Giáo trình Thực tập vi sinh kỹ thuật môi trường (Nguyễn Mỹ Linh, Nguyễn Thị Tịnh Ấu)

Giáo trình Thực tập vi sinh kỹ thuật môi trường (Nguyễn Mỹ Linh, Nguyễn Thị Tịnh Ấu) Thư Viện Số Dạy Kèm Quy Nhơn WORD VERSION | 2022 EDITION ORDER NOW / CHUYỂN GIAO QUA EMAIL TAILIEUCHUANTHAMKHAO@GMAIL COM THỰC TẬP VI SINH KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG Ths Nguyễn Thanh Tú eBook Collection Hỗ trợ trực tuyến Fb www.facebook.com/DayKemQuyNhon Mobi/Zalo 0905779594 vectorstock com/24597468 Tài liệu chuẩn tham khảo Phát triển kênh bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đơn vị tài trợ / phát hành / chia sẻ học thuật : Nguyen Thanh Tu Group

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ******************* TS. NGUYỄN MỸ LINH TS. NGUYỄN THỊ TỊNH ẤU THỰC TẬP VI SINH KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NĂM 2020

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 2

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 3 LỜI NÓI ĐẦU Giáo trình “Thực tập vi sinh kỹ thuật môi trường” được biên soạn nhằm phục vụ cho công tác giảng dạy môn học Thực tập vi sinh vật kỹ thuật môi trường cho sinh viên ngành Công nghệ kỹ thuật môi trường. Môn học cung cấp những kiến thức và kỹ thuật cơ bản về phân tích; kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh trong lĩnh vực kỹ thuật môi trường. Nội dung sách bao gồm 8 phần đi từ hướng dẫn các thao tác cơ bản trong việc chuẩn bị môi trường nuôi cấy, phân lập vi sinh vật và giữ giống vi sinh vật đến việc phân tích các chỉ tiêu Coliforms; tổng vi khuẩn hiếu khí là những chỉ tiêu đáng quan tâm trong tiêu chuẩn xử lý nước thải; nước cấp. Quyển sách này có thể được sử dụng làm tài liệu học tập cho sinh viên chuyên ngành kỹ thuật môi trường. Đồng thời, các cán bộ nghiên cứu, cán bộ quản lý và kỹ sư môi trường có thể sử dụng quyển sách này làm tài liệu tham khảo trong quá trình nghiên cứu và học tập. Các tác giả xin trân trọng gửi đến bạn đọc và mong nhận được ý kiến đóng góp về nội dung quyển sách để những lần tái bản sau được hoàn chỉnh và chất lượng hơn. Các tác giả

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 4

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 5 MỤC LỤC LỜI NÓI ĐẦU ................................................................................. 3 CÁC KÝ HIỆU VÀ ĐƠN VỊ .................................................................. 11 MỞ ĐẦU .................................................................................................13 BÀI THỰC HÀNH SỐ 1: CÁC THIẾT BỊ PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG ........................17 1.1. CƠ SỞ LÝ THUYẾT ....................................................................17 1.1.1. Dụng cụ...............................................................................17 1.1.2. Thiết bị ................................................................................19 1.1.3. Các phương pháp khử trùng dụng cụ..................................23 1.1.4. Kỹ thuật bao gói dụng cụ ....................................................25 1.2. DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ ............................................................26 1.2.1. Thiết bị ................................................................................26 1.2.2. Dụng cụ...............................................................................26 1.3. THỰC NGHIỆM...........................................................................27 1.3.1. Thí nghiệm 1: Khử trùng và bao gói ống nghiệm ..............27 1.3.2. Thí nghiệm 1: Khử trùng và bao gói đĩa petri ....................27 1.4. CÂU HỎI ÔN TẬP .......................................................................27 1.5. BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM .....................................27 BÀI THỰC HÀNH SỐ 2: CHUẨN BỊ MÔI TRƯ ỜNG DINH DƯỠNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT 28 2.1. CƠ SỞ LÝ THUYẾT ....................................................................28 2.1.1. Khái niệm ...........................................................................28 2.1.2. Phân loại môi trường dinh dưỡng .......................................28

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 6 2.1.3. Điều chỉnh độ pH của môi trường ......................................29 2.1.4. Phân phối môi trường vào dụng cụ 30 2.1.5. Bảo quản và kiểm tra môi trường .......................................31 2.1.6. Các phương pháp khử trùng môi trường dinh dưỡng .........32 2.2. HÓA CHẤT ..................................................................................32 2.3. THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ ............................................................33 2.3.1. Thiết bị ................................................................................33 2.3.2. Dụng cụ...............................................................................33 2.4. THỰC NGHIỆM...........................................................................33 2.4.1. Thí nghiệm 1: Pha chế môi trường dinh dưỡng nuôi cấy nấm men (Hansen) .......................................................33 2.4.2. Thí nghiệm 2: Phân phối môi trường vào ống nghiệm (thạch đứng, thạch nghiêng) ...............................................34 2.5. CÂU HỎI ÔN TẬP .......................................................................34 2.6. BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM .....................................35 BÀI THỰC HÀNH SỐ 3: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VI SINH VẬT ..........................................................................................36 3.1. CƠ SỞ LÝ THUYẾT ....................................................................36 3.1.1. Khái niệm ...........................................................................36 3.1.2. Kỹ thuật phân lập vi sinh vật thuần khiết ...........................36 3.2. HÓA CHẤT ..................................................................................39 3.3. THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ ............................................................39 3.3.1. Thiết bị ................................................................................39 3.3.2. Dụng cụ...............................................................................39 3.4. THỰC NGHIỆM...........................................................................39 3.4.1. Thí ngh iệm 1: Thực hiện kỹ thuật cấy ria ch ủng vi sinh nấm men ...................................................... 39

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 7 3.4.2. Thí nghiệm 2: Thực hiện kỹ thuật đổ đĩa chủng vi sinh nấm men ...................................................... 41 3.4.3. Thí nghiệm 3: Thực hiện kỹ thuật trải đĩa chủng vi sinh nấm men ........................................................... 41 3.5. CÂU HỎI ÔN TẬP .......................................................................42 3.6. BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM .....................................43 BÀI THỰC HÀNH SỐ 4: KỸ THUẬT GIEO CẤY VI SINH VẬT ............ 44 4.1. CƠ SỞ LÝ THUYẾT ....................................................................44 4.1.1. Khái niệm ...........................................................................44 4.1.2. Nguyên tắc ..........................................................................44 4.2. HÓA CHẤT ..................................................................................45 4.3. THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ ............................................................45 4.3.1. Thiết bị ................................................................................45 4.3.2. Dụng cụ...............................................................................45 4.4. THỰC NGHIỆM...........................................................................46 4.5. CÂU HỎI ÔN TẬP .......................................................................47 4.6. BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM .....................................47 BÀI THỰC HÀNH SỐ 5: CÁC PHƯƠNG PHÁP NHUỘM MÀU VÀ QUAN SÁT HÌNH THÁI VI SINH VẬT ........................................48 5.1. CƠ SỞ LÝ THUYẾT ...................................................................48 5.1.1. Phương pháp làm tiêu bản tạm thời ....................................48 5.1.2. Phương pháp làm tiêu bản cố định .....................................49 5.2. HÓA CHẤT..................................................................................50 5.3. THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ............................................................50 5.3.1. Thiết bị ......................................................................................50 5.3.2. Dụng cụ .....................................................................................50

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 8 5.4. THỰC NGHIỆM ..........................................................................50 5.4.1. Thí nghiệm 1: Quan sát hìn h thái vi sinh vật trên kính hiển vi bằng kỹ thuật tiêu bản giọt ép ................... 50 5.4.2. Thí nghiệm 2: Quan sát h ình thái vi sinh vật trên kính hiển vi bằng kỹ thuật tiêu bản giọt treo ................. 51 5.4.3. Thí nghiệm 3: Quan sát hìn h thái vi sinh vật trên kính hiển vi bằng kỹ thuậ t tiêu bả n tạm t hời có nhuộm màu ............................................................... .... 52 5.4.4. Thí nghiệm 4: Quan sát hình thái của vi khuẩn Gram (+) và Gram (-) trên kính hiển vi bằng phương pháp nhuộm Gram ........................................................ 52 5.5. CÂU HỎI ÔN TẬP ......................................................................54 5.6. BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM.....................................54 BÀI THỰC HÀNH SỐ 6: TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ .......55 6.1. CƠ SỞ LÝ THUYẾT ....................................................................55 6.1.1. Kỹ thuật đếm trên đĩa tế bào dị dưỡng ...............................55 6.1.2. Phương pháp xác định tổng vi khuẩn hiếu khí ...................55 6.2. HÓA CHẤT ..................................................................................56 6.3. THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ ............................................................56 6.3.1. Thiết bị ................................................................................56 6.3.2. Dụng cụ...............................................................................56 6.4. THỰC NGHIỆM...........................................................................57 6.4.1. Thí nghiệm 1: Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí bằng kỹ thuật đổ đĩa............................................................57 6.4.2. Thí nghiệm 2: Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí bằng kỹ thuật trải đĩa ..........................................................57 6.5. XỬ LÝ SỐ LIỆU ..........................................................................58

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 9 6.6. CÂU HỎI ÔN TẬP .......................................................................59 6.7. BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM .....................................59 BÀI THỰC HÀNH SỐ 7: PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA TỔNG COLIFORMS TRONG NƯỚC THẢI .................................................60 7.1. CƠ SỞ LÝ THUYẾT ....................................................................60 7.1.1. Khái niệm ............................................................................60 7.1.2. Sự phân bố của vi sinh vật và ý nghĩa của việc kiểm tra chỉ tiêu ...........................................................................60 7.1.3. Phương pháp màng lọc .......................................................61 7.1.4. Phư ơng ph áp MPN (Mo st Prob able Nu mbe r –phư ơng pháp định lượng; phương pháp pha lo ãng tới hạn) ...............................................................................61 7.2. HÓA CHẤT ..................................................................................63 7.3. THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ 63 7.3.1. Thiết bị ................................................................................63 7.3.2. Dụng cụ...............................................................................63 7.4. THỰC NGHIỆM...........................................................................64 7.4.1. Thí nghiệm 1: Kiểm tra Coliforms trong nước t hải bằng phương pháp màng lọc...............................................64 7.4.2. Thí nghiệm 2: Kiểm tra Coliforms trong nước thải bằng phương pháp MPN .....................................................65 7.5. XỬ LÝ SỐ LIỆU ..........................................................................66 7.6. CÂU HỎI ÔN TẬP .......................................................................67 7.7. BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM .....................................67 BÀI THỰC HÀNH SỐ 8: KIỂM TRA E. COLI TRONG NƯỚC THẢI ......................................................................................................68 8.1. CƠ SỞ LÝ THUYẾT ..................................................................68 8.1.1. Khái niệm ...........................................................................68

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 10 8.1.2. Các loại môi trường thường được sử dụng .........................68 8.2. HÓA CHẤT 70 8.3. THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ ............................................................70 8.3.1. Thiết bị ................................................................................70 8.3.2. Dụng cụ...............................................................................70 8.4. THỰC NGHIỆM...........................................................................70 8.4.1. Thí nghiệm 1: Kiểm tra sơ bộ E. coli bằng ống chuông ................................................................................70 8.4.2. Thí nghiệm 2: Nuôi cấy E. coli bằng phương pháp trải đĩa .................................................................................71 8.5. CÂU HỎI ÔN TẬP .......................................................................71 8.6. BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM .....................................72 PHỤ LỤC 1 ............................................................................................72 PHỤ LỤC 2 ............................................................................................82 TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................83

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 11 CÁC KÝ HIỆU VÀ ĐƠN VỊ Ký hiệu Nội dung Tiếng Anh Đơn vị VSV Vi sinh vật Microoganisms CFU/mL CFUTCVN Tiêu chuẩn Việt Nam Đơn vị khuẩn lạc Colony forming unit PCA Môi trường Plate count agar R2A Môi trường Reasoner’s 2A Agar LT Môi trường Lauryl Tryptose BGBL Môi trường Brilliant Green Lactose Bile Salt MPN Phương pháp pha loãng tới hạn Most Probable Number CFU/mL AgarE.M.B Môi trường Eosin LactoseMethylene-blueSucroseagar E.C Broth Môi trường Escherichia coli Broth

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 12

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 13 MỞ ĐẦU 1. Mục đích thí nghiệm - Giúp sinh viên làm quen với các kỹ năng cần thiết của người kỹ sư tương-lai.Nắm các phương pháp, kỹ thuật nuôi cấy, kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh vật trong nước. - Điều hành một nhóm sinh viên cùng thực hiện một công việc. - Luyện tập khả năng viết một báo cáo kỹ thuật.

2. Yêu cầu trước thí nghiệm - Sinh viên phải đọc bài hướng dẫn thí nghiệm, tham khảo tài liệu liên quan để tìm hiểu các kiến thức cần thiết cho bài thí nghiệm.

- Xem thiết bị để hiểu cách tiến hành thí nghiệm, vạch kế hoạch làm việc và phân công trong nhóm.

3. Yêu cầu khi làm thí nghiệm Sau mỗi bài thí nghiệm, mỗi nhóm sinh viên phải làm một bản báo cáo kết quả thu được. Tổng hợp tất cả các bản báo cáo thành một tập và nộp lại cho giảng viên sau khi học xong 08 bài thí nghiệm.

4. Nội dung - Trình bày yêu cầu, nội dung tóm tắt và kết quả của bài thí nghiệm - Lý thuyết liên quan đến bài thí nghiệm - Thực hiện: trình bày các bước thí nghiệm và số liệu thô. - Kết quả tính toán, nhận xét kết quả thu được. - Tài liệu tham khảo (nếu có)

5. Nội quy phòng thí nghiệm Nguyên tắc chung - Chuẩn bị bài thí nghiệm trước khi vào phòng thí nghiệm.

- Chuẩn bị mẫu nước và các dụng cụ cần thiết trước khi tiến hành thí nghiệm.

- Lắp ráp dụng cụ thí nghiệm theo đúng chỉ dẫn của giáo viên và tài liệu.-Để xa các chất, vật liệu dễ cháy khỏi nguồn lửa.

- Lau chùi ngay lập tức những thứ bị đổ, tràn ra ngoài.

- Tuân thủ các chỉ dẫn trong phòng thí nghiệm.

- Biết nơi để các thiết bị cần thiết trong các trường hợp khẩn cấp

- Không đeo các đồ trang sức hoặc trang phục không gọn gàng (dây chuyền, vòng tay, áo khoác,…) trong phòng thí nghiệm.

- Không làm việc một mình trong phòng thí nghiệm.

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 14

- Nơi làm việc phải sạch sẽ, ngăn nắp. Chỉ để vở ghi chép và tài liệu hướng dẫn thí nghiệm tại bàn làm việc. Các loại sách khác, túi xách, nón,… phải để đúng nơi qui định.

- Làm sạch và lau khô nơi làm việc khi kết thúc lớp học. Rửa tay kỹ.

- Không ngửi hóa chất, trừ khi được hướng dẫn bởi giáo viên. Khi cần kiểm tra mùi, dùng tay quạt nhẹ hơi cần thử về phía mũi.

- Làm thí nghiệm theo chỉ dẫn của giáo viên và điều kiện đã nêu trong tài liệu.

- Phải làm việc trong tủ hút đối với các chất khí độc.

- Đổ nước thải, hóa chất thải đúng nơi quy định (các bình đã dán nhãn).

- Không gây ồn ào, đùa giỡn trong phòng thí nghiệm.

- Không tự ý thay đổi quy trình làm thí nghiệm đã được giáo viên hướng dẫn và trong tài liệu.

- Luôn mặc áo blouse dài tay, kính bảo hộ khi trong phòng thí nghiệm.-Tócdài phải được buộc gọn lại, đặc biệt khi làm việc gần ngọn lửa.

- Không để mặt sát vào miệng chai, lọ chứa hóa chất.

- Không dùng tay trần lấy hóa chất, trừ khi được hướng dẫn bởi chính giáo viên.

- Luôn sử dụng các dụng cụ được chỉ định (kẹp ống nghiệm, các loại kẹp tay dài, găng tay,…) khi sử dụng các thiết bị hay dụng cụ khác.

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 15 (bình chữa cháy, vòi nước chữa cháy, tủ y tế,…) và biết cách sử dụng các thiết bị này. - Báo ngay lập tức cho giáo viên các tai nạn xảy ra trong phòng thí nghiệm. Sử dụng hóa chất - Đọc và kiểm tra nhãn trên chai, lọ hóa chất trước khi lấy hóa chất sử dụng. Lấy lượng hóa chất vừa đủ dùng. - Không bỏ lại hóa chất không sử dụng vào lọ hóa chất gốc. - Khi chuyển hóa chất từ lọ này qua lọ khác phải để các lọ này cách xa cơ -thể.Trách tiếp xúc trực tiếp bằng tay trần với hóa chất. Nếu tiếp xúc hóa chất phải rửa tay ngay lập tức. - Nói với giáo viên khi có các vấn đề sức khỏe có thể liên quan với thí nghiệm như dị ứng, hen, suyễn,… - Không mang kính sát tròng khi tiếp xúc với hóa chất trong phòng thí nghiệm. Nếu có thể thì thay bằng mắt kính hoặc báo cho giáo viên biết. Sử dụng dụng cụ thủy tinh - Đồ thủy tinh dạng ống, đặc biệt là những ống dài, nên di chuyển ở trạng thái thẳng đứng để tránh bị vỡ và đâm phải người khác.

- Không dùng tay không để dọn thủy tinh vỡ. Sử dụng chổi quét và dụng cụ hốt rác để gom thuy tinh vỡ. Để thủy tinh vỡ vào nơi quy định theo hướng dẫn của giáo viên.

- Không chạm tay trần vào dụng cụ thủy tinh đang nóng, không làm lạnh đột ngột dụng cụ thủy tinh nóng (Hãy nhớ: Thủy tinh nóng trông giống như nguội). Sử dụng các nguồn nhiệt - Phải cực kỳ cẩn thận khi sử dụng đèn cồn. Để quần áo, đầu tóc tránh xa ngọn lửa.

- Không đun dụng cụ thủy tinh không chịu nhiệt trực tiếp với ngọn lửa trần, nguồn nhiệt.

- Không bao giờ dùng lực mạnh khi tháo hay lắp một dụng cụ thủy tinh vào nút cao su. Hãy sử dụng động tác vặn. Nhờ giáo viên nếu không thể tháo dụng cụ thủy tinh đó.

- Luôn tắt lửa khi không sử dụng. - Không để hóa chất tiếp xúc với ngọn lửa, đặc biệt là các chất dễ cháy (bông gòn, giấy,...), trừ khi được hướng dẫn làm như vậy.

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 16

- Không đun nóng bất cứ thứ gì khi không được chỉ dẫn.

- Khi gia nhiệt các chất ống nghiệm, không để miệng ống nghiệm hướng vào mình hoặc người khác. Các lưu ý khi làm cần sát trùng mặt bàn bằng giấy lau tẩm cồn 70 0 hoặc dung dịch chất diệt khuẩn khác (lysol 5%, amphyl 10%, chlorox 10%), để khô. Thực hiện tương tự cho hai tay. Chú ý chưa đốt đèn cồn khi tay chưa khô cồn. Lặp lại việc sát trùng này sau khi hoàn thành công việc. - Cần ghi chú tên chủng vi sinh vật, ngày tháng thí nghiệm lên tất cả các hộp petri, ống nghiệm môi trường, bình nuôi cấy. - Khi lỡ làm đổ, nhiễm vi sinh vật ra nơi làm việc, dùng khăn giấy tẩm chất diệt khuẩn lau kỹ, sau đó thực hiện khử trùng lại bàn làm việc.-Cẩn thận khi thao tác với đèn cồn. Tắt ngọn lửa khi chưa có nhu cầu sử dụng hoặc ngay sau khi thực hiện xong mỗi thao tác. Lưu ý tránh đưa tay, tóc qua ngọn lửa. Cần có cách bảo vệ tóc thích hợp (trường hợp tóc dài). - Sử dụng quả bóp cao su khi thao tác ống hút định lượng (pipette), không hút bằng miệng.

thực hiện thí nghiệm - Nắm vững nguyên tắc, phương pháp làm việc với vi sinh vật. - Mang khẩu trang và bao tay khi thao tác với vi sinh vật. - Trước khi bắt đầu

- Cần gói hoặc ràng bằng băng keo khi đặt chồng các đĩa petri lên nhau.

- Không mở hộp petri và dùng mũi ngửi để tránh nhiễm vi sinh vật vào đường hô hấp. - Khi đốt que cấy có dính sinh khối vi sinh vật, cần đặt vòng hoặc đầu que cấy vào chân ngọn lửa để tránh sự văng nhiễm vi sinh vật vào không khí. - Sát trùng và rửa tay sạch sẽ trước khi rời phòng thí nghiệm.

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 17 BÀI THỰC HÀNH SỐ 1 CÁC THIẾT BỊ PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG Mục tiêu bài thực hành số 1: Sau khi học xong bài này, sinh viên có khả năng: • Mô tả được các thiết bị, dụng cụ sử dụng trong quá trình thực hành thí nghiệm vi sinh. • Trình bày được các phương pháp khử trùng được áp dụng trong phòng thí nghiệm. • Trình bày được cách sử dụng các thiết bị, dụng cụ sử dụng trong quá trình thực hành thí nghiệm vi sinh. • Bao gói được các dụng cụ sử dụng trong quá trình thực hành thí nghiệm vi sinh. 1.1. CƠ SỞ LÝ THUYẾT 1.1.1. Dụng cụ Ống nghiệm: Được sử dụng để chứa môi trường nuôi cấy vi sinh vật, có nút bằng gòn không thấm nước hay bằng nhựa chịu nhiệt Hình 1.1: Ống nghiệm (Test –tube) Đĩa petri: Gồm một nắp lớn và một đáy nhỏ úp lồng vào nhau, đường kính 8cm, 10cm, 12cm,... được sử dụng để nuôi cấy vi sinh vật.

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 18 Hình 1.2: Đĩa petri Micropipette (Pipetman): Đây là một pipette cho phép rút một lượng chất rất chính xác. Trong quá trình tiến hành thí nghiệm, cần sử dụng lượng mẫu thể tích nhỏ (0,1 mL; 1 mL); việc sử dụng micropipette cho phép ta lấy chính xác lượng mẫu cần sử dụng. Hình 1.3: Micropipette Một số dụng cụ khác: - Cốc thủy tinh (Beaker) - Bình tam giác (Erlen)

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 19 - Bông gòn không thấm nước - Đèn cồn - Que trang - Que cấy 1.1.2. Thiết bị 1.1.2.1. Tủ cấy vô trùng Mục đích: Nuôi cấy vi sinh vật (VSV) tránh sự tạp nhiễm từ bên ngoài. Cấu tạo: Hình 1.4: Tủ cấy vô trùng Gồm 2 phần: Hệ thống lọc không khí và buồng cấy. Không khí sau khi qua hệ thống lọc sẽ trở nên vô khuẩn. Bên trong tủ cấy được trang bị đèn tử ngoại (UV) để đảm bảo tính vô trùng tuyệt đối trong thao tác cấy. Đèn tử ngoại sẽ được bật trước và sau khi sử dụng buồng cấy (20 - 30 phút). Lưu ý: Cần lau cồn bề mặt tủ cấy trước và sau khi làm việc. 1.1.2.2. Nồi hấp áp lực (Autoclave) Mục đích: Tiệt trùng dụng cụ, môi trường, tiêu diệt tế bào dinh dưỡng và bào tử.

chọn theo chế độ điều khiển bằng tay; thông thường được thiết lập 120oC; 15 phút). Bước 6: Nếu chọn chương trình khác (xem thêm sách hướng dẫn). Bước 7: Ấn nút Start. Bước 8: Khi tiệt trùng xong lấy mẫu ra (khi nhiệt độ đạt mức bằng nhiệt bên ngoài, lúc đó áp suất trở lại bình thường mới mở nắp lấy dụng cụ ra được. Áp suất hạ xuống dưới 80 PA và có tiếng bíp báo hiệu quá trình hấp tiệt trùng đã hoàn tất).

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 20 Cấu tạo: Hình 1.5: Nồi hấp áp lực (Autoclave) Nguyên lý: Dùng hơi nước bão hòa áp suất cao để tiệt trùng. Sử dụng: Bước 1: Cắm nguồn; bật công tắc (bên hông thiết bị; phía tay phải). Bước 2: Gạt cần gạt sang biểu tượng ổ khóa mở, đồng thời dùng tay mở nắp. Bước 3: Xếp dụng cụ, môi trường cần tiệt trùng vào rổ và đặt vào trong thiết bị; đậy nắp lại.

Bước Chọn MANUAL (nhiệt độ và thời gian được

4:

Bước Kéo cần gạt qua biểu tượng ổ khóa đóng.

5:

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 21 Bước 9: Tắt máy bằng cách ấn nút Stop; đậy nắp (kéo cần gạt qua vị trí khóa đóng), rút nguồn cắm điện. Lưu ý: - Nước trong nồi tiệt trùng phải là nước cất. - Kiểm tra mực nước trong nồi, không thấp hơn mức quy định; (mâm để dụng cụ hấp). - Thời gian khử trùng tùy thuộc vào thể tích vật muốn khử trùng và dụng cụ.-Cần phải vệ sinh thiết bị sau một thời gian sử dụng. - Không hấp các dụng cụ bằng nhựa sẽ gây chảy và hư hỏng dụng cụ. 1.1.2.3. Tủ sấy (Oven) Mục đích: Tiệt trùng dụng cụ nuôi cấy VSV, tiêu diệt tế bào dinh dưỡng và bào tử. Cấu tạo: Hình 1.6: Tủ sấy (Oven) Nguyên lý: Sử dụng không khí nóng 1200/2 giờ; 1800/30 phút Sử dụng: - Rửa sạch dụng cụ, sấy khô, gói giấy báo, sấy. - Ống nghiệm: Làm nút bông, gói giấy báo, 10 ống/gói. - Đĩa petri: 5-10 đĩa/gói

- Khử trùng xong tắt công tắc, đợi nhiệt độ hạ xuống còn 800C mới mở tủ để tránh làm nứt vỡ và ảnh hưởng đến tính vô trùng của dụng cụ.

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 22 - Bình tam giác: Làm nút bông, gói giấy báo. - Khi xếp dụng cụ vào tủ sấy không nên xếp quá khít nhau.

- Bật công tắc, khi T0: 120-1800C mới bắt đầu tính thời gian.

- Sau khi sấy, giấy báo và bông gòn

phải có màu hơi vàng, nếu có màu nâu thì bông và giấy đã bị quá nhiệt. - Các dụng cụ đã khử trùng, cất ở chỗ kín, tránh bụi, chỉ bóc giấy báo ngay trước khi sử dụng. Lưu ý: Không sấy các dụng cụ bằng nhựa sẽ gây chảy và hư hỏng dụng cụ. 1.1.2.4. Kính hiển vi (Microscope) Mục đích: Được sử dụng để quan sát hình thái vi sinh vật. Cấu tạo: Hình 1.7: Kính hiển vi Bao gồm 4 hệ thống chính - Hệ thống giá đỡ - Hệ thống phóng đại

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 23 - Hệ thống chiếu sáng - Hệ thống điều chỉnh Cách sử dụng: - Chuẩn bị tiêu bản trên phiến kính, đặt tiêu bản lên bàn quan sát và kẹp cố định nhờ kẹp giữ mẫu. Tùy vào yêu cầu quan sát tiêu bản mà ta sử dụng vật kính thích hợp. - Điều chỉnh ánh sáng bằng nút vặn bên hông đế kính. - Điều chỉnh tụ quang: Đối với vật kính x10 hạ tụ quang đến tận cùng, vật kính x40 để tụ quang ở đoạn giữa, vật kính x100. Điều chỉnh cỡ màn chắn tương ứng với vật kính. Điều chỉnh vật kính lên xuống khi quan sát tiêu bản (Mắt nhìn vào ống kính).-Mắt nhìn thị kính, tay vặn núm chỉnh thô để đưa vật kính lên cho đến khi nhìn thấy hình ảnh mờ của mẫu vật. - Điều chỉnh núm chỉnh tinh để được hình ảnh rõ nét. 1.1.3. Các phương pháp khử trùng dụng cụ Cơ sở lý thuyết Vi sinh vật luôn có mặt trong không khí và trên bề mặt phòng thí nghiệm, dụng cụ và các thiết bị. Những vi sinh vật này có thể đóng vai trò như một nguồn gây ô nhiễm bên ngoài và gây ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm. Khử trùng dụng cụ là một trong những yếu tố quan trọng vì các dụng cụ được sử dụng trực tiếp trong quá trình thí nghiệm với vi sinh vật. Mục đích của việc khử trùng dụng cụ không chỉ là để kiểm soát các chất ô nhiễm gây hại đối với tế bào sinh vật mà còn để ngăn ngừa sự hình thành các quần thể vi sinh không mong muốn, gây ảnh hưởng đến kết quả quan sát và phân tích. Các phương pháp khử trùng dựa trên sự ảnh hưởng của các nhân tố vật lý, hóa học đối với sự tồn tại và phát triển của vi sinh vật: nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng, pH; acid, base, muối kim loại, cồn,...

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 24 Nguyên tắc Sau khi khử trùng cần đảm bảo: - Sự vô trùng tuyệt đối cho dụng cụ và vật phẩm. - Không làm thay đổi chất lượng mẫu vật. - Bảo đảm an toàn tuyệt đối cho con người. 1.1.3.1. Khử trùng bằng nhiệt Khi khử trùng bằng nhiệt, các tế bào sinh dưỡng của VSV bị tiêu diệt dễ dàng; tuy nhiên các bào tử vẫn còn tồn tại và không bị ảnh hưởng. Khả năng chịu nhiệt của vi sinh vật phụ thuộc vào: - Tính chất môi trường - Số lượng tế bào - Độ pH của vật cần khử trùng Để khử trùng bằng nhiệt hiệu quả cần xác định ngưỡng nhiệt độ thấp nhất và khoảng thời gian ngắn nhất cần thiết để tiêu diệt toàn bộ VSV và bào tử của chúng có trong dụng cụ cần khử trùng. Có thể khử trùng bằng phương pháp nhiệt khô; nhiệt ướt. Phương pháp nhiệt khô Khử trùng bằng tủ sấy: Được thực hiện trong tủ sấy; xem phần hướng dẫn sử dụng tủ sấy ở trên. Khử trùng bằng cách đốt dưới ngọn lửa nóng đỏ: Phương pháp này dùng để khử trùng que cấy, ống hút, đầu ống nghiệm, miệng bình tam giác sau khi lấy nút bông ra. Cách thực hiện: Bước 1: Hơ dụng cụ trên ngọn lửa đèn cồn, đưa qua đưa lại đến 3 – 4 lần. Với các dây mayxo ở đầu que cấy phải nung cho thật đỏ hết chiều dài dây cấy. Bước 2: Đợi dụng cụ nguội mới được sử dụng để tránh vỡ và vi khuẩn không bị tiêu diệt khi lấy giống nuôi cấy.

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 25 Phương pháp nhiệt ướt: Đun sôi trong nước: Phương pháp này được sử dụng khi cần khử trùng nhanh các dụng cụ: kim tiêm, dao, kéo, kẹp, cốc, ... Sử dụng nồi hấp tiệt trùng: Xem phần hướng dẫn cách sử dụng nồi hấp tiệt trùng. 1.1.3.2. Khử trùng bằng phương pháp hóa học Có rất nhiều loại hóa chất được sử dụng để tiêu diệt vi sinh vật: Phenol: Được sử dụng ở trạng thái dung dịch 2 – 5%. Không được thoa lên da. Ethanol: Thường được sử dụng để khử trùng ngoài da. Iod: Tác dụng lên hầu hết các vi sinh vật, có thể diệt nấm và virus. Dung dịch iod dùng để khử trùng ngoài da, tẩy uế nước. Clo và các hợp chất của Clo: Hơi Clo nén được dùng khử trùng nước uống nhưng khó sử dụng nên thường được dùng dưới dạng hợp chất: NaOCl, Ca (OCl)2, Cloramin. Các hợp chất khác: KMnO4, H2O2, … 1.1.4. Kỹ thuật bao gói dụng cụ Nguyên tắc: Dụng cụ được bao gói phải đảm bảo sạch và khô. Bao gói phải kín và cẩn thận để sau khi khử trùng vẫn đảm bảo sự vô trùng của dụng cụ trong lớp giấy gói và lấy ra sử dụng dễ dàng. Quy trình bao gói dụng cụ: Việc bao gói dụng cụ gồm 2 khâu: - Làm nút bông: Cho các ống nghiệm, bình tam giác, pipette. - Bao gói: Cho hầu hết các dụng cụ khác: đĩa petri. Quy trình làm nút bông Bước 1: Lấy một ít bông không thấm nước cuộn lại.

Bước

theo

gói. Bước 2:

keo. Yêu cầu: - Phần giấy bao bên ngoài phải chặt và kín. - Bao bằng giấy nhôm với dụng cụ hấp ướt. - Bao bằng giấy báo với dụng cụ sấy khô. - Với các dụng cụ như pipette, que trang phải dùng giấy bao kín toàn bộ. Có thể dùng hộp nhôm đựng các dụng cụ trên để khử trùng. 1.2. DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ 1.2.1. Thiết bị - Tủ sấy - Tủ cấy vô trùng - Kính hiển vi - Nồi hấp tiệt trùng 1.2.2. Dụng cụ - Bông gòn không thấm nước - Ống nghiệm - Đĩa petri

nhật

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 26 Bước 2: Dùng tay ấn vào giữa cuộn bông. Bước 3: Đẩy cuộn bông này gập đôi và từ từ vào miệng ống nghiệm.

Quy trình bao gói dụng cụ Với các dụng cụ sau khi làm nút bông cần bao gói phần có nút bông bằng giấy báo để khi khử trùng nút bông không bị ướt và đảm bảo điều kiện vô trùng tốt hơn. Cách làm như sau: Bước 1: Cắt giấy báo hình chữ với kích thước tùy dụng cụ cần bao Quấn quanh phần đầu có bông. 3: Dán chặt lại bằng băng

theo

nút

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 27 1.3. THỰC NGHIỆM 1.3.1. Thí nghiệm 1: Khử trùng và bao gói ống nghiệm Bước 1: Lau sạch toàn ống nghiệm bằng nước (bằng cồn) và để khô. Bước 2: Lấy một ít bông không thấm nước cuộn lại. Bước 3: Dùng tay ấn vào giữa cuộn bông. Bước 4: Đẩy cuộn bông này gập đôi và từ từ vào miệng ống nghiệm. Bước 5: Sử dụng giấy báo để gói kín toàn bộ dụng cụ. Bước 6: Dán chặt lại bằng băng keo. Bước 7: Đặt dụng cụ đã bao gói vào tủ sấy trong 30 phút ở 1000C. 1.3.2. Thí nghiệm 2: Khử trùng và bao gói đĩa petri Bước 1: Lau sạch toàn bộ đĩa petri bằng nước (bằng cồn) và để khô. Bước 2: Đậy nắp và đáy petri lại. Bước 3: Sử dụng giấy báo để gói kín toàn bộ dụng cụ. Bước 4: Dán chặt lại bằng băng keo. Bước 5: Đặt dụng cụ đã bao gói vào tủ sấy trong 30 phút ở 1000C. 1.4. CÂU HỎI ÔN TẬP Câu 1: Nêu cấu tạo và cách sử dụng nồi hấp tiệt trùng; tủ sấy; kính hiển vi. Câu 2: Trình bày nguyên tắc khử trùng. Câu 3: Nêu các phương pháp khử trùng. Câu 4: Trình bày nguyên tắc và phương pháp bao gói dụng cụ. 1.5. BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM Sinh viên báo cáo kết quả sau buổi thí nghiệm theo mẫu BÁO CÁO 1 (phần phụ lục). Sinh viên báo cáo tổng kết theo mẫu BÁO CÁO TỔNG KẾT (phần phụ lục) sau khi kết thúc môn học.

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 28 BÀI THỰC HÀNH SỐ 2 CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT Mục tiêu bài thực hành số 2: Sau khi học xong bài này, sinh viên có khả năng: • Trình bày được các loại môi trường dinh dưỡng cho vi sinh vật • Trình bày được nguyên tắc khử trùng môi trường dinh dưỡng • Thực hiện được môi trường thạch nghiêng, thạch đứng trong ống nghiệm • Pha chế được môi trường dinh dưỡng cho vi sinh vật 2.1. CƠ SỞ LÝ THUYẾT 2.1.1. Khái niệm Các chất dinh dưỡng là những hợp chất tham gia vào quá trình trao đổi chất nội bào trong cơ thể vi sinh vật. Môi trường dinh dưỡng là hỗn hợp gồm các chất dinh dưỡng và các chất có nhiệm vụ duy trì thế oxi hoá khử, áp suất thẩm thấu của tế bào và sự ổn định độ pH của môi trường. Yêu cầu của môi trường dinh dưỡng: - Có đủ các chất dinh dưỡng cần thiết. - Có độ pH thích hợp. - Có độ nhớt nhất định. - Không chứa các yếu tố độc hại. - Hoàn toàn vô trùng. 2.1.2. Phân loại môi trường dinh dưỡng Người ta dựa trên các cơ sở khác nhau để phân loại môi trường. 2.1.2.1. Căn cứ theo thành phần và nguồn gốc Môi trường tự nhiên: Có thành phần là các sản phẩm tự nhiên như:

2.1.2.3. Căn cứ vào công dụng Môi trường cơ bản: Thích hợp cho nhiều loại vi sinh vật khác nhau phát triển. Môi trường chọn lọc: Là môi trường đảm bảo cho sự phát triển ưu thế của một loài hay một nhóm loài vi sinh vật xác định nào đó dựa trên thành phần đặc trưng của môi trường.

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 29 trứng, sữa, khoai tây, dịch chiết nấm men, đường, cám. Thành phần hóa học của loại môi trường không được xác định chính xác do sự không ổn định của sản phẩm tự nhiên. Môi trường tổng hợp: Chứa các chất hóa học mà thành phần của chúng được xác định và định lượng một cách cụ thể và chính xác. Môi trường bán tổng hợp: Chứa cả các chất hóa học lẫn các sản phẩm tự nhiên. 2.1.2.2. Căn cứ theo tính chất lý học Môi trường lỏng: Thành phần môi trường này không chứa agar và thường được sử dụng để nghiên cứu quá trình tổng hợp của vi sinh vật. Môi trường đặc: Chứa 1,5 – 2% agar hoặc 10 – 20% gelatin. Môi trường này được sử dụng để nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý của vi sinh vật và nuôi cấy vi sinh vật. Môi trường bán lỏng: Chỉ chứa 0,3 – 0,7% agar. Môi trường này dùng để quan sát sự di chuyển của vi sinh vật.

2.1.3. Điều chỉnh độ pH của môi trường Muốn điều chỉnh độ pH của môi trường, sử dụng HCl 10% hay NaOH 10%. Ngoài ra có thể dùng một số hoá chất khác như: H3PO4, H2SO4, KOH, NaHCO3, Na2CO3. Muốn kiểm tra độ pH của môi trường ta sử dụng máy đo pH (pH – meter). Phương pháp này nhanh nhạy và cho độ chính xác cao. Trong phòng thí nghiệm có thể dùng chỉ thị màu xanh bromotomol hay giấy quỳ đ ể đo pH. Phương pháp này tiện lợi, nhanh nhưng không cho độ chính xác cao.

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 30 2.1.4. Phân phối môi trường vào dụng cụ Môi trường được phân phối vào ống nghiệm, đĩa petri, bình tam giác. Trình tự phân phối gồm các bước sau: Bước 1: Môi trường cần được đun cho hoá chất lỏng rồi đổ qua phễu thuỷ tinh vào các dụng cụ.

Bước 2: Tay trái giữ dụng cụ chứa môi trường.

Bước 3: Tay phải kẹp nút bông và kéo ra. Bước thì lượng môi trường cần được phân phối từ 1/2 - 1/3 thể tích ống nghiệm. - Đối với bình cầu hay bình tam giác: Lượng môi trường được phân phối chiếm 1/2 - 1/3 thể tích của bình. - Các thao tác phân phối phải nhanh, gọn, khéo léo để môi trường không dính lên miệng dụng cụ hoặc nút bông và việc phân phối cần thực hiện xong trước khi môi trường bị đông đặc. 2.1.4.1. Làm thạch nghiêng, thạch đứng Làm thạch nghiêng: Cần tiến hành ngay sau khi khử trùng môi trường vừa kết thúc và môi trường chưa đông đặc. Sau khi phân phối 1/4 thể tích môi trường vào ống nghiệm, nhẹ nhàng đặt nghiêng ống nghiệm 1 góc 200 - 300, để yên cho đến khi môi trường nguội và đông đặc. Làm thạch đứng: Đặt các ống nghiệm đã có môi trường làm thạch đứng vào giá, để yên cho đến khi môi trường nguội và đông đặc. 2.1.4.2. Phân phối môi trường vào đĩa petri Toàn bộ quy trình đổ thạch vào đĩa petri đều thực hiện trong tủ cấy vô trùng hoặc dưới ngọn lửa đèn cồn.

4: Nhanh tay rót môi trường vào dụng cụ, hơ miệng dụng cụ dưới ngọn lửa đèn cồn và đậy nút bông lại. Lưu ý: - Đối với ống nghiệm: Nếu dùng môi trường làm thạch nghiêng thì lượng môi trường cần được phân phối chiếm 1/4 thể tích của ống nghiệm. Nếu làm thạch đứng

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 31 Bước 1: Hé mở nắp đĩa petri dưới ngọn lửa đèn cồn, từ từ đổ môi trường vào đĩa sao cho thể tích tràn 2/3 đĩa sau đó xoay nhẹ cho toàn bộ môi trường trải đều trên bề mặt đĩa. Bước 2: Thao tác đổ thạch phải hết sức khẩn trương và khéo léo để hạn chế sự nhiễm khuẩn. Bước 3: Mặt thạch phải phẳng, nhẵn, có độ dày khoảng 2mm. Thông thường cứ 1/4 lít môi trường có thể phân phối được 22 - 25 đĩa petri. Bước 4: Sau khi đổ môi trường vào đĩa petri, 1 - 2 ngày sau, kiểm tra lại xem môi trường có bị nhiễm khuẩn không rồi mới sử dụng để cấy phân lập. Bước 5: Ghi chú vào nhãn: Tên môi trường, khử trùng ngày ... tháng ... năm ... Bước 6: Để vào nơi cất giữ môi trường để tiện cho việc theo dõi, sử dụng và bảo quản. Hình 2.1: Một số dạng môi trường trong ống nghiệm 2.1.5. Bảo quản và kiểm tra môi trường Môi trường chưa dùng cần được bảo quản ở chỗ mát, hạn chế tác dụng của ánh sáng, nhiệt độ từ 0 - 50C và không để môi trường bị khô. Trước khi sử dụng, để kiểm tra độ vô khuẩn của môi trường, người ta thường đặt chúng vào tủ ấm 350C, trong 48 - 72 giờ. Sau lấy ra quan sát, loại bỏ các ống có vi sinh vật phát triển và chỉ sử dụng những ống nghiệm, những đĩa petri có môi trường đạt yêu cầu.

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 32 2.1.6. Các phương pháp khử trùng môi trường dinh dưỡng 2.1.6.1. Nguyên tắc Khử trùng môi trường dinh dưỡng nhằm mục đích: Tiêu diệt toàn bộ vi sinh vật ngoại lai hiện diện trong môi trường; tạo điều kiện vô trùng cho môi trường để kết quả phân lập, nuôi cấy chính xác. Do đó, khi khử trùng môi trường phải đảm bảo một số điều kiện như sau:-Không làm biến tính môi trường. - Sau khi khử trùng, trong môi trường không sản sinh ra các chất độc gây chết vi sinh vật nuôi cấy. - Phải đảm bảo điều kiện vô trùng tuyệt đối sau khi khử trùng. - Bảo đảm an toàn đối với người sử dụng. 2.1.6.2 Một số phương pháp khử trùng môi trường dinh dưỡng Phương pháp khử trùng được sử dụng chủ yếu để khử trùng môi trường là dùng nồi hấp tiệt trùng (Autoclave).Thời gian tiệt trùng phụ thuộc vào khối lượng môi trường đem đi tiệt trùng, thường kéo dài từ 20 –30 phút ở nhiệt độ 1210C. Tuy nhiên, tùy từng loại môi trường khác nhau sẽ có những điều kiện khử trùng khác nhau. 2.2. HÓA CHẤT Môi trường nuôi cấy nấm men (Hansen) Công thức: - Saccharose hoặc Maltose: 50 gam - Pepton: 10 gam - KH2PO4: 3 gam - MgSO4: 3 – 5 gam - Agar: 20 gam - Nước cất: 1000 mL

Bước 3: Hấp tiệt trùng ở 1210C; 15 phút. Bước 4: Lấy môi trường ra khỏi máy hấp tiệt trùng và để nguội tới khoảng 500C và thực hiện ngay các thí nghiệm tiếp theo.

Lưu ý: Nếu thạch bị nguội và đông tụ thì phải cho vào lò vi sóng để hâm nóng thạch và tiếp tục thực hành thí nghiệm

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 33 2.3. THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ 2.3.1. Thiết bị - Tủ sấy - Nồi hấp tiệt trùng (Autoclave) - Tủ cấy vi sinh - Cân kỹ thuật 2.3.2. Dụng cụ - Bình tam giác 250 mL - Đĩa petri - Ống nghiệm - Bông gòn không thấm - Giá ống nghiệm - Đèn cồn 2.4. THỰC NGHIỆM 2.4.1. Thí nghiệm 1: Pha chế môi trường dinh dưỡng nuôi cấy nấm men (Hansen)Quytrình thực hiện: Bước 1: Cân chính xác các thành phần của môi trường vào cốc có chứa sẵn một ít nước. Bước 2: Khuấy cho tan hỗn hợp sau đó thêm lượng nước theo yêu cầu. Đưa vào bình tam giác, sau đó đậy lại bằng nút bông và bọc giấy bạc.

(1/2 ống), hơ miệng dụng cụ dưới ngọn lửa đèn cồn và đậy nút bông của dụng cụ chứa môi trường và ống nghiệm. Bước 4: Nhẹ nhàng đặt ống nghiệm thạch đứng vào khay đựng dụng cụ. Bước 5: Để thạch đông lại rồi cho vào thiết bị nuôi cấy vi sinh vật. Ống nghiệm

Bước 2: Tay trái giữ dụng cụ chứa môi trường, tay phải kẹp nút bông và kéo ra. Sau đó, chuyển dụng cụ chứa môi trường sang tay phải.

Bước

Bước 2: Tay trái giữ dụng cụ chứa môi trường, tay phải kẹp nút bông và kéo ra. Sau đó, chuyển dụng cụ chứa môi trường sang tay phải.

Bước 3: Nhanh tay rót môi trường vào dụng cụ thạch nghiêng: Bước 1: Tay trái giữ ống nghiệm, tay phải kẹp nút bông và kéo ra.

Bước 3: Nhanh tay rót môi trường vào dụng cụ (1/3 ống), hơ miệng dụng cụ dưới ngọn lửa đèn cồn và đậy nút bông của dụng cụ chứa môi trường và ống nghiệm. 4: Nhẹ nhàng đặt nghiêng ống nghiệm thạch nghiêng 1

góc 200 - 300 . Bước 5: Để thạch đông lại rồi cho vào thiết bị nuôi cấy vi sinh vật. 2.5. CÂU HỎI ÔN TẬP Câu 1: Liệt kê các loại môi trường dựa trên: Thành phần và nguồn gốc; tính chất lý học; công dụng. Câu 2: Nêu cách phân phối môi trường vào dụng cụ: Đĩa petri; thạch đứng; thạch nghiêng. Câu 3: Nêu cách pha chế môi trường dinh dưỡng.

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 34 2.4.2. Thí nghiệm 2: Phân phối môi trường vào ống nghiệm (thạch đứng, thạch nghiêng) Ống nghiệm thạch đứng: Bước 1: Tay trái giữ ống nghiệm, tay phải kẹp nút bông và kéo ra.

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 35 2.6. BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM Sinh viên báo cáo kết quả sau buổi thí nghiệm theo mẫu BÁO CÁO 2 (phần phụ lục). Sinh viên báo cáo tổng kết theo mẫu BÁO CÁO TỔNG KẾT (phần phụ lục) sau khi kết thúc môn học.

Quá trình phân lập vi sinh vật ở dạng thuần khiết: Với hầu hết các loại mẫu nghiên cứu, quá trình phân lập vi sinh vật ở dạng thuần khiết gồm các bước cơ bản sau: Bước 1: Tạo ra các khuẩn lạc riêng rẽ từ quần thể vi sinh vật ban đầu. Bước 2: Phân lập vi sinh vật thuần khiết. Bước 3: Kiểm tra độ tinh khiết của các khuẩn lạc.

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 36 BÀI THỰC HÀNH SỐ 3 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VI SINH VẬT Mục tiêu bài thực hành số 3: Sau khi học xong bài này, sinh viên có khả năng: • Trình bày được khái niệm phân lập vi sinh vật • Trình bày được các phương pháp phân lập vi sinh vật • Thực hiện được phương pháp cấy ria phân lập vi sinh vật 3.1. CƠ SỞ LÝ THUYẾT 3.1.1. Khái niệm Phân lập vi sinh vật là quá trình tách riêng các loài vi sinh vật từ quần thể ban đầu và đưa về dạng thuần khiết. Đây là một khâu có ý nghĩa rất quan trọng trong việc nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật. Vi sinh vật ở dạng thuần khiết là giống vi sinh vật được tạo ra từ một tế bào ban đầu. Trong tự nhiên hoặc trong các vật phẩm nghiên cứu, vi sinh vật thường tồn tại ở dạng hỗn hợp gồm nhiều loài khác nhau. Muốn nghiên cứu về hình thái, sinh lý, lý hoá hoặc sử dụng vào thực tiễn một loài nào đó thì cần phải đưa chúng về dạng thuần khiết. Nguyên tắc: Tách rời các tế bào vi sinh vật; nuôi cấy các tế bào trên trong môi trường dinh dưỡng đặc trưng để cho khuẩn lạc riêng rẽ, tách biệt nhau.

3.1.2. Kỹ thuật phân lập vi sinh vật thuần khiết

37 Trong bài thí nghiệm này, người học sẽ được thực hành kỹ thuật tách riêng rẽ các khuẩn lạc từ quần thể vi sinh vật trên môi trường phân lập. Mỗi khuẩn lạc tượng trưng cho một cụm sinh khối của vi khuẩn có thể nhìn thấy được bằng mắt thường và phát triển trên bề mặt thạch. Sau khi đã tách được các khuẩn lạc riêng lẻ, chúng sẽ được cấy chuyền trong điều kiện vô trùng vào môi trường thạch dinh dưỡng để tạo ra các vi sinh vật thuần khiết và duy trì nguồn giống. Kỹ thuật tạo ra các khuẩn lạc riêng rẽ từ quần thể vi sinh vật trên môi trường phân lập Kỹ thuật pha loãng mẫu Khi mẫu vi sinh vật đậm đặc, ta cần pha loãng để dễ dàng xác định số lượng vi sinh vật. Ta pha loãng theo sơ đồ sau: Phương pháp pha loãng vi sinh vật Kỹ thuật cấy ria Kỹ thuật phổ biến nhất để tách các tế bào vi khuẩn trong môi trường dinh dưỡng là kỹ thuật cấy ria trên đĩa petri. Sự lặp đi lặp lại của các đường nét cấy ria khiến cho mật độ vi khuẩn giảm dần và có nhiều vi khuẩn bị loại bỏ cho đến khi các VSV riêng biệt được lắng đọng trên môi trường thạch.

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 38 Sau khi ủ, khu vực cấy ria đầu tiên sẽ hiển thị quần thể vi sinh vật trong khi khu vực cấy ria cuối cùng sẽ hiển thị các khuẩn lạc riêng lẻ. Có nhiều kỹ thuật ria khác nhau để thực hiện hộp ria và tạo khuẩn lạc đơn. Một số kỹ thuật ria thường dùng: Kỹ thuật ria chữ T, kỹ thuật ria bốn góc, kỹ thuật ria tia, kỹ thuật ria liên tục. Sau mỗi lần cấy ria, vi sinh vật sẽ bị tách dần ra khỏi hỗn hợp và phát triển thành khuẩn lạc riêng rẽ. Kỹ thuật trải đĩa Kỹ thuật trải đĩa là một phương pháp được sử dụng để giàn đều mẫu chất lỏng với mục đích phân lập hoặc đếm vi khuẩn có trong mẫu đó. Lượng mẫu cần sử dụng nhỏ (0,01 mL). Kỹ thuật trải đĩa tốt sẽ tạo ra các khuẩn lạc riêng rẻ, mọc đều và có thể đếm được dễ dàng. Kỹ thuật này được áp dụng phổ biến nhất để kiểm nghiệm vi sinh vật dị dưỡng hoặc bất kỳ mẫu nào khác hoặc để phân lập và xác định nhiều loại vi sinh vật có trong các mẫu môi trường. Kỹ thuật đổ đĩa Kỹ thuật đổ đĩa là phương pháp thường được lựa chọn để đếm số lượng vi khuẩn hình thành khuẩn lạc có trong mẫu vật lỏng. Trong phương pháp này, lượng mẫu sử dụng cố định (thường là 1 mL) được đưa vào giữa đĩa petri vô trùng bằng pipette vô trùng. Sau đó, môi trường có nhiệt độ trong khoảng 35 oC – 40 oC được đổ vào đĩa Petri có chứa mẫu và trộn đều. Sau khi agar đông đặc, lật ngược đĩa và ủ ở 37°C trong 24 - 48 giờ. Vi sinh vật sẽ phát triển cả trên bề mặt và trong môi trường. Các khuẩn lạc mọc trong môi trường thường có kích thước nhỏ và có thể kết cụm, còn các khuẩn lạc mọc trên bề mặt môi trường thường có cùng kích thước và riêng lẻ. Mỗi khuẩn lạc (to và nhỏ) đều được đếm cần thận để tính toán số lượng khuẩn lạc trong mẫu. Lưu ý: Nếu mẫu ban đầu ở dạng rắn phải đưa về dạng lỏng bằng cách: Nghiền mẫu và hoà tan mẫu trong nước cất vô trùng. Sau đó thực hiện như mẫu dạng lỏng.

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 39 3.2. HÓA CHẤT Plate Count Agar (PCA): - Trypton: 5,0 gam - Chiết xuất nấm men (Yeast extract): 2,5 gam - Glucose: 1,0 gam - Agar: 15,0 gam - Pha 23,5 gam vào 1000 mL nước cất 3.3. THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ 3.3.1. Thiết bị - Tủ sấy - Nồi hấp tiệt trùng (Autoclave) - Tủ cấy vi sinh - Cân kỹ thuật 3.3.2. Dụng cụ - Đĩa petri - Ống nghiệm - Bình tam giác 250 mL - Bông gòn không thấm - Que trang thủy tinh - Que cấy - Mẫu vật cần phân lập (nấm men) - Đèn cồn 3.4. THỰC NGHIỆM 3.4.1. Thí nghiệm 1: Thực hiện kỹ thuật cấy ria chủng vi sinh nấm men

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 40 Hình 3.1: Phương pháp cấy ria

Bước 3: Hơ đỏ que cấy, làm nguội và gạch những đường song song ở phần (b) của petri như Hình 3.1.

Bước 4: Hơ đỏ que cấy, làm nguội và gạch những đường song song ở phần (c) của petri như Hình 3.1.

Bước 5: Lật ngược hộp petri có chứa VSV và để vào tủ ấm ở 350C trong 24 - 48 h.

Bước 2: Nghiêng hé mở hộp petri, dùng que cấy gạch những đường song song ở phần (a) của hộp petri.

Bước 1: Hơ đỏ que cấy, làm nguội và lấy một vòng que cấy đầy hỗn hợp VSV cần phân lập.

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 41 3.4.2. Thí nghiệm 2: Thực hiện kỹ thuật đổ đĩa chủng vi sinh nấm men Một lượng nhỏ VSV đã pha loãng được trộn đều với môi trường agar nóng chảy và đổ vào hộp petri. Sau thời gian nuôi cấy ở nhiệt độ thích hợp, VSV sẽ mọc thành những khuẩn lạc riêng rẽ. Bước 1: Dùng micropipette và đầu típ vô trùng, thao tác vô trùng chuyển 1 mL dịch chứa giống vi sinh vật lên bề mặt môi trường trong đĩa petri. Bước 2: Đổ khoảng 15 - 20 mL môi trường đã đun chảy và để nguội đến 45 - 550C vào đĩa petri đã cấy mẫu. Bước 3: Xoay nhẹ đĩa petri cùng chiều và ngược chiều kim đồng hồ vài lần để dung dịch giống được trộn đều trong môi trường cấy. Bước 4: Đậy nắp đĩa petri, để đông tự nhiên và đem ủ ở nhiệt độ thích hợp. 3.4.3. Thí nghiệm 3: Thực hiện kỹ thuật trải đĩa chủng vi sinh nấm men Bước 1: Pha loãng mẫu trước được dàn đều lên trên bề mặt đĩa petri có chứa môi trường dinh dưỡng thích hợp. Bước 2: Dùng micropipette và đầu típ vô trùng, thao tác vô trùng chuyển 0,1 mL dịch chứa giống vi sinh vật lên bề mặt môi trường trong đĩa petri. Bước 3: Nhúng đầu thanh gạt (que trang) thuỷ tinh vào cồn 700, hơ qua ngọn lửa để khử trùng. Để đầu thanh gạt nguội trong không gian vô trùng của ngọn lửa. Bước 4: Mở đĩa petri, đặt nhẹ nhàng thanh gạt lên bề mặt thạch của đĩa petri. Dùng đầu thanh gạt xoay, trải đều dịch giống lên bề mặt thạch. Trong khi trải, thực hiện xoay đĩa một vài lần, mỗi lần khoảng 1/2 chu vi đĩa tạo điều kiện cho thanh gạt trải dịch giống đều khắp bề mặt môi trường.

Bước 5: Rút que trang khỏi đĩa, đậy đĩa, gói và ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp trong tủ ấm.

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 42 Hình 3.2: Quy trình đổ đĩa (a) và trải đĩa (b) 3.5. CÂU HỎI ÔN TẬP Câu 1: Nêu cách khái niệm và nguyên tắc phân lập vi sinh vật. Câu 2: Nêu cách thực hiện phương pháp cấy ria Câu 3: Nêu cách thực hiện phương pháp đổ đĩa Câu 4: Nêu cách thực hiện phương pháp trải đĩa.

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 43 3.6. BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM Sinh viên báo cáo kết quả sau buổi thí nghiệm theo mẫu BÁO CÁO 3 (phần phụ lục). Sinh viên báo cáo tổng kết theo mẫu BÁO CÁO TỔNG KẾT (phần phụ lục) sau khi kết thúc môn học.

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 44 BÀI THỰC HÀNH SỐ 4 KỸ THUẬT GIEO CẤY VI SINH VẬT Mục tiê u bài thực hành số 4: Sau khi học xong bài này, sinh viên có khả năng: • Trình bày được nguyên tắc cấy chuyền • Trình bày được phương pháp gieo cấy vi sinh vật • Thực hiện được phương pháp nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường thạch nghiêng 4.1. CƠ SỞ LÝ THUYẾT 4.1.1. Khái niệm Kỹ thuật gieo cấy vi sinh vật là một kỹ năng thí nghiệm cơ bản và quan trọng trong lĩnh vực vi sinh. Các nhà vi sinh học sử dụng kỹ thuật cấy chuyền cho một loạt các quy trình như chuyển môi trường nuôi cấy và để thực hiện các xét nghiệm vi sinh. Kỹ thuật cấy chuyền thích hợp trong việc ngăn ngừa ô nhiễm môi trường nuôi cấy từ vi khuẩn lạ vốn có trong môi trường. Ví dụ, các vi sinh vật trong không khí (bao gồm cả nấm), vi khuẩn bám trên cơ thể của các nhà nghiên cứu, mặt bàn thí nghiệm hoặc các bề mặt khác, vi khuẩn được tìm thấy trong hạt bụi, cũng như trên các thiết bị và dụng cụ thủy tinh không được khử trùng,... Do đó, ảnh hưởng đến kết quả phòng thí nghiệm. Ngoài ra, kỹ thuật cấy chuyền là vô cùng quan trọng để duy trì chủng vi sinh thuần khiết trong khi chuyển từ môi trường này sang môi trường khác. Hơn nữa, kỹ thuật cấy chuyền thích hợp sẽ ngăn chặn các vi khuẩn được sử dụng trong phòng thí nghiệm vô tình thải ra môi trường và lây nhiễm cho những người làm việc trong phòng thí nghiệm. Điều này đặc biệt quan trọng khi mầm bệnh đang được xử lý. 4.1.2. Nguyên tắc Vi sinh vật được chuyển từ môi trường này sang môi trường khác

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 45 bằng cách cấy chuyền trong điều kiện môi trường vô trùng. Mỗi lần cấy chuyền, chỉ nên dùng với một loại VSV để tránh nhiễm chéo các loại vi sinh vật với nhau. Ghi nhãn từng ống nghiệm sẽ cấy chuyền với đầy đủ các thông tin về VSV trong ống nghiệm, bao gồm: tên vi sinh vật, ngày cấy chuyền, môi trường cấy chuyền. 4.2. HÓA CHẤT Plate Count Agar (PCA): - Trypton: 5,0 gam - Chiết xuất nấm men (Yeast extract ): 2,5 gam - Glucose: 1,0 gam - Agar: 15,0 gam - Pha 23,5 gam vào 1000 mL nước cất 4.3. THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ 4.3.1. Thiết bị - Tủ sấy - Nồi hấp tiệt trùng (Autoclave) - Tủ cấy vi sinh - Cân kỹ thuật 4.3.2. Dụng cụ - Ống nghiệm - Bình tam giác 250 mL - Bông gòn không thấm - Que cấy - Mẫu vật cần phân lập (Nấm men) - Đèn cồn

Bước 6: Lướt que cấy trên mặt thạch nghiêng theo hình chữ chi, hình xoắn, hình vạch ngang song song như hình: Bước 7: Rút que cấy ra, hơ đỏ trên ngọn lửa đèn cồn vô khuẩn sau đó đặt que cấy lên giá đỡ ống nghiệm.

Bước 3: Mở nắp ống nghiệm gốc trước bằng cách dùng ngón tay út kẹp chặt nút bông trong lòng bàn tay, từ từ xoay và kéo nút bông ra khỏi ống nghiệm, hơ nút bông và miệng ống nghiệm gốc trên ngọn lửa đèn cồn. Chú ý, không làm cháy nút bông cũng như không làm rơi nút bông xuống bàn cấy hay để nút bông chạm vào bất kỳ vật gì xung quanh. Luôn giữ miệng ống nghiệm đang mở ở vị trí nằm nghiêng và gần ngọn lửa đèn cồn.

Bước 5: Cho que cấy đã vô khuẩn và làm nguội vào ống nghiệm gốc, lấy một vòng que cấy môi trường (lỏng hay đặc) có chứa vi sinh vật và chuyển nó sang môi trường trong ống nghiệm thứ 2.

Bước 2: Tiệt trùng que cấy bằng cách hơ trên ngọn lửa đèn cồn tới khi que cấy nóng đỏ.

Bước 1: Cầm que cấy trong tay phải (tay thuận), ống nghiệm gốc và ống nghiệm sẽ cấy chuyền trong tay trái.

Bước 4: Mở nắp ống nghiệm sẽ cấy chuyền bằng cách kẹp chặt nút ống nghiệm giữa ngón út và ngón áp út, làm tương tự như trường hợp ống nghiệm gốc.

Bước 8: Hơ lần lượt miệng ống nghiệm và nút bông qua ngọn lửa đèn cồn sau đó đậy nắp ống nghiệm lại. Lưu ý nút bông của ống nghiệm nào thì đậy đúng ống nghiệm đó.

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 46 4.4. THỰC NGHIỆM Mẫu vật được sử dụng để cấy chuyền trong bài thí nghiệm này là giống nấm men (Saccharomyces Cerevisiae).

Bước 9: Đem ống nghiệm đi ủ nhiệt độ 350C trong 24 - 48 giờ.

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 47 Hình 4.1: Các kiểu cấy thạch nghiêng 4.5. CÂU HỎI ÔN TẬP Câu 1: Trình bày mục đích của việc cấy chuyền. Câu 2: Kỹ thuật gieo cấy vi sinh vật là gì. Câu 3: Trình bày quy trình của việc cấy chuyền vi sinh vật. 4.6. BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM Sinh viên báo cáo kết quả sau buổi thí nghiệm theo mẫu BÁO CÁO 4 (phần phụ lục). Sinh viên báo cáo tổng kết theo mẫu BÁO CÁO TỔNG KẾT (phần phụ lục) sau khi kết thúc môn học.

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 48 BÀI THỰC HÀNH SỐ 5 CÁC PHƯƠNG PHÁP NHUỘM MÀU VÀ QUAN SÁT HÌNH THÁI VI SINH VẬT Mục tiêu bài thực hành số 5: Sau khi học xong bài này, sinh viên có khả năng: • Trình bày được các phương pháp nhuộm dùng để quan sát hình thái vi sinh vật • Thực hiện được phương pháp làm tiêu bản giọt ép • Thực hiện được phương pháp nhuộm gram • Sử dụng được kính hiển vi để quan sát hình thái vi sinh vật 5.1. CƠ SỞ LÝ THUYẾT Nguyên tắc: Vi sinh vật có kích thước rất nhỏ và chỉ số khúc xạ gần bằng với nước nên không thể quan sát được bằng mắt thường. Kính hiển vi thường được sử dụng để quan sát sự khác biệt về kích thước và hình dạng của các tế bào cũng như là sự hình thành bào tử, sự chuyển động thực tế hay chuyển động Brown của các tế bào. Kỹ thuật làm tiêu bản giọt ép, tiêu bản giọt treo hoặc tiêu bản tạm thời có nhuộm màu thường được sử dụng bỡi những kỹ thuật này sẽ làm hạn chế sự di chuyển của vi sinh vật trong môi trường nước dể dễ dàng quan sát hơn. Trong bài thí nghiệm này, vi khuẩn nấm men bánh mì (S. cerevisiae), vi khuẩn trong nước dưa chua (Lactobacillus) và vi khuẩn trong hệ bùn hoạt tính (Rotifer, Stalked ciliates,...). 5.1.1. Phương pháp làm tiêu bản tạm thời Tiêu bản giọt ép Trong kỹ thuật làm tiêu bản giọt ép, mẫu vật trong một giọt nước hoặc một chất lỏng khác được đặt trên một vòng tròn nhỏ đã được vẽ trên phiến kính. Sau đó cố định mẫu vật bằng cách đặt nhẹ nhàng lá kính lên mẫu vật. Phương pháp này thường được sử dụng để quan sát các sinh vật cực nhỏ trong nước sông, suối, ao, hồ hoặc môi trường lỏng khác. Đặc biệt,

Nhóm 2: Vi khuẩn không có khả năng giữ được phức chất và bị mất màu khi xử lý bằng cồn, vi khuẩn gram (-). Nguyên tắc: Dựa vào sự khác biệt giữa thành phần hóa học của tế bào vi khuẩn. Các tế bào gram dương có lớp peptidoglycan dày, trong khi

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 49 phương pháp này còn được sử dụng để quan sát, nghiên cứu sự chuyển động và hành vi của vi sinh vật Tiêu bản giọt treo Kỹ thuật này cũng được dùng để quan sát, nghiên cứu sự chuyển động, đặc điểm hình thái của vi sinh vật giống như tiêu bản giọt ép. Tuy nhiên, trong kỹ thuật này, một giọt chủng cấy được đặt lên phiến kính có một đường tròn lõm ở giữa và được bôi một lớp vaseline mỏng xung quanh phần lõm để tạo ra một lớp vật liệu có khả năng dính lá kính lên phiến kính. Tiêu bản tạm thời có nhuộm màu Trong kỹ thuật làm tiêu bản tạm thời có nhuộm màu, dấu vết của vi khuẩn được nhuộm bằng một thuốc thử duy nhất, tạo ra sự tương phản đặc biệt giữa sinh vật và màu nền môi trường chứa sinh vật đó. Màu nhuộm có các nhiễm sắc thể mang điện tích dương được ưa thích vì axit nucleic của vi khuẩn và các thành phần nhất định của thành tế bào mang điện tích âm thu hút mạnh và liên kết với nhiễm sắc thể cation. Mục đích của việc nhuộm màu là làm sáng tỏ hình thái và sự sắp xếp của các tế bào vi khuẩn. Người ta thường sử dụng thuốc nhuộm không độc hoặc ít độc với vi sinh vật và được pha loãng ở nồng độ đảm bảo cho tế bào vi sinh vật vẫn sống và hoạt động sau khi nhuộm màu. Các chất nhuộm màu cơ bản thường được sử dụng là Methylene blue, Mrystal violet và Marbol fuchsin. 5.1.2. Phương pháp làm tiêu bản cố định Năm 1884, nhà bác học Đan mạch Cristian Gram đề xuất phương pháp nhuộm đặc biệt. Đây là phương pháp nhuộm để phân loại vi khuẩn, dựa trên khả năng bắt màu phức chất được tạo thành từ thuốc nhuộm tím kết tinh và iod, tất cả các vi khuẩn được chia làm 2 nhóm lớn: Nhóm 1: Giữ được phức chất tạo thành và còn màu tím sau khi xử lý bằng cồn, vi khuẩn gram (+).

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 50 đó lớp peptidoglycan trong các tế bào gram âm mỏng hơn nhiều và được bao quanh bởi các lớp lipid-containing bên ngoài. Thêm vào đó, vi khuẩn gram (-) còn chứa teichoic acids được tạo ta bởi nhóm chức alcohol và phosphate. 5.2. HÓA CHẤT - Methylene Blue - Fuchsine - Cồn 900 - Crystal violet - Lugol 5.3. THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ 5.3.1. Thiết bị - Kính hiển vi 5.3.2. Dụng cụ - Phiến kính ( lamella) - Lá kính - Pipette nhựa - Đèn cồn 5.4. THỰC NGHIỆM 5.4.1. Thí nghiệm 1: Quan sát hình thái vi sinh vật trên kính hiển vi bằng kỹ thuật tiêu bản giọt ép Bước 1: Dùng que cấy hoặc ống hút lấy giống vi sinh vật để làm vết bôi. Giống vi sinh được sử dụng là nấm men bia, bùn hoạt tính, nước dưa chua. Bước 2: Đặt lá kính lên giọt mẫu VSV thật nhẹ nhàng tránh không tạo thành bọt khí. Muốn vậy để một mép lá kính tiếp xúc với phiến kính rồi từ từ hạ lá kính xuống. Bước 3: Đưa tiêu bản lên quan sát trên kính hiển vi.

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 51 Hình 5.1: Quy trình làm tiêu bản giọt ép 5.4.2. Thí nghiệm 2: Quan sát hình thái vi sinh vật trên kính hiển vi bằng kỹ thuật tiêu bản giọt treo Bước 1: Dùng phiến kính đặc biệt có phần lõm hình tròn ở giữa. Bước 2: Bôi vaseline quanh phần lõm của phiến kính. Bước 3: Cho 1 giọt mẫu VSV lên giữa lá kính. Bước 4: Thận trọng xoay ngược lá kính cho giọt mẫu VSV xuống phía dưới rồi đặt lên phần lõm của phiến kính. Hình 5.2: Quy trình làm tiêu bản giọt treo

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 52 5.4.3. Thí nghiệm 3: Quan sát hình thái vi sinh vật trên kính hiển vi bằng kỹ thuật tiêu bản tạm thời có nhuộm màu Bước 1: Nhỏ 1 giọt mẫu vi sinh vật với thuốc nhuộm. Vi sinh vật được sử dụng để quan sát là nấm men bia. Để khô tự nhiên trong không khí hoặc cố định vi sinh vật bằng cách hơ phiến kính nhanh vài lần qua ngọn lửa đèn cồn. Bước 2: Nhỏ 1 giọt thuốc nhuộm xanh methylene lên tiêu bản vi sinh vật, để trong 1 phút. Bước 3: Đậy lá kính lên giọt dịch. Bước 4: Quan sát tiêu bản ở vật kính (x10) và (x40). Hình 5.3: Quy trình làm tiêu bản tạm thời có nhuộm màu 5.4.4. Thí nghiệm 4: Quan sát hình thái của vi khuẩn Gram (+) và Gram (-) trên kính hiển vi bằng phương pháp nhuộm Gram Bước 1: Tạo vết bôi, cố định vi khuẩn. - Vi khuẩn trong môi trường lỏng: dùng que cấy đầu tròn lấy 1 giọt vi khuẩn đặt lên lamelle sạch, chờ khô. - Vi khuẩn trong môi trường đặc: lấy 1 giọt nước vô trùng đặt lên lamelle, chờ khô. Bước 2: Nhuộm tiêu bản bằng Crytal Violet (Getian violet) trong 1 ph ú t.

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 53 Bước 3: Rửa nước. Bước 4: Nhuộm Lugol (Iodine) trong 1 phút .\ Bước 5: Rửa nước. Bước 6: Tẩy cồn trong 1 phút. Bước 7: Rửa nước. Bước 8: Nhuộm Fuchsin (Safranin) 1 phút. Bước 9: Rửa nước và để khô. Bước 10: Nhỏ dầu, quan sát ở vật kính x100. Hình 5.4: Quy trình nhuộm Gram

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 54 Yêu cầu: - Giống vi khuẩn nhuộm Gram là giống đúng ngày tuổi (18 - 24 giờ). Nuôi cấy ở môi trường thích hợp. - Nhuộm theo đúng thứ tự và thời gian. - Sau khi quan sát ở vật kính dầu, lau sạch kính bằng xylen.

5.5. CÂU HỎI ÔN TẬP Câu 1: Trình bày nguyên tắc của phương pháp nhuộm Gram. Câu 2: Hãy giải thích tại sao khi quan sát trên tiêu bản cố định lại dùng lá kính? Câu 3: Mục đích của việc bôi vaseline xung quanh phần lõm trên phiến kính trong kỹ thuật làm tiêu bản giọt treo? Câu 4: Người ta thường sử dụng 04 loại hóa chất trong quá trình nhuộm Gram. Hãy kể tên và công dụng của từng loại. 5.6. BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM Sinh viên báo cáo kết quả sau buổi thí nghiệm theo mẫu BÁO CÁO 5 (phần phụ lục). Sinh viên báo cáo tổng kết theo mẫu BÁO CÁO TỔNG KẾT (phần phụ lục) sau khi kết thúc môn học.

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 55 BÀI THỰC HÀNH SỐ 6 TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ Mục tiêu bài thực hành số 6: Sau khi học xong bài này, sinh viên có khả năng: • Trình bày được khái niệm, ứng dụng, phương pháp xác định vi sinh vật hiếu khí • Thực hiện được phương pháp đổ đĩa và trải đĩa trong kiểm định tổng vi sinh vật hiếu khí 6.1. CƠ SỞ LÝ THUYẾT 6.1.1. Kỹ thuật đếm trên đĩa tế bào dị dưỡng Kỹ thuật đếm trên đĩa các tế bào dị dưỡng (Heterotrophic plate count – HPC method) là phương pháp tốt nhất xác định thành phần vi khuẩn hiếu khí tổng quát của mẫu nước, để có thể đánh giá hiệu quả nhà máy xử lý nước, sự tăng trưởng sau đó của vi khuẩn trong các đường ống, trong các nguồn nước (Regrowth). Ngoài ra, chỉ tiêu tổng vi khuẩn hiếu khí còn được sử dụng để đánh giá chất lượng nước đóng chai, chỉ số vi khuẩn hiếu khí càng cao chứng tỏ quy trình sản xuất kém và thời gian bảo quản sẽ ngắn. 6.1.2. Phương pháp xác định tổng vi khuẩn hiếu khí Phương pháp đổ đĩa (Pour plate method): là phương pháp đếm tiêu chuẩn. Có vài nhược điểm là hạn chế số lượng tối đa của vi khuẩn trên môi trường do nhiệt độ ủ và thời gian xét nghiệm. Nhiệt độ môi trường 44460C có thể gây sốc nhiệt cho vi khuẩn và môi trường giàu dinh dưỡng có thể làm giảm sự phát triển của những vi khuẩn thiếu dinh dưỡng. Kỹ thuật cải tiến có thể khắc phục những hạn chế trên. Phương pháp trải đĩa (Spread plate method): Không bị sốc nhiệt do nhiệt độ của thạch. Thêm vào đó, tất cả khuẩn lạc mọc trên mặt thạch có thể được nhìn thấy và đếm dễ dàng và cũng dễ phân biệt những khuẩn lạc riêng biệt hoặc những bong bóng khí. Kỹ thuật này có hạn chế chỉ sử dụng những mẫu thể tích nhỏ: 0,1 - 0,5 mL phụ thuộc vào khả năng hấp phụ của thạch.

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 56 Phương pháp màng lọc (Membrane filtration method): Hạn chế việc xét nghiệm thể tích mẫu lớn của những mẫu có độ đục cao và đặc biệt hữu ích cho nước có mật độ vi khuẩn thấp. Phương pháp này đòi hỏi thời gian phân tích ít nhất. Nhược điểm của nó do người thao tác, nhiễm bẩn các đĩa do chuẩn bị và bảo quản quá lâu và những thay đổi do chất lượng màng lọc. 6.2. HÓA CHẤT Tryptone glucose extract agar: dùng cho phương pháp đổ đĩa và trải đĩa. pH được chỉnh ở 6,8 - 7,0 sau khi khử trùng ở 1210C trong 15 phút. Plate count agar: dùng cho phương pháp đổ đĩa và trải đĩa. pH 7,0 -7,2 sau khi khử trùng ở 121 0C trong 15 phút. R2A (Reasoner’s 2A Agar): dùng cho phương pháp đổ đĩa, trải đĩa và màng lọc. Môi trường này không ở dạng dehydrate mà phải chuẩn bị theo những thành phần cơ bản theo công thức môi trường. Điều chỉnh pH đến 7,2 bằng K2HPO4 hoặc KH2PO4 dạng rắn trước khi thêm agar và khử trùng ở 1210C, 15 phút. 6.3. THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ 6.3.1. Thiết bị - Tủ sấy - Nồi hấp tiệt trùng (Autoclave) - Tủ cấy vi sinh - Cân kỹ thuật 6.3.2. Dụng cụ - Đĩa petri - Bình tam giác 250 mL - Bông gòn không thấm - Que trang thủy tinh - Micropipette - Đèn cồn

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 57 6.4. THỰC NGHIỆM 6.4.1. Thí nghiệm 1: Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí bằng kỹ thuật đổ đĩa Bước 1: Chuẩn bị môi trường: khử trùng hoặc đun cho đến khi nóng chảy agar nếu là môi trường đã khử trùng và trữ lạnh. Bước 2: Chuẩn bị nước cất tiệt trùng. Bước 3: Khử trùng dụng cụ: Pipette, petri. Bước 4: Pha loãng mẫu nước thải. Bước 5: Hút vào petri đã khử trùng 1 mL mẫu đã pha loãng, mỗi độ pha loãng chuẩn bị 2 petri (thao tác vô trùng dưới đèn cồn). Bước 6: Ghi ký hiệu độ pha loãng lên từng petri. Bước 7: Thực hiện 3, 4 độ pha loãng cho mỗi mẫu. Bước 8: Sau khi để nguội môi trường khoảng 35 - 400C, rót vào các petri đã chứa mẫu mỗi petri khoảng 10 mL môi trường. Bước 9: Xoay nhè nhẹ petri, tránh không để môi trường tràn ra ngoài và phân bố đều vi sinh vật có trong mẫu. Bước 10: Chờ thạch đông cứng lại, lật ngược các petri và ủ ở 30 - 350C. Bước 11: Sau 24 - 72 giờ đếm các khuẩn lạc riêng rẽ quan sát được. 6.4.2. Thí nghiệm 2: Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí bằng kỹ thuật trải đĩa Bước 1: Chuẩn bị môi trường: khử trùng hoặc đun cho đến khi nóng chảy agar nếu là môi trường đã khử trùng và trữ lạnh. Bước 2: Chuẩn bị nước cất tiệt trùng. Bước 3: Khử trùng dụng cụ: pipette, petri Bước 4: Pha loãng mẫu nước. Bước 5: Sau khi để nguội môi trường khoảng 35 - 400C, rót vào các petri vô trùng; khoảng 10 mL môi trường/đĩa; để yên cho tới khi thạch hoàn toàn đông cứng.

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 58 Bước 6: Hút vào petri đã khử trùng 0,1 mL mẫu đã pha loãng, mỗi độ pha loãng chuẩn bị 2 petri (thao tác vô trùng dưới đèn cồn). Bước 7: Ghi ký hiệu độ pha loãng lên từng petri. Bước 8: Thực hiện 3, 4 độ pha loãng cho mỗi mẫu. Bước 9: Hơ nóng que trang; làm nguội và nhẹ nhàng lướt que trang trên mặt thạch nhằm dàn trải đều vi sinh vật trên bề mặt thạch. Bước 10: Chờ thạch đóng cứng lại, lật ngược các petri và ủ ở 30 - 350C. Bước 11: Sau 24 - 72 giờ đếm các khuẩn lạc riêng rẽ quan sát được. 6.5. XỬ LÝ SỐ LIỆU Đếm tất cả số các khuẩn lạc xuất hiện trên các đĩa sau khi ủ. Chọn các đĩa có số đếm từ 25 - 250 để tính kết quả. Mật độ tổng vi khuẩn hiếu khí trong 1g hay 1 mL mẫu được tính như sau: Trong đó: A: số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn trong 1g hay 1 mL mẫu N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn ni: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i V: thể tích dịch mẫu (mL) cấy vào trong mỗi đĩa Fi: độ pha loãng tương ứng Ví dụ: Trong một trường hợp phân tích 1 mL mẫu cụ thể nhận được kết quả như sau: Tên bảng

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 59 Nồng độ pha loãng 10-3 10-4 Đĩa 1 235 26 Đĩa 2 246 21 Lưu ý: - Các kết quả tổng số vi khuẩn hiếu khí thường được biểu diễn dưới dạng số mũ của cơ số thập phân. - Trường hợp có khuẩn lạc vi sinh vật mọc loang, mỗi vết loang được tính là một khuẩn lạc. - Nếu số khuẩn lạc chiếm hơn 1/3 đĩa thì phải ghi nhận điều này và đánh dấu kết quả nhận được. - Nếu ở độ pha loãng cao nhất, số khuẩn lạc đếm được trên đĩa > 250, ví dụ ở nồng độ 10-5 số đếm được lớn hơn 250, kết quả được ghi: >2,5 x107 CFU/g. - Nếu ở độ pha loãng thấp nhất, số khuẩn lạc đếm được trên 1 đĩa < 25, ví dụ ở nồng độ 10-1 số đếm nhỏ hơn 25, kết quả được ghi: < 2,5 x 102 CFU/g. 6.6. CÂU HỎI ÔN TẬP Câu 1: Trình bày định nghĩa kỹ thuật đếm tế bào dị dưỡng. Câu 2: Trình bày quy trình xác định tổng vi sinh vật hiếu khí bằng phương pháp đổ đĩa và trải đĩa. Câu 3: So sánh ưu nhược điểm của phương pháp đổ đĩa, trải đĩa, màng lọc. 6.7. BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM Sinh viên báo cáo kết quả sau buổi thí nghiệm theo mẫu BÁO CÁO 6 (phần phụ lục). Sinh viên báo cáo tổng kết theo mẫu BÁO CÁO TỔNG KẾT (phần phụ lục) sau khi kết thúc môn học.

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 60 BÀI THỰC HÀNH SỐ 7 PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA TỔNG COLIFORMS TRONG NƯỚC THẢI Mục tiêu bài thực hành số 7: Sau khi học xong bài này, sinh viên có khả năng: • Trình bày được khái niệm về các loại vi sinh vật gây bệnh • Trình bày được phương pháp xác định tổng Coliforms trong nước thải • Giải thích được ý nghịa của việc kiểm tra chỉ tiêu vi sinh vật • Thực hiện được phương pháp pha loãng tới hạn (MNP) 7.1. CƠ SỞ LÝ THUYẾT 7.1.1. Khái niệm Coliforms là những trực khuẩn gram âm không sinh bào tử, hiếu khí hoặc kỵ khí tuỳ ý, có khả năng lên men lactose sinh acid và sinh hơi ở 370C trong 24 - 48 giờ. Trong thực tế phân tích, Coliforms còn được định nghĩa là các vi khuẩn có khả năng lên men sinh hơi trong khoảng 48 giờ khi được ủ ở 370C trong môi trường Lauryl Tryptose và canh Brilliant Green Lactose Bile Salt (BGBL). Coliforms gồm 2 nhóm: Coliforms chịu nhiệt và Coliforms phân. Trong đó, Coliforms phân là một thành phần của hệ vi sinh đường ruột ở người và các động vật máu nóng khác. Nhóm Coliforms gồm 4 giống là: Escherichia với 1 loài duy nhất là E. coli, Citrobacter, Klebsiella và Enterobacter. Tính chất sinh hoá đặc trưng của nhóm này được thể hiện qua các thử nghiệm Indol (I), Methyl Red (MR), Voges-Proskauer (VP) và Citrate (iC) thường được gọi tóm tắt chung là IMViC. 7.1.2. Sự phân bố của vi sinh vật và ý nghĩa của việc kiểm tra chỉ tiêu Coliforms phân bố ở mọi nơi, có trong ruột người và các động vật máu nóng.

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 61 Coliforms được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị. Số lượng hiện diện của chúng trong thực phẩm, nước được dùng để chỉ thị cho khả năng hiện diện của các VSV gây bệnh khác. Số lượng Coliforms cao thì khả năng hiện diện của VSV gây bệnh khác cao. Tuy nhiên, mối quan hệ giữa Coliforms và các loại VSV gây bệnh vẫn chưa được chứng minh rõ ràng. 7.1.3. Phương pháp màng lọc Phương pháp màng lọc (Membrane filtration method): Hạn chế việc xét nghiệm thể tích mẫu lớn của những mẫu có độ đục cao và đặc biệt hữu ích cho nước có mật độ vi khuẩn thấp. Phương pháp này đòi hỏi thời gian phân tích ít nhất. Nhược điểm của nó do người thao tác, nhiễm bẩn các đĩa do chuẩn bị và bảo quản quá lâu và những thay đổi do chất lượng màng lọc. 7.1.4. Phương pháp MPN (Most Probable Number – phương pháp định lượng; phương pháp pha loãng tới hạn) Phương pháp MPN còn được gọi là phương pháp pha loãng tới hạn hay phương pháp chuẩn độ. Đây là phương pháp dùng để đánh giá số lượng vi sinh vật theo số lượng vi sinh vật có xác suất lớn nhất hiện diện trong một đơn vị thể tích mẫu. Phương pháp định lượng này dựa trên kết quả định tính của một loạt thí nghiệm được lặp lại ở một số độ pha loãng khác nhau. Thông thường, việc định lượng này được thực hiện lặp lại 3 lần ở 3 độ pha loãng bậc 10 liên tiếp, tổng cộng 3 x 3 = 9 ống nghiệm. Nguyên tắc: - Mẫu được pha loãng thành một dãy thập phân, 3 nồng độ kế tiếp nhau khác nhau 10 lần. - Mẫu được ủ trong môi trường thích hợp có ống durham. - Mỗi nồng độ pha loãng được lặp lại 3 - 5 ống. - Theo dõi sự sinh hơi trong từng ống nghiệm.

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 62 - Xác định các ống dương tính ở mỗi nồng độ pha loãng và dựa vào bảng MPN để suy ra số lượng nhóm VSV tương ứng hiện diện trong 1g (hoặc 1 mL) mẫu ban đầu. Các hệ thống thường dùng trong phân tích: Hệ thống 1: Mỗi dãy 3 ống Dãy 1 3 ống 10 mL mẫu nước Dãy 2 3 ống 1 mL mẫu nước Dãy 3 3 ống 0,1 mL mẫu nước Hệ thống 2: Mỗi dãy 5 ống Dãy 1 5 ống 10 mL mẫu nước Dãy 2 5 ống 1 mL mẫu nước Dãy 3 5 ống 0,1 mL mẫu nước Đọc kết quả: Theo bảng MNP và con số đạt được là số lượng vi khuẩn/100 mL. Bước 1: Hơ dụng cụ trên ngọn lửa đèn cồn, đưa qua đưa lại đến 3 – 4 lần. Với các dây mayxo ở đầu que cấy phải nung cho thật đỏ hết chiều dài dây cấy.Ví dụ đọc kết quả: Hệ số 1: + + + + + + - - - MPN=240/100 mL 36 < N < 1300 + + + + + + + - - MPN = 1100/100 mL 150 < N < 4800 Trong trường hợp không tìm thấy con số nào thích hợp trong bảng MPN, ta phải nghĩ đến có sự sai sót trong thao tác. Nếu mẫu nước bị nhiễm nặng, ta pha loãng mẫu nước 1/10, 1/100, 1/1000,…

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 63 Ví dụ: Với hệ thống 1 Dãy 1 3 ống 1 mL mẫu nước Dãy 2 3 ống 0,1 mL mẫu nước Dãy 3 3 ống 0,01 mL mẫu nước Kết quả sẽ là con số trên bảng MPN nhân với 10. Kết quả thử nghiệm Coliform được trình bày bằng chỉ số MPN, ước lượng mật độ Coliform trong mẫu theo thống kê. Bảng MPN được thiết lập dựa trên phân bố Poisson (phân bố ngẫu nhiên). 7.2. HÓA CHẤT - Bộ lọc Milipore khử trùng - Màng lọc - Môi trường Lactose Broth hoặc Lauryl tryptose: Pepton (5 gam); Chiết xuất thịt bò (3 gam); Lactose (5 gam); Pha 13 gam trong 1000 mL nước cất.-Môi trường Brillian Green Bile Lactose Broth: Pepton (10 gam); Lactose (10 gam); mật bò khô (20 gam); Brilliant xanh (0,0133 gam); Pha 40 gam trong 1000 mL nước cất. - Nước cất khử trùng 7.3. THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ 7.3.1. Thiết bị - Tủ sấy - Nồi hấp tiệt trùng (Autoclave) - Tủ cấy vi sinh - Cân kỹ thuật - Bộ lọc chân không 7.3.2. Dụng cụ - Mẫu nước - Kẹp gắp

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 64 - Đĩa petri - Micropipette - Ống nghiệm - Ống chuông (durham) - Bình tam giác 250 mL - Bông gòn không thấm - Đèn cồn 7.4. THỰC NGHIỆM 7.4.1. Thí nghiệm 1: Kiểm tra Coliforms trong nước thải bằng phương pháp màng lọc Bước 1: Chọn độ pha loãng (ứng với bảng). Bảng 7.1: Thể tích mẫu đề nghị lọc trong phương pháp lọc MF xác định Coliform Nguồn nước Thể tích mẫu (x) được lọc (mL) 100 50 10 1 0,1 0,01 0,001 Nước uống x Nước hồ bơi x Nước suối, giếng x x x Nước hồ, bể chứa x x x Đầu nguồn cấp nước x x x x Bãi tắm x x x x Nước sông x x x Nước cống đã Chlor hóa x x x Nước cống x x Lưu ý: Một mẫu nước được xem là lý tưởng nếu đếm được khoảng 10-80 khuẩn lạc Coliform. Mẫu có thể được pha loãng hoặc không pha loãng tùy theo mật độ vi sinh trong mẫu.

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 65 Bước 2: Dùng kẹp gắp đã khử trùng, đặt tấm màng lọc (bề có kẻ vạch ở phía trên) lên trên mặt phễu lọc một cách cẩn thận, khóa phễu lọc. Lọc mẫu bằng cách hút chân không, tráng phễu lọc bằng nước cất khử trùng. Mở phễu lọc và đặt tấm màng lọc lên đĩa petri đã khử trùng, có sẵn môi trường. Cẩn thận lăn tấm màng lọc trên mặt thạch và tránh sao cho không tạo các bong bóng khí dưới màng lọc. Bước 3: Khuẩn lạc Coliform tiêu biểu có màu hồng cho đến đỏ đậm, có ánh kim trên bề mặt. Ánh kim có thể bao phủ toàn bộ khuẩn lạc hoặc chỉ có một chấm nhỏ. Các khuẩn lạc không có ánh kim có thể có màu hồng, đỏ, trắng và không màu xem như không phải Coliform. 7.4.2. Thí nghiệm 2: Kiểm tra Coliforms trong nước thải bằng phương pháp MPN Bước 1: Pha loãng mẫu. Bước 2: Nuôi cấy dịch mẫu trong môi trường Laury Tryptose (LT)10 mL ở 3 nồng độ liên tiếp, 3 ống/nồng độ, 1 mL dịch pha loãng/ống LT. Ủ 370C/24 giờ. Bước 3: Đọc kết quả các ống Laury Tryptose dương tính (+), cấy chuyển các ống LT + vào các ống môi trường BGBL 2%. Ủ 370C/24 giờ. - Ống LT +: Môi trường đục và ống durham (ống chuông) nổi hoặc có bọt khí trong ống chuông (thể tích bọt khí trong ống chuông = 1/10 thể tích ống chuông). - Ống LT -: không có các trường hợp trên. Bước 4: Lập tỷ lệ các ống BGBL + ở 3 nồng độ liên tiếp. Tra bảng Mac Crady tìm số MPN tương ứng. - Ống BGBL +: môi trường đục và ống durham (ống chuông) nổi hoặc có bọt khí trong ống chuông (thể tích bọt khí trong ống chuông = 1/10 thể tích ống chuông). - Ống BGBL -: không có các trường hợp trên.

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 66 7.5. XỬ LÝ SỐ LIỆU Tính toán mật độ Coliform Số khuẩn lạc/ 100 ml = (Số khuẩn lạc đếm được x 100) / ml mẫu được lọc Tổng số Coliforms (CFU/g hoặc CFU/ml) = số MPN * 10n n là số nguyên dương của nồng độ pha loãng đầu tiên được nuôi cấy. Bảng 7.2: Chỉ số MPN (Áp dụng khi dùng 9 ống nghiệm, 3 ống 10 mL, 3 ống 0,1 mL) Số ống nghiệm có phản ứng (+) Chỉ số mLMPN/100 Giới hạn độ 3 ốngmL10 3 ống 1 mL 3 ốngmL0,1 Thấp Cao 0 0 0 <3 0 0 1 3 <0,5 9 0 1 0 3 <0,5 13 1 0 0 4 <0,5 20 1 0 1 7 1 21 1 1 0 7 1 23 1 1 1 11 3 3 1 2 0 11 3 36 2 0 0 9 1 36 2 0 1 14 3 37 2 1 0 15 3 44 2 1 1 20 7

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 67 2 2 0 21 4 47 2 2 1 28 10 150 3 0 0 23 4 120 3 0 1 39 7 130 3 0 2 64 15 380 3 1 0 43 7 210 3 1 1 57 14 230 3 1 2 120 39 380 3 2 0 93 15 380 3 2 1 150 30 440 3 2 2 210 35 470 3 3 0 240 36 1300 3 3 1 460 71 2400 3 3 2 1100 150 4800 3 3 3 >2400 7.6. CÂU HỎI ÔN TẬP Câu 1: Trình bày khái niệm và phân loại Coliforms. Câu 2: Trình bày quy trình thực hiện phương pháp pha loãng tới hạn. Câu 3: Ống chuông LT (+)/ LT (-) có đặc điểm gì sau thời gian ủ? 7.7. BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM Sinh viên báo cáo kết quả sau buổi thí nghiệm theo mẫu BÁO CÁO 7 (phần phụ lục). Sinh viên báo cáo tổng kết theo mẫu BÁO CÁO TỔNG KẾT (phần phụ lục) sau khi kết thúc môn học.

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 68 BÀI THỰC HÀNH SỐ 8 KIỂM TRA E. COLI TRONG NƯỚC THẢI Mục tiêu bài thực hành số 8: Sau khi học xong bài này, sinh viên có khả năng: • Trình bày được khái niệm vi khuẩn gây bệnh E. coli, Coliforms trong nước thải • Trình bày được phương pháp xác định tổng Coliforms trong nước thải • Thực hiện được phương pháp trải đĩa để kiểm định E. coli trong nước thải 8.1. CƠ SỞ LÝ THUYẾT 8.1.1. Khái niệm Escherichia coli là dạng coliforms có nguồn gốc từ phân, phát triển được ở 440C, sinh indol (phản ứng IND +), sinh acid (phản ứng MR+), không sinh aceton (phản ứng V.P -) và không sử dụng citrat làm nguồn cacbon (phản ứng CIT-). 8.1.2. Các loại môi trường thường được sử dụng Môi trường E.C Broth (Escherichia coli Broth): dùng để xác định có chọn lọc vi khuẩn Coliform và E. coli trong nước, thực phẩm và nguyên liệu. Môi trường này có chứa đường lactose giúp kích thích sự phát triển của nhóm vi khuẩn sử dụng lactose, đặc biệt là Coliforms và E. coli. Đồng thời, muối mật trong E.C Broth ức chế các vi khuẩn Gram + và các vi khuẩn không thuộc nhóm vi khuẩn đường ruột phát triển. Các vi khuẩn sử dụng lactose sẽ sinh acid và sinh hơi. Khí sinh ra được xác định bằng cách quan sát ống durham. Môi trường Endo agar: dùng để phát hiện và phân lập Coliforms, Coliforms phân, E. coli trong nước thải. Môi trường Endo agar có tính chọn lọc chủ yếu do chứa hai chất sodium sulfite và fuchsin kiềm sẽ ức chế vi khuẩn gram (+). Pepton trong môi trường cung cấp dưỡng chất, còn

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 69 lactose cung cấp năng lượng. Coliforms sẽ phân giải lactose sinh acid và aldehyde.Trong môi trường này, vi khuẩn không lên men lactose sẽ tạo khuẩn lạc không màu và sáng, trong khi các chủng Coliform hình thành khuẩn lạc đỏ. Màu này do acetaldehyde sinh ra phản ứng với fuchsin sulfat hoá sẽ tạo ra fuschin tinh thể. Vi khuẩn E. coli sẽ tạo ra khuẩn lạc có màu đỏ ánh kim. Bảng 8.1: Đặc điểm khuẩn lạc của các loại vi khuẩn trên môi trường Endo Agar Vi khuẩn Đặc điểm E. coli Khuẩn lạc tròn bóng có ánh kim và tâm đen Enterobacter aerogenes Khuẩn lạc nhớt Proteus, Salmonella, Shigella, Pseudomonas Khuẩn lạc không màu Môi trường E.M.B Agar (Eosin Methylene- blue Lactose Sucrose agar) là môi trường dùng để xác định và phân lập nhóm Enterobacteria gây bệnh. Lactose và sucrose có trong môi trường cho phép phân biệt được nhóm salmonellae; shigellae và nhóm chỉ sử dụng glucose như Proteus vulgaris, Citrobacter, Aeromonas hydrophila. Ngoài ra, methylene xanh, yellowish có trong môi trường gây ức chế sự phát triển của vi khuẩn Gram (+). Bảng 8.2: Đặc điểm khuẩn lạc của các loại vi khuẩn trên môi trường E.M.B Agar Vi khuẩn Khả năng mọc trên trườngmôi Đặc điểm khuẩn lạc E. coli Tốt/rất tốt Có tâm đen, ánh kim Salmonella, Shigella Tốt/rất tốt Trong mờ, không màu Enterobacter, Klebsiella… Tốt/rất tốt Lớn hơn khuẩn lạc của E. coli, nhớt, màu hồng có tâm màu nâu xám Bacillus cereus Không phát triển

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 70 8.2. HÓA CHẤT - Môi trường Endo-agar - Môi trường Lactose Broth hoặc Lauryl tryptose - Môi trường Brillian Green Bile Lactose Broth - Nước cất khử trùng - Mẫu nước 8.3. THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ 8.3.1. Thiết bị - Tủ sấy - Nồi hấp tiệt trùng (Autoclave) - Tủ cấy vi sinh - Cân kỹ thuật 8.3.2. Dụng cụ - Đĩa petri và pipette khử trùng - Kẹp gắp - Bình tam giác 250 mL - Bông gòn không thấm - Đèn cồn 8.4. THỰC NGHIỆM 8.4.1. Thí nghiệm 1: Kiểm tra sơ bộ E. coli bằng ống chuông Bước 1: Pha loãng mẫu. Bước 2: Nuôi cấy dịch mẫu trong môi trường Laury Trytose (LT) ở 3 nồng độ liên tiếp, 3 ống/nồng độ, 1 mL dịch pha loãng/ ống nghiệm. Ủ 370C/24 giờ. Bước 3: Đọc kết quả các ống Laury Tryptose dương tính (+), cấy chuyển các ống LT + vào các ống môi trường E.C. Ủ 440C/24 giờ.

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 71 Nếu ống LT +: môi trường đục và ống durham (ống chuông) nổi hoặc có bọt khí trong ống chuông (thể tích bọt khí trong ống chuông = 1/10 thể tích ống chuông). Bước 4: Từ các ống E.C +, cấy phân lập trên môi trường Endo agar hoặc E.M.B Agar. Ủ 370C/24 giờ. Bước 5: Nhận diện khuẩn lạc điển hình. Môi trường Endo agar: tròn, bóng, có ánh kim. Môi trường E.M.B Agar: khuẩn lạc tròn, bóng, có tâm đen, có ánh kim. Bước 6: Từ các khuẩn lạc nghi ngờ, cấy chuyền sang môi trường N.A (Nutrient Agar), ủ 370C/24 giờ. Bước 7: Làm nghiệm pháp IMViC với vi khuẩn đã cấy ở bước 6. Ủ 370C/24 giờ. Bước 8: Đọc kết quả IMViC. Bước 9: Kết luận. 8.4.2. Thí nghiệm 2: Nuôi cấy E. coli bằng phương pháp trải đĩa Bước 1: Chuẩn bị đĩa có chứa môi trường Endo Agar đã được hấp tiệt trùng. Bước 2: Lấy 0,1 mL mẫu đã được pha loãng đưa lên bề mặt thạch. Dùng que trang trải đều mẫu trên bề mặt đĩa dưới ngọn lửa đèn cồn. Bước 3: Ủ đĩa petri ở nhiệt độ 350C trong vòng 24 - 48 giờ. Bước 4: Đếm số lượng khuẩn lạc và tính toán số E. coli trong mẫu. 8.5. CÂU HỎI ÔN TẬP Câu 1: Trình bày khái niệm E. coli. Câu 2: Trình bày một số loại môi trường sử dụng trong kỹ thuật nuôi cấy E. coli. Câu 3: Đặc điểm môi trường LT (+)/ LT (-) sau thời gian ủ? Câu 4: Trình bày đặc điểm nhận dạng của E. coli trong môi trường Endor agar và E.M.B agar.

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 72 8.6. BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM Sinh viên báo cáo kết quả sau buổi thí nghiệm theo mẫu BÁO CÁO 8 (phần phụ lục). Sinh viên báo cáo tổng kết theo mẫu BÁO CÁO TỔNG KẾT và so sánh kết quả theo TCVN (phần phụ lục) sau khi kết thúc môn học.

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 73 PHỤ LỤC 1 BÁO CÁO 1 NGÀYLỚPNHÓM:________________________:________________________:________________________ BÀI THỰC HÀNH SỐ 1 CÁC THIẾT BỊ PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG Họ và tên Bao gói ống nghiệm Bao gói đĩa petri Nguyễn Văn A …

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 74 BÁO CÁO 2 NGÀYLỚPNHÓM:________________________:________________________:________________________ BÀI THỰC HÀNH SỐ 2 CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT Họ và tên Thạch đứng Thạch nghiêng Đĩa petri Nguyễn Văn A …

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 75 BÁO CÁO 3 NGÀYLỚPNHÓM:________________________:________________________:________________________ BÀI THỰC HÀNH SỐ 3 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VI SINH VẬT Họ và tên Đĩa petri 1 Đĩa petri 2 Nguyễn Văn A Kỹ thuật trải đĩa Kỹ thuật đổ đĩa Kỹ thuật cấy ria

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 76 BÁO CÁO 4 NGÀYLỚPNHÓM:________________________:________________________:________________________ BÀI THỰC HÀNH SỐ 4 KỸ THUẬT GIEO CẤY VI SINH VẬT Họ và tên Ống nghiệm 1 Ống nghiệm 2 Nguyễn Văn A …

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 77 BÁO CÁO 5 NGÀYLỚPNHÓM:________________________:________________________:________________________ BÀI THỰC HÀNH SỐ 5 CÁC PHƯƠNG PHÁP NHUỘM MÀU VÀ QUAN SÁT HÌNH THÁI VI SINH VẬT Họ và tên Đĩa petri 1 (Chụp hình) Đĩa petri 2 (Vẽ) Nguyễn Văn A Hình thái vi khuẩn S. Cerevisiae (Nấm men) Hình thái vi khuẩn Lactobacillus (Dưa chua) Hình thái vi khuẩn S. Cerevisiae và Lactobacillus

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 78 Hình thái vi khuẩn Gram dương Hình thái vi khuẩn Gram âm Hình thái vi khuẩn hiếu khí trong bùn hoạt tính

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 79 BÁO CÁO 6 NGÀYLỚPNHÓM:________________________:________________________:________________________ BÀI THỰC HÀNH SỐ 6 TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ Họ và tên Đĩa petri 1 Đĩa petri 2 Nguyễn Văn A Kỹ thuật trải đĩa Kỹ thuật đổ đĩa

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 80 BÁO CÁO 7 NGÀYLỚPNHÓM:________________________:________________________:________________________ BÀI THỰC HÀNH SỐ 7 PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA TỔNG COLIFORM TRONG NƯỚC THẢI Họ và tên Đĩa petri 1 Đĩa petri 2 Nguyễn Văn A Phương pháp màng lọc Tổng số khuẩn lạc đếm được = Tổng số Coliforms = Phương pháp MPN Tổng số Coliforms =

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 81 BÁO CÁO 8 NGÀYLỚPNHÓM:________________________:________________________:________________________ BÀI THỰC HÀNH SỐ 8 KIỂM TRA E. COLI TRONG NƯỚC THẢI Họ và tên Đĩa petri 1 Đĩa petri 2 Nguyễn Văn A Kiểm tra Coliforms bằng ống chuông Nuôi cấy E. coli trên môi trường Endo agar Tổng số E. coli =

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 82 PHỤ LỤC 2 HƯỚNG DẪN BÁO CÁO TỔNG KẾT Dựa trên những kết quả đạt được trong quá trình thực hành, sinh viên cần báo chi tiết từng bài như sau: 1. Trang bìa. 2. Giới thiệu chung: Trình bày ngắn gọn (không quá 1/2 trang) ý nghĩa môi trường của chỉ tiêu phân tích. 3. Nguyên tắc. 4. Phương pháp phân tích; nguồn lấy mẫu cụ thể. 5. Các bước tiến hành thí nghiệm (hình ảnh thao tác cụ thể). 6. Kết quả thí nghiệm. Ghi nhận lại kết quả bằng hình ảnh. 7. Nhận xét và bàn luận kết quả thí nghiệm. Chú ý: - Viết báo cáo trên giấy A4, in 2 mặt.

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL 83 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng1.ViệtĐặng Vũ Bích Hạnh, Đặng Vũ Xuân Huyền, Đặng Thị Bích Huyền (2019). Giáo trình Thí nghiệm vi sinh vật môi trường. Nhà xuất bản Xây dựng. 2. Lê Văn Việt Mẫn, Lại Mai Hương (2006). Thí nghiệm Vi sinh vật học thực phẩm. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh. 3. Đỗ Hồng Lan Chi, Bùi Lê Thanh Khiết, Nguyễn Thị Thanh Kiều, Lâm Minh Triết (2014). Vi sinh vật môi trường. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh. Tiếng4.AnhJamie Bartram, Richard Ballance (2000). Water Quality Monitoring - A Practical Guide to the Design and Implementation of Freshwater Quality Studies and Monitoring Programmes Published on behalf of United Nations Environment Programme and the World Health Organization © 1996 UNEP/WHO ISBN 0 419 22320 7 (Hbk) 0 419 21730 4 (Pbk). 5. Ralph Mitchell, Ji Dong Gu (2010). Environmental Microbiology, Wiley Blackwell. 6. James G. Cappuccino, Chad Welsh (2017). Microbiology A Laboratory Manual, Pearson

DẠYKÈMQUYNHƠNOFFICIAL