et al., 1986, citado en Borowitzka et al., 2007; de Heck & Valentine, 2006, citado en Hogarth, 2015). Dentro de los pastos marinos que presentan mayor distribución en el caribe, se encuentra Thalassia testudinum Banks ex König, el cual proporciona un amplio sustrato para las algas epífitas (Cho et al., 2002; Barrios & Díaz, 2005; Corlett & Jones, 2007; Samper-Villarreal et al., 2008, citados en Albis-Salas & Gavio, 2015); a pesar de lo anterior, se presenta un déficit en los reportes de epifitas presentes en estos ecosistemas caribeños, centrándose principalmente en Florida (Dawes 1987; Won et al., 2010, citados en Albis-Salas & Gavio, 2015; Albis-Salas & Gavio, 2015), en Costa Rica (Samper-Villareal et al., 2008, citado en Albis-Salas & Gavio, 2015; Albis-Salas & Gavio, 2015), y en Venezuela (Barrios & Díaz, 2005, citado en Albis-Salas & Gavio, 2015; AlbisSalas & Gavio, 2015); para el caso Colombiano, aparte de los estudios realizados en las estimaciones de la biomasa (Palacios, Díaz & Rodríguez, 1992), son pocos los reportes que se encuentran disponibles en la literatura, pero cabe resaltar primeros avances en este tema gracias a los reportes de Albis-Salas y Gavio (2011, 2015).

4.3 Manglar Los manglares se caracterizan por ser ecosistemas cuya productividad primaria es bastante alta, pero que generalmente son pobres a nivel de nitrógeno y fósforo (Holguín et al., 2003). Es aquí donde se establece una relación entre los microorganismos y las plantas; donde los primeros se encargan del ciclado de nutrientes; mientras que, los exudados de las raíces de las plantas sirven como alimento de estos (Felix-Pico et al., 2011). Entre los microorganismos más frecuentes como endófitos de los árboles de manglar, se encuentran los géneros Vibrio, Aspergillus, Bacillus, Azotobacter, Rhizobium, Pseudomonas, entre otros.

ASPECTOS GENERALES SOBRE MICROORGANISMOS ENDÓFITOS Y EPÍFITOS: CASOS DE ESTUDIO

4.3.1 Bacterias promotoras de crecimiento vegetal

Organismos diazotróficos rizosféricos de los géneros Aeromonas, Arthrobacter, Azospirillum, Azotobacter, Bacillus interactúan con la planta. En algunos estudios (Holguín et al., 1992) se ha mencionado que, en asociaciones entre bacterias fijadoras de nitrógeno y que no llevan a cabo fijación biológica de nitrógeno, como el Staphylococcus sp., la fijación de nitrógeno se dio en mayor porcentaje, comparada con el aislamiento de cepas de diazótrofas puras, es decir, que una coinoculación se notó más efectiva para el consumo de nitrógeno por la planta. La condición de anoxia, debido a las características anaerobias que presentan los sedimentos, hacen que el fosfato que se encuentra precipitado debido, al agua intersticial sea aprovechado por las plantas gracias a la acción de las bacterias solubilizadoras de fosfatos pertenecientes a géneros como Bacillus, Paenibacillus, Xanthobacter, Enterobacter, entre otras, donde su función puede variar de efectividad, dependiendo del grado de aireación que se presente en la rizósfera (Holguín et al., 2001), señalando que esta actividad no solo beneficia a la planta puesto que los aminoácidos y glucosa generados por los exudados se convierten en energía y fuente de carbono para las bacterias (Felix-Pico et al, 2011). Varios autores sostienen la hipótesis que habla acerca de los microorganismos como biorremediadores de los ecosistemas de manglar, ya que pueden participar en la inoculación de los árboles del ecosistema. Por ejemplo, se ha reportado (Holguín et al., 1999) que bacterias del género Azospirillum y árboles de Aviccenia germinans y Rhizophora mangle establecen una cooperación, por lo que se inoculan las raíces de dichas plantas en zonas de repoblamiento (James, 2000), esperando que se establezca una tasa de crecimiento y propagación para restablecer el ecosistema.

4.3.2 Hongos con actividad antimicrobiana En la microbiota de manglar, además de bacterias también se encuentra una cantidad importante de hongos, en donde géneros como Trichoderma se encuentran en abundancia. Por su capacidad de producir metabolitos secundarios con potencial actividad antimicrobiana, han sido evaluados a nivel farmacéutico y, por ejemplo, Narendran y Kathiresan (2016) comprobaron su efecto antimicrobiano contra E. coli y S. aureus, lo que resulta promisorio para control de algunas enfermedades en humanos y animales. Se concluye que el estudio de los microorganismos endófitos y epifitos, en diferentes hábitats, es de gran importancia para su conocimiento. En términos de bioprospección, es fundamental la realización de investigaciones para evaluar el uso potencial que estos pueden tener según sus compuestos activos, aspecto de gran interés en Colombia.

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MICROORGANISMOS EN A M B IENTE S E X T R E M O S : E L DE S IE R TO CO M O C A S O DE E S T U DIO

1 Bióloga. Maestría Ciencias Biología (En curso). Coordinadora grupo de Astrobiología Universidad Nacional de Colombia. 2 Microbióloga. Maestría en Ciencias Geología (En Curso) 3 Bacterióloga. M.Sc. Microbiología. Candidata Ph.D. ciencias Agrarias. Docente Asociada, dedicación exclusiva, departamento de Biología. Facultad de Ciencias. Universidad Nacional de Colombia. 4 Estudiante Biología. Universidad Nacional de Colombia. 5 Bióloga. M.Sc. Soil and Crop Sciences, Texas A&M University Systems. Directora de laboratorios e investigadora del centro de investigación Corpogen. 6 Tecnólogo en química Industrial. Técnico de apoyo laboratorio de Microbiología. Departamento de Biología. Facultad de Ciencias. Universidad Nacional de Colombia.

Leal, María1 Méndez, Yael2 Sánchez, Jimena3 Infante, Alexis4 Rodríguez, Jenny4 Bolivar, Hermes4 Miranda, Lorena4 Mejía, Luisa4 Ballesteros, David4 Tamayo, Pablo4 Cepeda, Martha5 Ruiz, Elkin6

1. Introducción Los ecosistemas xerofíticos se caracterizan, principalmente, por presentar altas temperaturas y un déficit hídrico significativo durante todo el año (Leyva, 2001). Es así como la temperatura media en estos ecosistemas supera los 25°C y la precipitación fluctúa entre los 250 y 1800mm (Restrepo-Ángel, 2005). A lo largo del año, se presentan periodos de sequía extrema en los cuales las plantas, los animales y los microorganismos que allí habitan experimentan un déficit de agua que los afecta considerablemente (Restrepo-Ángel, 2005). Debido a esta escasez de agua en el ecosistema, las actividades biológicas están condicionadas a la cantidad de agua disponible; sin embargo, dicha disponibilidad está mediada por la interacción de varios factores como: la precipitación, la temperatura, la evaporación y la evapotranspiración (Bhatnagar & Bhatnagar, 2005). Por ello, el mejor indicador de la sequedad de un desierto o ecosistema xerofítico es su índice de aridez (IA), que se define como el cociente entre la precipitación media anual y la evapotranspiración media anual. Las regiones con un IA inferior a 0,20 son consideradas zonas áridas o híper-áridas, y las zonas con un IA inferior a 0,05 son consideradas extremadamente áridas (Wierzchos, de los Ríos & Ascaso, 2012). No obstante, la poca disponibilidad de agua no es el único factor determinante en este ecosistema. El viento es uno de los factores que más se ha relacionado con los ecosistemas xerofíticos ya que ha contribuido, en gran medida, en la caracterización de estos, facilitando la dispersión y colonización de ciertas plantas propias en este ambiente, y evitando el establecimiento de algunas otras. Igualmente, debido a la ubicación geográfica de estos ecosistemas, ubicados sobre todo en regiones tropicales, la radiación solar por unidad de superficie que reciben es mucho mayor, en comparación con otras regiones del planeta; adicionalmente, el hecho de que la cobertura vegetal sea tan pobre y de que la cantidad de agua en la superficie sea muy poca (lo que genera poca nubosidad) contribuye a que la cantidad de radiación solar a la que se ven sometidos estos ecosistemas pueda llegar a ser extrema (Leyva, 2001). Otro factor abiótico que caracteriza las zonas xerofíticas es su geografía en sí, pues la presencia de sales en el suelo y superficies rocosas de meteorización lenta contribuyen a que la cobertura vegetal sea muy pobre, siendo este un factor determinante en la desertificación del ambiente (Leyva, 2001). Las zonas xerofíticas o áridas en el mundo se ubican, generalmente, entre el trópico de cáncer y el trópico de capricornio (a excepción de los desiertos australianos) (Bhatnagar & Bhatnagar, 2005). Además, se estima que el 19% del territorio mundial corresponde a ecosistemas desérticos y el 14.6 % a ecosistemas semidesérticos (Bhatnagar & Bhatnagar, 2005). En Colombia, según el Cuarto Informe Nacional ante el Convenio sobre la Diversidad Biológica (Ministerio de Ambiente, Vivienda y Desarrollo Territorial, 2010), estos ecosistemas pueden encontrarse en todo el territorio Colombiano, tanto en el piso andino como en el basal (Leyva, 2001). En tierras bajas, se hallan en el

cinturón seco del Caribe y los valles secos interandinos por debajo de los 1000 msnm; en la alta y media Guajira, parte del flanco noroccidental de la Sierra Nevada de Santa Marta (SNSM) y en el litoral de los departamentos del Atlántico, Bolívar, Córdoba y Sucre. Igualmente, se encuentran en tierras altas en algunos enclaves secos de la cordillera oriental, como la Sabana de Bogotá, el Valle de Ubaté, Boyacá, Caquetá y el enclave seco del río Chicamocha. Leyva citando el Mapa de coberturas vegetales, uso y ocupación de territorio (Ideam, 1996) define la xerofita andina como “la porción de territorio sometida a condiciones extremas de aridez que se encuentra sobre los 1.000 msnm” y a la xerofita basal como “aquella que se halla en los valles interandinos o el resto del territorio siempre por debajo de los 1.000 msnm” (2001, p. 290).

MICROORGANISMOS EN AMBIENTES EXTREMOS: EL DESIERTO COMO CASO DE ESTUDIO

2. Microorganismos asociados a ecosistemas xerofíticos

Las condiciones físicas que caracterizan un ambiente xerofítico, mencionadas anteriormente, limitan considerablemente las formas de vida en estos ecosistemas. La desecación (eliminación del agua de las células) puede llegar a ser totalmente letal para la mayoría de las especies de animales, plantas y microorganismos, haciendo de la disponibilidad de agua un factor que genera una fuerte presión evolutiva sobre la vida en la tierra (Alpert, 2005; Ramírez, Serrano & Sandoval, 2006). Potts et al. (2005) exponen como ejemplo de evolución a las cianobacterias, organismos que han sobrevivido desde la era precámbrica gracias a sus múltiples adaptaciones a varios factores ambientales, como la desecación y la alta radiación. Estas condiciones le generan retos físico-químicos a las células que habitan estos ecosistemas, algunos de ellos son: el aumento de la cantidad de agentes oxidantes, que pueden dañar especies oxigeno-reactivas del microorganismo; un medio extracelular sobresaturado, que disminuye el agua disponible; aumento en la presión osmótica, que incrementa la tensión superficial de la membrana celular, y la precipitación de ciertas macromoléculas y sales intracelulares (Potts, 2005). Sin embargo, hay organismos que tienen la capacidad de tolerar la desecación, capacidad que no se ha visto monopolizada por un solo grupo de organismos. Alpert (2006) expone una tabla de los grupos taxonómicos de los que se ha registrado tolerancia a ambientes que presentan alta desecación (tabla 3-1). Dentro de las bacterias xerófilas se pueden destacar los géneros Metallogenium y Pedomicrobium (Ramírez et al., 2006). Si bien, en lo que se refiere a extremófilos, los microorganismos tienen un papel protagónico indiscutible, no es posible ignorar el hecho de que la existencia de animales y plantas, las cuales se han adaptado a condiciones extremas, dependen de los microorganismos, haciéndolos vitales para su supervivencia; es el caso de Alvinella pompejana, como lo exponen Le Bris y Gaill (2007), un poliqueto que habita las profundidades marinas del Océano Pacífico, muy cerca de las fuentes hidrotermales; además, es el animal registrado que sobrevive a las más altas temperaturas, las cuales, por lo general, se encuentran alrededor

de los 60ºC e incluso llegan a superar los 80ºC gracias a los comportamientos que ha adquirido a lo largo de su historia evolutiva y a las relaciones simbiontes que tiene con bacterias que viven en su superficie; también es el caso de Thellungiella halophila, una angiosperma con diferentes ecotipos en Asia central y Norteamérica, que está altamente adaptada a condiciones desecantes, muy bajas temperaturas y suelos muy ricos en sales, y pobres en nitrógeno (Gong et al., 2005). A estos microorganismos, que son capaces de crecer en estas condiciones de extrema sequía, se les denomina xerófilos y van desde colonias de bacterias hasta colonias simbióticas de algas con hongos (líquenes) (Ramírez et al., 2006). Este término se usa hace más de setenta años, originalmente, para referirse a plantas que crecían en zonas áridas y semiáridas; por sí mismo, el término no hace referencia a ningún proceso metabólico específico, sino a la capacidad de sobrevivir a condiciones de desecación (Thoday, 1933). Actualmente, además del término xerófilo, también se usa el término anhidrobionte (Crowe & Crowe, 2000 en Potts et al., 2005), el cual hace referencia a los microorganismos que pueden resistir la pérdida de casi toda su agua intracelular; incluso, pueden soportar una proporción de ~0,02g de H2O por un gramo de sólido celular (Potts et al., 2005). Tabla 3-1. Rango taxonómico de la resistencia a la desecación.

Grupo

Ocurrencia conocida

Referencia

Nemátodos

Varias especies

Wharton (2003); Treonis & Wall (2005)

Rotíferos

Muchas especies, incluida la mayoría de las especias del orden Bdelloidea

Ricci & Caprioli (2005)

Tartígrados

Varias especies

Wright (2001); Jönsson & Järemo (2003)

Crustáceos

Embriones enquistados de varios géneros de anostracans, incluyendo artemias y camarones hada

Mitchell (1990); Clegg (2005)

Artrópodos

Larva de la mosca Polypedilium vanderplanki

Watanabe et al. (2004); Kikawada et al. (2005)

Líquenes

Mayoría de las especias probadas

Kappen & Valladares (1999)

Levaduras

Algunas especies

Garay-Arroyo et al. (2000)

Otros hongos

Algunas especies

Mazur (1968)

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Grupo

Ocurrencia conocida

Referencia

Mohos

Mayoría de especies probadas

Proctor & Tuba (2002)

Plantas hepáticas

Varias especies

Proctor & Tuba (2002)

Pteridófitos

Tal vez 50 especies como esporófito , probablemente muchas como espora, y algunas como gametófito

Pence (2000); Porembski & Barthlott (2000)

Gimnospermas

Ningún adulto pero algunas semillas y polen

Porembski & Barthlott (2000); Dickie & Prichard (2002); Hoekstra (2002)

Angiospermas

Tal vez 300 especies como adulto, 95% de las especies como semilla y tal vez la mayoría del polen

Porembski & Barthlott (2000); Hoekstra (2002); Tweddle et al. (2003)

Bacterias

Varias especies, incluidas las cianobacterias

Billi & Potts (2002); Buedel et al. (2002); de la Torre et al. (2003)

Microalgas terrestres

Varias especies

Trainor & Gladych (1995)

Microalgas marinas

El alga roja interstidial Porphyra denatata

Abe et al. (2001)

Fuente: tomado y modificado de Alpert (2006, p. 1578). Traducido por David Ballesteros.

Estos organismos cuentan con diferentes adaptaciones que les permiten soportar estas condiciones extremas, una de ellas es la presencia de disacáridos, como la sacarosa, los cuales se encargan de proteger las membranas y proteínas de la desecación, proporcionándoles un estado físico similar al de la hidratación en el momento en el que están sometidas a desecación (Ramírez et al., 2006). No obstante, uno de los factores más importantes para determinar la capacidad de un organismo de adaptarse o no a estas condiciones es la estabilidad del ADN: los ambientes xerofíticos pueden causar daño oxidativo en un nucleótido o en varias regiones del ADN (Potts et al., 2005). La mayoría de las reacciones que se presentan para tolerar las condiciones de desecación terminan en un estado celular viable pero no cultivable (VPNC), el cual se caracteriza por una disminución de la actividad metabólica (Potts, 2001). En general, un microorganismo pasa por tres etapas en su proceso de resistencia a la desecación: la fase de pérdida de humedad, la fase de dese-

cación, y la fase de rehidratación, donde el organismo vuelve a ser cultivable (Potts, 2001). La capacidad de sobrevivir en VPNC ha sobrepasado las estimaciones ya que se han podido cultivar microorganismos de muestras en condiciones de desecación total recolectadas antes de 1700 d. C. (Boylen, 1973). La importancia del conocimiento de estos microorganismos radica en entender cómo estos han logrado desarrollar estrategias evolutivas que les permiten adaptarse a ambientes extremadamente hostiles, como lo son los ecosistemas xerofíticos, además, esto nos ayuda a empezar a entender los límites de la vida en nuestro planeta. Por último, estos podrían proporcionar datos importantes acerca de la historia de la vida en la tierra e incluso en otros lugares del sistema solar (Wierzchos et al., 2012). Con respecto a los ecosistemas terrestres, existe una estrecha relación entre microorganismo y planta, puesto que los microorganismo influyen, en gran medida, en la disponibilidad de nutrientes para las plantas mediante la mineralización de estos; a su vez, la planta proporciona carbono orgánico, que es, una fuente que alimenta el crecimiento y la actividad microbiana (Kaye & Hart, 1997). Sin embargo, a pesar de esta asociación enriquecedora para ambos organismos, los ecosistemas áridos y semiáridos tienen una variabilidad irregular de las propiedades del suelo, teniendo un gran impacto en la estructura, la producción y la dinámica de las poblaciones vegetales, pues es a menudo limitada por la disponibilidad de nitrógeno (N) (McCrackin et al., 2008). Teniendo en cuenta que los microorganismos del suelo son contribuyentes importantes en la formación y desarrollo de los recursos en estos ecosistemas, debido a su papel clave en la descomposición de material vegetal y la mineralización de nutrientes (Diedhiou et al., 2009; Dossa et al., 2009; Dossa et al., 2010, citados por Cao et al., 2016), la disponibilidad de estos nutrientes alrededor de la vegetación ha sido una preocupación primordial en las últimas décadas.

3. Aspectos generales ecología de microorganismos en ambientes extremos Los microorganismos, en su gran variedad, han presentado adaptaciones a diferentes entornos; esto no es extraño, debido a que son los primeros seres vivos que habitan en nuestro planeta y no es de sorprender que estos microorganismos puedan tolerar y sobrevivir a condiciones que organismos más complejos no pueden siquiera tolerar en lo más mínimo. Es por eso que, la presente sección tratará acerca de los diferentes aspectos ecológicos de los microorganismos que habitan en ambientes extremos. El principal rol que llevan a cabo los microorganismos extremófilos a nivel ecológico es en la participación, como organismos pioneros en la sucesión primaria. Aquí, estos microorganismos, principalmente pertenecientes al dominio Archaea, son los primeros en colonizar un espacio determinado, gracias a que no poseen una restricción en cuanto temperatura, humedad o anoxia (Nicol et al., 2005). De acuerdo con Pikuta, Hoover y Tang (2007), la organiza-

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ción de estos microorganismos ocurre a través de la colonización béntica, la formación de biofilms y los enjambres microbianos. Las cianobacterias son un perfecto ejemplo de lo anteriormente mencionado, su tolerancia a las condiciones de la tierra primitiva las convirtieron en especies pioneras para la formación de vida más compleja (Kulasooriya, 2011); debido a ello, son denominadas por Kulasooriya como “pioneras del planeta tierra”. Si bien en la actualidad, se ha enfocado la investigación hacia extremófilos procariotas, existe cierto sesgo al afirmar que solo los microorganismos pertenecientes al dominio archaea son extremófilos; en la actualidad, se han encontrado extremófilos pertenecientes al dominio bacteria y al dominio eukaria; de este último, lo que más se han encontrado son algas y hongos; así mismo, la diversidad de estos organismos se ha derivado de los diferentes ambientes extremos existentes en la tierra (Horikoshi, 2011). En general, desde el punto de vista ecológico, los ambientes extremos son reconocidos por las mismas características usadas para reconocer cualquier otro ecosistema; diversidad, biomasa, productividad, diversidad de procesos ecosistémicos y adaptaciones; es así como en un lugar donde la cantidad de biomasa y productividad son bajos, prevalece la formación de vida arcaica y no se observan organismos complejos, con una ausencia de fotosíntesis y fijación de nitrógeno; pero que dependen de adaptaciones fisiológicas morfológicas y vías metabólicas específicas o poseen adaptaciones que, en su ciclo de vida, son parte de un ambiente extremo (Bell, 2012). Siendo así, existe una relación entre el tipo de extremófilo y el entorno donde habita, más aún, poseen mecanismos que permiten su dominio sobre dicho ecosistema; es así como algunos microorganismos, como los acidófilos, requieren estrictamente de un pH bajo para poder crecer, este caso se repite en microorganismos termófilos y halófilos. Esto quiere decir que no solo toleran dichos ambientes sino que requieren de ellos para su supervivencia (Cavicchioli et al., 2011). En la actualidad, se ha hecho importante la investigación de la biodiversidad de los microorganismos que viven en ambientes extremos, debido a las futuras aplicaciones biotecnológicas que dichos microorganismos pueden ofrecer; para ello, se ha enfocado la investigación a través de metagenómica, que no solo puede ayudar a identificar las relaciones filogenéticas entre estos microorganismos, sino también sus potenciales biotecnológicos y facilitar la detección de microorganismos que no pueden ser cultivados por métodos convencionales (Satyanarayana et al., 2005). Es así como, a través de los diferentes aspectos ecológicos, se hace necesario conocer más acerca de estos microorganismos. Por lo que, a continuación, trataremos acerca de otros factores como la incidencia y ocurrencia de estos microorganismos, los tipos de microorganismos extremófilos y sus adaptaciones metabólicas, y finalizaremos con los avances que se han realizado en torno a aplicaciones de estos microorganismos.

3.1 Generalidades sobre incidencia Es claro que, desde su origen y hasta la actualidad, la vida se ha enfrentado a condiciones desfavorecedoras, enfrentando ambientes que, para la gran mayoría de organismos conocidos, solo representan un riesgo fatal; aun así, existen organismos que desde hace millones de años están adaptados a esas condiciones e incluso las requieren para continuar con vida (Rothschild, 2002). Algunos de estos ambientes extremos (término que comienza a ser bastante relativo) pueden llegar a ser similares a ambientes que se podrían encontrar en otros planetas y, de ser así, organismos análogos a los que los habitan, podrían llegar a ser encontrados en esos ambientes extraplanetarios (Mix & Berkeley, 2006). Se ha encontrado evidencia fósil de las primeras formas de vida en la tierra hace unos 3500 millones de años, cianobacterias y estromatolitos, periodo en los que las condiciones del planeta eran completamente diferentes a las que estamos familiarizados actualmente; pero, aun así, la vida pudo surgir y prosperar en condiciones más que adversas para la inmensa mayoría de los organismos conocidos hasta el momento (Knoll, 2015). Una de las muchas teorías de la abiogénesis, proceso de aparición la vida a partir de materia no viva, ubica a los procesos que dieron origen a la vida en fuentes hidrotermales, debido a que, en estos ambientes, son beneficiadas reacciones de síntesis de compuestos orgánicos a partir de CO2 y ácido carbónico. Fuentes hidrotermales formarán no solo un ambiente favorable para la vida sino también para su origen, ambientes donde podemos encontrar organismos adaptados a las altas temperaturas y presiones de estos sitios; incluso evidencia genética sustenta que organismos hipertermófilos actuales que habitan estos lugares están más cerca de un ancestro común que otros (Shock, 1996). En el momento de estudiar extremófilos, es necesario tener en cuenta varias categorizaciones en función de sus características, donde, tal vez, la más conocida es la categorización en función del tipo de ambiente o ambientes a los que pueden estar adaptados; otras categorizaciones, en función de su resistencia, siendo estos extremo tolerantes y extremófilos verdaderos; los organismos extremo tolerantes son capaces de sobrevivir en un ambiente con perturbaciones que resultan perjudiciales para otros organismos; mas, su resistencia es limitada, en comparación con los verdaderos extremófilos; su capacidad reproductiva también se ve afectada; por ejemplo, la bacteria Virgibacillus spp. puede sobrevivir altos niveles de pH, aunque a partir de pH 10 no puede crecer y en pH 7 se encuentra su crecimiento óptimo (Yumoto, Hirota & Yoshimune, 2011). Otra categoría está dada en función de su supervivencia o no fuera del ambiente extremo en donde los organismo extremófilos facultativos presentan estructuras adaptativas a una condición determinada; no obstante, en el momento en que la condición se aplica, el organismo pone en marcha las adaptaciones, y organismos extremófilos que requieren permanecer en su ambiente para su supervivencia (Krulwich et al., 2011). Son muy diversos los ambientes extremos que pueden ser encontrados en el planeta, ambientes en los que la vida puede hacer presencia; pero no todos

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estos tienen un origen natural; como consecuencia, las diferentes actividades del ser humano (p.e. la explotación minera o petrolera) han dejado un preocupante deterioro ambiental y han producido condiciones extremas en las que la vida ha demostrado su prevalencia. Es el caso de el lago Pit Berkeley, Estados Unidos, lugar que operaba como mina de cobre a cielo abierto hasta el año 1982. Cuando la mina dejó de operar, también lo hicieron la bombas que extraían el agua proveniente de filtraciones subterráneas y de la escorrentía de la superficie; por lo que, en poco tiempo, se formó un cuerpo de agua altamente acidificado, con un pH entre 2.5 y 2,7, producto de la disolución de minerales en el agua como la pirita y contaminado con altas concentraciones de metales como hierro, cobre, cadmio, aluminio y zinc (Stierle & Stierle, 2005). A pesar de la condiciones hostiles del lugar, se han logrado aislar organismos como hongos, bacterias, algas y otros eucariontes unicelulares que habitan el lugar; incluso, investigadores como Stierle y Stierle (2005) demuestran gran interés por los organismos que allí habitan y la utilidad que pueden llegar a tener.

3.2 Tipos de extremófilos, adaptaciones, metabolismo y aplicaciones Al clasificar los extremófilos podemos hacerlo según la condición “extrema” que toleran. Los más comunes son acidófilos (crecen en pH ácidos), alcalófilos (crecen en pH alcalinos), endolíticos (crecen dentro de sustancias rocosas), halófilos (crecen a altas concentraciones salinas), hipertermófilos (crecen a más de 80°C), oligotróficos (crecen en ambientes nutricionalmente limitados), radiofilos (crecen en exposición a altos niveles de radiación ionizante), tóxico tolerantes (capaces de soportar altos niveles de sustancias tóxicas), termófilos (crecen entre 60 y 80°C) y xerófilos (crecen en ambientes con muy poca actividad de agua) (Gerday & Glansdorff, 2007). Empero, se hará especial énfasis en los organismos radiófilos, xerófilos y oligotróficos, ya que este tipo de extremófilos son los candidatos más probables a habitar en desiertos. Un concepto importante para recordar es el del metabolismo, este hace referencia al conjunto de reacciones químicas que ocurren en una célula de un organismo, con el objetivo de obtener energía, almacenarla y utilizarla para su beneficio en los procesos celulares que sean requeridos. Una vez obtenida la energía, los organismos tienen la capacidad de realizar procesos más complejos, como la obtención de los nutrientes disponibles en el medio en el que se encuentra, además de procesos como la síntesis y degradación de macromoléculas que contribuyen al funcionamiento adecuado de la maquinaria celular (Varela & Grotiuz, 2000). Para lograr sobrevivir a ambientes extremos, los microorganismos desarrollan adaptaciones tanto fisiológicas como metabólicas, que son más eficientes en las condiciones de los mismos. Los organismos oligotróficos, al encontrarse en ambientes carentes de nutrientes, suelen tener alta afinidad por un sustrato en específico, el cual, al ser modificado, altera la tasa de

crecimiento de los microorganismos (Van Gemerden & Kuenen, 1984). Otra adaptación importante es la relación entre el radio y el volumen de la superficie, puesto que, al aumentar el área de contacto con el sustrato, sin aumentar mucho el volumen de la colonia, se es capaz de acceder a una mayor cantidad de nutrientes. Por último, tenemos la adaptación de los sistemas enzimáticos, de los cuales se han identificado 3 principales caminos que usan los organismos oligotróficos para continuar su crecimiento en bajas concentraciones de nutrientes: aumentar los niveles de enzimas críticas, modular la actividad enzimática y sintetizar enzimas especializadas de baja afinidad (Van Gemerden & Kuenen, 1984). Los organismos radiófilos han desarrollado mecanismos para evitar el daño del DNA, principal causa de lisis de microorganismos expuestos a altas radiaciones. En varios experimentos, se ha encontrado que algunas especies de bacterias, resistentes a la radiación, tienen altos niveles intracelulares de manganeso y muy bajo nivel de hierro (Pikuta, Hoover & Tang, 2007). También se ha encontrado un tipo especial de proteínas, de la familia fosfohidrolasa, la cual está involucrada en la resistencia a la alta radiación, en especial, la Nudix hidrolasa (Pikuta et al., 2007). La disponibilidad de agua en un ambiente es esencial para el desarrollo de un microorganismo; a pesar de ello, existen microorganismos extremófilos con capacidad de sobrevivir en condiciones de desecación, los microorganismos xerófilos. Un ambiente con un alto contenido de sales y azúcares presenta una baja disponibilidad de moléculas de agua; por lo tanto, el agua se asociará a moléculas polares o iones presentes en el medio, disminuyendo la capacidad de la célula para absorberla (Varela & Grotiuz, 2000). La tolerancia a la desecación es considerada un estado de metabolismo suspendido, inducido por la eliminación de agua de la célula (Potts et al., 2005). El metabolismo de un microorganismo xerófilo se caracteriza por una detención completa del metabolismo celular, seguido por el tiempo de suspensión de este y, por último, la recuperación de funciones metabólicas (Potts et al., 2005). La desecación genera un incremento en la osmolaridad en el citosol (aumento de la concentración de partículas osmóticamente activas en una solución), permitiéndole al microorganismo resistir a la deshidratación. Algunos mecanismos adicionales, que utilizan este tipo de microorganismos para retener el agua, estabilizar las membranas y proteínas, son el uso de solutos como glutamato, glicina, sacarosa, entre otros (Ramírez et al., 2006). Los usos biotecnológicos de estos organismos, actualmente, se enfocan, especialmente, en la extracción de metabolitos secundarios de interés, como enzimas degradadoras de celulosa, alfa y beta amilasas; enzimas proteolíticas; descontaminación y producción de hidrógeno; producción de biopolímeros; descomposición de desechos radioactivos (Gerday & Glansdorff, 2007).

4. Ejemplos

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Tabla 3-2. Algunos ejemplos de organismos de ambientes xerofíticos.

Organismo

Nombre

Tipo de extremófilo

Bacteria

Metallogenium

Xerófilos

Bacteria

Pedomicrobium

Xerófilos

Artrópodo

Artemia salina

Xerófilos

Hongo

Wawelia argentea

Xerófilos

Hongo

Wawelia microspora

Xerófilos

Hongo

Aspergillus niger

Radiófilo

Bacteria

Bacillus subtilis

Radiófilo

Bacteria

Deinococcus radiodurans

Radiófilo

Fuente: elaboración propia, con base en la información de Webster et al. (1999); Dose et al. (2001); Alpert (2006); Ramírez et al. (2006); Bauermeister et al. (2011).

Se han evaluado la abundancia de los principales grupos de microorganismos de suelos áridos y semiáridos (bacterias, levaduras y hongos filamentosos), donde la vegetación suele distribuirse en parches y en suelos donde la cobertura vegetal es baja (estos suelos son relativamente infértiles). En estos estudios, por un lado, se ha encontrado que los microorganismos asociados a los parches de fertilidad son importantes para el crecimiento de las plantas, toda vez que favorecen la absorción de nutrientes por plantas, producen hormonas que promueven su crecimiento, fijan nitrógeno, suprimen patógenos e intervienen en la descomposición de la materia orgánica (Farnsworth et al., 1977; Nakas & Klein 1980; Davison 1988, Denarie et al.,1992; Aguilera et al., 1999, citados en Avila et al., 2010). Por otra parte, se ha sugerido que las comunidades microbianas de este tipo de ecosistemas están dominadas por microorganismos inactivos, incluyendo formas esporulantes (Mamilov & Dilly, 2002, citado en Avila et al., 2010). Estos estudios son de suma importancia porque la variación de la biomasa microbiana es un indicador medible de la calidad y del potencial de uso de un suelo, debido a que es una de las pocas fracciones de materia orgánica, biológicamente significativa, sensible a las consecuencias del manejo humano y a la polución (Schloter et al. 2003, citado en Avila et al., 2010). El siguiente caso de estudio es acerca del uso de los microorganismos como recurso para recuperar suelos erosionados. Como bien lo sabemos, existe una fuente favorable de material microbiano para uso agrícola, como las bacterias promotoras de crecimiento (e.g. Azospirillum sp., Pseudomonas sp., y Bacillus sp.)

y los hongos MA, dado que muchas plantas nativas responden positivamente a la inoculación, mejorando así su crecimiento (Basán, 2005; Lucy et al., 2004, citados en Bashan et al., 2012). A pesar de ello, aquellos microorganismos nativos, que crecen y sobreviven en suelos con alta dureza, son mejores candidatos para inocular las plantas nativas (Bashan, Puente & Salazar, 2006). Una fuente potencial de estos microorganismos son las plantas del desierto creciendo en rocas en ausencia de suelo, siendo esta una de las condiciones que inhibe el crecimiento en la mayoría de las plantas. Estos estudios demuestran que, los recursos microbianos nativos del desierto, pueden ser utilizados como herramientas prácticas para programas de reforestación encaminados a reducir tanto la erosión del suelo como la contaminación por polvo (Bashan et al., 2006). Por otra parte, uno de los aspectos tecnológicos va ligado a la información proveniente de la Nasa, donde se considera que las superficies de la Luna y de Marte son desiertas, es decir que, el estudio de los microorganismos de los desiertos terrestres aportarán, en gran medida, a los conocimientos sobre el posible signo de vida en los desiertos de otros lugares (Wiener, 2006). Otro aspecto tecnológico, es el desarrollo de filtros solares naturales de alta demanda, parte de la industria dermo-cosmetológica, con base en compuestos activos de microrganismos del desierto de Atacama, a partir del conocimiento de la diversidad microbiana, la genómica y las capacidades metabólicas de los cultivos (Pastén, 2013).

5. Usos asociados a organismos extremófilos 5.1 Aspectos económicos y aplicados de los tapetes microbianos Teniendo en cuenta el punto de vista económico, podemos decir que los ambientes extremos han sido factores importantes en el desarrollo de los diferentes campos industriales. A nivel de minería, los ambientes hipersalinos permiten la producción de sal y otros minerales que resultan de la evaporación del agua de mar, donde los microorganismos tienen una participación fundamental, la cual tiene múltiples usos en la industria manufacturera. Por un lado, en la agricultura, un amplio grupo de especies microbianas nativas, de ambientes extremos, se han empleado como biofertilizantes gracias a sus propiedades para fijar nitrógeno y generar materia orgánica, mejorando, de tal forma, suelos deficientes en nutrientes (López-Cortés, García-Pichel, Nübel & Vázquez-Juárez, 2001). Existen también microorganismos utilizados para la producción de biomasa y proteína como suplemento nutricional. Por otro lado, en la industria química, se emplean bioplásticos (LópezCortés et al., 2010), polisacáridos y pigmentos producidos por diferentes microorganismos. En el Estado de Baja California Sur, México, se encuentra una de las salineras más importantes en el mundo; esto ha permitido el hallazgo de diversos tapetes microbianos productores de biogás. Este es un combus-

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tible obtenido a partir de la degradación de la materia orgánica por actividad de los microorganismos en ecosistemas naturales y ambientes creados por el hombre (basureros y biodigestores) que carecen de oxígeno, denominados ambientes anóxicos. Este biogás es una mezcla de gases, constituida por metano (CH4), dióxido de carbono (CO2) e hidrógeno (H2); a su vez, el biogás puede ser utilizado en sistemas de combustión, como estufas u hornos; así como combustible para generadores de energía eléctrica. La producción de biogás ha cobrado relevancia debido a que es un proceso ambientalmente amigable, gracias a su contribución con la reducción de gases tóxicos tales como el monóxido de carbono y los óxidos de azufre, los cuales resultan de la degradación de los combustibles fósiles (Ramos et al., 2012). En conclusión, los tapetes microbianos de ambientes hipersalinos pueden ser considerados como una fuente alternativa para la generación de uno de los principales componentes del biogás, el cual puede ser utilizado para el abastecimiento de combustible en comunidades aisladas, donde el acceso a los combustibles de origen fósil, no renovable, es complicado. Por ende, podemos concebir las células microbianas del tapete como fábricas microscópicas, las cuales proveen sistemas de energía sustentable, que rescatarán a la sociedad, ante el inevitable agotamiento del petróleo. Finalmente, con este trabajo se pretende difundir el uso e importancia de los tapetes microbianos, ya que es un patrimonio biológico de mucho valor que se debe proteger y aprovechar.

5.2 Bacterias de crecimiento vegetal (alternativa ambiental) Uno de los grandes objetivos de la microbiología ha sido plantear alternativas de solución para los problemas ambientales que actualmente aquejan al planeta; para ello, se ha hecho énfasis en la utilización y contribución de las bacterias promotoras de crecimiento en plantas (PGPR, por sus siglas en inglés) para lograr este objetivo. Si bien el uso de estos microorganismos ha sido, en su mayoría, el mejoramiento de la producción de gran variedad de cultivos, también se ha observado que su contribución hacia otros campos es bastante amplia. Dado que dichas bacterias pueden llegar a ser utilizadas para fomentar el crecimiento de microoalgas y la eliminación de compuestos nitrogenados y fosfatados presentes en aguas residuales; de igual forma, pueden mejorar la reforestación de árboles de mangle, mediante la colonización de las raíces y el mejoramiento del crecimiento de las semillas, y pueden prevenir la erosión del suelo, al mejorar las posibilidades de supervivencia de pequeñas plántulas de cactus, las cuales sirven como estabilizadores de suelo (Bashan et al., 2012). El aumento de la población humana ha agudizado el problema de la escasez de fuentes hídricas en las zonas desérticas; ante esto, se ha planteado la reutilización de agua después de ser biotratada. Los sistemas naturales con microalgas constituyen una alternativa a este respecto, pues sus bajos requerimientos energéticos y la simplicidad de su tecnología los hacen fácilmente adaptables a las condiciones de muchas regiones. Además, presentan la ven-

taja adicional de producir biomasa rica en nutrientes, capaz de ser aprovechable económicamente. No obstante, estos cultivos, basados en microalgas en suspensión, presentan el problema de recuperar la biomasa producida una vez finalizado el tratamiento; por ende, se han diseñado sistemas que utilizan microalgas inmovilizadas en polímeros de alginato; e.g., un estudio revela que el alga Chlorella sp, al ser co-inmovilizadas con la PGPR Azospirillum brasilense, presenta mejores resultados. Esta bacteria es conocida por sus efectos en el crecimiento de cultivos agrícolas, dentro de los cuales está la producción y liberación de compuestos como fitohormonas (Bashan et al., 2012), y para asegurar que las sustancias secretadas por la bacteria alcanzarán y afectarán la microalga; una solución práctica es inmovilizarlas juntas en algún polímero. La co-inmovilización permite, también, remover fácilmente los agentes de biotratamiento, una vez que el proceso ha finalizado. Según los resultados presentados en Bashan et al. (2015), al comparar la acción de la microalga sola, contra la inmovilización combinada de la microalga y la bacteria, esta co-inmovilización logra ampliamente eliminar amonio y fosfato presente en aguas residuales sintéticas.

5.3 Restauración de suelos erosionados El daño que ha venido ocasionando el uso de agroquímicos en la agricultura ha despertado el interés sobre cómo fomentar una colaboración entre microbiota y plantas. La microfauna afecta el crecimiento de las plantas y las cadenas tróficas del suelo; pero, es mucho más impactante el efecto de las asociaciones microbianas puesto que el suelo es una hábitat complejo, donde tales poblaciones interactúan con variados sustratos, y gran parte de estas asociaciones microbiananas asociadas a las raíces de las plantas en la zona rizosférica (Reyes, Alvarez, El-Ayoubi & Valery, 2008). Gracias al constante uso de biofertilizantes químicos, los suelos han venido presentando un déficit en su producción, afectando la economía local además de proporcionar un resultado altamente negativo en el impacto ambiental. En estas áreas de trabajo, se está proyectando la utilización de plantas nativas del desierto, junto con bacterias promotoras de crecimiento vegetal como una estrategia para restaurar suelos desérticos erosionados. De acuerdo con varios estudios, se ha comprobado que, al inocular el cardon gigante Pachycereus pringlei, endémico del desierto de Sonora, con Azospirillum brasilense, se estabiliza el suelo, se promueve el crecimiento de la planta y puede recobrarse aun después de 300 días de inoculación (Bashan et al., 2012). Esta inoculación promovió el aumento de la biomasa de la planta, mientras que las características del suelo mejoraron significativamente, obteniendo como resultado la reducción de la erosión del suelo y el aumento en la cantidad de suelo superficial.

MICROORGANISMOS EN AMBIENTES EXTREMOS: EL DESIERTO COMO CASO DE ESTUDIO

6. Perspectivas de investigación

Respecto a las perspectivas de investigación, importa decir que, aunque el uso de este tipo de microorganismos y, en general, de los productos que los mismos generan resulta ser prometedor, aún existen vacíos de conocimiento y campos por explorar para obtener un real provecho de ellos. Estos espacios faltantes aluden, principalmente, a todo aquello que tiene que ver con las enzimas que dichos producen, es decir, su aislamiento, purificación y caracterización. Así mismo, se requiere un soporte investigativo alrededor del diseño de nuevos medios de cultivo los cuales sean sustentables para la supervivencia de estos organismos, los cuales, como ya se ha mencionado, se desarrollan o incluso requieren de condiciones físicas o geoquímicas extremas que son perjudiciales para la mayoría de la vida en la tierra. Adicionalmente, su uso a gran escala requiere el desarrollo de nuevos métodos industriales y de innovación tecnológica, además de un profundo conocimiento de la fisiología, genética y metabolismo de estas formas de vida. En concordancia con lo anterior, uno de los mayores atractivos de estos microorganismos son las enzimas que producen, también llamadas extremozimas. A estas proteínas se les han asociado variadas cualidades, las cuales son focos de uso biotecnológico. Entre estas características se encuentran: su biodegradabilidad, su estabilidad específica bajo condiciones extremas [pHs muy alcalinos o muy ácidos, altas temperaturas, soluciones de gran fuerza iónica o, incluso, la presencia de solventes orgánicos (Schiraldi & de Rosa, 2002)] y la disminución en la cantidad de productos de desecho que generan. Sobre estas se ha proyectado analizar su función en aquellos gradientes significativamente marcados (e.g. cerca del punto de congelamiento o de ebullición del agua). Así mismo, se quiere conocer cómo las propiedades inusuales de este tipo de enzimas pueden ser aprovechadas para optimizar procesos industriales ya existentes o, incluso, desarrollar nuevas tecnologías sostenibles (Schiraldi & de Rosa, 2002; Antranikian, Vorgias & Bertoldo, 2005). De otro lado, ha sido necesario generar, mediante la investigación de nuevos desarrollos relacionados con la clonación de estos organismos, la expresión de sus genes en hospederos heterólogos, y la invención de nuevos medios y métodos de cultivo. Todo ello permitiría incrementar, en un futuro, el número de transformaciones mediadas por extremozimas en distintos tipos de aplicaciones industriales; entre ellas las químicas, nutricionales, alimenticias y farmacéuticas (Van den Burg, 2003). Sobre el último punto, consistente en el cultivo de estos organismos, cabe decir que no se ha podido aprovechar su diversidad debido a que muchos de ellos no se han logrado aislar en cultivos puros (se ha estimado que menos del 1% de los microorganismos que se encuentran en el ambiente han sido llevados a esta fase). Incluso, se ha afirmado que, a pesar del conocimiento de las notables oportunidades que ofrecen estos organismos en la aplicación biotecnológica, solo pocos casos han sido reportados para su explotación actual, debido, en parte, a este hecho (Schiraldi & de Rosa, 2002).

Adicionalmente, el uso a gran escala de estos microorganismos exige plantear soluciones a importantes retos en la producción industrial. Entre ellos, se encuentran el diseñar estrategias de contingencia al uso de altas temperaturas en las fases de producción necesarias para algunos de estos microorganismos, las cuales generan disminución de la solubilidad de gases o el aumento en la inestabilidad de sustratos y reactivos. Entre otros desafíos se encuentran el que el metabolismo de estos microorganismos es susceptible a bajas concentraciones de sustancias inhibitorias y, sobretodo, que presentan bajas tasas de crecimiento. Bajo este contexto, se ha planteado el optimizar la composición del medio que requieren, emplear equipamiento especial (como fermentadores de gas-lift y biorreactores de membrana) y otros modos de operación (como el lote alimentado o fed-batch, el reciclamiento celular y técnicas de cultivo continuas). Esto, a su vez, se sugiere que debe estar acompañado por la innovación de biorreactores y el rediseño de bioprocesos que puedan responder a la fisiología de estos microorganismos. Como resultado, todo esto podría permitir tener un mayor rendimiento en la biomasa de estos organismos, favoreciendo la producción asociada a dichos en la escala industrial, la cual se espera pueda ser comparable a la de sus organismos contrapartes, como lo son los mesófilos (Schiraldi & de Rosa, 2002). Finalmente, el campo de investigación alrededor de los organismos extremófilos también se encuentra abierto a explorar más a fondo el uso de la ingeniería genética para aumentar la productividad a escala industrial, el desarrollo en la tecnología de fermentación de estos organismos y en pruebas de detección de los inusuales polímeros bacterianos, que estos son capaces de generar (Guezennec, 2003).

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DIVE RSIDA D MO LECULAR DE M IC R OO R G A NI S M O S DE L S U E L O : E S T U DIO C A S O DE M IC R OO R G A NI S M O S DE M A N G L A R

1 Biólogo. M.Sc. Microbiología. Ph.D. Biotecnología. Docente del Departamento de Biología, Facultad de Ciencias. Universidad Antonio Nariño. 2 Biólogo. Candidato M.Sc. Bioinformática. Facultad de Ingeniería. Universidad Nacional de Colombia. 3 Ingeniera Biotecnológica. Candidata M.Sc. Microbiología. Posgrado Interfacultades Microbiología. Universidad Nacional de Colombia. 4 Bacteriologa. Facultad de Ciencias de la Salud. Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca. 5 Estudiante pregrado. Universidad Distrital Francisco José de Caldas. 6 Bióloga. Universidad Nacional de Colombia.

Vanegas, Javier1 Mestanza, Orson2 Figueroa, Ingrid3 Muñoz, Andrea4 Pérez, Katty4 Montaño, Sandra6 Herrera, Yuly5

1. ¿Qué es la diversidad microbiana? La diversidad biológica o biodiversidad fue definida por la Convención sobre Diversidad Biológica (CBD) como la variabilidad entre los organismos vivos a partir de todas sus fuentes, incluyendo entre otros, los ecosistemas terrestres, marinos y otros acuáticos y los complejos ecológicos de los cuales ellos hacen parte; esto incluye diversidad dentro de especies, entre especies y de ecosistemas (Mace, Norris & Fitter, 2012). En procariotas, el conocimiento de la diversidad entre microorganismos es un tema de debate (Cordero & Polz, 2014) ya que la clasificación filogenética en procariotas tiene poca coherencia genética en algunos grupos microbianos y no son claros los límites que permiten diferenciar una especie de otra. Por consiguiente, algunos autores proponen el término de ”especies confusas” o fuzzy species, debido a la limitación que existe para clasificar microorganismos dentro de una especie u otra (Hanage, 2013). La caracterización filogenética de los microorganismos está basada en la secuencia de genes altamente conservados, pero que permiten la diferenciación entre grupos de organismos, siendo el gen de principal estudio el gen de la subunidad pequeña del ARN ribosomal (De Bruijn, 2011) 16S para procariotas y 18S para eucariotas. Los ribosomas juegan un papel importante en el funcionamiento de todos los organismos vivos ya que son la maquinaria por la cual las proteínas son sintetizadas; por tal razón, el arreglo espacial exacto de tales componentes puede ser crítico para el funcionamiento ribosomal. Dicha restricción funcional dicta cuáles áreas de una secuencia de ARN ribosomal deben permanecer conservadas y cuáles pueden presentar variación (Pei et al., 2010).

2. De lo cultivable a lo no cultivable El cultivo del suelo de diferentes ambientes muestran que solo el 0,01-1% de las células visibles bajo el microscopio formarán colonias en una placa de Petri; por lo tanto, la mayoría de microorganismos son no cultivables (Reeder & Knight, 2009). El desarrollo de nuevas tecnologías moleculares, independientes de los métodos de cultivo, ha permitido explorar un nuevo mundo de posibilidades para determinar la biodiversidad del suelo. El uso de marcadores moleculares como los genes ribosomales 16S y 18S permitieron desarrollar técnicas de fingerprint como la electroforesis en gel con gradiente de desnaturalización (DGGE) o de temperatura (TGGE); el análisis de restricción de ADNr amplificado (ARDRA); el polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción terminal (RFLP-T), y el polimorfismo de conformación de cadena simple (SSCP). Aunque estos métodos basados en la PCR son reproducibles y robustos, tienen sesgos asociados a la extracción de ácido nucleico y la amplificación por PCR (Garbeva, van Veen, & van Elsas, 2004). Con las técnicas de secuenciación masiva o de nueva generación, ha sido posible acceder a todo el metagenoma y desarrollar no solo acercamientos taxonómicos sino también funcionales de la comunidad de microorganismos en diversos hábitats.

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La diversidad de los microorganismos del suelo está determinada, principalmente, por las relaciones establecidas entre los microorganismos, la planta y el suelo (Garbeva et al., 2004). Por ejemplo, la rizósfera, la zona alrededor de las raíces, es uno de los hábitats de mayor complejidad del mundo y puede llegar a tener más de 55.000 OTUs (Mendes, Garbeva & Raaijmakers, 2013). En suelos de manglar, se ha reportado que las proteobacterias son el filum más abundante, con una cobertura entre el 36-40% de las secuencias (Gomes et al., 2010) y el registro de alrededor de 300 OTUs de arqueas (Pires et al., 2012). Holguín, Vázquez y Bashan (2001) proponen que en los manglares existe una estrecha relación microorganismos-nutriente-plantas. Los microorganismos transforman continuamente restos vegetales en fuentes de nitrógeno, fósforo y otros nutrientes, los cuales pueden ser utilizados por las plantas. A su vez las plantas de manglar emiten exudados radiculares que sirven como alimento para los microorganismos del ecosistema, de tal forma que se nutre toda la cadena alimenticia del manglar (Holguín et al., 2001).

3. Métodos de biología molecular para entender la diversidad funcional y taxonómica A pesar de su ubicuidad, se desconoce bastante sobre los microorganismos debido a su resistencia a ser cultivados utilizando métodos dependientes de cultivo (Tringe et al., 2005, D'Onofrio et al., 2010). Para entender más a fondo la identificación de comunidades microbianas, se han explorado diversas técnicas para la identificación de estos organismos, utilizando métodos independientes de cultivo.

3.1 ARDRA Es una técnica que implementa el análisis por restricción de un gen amplificado para acceder a la información contenida en el ADN ribosomal (Vaneechoutte et al., 1993). En esta técnica, el producto de PCR es digerido con endonucleasas de restricción, los fragmentos se separan mediante electroforesis con base en sus polimorfismos, y luego son visualizados y analizados (Morrison & Murphy, 2006). El poder de resolución del ARDRA va a depender de la enzima de restricción utilizada (Czichos, Saito & Smith, 2011; Das, 2014). Los datos de los patrones de restricción pueden ser comparados con los resultados del análisis de restricción de secuencias de ADNr conocidas y depositados en bases de datos (Sherameti & Varma, 2010). El ARDRA es utilizado para el monitoreo de comunidades microbianas, para comparar la respuesta de la diversidad microbiana frente a condiciones ambientales (Vaneechoutte et al., 1993; Torsvik & Øvreås, 2002; Garbeva et al., 2004, Liu et al., 2007), identificar clones únicos, estimar OTUs en librerías de clones ambientales con base en perfiles de restricción (Ahmad, Ahmad & Pichtel, 2011) y para la identificación de especies estrechamente relacionadas (Sherameti & Varma, 2010).

3.2 DGGE La electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante es un método robusto, utilizado para separar productos de PCR de tamaño similar con base en diferencias entre las secuencias, principalmente, en sus características de melting (Wilson, 2007). Para visualizar la diferencia en las temperaturas melting, los productos se deben correr en un gel de poliacrilamida, con agentes desnaturalizantes como formamida o urea, y se debe emplear una temperatura de corrida alta y constante, usualmente de 60°C. El gradiente de desnaturalización en la DGGE debe ser relativamente amplio, entre 20-80% (Wilson, 2007). Durante la electroforesis, los productos de PCR corren en el gel como ADN de doble cadena hasta que alcanzan su punto de inicio de la desnaturalización (Walker & Rapley, 2008). La separación de los fragmentos se basa en la movilidad electroforética decreciente del ADN de doble cadena en un gel con gradiente denaturante de la mezcla de urea y formamida. Algo tan pequeño como un único par de bases puede generar un cambio en la movilidad (Wilson, 2007). Otro factor importante que rige la separación en la corrida electroforética es el contenido de guanina-citosina de cada fragmento. Las secuencias con mayor contenido de guanina-citosina, que son más estables, migrarán más que las que tengan un bajo contenido. El resultado final será un patrón de bandeo que varía según la composición de la comunidad microbiana (Varma & Oelmüller, 2007). La DGGE se ha utilizado para analizar mutaciones puntuales (Walker & Rapley, 2008) y para el análisis de diversidad microbiana (Ferris, Muyzer & Ward, 1996; Torsvik & Øvreås, 2002; Kirk et al., 2004; Varma & Oelmüller, 2007; Dowd et al., 2008; Leite et al., 2012).

3.3 Los microarreglos Estos comprenden el uso de sondas cortas de oligonucleótidos, complementarias a las transcripciones de secuencia de una muestra problema que son fijadas en una matriz sólida (Malone & Oliver, 2011). Los microarreglos se han implementado para el estudio de expresión diferencial de genes, hacer seguimiento a procesos ambientales y para el diagnóstico clínico (He et al., 2007). Entre las limitaciones de los microarreglos, tenemos el diseño de sondas ya que las secuencias de un gen funcional son altamente homólogas y/o incompletas. Por otra parte, el alto costo del equipo para la lectura de los arreglos llegó a superar los US$50,000. A pesar de estas limitaciones, los microarreglos evolucionaron hacia la detección de genes funcionales, con el fin de responder a un gran número de preguntas relacionadas con los ciclos biogeoquímicos, la biorremediación, el cambio climático y las teorías ecológicas (Deng et al., 2010); así como para la búsqueda de microorganismos en el medio ambiente; por esta razón se han llevado a cabo varios cambios en estos microarreglos basados en FGA (functional gene arrays) a través de la implementación de la tecnología GeoChip.

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3.4 GeoChip

GeoChip es un tipo especial de microarreglo, basado en arreglos de genes funcionales, el cual contiene sondas para la detección de genes clave involucrados en procesos funcionales microbianos, tales como los ciclos biogeoquímicos del carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y metales; la biodegradación de contaminantes medioambientales, resistencia a antibióticos, procesamiento de energía y respuesta al estrés (He et al., 2015). El GeoChip, también, ha sido empleado para el estudio de los procesos y actividades de las comunidades microbianas en el ámbito de la salud humana y la agricultura (He et al., 2007). El GeoChip permite la detección simultánea de miles de marcadores para genes funcionales y poblaciones microbianas (Wang et al., 2009) en corto tiempo. Las primeras versiones del GeoChip 2.0 contaban con más de 24.000 sondas de todos los genes conocidos, implicados en diversos procesos biogeoquímicos, ecológicos y ambientales (He et al., 2007). La implementación del GeoChip 2.0 permitió analizar las comunidades microbianas tanto en suelos, como en aguas, yacimientos de petróleo, sedimentos marinos, entre otros hábitats. El GeoChip 3.0 cuenta con 56.990 secuencias genéticas de diversos genes funcionales, con 27.812 sondas, de las cuales 9.251 son empleadas para secuencias específicas y 18.561 para grupos específicos (Deng et al., 2010). GeoChip 4.0 fue desarrollado en año 2014 y permite el análisis de ~82.000 sondas, las cuales cubren 410 familias de genes funcionales, relacionadas con el ciclo del carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y otros (Gao et al., 2014). El GeoChip 5.0, la versión actual, contiene 167.044 sondas distintas, las cuales cubren 395.894 secuencias codificantes de ~1500 familias de genes funcionales, implicados en el ciclo del carbono, nitrógeno, azufre y fósforo; además de la degradación y fijación de metano; también está incluido el metabolismo energético, la homeostasis de metales, genes filogenéticos, metabolismo secundario y respuesta al estrés (Cong et al., 2015).

3.5 Metagenómica La metagenómica comprende la extracción, secuenciación y análisis estadístico del ADN genómico total de un ecosistema (Riesenfeld, Schloss & Handelsman, 2004; Handelsman, 2004). Del análisis estadístico, se generan datos que, al ser interpretados, permiten una mejor comprensión de la diversidad, el papel, el metabolismo y la evolución de las comunidades microbianas presentes en un ecosistema (Kim et al., 2013). La metagenómica facilita la identificación de microorganismos no cultivables, expandiendo y transformando nuestra visión del mundo microbiano. En la metagenómica, los datos provienen de comunidades microbianas heterogéneas, a veces, con más de 10.000 especies que son analizados por herramientas bioinformáticas que presentan nuevas demandas en la interpretación de secuencias voluminosas, ruidosas, y, a menudo, parciales (Wooley, Godzik & Friedberg, 2010).

Para muestras microbianas, los diferentes OTUs se caracterizan por ADNr 16S (procariotas) o 18S e ITS (eucariotas). Posteriormente, se realiza una filtración de las muestras ambientales, con el objetivo de: (1) obtener la mayor cantidad posible de lo que se quiere buscar y (2) dejar de lado todo lo que no desea. Después, se lleva a cabo la secuenciación. En metagenómica, la secuenciación shotgun se realiza de la misma manera que en la genómica de un cultivo clonal. Sin embargo, el material genómico prima no viene de un solo organismo: se trata de una comunidad de microbios, de ahí el nombre de secuenciación shotgun del medio ambiente (Wooley et al., 2010). Al obtener el set de datos posterior a la secuenciación, se realiza una serie de pasos a través de diferentes herramientas empleadas por pipelines o flujos de trabajo. El estudio de las comunidades microbianas en diversos ambientes ha venido creciendo de manera paralela con el desarrollo de las tecnologías de secuenciación de ADN, lo cual permite acceder a una gran cantidad de información genómica y expandir los enfoques y las preguntas a abordar acerca de las comunidades (Riesenfeld et al., 2004). Actualmente, las tecnologías de secuenciación de alto rendimiento pueden agruparse en dos grupos de acuerdo con la metodología utilizada (tabla 4-1); el primer grupo de tecnologías realizan amplificación de ácidos nucleicos por PCR entre las que se encuentran Roche 454 Genomes Sequencer (Roche Diagnostics Corp., Branford, CT, USA), HiSeq 2000 (Illumina Inc., San Diego, CA, USA), AB SOLiD System (Life Technologies Corp., Carlsbad, CA, USA) y Ion Personal Genome Machine (Life Technologies, South San Francisco, CA, USA). Las tecnologías que no realizan un paso de amplificación son HeliScope (Helicos BioSciences Corp., Cambridge, MA, USA) y PacBio RS SMRT system (Pacific Biosciences, Menlo Park, CA, USA) (Shokralla et al., 2012).

3.6 Proteómica La proteómica es la línea de investigación que se encarga de caracterizar conjuntos totales de proteínas expresadas en un momento dado en una muestra biológica; el proteoma se sintetiza a partir de los genes (genoma) que lo contienen (Battaner-Arias, 2012). Los proteomas son dinámicos y cambian con el tiempo, con el estadio de desarrollo y con las condiciones intra y extracelulares (Mojica, Sánchez & Bobadilla, 2003). Este conjunto de proteínas permite identificar, categorizar, separar y clasificar las proteínas con respecto a su función, su estructura, su actividad biológica, sus modos de acción, su localización celular, sus modificaciones post-transcripcionales y las interacciones que establecen entre estas o con otras moléculas (Jara & Kopchick, 2013). De este modo, se pueden identificar las redes funcionales que establecen las proteínas y su dinámica durante procesos fisiológicos y patológicos (Cieslak & Ribera, 2006). La proteómica se emplea en la identificación de nuevos marcadores proteicos para los blancos moleculares en el diseño de medicamentos para la determinación de proteínas involucradas en la producción de enfermedades y el análisis de procesos de transducción de señales (Jara & Kopchick, 2013). Esta se divide, según su estudio, en tres áreas muy importantes; estas son: la proteó-

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mica de expresión, la cual determina la abundancia relativa de proteínas y todo el proceso de modificaciones postranscripcionales (Pallás, 2008); la proteómica estructural, encargada de caracterizar la estructura tridimensional de las proteínas, aportar indicios sobre las funciones de una proteína desconocida, sugerir la ubicación de sitios activos e información sobre otras moléculas que pueden estar haciendo interacción con la proteína (Pierce, 2010), y la proteómica funcional, cuya finalidad es estudiar la localización y distribución subcelular de proteínas, y, allí, analizar las interacciones que se producen entre las proteínas y otras moléculas con el fin de determinar su función (Pallás, 2008). Las técnicas más usadas en proteómica se basan, fundamentalmente, en la electroforesis y en la espectrometría de masas (Pierce, 2010). Dependiendo del objetivo del estudio, se puede usar uno u otro método, como lo son DIGE (electroforesis diferencial en gel) (Castagnino, 2008) MudPIT (tecnología de identificación de proteínas multidimensional) e ICAT (marcaje isotópico diferencial), las cuales son usadas para analizar e identificar a gran escala el proteoma, comparar los patrones de expresión de proteínas en dos o más muestras y lograr la separación de proteínas (Cieslak & Ribera, 2006). Cuando se mencionan procesos que buscan analizar e identificar individualmente las proteínas, se usan distintos tipos de espectrometría de masas como el SELDI-TOF-MS (espectrometría de masas en "Tiempo de Vuelo" mediante desorción/ionización por láser de superficie) MALDI-TOF (desorción/ ionización mediante láser asistida por matriz en “tiempo de vuelo”), MS/MS (espectrometría de masas en tándem), cuyos resultados darán origen a un conjunto de fragmentos peptídicos, denominado huella peptídica, los cuales se obtienen al tratar una proteína específica con una proteasa determinada (Jara & Kopchick, 2012). Con esto, se pueden reunir numerosas bases de datos a través de programas bioinformáticos, los cuales permiten recoger numerosas huellas peptídicas de proteínas conocidas, con la finalidad de poder determinar otras proteínas mediante la comparación de los datos ya conservados en los programas (Cieslak & Ribera, 2006).

4. Herramientas bioinformáticas para el estudios de la diversidad microbiana El uso de técnicas de secuenciamiento masivo de ADN o ARN (tabla 4-1) han demostrado ser poderosas para la investigación biológica, puesto que revelaron la gran biodiversidad de microorganismos existentes; esto permitió clarificar las relaciones de diversidad y función de las comunidades microbianas en diferentes escenarios ambientales (Jiang et al., 2013). Sin embargo, la gran cantidad de información generada por las técnicas de secuenciamiento masivo de última generación está en magnitud de Gigabytes o Terabytes dependiendo del tipo de análisis que se desea realizar; por lo tanto, el campo de la metagenómica o metatranscriptómica es dependiente de la bioinformática (Pradhan, 2016).

En un análisis metagenómica o metatranscriptómico, el 99% de las lecturas (reads), producto de la secuenciación ambiental, provienen de organismos desconocidos, de los cuales no existe referencia en las actuales bases de datos de nucleótidos o proteínas (Lin, 2015). Por lo tanto, las herramientas bioinformáticas que se han desarrollado para asignar los reads, a alguna característica de diversidad o función en los microorganismos, solo pueden detectar el ~1% de lo conocido. En estudios donde se secuencia el ADN total de un ambiente, es posible realizar dos aproximaciones a partir de los datos obtenidos. Primero, es posible llegar a identificar las especies que se encuentran en nuestro lugar de estudio; para este caso, es posible usar algoritmos que busquen patrones de similitud entre los reads y las secuencias reportadas en las bases de datos; hay que tener en cuenta que es una búsqueda por homología entre secuencias. Entre las herramientas bioinformáticas que trabajan con asignación por similitud de secuencia, tenemos a KRAKEN y REIMS que han llegado a índices de precisión y sensibilidad de ~99% (Wood & Salzberg, 2014; Scheuch et al., 2015). Segundo, los métodos que se basan en composición de secuencia (contenido de GC, longitud, A% y T%), usando técnicas de aprendizaje de máquina supervisadas (se les enseña), presentan índices de precisión de ~97,01% y sensibilidad de ~96,15% clasificando los reads (Wu et al., 2014). Los métodos que se basan en la composición de una secuencia con algoritmos no supervisados (aprenden solos) presentan un índice de precisión de ~84% (Lin, 2015). Finalmente, los algoritmos semi-supervisados se han trabajado muy poco en el campo de la metagenómica y en las publicaciones no se han reportado los índice de precisión o sensibilidad (Zhang, Sun & Cole, 2014; Sharma et al., 2015). En una análisis de metagenómica o transcriptómica, es posible identificar el potencial funcional de las especies presentes en el ambiente, mediante la anotación de genes funcionales a partir de los reads; en este caso, no es suficiente asignar reads por homología a las bases de datos; es necesaria la identificación de secuencia promotoras características de un gen, como es el caso de regiones promotoras, Shine-Dalgarno, marcos abiertos de lectura y una secuencia terminadora para poder dar la certeza de que estamos frente a un posible gen. Las herramientas bioinformáticas en este contexto usan algoritmos probabilísticos de predicción. Entre los más usados, tenemos: modelos ocultos de Markov, aprendizaje de máquina, programación dinámica y técnicas ab initio; entre las herramientas más importantes tenemos a Orphelia (Hoff et al., 2009), que usa una red neuronal; FragGeneScan (Rho et al., 2010; Kim et al., 2015) y Xander (Wang et al., 2015), que usan modelos ocultos de Markov; y Metaprodigal (Hyatt et al., 2012), que usa algoritmos de programación dinámica. No obstante, las herramientas relacionadas con la predicción de genes presentan el inconveniente de tener mayor rendimiento con reads 300-700 pb y no con reads pequeños 50-200 pb; asimismo, los porcentajes de especificidad varían entre 62-91% y para sensibilidad de 82,1- 98,4% (Tang & Borodovsky, 2014).

Tabla 4-1. Características de las tecnologías de secuenciamiento masivo y aplicaciones en el estudio de los ecosistemas ambientales.

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Máquina

GLX Titanium (454 Roche)*

Longitud de la lectura / Precio

~1 millón de lecturas de ~400 -700 pb / $ 7000 por corrida (Liu et al., 2012)

Porcentaje de error

0.1% de sustitución. 0.56% indels

Ventajas (V) y limitaciones (L)

Ecosistema (enfoque) / Lugar de estudio

(V) Lecturas largas. El proceso de secuenciamiento es rápido. (L). Tasa de error con más de 6 polibases, Alto costo. Bajo rendimiento

Manglar (microbioma asociado a Avicennia marina)/ Mar Rojo. Manglar (microbioma) / São Paulo - Brasil Manglar (variación de las comunidades bacterianas) / China Sedimentos marinos / China Lago (comunidades microbianas planctónicas) / EE.UU.

HiSeq Illumina 2000**

~75 - 90 Gb por corrida, lecturas de 150 bp / $4050 por corrida (Goodwin et al., 2016)

0.1% de sustitución (Goodwin et al., 2016)

(V) Alto rendimiento en la generación de lecturas, baja tasa de errores. (L). Secuenciación de lecturas cortas

Ion Torrent***

~1.5 millones - 3 millones de lecturas de ~200 pb/ $225 - $625 por corrida (Loman et al., 2012)

~1.71% total (Quail et al., 2010) 1% in 1% dels (Kuczynski et al., 2011)

(V) Corto tiempo de corrida (2h) Maquinaria de bajo costo y simple Baja tasa de error. (L) Bajo rendimiento

Río de Athabasca / Canadá. Estanque anaeróbico cubierto/ Australia. Suelo Bosque Experimental Hitchiti /E.U.

0.1% (Goodwin et al., 2016)

(V) Permite la generación de millones de secuencias cortas, cobertura más profunda en ARNs (Morozova & Marra, 2008), eliminación del paso de la clonación en vivo (L) Lecturas cortas (Mardis, 2008)

No se ha implementado en ecosistemas ambientales

SOLiD™ 4 System****

3000 Mb por corrida, 25-35 pb longitud de la corrida/$17447 por corrida (Mardis, 2008)

Máquina

Pacific Biosciences*****

MinION™ (Oxford Nanopore Technologies)******

Longitud de la lectura / Precio

350 millones de lecturas entre 1.100 - 30.000 pb (Rhoads & Au, 2015) / $110-900 por corrida(Glenn 2011)

0.005 - 0.09 Mb (Laver et al., 2015) / $1000

Porcentaje de error

Ventajas (V) y limitaciones (L)

Ecosistema (enfoque) / Lugar de estudio

13% (Rhoads & Au, 2015)

(V) Corto tiempo de corrida (0.5 - 4h) (Rhoads & Au, 2015). No requiere amplificación de las secuencias (PCR). Detección directa. Longitud de los reads. (L) Alta tasa de error

Aguas residuales / Carolina del Sur, EE.UU.

(V) Secuenciación directa de moléculas únicas (no requiere amplificación, marcaje ni maquinaria óptica). Detección en tiempo real. Longitud de los reads. Corto tiempo de corrida. (L) Alta tasa de error

No se ha implementado en ecosistemas ambientales

38.2% (Laver et al., 2015)

Fuente: elaboración propia, con base en la información de *Alzubaidy et al. (2016) y Andreote et al. (2012); **Jiang et al. (2013), Wang et al. (2012) y Oh et al. (2011); ***Yergeau et al. (2012); Whiteley et al. (2012) y Brown et al. (2013); ****Mardis (2008); Morozova & Marra (2008); *****Marshall et al. (2012). ******Benítez-Páez & Sanz (2016).

Es posible evidenciar que las técnicas de secuenciamiento incrementan la complejidad de análisis, además de la ya implícita en un metagenoma; los factores principales son: el tamaño de los reads que producen y los errores en el secuenciamiento (inserciones, deleciones y tasa de error). Esto requiere del uso de herramientas bioinformáticas que tengan en cuenta estos detalles al realizar la predicción taxonómica o funcional de un read en un metagenoma. En tal sentido, realizar un análisis bioinformático no es tan sencillo como ejecutar simplemente un programa; hay que conocer los puntos débiles y fuertes de la herramienta bioinformática que se está utilizando. Se sabe que no necesariamente la herramienta bioinformática más veloz, es la más precisa en la asignación de los reads a las característica biológica (Lindgreen, Adair & Gardner, 2015), esto podría derivar en sobre estimación de los valores de diversidad o mala predicción de los genes asociados a función de un metagenoma o metatranscriptóma.

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5. Trabajos de metagenómica en manglares

Xu et al. (2014) estudiaron 33 metagenomas de suelos, entre estos, el suelo de manglar, con el propósito de explorar las caracterizaciones de la microbiota del suelo a través de la integración de herramientas bioinformáticas actuales. Para tal fin, implementaron un pipeline personalizado para visualizar la composición microbiana y su potencial funcional. Para estimar la composición microbiana, utilizaron las herramientas MetaPhylAn v1.7 y BLAST v2.2.22; hicieron un análisis de varianza multivariado, basado en permutación (PERMANOVA); asignaron los reads con KEGG Orthology; realizaron la reconstrucción metabólica de los metagenomas, empleando la metodología HUMAnN; implementaron MinPath para calcular la cobertura y las abundancias relativas de las unidades funcionales manualmente asignadas; por último, detectaron las interacciones microbianas mediante la construcción de una ruta de interacciones de co-ocurrencia y co-exclusión, para lo que emplearon Cytoscape plugin CoNet 1.0b2. Los análisis revelaron la presencia de las familias Ectothiorhodospiraceae (37.0%) y Desulfobulbaceae (30.8%) en los sedimentos de manglar. El análisis de la similitud estructural entre los suelos, mostraron que el suelo de manglar presentó un 0.52 de similitud con el suelo ártico; por último, las rutas de interacción revelaron que habían 126 asociaciones, que el 54% corresponden a co-presencia y el 56% remanente a co-exclusión. Simões et al. (2015) identificaron las comunidades fúngicas asociadas a la rizósfera de Avicennia germinans en un manglar de Thuwal, Arabia Saudita. Para tal fin, recolectaron cuatro muestras de sedimento en suelo rizosférico y dos de sedimento en suelo no rizosférico del mangle Avicennia germinans. De las seis muestras de suelo se extrajo el ADN con el kit ZR Soil Microbe ADN MidiPrep de Zymo Research y se llevó a cabo la secuenciación mediante la plataforma 454 GS FLX Titanium de Roche. Se determinó la abundancia relativa a nivel de clase y la similitud entre las muestras mediante un análisis de componentes principales. El análisis estadístico se realizó con el servidor MG RAST. Los resultados mostraron una alta diferencia entre las muestras de suelo rizosférico y el suelo no rizosférico: mediante el análisis de componentes principales, se evidenció que, a nivel de clase, las muestras control fueron distintas de las de suelo rizosférico, y que estas últimas muestran una menor variabilidad intragrupo. A nivel general, los resultados mostraron una abundancia de los filos Ascomycota y Basidiomycota, los cuales representaron el 80% y 20% de los reads, respectivamente (Simões et al., 2015). Alzubaidy et al. (2016) publicaron un estudio titulado “Rhizosphere microbiome metagenomics of gray mangroves (Avicennia marina) in the Red Sea”, dentro del marco del proyecto “A. marina rhizosphere”, cuyo objetivo era comparar el microbioma asociado a la rizósfera de A. marina con el asociado al suelo no rizosférico, en sedimentos recolectados al norte del Mar Rojo, con un enfoque metagenómico. Para tal fin, recolectaron cuatro muestras de sedimento en suelo rizosférico y dos muestras de sedimento en suelo no rizos-

férico como control. De las muestras, determinaron parámetros fisicoquímicos: temperatura, pH, conductividad, salinidad, nitratos, Mg, K, S y P, metales traza, materia orgánica, y extrajeron el ADN utilizando el kit ZR Soil Microbe DNA MidiPrep de Zymo Research Corporation. El ADN extraído fue secuenciado mediante la plataforma 454. Las secuencias fueron analizadas con el servidor MG-RAST, los reads fueron anotados funcionalmente, utilizando la base de datos SEED Subsystems; la identificación de las funciones fue realizada utilizando la herramienta STAMP y la ruta metabólica de los osmolitos y otras rutas asociadas fueron identificadas utilizando la base de datos DEOP. Los resultados de los parámetros físico-químicos mostraron que la temperatura, el pH, la conductividad y la salinidad fueron mayores en el suelo rizosférico, así como los valores de materia orgánica, nitratos, Mg, K, P y S. Los datos de las comunidades fúngicas se excluyeron de este estudio y se mostraron en el publicado por Simoes et al. (2015), anteriormente descrito. A nivel de filo y género, las comunidades procariotas del sedimento de suelo rizosférico mostraron menor variabilidad intra-grupo. El taxón Arquea fue dominado por los órdenes: Methanosarcinales, Thermococcales, Methanococcales y Methanobacteriales en el sedimento de suelo no rizosférico, y por los órdenes: Halobacteriales y Nitrosopumilales en los de suelo rizosférico. Respecto al taxón bacteria, los suelos, en general, estuvieron dominados por proteobacteria, Bacteroidetes y Firmicutes. A su vez, los sedimentos de suelo rizosférico mostraron mayor riqueza a nivel de especie que los de suelo no rizosférico. Las bacterias detectadas en los sedimentos de suelo fueron, principalmente, reductoras de sulfato, como principales representantes de las Deltaproteobacterias. Los resultados arrojados por anotación con SEED Subsystems revelaron que las secuencias obtenidas de los sedimentos de suelo rizosférico estuvieron enriquecidas en rutas relacionadas con el metabolismo de compuestos aromáticos, elementos genéticos móviles, potasio y de utilización de los osmolitos para aliviar el estrés producto de las altas concentraciones de sal características de los manglares y, en el caso especial del mangle, Avicennia marina. Chan e Ismail (2015) quisieron investigar el metagenoma y, a partir de este, determinar el papel ecológico de los microorganismos presentes en muestras de suelo en el manglar de Rantau Abang, en la costa este de la península de Malasia. Se extrajo el ADN genómico; este ADN fue secuenciado con Illumina HiSeq 2000. Para realizar el análisis taxonómico, se cortaron las secuencias obtenidas con CLC Bio Genomic Workbench 5.5.2 (Aarhus, Denmark); dejando longitudes de 50 nucleótidos, con el fin de eliminar las lecturas de baja calidad. Estos datos, que fueron cortados, se compararon con la base de datos de NCBI, utilizando Blastall 2.2.25; para el estudio de genes funcionales, las secuencias de nucleótidos cortadas fueron ensambladas con el montaje de novo en CLC Bio Genomic Workbench. La predicción de genes se realizó en las secuencias extraídas utilizando Prodigal 2.60; cada predicción de genes fue anotada, usando RAPsearch 2.09. Los datos obtenidos para el análisis taxonómico y funcional fueron analizados en MEGAN 4.70.4.

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Como resultado, se obtuvo que el 43,72% de la muestra correspondía al filo Proteobacteria. Se detectaron 43 clases de bacterias en la muestra, donde las clases más abundantes fueron: Deltaproteobacteria (19,29%) y Alphaproteobacteria (16,89%), seguido de Acidobacteria (16,61%). A nivel de género, el más abundante fue Acidobacterium; así mismo, se detectaron un total de ocho clases de arqueas, como: Thermoprotei (63,78%) y Methanomicrobia (17,85%). El análisis funcional metabólico se realizó a través de la reconstrucción de la biblioteca metagenómica. El gen más abundante detectado en la muestra se asoció con el metabolismo de hidratos de carbono (12,97%). Los siguientes genes más abundantes en la muestra fueron asociados con el metabolismo de proteínas (9,89%), virulencia (9,53%), respiración (8,39%), y aminoácidos y sus derivados (8,19%) (Chan e Ismail, 2015).

6. Conclusión Existen muchas técnicas moleculares para entender la diversidad microbiana. No obstante, la elección de cualquier técnica radica en la aproximación o descripción del problema que se desea abordar; en algunos casos, necesitaremos procedimientos que nos proporcionen la máxima resolución posible; otras veces, nos bastará un acercamiento descriptivo del problema. Se espera que las técnicas moleculares vayan mejorando a la par con las herramientas bioinformáticas, para obtener una descripción más precisa y detallada de los eventos naturales que vienen sucediendo en los microorganismos y su interacción con el ecosistema. La metagenómica se ha convertido en una técnica valiosa para el estudio de la diversidad microbiana y la inferencia del rol funcional de los microorganismos en los ecosistemas, especialmente, para el estudio de los manglares que albergan comunidades dinámicas y complejas de microorganismos. A su vez, estudiar la biodiversidad microbiana de los manglares es imperativo, dado que el rol de los microorganismos en estos ecosistemas está bien documentado en servicios ambientales, tales como la degradación de materia orgánica, la promoción del crecimiento vegetal, la protección de las plantas frente a patógenos y el ciclo de nutrientes. Si bien la importancia de los microorganismos y de los manglares es bien conocida, han sido pocos los estudios publicados que revelan la diversidad microbiana con un enfoque metagenómico en estos ecosistemas, y limitados para ecosistemas en el ámbito nacional.

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USO DE MICROORGANISMO S ENTO M O P A T Ã&#x201C; G ENO S P A R A E L CONT R O L DE IN S ECTO S - P L A G A

1 Biólogo. MSc Microbiología. PhD Biotecnología. Docente del Departamento de Biología, Facultad de Ciencias. Universidad Antonio Nariño 2 Bacterióloga. Candidato MSc Biotecnología. Universidad Nacional de Colombia. 3 Bacterióloga. Candidato MSc Bioquímica. Facultad de Ciencias. Universidad Nacional de Colombia 4 Estudiante pregrado. Departamento de Biología. Facultad de Ciencias. Universidad Nacional de Colombia 5 Estudiante pregrado. Departamento de Biología. Facultad de Ciencias. Universidad Nacional de Colombia 6 Estudiante pregrado. Departamento de Biología. Facultad de Ciencias. Universidad Nacional de Colombia 7 Estudiante pregrado. Departamento de Biología. Facultad de Ciencias. Universidad Nacional de Colombia 8 Biólogo. Universidad Nacional de Colombia

Vanegas, Javier1 Pantoja, Luisa2 Boyacá, Johanna3 Salas, Paula4 Pulido, Ana5 Santa, Andrea6 Rodríguez, Edwin7 Barriga, Oscar8

1. Introducción Un insecto se considera plaga de un cultivo cuando genera un daño económico al incidir negativamente en los rendimientos y la calidad del producto (Badii, Landeros & Cerda, 2015). Una de las estrategias más empleadas para el control de estos insectos plagas es la aplicación indiscriminada de insecticidas de síntesis química, lo que ha generado: contaminación de campos y cuerpos de agua; resistencia de insectos plaga a varios productos químicos; que plagas de importancia secundaria suban a nivel primario (Marín-Domínguez et al., 2014); destrucción de enemigos naturales, y aumento de los costos de producción (Badii et al., 2015). Por ejemplo, la polilla guatemalteca Tecia solanivora (Lepidóptero: Gelechiidae) es considerada la principal plaga de cultivos de papa en Venezuela, Colombia y Ecuador (Carballo & Falguno, 2013), genera daños hasta del 100% en tubérculos de papa que son almacenados (López-Ávila, Vargas & Rubio, 2004, Arias-Restrepo et al., 1996) y considerables daños en el tubérculo bajo condiciones de campo (Benavides, 2000). Para detener estos insectos plaga, se han usado diversos enemigos naturales, como bacterias, virus, nematodos, hongos y protozoos, como estrategias de control biológico. Entre las principales bacterias entomopatógenas para el control de T. solanivora esta el Bacillus thuringiensis (Bt). Villanueva et al. (2009) reportan que dos cepas de Bt con los genes cry1Ac y cry2 presentaron alta actividad contra T. solanivora, con una dosis letal 50 de 56,82 ng/µl. López-Pazos et al. (2010) reportan qué proteínas híbridas Cry pueden mejorar la toxicidad contra T. solanivora, en comparación con las proteínas parentales Cry1B y Cry1I. Similarmente, Pitre-Ruiz, Hernández-Fernández y Bernal-Villegas (2008) indican que existe una mayor actividad tóxica de la proteína recombinante Cry1B que las proteínas Cry1Aa, Cry1Ac Cry1B y Cry1C contra larvas de T. solanivora. Por otra parte, Torres-Villalobos et al. (2012) desarrollaron líneas de papa Solanum tuberosum spp., capaces de expresar proteína Cry1Ac de Bt con valores entre 88 a 639 ng mg-1 de tejido foliar fresco para el control de T. solanivora. Otra estrategia exitosa para el control de esta plaga es el uso de virus. Espinel-Correal et al. (2010) reportan el aislamiento y la patogenicidad de granulovirus en Colombia, con actividad patogénica contra T. solanivora. Similares resultados fueron encontrados por Carballo y Falguno (2013). En contraste, el uso de hongos entomopatógenos para el biocontrol de T. solanivora es limitado y con pocas perspectivas. Pkr una parte, Feris et al. (2002), al enfrentar cepas de Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae, solo reportaron una mortalidad máxima del 15,72% en larvas de T. solanivora. Villamil y Martínez (2014) reportan bajo potencial de hongos entomopatógenos nativos de Beauveria frente a T. solanivora al obtener una mortalidad máxima acumulada de 8,5%, luego de 32 días de infección. Por otra parte, se ha evaluado el biocontrol de T. solanivora con nematodos. Argotti et al. (2010) reportan porcentajes de mortalidad de T. solanivora del 77% y 62%, usando los nematodos Heterorhabditis y Steinernema, respectivamente. El uso de estos nematodos es muy importante, ya que muchos insectos plaga pasan parte de su ciclo biológico en contacto con el suelo.

A continuación describiremos los principales controladores biológicos contra insectos plaga.

USO DE MICROORGANISMOS ENTOMOPATÓGENOS PARA EL CONTROL DE INSECTOS-PLAGA

2. Control biológico de insectos mediante hongos entomopatógenos

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Los hongos entomopatógenos (EPF, por sus siglas en inglés) constituyen un total de 90 géneros y 700 especies, de los cuales solo algunos entomoftorales e hyphomycetes han sido estudiados (Khachatourians & Qazi, 2008). Los EPF, a diferencia de las bacterias entomopatógenas, no necesitan ser ingeridos por el insecto plaga, puesto que la infección puede ocurrir por contacto y adhesión de las esporas al insecto, incluso por la trasmisión insecto-insecto (Díaz et al., 2006). Los EPF cumplen importantes funciones ecológicas, como la regulación de poblaciones de insectos, y facilitan la toma de nutrientes como P y N por parte de las plantas (Bidochka, 2010). La actividad entomopatógena de estos hongos depende de la relación patógeno-hospedero, la cual está regulada a nivel genético y celular (Keswani, Singh & Singh, 2013; Chen et al., 2014, Ortiz-Urquiza & Keyhani, 2015). Las tres principales vías de regulación de la actividad entomopatógena en hongos son MAPK, Fus3/Kss1, Slt2 o Hog1, específicamente en la respuesta a estrés y la virulencia (Chen et al., 2014; Tseng, Chung & Tzean, 2014; Ortiz-Urquiza & Keyhani, 2015).

3. Principales hongos con actividad entomopatógena Los EPF más estudiados y utilizados como principio activo de productos comerciales son Beauveria bassiana (Ascomycota: Hyphomycetes), Metarhizium anisopliae y Paecilomyces fumosoroseus (Ascomycota: Hypocreales) (Shi & Feng, 2004; Meikle et al., 2005; Michalaki et al., 2007; Vega et al., 2008). Estos EPF se caracterizan por: su distribución cosmopolita, una gran adaptabilidad al entorno (GóngoraBotero, Marín-Marín & Benavides-Machado, 2013), una actividad entomopatógena frente a un gran número de insectos como lepidópteros y coleópteros, las clases más peligrosas de plagas agrícolas, que ocasionan miles de millones de dólares en pérdidas de cosechas cada año (Resquín-Romero, Garrido-Jurado & Quesada-Moraga, 2016. B. bassiana es utilizado en el control de langostas, áfidos, escarabajos y contra la mosca blanca (Díaz et al., 2006). Se caracteriza por presentar hifas blancas de aspecto algodonoso en medio de cultivo PDA (Agar papa dextrosa) y en el insecto infectado (Góngora et al., 2013; Pinto-Oliveira et al., 2015). La actividad entomopatógena de M. anisopliae se ha reportado en termitas, chisas, langostas, picudos del chile y escarabajos (Díaz et al., 2006). Este hongo tiene un aspecto polvoso, con una tonalidad verde-amarilla y contorno blanco (PikKheng et al., 2009). P. fumosoroseus tiene actividad en termitas, larvas de polilla, áfidos y whitexies (Altre & Vandenberg, 2001; James, 2003; Meikle et al., 2005). Al esporular tiene un color blanco que cambia a medida que los nutrientes se acaban y, con el tiempo, el hongo cambia a un color gris (Luangsa-Ard et al., 2005).

Los principales mecanismos de acción para estos hongos y el gen asociado a cada enzima o toxina se relacionan en la tabla 5-1.

Tabla 5-1. Mecanismos de acción de M. anisopliae, B bassiana y P. fumosoroseus.

Hongo

Metarhizium anisopliae

Beauveria bassiana

Paecilomyces fumosoroseus

Enzima/Toxina

Gen asociado

Superóxido dismutasa

Sod

Proteasas

Pr1B, Pr1 (A–K)

Proteína de unión al ADN

CRR1

Regulador a respuesta a nitrógeno

nrr1

Quitina sintasa, quitinasas

chit1, chi2

Carboxipeptidasa de zinc

MeCPAA

Hidrofobina, Peptidos sintasas, Trealasa

SsgA

Destruxinas

No reportado

Triptófano sintasa

trp1

Bassianina I

prt1

Serina-endoproteasa

prt1-like

Quitinasa, endonucleasa

Chit

Reparación daños por UV

buv1

Tonellin, Bassianin, ácido oxálico, Beauvericina, toxina 10-kDa, TF-1 y TF-2, beauverolides

No reportado

Bassiacridina

No reportado

Paecilomicina, beauverolides, ácido piridino-2-6-dicarboxilico, Beuvericina, leucinostins

No reportado

Fuente: tomado y modificado de Khachatourians & Qazi (2008).

4. Ciclo de vida del hongo y proceso infectivo en el insecto el proceso infectivo de los EPF inicia por la unión de las esporas a la superficie del integumento de los insectos, la formación del tubo germinativo, la producción de apresorios y la liberación de una batería enzimática constituida por proteasas, quitinasas, lipasas, quitobiasas, lipooxigenasas, y la producción de toxinas (Vega et al., 2008; Chen et al., 2014; Ortiz-Urquiza & Keyhani, 2015), las cuales le permiten, al

101

hongo, penetrar la cutícula del insecto, posterior a esto se desarrollan los cuerpos hifales y la diseminación del hongo a través del hemocele por todos los tejidos, ocasionando, finalmente, la muerte del insecto, iniciando un nuevo proceso de esporulación (Vega et al., 2008; Ortiz-Urquiza y Keyhani 2013; Tseng et al., 2014).

USO DE MICROORGANISMOS ENTOMOPATÓGENOS PARA EL CONTROL DE INSECTOS-PLAGA

5. Ventajas y desventajas del uso de biocontroladores fúngicos Las principales ventajas del uso de EPF son: baja toxicidad, alta eficiencia y facilidad para su cultivo en medios artificiales (Moore et al., 1996; Bustillo-Pardey, 2010). Algunas limitaciones de los EPF son las alteraciones de las diferentes fases del desarrollo del hongo y una notable disminución en su actividad por variaciones, incluso moderadas, de radiación solar, humedad y temperatura. Su vida de anaquel es corta y su presencia en el cultivo es limitada por las precipitaciones. El efecto letal en el insecto está determinado por el ciclo de vida, el cual se encuentra entre 4-8 días, y su apariencia blancuzca-algodonosa dificulta su comercialización y aceptación por los agricultores (Ortiz-Urquiza & Keyhani 2013). Tabla 5-2. Productos comerciales de hongos entomopatógenos.

Producto/Principio activo

Características

MYCOTROL® (cepa GHA de B. bassiana)

2x1013 UFC/Litro, viabilidad (>95%), control de mosca blanca, trip, áfidos, picudos, crisomélidos, chinches, escamas y lepidópteros

BASSIANIL WP® y BAUBASSIL® (B. bassiana)

1x109 UFC/g, control de hemípteros como: broca del café, chinches, picudos y collaria

Bea-sin ® y Bea-sin ® wp (B. bassiana 2.5%) Pae-sin ® y Spectrum ® pae f (P. fumosoroseus 3%)

Control mosquita blanca (Bemisia tabaci)

Meta-sin ® y Meta-sin ® wp (M. anisopliae 3%)

Control Picudo del chile (Anthonomus eugenii)

Tri-sin ® y Tri-sin ® wp P. fumosoroseus 1.8% M. anisopliae 2.4% B. bassiana 1.5%

Control de Paratrioza (Bactericera cockerell)

Fuente: Basado en la información de Wraight, Jacksonz & de Kock (2001), De Faria y Wraight (2007), Chan-Cupul et al. (2013), Góngora-Botero et al. (2013), y Reddy y Antwi (2016).

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7. Control biológico de insectos mediante bacterias entomopatógenas Estas bacterias entomopatógenas se pueden dividir en tres grupos: el primer grupo corresponde a las bacterias entomopatógenas facultativas, que tienen una patogenicidad baja pero una virulencia alta; el segundo grupo corresponde a las bacterias entomopatógenas obligadas, las cuales presentan elevada patogenicidad pero baja virulencia; por último, están las bacterias patógenas potenciales, estas normalmente no presentan patogenicidad ni virulencia; sin embargo, son oportunistas cuando el insecto presenta una baja en su sistema inmune (Charles, Delécluse & Nielsen-Le Roux, 2013). De acuerdo con su persistencia, también, se pueden dividir en dos grupos: las bacterias entomopatógenas esporuladas y las no esporuladas. Las primeras, por su capacidad de formar esporas, presentan mayor persistencia en el ambiente y alta capacidad de producir toxinas, se incluyen las bacterias entomopatógenas obligadas y facultativas, un ejemplo es Bt. Las bacterias no esporuladas, generalmente, se encuentran en el tracto digestivo del insecto y pertenecen al grupo de potenciales patógenas, algunos ejemplos son las pertenecientes al género Pseudomonas y Enterobacterias (Cano et al., 2004).

8. Principales bacterias con actividad entomopatógena 8.1 Bacillus thuringiensis (Bt) Bt es un bacilo Gram positivo, aerobio facultativo, esporulado entre 1 a 1.2 µm de ancho y 3 a 5 µm de largo, perteneciente a la familia Bacillaceae, donde se incluyen Bacillus cereus y Bacillus anthracis, de los cuales Bt se diferencia por la formación de una inclusión paraesporal (δ-endotoxinas) producida durante la fase estacionaria de su crecimiento, las cuales se forman por proteínas Cry (del inglés Crystal) y Cyt (del inglés cytolitic) (Boukedi et al., 2016). El principal factor de virulencia de Bt son las proteínas Cry; estas son específicas contra Lepidópteros, Dípteros, Coleópteros, Himenópteros y Hemíptera; además, se consideran proteínas inocuas para el medio ambiente, la entomofauna benéfica y demás organismos vivos, incluyendo el hombre (Jiménez et al., 2012). Su estructura consiste en 3 dominios: el Dominio I está constituido por siete α-hélices antiparalelas, es responsable de la formación de poros líticos en el epitelio intestinal (Guo et al., 2009); el Dominio II consta de tres laminas β, con forma de β-prisma y bucles, implicado en el reconocimiento del receptor de superficie de la membrana apical del intestino del organismo susceptible; el Dominio III se constituye por dos laminas β, las cuales forman una configuración de β-sandwich, desempeña un papel importante en el mantenimiento de la integridad estructural de la toxina, protegiéndola de la acción de ataque de proteasas; adicionalmente, tiene funcionalidad en el reconocimiento del receptor y la formación del poro (Bravo, Gill & Soberón, 2007). El mecanismo de acción de las toxinas Cry inicia al ser ingeridas por un insecto susceptible; al llegar al intestino medio, la toxina se solubiliza por ac-

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ción del pH y de las enzimas proteolíticas, las cuales liberan un fragmento que tiene un carácter tóxico, el cual se une a receptores específicos, ubicados sobre las vesículas de la membrana de las microvellosidades apicales (VMMA); entre los receptores conocidos se encuentran cadherinas, aminopeptidasas N, fosfatasas alcalinas, proteínas de 505 y 270 KDa, y glucolípidos (Portugal et al., 2014). Después de darse la unión, se da la formación de poros (1-2 nm), causado por la inserción de las α-hélices del Dominio I; posteriormente, se pierde el potencial de membrana, se aumenta la permeabilidad, permitiendo la entrada de aniones, cationes y agua, los cuales alteran la membrana intestinal al punto de causar lisis de la misma, pérdida de integridad y la muerte de las larvas por septicemia, debido al ingreso de esporas de Bt hacia la hemolinfa (Kim et al., 2016).

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8.2 Pseudomonas El género Pseudomonas es un grupo diverso de bacterias Gram negativas, con una alta capacidad de adaptación y se encuentran en casi todos los hábitats del mundo (Wu et al., 2011). Muchas de estas viven como saprófitas, patógenos de plantas y patógenos oportunistas en humanos, mientras que otros en relaciones mutualistas con plantas (Kupferschmied, Maurhofer & Keel, 2013). Además de su potencial como bacterias promotoras de crecimiento vegetal (PGPR), se han utilizado como bacterias entomopatógenas, mediante la síntesis de antibióticos, competencia, producción de sideróforos, inducción de resistencia sistémica inducida y la producción de compuestos volátiles como el ácido cianhídrico (HCN); actualmente, las principales Pseudomonas entomopatógenas son: P. entomophila, P. aeruginosa y P. syringae (Siddiqui & Shaukat, 2003). La actividad insecticida de P. fluorescens se ha reportado contra insectos plaga como áfidos, termitas y mariquitas fitófagas. En algunos casos, extractos de proteínas, metabolitos como HCN o lipopéptidos como orfamida y viscosina tienen propiedades insecticidas, pero la base molecular y regulación de las actividades insecticidas aún se desconocen (Kupferschmied et al., 2013). En P. fluorescens se ha descrito una proteína similar a la potente toxina Mcf1 de la bacteria entomopatógena Photorhabdus luminescens (Péchy-Tarr et al., 2013). Mfc1 fue descubierto en la librería de cósmidos de P. luminescens, con miras a la identificación de nuevas proteínas y metabolitos insecticidas. Cuando este gen se expresa heterogéneamente en Escherichia coli causa que los hemocitos y el tejido epitelial del intestino medio entren en muerte celular programada (Daborn et al., 2002). La bacteria entomopatógena P. entomophila infecta naturalmente a la mosca de la fruta Drosophila melanogaster. Seguido de la infección oral del insecto, la bacteria es capaz de persistir en el intestino del insecto, induciendo una respuesta local y sistémica inmune. A una alta concentración P. entomophila es capaz de matar al insecto. La virulencia de P. entomophila es multifactorial y depende de un sistema de dos componentes GacS/GacA (Vodovar et al., 2005). Otro sistema global regulatorio tiene que ver con una molécula señal desconocida sintetizada por proteínas Pvf que contribuyen al control de la virulencia y

a la inducción de la respuesta inmune independiente de GacS/GacA (Vallet-Gely et al., 2010) La secuencia genómica de P. entomophila revela que un cierto número de Loci codifica potenciales factores de virulencia como toxinas relacionadas con Tc, HCN, hemolisinas y lipopéptidos (Vodovar et al., 2006). Dentro de las actividades desarrolladas en el proyecto "Alternativas biotecnológicas para control de las plagas de papa Tecia solanivora (Lepidóptera: Gelechiidae) y Premnotrypes vorax (Coleóptera: Curculionidae) y sus Implicaciones socio-económicas" se ha encontrado que, al menos, diez microorganismos rizosféricos de papa presentan actividad biocontroladora contra Tecia solanivora. Este es un acercamiento muy interesante dado que una de las principales dificultades para el control de T. solanivora es que la mayor parte de su ciclo de vida y el más voraz se desarrolla en el suelo. Estas bacterias no solo biocontrolan a Tecia desde el espacio rizosférico si no que hemos encontrado que pueden biocontrolar hongos fitopatógenos como Rhizoctonia solani y tendrían potencial actividad como promotoras de crecimiento vegetal.

8.3 Xenorhabdus spp. y Photorhabdus spp. Xenorhabdus spp. y Photorhabdus spp. son bacterias Gram negativas de la familia Enterobacteriaceae (Blackburn et al., 2016), las cuales presentan asociaciones mutualistas con nematodos entomopatógenos de las familias Steinernematidae y Heterorhabditidae (Ma et al., 2013; Orozco, Hill & Stock, 2013; Ferreira & Malan, 2016), donde las bacterias permanecen en el lumen intestinal del insecto y proveen, al nematodo, proteínas para evadir el sistema inmune del hospedero (Tailliez et al., 2010). Los nematodos inician el proceso infectivo durante el tercer estadio de su ciclo de vida (IJs). Una vez que los IJs encuentran un huésped adecuado penetran al insecto y migran al hemocel (Orozco et al., 2013), donde liberan las bacterias simbiontes (Xenorhabdus spp o Photorhabdus). Las bacterias presentan factores de virulencia como la producción de enzimas hidrolíticas, lipasas, fosfolipasas, proteasas, antibióticos (Zhou et al., 2002) y de toxinas como la McF1 que actúa en el intestino del insecto y en los hemocitos (Ruffner et al., 2015). Las bacterias, al multiplicarse, causan septicemia y con esto la muerte del insecto (Ferreira & Malan, 2014; Blackburn et al., 2016), generalmente en un periodo de tiempo corto, entre 48h-72h después de ocurrida la infección, lo cual concede a este complejo nematodos-bacteria una alta virulencia y efectividad (Orozco et al., 2013).

9. Ventajas y limitaciones •

•

Entre las ventajas del uso de bacterias está el bajo riesgo ambiental producido por las toxinas Cry de Bt, gracias a la alta especificidad de estas toxinas en los insectos susceptibles. Las Pseudomonas sp., al colonizar la rizósfera, pueden controlar plagas que se alimentan de raíz o tubérculos, promover el crecimiento vegetal,

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•

controlar fitopatógenos e inducir la resistencia sistémica en la planta. Entre las limitaciones del uso de bacterias entomopatógenas está la supervivencia de estas especies durante los procesos de fabricación, almacenamiento y supervivencia en campo. Se han presentado preocupaciones del público frente a la seguridad biotecnológica por transgénicos basados en genes cry, la liberación de cepas genéticamente modificadas y el uso de algunas bacterias que son patógenas humanas oportunistas como Pseudomonas aeruginosa.

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10. Productos comerciales actuales y perspectivas

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Los insecticidas a base de Bt incluyen como ingrediente activo una mezcla de cristales y esporas, conocidos como bioinsecticidas de primera generación como “Sporoine”. Estos productos se utilizan en cultivos de maíz, trigo, sorgo, soja, algodón y frutales, principalmente para el manejo integrado de plagas. Los bioinsecticidas de segunda generación requieren la transferencia de genes lo que permite ampliar su actividad tóxica mediante un efecto aditivo, reduciendo la posibilidad de desarrollar resistencia por parte de los insectos. Por otra parte, los bioinsecticidas de tercera generación contienen bacterias recombinantes, las cuales han sido modificadas genéticamente con la inserción de genes cry (Sauka & Benintende, 2008).

11. Control biológico de insectos mediante virus entomopatógenos Se conocen cerca de 13 familias de virus entomopatógenos y ~450 especies han sido estudiadas en insectos y ácaros, entre los que están virus de tipo RNA, como los cipovirus, dicistrovirus, nodavirus y tetravirus; y virus tipo DNA, como los densovirus, entomopoxvirus, ascovirus, iridovirus, nudivirus, hitrosavirus, iflavirus y baculovirus (Suparman et al., 2013). A continuación, algunas familias de virus con actividad entomopatógena.

11.1 Baculoviridae La familia Baculoviridae se caracteriza por su alta virulencia y amplio espectro de acción contra géneros como Lepidóptera, Díptera, Hymenóptera, Orthóptera, Isóptera y Neuróptera (Morales-Ramos, Rojas & Shapiro-Ilan, 2013; Abrol, 2014). Está familia comprende los géneros Granulovirus (GVs) y Nucleopolyhedrovirus (NPVs). Los GVs tienen un solo virión por cada cuerpo de inclusión, se multiplican en los núcleos de las células infectadas y solo han sido aislados de tejidos de insectos del orden Lepidóptera (Mohammad, Khadam & Basheer, 2013). Los NPVs tienen varios viriones dentro de cada cuerpo de inclusión y logran su multiplicación al interior del núcleo de las células infectadas. El virión de NPVs es baciliforme y presenta alta virulencia contra los órdenes Lepidóptera, Himenóptera, Díptera, Thysanoptera y Trichoptera (Yang et

al., 2012). Los NPVs son muy eficientes ya que solo una aplicación de 1.5x1011 cuerpos de inclusión por hectárea son necesarios para obtener resultados óptimos (Embrapa Soja, 2001; Mohammad et al., 2013).

11.2 Poxviridae En esta familia, el género Parapoxvirus es el más reportado con actividad entomopatógena (Lacey et al., 2001). La infección de Parapoxvirus en artrópodos requiere del desnudamiento y liberación de los viriones, los cuales ingresan por la fagocitosis del huésped hacia el citoplasma, donde el ADN desprovisto de la cápside inicia la producción masiva de más ADN; todo el proceso de formación tarda cerca de 5 h y comienza unos 90 min después de la infección inicial; es por esto que se trata de un entomopatógeno importante, debido a su velocidad de acción y su relativa simplicidad (Inceoglu, Kamita & Hammock, 2006).

11.3 Iridovirus Son virus icosaédricos, poseen DNA de doble cadena. Afectan tanto vertebrados como invertebrados. Se caracterizan por replicarse en el citoplasma y generar iridiscencia en los tejidos infectados. El virus iridiscente de invertebrados 6 (IV-6) controla el coleóptero Diaprepes patógeno en cítricos y ornamentales además del coleóptero Phyllophaga vandinei (Bender et al., 2014; Lacey et al., 2015).

11.4 Dicistrovirus Se caracterizan por poseer dos fragmentos abiertos de lectura (cistrones), su tamaño es de ~30nm de diámetro, los constituye una pseudocapsula icosaédrica, poseen un genoma RNA positivo. Afecta principalmente plagas de varios cultivos como el hemíptero Homalodisca coagulate (Susevich et al., 2015).

11.5 Densovirus Son virus no encapsulados icosaédricos con DNA lineal. Afecta insectos como Myzus persicae (pulgón del melocotón) y Acheta domesticus (grillo doméstico), los virus de este tipo han sido considerados como biocontroladores debido a su alta virulencia y facilidad de transmisión (Xu et al., 2014).

11.6 Polydnaviruses Incluyen géneros como Bracovirus e Ichnovirus, los cuales poseen cierto mutualismo con familias de avispas parasitoides (Braconidae y Ichneumonidae), son virus DNA de doble cadena. Está involucrado con la supresión y daño del sistema inmune de su hospedero. Se ha reportado su uso conjunto con Bt para el control de la polilla del repollo (Plutella xylostella), donde la inmunosupresión que produce el virus, genera una susceptibilidad en las larvas frente a Bt (Karimzadeh & Sayyed, 2011; Wei et al., 2015).

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12. Ventajas y desventajas de los virus entomopatógenos

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Los virus, al igual que otros agentes biológicos, poseen ciertas ventajas sobre los productos inorgánicos de naturaleza química, una de las cuales es, la acción sobre los insectos plaga sin afectar de manera indiscriminada sobre el medio ambiente. Dentro de los virus, los Baculovirus son los de mayor potencial ya que controlan importantes plagas de interés comercial. El reducido espectro de estos virus sobre insectos y otros artrópodos, elimina la posibilidad de que sea agente patógeno de plantas y otros animales, como vertebrados (Morales-Ramos et al., 2013). No obstante, los ciclos de infección y letalidad de los Baculovirus, constituyen una de las más grandes desventajas sobre otros biopesticidas o pesticidas de origen inorgánico. Esta baja infectividad, en algunos casos, puede tomar de 4 a 14 días para matar a su hospedero (Popham, Nusawardani & Bonning, 2016). Los virus, desafortunadamente, en mayor proporción, solamente actúan en estados larvales, siendo su pico de acción los estados iniciales del insecto huésped, lo que limita su uso a un estado inicial y son necesario varias cantidades sobre las larvas para que sea útil; lo genera una desventaja a nivel económico, pues los bioinsecticidas virales tienen altos costos. Su manipulación in vitro presenta dificultades por la necesidad de utilizar líneas celulares de insectos y se requieren de muchas células para obtener cantidades estimables de virus colonizados para generar los biopesticidas (Morales-Ramos et al., 2013; Popham et al., 2016). Otras limitantes de estos virus son la amplia capacidad de polimorfismo y mutación, lo que puede generar variantes que, muchas veces, son inactivas o poco eficaces. También, es necesario tener en cuenta eventos como la aparición de elementos transponibles, propios de muchos virus, y que pueden generar efectos no muy claros en la dinámica de infección y el comportamiento del insecto a nivel fisiológico (Badii & Abreu, 2006; Morales-Ramos et al., 2013).

13. Conclusión Los biopesticidas son una alternativa prometedora al uso de pesticidas químicos. Entre las principales bacterias con actividad biocontroladora tenemos a Bt. Pseudomonas y nematodos, los cuales establecen relaciones con Xenorhabdus y Photorhabdus. A partir del conocimiento de los mecanismos moleculares de infección de Bt., se han hecho importantes invenciones; pese a esto, en otros grupos de bacterias entomopatógenas la información es muy limitada, lo que abre todo un nuevo camino de exploración para el control de insectos plaga. Los organismos entomopatógenos han co-evolucionado con sus huéspedes y han permitido desencadenar complejos procesos de señalización, cuya respuesta determina el éxito del proceso infeccioso en el insecto. Estos organismos presentan alta especificidad y selectividad, lo que limita su actividad únicamente al ambiente molecular ofrecido por los insectos plaga.

A pesar de la relevancia de estos organismos entomopatógenos, su alcance en el sector agrícola es muy restringido, por lo que es necesario desarrollar formulados que se integren a las prácticas de los agricultores, aumentar el espectro de acción mediante mezclas de entomopatógenos y realizar ensayos demostrativos a nivel de campo para el desarrollo de programas de transferencia tecnológica que promuevan el uso de estas alternativas.

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Casos de estudio y aplicaciones en ecología microbiana se terminó de imprimir en las instalaciones de GRACOM Gráﬁcas Comerciales ubicada en la Ciudad de Bogotá, Colombia en la carrera 69K nº 70-76 en el mes de noviembre de 2017. El tiraje es de 300 ejemplares en papel ivory. Las familias tipográﬁcas usadas fueron: Ubuntu Lato

FE DE ERRATAS* En la primera edición del libro CASOS DE ESTUDIO Y APLICACIONES EN ECOLOGÍA MICROBIANA, cuya fecha de impresión es noviembre de 2017, se publicó: - Página 16 del artículo Microorganismos, biorremediación/biodegradación: generalidades y aplicaciones: «A nivel de los ecosistemas acuáticos, los hongos que pertenecen a la división Chytridiomycota (que también suelen ser considerados como protistas) son los preponderantes saprótrofos de material alóctono de aguas epicontinentales y océanos, además de utilizar como sustrato algas ya en descomposición. […]». - Página 98, del artículo Uso de microorganismos entomopatógenos para el control de insectos-plaga: «3 Bacterióloga. Candidato M.Sc. Química. Facultad de Ciencias. Universidad Nacional de Colombia». Por un error en la edición del libro, se omitió la palabra “erróneamente” y se indicó a la autora Johanna Boyacá como “Candidato M.Sc. Química”, en vez de “Candidato M.Sc. Bioquímica”, respectivamente. Por ello se aclara: Artículo: Microorganismos, biorremediación/biodegradación: generalidades

y aplicaciones Ubicación: Página 16, párrafo 3, línea 2. Autores: Yih Fung, Jimena Sánchez, ElkinRuíz, María Leal, Hugo Rivera, Johanna

Torres, Luisa Boada, Paula Córdoba, Camilo Guevara, Ivanna Hoyos, Marlon Pulido, Andrés Sáenz, Silvia Miñana, María Orozco y Jairo Mejía. Corrección: «A nivel de los ecosistemas acuáticos, los hongos que pertenecen a la división Chytridiomycota (que también suelen ser considerados erróneamente como protistas) son los preponderantes saprótrofos de material alóctono de aguas epicontinentales y océanos, además de utilizar como sustrato algas ya en descomposición. […]». Artículo: Uso de microorganismos entomopatógenos para el control de insectos-plaga Ubicación: Página 98, línea 6. Autores: Javier Vanegas, Luisa Pantoja, Johanna Boyacá, Paula Salas, Ana Pulido, Andrea Santa, Edwin Rodríguez y Oscar Barriga. Corrección: «3 Bacterióloga. Candidato M.Sc. Bioquímica. Facultad de Ciencias. Universidad Nacional de Colombia ». * Esta Fe de erratas se encuentra al final del libro impreso

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