porciSapiens Octubre 2023

Nº9 | Octubre 2023

p. 4

IDENTIFICACIÓN DE MARCADORES GENÉTICOS DE CÉLULAS LINFOCITARIAS PARA MEJORAR LA ROBUSTEZ Y RESISTENCIA A ENFERMEDADES EN CERDOS

Como hiclato de doxiciclina 577,1 mg

Tratamiento y metafilaxis de infecciones

DIGESTIVAS

EXCELENTE

PALATABILIDAD

RESPIRATORIAS

+INFO

EDITORIAL

RITMOS PORCINOS AL SON DE LOS RELOJES BIOLÓGICOS

El tiempo pasa inexorablemente para todos. Si bien, en sentido general, se trata de una magnitud física que permite medir y ordenar objetivamente una secuencia de sucesos, lo cierto es que el paso del tiempo está sujeto a la realidad subjetiva de quien lo percibe. Así, un instante puede parecer dilatarse eternamente, mientras que meses y años pasar volando, quedando reducidos a meros fotogramas para el recuerdo.

La percepción del paso del tiempo tiene un papel fundamental en la supervivencia de los organismos vivos, no solo a nivel consciente, sino a nivel celular donde entran en juego los relojes biológicos controlados por moléculas específicas que sincronizan la actividad de células en respuesta a señales procedentes del medio externo.

En este sentido, todos los seres vivos, incluidos los cerdos, se rigen por la periodicidad de los ritmos circadianos (24 h), ultradianos (<24 h) e infradianos (>24 h).

Quizá el ritmo más sonado sea el circadiano. ¿Quién no ha experimentado el desajuste fisiológico que conlleva viajar en el tiempo atravesando distintos husos horarios o, en el caso de los menos viajeros, pasar del horario de verano a invierno (o viceversa)? Y es que los cambios de horario afectan, en mayor o menor medida, a todos los organismos vivos. De hecho, tal es el impacto de la desincronización circadiana que los turnos de trabajo rotativos son considerados carcinógenos por sus efectos disruptivos sobre la fisiología celular.

Nos guste o no, las rutinas aportan paz y tranquilidad a la maquinaria celular.

Por ello, sería interesante indagar en los mecanismos moleculares implicados en la sincronización de las funciones biológicas de los cerdos y los factores relacionados con el manejo que pueden alterarlos, conduciendo en última instancia a una mayor susceptibilidad a enfermedades, pérdida de productividad, fallos inmunitarios, fallos reproductivos, etc.

Por ejemplo, sabemos que los patrones de consumo de alimento en los cerdos se caracterizan por picos puntuales a lo largo del día. Sin embargo, estos patrones pueden verse modificados por estresores externos, ocurriendo más picos durante la noche en respuesta al exceso de calor o para evitar la competencia con los compañeros de corral. Por ello, la detección de desviaciones en los patrones de consumo es ya una forma práctica y útil para ponernos en alerta cuando algo anda mal.

GRUPO DE COMUNICACIÓN AGRINEWS S.L. DISEÑO GRÁFICO & WEB Marie Pelletier Enrique Núñez Ayllón

PUBLICIDAD Laura Muñoz +34 629 42 25 52 laura@mediatarsis.com Luis Carrasco +34 605 09 05 13 lc@agrinews.es

REDACCIÓN Daniela Morales Osmayra Cabrera F.X. Mora

ADMINISTRACIÓN

Estudiar en profundidad los ritmos biológicos de los cerdos, especialmente con la irrupción de las nuevas tecnologías de ganadería de precisión, nos puede llevar un paso más allá para aprovechar mejor sus ritmos biológicos naturales, ajustando mejor nuestros manejos, planes vacunales y programas nutricionales a lo que su fisiología espera y necesita, es decir, una producción porcina en sintonía con las características biológicas de unos animales que tienen aún un enorme potencial por desarrollar.

Mercè Soler Barcelona España Tel: +34 93 115 44 15 info@agrinews.es www.porcinews.com www.porcinews.com/revista-porcisapiens/ Precio de suscripción anual: España 45 € Extranjero 120 € ISSN (Revista impresa) 2696-8142 ISSN (Revista digital) 2696-8151

Con estas reflexiones temporales ponemos en marcha el reloj y les invitamos a ir más allá y descubrir qué más tiene que ofrecer la cronobiología al sector porcino…

La dirección de la revista no se hace responsable de las opiniones de los autores. Todos los derechos reservados.

Imágenes: Noun Project/Freepik/Dreamstime/BioRender

EDITOR

DIRIGIDA A VETERINARIOS DE PORCINO Depósito Legal PorciSapiens B 7620-2021 Revista Cuatrimestral

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SUMARIO 4/15 IDENTIFICACIÓN DE MARCADORES GENÉTICOS DE CÉLULAS LINFOCITARIAS PARA MEJORAR LA ROBUSTEZ Y RESISTENCIA A ENFERMEDADES EN CERDOS Maria Ballester y Raquel Quintanilla Programa de Genética y Mejora Animal IRTA-Torre Marimon El auge de las resistencias antimicrobianas y la necesidad de desarrollar sistemas de producción más sostenibles hacen necesario reorientar los actuales esquemas de selección genética para incorporar nuevos caracteres como los relacionados con la robustez y resiliencia animal.

16/20 ESTUDIO DE PREVALENCIA DE APP EN ESPAÑA: ¿ES NECESARIO PROTEGER FRENTE A TODOS LOS SEROTIPOS? Marta Jiménez, Marcial Marcos y Rut Menjón Servicio Técnico Porcino MSD Animal Health

22/41 DETECCIÓN Y CARACTERIZACIÓN

GENÉTICA DE VIRUS ENTÉRICOS EN BROTES DE DIARREA DE EXPLOTACIONES PORCINAS EN ESPAÑA Héctor Puente1*, Héctor Arguello1, Martí Cortey2, Manuel Gómez-García1, Lucía Pérez-Pérez1, Samuel Gómez-Martínez1, Iván Díaz3 y Ana Carvajal1 Departamento de Sanidad Animal, Facultad de Veterinaria, Universidad de León 1

Departament de Sanitat i Anatomia Animals, Facultat de Veterinària, Universitat Autònoma de Barcelona 2

IRTA, Programa de Sanitat Animal, Centre de Recerca en Sanitat Animal (CReSA), Campus de la Universitat Autònoma de Barcelona 3

El objetivo de este trabajo fue estudiar la prevalencia y distribución de Astrovirus porcino, Kobuvirus porcino, Torovirus porcino, Orthoreovirus de mamíferos y Mastadenovirus porcino, y su asociación con los Coronavirus y Rotavirus en brotes de diarrea en explotaciones porcinas españolas.

2

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42/44 “TWISTPAK® ES UN AVANCE

NO 9

REVOLUCIONARIO QUE PERMITE MEZCLAR DOS VACUNAS DE BOEHRINGER INGELHEIM EN LA GRANJA EN MENOS DE 5 SEGUNDOS” Sofía Gaviria Brand Manager Swine Boehringer Ingelheim Animal Health España

46/58 VACUNAS FRENTE A LA ENFERMEDAD DE GLÄSSER

César B. Gutiérrez Martín Catedrático de Sanidad Animal Universidad de León A lo largo de este artículo revisamos los puntos más relevantes de Glaesserella parasuis y la situación actual de las vacunas desarrolladas para prevenir la enfermedad de Glässer.

59/67

SENSIBILIDAD ANTIBIÓTICA DE BRACHYSPIRA HYODYSENTERIAE, AGENTE CAUSAL DE LA DISENTERÍA PORCINA

68/88

ESTRATEGIAS DE BIOSEGURIDAD FRENTE A VIRUS PORCINOS EN LOS PIENSOS Gerald C. Shurson1, Pedro E. Urriola1 y Declan C. Schroeder2 1 Departamento de Ciencia Animal, Universidad de Minnesota 2 Departamento de Medicina Veterinaria Poblacional, Universidad de Minnesota Revisamos los conocimientos actuales sobre la idoneidad de los protocolos de bioseguridad durante la producción, procesamiento, almacenamiento y transporte de los ingredientes para piensos y piensos completos, así como los retos de determinar la inactivación y supervivencia de los virus en los ingredientes, y la eficacia de las estrategias de descontaminación vírica en las fábricas de piensos.

Lara Domínguez Estallo y Silvia del Caso Yagüe Exopol S.L. En este artículo se presentan los resultados del análisis de sensibilidad antibiótica de cepas de B. hyodysenteriae aisladas en casos clínicos de porcino en edad de cebo que cursaban con diarrea en España entre 2019 y 2023.

Agradecemos a nuestros anunciantes por hacer posible la publicación de esta revista: Boehringer Ingelheim Animal Health, MSD Animal Health, S.P. Veterinaria y Tashia.

WWW.PORCINEWS.COM/ REVISTA-PORCISAPIENS/

3

GENÉTICA

G

IDENTIFICACIÓN DE MARCADORES GENÉTICOS DE CÉLULAS LINFOCITARIAS PARA MEJORAR LA ROBUSTEZ Y RESISTENCIA A ENFERMEDADES EN CERDOS Descarga el PDF

EE Maria Ballester y Raquel Quintanilla Programa de Genética y Mejora Animal, IRTA-Torre Marimon Email: maria.ballester@irta.cat

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l contexto actual de industrialización y globalización de la producción porcina, con el movimiento de animales y productos de origen animal, facilita la aparición y propagación de patógenos endémicos y emergentes que causan importantes pérdidas económicas en el sector. Estos factores, unidos al desarrollo de las resistencias antimicrobianas y la necesidad de desarrollar sistemas de producción más sostenibles, hacen necesario reorientar los actuales esquemas de selección genética para incorporar nuevos caracteres como los relacionados con la robustez y resiliencia animal.

En este escenario, los caracteres de inmunidad se consideran parámetros relevantes para medir la inmunocompetencia (capacidad de producir una respuesta inmunitaria normal), de los animales1.

Nº 9 | Octubre 2023 Identificación de marcadores genéticos de células linfocitarias para mejorar la robustez y resistencia a enfermedades en cerdos

INMUNOLOGÍA

INMUNOCOMPETENCIA Y FACTORES DE INMUNIDAD Los caracteres de inmunidad pueden dividirse en los dos componentes principales del sistema inmunitario: Inmunidad innata o natural Inmunidad adquirida o adaptativa

INMUNIDAD INNATA La inmunidad innata está compuesta por elementos no específicos y constituye la primera línea de defensa del organismo.

Reconoce una amplia gama de patógenos a través de un conjunto restringido de receptores de reconocimiento de patrones conocidos como PRRs que se unen a moléculas PAMPs (patrones moleculares asociados a patógenos) expresadas por el patógeno.

Entre otros componentes, las células Natural Killer (células NK) o asesinas naturales, las células dendríticas, los monocitos y las células T gamma delta (células T γδ) son ejemplos de células que formaran parte de la inmunidad innata.

ALGUNAS DE ESTAS CÉLULAS, COMO LAS CÉLULAS T γδ, PUEDEN FUNCIONAR DE PUENTE ENTRE LA INMUNIDAD INNATA Y ADAPTATIVA C É L UL A S T γ δ

C É L U L AS T γδ

Las células T γδ constituyen una alta proporción de linfocitos en la sangre periférica porcina y tienen el potencial de combinar respuestas innatas y adaptativas gracias a la expresión de sus receptores TCR o genes WC1 que pueden tener una función híbrida.

Un mayor reclutamiento de células T γδ cuando los animales se vacunan a una edad temprana parece correlacionarse con una mayor eficacia vacunal (revisado en2).

Dentro de la población de células T γδ existen subpoblaciones que se distinguen por la expresión de sus genes WC1 y correlacionan con la capacidad de responder a patógenos particulares2, lo que hace de estas células un fenotipo interesante a ser estudiado a nivel genético.

5

GENÉTICA

INMUNIDAD ADAPTATIVA A diferencia de las células del sistema inmunitario innato, las células del sistema inmunitario adaptativo (células B y T) pueden proporcionar memoria inmunológica tras una respuesta inicial mediada por múltiples receptores específicos de antígenos que están presentes en patógenos.

El sistema inmunitario tiene un alto grado de variación interindividual que está controlado por factores genéticos y ambientales. No obstante, las células inmunitarias, sobre todo las adaptativas, están muy determinadas por la genética del organismo.

Estudios genéticos han estimado heredabilidades moderadas-altas para distintos tipos celulares del sistema innato (ej. células NK y T γδ) y adaptativo (ej. linfocitos T CD4+, linfocitos T CD8+ y linfocitos B) en cerdos en diferentes condiciones, lo que sugiere que estos caracteres podrían seleccionarse y obtener un progreso genético.

EN BUSCA DEL SANTO GRIAL DE LA ROBUSTEZ Y RESISTENCIA GENÉTICA A ENFERMEDADES En un estudio previo de nuestro grupo, resultado del proyecto IMMUPIGEN (AGL2016-75432-R), se estudió la arquitectura genética de un total de 30 caracteres relacionados con la salud animal en 432 animales de una línea comercial Duroc de la empresa Selección Batallé que comprendían:

Fenotipos de inmunidad Fenotipos hematológicos Fenotipos de estrés

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Los principales resultados mostraron que muchos de estos caracteres estaban determinados a nivel genético y que por tanto existe la posibilidad de seleccionar genéticamente los fenotipos de inmunidad para obtener poblaciones porcinas más robustas y resistentes a enfermedades3.

Nº 9 | Octubre 2023 Identificación de marcadores genéticos de células linfocitarias para mejorar la robustez y resistencia a enfermedades en cerdos

INMUNOLOGÍA

DETERMINACIÓN GENÉTICA DE FENOTIPOS CELULARES DE INMUNIDAD INNATA Y ADAPTATIVA Teniendo en cuenta el papel relevante que juegan los linfocitos en el control de numerosos patógenos porcinos, en el presente artículo mostraremos los resultados obtenidos sobre la determinación genética de fenotipos celulares de inmunidad innata y adaptativa, incluyendo las células T γδ debido a su doble papel en ambas inmunidades.

Para ello, se aislaron las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de un total de 391 animales sanos (machos y hembras) de 8 semanas de vida del proyecto IMMUPIGEN.

INMUNOFENOTIPADO El inmunofenotipado se realizó utilizando diferentes anticuerpos para marcar diferentes subpoblaciones de linfocitos, cuantificándose mediante citometría las siguientes subpoblaciones celulares (Figura 1):

LINFOCITOS B (CD21+) Participan en la inmunidad humoral y se encargan de producir los anticuerpos.

CÉLULAS NK (CD3- CD21- CD8+) Forman parte del sistema inmunitario innato y actúan destruyendo las células infectadas.

LINFOCITOS T (CD3+) Participan en la inmunidad mediada por células (inmunidad celular) e incluyen: Linfocitos T citotóxicos o CTL (CD3+ CD4- CD8+): reconocen y destruyen las células infectadas por patógenos.

Linfocitos T cooperadores o T helper (CD3+ CD4+ CD8-): estimulan la activación de los linfocitos B para producir anticuerpos y activan otras células mediante la secreción de citoquinas.

Linfocitos T de memoria (memory T-helper) (CD3+ CD4+ CD8+): responden de forma rápida a un antígeno tras una exposición previa.

Linfocitos T naive (CD3+ CD4- CD8-): responden a nuevos patógenos con los que el organismo no ha tenido contacto previo.

FIGURA 1

Cuantificación mediante citometría de las diferentes subpoblaciones de linfocitos.

PARA EL MARCAJE DE LAS CÉLULAS T γδ SE UTILIZÓ UN ANTICUERPO ESPECÍFICO: MAC320 7

GENÉTICA

ANÁLISIS DESCRIPTIVO DISTRIBUCIÓN Y CORRELACIÓN FENOTÍPICA

HEREDABILIDAD Y CORRELACIÓN GENÉTICA

Una vez generados los fenotipos celulares, se realizó un primer análisis descriptivo para evaluar su distribución y correlación fenotípica entre las diferentes subpoblaciones celulares.

Posteriormente se obtuvieron las estimas de heredabilidad y correlación genética.

La Tabla 1 muestra algunos estadísticos descriptivos, así como las estimas de heredabilidad de las diferentes subpoblaciones linfocitarias.

TABLA 1.

Estadísticos descriptivos y valores de heredabilidad (h2) para los caracteres de inmunidad celular.

FENOTIPO (% PBMCs*)

MEDIA

SD

CV

H2

SE

CI95

LINFOCITOS T

43,81

9,19

0,21

0,771

0,152

0,473 - 1,070

Células CTL

19,41

8,52

0,44

0,563

0,155

0,259 - 0,868

Células T de memoria

3,18

2,79

0,88

0,841

0,161

0,526 - 1,157

Células T helper

1,84

0,95

0,52

0,470

0,148

0,181 - 0,759

Células T naive

19,37

8,23

0,43

0,481

0,144

0,198 - 0,764

Células Natural Killer (NK)

14,16

6,12

0,43

0,361

0,165

0,036 - 0,685

LINFOCITOS B

21,22

7,84

0,37

0,558

0,168

0,228 - 0,887

Células T CD4+

5,02

3,25

0,65

0,725

0,159

0,413 - 1,036

Células T CD8+

22,59

9,49

0,42

0,487

0,158

0,178 - 0,796

-

-

-

0,462

0,141

0,186 - 0,738

CD4+/CD8+

*Proporciones de las diferentes subpoblaciones linfocitarias respecto a las células PBMCs.

8

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INMUNOLOGÍA

Los linfocitos T fueron la población más abundante, representando un 43,8% de los PBMCs. Entre las subpoblaciones de linfocitos T, las células CTL y naive fueron las más abundantes (~19% cada una), mientras que las células helper junto con las células de memoria representaron el 5% de los PBMCs. Los linfocitos B representaron un 21,2%, mientras que el 14,16% de los PBMCs fueron células NK.

EN CUANTO A LAS CORRELACIONES FENOTÍPICAS CABE DESTACAR QUE SE ENCONTRÓ UNA CORRELACIÓN MUY ALTA ENTRE LAS CÉLULAS T γδ Y NAIVE, LO QUE INDICARÍA QUE UN GRAN PORCENTAJE DE ESTA ÚLTIMA POBLACIÓN CORRESPONDE MAYORITARIAMENTE A CÉLULAS T γδ PARÁMETROS GENÉTICOS En cuanto al determinismo genético de estos caracteres, cabe destacar las altas heredabilidades estimadas para las células T de memoria y la abundancia relativa de las células T, estimándose heredabilidades medias-altas para el resto de fenotipos (Tabla 1). La heredabilidad más baja se estimó para la abundancia relativa de células B, resultado similar al descrito en humanos, donde se demuestra que los linfocitos B estarán más influenciados por factores ambientales4.

Estos resultados coinciden con estudios previos publicados en humanos y otras poblaciones porcinas, confirmando el papel de la genética como determinante importante en los fenotipos de inmunidad celular.

La selección de animales para producir una buena respuesta inmunitaria debe considerar ambos tipos de caracteres de inmunidad, tanto los innatos como los adaptativos, para evaluar las consecuencias/conveniencia de seleccionar ambos tipos de caracteres.

Teniendo en cuenta esta premisa, el estudio de correlaciones genéticas se llevó a cabo con todos los fenotipos de inmunidad analizados en la población IMMUPIGEN: fenotipos de inmunidad innata, inmunidad adaptativa y parámetros hematológicos.

9

GENÉTICA

ESTUDIO DE CORRELACIONES GENÉTICAS DE FENOTIPOS DE INMUNIDAD INNATA, INMUNIDAD ADAPTATIVA Y PARÁMETROS HEMATOLÓGICOS El mapa de interacciones genéticas mostró correlaciones positivas y negativas entre los diferentes fenotipos de inmunidad.

CORRELACIONES POSITIVAS

CORRELACIONES NEGATIVAS

La proporción de células T helper y T de memoria se correlacionaron de forma positiva.

Las células B mostraron una correlación negativa con las diferentes subpoblaciones linfocitarias, particularmente con el porcentaje de células T, y la capacidad de fagocitosis.

La abundancia relativa de las células T citotóxicas se correlacionó positivamente con los fenotipos hematológicos, en particular los contajes de leucocitos y hematocrito.

Las subpoblaciones de células T citotóxicas y T de memoria mostraron una correlación negativa con las concentraciones de inmunoglobulinas en suero.

Células T Células T

Células T

de memoria

helper

Células B

Fagocitosis

Hematocrito Células T citotóxicas Leucocitos

10

Células T citotóxicas

Células T de memoria

Inmunoglobulinas en suero

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INMUNOLOGÍA

En la Figura 2 se muestran las correlaciones genéticas entre varios caracteres de inmunidad.

Cabe destacar la falta de interacción de las diferentes subpoblaciones linfocitarias con la concentración de proteínas de fase aguda (proteína C reactiva y haptoglobina) en sangre, permitiendo la selección independiente de este tipo de caracteres.

Conteo

25

Clave de color e Histograma

15 5 0 -1 -0,5 0 0,5 1 Valor

Células T

Células T de memoria

Células CTL

Células T naïve

Células NK

Células T helper

Células B

Células T Células T de memoria VCM (Volumen Corpuscular Medio) HCM (Hemoglobina Corpuscular Media) Células T helper Células CTL Monocitos Linfocitos Leucocitos HTCR Haptoglobina CRP (Proteína C Reactiva) Células T naïve Células T γδ Eosinófilos Eritrocitos Plaquetas IgA IgG Células B

FIGURA 2

Mapa de color de correlaciones genéticas estimadas por combinación de pares entre los fenotipos de inmunidad.

El mapa de interacción genético entre los diferentes fenotipos de inmunidad sustenta la posibilidad de aplicar una selección multicarácter para los fenotipos de inmunidad innata y adaptativa.

En este escenario, la posibilidad de identificar genes candidatos, marcadores genéticos y/o biomarcadores asociados a la variación fenotípica de estos caracteres adquiere una mayor relevancia al permitir una selección genética más directa para algunos de estos fenotipos.

11

GENÉTICA

IDENTIFICACIÓN DE REGIONES GENÓMICAS Y GENES CANDIDATOS ASOCIADOS A LA VARIACIÓN DE LAS POBLACIONES LINFOCITARIAS EN SANGRE Con el fin de identificar regiones del genoma que pudiesen estar asociadas a la variación de los fenotipos linfocitarios, se llevó a cabo el genotipado de todos los animales con el chip comercial GGP Porcine HD Array de Illumina.

El análisis de asociación del genoma completo (GWAS) se realizó con 42.641 polimorfismos de nucleótido único (SNPs) distribuidos a lo largo de todo el genoma porcino y los 10 fenotipos de inmunidad celular.

El estudio de asociación identificó un total de 32 SNPs significativos asociados a nivel genómico con las cantidades relativas de células T helper, T memoria y T naive/γδ.

Estas regiones se identificaron en los cromosomas porcinos SSC3, SSC5, SSC8 y SSCX (Tabla 2).

TABLA 2.

Descripción de las regiones cromosómicas asociadas con los caracteres linfocitarios.

CHR

3

55,60

FINAL (MBP)

58,34

N SNPs

TOP SNPs

14

rs81340900, rs81293514, rs81336780

MAF

0,49

p-valor

2,18E-06

FDR

CARÁCTER

GENES CANDIDATOS

3,10E-02

Células T helper (% de PBMCs)

CD8A, CD8B, CHMP3, GNLY, IGKV, RMND5A, SMYD1, ZAP70 AICDA, CD4, CD69, CD163, MFAP5, PHC1, STYK1, TAS2Rs, KLRs, C-type lectins

RBPJ, STIM2

5

61,62

62,44

10

rs326461238

0,26

1,18E-05

8,70E-02

Células T de memoria (% de PBMCs) CD4+ T cells

8

20,51

20,57

2

rs81406759, rs81406807

0,40

3,45E-05

9,80E-02

Células T helper (% de PBMCs)

X

12

INICIO (MBP)

33,36

33,63

6

rs342772739

0,13

1,18E-06

1,20E-02

Células T naive (% of PBMCs)

CYBB, sscmir-9786-1

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INMUNOLOGÍA

En estas regiones genómicas se anotaron una serie de genes candidatos relacionados con funciones de inmunidad:

SSCX El gen CYBB codifica para un componente del sistema microbicida oxidasa expresado por neutrófilos y células T, y desempeña un papel esencial contra infecciones bacterianas y fúngicas.

SSC8 El gen RBPJ codifica un factor de transcripción que actúa a través de la vía de señalización NOTCH para proteger a las células T helper de la apoptosis.

32 SNPs Y 10 GENES CANDIDATOS IDENTIFICADOS EN 4 CROMOSOMAS Gen CYBB

Genes CD8A y CD8B

Neutrófilos y células T

SSC3 Los genes CD8A y CD8B codifican para proteínas de membrana que sirven de co-receptores durante el reconocimiento de antígenos por los receptores TCR de los linfocitos.

Actividad microbicida oxidasa frente a infecciones bacterianas y fúngicas

Linfocitos Reconocimiento de antígenos

Gen GNLY Células T citotóxicas y células NK Secreción antimicrobiana

El gen GNLY codifica una proteína de secreción antimicrobiana presente en células T citotóxicas y células NK.

SSC5 El gen CD4, principal marcador de membrana de algunas células T, sirve también como co-receptor para el receptor TCR. El marcador de activación CD69, expresado en células T de memoria residentes y células T γδ.

Los genes CLECL1, KLRC1 y KLRD1, altamente expresados en las células T de memoria y están involucrados en su activación y función de destrucción.

Gen CD4 Células T

Gen RBPJ

Marcador de membrana y

Células T

co-receptor de receptor TCR

helper

Marcador de activación CD69

Señalización NOTCH frente a la apoptosis

Células T de memoria residentes y células T γδ

Genes CLECL1, KLRC1 y KLRD1 Células T de memoria Funciones de activación y destrucción

13

GENÉTICA

Un resultado destacable de nuestro estudio fue el nivel de solapamiento entre nuestros resultados y estudios previos descritos en humanos y en otras poblaciones porcinas, identificándose las mismas regiones genómicas y genes candidatos para algunos de los caracteres analizados (Figura 3).

COMPARACIÓN CON OTROS ESTUDIOS GWAS EN CERDOS Y HUMANOS

-log 10 (p-valor)

Células T helper (% de PBMCs)

Proliferación de CD4+; CD4+CD8dim AC (Orrù et al., 2013; Lagou et al., 2018; Orrù et al., 2020)

6 4 2

Porcentaje de leucocitos CD8+; CD8-; CD3-CD8- (Zhang et al., 2016)

0 1

2

3

4 5

6

7

8

9 10 11 12 13

14

15 16 17 18 X

Cromosoma

-log 10 (p-valor)

Células T de memoria (% de PBMCs) 6 4

Porcentaje de leucocitos CD4+CD8+ (Lu et al., 2012) CD4+CD8+; Células T memoria efectoras CD4+ % células T (AguirreGamboa et al., 2016; Orrù et al., 2020)

2 0 1

2

3

4 5

6

7

8

9 10 11 12 13

14

15 16 17 18 X

Cromosoma

-log 10 (p-valor)

Células T naive (% de PBMCs) 6 4 2 0 1

2

3

4 5

6

7

8

9 10 11 12 13

14

15 16 17 18 X

Cromosoma

FIGURA 3

Solapamiento entre las regiones genómicas y genes candidatos de nuestro estudio con estudios previos descritos en humanos y en porcino5-9.

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INMUNOLOGÍA

CONCLUSIONES LOS RESULTADOS OBTENIDOS CONFIRMAN EL CONTROL GENÉTICO DE LOS CARACTERES DE INMUNIDAD CELULAR EN CERDOS Las correlaciones genéticas entre los diferentes fenotipos de inmunidad innata y adaptativa y los marcadores genéticos identificados para las células T helper, T de memoria y T γδ avalan la posibilidad de aplicar una selección multicarácter efectiva para ambos tipos de inmunidades.

Asimismo, nuestros resultados avalan la posibilidad de seleccionar animales con distintos porcentajes de células T γδ en sangre periférica con el fin de explorar y optimizar la respuesta a diferentes vacunas.

Por último, el solapamiento de genes para los mismos fenotipos en humanos potencia aún más el biomodelo porcino para el estudio de enfermedades infecciosas y el desarrollo de vacunas en humanos.

Artículo adaptado de: Ballester, M. et al. Genetic architecture of innate and adaptive immune cells in pigs. Frontiers in Immunology, 14:1058346 (2023). doi: 10.3389/fimmu.2023.1058346.

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4. Aguirre-Gamboa R, Joosten I, Urbano PCM, van der Molen RG, van Rijssen E, van Cranenbroek B, et al. Differential effects of environmental and genetic factors on T and b cell immune traits. Cell Rep (2016) 17:2474–87. doi: 10.1016/j.celrep.2016.10.053

7. Zhang J, Chen JH, Liu XD, Wang HY, Liu XL, Li XY, et al.

Genomewide association studies for hematological traits and T lymphocyte subpopulations in a duroc × erhualian F2 resource population. J Anim Sci (2016) 94:5028–41. doi: 10.2527/jas.2016-0924

5. Orrù V, Steri M, Sole G, Sidore C, Virdis F, Dei M, et al. Genetic variants regulating immune cell levels in health and disease. Cell (2013) 155:242. doi: 10.1016/ J.CELL.2013.08.041

8. Orrù V, Steri M, Sidore C, Marongiu M, Serra V, Olla S, et al. Complex genetic signatures in immune cells underlie autoimmunity and inform therapy. Nat Genet (2020) 52:1036–45. doi: 10.1038/s41588-020-0684-4

6. Lagou V, Garcia-Perez JE, Smets I, Van Horebeek L, Vandebergh M, Chen L, et al. Genetic architecture of adaptive immune system identifies key immune regulators. Cell Rep (2018) 25:798–810.e6. doi: 10.1016/J. CELREP.2018.09.048

9. Aguirre-Gamboa R, Joosten I, Urbano PCM, van der Molen RG, van Rijssen E, van Cranenbroek B, et al. Differential effects of environmental and genetic factors on T and b cell immune traits. Cell Rep (2016) 17:2474–87. doi: 10.1016/j.celrep.2016.10.053

15

EPIDEMIOLOGÍA

E

ESTUDIO DE PREVALENCIA DE APP EN ESPAÑA: ¿ES NECESARIO PROTEGER FRENTE A TODOS LOS SEROTIPOS?

LL

Descarga el PDF a pleuroneumonía porcina es una enfermedad ampliamente extendida a nivel mundial, cuyo agente causal es Actinobacillus pleuropneumoniae (App).

Si bien es cierto que se trata de una enfermedad con la que convivimos en el sector porcino desde hace décadas, desde hace unos cuantos años se ha experimentado un aumento de su prevalencia en nuestro país.

Marta Jiménez, Marcial Marcos y Rut Menjón Servicio Técnico Porcino MSD Animal Health

16

Nº 9 | Octubre 2023

Estudio de prevalencia de App en España: ¿es necesario proteger frente a todos los serotipos?

PATOLOGÍA

EL AUGE DE LA PLEURONEUMONÍA PORCINA La causa o causas concretas del aumento de la prevalencia de pleuroneumonía porcina se desconocen, aunque se especula con algunas de las siguientes razones o una combinación de todas ellas: La entrada de nuevos serotipos de mayor patogenicidad procedentes de otras zonas geográficas.

Las políticas de reducción de uso de antibióticos.

El aumento de la edad de destete.

El aumento de la edad de sacrificio.

La enfermedad puede manifestarse mediante tres presentaciones clínicas: aguda, crónica y subclínica.

FORMA AGUDA

FORMA CRÓNICA

FORMA SUBCLÍNICA

La forma aguda es, sin duda, la más llamativa y la que genera mayores pérdidas económicas.

No debe subestimarse la importancia de la presentación crónica de la enfermedad que, aunque no se caracterice por los episodios de muertes súbitas que definen a la presentación aguda, genera retraso en el crecimiento de los animales y necesidad de uso de antibióticos para su control.

Incluso en el caso de la presentación subclínica, no debe bajarse la guardia, pues potencialmente, y en función del serotipo involucrado, cambios en el manejo, ambiente o la aparición de otras patologías, pueden desencadenar la aparición de clínica aguda en una granja con la forma subclínica hasta ese momento.

La presencia de mayor o menor afectación clínica de los animales infectados depende de varios factores.

LA PATOGENICIDAD DEL SEROTIPO Y CEPA INVOLUCRADOS, AUNQUE NO ES EL ÚNICO FACTOR, ES UNO DE LOS MÁS RELEVANTES

17

EPIDEMIOLOGÍA

CEPAS

SEROTIPOS

En general, hay cepas poco patógenas que no generan mayor problemática y cepas más patógenas que pueden generar las diferentes presentaciones de la enfermedad, viéndose agravadas o potenciadas por factores como:

Actualmente se conocen 20 serotipos (el 17 y 18 de reciente descripción) y su prevalencia y patogenicidad difiere significativamente entre países.

El manejo.

La densidad.

Condiciones ambientales desfavorables.

Presencia de otras patologías.

¿QUÉ SABEMOS SOBRE LA PREVALENCIA DE ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE? En España existen varios estudios de prevalencia de los diferentes serotipos. En concreto, en el pasado European Symposium of Porcine Health and Management, que tuvo lugar en Tesalónica, se presentó un estudio actualizado sobre los serotipos aislados en casos clínicos agudos, cuyos resultados se muestran a continuación.

EL ESTUDIO REVELA QUE EN ESPAÑA PODEMOS ENCONTRAR LA GRAN MAYORÍA DE SEROTIPOS VINCULADOS A CASOS CLÍNICOS DE CAMPO Estos resultados nos deben hacer reflexionar sobre algunas creencias previas referentes a la teórica “apatogenicidad” de algunos serotipos, pues como se ha demostrado, la mayoría de serotipos pueden ser potencialmente patógenos, aunque algunos lo sean con más frecuencia que otros.

Es importante recordar que la mayoría de las granjas convencionales están infectadas por uno o varios serotipos de App y, aunque muchas de ellas pueden ser cepas de baja virulencia, también podemos encontrar cepas de alta virulencia conviviendo en la misma explotación, incluso en el mismo animal.

Por tanto, y con respecto a su control, es necesario tener en cuenta estos datos a la hora de decidir qué estrategia de prevención es la más adecuada y eficaz para un control exitoso de la enfermedad.

18

Nº 9 | Octubre 2023

Estudio de prevalencia de App en España: ¿es necesario proteger frente a todos los serotipos?

PATOLOGÍA

ACTUALIZACIÓN SOBRE LOS SEROTIPOS DE ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE ENCONTRADOS EN ESPAÑA ESPHM 2023. M. Jiménez, R. Menjón y M. Marcos El objetivo de este estudio fue el actualizar e incrementar la información disponible sobre los serotipos de App involucrados en casos clínicos en España, así como evaluar su posible evolución temporal.

MATERIALES Y MÉTODOS Un total de 210 aislados de App provenientes de casos clínicos retrospectivos desde enero de 2017 hasta octubre de 2022 se analizaron en 5 laboratorios de diagnóstico diferentes, ubicados en diferentes áreas geográficas del país. De todos ellos, se tipificaron 168, la mayoría mediante una PCR específica de serotipo. Se estudió: La estacionalidad de los casos.

Los serotipos más prevalentes.

La evolución temporal de los casos.

RESULTADOS No se observó una clara correlación entre los casos de App y la estación del año, tal y como se observa en el Gráfica 1.

10 8 6 4 2 OCT - 22

JUL - 22

ABR - 22

ENE - 22

JUL - 21

OCT - 21

ENE - 21

ABR - 21

OCT - 20

JUL - 20

ABR - 20

ENE - 20

JUL - 19

OCT - 19

ENE - 19

ABR - 19

OCT - 18

JUL - 18

ABR - 18

ENE -18

OCT - 17

JUL - 17

ENE - 17

0 ABR - 17

Nº casos positivos

12

GRÁFICA 1

Número de casos positivos de App por mes aislados en España en el periodo de enero 2017 a octubre 2022.

19

EPIDEMIOLOGÍA

Los serotipos más frecuentemente encontrados fueron (Gráfica 2): Serotipo 2 (16%) Serotipo 1/9/11 o 9/11 (14%) Serotipo 4 (14%) Serotipo 10 (14%)

El serotipo 2 fue el más prevalente en 2018, 2019 y 2022.

El serotipo 9/11 fue el más prevalente en 2017 y 2021.

En 2020 los serotipos 2 y 9/11 se encontraron en la misma proporción.

Excepto en el caso del serotipo 10, que se encontró solo en un área específica de Cataluña, el resto de serotipos se encontraron sin distinción por todo el país.

Los serotipos menos prevalentes fueron el 3, 6 y 18, encontrados solo en 2, 2 y 1 caso clínico, respectivamente. Estos resultados difieren de los observados en estudios previos, en los que los serotipos 6 y 18 no se habían encontrado con anterioridad.

LOS ÚNICOS SEROTIPOS NO ENCONTRADOS EN EL ACTUAL ESTUDIO FUERON EL 1, 12, 14, 15 Y 16, COINCIDIENDO CON RESULTADOS PREVIOS Serotipo 18 1%

No tipificable 13%

Serotipo 1/9/11 o 9/11 14%

Serotipo 17 4% Serotipo 13 6%

Serotipo 2 16%

Serotipo 11 5%

Serotipo 3 1%

Serotipo 10 14% Serotipo 8 3% Serotipo 7 2%

Serotipo 5 6% Serotipo 6 1%

Serotipo 4 14%

GRÁFICA 2

Prevalencia de los diferentes serotipos de App aislados en España en el periodo de enero 2017 a octubre 2022.

CONCLUSIÓN Los resultados de este estudio retrospectivo indican que en España pueden encontrarse la mayoría de serotipos de App relacionados con casos clínicos de campo.

Estos resultados difieren de los obtenidos en otros países en los que los serotipos 3 y 10 son raramente encontrados, y el serotipo 4 no suele relacionarse con casos clínicos.

20

Nº 9 | Octubre 2023

Estudio de prevalencia de App en España: ¿es necesario proteger frente a todos los serotipos?

Que no te cuenten cuentos La protección universal frente a App es una realidad.

Porcilis APP

Vacuna C

PORCILIS® APP Vacuna N

Única vacuna registrada en España frente a todos los serotipos conocidos de Actinobacillus pleuropneumoniae

PORCILIS® APP SUSPENSIÓN INYECTABLE PARA PORCINO. COMPOSICIÓN POR DOSIS: Sustancias activas: Toxoide ApxI de Actinobacillus pleuropneumoniae, serotipo 10, cepa App HV169 ≥500 DEC80*; toxoide ApxII de Actinobacillus pleuropneumoniae, serotipos 2 y 7, cepas App2 y App HV143 respectivamente ≥500 DEC80*; toxoide ApxIII de Actinobacillus pleuropneumoniae, serotipo 2, cepa App2 ≥10.000 DEC80*; OMP** de Actinobacillus pleuropneumoniae, serotipo 1, cepa App 1-L-452 ≥10.000 DEC80*. Adyuvante: Acetato de dl-α-tocoferilo 150 mg. Excipiente: Formaldehído (conservante) 1,08 mg. * DEC80: Dosis efectiva en el 80% de los conejos (al menos 4 de 5 conejos vacunados con la dosis diluida 1/500 o 1/10.000 seroconvierten). **OMP: Proteína de membrana externa. INDICACIONES Y ESPECIES DE DESTINO: Porcino (lechones destetados).

Para la inmunización activa de lechones destetados, para reducir la mortalidad, signos clínicos y lesiones de la pleuroneumonía causada por todos los serotipos conocidos de Actinobacillus pleuropneumoniae (demostrada mediante desafío frente a los serotipos 1, 2 y 7 en cerdos). Inicio de la inmunidad: 2 semanas después de la administración de la segunda dosis. Duración de la inmunidad: Al menos 11 semanas después de la administración de la segunda dosis. CONTRAINDICACIONES: Ninguna. PRECAUCIONES: Precauciones especiales para su uso en animales: Vacunar solamente animales sanos. debe tomar la persona que administre el medicamento veterinario a los animales: En caso de autoinyección accidental, consulte con un médico inmediatamente y muéstrele el prospecto o la etiqueta. Conservar en nevera (entre 2 °C y 8 °C). Proteger de la luz. No congelar. Período de validez después de abierto el envase primario: 10 horas. TIEMPO DE ESPERA: Cero días. Uso veterinario – medicamento sujeto a prescripción veterinaria. Administración bajo control o supervisión del veterinario. Instrucciones completas en el prospecto. Mantener fuera de la vista y el alcance de los niños. En caso de duda, consulte a su veterinario.

Reg. Nº: 3275 ESP. Merck Sharp & Dohme Animal Health, S.L. Ficha técnica actualizada a 21 de abril de 2022.

VIROLOGÍA

V

DETECCIÓN Y CARACTERIZACIÓN GENÉTICA DE VIRUS ENTÉRICOS EN BROTES DE DIARREA DE EXPLOTACIONES PORCINAS EN ESPAÑA

EE

Descarga el PDF l objetivo de este trabajo fue estudiar la prevalencia y distribución de Astrovirus porcino (PAstV), Kobuvirus porcino (PKoV), Torovirus porcino (PToV), Orthoreovirus de mamíferos (MRV) y Mastadenovirus porcino (PAdV), así como su asociación con virus ampliamente reconocidos como causantes de diarrea en porcino como coronavirus (CoV) y rotavirus (RV) en brotes de diarrea en explotaciones porcinas españolas.

Además, se caracterizó genéticamente una selección de las cepas virales.

Héctor Puente1*, Héctor Arguello1, Martí Cortey 3, Manuel Gómez-García1, Lucía Pérez-Pérez1, Samuel Gómez-Martínez1, Iván Díaz3 y Ana Carvajal1 1 Departamento de Sanidad Animal, Facultad de Veterinaria, Universidad de León.

2 Departament de Sanitat i Anatomia Animals, Facultat de Veterinària, Universitat Autònoma de Barcelona.

3 IRTA, Programa de Sanitat Animal, Centre de Recerca en Sanitat Animal (CReSA), Campus de la Universitat Autònoma de Barcelona. *E-mail: hpuef@unileon.es Tlf: 987 291 306

22

Nº 9 | Octubre 2023

Detección y caracterización genética de virus entéricos en brotes de diarrea de explotaciones porcinas en España

EPIDEMIOLOGÍA

VIRUS ENTÉRICOS PORCINOS LOS SOSPECHOSOS HABITUALES Las enfermedades entéricas causadas por virus son muy prevalentes y tienen un impacto negativo en la producción porcina1.

Los Coronavirus (CoV) y los Rotavirus (RV) son los virus más comunes y reconocidos como responsables de la diarrea en cerdos2-4 (Tabla 1).

ROTAVIRUS Entre los RV, Rotavirus A (RVA) y Rotavirus C (RVC) son las especies más relevantes3 y están implicados principalmente en brotes de diarrea en lechones lactantes y destetados, aunque pueden detectarse en todas las fases de la producción porcina3.

CORONAVIRUS Entre los CoV, el Virus de la gastroenteritis transmisible (VGET) y el Virus de la diarrea epidémica porcina (VDEP), dos Alphacoronavirus, han arrasado las granjas de todo el mundo desde su aparición en el siglo pasado5,6.

Más recientemente, un virus recombinante entre el VGET y el VDEP, conocido como Coronavirus entérico porcino (SeCoV), ha sido identificado en granjas porcinas europeas7-10, causando una enfermedad diarreica idéntica a la causada por el VGET y el VDEP3,11.

Asimismo, otros dos CoV porcinos, el Deltacoronavirus porcino (PDCoV)12 y el Coronavirus del síndrome de diarrea aguda porcina (SADS-CoV)13,14, un Alphacoronavirus, también se han descrito como causa de brotes de diarrea, aunque nunca se han detectado en explotaciones porcinas europeas.

OTROS VIRUS ENTÉRICOS Además de estos agentes infecciosos, en granjas porcinas se han detectado otros virus entéricos (Tabla 1) en cerdos con diarrea en todo el mundo, aunque su papel etiológico sigue sin estar claro: Astrovirus porcino (PAstV)15-20 Kobuvirus porcino (PKoV)16,21-24 Torovirus porcino (PToV)25-29 Orthoreovirus de los mamíferos (MRV)30-34 Mastadenovirus porcino (PAdV)1,35-37

Estos virus se identifican frecuentemente en coinfecciones con CoV y RV4,38-45, pero también se detectan habitualmente en animales sanos39,46-50.

La enteropatogenicidad de PAstV, MRV y PAdV se ha demostrado en lechones convencionales infectados experimentalmente51-55, pero no conocemos la existencia de desafíos experimentales con PKoV o PToV.

23

VIROLOGÍA

Virus

Género

Familia

Envoltura

Estructura del genoma

Tamaño del genoma (Kb)

Identificación en muestras porcinas

Virus entéricos reconocidos como agentes etiológicos de brotes de diarrea en explotaciones porcinas VDEP

Alphacoronavirus

Coronaviridae

Sí

ARN de cadena sencilla (+)

28 - 30

2, 58, 72

VGET

Alphacoronavirus

Coronaviridae

Sí

ARN de cadena sencilla (+)

28 - 30

72–74

SeCoV

Alphacoronavirus

Coronaviridae

Sí

ARN de cadena sencilla (+)

28 - 30

7–10

PDCoV

Deltacoronavirus

Coronaviridae

Sí

ARN de cadena sencilla (+)

28 – 30

12, 75, 76

SADS

Alphacoronavirus

Coronaviridae

Sí

ARN de cadena sencilla (+)

28 - 30

13, 14, 77–79

RVA

Rotavirus

Sedoreoviridae

No

ARN de cadena doble segmentada (11)

18 - 19

3, 80, 81

RVC

Rotavirus

Sedoreoviridae

No

ARN de cadena doble segmentada (11)

18 - 19

3, 80, 82

Virus entéricos cuyo papel en la etiología de brotes de diarrea en explotaciones porcinas no está claramente establecido PAstV

Astrovirus

Astroviridae

No

ARN de cadena sencilla (+)

6,4 - 7,3

15–20

PKoV

Kobuvirus

Picornaviridae

No

ARN de cadena sencilla (+)

8,2 - 8,3

16, 21–24

PToV

Torovirus

Tobaniviridae

Sí

ARN de cadena sencilla (+)

25 - 30

25–29

MRV

Orthoreovirus

Spinareoviridae

No

ARN de cadena doble segmentada (10)

23 - 24

31–34, 83

PAdV

Mastadenovirus

Adenoviridae

No

ADN de cadena doble lineal

32 - 34

1,35–37

MRV: Orthoreovirus de los mamíferos, PAdV: Mastadenovirus porcino, PAstV: Astrovirus porcino, VDEP: Virus de la diarrea epidémica porcina, PDCoV: Deltacoronavirus porcino, PKoV: Kobuvirus porcino, PToV: Torovirus porcino, RVA: Rotavirus A, RVC: Rotavirus C, SADS: Síndrome diarreico agudo porcino coronavirus, SeCoV: Coronavirus entérico porcino, VGET: Virus de la gastroenteritis transmisible.

TABLA 1

Principales características de los virus entéricos porcinos investigados clasificados en función de su relevancia clínica.

VIRUS ENTÉRICOS PORCINOS EN ESPAÑA Los objetivos de este trabajo fueron:

1 2 3

Estudiar la prevalencia y distribución de los virus entéricos PAstV, PKoV, PToV, MRV y PAdV en brotes de diarrea en explotaciones porcinas de España.

Identificar su asociación con virus ampliamente reconocidos como causantes de diarrea, como CoV y RV. Caracterizar una selección de las cepas virales obtenidas para investigar sus relaciones filogenéticas.

En conjunto, los resultados obtenidos aportan información sobre la etiología de las enfermedades entéricas en porcino que puede ser utilizada para diseñar e implementar estrategias de diagnóstico y control adecuadas.

24

Nº 9 | Octubre 2023

Detección y caracterización genética de virus entéricos en brotes de diarrea de explotaciones porcinas en España

EPIDEMIOLOGÍA

MATERIAL Y MÉTODOS R E CYOGID Y EP SR OC MIE L A SM MUE AS R E C O G I DA P R AO C A ME ISEAN TON TDOE DE L AS U E SSTTRRAS El estudio se llevó a cabo entre enero de 2017 y octubre de 2020 en 206 explotaciones porcinas españolas con brotes de diarrea que afectaban a: Lechones lactantes (<21 días): 66 explotaciones Lechones de postdestete o en transición (21-70 días): 64 explotaciones Cerdos de engorde (>70 días): 76 explotaciones De cada granja se recibieron 2-6 muestras de heces individuales y el veterinario responsable de la explotación clasificó el brote, en función de criterios clínicos como la velocidad de progresión de la enfermedad o la respuesta a los antimicrobianos, como: Sin sospecha de etiología viral Con sospecha de etiología viral Las muestras individuales se mezclaron para preparar una muestra conjunta de heces por granja que se diluyó 1:2 (v/v) en solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS), se homogeneizó en vórtex y se clarificó mediante centrifugación.

El ácido nucleico se extrajo a partir de 140 µl del sobrenadante y utilizando un kit comercial (QIAMP Viral RNA and DNA Mini Kit, QIAGEN), siguiendo las instrucciones del fabricante. Tras la extracción se almacenó a -80 °C hasta su uso.

TEM C CIÓ ULDAER VDEI RVUIRSUESNETNÉT ÉRRI C ICOO SS D E T E C C IDE ÓN O LNE MOL C U LEACR ORCCINO S P OPR INOS Se llevaron a cabo cuatro PCRs de transcripción reversa o RT-PCR múltiplex utilizando el kit Verso 1-Step RT-PCR ReddyMix (Thermo Scientific) para la detección de: VDEP VGET SeCoV (detección simultánea del gen S del VDEP y del gen N del VGET) RVA RVC PToV PAstV PKoV

Las reacciones se llevaron a cabo en las siguientes condiciones: 50 oC durante 30 min, 95 oC durante 2 min, 45 ciclos a 95 oC durante 20 s, 50 oC durante 30 s y 72 oC durante 1 min y 30 s, seguidos de un paso final de extensión a 72 oC durante 10 min.

Los productos de la RT-PCR se visualizaron en un gel de agarosa al 1,5% con RedSafe Nucleic Acid Staining Solution (iNtRON Biotechnology, Inc.) y se compararon con las longitudes esperadas para los fragmentos.

MRV PAdV

25

VIROLOGÍA

UE NCI F ILGOGE O S E C U E NSCE ICAC I Ó NA CIÓN Y A NYÁ ALNI SÁILSI SFI SI LO E N NÉ É TTI IC CO Se seleccionaron 14 muestras para su secuenciación en función de los resultados de la RT-PCR (muestras con el mayor número de virus diferentes detectados).

De cada una de ellas se extrajo el ARN total empleando TRIzol LS (Thermo Scientific) y se llevó a cabo la secuenciación en el Servicio de Genómica y Bioinformática (SGB) de la Universidad Autónoma de Barcelona (UAB), sin utilizar ningún cebador ni paso de amplificación previo, en la plataforma Illumina Miseq.

Finalmente, las secuencias obtenidas fueron alineadas y comparadas filogenéticamente con otras secuencias completas disponibles en la plataforma GenBank.

Las relaciones filogenéticas entre secuencias se analizaron con el programa informático MEGA1171, mediante el algoritmo de NeighborJoining (NJ), utilizando el modelo de máxima verosimilitud compuesta y 10.000 réplicas bootstrap para estimar la confianza de las ramas internas de los árboles.

S TA O A N ÁALNIÁSLI ISS IESSETA D ÍDÍSSTTI IC CO Los análisis estadísticos de los datos se realizaron mediante las pruebas exacta y ANOVA de Fisher utilizando Epi InfoTM para un nivel de confianza del 95%.

RESULTADOS VACLI EANCI A IYS TDIRSITBRUIBUCIÓN L O SS P R E VAPLREEN YD C I Ó N DDE E LO DI S T IN T O S V IR U S E N T É R IC O S P OR CINO S E N L O SS D I S T I N TO S V I R U S E N T É R I C O S P O R C I N O S E N LO BR O T E S DE DI A R R E A E N E S PA A B R OT E S D E D I A R R E A E N E S PA ÑÑ A

Se detectó al menos uno de los virus entéricos investigados en 160 de los 206 brotes investigados (77,7%).

PAstV fue el virus más frecuentemente detectado (48,5%; n = 100), seguido de PKoV (27,2%; n = 56), VDEP (19,9%; n = 41), PAdV (14,1%; n = 29), RVA (13,6%; n = 28), PToV (11,2%; n = 23), RVC (6,3%; n = 13) y MRV (4,4 %; n = 9).

NO SE DETECTARON EN NINGUNA DE LAS EXPLOTACIONES INVESTIGADAS EL VGET NI EL SeCoV 26

Nº 9 | Octubre 2023

Detección y caracterización genética de virus entéricos en brotes de diarrea de explotaciones porcinas en España

EPIDEMIOLOGÍA

La prevalencia de brotes de diarrea positivos (un resultado positivo para al menos uno de los virus analizados) fue similar (p = 0,787) entre los periodos de lactación (75,8%, 50 de 66), postdestete-transición (76,6%, 49 de 64) y engorde (80,3%, 61 de 76). Sin embargo, se observaron diferentes patrones de distribución por edades para cada uno de los virus investigados (Figura 1).

La detección de PAstV y RVA fue significativamente menor en los brotes de diarrea en lactación en comparación con los brotes de postdestete-transición (p < 0,001 y p = 0,025, respectivamente) y de engorde (p < 0,001 y p = 0,036, respectivamente).

En cambio, los PKoV fueron más prevalentes en lactación y postdestete que en el engorde (p < 0,001), mientras que los RVC solo se detectaron en los brotes de diarrea que afectaron a lechones lactantes.

PToV y PAdV se detectaron con mayor frecuencia en los brotes de engorde que en los de lactación (p = 0,016 y p = 0,005, respectivamente) y se observó una tendencia similar para VDEP y MRV, aunque sin significación estadística.

80 70

73,4 (47/64)

57,9 (44/76)

60

48,5 (32/66)

50 40

34,4 (22/64)

2,6 (2/76)

30 20

22,4 (17/76)

17,1 (13/76)

13,6 (9/66)

10,9 (7/64) 4,5 (3/66)

10 0 Astrovirus porcino

Lactación

Kobuvirus porcino

Torovirus porcino

Postdestete

Cebo

12,5 (8/64) 7,9 (6/76) 3,0 1,6 (4/66) (1/64)

6,1 (4/66)

Orthoreovirus de los mamíferos

Mastadenovirus porcino

26,3 (20/76) 17,2 15,2 (12/64) (10/66)

18,8 (12/64) 15,8 (12/76)

19,7 (13/66)

6,1 (4/66) 0,0 0,0

Virus de la diarrea epidémica porcina

Rotavirus A

Rotavirus C

FIGURA 1

Prevalencia de los virus entéricos investigados en brotes de diarrea según la edad de los animales. De los 206 brotes de diarrea investigados, 66 afectaron a lechones lactantes (<21 días), 64 a lechones postdestete-transición (21-70 días) y 76 a cerdos de cebo o engorde (>70 días).

LA MAYORÍA DE LOS BROTES INVESTIGADOS (50,0%; 103 DE 206) SE PRODUJERON DURANTE EL PRIMER TRIMESTRE EN COMPARACIÓN CON EL RESTO DEL AÑO (P < 0,001) 27

VIROLOGÍA

La distribución estacional fue clara para el VDEP que se detectó con mayor frecuencia durante el invierno (de enero a marzo) (p = 0,011), pero no se observó para ninguno de los otros virus entéricos investigados (Figura 2).

Prevalencia de detección viral entre enero de 2017 y diciembre de 2019: variación estacional Astrovirus porcino

90%

60%

70%

50%

60% 50%

40%

40%

30%

30%

20%

20%

10%

10% 0%

0% 1st

2nd

3rd

4th

1st

2017

2nd

3rd

4th

1st

2018

2nd

3rd

4th

1st

2019

2nd

3rd

4th

1st

2017

Torovirus porcino

70%

2nd

3rd

4th

1st

2018

2nd

3rd

4th

2019

Orthoreovirus de los mamíferos

70%

60%

60%

50%

50%

40%

40%

30%

30%

20%

20%

10%

10%

0% 1st

2nd

3rd

4th

1st

2017

2nd

3rd

4th

1st

2018

2nd

3rd

4th

0% 1st

2019

2nd

3rd

4th

1st

2017

Mastadenovirus de los mamíferos

70%

2nd

3rd

4th

1st

2018

2nd

3rd

4th

2019

Virus de la diarrea epidémica porcina

70%

60%

60%

50%

50%

40%

40%

30%

30%

20%

20%

10%

10%

0% 1st

2nd

3rd

4th

1st

2017

2nd

3rd

4th

1st

2018

2nd

3rd

4th

0% 1st

2019

2nd

3rd

4th

1st

2017

Rotavirus A

70% 60%

60%

50%

50%

40%

40%

30%

30%

20%

20%

10%

10%

2nd

3rd

4th

1st

2018

2nd

3rd

4th

2019

Rotavirus C

70%

0%

0% 1st

2nd

3rd

2017

FIGURA 2

Porcentaje de detección de cada uno de los diferentes virus entéricos investigados en brotes de diarrea ocurridos entre enero de 2017 y diciembre de 2019.

28

Kobuvirus porcino

70%

80%

Nº 9 | Octubre 2023

4th

1st

2nd

3rd

2018

4th

1st

2nd

3rd

2019

4th

1st

2nd

3rd

2017

4th

1st

2nd

3rd

2018

4th

1st

2nd

3rd

4th

2019

El riesgo de resultado positivo a, al menos, uno de los virus analizados fue mayor en los brotes en los que el veterinario clínico indicó que existía sospecha de etiología viral (OR= 2,52; IC 95%: 1,27-5,04) en comparación con los brotes sin sospecha vírica (85,4% frente a 69,9%).

Así, la prevalencia de cada uno de los virus investigados fue mayor en los brotes con sospecha de etiología viral, con la excepción de PKoV, RVA y RVC (Figura 3), aunque solo se alcanzaron diferencias estadísticamente significativas para el VDEP (p < 0,001) y el PAdV (p = 0,002).

Detección y caracterización genética de virus entéricos en brotes de diarrea de explotaciones porcinas en España

EPIDEMIOLOGÍA

60

Prevalencia (%)

50

55,3 (57/103) 41,7 (43/103)

40

36,9 (38/103)

31,1 (32/103) 23,3 (24/103)

30 20

6,8 (7/103)

10 0

21,4 (22/103)

15,5 (16/103)

Astrovirus porcino

Kobuvirus porcino

Sin sospecha de etiología viral

1,9 (2/103)

Torovirus porcino

6,8 (7/103)

Orthoreovirus de los mamíferos

6,8 (7/103)

Mastadenovirus porcino

14,6 (15/103)

12,6 (13/103)

2,9 (3/103)

Virus de la diarrea epidémica porcina

Rotavirus A

8,7 (9/103)

3,9 (4/103)

Rotavirus C

Con sospecha de etiología viral

FIGURA 3

Prevalencia de brotes de diarrea positivos a cada uno de los diferentes virus entéricos investigados según el aspecto epidemiológico y clínico de los brotes (sin sospecha -nº = 103- o con sospecha –nº = 103- de afectación viral).

VACLIEAN YCI D A IYS TDIRSITBRUIBUCIÓN AS P R E VAPLREEN C I Ó N DDE E LLAS

CIO NEÍ RS IVCAS ÍR IC AESN ELO N LSO B S RBR O TEESS DDEE C O I N F ECCOINF C I OENC E SV OT E NE ESSPA PAÑÑ AA D I ADI R ARRERAE A EN

En 69 de los 206 brotes analizados (33,5%) se detectó un único agente viral, mientras que 56 (27,2%) presentaron coinfección con dos virus al mismo tiempo y 35 (17,0%) fueron positivos a más de dos (hasta 5 especies víricas diferentes detectadas simultáneamente en tres granjas distintas).

La detección de un único agente vírico fue más frecuente en los brotes de diarrea en lactación que en los de postdestete (26,6%, 17 de 64, p = 0,019) y engorde (28,9%, 22 de 76, p = 0,031).

Los brotes con dos o más virus coinfectando fueron más prevalentes en postdestete (50,0%, 32 de 64, p = 0,017) y engorde (51,3%, 39 de 76, p = 0,009) en comparación con lactación (30,3%, 20 de 66).

Los brotes que presentaban dos o más virus en coinfección fueron más frecuentes en los brotes con sospecha de etiología vírica según los criterios del veterinario responsable de la explotación (55,3% frente a 33,0%, p = 0,001).

Tal y como se muestra en la Tabla 2, PAstV y PKoV se detectaron en casi el 30% de los brotes positivos como infección única, mientras que PToV, MRV y PAdV se detectaron en más del 90% de los brotes positivos coinfectando con el VDEP, RV u otros virus entéricos.

29

VIROLOGÍA Brotes positivos a PAstV (n = 100)

Brotes positivos a PKoV (n = 56)

Brotes positivos a PToV (n = 23)

Brotes positivos a MRV (n = 9)

Brotes positivos a PAdV (n = 29)

Infección simple

28,0%

32,1%

4,3%

0,0%

6,9%

Coinfección con PAstV

-

46,4%

78,3%

88,9%

75,9%

Coinfección con PKoV

26,0%

-

30,4%

11,1%

20,7%

Coinfección con PToV

18,0%

12,5%

-

33,3%

17,2%

Coinfección con MRV

8,0%

1,8%

13,0%

-

3,4%

Coinfección con PAdV

22,0%

10,7%

21,7%

11,1%

-

Coinfección con VDEP

23,0%

17,9%

39,1%

33,3%

10,3%

Coinfección con RVA

20,0%

19,6%

34,8%

11,1%

20,7%

Coinfección con RVC

1,0%

8,9%

0,0%

0,0%

3,4%

TABLA 2

Distribución de infecciones simples y coinfecciones por Astrovirus porcino (PAstV), Kobuvirus porcino (PKoV), Torovirus porcino (PToV), Orthoreovirus de mamíferos (MRV), Adenovirus porcino (PAdV), Virus de la diarrea epidémica porcina (VDEP), Rotavirus A (RVA) y Rotavirus C (RVC) en los brotes de diarrea investigados (n = 206).

Las combinaciones virales más frecuentes (Top 8) se muestran en la Tabla 3.

Una vez más, se observó una clara distribución en función de la edad, siendo las coinfecciones con PAstV más prevalentes en los brotes de postdestete-transición y engorde y las coinfecciones con PKoV en los brotes en lactación.

Edad de los animales afectados (número de brotes investigados) Lactación (n = 66)

Postdestete-Transición (n = 64)

Cebo (n = 76)

Total (n = 206)

Ranking

Virus

Prevalencia (%)

Ranking

Virus

Prevalencia (%)

Ranking

Virus

Prevalencia (%)

Ranking

Virus

Prevalencia (%)

1

PKoV + VDEP

7,6

1

PAstV + PKoV

32,8

1

PAstV + PAdV

18,4

1

PAstV + PKoV

12,6

2

PKoV + RVC

7,6

2

PAstV + VDEP

15,6

2

PAstV + PToV

13,2

2

PAstV + VDEP

11,2

3

PKoV + RVA

4,5

3

PKoV + RVA

12,5

3

PAstV + VDEP

13,2

3

PAstV + PAdV

10,7

4

PAstV + VDEP

4,5

4

PAstV + RVA

10,9

4

PAstV + RVA

7,9

4

PAstV + RVA

9,7

5

PAstV + PKoV

4,5

5

PAstV + PToV

10,9

5

PAstV + MRV

7,9

5

PAstV + PToV

8,7

6

PAstV + RVA

3,0

6

PAstV + PAdV

9,4

6

PToV + VDEP

5,3

6

PKoV + RVA

5,3

7

PKoV + PToV

3,0

7

PKoV + VDEP

7,8

7

PToV + RVA

5,3

7

PKoV + VDEP

4,9

8

PToV + VDEP

3,0

8

PAstV + PToV

7,8

8

PToV + PAdV

3,9

8

PToV + VDEP

4,4

TABLA 3

Coinfecciones víricas más frecuentemente detectadas (Top 8) en los brotes de diarrea investigados distribuidas en función de la edad de los animales afectados.

30

Nº 9 | Octubre 2023

Detección y caracterización genética de virus entéricos en brotes de diarrea de explotaciones porcinas en España

EPIDEMIOLOGÍA

En la Figura 4 se muestran los virus más frecuentemente asociados con el VDEP, RVA y RVC. El PAstV se identificó en más del 50% de los brotes del VDEP y RVA, mientras que el RVC coinfecta, principalmente, con el PKoV, probablemente como consecuencia del patrón dependiente de la edad de estas infecciones.

La comparación de la prevalencia de cada uno de los virus investigados entre los brotes positivos y negativos a VDEP, RVA y RVC revela que los PToV se detectaron más comúnmente en los brotes VDEP y RVA positivos (p = 0,021 y p = 0,005, respectivamente) mientras que la detección de PAstV fue más común en las granjas RVA positivas (p = 0,027).

RVA

VDEP

14,3% (4/28)

70,7% (29/41)

85,7% (24/28)

67,9

50 30 20

24,4 (10/41) 22,0 (9/41) 7,4 7,3 (3/41) (3/41)

10 0

PAstV PKoV PToV MRV PAdV

Prevalencia (%)

Prevalencia (%)

53,7 60 (22/41)

40

46,2% (6/13)

80 (19/28) 70 60 39,3 50 (11/28) 28,6 40 (8/28) 21,4 30 (19/28) 20 3,6 (1/28) 10 0 PAstV PKoV PToV MRV PAdV

Infección simple

53,8% (7/13)

38,5

Prevalencia (%)

29,3% (12/41)

RVC

(5/13) 45 40 35 30 25 20 15 7,7 7,7 10 (1/13) (1/13) 5 0,0 0,0 0 PAstV PKoV PToV MRV PAdV

Coinfección

FIGURA 4

Detección de cada uno de los diferentes virus entéricos investigados (Astrovirus porcino o PAstV, Kobuvirus porcino o PKoV, Torovirus porcino o PToV, Orthoreovirus de mamíferos o MRV y Mastadenovirus porcino o PAdV) en brotes positivos a virus entéricos bien reconocidos (Virus de la diarrea epidémica porcina o VDEP -nº = 41-, Rotavirus A o RVA -nº = 28- y Rotavirus C o RVC -nº = 13-).

31

VIROLOGÍA

UE NCI F ILGOGE O S E C U E NSCE ICAC I Ó NA CIÓN Y A NYÁ ALNI SÁILSI SFI SI LO E N NÉ É TTI IC CO DE TPAVs, tPV,KPOV K oVY YP PTOV ToV D E PAS Los resultados de la secuenciación de nueva generación (NGS) en 14 muestras de heces se muestran en la Tabla 4.

Se obtuvo el genoma completo o casi completo de 24 virus, incluyendo PAstV2 (5), PAstV3 (1), PAstV4 (8), PAstV5 (2), PKoV (3), PToV (1) y VDEP (4).

ID

Edad

VC4*

Lactación

VC9

Lactación

VC18

Lactación

VC19

Lactación

VC29

Postdestete

VC35

Postdestete

VC36

Cebo

VC41

PAstV2

PAstV3

PAstV4

PAstV5

P C

T

C

C

C

T

T

C

T

T

T

C

C

C

Lactación

C

T

C

VC46*

Postdestete

C

P

P

VC57*

Lactación

T

T

VC64

Postdestete

T

VC100*

C

PKoV

PToV

VDEP

RVA

RVC

C

3

T

T

6

C

T

2

P

T

4

C

T

T

C

P

T

9 T

T

T P

N

C

T T

MRV

6 T

P

P

C

C

T

P

C

T

T

T

T

T

T

Cebo

T

T

T

C

T

VT9

Cebo

T

C

C

VT41

Postdestete

C

T

P

4

P

6 7 T

T

7 8

T

4

T

4

T

4

TABLA 4

Resumen de los resultados de la secuenciación de nueva generación (NGS) en 14 muestras fecales seleccionadas. C = secuencia consenso (genoma completo o genoma casi completo, > 90%); P = secuencia parcial (menos del 90% del genoma cubierto) y T = trazas (menos del 10% del genoma cubierto). N = número de virus detectados por muestra. Un asterisco indica los genomas de VDEP que ya habían sido publicados8.

32

Nº 9 | Octubre 2023

Detección y caracterización genética de virus entéricos en brotes de diarrea de explotaciones porcinas en España

EPIDEMIOLOGÍA

PAstV

SE DETECTARON CUATRO ESPECIES DE PAstV (PAstV2 A PAstV5), SIENDO PAstV4 Y PAstV2 LAS MÁS REPRESENTADAS Las identidades nucleotídicas entre las secuencias de las cepas PAstV2 y PAstV4 recuperadas en nuestra investigación fueron del 77,2-95,2% y 87,2-93,7% respectivamente, mientras que su comparación con secuencias previamente descritas mostró identidades nucleotídicas del 68,7-91,0% para PAstV2, 87,689,1% para PAstV3, 73,4-91,8% para PAstV4 y 83,3-94,4% para PAstV5.

La mayoría de las secuencias españolas de PAstV se agruparon con cepas norteamericanas del mismo linaje, aunque PAstV4 se agrupó con secuencias de Japón y algunas de PAstV2 con secuencias de Europa y China (Figura 5).

FIGURA 5

Árbol filogenético basado en la p-distancia entre las secuencias de nucleótidos de los genomas completos de PAstV. A lo largo de las ramas, se muestra el porcentaje de valores bootstrap basados en 10.000 réplicas (solo se muestran valores iguales o superiores al 70%).

Los círculos rellenos identifican los aislados secuenciados en esta investigación. El número de acceso del GenBank, el país y el año del brote también se muestran a continuación de las cepas. Los linajes de PAstV a los que se hace referencia en el texto se incluyen a la derecha del árbol. Las barras de escala indican las sustituciones de nucleótidos por sitio.

33

VIROLOGÍA

PKoV En cuanto al análisis filogenético de PKoV (Figura 6), las tres secuencias obtenidas en este estudio se agruparon con otros aislados españoles y húngaros descritos con anterioridad.

La identidad nucleotídica fue del 90,3-91,4% entre los aislados españoles identificados en este estudio y del 87,2-91,9% con las secuencias del genoma completo del PKoV previamente descritas.

PToV Se obtuvo un único genoma completo de PToV y, cuando se comparó con PToV descritos previamente, su identidad nucleotídica fue del 88,6-94,1%, mientras que cuando se comparó con secuencias de Torovirus de otras especies animales fue del 77,3-87,9%.

Esta secuencia española de PToV se agrupó con secuencias virales de Europa, en particular de Alemania, pero también con secuencias de EE.UU. y Japón (Figura 7).

FIGURA 6

Árbol filogenético basado en la p-distancia entre las secuencias de nucleótidos de los genomas completos de PKoV. A lo largo de las ramas, se muestra el porcentaje de valores bootstrap basados en 10.000 réplicas (sólo se muestran valores iguales o superiores al 70%). Los círculos rellenos identifican los aislados secuenciados en esta investigación. El número de acceso del GenBank, el país y el año del brote también se muestran a continuación de las cepas. Las barras de escala indican las sustituciones de nucleótidos por sitio.

34

Nº 9 | Octubre 2023

Detección y caracterización genética de virus entéricos en brotes de diarrea de explotaciones porcinas en España

EPIDEMIOLOGÍA

FIGURA 7

Árbol filogenético basado en la p-distancia entre las secuencias de nucleótidos de los genomas completos de PKoV. A lo largo de las ramas, se muestra el porcentaje de valores bootstrap basados en 10.000 réplicas (sólo se muestran valores iguales o superiores al 70%).

Los círculos rellenos identifican los aislados secuenciados en esta investigación. El número de acceso del GenBank, el país y el año del brote también se muestran a continuación de las cepas. Las barras de escala indican las sustituciones de nucleótidos por sitio.

DISCUSIÓN El papel enteropatógeno de PAstV, PKoV, PToV, MRV y PAdV sigue siendo controvertido y los estudios de casos y controles que han comparado las ratios de detección en cerdos con diarrea y en cerdos sanos no han logrado, por el momento, clarificar esta cuestión39,46-50.

E VA L ENNCCII AS AS P R PERVA LE En este estudio nos planteamos como objetivo determinar, como punto de partida, la prevalencia de estas especies víricas entéricas en brotes de diarrea de diferentes edades y estudiar su asociación con enteropatógenos víricos bien reconocidos como los CoV (VDEP, VGET y SeCoV) y los RV (RVA y RVC).

Aunque el diseño del estudio no permite extraer conclusiones sobre el papel de estos virus en la etiología de la enfermedad entérica, pretende aumentar los conocimientos sobre su frecuencia, distribución y coinfecciones en granjas con problemas entéricos.

NUESTROS RESULTADOS CONFIRMAN QUE LAS INFECCIONES POR PAstV Y PKoV SON ALTAMENTE PREVALENTES EN LAS GRANJAS PORCINAS EUROPEAS, TAL Y COMO HABÍAN DESCRITO VARIOS ESTUDIOS19,46,49,50,56

35

VIROLOGÍA

Así, el PAstV fue el virus entérico más frecuente en nuestra investigación, detectado en casi la mitad de los brotes, seguido del PKoV, detectado en más del 25% de las granjas investigadas.

En concordancia con un informe previo en Hungría49, el PAdV fue menos frecuente (14,1% de los brotes positivos) mientras que el PToV solo se identificó en el 11,2% de las granjas investigadas, en contraposición a la amplia distribución de este virus evidenciada por otro estudio español que estimó más del 99% de animales seropositivos entre los cerdos de más de 11 semanas de edad57.

Por último, el MRV se detectó con menor frecuencia (4,4%), no existiendo datos previos sobre su prevalencia en las explotaciones porcinas europeas.

En cuanto a los CoV podemos destacar que no se detectaron ni el VGET ni el SeCoV, identificándose el VDEP en el 19,9% de los brotes de diarrea investigados. Finalmente, la prevalencia de brotes positivos a RVA y RVC fue del 13,6 y el 6,3%, respectivamente.

IBUCIÓN E D ADDEE SS D I S T DI R ISBTUR C I Ó N P OPRORE DA Se observaron tres patrones de distribución por edades entre los virus entéricos investigados.

Al igual que en estudios previos realizados en China16,47, Canadá44 y varios países europeos38,49,50, los PKoV fueron más prevalentes en animales jóvenes, lechones lactantes y postdestete, en comparación con las fases de engorde.

Se ha descrito una distribución similar para el RVC3, confirmándose en nuestro estudio, ya que no se produjo ningún brote positivo a RVC después del destete.

PAstV y RVA mostraron un aumento significativo de su prevalencia en cerdos destetados en comparación con cerdos lactantes.

Estudios previos en granjas porcinas europeas han informado de una tendencia similar para el PAstV46,49,50. Como se ha descrito para los RVA en granjas porcinas1, la disminución de anticuerpos maternales específicos podría explicar el aumento de la prevalencia del PAstV en el periodo postdestete.

Por último y, en consonancia con estudios anteriores28,49, PToV y PAdV se identificaron con mayor frecuencia en los brotes de diarrea durante el periodo de engorde.

36

Nº 9 | Octubre 2023

Detección y caracterización genética de virus entéricos en brotes de diarrea de explotaciones porcinas en España

EPIDEMIOLOGÍA

E S TAI OCION ID ADD E S TAC N A ALLI DA Solo se demostró una distribución estacional para los brotes positivos de VDEP, que fueron más comunes durante los meses más fríos del año (enero-marzo).

Las bajas temperaturas que favorecen la supervivencia del CoV en el ambiente y facilitan la transmisión indirecta pueden explicar la variación estacional de los brotes de VDEP58,59. Además, se ha propuesto que la exposición a bajas temperaturas ambientales puede aumentar la replicación del VDEP a través de la regulación de la proteína de choque térmico Hsp70 en el intestino del cerdo, contribuyendo a la estacionalidad de este virus60.

NO SE HA DESCRITO ESTACIONALIDAD PARA LOS RV PORCINOS3 E CDHEA EDET IEOT LO IOLGOGÍ L SOSPS EOCSHPA Í AAVVIIR R AA L Curiosamente, los criterios clínicos veterinarios que sugieren una presunta etiología viral se asociaron con la detección viral mediante análisis moleculares.

Esto fue particularmente evidente para los brotes positivos al VDEP, pero también para PAdV y en menor medida para PAstV, PToV o MRV. Por el contrario, RVA, RVC y PKoV se detectaron principalmente en brotes sin sospecha vírica.

El hecho de que las infecciones por RV sean endémicas en las poblaciones porcinas y se asocien con frecuencia a otros agentes productores de diarrea, como Escherichia coli enterotoxigénica o Clostridium perfringens tipo A3,61,62, podría complicar su reconocimiento por parte de los profesionales.

37

VIROLOGÍA

C CIONE S C O ICNOINF F E CEC IONES Las coinfecciones fueron relativamente frecuentes, detectándose dos o más virus en casi el 40% de los brotes investigados.

Este resultado está en consonancia con estudios anteriores realizados en granjas porcinas europeas16,49,63 en los que se señalaba una elevada frecuencia de coinfecciones con varios virus entéricos en cerdos con diarrea.

En concordancia con estudios anteriores realizados en Europa49, China4,47 o Canadá44, el número de especies víricas diferentes detectadas en un brote aumenta con la edad de los cerdos afectados.

LAS INFECCIONES SIMPLES FUERON MÁS FRECUENTES EN LECHONES LACTANTES, MIENTRAS QUE EN CERDOS POSTDESTETE Y DE ENGORDE SE OBSERVARON COINFECCIONES SIMULTÁNEAS CON HASTA CINCO VIRUS Muchos factores asociados al destete, como los cambios en la dieta, la colocación en un entorno nuevo y más contaminado, la mezcla de cerdos o la pérdida de inmunidad pasiva, pueden favorecer la infección por diferentes especies víricas. Además, se ha propuesto que la maduración del sistema inmunitario asociado al intestino tras el destete puede prevenir el desarrollo de enfermedades entéricas asociadas a infecciones simples para aquellos virus entéricos con una enteropatogenicidad moderada64.

Las coinfecciones más frecuentes variaron en función de la edad o la etapa productiva de los cerdos afectados. Como era de esperar, a partir de los patrones observados de distribución por edades:

Las coinfecciones que implicaban a PKoV fueron las más prevalentes en lechones lactantes (27,2%).

Las coinfecciones con PAstV predominaron en los brotes posteriores al destete y en el engorde (87,4% y 60,6%, respectivamente).

La excreción de PToV fue más frecuente en los brotes positivos al VDEP y RVA.

38

Nº 9 | Octubre 2023

Recientemente, se ha propuesto que el VDEP y el PKoV podrían desempeñar algún papel sinérgico65, pero en nuestra investigación no se observó ninguna asociación significativa entre ambos virus.

El hecho de que la mayoría de los brotes de VDEP se produjeran en cerdos postdestete o de engorde, cuando el PKoV es menos prevalente, puede explicar este resultado.

Disponemos de muy poca información sobre las infecciones por PToV, pero merece la pena mencionar que el primer informe de PToV en Estados Unidos fue en un cerdo positivo a VDEP66. Además, observamos un aumento de la prevalencia de eliminadores de PAstV en brotes positivos a RVA.

Detección y caracterización genética de virus entéricos en brotes de diarrea de explotaciones porcinas en España

EPIDEMIOLOGÍA

SON NECESARIAS MÁS INVESTIGACIONES PARA DESCIFRAR LAS INTERACCIONES ENTRE LOS VIRUS ENTÉRICOS QUE PUEDEN DESEMPEÑAR UN PAPEL PRIMARIO O SECUNDARIO EN LA ETIOLOGÍA DE LA ENFERMEDAD ENTÉRICA EN CERDOS Cabe señalar que los enfoques cuantitativos basados en la PCR cuantitativa (qPCR) y la secuenciación de nueva generación (NGS), que permiten estimar la carga viral, podrían aportar información adicional relevante en la investigación de la etiología de infecciones entéricas del ganado porcino.

Como proponen Cortey y colaboradores63, la determinación de la abundancia relativa de las distintas especies virales en las coinfecciones permite identificar el virus predominante que, con toda probabilidad, puede proponerse como agente etiológico primario.

F ILGOGE O A N Á ALNI SÁILSI SFI SI LO E N NÉ É TTI IC CO Por último, el análisis filogenético reveló que la mayoría de las cepas de PAstV se clasificaban como PAstV4 (50,0%, 8/16) y PAstV2 (31,2%, 5/16), siendo estas dos especies las más prevalentes en cerdos con diarrea en España, de forma similar a lo descrito en varios países europeos46,50,67, en Norteamérica68 y en Asia39,69,70.

Los análisis filogenéticos de PKoV revelaron que todas las secuencias completas españolas disponibles (incluidas las tres identificadas en nuestro estudio) estaban incluidas en un único clúster local junto con una cepa húngara y bien diferenciadas de otros aislados europeos38, mientras que la única secuencia completa del genoma de PToV obtenida en esta investigación se agrupó junto con otros aislados de PToV de Europa, América o Asia25,26.

39

VIROLOGÍA

CONCLUSIONES A pesar de que el diseño de este estudio no permitió evaluar el papel de PAstV, PKoV, PToV, MRV o PAdV como agentes causales de diarrea en cerdos, demuestra una alta prevalencia de estos virus entéricos en los brotes de diarrea, particularmente para PAstV y PKoV, detectados en casi el 50% y el 30% de las granjas investigadas.

El hecho de que estos virus entéricos estén frecuentemente implicados en coinfecciones entre ellos y con enteropatógenos virales bien reconocidos, como CoV o RV, hace necesarios estudios adicionales de vigilancia y caracterización, así como investigaciones para evaluar su potencial patogénico tanto en infecciones experimentales como naturales.

Una vez que se disponga de estos estudios, deberá considerarse la inclusión de estos virus en los paneles de diagnóstico de rutina para la diarrea en cerdos.

Artículo adaptado de: Puente, H., Arguello, H., Cortey, M. et al. Detection and genetic characterization of enteric viruses in diarrhoea outbreaks from swine farms in Spain. Porc Health Manag 9, 29 (2023). https://doi. org/10.1186/s40813-023-00326-w.

BIBLIOGRAFÍA

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ENTREVISTA

“TWISTPAK ES UN AVANCE REVOLUCIONARIO QUE PERMITE MEZCLAR DOS VACUNAS DE BOEHRINGER INGELHEIM EN LA GRANJA EN MENOS DE 5 SEGUNDOS” ®

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ENTREVISTA CON SOFÍA GAVIRIA, BRAND MANAGER SWINE DE BOEHRINGER INGELHEIM ANIMAL HEALTH ESPAÑA

TT

ras el reciente lanzamiento de TwistPak®, la nueva tecnología que optimiza el proceso de mezcla de Ingelvac CircoFLEX® e Ingelvac MycoFLEX®, Sofía Gaviria, Brand Manager Swine de Boehringer Ingelheim Animal Health España, analiza las claves de un sistema que representa la apuesta por la innovación de la compañía.

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Nº 9 | Octubre 2023 “TwistPak® es un avance revolucionario que permite mezclar dos vacunas de Boehringer Ingelheim en la granja en menos de 5 segundos” - Entrevista con Sofía Gaviria

SANIDAD

Q UÉ E S T W I S T PA K ® Y Q UÉ V E N TA J A S A P OR TA R E S P E C T O A L S I S T E M A T R A DICIO N A L TwistPak® es una nueva tecnología que optimiza el proceso de mezcla de Ingelvac CircoFLEX® e Ingelvac MycoFLEX®. TwistPak® representa un avance revolucionario que ofrece a los veterinarios un sistema sencillo, seguro e higiénico para la mezcla de vacunas, manteniendo la flexibilidad de usar una monovalente si así se desea.

Frente al sistema tradicional, TwistPak® aporta una solución innovadora para optimizar el proceso de mezcla de dos vacunas.

Esta solución elimina por completo la necesidad de utilizar una aguja de transferencia. Al eliminar este paso, se logra un proceso de mezcla más seguro y eficiente para el personal de la granja, al mismo tiempo que se reduce el riesgo de posibles contaminaciones durante la mezcla de las vacunas.

C ÓMO F UN CIO N A T W I S T PA K ® La tecnología TwistPak® incorpora un mecanismo único e higiénico en la base de cada frasco de Ingelvac CircoFLEX® e Ingelvac MycoFLEX®.

La mezcla se efectúa alineando y girando los botes de ambas vacunas. Este proceso genera una sola cámara donde se mezclan las vacunas. Para garantizar una mezcla homogénea se debe invertir lentamente los frascos hasta lograr un color uniforme.

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ENTREVISTA

Asimismo, hay que tener en cuenta que: Su gran resistencia y dureza garantiza la estabilidad del envase durante toda su vida útil.

La industria se enfrenta a desafíos como la aparición de nuevas enfermedades, la presión para reducir el uso de antibióticos y el cumplimiento de normativas en materia de bienestar animal.

Se trata de uno de los plásticos más fáciles de reciclar.

Ante estas exigencias, la innovación se convierte en una herramienta indispensable para superar obstáculos y lograr resultados óptimos.

La correcta separación en la granja es esencial para su reciclaje.

En este contexto, contamos con dos productos que comparten su enfoque innovador y disruptivo:

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TwistPak®, que representa un avance significativo en el campo de la vacunación.

SoundTalks®, una herramienta basada en inteligencia artificial que está diseñada para la vigilancia de la salud respiratoria en granjas de cerdos. Capaz de predecir la aparición de patologías respiratorias con hasta 5 días de antelación, su implementación consigue reducir el uso de antibióticos, la duración del proceso respiratorio y la mortalidad asociada al mismo.

ESTA VISIÓN DE VANGUARDIA REFLEJA NUESTRO COMPROMISO DE OFRECER SOLUCIONES PRÁCTICAS Y EFECTIVAS QUE IMPULSEN LA PRODUCTIVIDAD, LA SEGURIDAD Y EL BIENESTAR EN LAS GRANJAS Más información: Fichas técnicas: Ingelvac CircoFLEX®

Ingelvac MycoFLEX®

Nº 9 | Octubre 2023 “TwistPak® es un avance revolucionario que permite mezclar dos vacunas de Boehringer Ingelheim en la granja en menos de 5 segundos” - Entrevista con Sofía Gaviria

VACUNACIÓN

V

VACUNAS FRENTE A LA ENFERMEDAD DE GLÄSSER

AA

Descarga el PDF lo largo de este artículo se revisa la práctica totalidad de las vacunas estudiadas para prevenir la enfermedad de Glässer y se comenta su eficacia o ineficacia, después de una breve descripción de la enfermedad y su agente etiológico, Glaesserella parasuis.

César B. Gutiérrez Martín Catedrático de Sanidad Animal de la Universidad de León

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Nº 9 | Octubre 2023

Vacunas frente a la enfermedad de Glässer

INMUNIDAD

LA ENFERMEDAD DE GLÄSSER Entre los agentes patógenos secundarios habituales que integran el Complejo Respiratorio Porcino (término acuñado por Dee en 1996) se encuentra Glaesserella parasuis, una bacteria Gram negativa de la familia Pasteurellaceae, que suele comportarse como comensal de la cavidad nasal y las tonsilas, lugares anatómicos que coloniza rápidamente después del nacimiento de los lechones.

No se considera un patógeno per se, sino que el peligro aparece cuando se difunde a otras localizaciones, desencadenando cuadros septicémicos.

Esta diseminación se ve favorecida por factores estresantes, como la mezcla de cerdos de diferentes edades y procedencias, densidades elevadas, condiciones higiénicas deficientes, destetes precoces, etc. y que suelen darse en las explotaciones intensivas.

Es entonces cuando aparece la enfermedad de Glässer, que cursa con: Poliserositis fibrinosa porcina generalizada, con especial afectación de las meninges, los aparatos digestivo y respiratorio, y las articulaciones (Imagen 1).

Posibles miositis y abortos esporádicos.

Trombos o hemorragias ocasionales en algunas localizaciones (Imagen 2).

A

IMAGEN 1

B

Lesiones macroscópicas de la enfermedad de Glässer después de una infección experimental con la cepa Nagasaki, cepa de referencia del serotipo 5. A. Pericarditis fibrinosa. B. Exudado fibrinoso en la cavidad torácica (Fuente propia).

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VACUNACIÓN

A

B

C

IMAGEN 2

Lesiones microscópicas de la enfermedad de Glässer (tinción con hematoxilina-eosina 100X). A. Hemorragias en el encéfalo. B. Meningitis fibrinopurulenta intensa. C. Pulmón con pleuritis fibrinosa y trombosis (Fuente propia).

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Nº 9 | Octubre 2023

Vacunas frente a la enfermedad de Glässer

INMUNIDAD

GLAESSERELLA PARASUIS DE CERCA La enfermedad de Glässer se ha relacionado exclusivamente con la especie porcina hasta la primera década del siglo XXI, cuando fue descrita en jabalíes (Olvera y cols., 2007), una especie sinantrópica cada vez más habitual en las zonas metropolitanas, especialmente desde la pandemia del Coronavirus (SARS-CoV-2).

La enfermedad está producida por G. parasuis, un bacilo corto Gram negativo (Imagen 3) capsulado y aflagelar, clasificado en 15 serotipos (esquema de Kielstein y Rapp-Gabrielson), aunque también existen cepas que no han podido ser tipificadas.

IMAGEN 3

Aspecto microscópico cocobacilar, negativo a la tinción de Gram, de Glaesserella parasuis (1000X) (Fuente propia).

Solo crece en los medios de cultivo enriquecidos que contienen el factor V sanguíneo, como el agar chocolate o similares (Imagen 4).

Crece bien después de 24 horas de incubación en aerobiosis, a 37 °C, pero cuando se recupera de lesiones sospechosas, es necesario aplicar microaerofilia durante 48 horas.

Como otras pasteurelaceas, crece sobre agar sangre de caballo o cordero si se combina con una estría nodriza de un estafilococo productor de factor V necesario, desarrollándose pequeñas colonias en la proximidad de la estría de esta bacteria Gram positiva (Imagen 5).

IMAGEN 4

Colonias de Glaesserella parasuis en agar chocolate (Fuente propia).

IMAGEN 5

Satelitismo de Glaesserella parasuis sobre agar sangre. Las colonias de G. parasuis pueden crecer gracias al factor V liberado por el crecimiento de la estría de la cepa nodriza de estafilococo (Fuente propia).

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VACUNACIÓN

No ha podido establecerse en G. parasuis una vinculación tan estrecha entre serotipo y virulencia como en Actinobacillus pleuropneumoniae, ya que una vez identificado el serotipo en esta última especie puede presumirse su grado de patogenicidad, mientras que en el caso de G. parasuis coexisten cepas de virulencia muy diversa dentro de cada serotipo, incluso aislados avirulentos. Por ello, el concepto de serotipo se encuentra en desuso, en favor del de patotipo, que se refiere a la virulencia de cada cepa.

G. parasuis se adhiere a las células epiteliales, para lo que las cepas virulentas forman biopelículas que favorecen la colonización de la mucosa respiratoria porcina previa a la invasión. Además, cuenta con proteasas que degradan las IgAs de los epitelios respiratorios, al tiempo que soportan la fagocitosis.

Se ha relacionado el bloqueo de los mecanismos celulares de la inmunidad innata porcina con las características capsulares de G. parasuis, habiéndose observado concretamente la evasión de la fagocitosis por parte de los macrófagos alveolares, circunstancia que permite su persistencia en estas células y su posterior multiplicación en el parénquima pulmonar.

Se ha documentado la inducción de la “muerte celular programada” o apoptosis de las células epiteliales traqueales, con el daño tisular consiguiente. Asimismo, se ha comprobado igualmente la invasión de los endotelios vasculares, lo que permite el fenómeno septicémico posterior. Si a ello unimos la resistencia de la bacteria al sistema del complemento porcino, también debido a las características de su cápsula, se explica el desarrollo de las poliserositis, especialmente de las poliartritis.

Nuestro grupo de investigación (BACRESPI, nº 443 de los de la Universidad de León) ha descrito con detalle el sistema de captación del hierro porcino por parte de G. parasuis, un oligoelemento que debe obtener a partir de su hospedador, para lo que se sirve de dos proteínas de la membrana externa (Omps) de su pared celular.

La captación del hierro se lleva a cabo a partir de la transferrina porcina, mediante las proteínas A y B de unión a la transferrina porcina (TbpA y TbpB) (Frandoloso y cols., 2013, 2015); en mucho menor grado, a partir de sus sideróforos citoplasmáticos.

NO SE HA DESCRITO HASTA LA FECHA NINGUNA HEMOLISINA PRODUCIDA POR G. PARASUIS

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Vacunas frente a la enfermedad de Glässer

INMUNIDAD

ANÁLISIS LABORATORIAL DE GLAESSERELLA PARASUIS Son numerosas las posibilidades de diagnóstico de la enfermedad de Glässer.

Nos detenemos tan solo en una de las más modernas que, con una base molecular, permite diferenciar G. parasuis de otras especies involucradas en cuadros respiratorios porcinos. Se trata del análisis genético del ARN ribosómico 23S, técnica que se resuelve en apenas dos horas (ÁlvarezEstrada y cols., 2018a).

Han sido abundantes los estudios efectuados acerca del tratamiento.

En uno de los publicados por nuestro grupo de investigación, se analizó la sensibilidad de distintas cepas clínicas de G. parasuis frente a los antibióticos más comunes, con buenos resultados de sensibilidad frente a algunas penicilinas (Martín de la Fuente y cols., 2007) y frente a la tildipirosina, un macrólido semisintético (Rodrigues Peres y cols., 2020).

Debe hacerse notar que el uso desmedido de los antibióticos en la producción porcina intensiva ha originado un incremento de las resistencias bacterianas, también en G. parasuis, que se transmiten a gran velocidad mediante mecanismos de conjugación, entre otros.

PREVENCIÓN Y CONTROL DE LA ENFERMEDAD DE GLÄSSER Respecto a las medidas de prevención y control, debe recurrirse a las medidas habituales: Limpieza minuciosa de las instalaciones seguida de su desinfección exhaustiva.

Prevención de los factores predisponentes y de las condiciones ambientales desfavorables.

Cobra gran relevancia la apuesta por las vacunas, aunque no existe en el mercado una opción totalmente eficaz que proteja frente a todos los casos de enfermedad de Glässer, a pesar de los numerosos ensayos realizados.

En el contexto global actual del uso restringido y racional de los antibióticos, el control de la enfermedad de Glässer debe asentarse en unas estrategias de manejo correctas y en unas medidas de bioseguridad estrictas.

SE RECOMIENDA UN ENFOQUE HOLÍSTICO, QUE INTEGRE ESTAS MEDIDAS CON MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO RÁPIDOS Y EFICACES QUE PERMITAN EL CONOCIMIENTO DE LAS CARACTERÍSTICAS ANTIGÉNICAS DE G. PARASUIS

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VACUNACIÓN

VACUNACIÓN FRENTE A LA ENFERMEDAD DE GLÄSSER Se ha barajado una gran cantidad de posibilidades sin que ninguna de las vacunas haya ofrecido unos resultados óptimos de protección absoluta, habiéndose relacionado los fallos, principalmente, con un nivel de protección insuficiente o con la ausencia total de protección cruzada entre los 15 serotipos.

Podemos clasificar las vacunas propuestas en cinco grupos: Vacunas inactivadas o bacterinas Vacunas “fantasma” Vacunas con microorganismos atenuados Vacunas de ADN Vacunas de subunidades

VACUNAS INACTIVADAS O BACTERINAS Las vacunas inactivadas o bacterinas fueron las primeras desarrolladas, como frente a casi cualquier enfermedad infecciosa.

Se continúan utilizando bastante y se formulan, como mínimo, con una cepa virulenta que suele inactivarse con formol y potenciarse con hidróxido de aluminio, aceites minerales o propóleo.

Algunas bacterinas comerciales contienen hasta cuatro serotipos diferentes, los más prevalentes en una región determinada. Esto se debe a que proporcionan una protección cruzada escasa, que mejora incorporando los principales serotipos de una zona concreta.

Pires Espíndola y cols. (2019) demostraron que el polisacárido capsular representa el antígeno dominante de estos productos.

Se sabe que la protección de las madres vacunadas se transmite a la descendencia, de modo que una doble vacunación de las cerdas gestantes podría proteger a los lechones hasta seis meses a través de los anticuerpos maternales, inicialmente IgGs (predominantes en el calostro) y después IgAs (las más abundantes en la leche).

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Vacunas frente a la enfermedad de Glässer

INMUNIDAD

Entre sus limitaciones cabe destacar que: Ninguna suele contener todos los serotipos virulentos de una región determinada.

No resulta posible conseguir el mismo grado de protección con las vacunas que contienen varios antígenos que con las que incorporan uno solo, por lo que podrían desencadenarse brotes en los cerdos vacunados con las bacterinas multivalentes.

Inducen periodos breves de protección en comparación con las vacunas atenuadas, lo que obliga a repetir las inmunizaciones.

No permiten diferenciar los animales vacunados de los infectados de forma natural.

A continuación, se resumen tres ensayos realizados con bacterinas: Li y cols. (2015a) utilizaron un aislado del serotipo 5, el más prevalente en China, inactivado con formaldehído y adyuvantado con un aceite comercial, que consiguió inducir buenas respuestas Th1 y Th2, además de mostrarse eficaz frente al desafío experimental con la misma cepa. No se valoraron otros serotipos ni otras cepas de este serotipo.

Zhao y cols. (2017) contrastaron la eficacia de una bacterina formulada con los tres serotipos más frecuentes en China (4, 5 y 12) y consiguieron la mejor protección en los cerdos inoculados con esta vacuna, respecto a la de otras fórmulas comerciales.

Hau y cols. (2021) valoraron las protecciones homóloga y heteróloga de cepas pertenecientes a los serotipos 5 y 1, respectivamente, y determinaron que la selección de las cepas resultaba fundamental en la generación de inmunidad cruzada.

VACUNAS “FANTASMA” (GHOST VACCINES) Se ha ensayado una vacuna con bacterias completas de la cepa Nagasaki (de referencia del serotipo 5 y virulencia demostrada) desprovistas de sus cromosomas (ghost vaccines), generándose una respuesta humoral mayor que con la de las bacterinas tradicionales (Hu y cols., 2013).

VACUNAS ATENUADAS El desarrollo de las vacunas atenuadas frente a G. parasuis no comenzó hasta la década pasada, debido a la escasa información disponible sobre sus factores de virulencia, lo que dificultó ostensiblemente su diseño.

LAS VACUNAS ATENUADAS SUELEN INDUCIR UNA PROTECCIÓN MÁS PROLONGADA QUE LA DE LAS VACUNAS INACTIVADAS 53

VACUNACIÓN

Las cepas utilizadas son mutantes para algún factor de virulencia demostrada, por ejemplo: Se han efectuado deleciones (eliminaciones) de los genes que codifican algunos hidratos de carbono, como aquellos casos en los que se eliminaron genes relacionados con la síntesis de polisacáridos (Wang y cols., 2013; Kang y cols., 2015).

En otro caso, se retiró un gen que codificaba una enzima necesaria para la síntesis de la porción central del lipopolisacárido Gram negativo (Zhang y cols., 2014).

En un tercer abordaje sufrió la deleción un gen para un regulador de la quimiotaxis bacteriana (He y cols., 2016).

En otro estudio se eliminó el gen que codificaba una chaperona (Ren y cols., 2016).

VACUNAS DE SUBUNIDADES Al no utilizar bacterias completas, las vacunas de subunidades también evitan cualquier riesgo de infección derivada de la vacunación.

Como inconveniente, un gran número de animales no desarrolla una inmunidad tan potente como con las vacunas atenuadas o las inactivadas, ya que se trabaja con moléculas muy purificadas, por lo que deben potenciarse mediante adyuvantes adecuados.

Con diferencia, son las vacunas más estudiadas, con una treintena de publicaciones desde 2009. Sin embargo, solo unas pocas formulaciones han conseguido inducir niveles suficientes de anticuerpos protectores.

Eso sí, nunca se ha pasado de un abordaje meramente experimental, en algunos casos ni siquiera sobre cerdos, sino sobre animales de experimentación.

Los resultados aceptables de algunas moléculas sobre estos modelos deben ser confirmados necesariamente en cerdos, puesto que nuestro grupo cuenta con la amarga experiencia de que algunas Omps (Omp2, Omp5 y OmpD15), eficaces en un modelo murino, no funcionaron como inmunógenos en cerdos (Álvarez-Estrada y cols., 2018b) (Imagen 6).

Estas bacterias mutantes perdieron patogenicidad, pero en ninguna publicación se aludió a la respuesta inmunitaria desarrollada.

VACUNAS DE ADN Las vacunas de ADN son más seguras y estables que las anteriores ya que solo contienen este material genético en su composición.

Solo existen dos estudios sobre vacunas de ADN frente a G. parasuis (Fu y cols., 2012a,b), ambos con el material genético de la enzima gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH).

IMAGEN 6

Ensayo de una vacuna de subunidades frente a la enfermedad de Glässer, preparada a base de las proteínas de la membrana externa Omp2, Omp5 y OmpD15 de Glaesserella parasuis, por parte del grupo de investigación BACRESPI (Fuente propia).

Esta vacuna generaba protecciones humoral y celular parciales en ratones, puesto que no se trabajó con el hospedador natural de la enfermedad de Glässer.

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Vacunas frente a la enfermedad de Glässer

INMUNIDAD

A continuación, repasamos algunas de las investigaciones con vacunas de subunidades.

Li y cols. (2015b) describieron seis proteínas del serotipo 5 que generaban una protección parcial en ratones frente a una cepa del serotipo homólogo. Este mismo grupo obtuvo otras seis proteínas de membrana externa (Li y cols., 2017a) con una protección válida en ratones. Álvarez-Estrada y cols. (2018c) expresaron siete proteínas de la cepa Nagasaki (referencia del serotipo 5) en condiciones similares a las de una infección natural (es decir, a una temperatura elevada y en condiciones de restricción de hierro) en porcino, que podrían funcionar como buenos inmunógenos. Sin embargo, no se verificaron con los otros catorce serotipos ni directamente en cerdos.

Macedo y cols. (2016) ensayaron una proteína transmembrana, la oligopéptido permeasa A potenciada con un adyuvante oleoso, que, a pesar de inducir una respuesta humoral destacada, no consiguió estimular una respuesta de protección en cerdos.

Dos equipos asiáticos utilizaron tres proteínas recombinantes eficaces frente al desafío con G. parasuis en cobayos (Li y cols., 2016) o ratones (Wen y cols., 2016). Diferentes grupos orientales continuaron trabajando con ratones y demostraron la eficacia de varias proteínas recombinantes: la superóxido dismutasa (Guo y cols., 2017), tres OMPs (Li y cols., 2017b), la proteína A de unión al glutatión (Zhang y cols., 2017) y la Omp-16 recubierta por nanoesferas de alginato-quitosán (Zheng y cols., 2017).

Bregón-Villahoz y cols. (2017) estudiaron un fragmento de la enzima neuraminidasa presente en los 15 serotipos de G. parasuis y, al tratarse de una molécula conservada (a excepción del serotipo 2), especularon con la posibilidad de que pudiera representar un buen candidato vacunal frente a los 14 serotipos restantes, lo que debería confirmarse obviamente mediante estudios experimentales en el cerdo.

Hau y cols. (2020) valoraron dos lipoproteínas recombinantes de la membrana externa (una esencial para la viabilidad y la otra con resistencia al complemento porcino), potenciadas con un adyuvante oleoso antes de un desafío en cerdos con una cepa del mismo serotipo, pero no resultaron eficaces.

Lo más reseñable de este estudio fue que por primera vez se afirmó que los roedores no constituían un modelo experimental adecuado para la reproducción experimental de la enfermedad de Glässer, lo que invalidaba la mayoría de los estudios vacunales así efectuados.

An y cols. (2023) validaron la producción de una respuesta inmunitaria intensa por parte de la subunidad proteica PilA de los pili del serotipo 5 de G. parasuis en ratones.

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VACUNACIÓN

Entre las vacunas de subunidades basadas en las Omps destacan los estudios de dos grupos españoles.

El de Virginia Aragón, adscrito al CRESA (Centro de Investigación en Sanidad Animal), ha investigado los autotransportadores triméricos, habiendo logrado una protección parcial de cerdos desafiados por vía intranasal con una cepa del mismo serotipo (Olvera y cols., 2011).

López-Serrano y cols. (2021) probaron el fragmento proteico F4 sobre cerdas gestantes, pero, aunque inducía anticuerpos en los lechones, no prevenía la colonización nasal de las cepas virulentas. Dos años después, evaluaron este mismo fragmento conservado de los autotransportadores triméricos sobre lechones recién nacidos y comprobaron su buen potencial protector, que variaba en función del adyuvante utilizado (LópezSerrano y cols., 2023).

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El equipo constituido por la Facultad de Veterinaria de León (César B. Gutiérrez Martín y colaboradores), junto con las Universidades de Calgary (grupo de Anthony B. Schryvers) y Passo Fundo (grupo de Rafael Frandoloso) han estudiado exhaustivamente las TbpA y TbpB, principalmente la segunda.

Diseñaron una vacuna basada en el mutante Y167 de la cepa Nagasaki que impedía la captación del hierro porcino por parte de su TbpB. Sin embargo, este mutante conservaba su potencial inmunógeno, por lo que parecía adecuado a priori para el desarrollo de una vacuna con garantías.

Potenciado el mutante con un aceite comercial, se obtuvo una protección total frente al desafío experimental de cerdos con la cepa silvestre, con activación de las dos ramas de la respuesta específica, lo que convertía esta cepa mutante en un candidato prometedor para una vacuna de subunidades, al funcionar mejor que algunas vacunas comerciales (Frandoloso y cols., 2015).

Vacunas frente a la enfermedad de Glässer

McCaig y cols. (2016) consiguieron resultados similares al trabajar con vesículas de la membrana externa de G. parasuis.

Al analizar la estructura molecular de la TbpB en G. parasuis y en otras especies de la familia Pasteurellaceae, se clasificó en tres grupos (1, 2 y 3) como punto de partida de un experimento publicado el año pasado (Ramos Prigol y cols., 2022).

Se vacunaron cerdos con el mutante Y167 (cuya TbpB pertenece al grupo 3) y se desafiaron con el serotipo 7 (TbpB del grupo 1), obteniéndose una protección cruzada eficaz.

SE CONCLUYÓ POR PRIMERA VEZ QUE UNA VACUNA BASADA EN EL MUTANTE Y167 PODÍA RESULTAR EFICAZ FRENTE A OTRAS CEPAS CON Tbps ADSCRITAS A OTROS GRUPOS MOLECULARES, LO QUE SUPONDRÍA UN CIERTO GRADO DE PROTECCIÓN FRENTE A SEROTIPOS DIFERENTES, NO SOLO FRENTE AL HOMÓLOGO

INMUNIDAD

En línea con el estudio anterior, González Fernández y cols. (2023) analizaron bioinformáticamente cepas clínicas castellanoleonesas adscritas a los grupos 1 o 3 de la TbpB, pero ninguna al grupo 2.

Este hallazgo planteaba la posibilidad de que una vacuna de subunidades basada en la cepa mutante Y167 del serotipo 5 podría proteger frente a ese mismo serotipo o frente a cualquiera de los otros ocho a los que pertenecían los aislados españoles analizados.

Estos estudios deben confirmarse experimentalmente en cerdos, tarea que se está llevando a cabo en la actualidad.

Existen ocho investigaciones relacionadas con la protección cruzada.

En dos de ellas se trabajó con el serotipo 3 por las vías intranasal e intramuscular (Susan y cols., 2013), consiguiéndose protección frente a los serotipos 1 y 4.

En los seis ensayos restantes, la protección fue únicamente parcial, cubriendo los serotipos 1-5 y 13 (citado en Liu y cols., 2016).

INMUNIDAD DE MUCOSAS FRENTE A LA ENFERMEDAD DE GLÄSSER Debido a las características de transmisión de G. parasuis, junto con la inmunidad sistémica resulta fundamental la inmunidad de mucosas, especialmente la de la mucosa respiratoria.

Frandoloso y cols. (2013) ya demostraron que la inoculación intratraqueal de una vacuna era capaz de estimular la inmunidad de mucosas, aunque esta vía no resulta práctica por su complejidad.

Frandoloso y cols. (2020) publicaron además los resultados de la administración yugal de una vacuna con el mutante Y167, lográndose una protección total después del desafío intranasal con el mismo serotipo, impidiendo asimismo la colonización de G. parasuis de las vías respiratorias superiores.

Dellagostin y cols. (2023) demostraron que la vacunación de madres gestantes con el mutante Y167 generaba niveles suficientes de IgGs para reducir la carga de G. parasuis en su tracto respiratorio durante el primer mes de vida de los lechones, con mejores resultados que los de una vacuna autógena con la que era comparada.

La vacunación doble de cerdas gestantes con el antígeno F4 poco antes del parto, llevada a cabo por Blanco-Fuertes y cols. (2022), modificó la composición general de la microbiota nasal de los lechones durante los primeros 15 días, no solo afectando a las cepas de G. parasuis ahí asentadas.

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VACUNACIÓN

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Nº 9 | Octubre 2023

Wen Y., Yan X., Wen Y., Cao S., He L., Ding L., Zhang L, Zhou P., Wu R., Wen X. 2016.

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Vacunas frente a la enfermedad de Glässer

ONE HEALTH

B

SENSIBILIDAD ANTIBIÓTICA DE BRACHYSPIRA HYODYSENTERIAE, AGENTE CAUSAL DE LA DISENTERÍA PORCINA

BB

rachyspira hyodysenteriae, bacteria gram negativa, anaerobia y β-hemolítica, es el principal agente etiológico causante de la disentería porcina, que puede llegar a tener un gran impacto clínico y económico en las granjas afectadas.

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Lara Domínguez Estallo y Silvia del Caso Yagüe Exopol S.L.

59

ANTIMICROBIANOS

La disentería porcina se caracteriza por una diarrea mucohemorrágica (Imagen 1), deshidratación, pérdida de peso y, en casos extremos, la muerte, observándose con mayor frecuencia en cerdos de cebo.

La transmisión de B. hyodysenteriae se produce por vía fecal-oral, por lo que puede propagarse de forma fácil y rápida entre los individuos de la misma granja.

IMAGEN 1

Heces diarreicas con presencia de moco con restos de sangre.

Existen otras especies de Brachyspira spp. descritas en cerdos como B. pilosicoli débilmente hemolítica que causa espiroquetosis colónica o B. intermedia que causa colitis leve.

ABORDAJE DIAGNÓSTICO DE LA DISENTERÍA PORCINA Ante la sospecha de infección por Brachyspira hyodysenteriae conviene realizar un diagnóstico diferencial completo por qPCR testando otras especies de Brachyspira patógenas como B. pilosicoli y B. intermedia.

También hay que descartar otros de los principales agentes infecciosos que cursan con diarrea en estas edades, como Clostridium perfringens, PEDV (virus de la diarrea epidémica porcina), Salmonella enterica y, sobre todo, Lawsonia intracellularis, ya que puede cursar con una sintomatología similar.

60

Nº 9 | Octubre 2023

Sensibilidad antibiótica de Brachyspira Hyodysenteriae, agente causal de la disentería porcina

ONE HEALTH

Si bien, la qPCR facilita mucho el diagnóstico de los procesos asociados a B. hyodysenteriae, el aislamiento de la bacteria sigue siendo necesario para realizar los estudios de sensibilidad antibiótica y la probabilidad de éxito del cultivo depende de la calidad de la muestra.

Por ello, se deben seleccionar animales sin tratar y que cursen un cuadro diarreico para tomar muestras. El muestreo se realizará mediante hisopado rectal o recogida de heces. En el caso de bajas, se puede analizar el ciego o el colon.

OBTENER UN CULTIVO PURO DE LA CEPA A PARTIR DE LA MUESTRA RECIBIDA REQUIERE UN MÍNIMO DE 7 DÍAS Una vez obtenido el cultivo puro, se puede realizar el estudio de sensibilidad antibiótica que ayude a seleccionar el tratamiento con más probabilidades de éxito. Para ello, se analiza un panel de antibióticos que incluye los tratamientos registrados en España para la disentería porcina y antibióticos de amplio espectro: Tilosina Tiamulina Tilvalosina Gentamicina Valnemulina Doxiciclina

61

ANTIMICROBIANOS

CONCENTRACIÓN MÍNIMA INHIBITORIA La prueba más frecuente para valorar la sensibilidad de cepas de B. hyodysenteriae es la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) (Imagen 2) que se realiza mediante la técnica de microdilución testando los principales antibióticos utilizados para tratar la disentería porcina.

Al ser una bacteria de crecimiento difícil, las condiciones de cultivo para realizar la CMI son especiales.

Se preparan diluciones de cada antibiótico de menor a mayor concentración y se distribuyen por orden en una placa de 48 pocillos (Imagen 2).

La incubación es más larga de lo habitual, dura 4 días, y se realiza en anaerobiosis.

Concentración de antibiótico

4 días

Tras la incubación se puede apreciar el crecimiento bacteriano como turbidez en el pocillo.

La CMI indica la concentración más baja de antibiótico que inhibe el crecimiento bacteriano y que debe ser la concentración mínima que debe llegar al órgano diana para que el tratamiento sea efectivo.

Concentración de antibiótico

Sin crecimiento bacteriano Crecimiento bacteriano

Anaerobiosis

EL RESULTADO DE CMI SE COMPARA CON LOS PUNTOS DE CORTE CLÍNICOS ESTABLECIDOS PARA DETERMINAR SI LA CEPA AISLADA ES SENSIBLE O RESISTENTE A LOS DIFERENTES ANTIBIÓTICOS TESTADOS Los puntos de corte de gentamicina, tiamulina, valnemulina, tilvalosina y tilosina están publicados por el organismo oficial CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute). Sin embargo, no aparecen los de doxiciclina y lincomicina y se debe recurrir a puntos de corte establecidos en la literatura científica.

IMAGEN 2

CMI por microdilución de Brachyspira sp en placa de 48 pocillos.

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Sensibilidad antibiótica de Brachyspira Hyodysenteriae, agente causal de la disentería porcina

ONE HEALTH

FRECUENCIA DE DETECCIÓN Y SENSIBILIDAD ANTIBIÓTICA DE BRACHYSPIRA SPP. EN ESPAÑA Se han recopilado los resultados de casos clínicos de porcino en edad de cebo que cursaban con diarrea procedentes de España recibidos en Exopol entre 2019 y 2023.

FRECUENCIA DE DETECCIÓN En la Figura 1 se muestra la frecuencia de detección de las especies patógenas de Brachyspira spp. que pueden causar problemas en la edad de cebo.

B. pilosicoli es la especie menos frecuente, con una media de 9% de muestras positivas, seguido de B. intermedia con un 24%, siendo B. hyodysenteriae la más frecuente con un 37% de muestras positivas.

50% 45%

41% 40%

40%

39%

35% 30% 25%

2019 2020 2021 2022 2023

40% 31%

24%

20%

34%

23% 16% 15%

15%

13% 13%

10%

5% 5% 6%

5% 0%

Brachyspira hyodysenteriae

Brachyspira intermedia

Brachyspira pilosicoli

FIGURA 1

Frecuencia de las especies de Brachyspira spp. detectadas por qPCR en casos con procesos digestivos en cebo recibidos en Exopol entre los años 2019 y 2023.

Las qPCR realizadas de B. intermedia y B. pilosicoli fueron: 2019 (N=572), 2020 (N=342), 2021 (N=420), 2022 (N=670), 2023 (N=383).

Las qPCR realizadas de B. hyodysenteriae fueron: 2019 (N=739), 2020 (N=735), 2021 (N=878), 2022 (N=1.085), 2023 (N=765).

A pesar de que no se realizaron pruebas de sensibilidad antibiótica para B. intermedia y B. pilosicoli, hay que destacar que el porcentaje de casos positivos en los últimos 5 años se ha duplicado, siendo recomendable valorar en otros estudios su impacto en procesos diarreicos.

63

ANTIMICROBIANOS

SENSIBILIDAD ANTIBIÓTICA Para el periodo 2019-2023 se han obtenido resultados de CMI de 510 cepas de Brachyspira hyodysenteriae de casos clínicos de porcino que cursaban con diarrea.

Gentamicina

CMI50

CMI90

N

Sensible si ≤

Cepas sensibles

4

16

289

8

80%

Doxiciclina

1

2

361

0,5

45%

Lincomicina

16

>64

510

50

75%

Tiamulina

0,5

8

510

0,5

61%

Tilosina

>64

>64

510

32

12%

Tilvalosina

4

32

510

32

92%

Valnemulina

0,5

4

510

2

87%

TABLA 1

Resultados de CMI50, CMI90 de las 510 cepas de Brachyspira hyodysenteriae analizadas.

Con estos resultados se ha calculado la CMI50 y CMI90 (Tabla 1) que corresponden a la concentración mínima de antibiótico capaz de inhibir el crecimiento del 50% y 90% de la población bacteriana, respectivamente.

Estos resultados muestran que, como mínimo, el 50% de las cepas analizadas eran sensibles a gentamicina, lincomicina, tiamulina y valnemulina. Sin embargo, para inhibir el crecimiento del 90% de las cepas sería necesaria una concentración de antibiótico que supere el punto de corte clínico establecido.

En el caso de la doxiciclina y la tilosina, ya es necesario superar dicho punto para inhibir el crecimiento del 50% de las cepas.

LA TILVALOSINA MUESTRA LOS MEJORES RESULTADOS YA QUE PRESENTA UNA CMI90 QUE NO SUPERA EL PUNTO DE CORTE

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Nº 9 | Octubre 2023

Sensibilidad antibiótica de Brachyspira Hyodysenteriae, agente causal de la disentería porcina

ONE HEALTH

La Figura 2 muestra el diagrama de frecuencias de cada uno de los antibióticos testados con el número de cepas que han tenido como resultado de CMI cada una de las concentraciones analizadas.

Distribución de CMI de tilvalosina 141 95

100

93 62

50

49

31

39

2

4

8

16

32

50

66

38

30

>32

≤2

43

4

8

16

32

64

>64

Concentración de antibiótico (µg/mL)

Concentración de antibiótico (µg/mL)

Distribución de CMI de valnemulina

Distribución de CMI de gentamicina

150 102

80

101 58

55

0

25

06

≤0,

5

2 0,1

0,25

0,5

49

1

2

32 4

33

nº de cepas

150

50

97

100

97 38

50

>4

≤2

4

437

nº de cepas

400 300 200 100 0

37 ≤4

9

10

6

11

8

16

32

64

8

16

10

7

32

>32

Concentración de antibiótico (µg/mL)

Concentración de antibiótico (µg/mL)

500

40

0

Distribución de CMI de tilosina 160 140 120 100 80 60 40 20 0

Distribución de CMI de tiamulina

146

88 75

≤0,125

0,25

>64

0,5

61

45

1

39

32

2

4

24 8

>8

Concentración de antibiótico (µg/mL)

Concentración de antibiótico (µg/mL)

Distribución de CMI de doxiciclina 150

FIGURA 2

Diagrama de frecuencias que representa la distribución de las CMI de Brachyspira hyodysenteriae para cada antibiótico testado.

Se muestran en verde las barras de las concentraciones que no superan el punto de corte y, por lo tanto, se consideran sensibles, y en gris las que sí lo superan y son resistentes.

nº de cepas

nº de cepas

85

0 ≤1

nº de cepas

106

100

0

100

142

150

nº de cepas

nº de cepas

150

Distribución de CMI de lincomicina

91

100 50 0

26 ≤0,125

127 52

45

0,25

0,5

1

2

10

10

4

>4

Concentración de antibiótico (µg/mL)

65

ANTIMICROBIANOS

S INLAN, EVAMLUNELMUL INOCM OMICIN A T I LVA LOTSILVA I N AL,OVA I N AIN YALYI NLC ICINA En el caso de la valnemulina y lincomicina la distribución de las CMI se asemeja a una distribución normal. Sin embargo, la tilvalosina acumula un gran número de cepas en los valores de CMI más bajos.

LA TILVALOSINA Y LA VALNEMULINA SERÍAN BUENOS CANDIDATOS PARA EL TRATAMIENTO DEBIDO AL BAJO NÚMERO DE CEPAS RESISTENTES (8% Y 13%, RESPECTIVAMENTE) En el caso de la lincomicina, hay un 25% de cepas resistentes, pudiéndose observar en su gráfica de distribución que, aunque la gran mayoría de las cepas se distribuyen en valores de CMI sensibles, existen poblaciones de cepas resistentes, siendo necesario realizar pruebas de sensibilidad antibiótica antes de instaurar un tratamiento.

A MUL A T I TAIM U L IIN NA La tiamulina, a pesar de ser de la misma familia que la valnemulina (pleuromutilinas), presenta un 39% de cepas resistentes que están distribuidas en todo el rango de concentraciones analizado por encima del punto de corte, por lo que, con un uso racional de este medicamento se podría frenar el avance de las resistencias.

De todos modos, presenta un 61% de cepas sensibles y se observa en la gráfica de distribución que hay una población de cepas muy sensibles.

IL OSSIIN A T ITLO NA

LA RESISTENCIA A LOS MACRÓLIDOS SE DESARROLLA CON RAPIDEZ EN CEPAS DE B. HYODYSENTERIAE, YA QUE SOLO SE REQUIERE UNA ÚNICA MUTACIÓN TRANSVERSAL EN UNA POSICIÓN DEL GEN 23S DEL rRNA 66

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Destaca la diferencia de sensibilidad entre la tilosina y la tilvalosina, ambos pertenecientes a la familia de los macrólidos.

Aunque la tilvalosina es un derivado de la tilosina, la distribución de sus CMI es mucho más sensible, ya que es el antibiótico que menos tiempo lleva registrado para tratar la disentería porcina (desde 2004).

El tratamiento con tilosina estaría desaconsejado para tratar la disentería porcina en España porque, además de que existe una alta probabilidad de que no sea efectivo, podría incluso empeorar la situación al ejercer presión para mantener el alto nivel de resistencia.

Sensibilidad antibiótica de Brachyspira Hyodysenteriae, agente causal de la disentería porcina

ONE HEALTH

N TAMMICIN A G E GE N TA ICINA Un alto porcentaje de cepas sensibles (81%) son sensibles a gentamicina y en la gráfica de distribución de cepas se ve que la mayoría tienen CMI categorizadas como sensibles, pero hay que mantener un uso racional para que no se incremente el número de cepas resistentes.

CONCLUSIONES Las cepas aisladas de B. hyodysenteriae presentan una sensibilidad superior al 60% para la mayoría de los antibióticos utilizados en el tratamiento de la disentería porcina (gentamicina, tilvalosina, valnemulina, tiamulina y lincomicina).

No obstante, los resultados de este estudio también confirman la existencia de cepas resistentes a estos antibióticos y, en el caso de la doxiciclina y la tilosina, son resistentes la mayoría de las cepas analizadas.

Es evidente que, para establecer un tratamiento, debe realizarse:

A D ODO X IXCICICL I C L IIN NA La doxiciclina, de la familia de las tetraciclinas, tiene peores resultados de sensibilidad, ya que solo el 45% de las cepas fueron sensibles.

Como se puede ver en la Figura 2, también se asemeja a una distribución normal. Hay un importante número de cepas con el resultado de CMI en los valores próximos (mayores y menores) al punto de corte que marca la sensibilidad, es decir, con valores entre 0,25 µg/mL y 2 µg/mL. Esto implica que probablemente estén aumentando las resistencias por el uso frecuente de esta familia para otros procesos al ser de amplio espectro de actividad, y si no se frena seguirá en aumento el número de cepas resistentes.

BIBLIOGRAFÍA Burrough E. R. (2017). Swine Dysentery. Veterinary pathology, 54(1), 22–31. https://doi. org/10.1177/0300985816653795 Zeeh, F., Nathues, H., Frey, J., Muellner, P., & Fellström, C. (2017). A review of methods used for studying the molecular epidemiology of Brachyspira hyodysenteriae. Veterinary microbiology, 207, 181–194. https:// doi.org/10.1016/j.vetmic.2017.06.011

1 2

Una prueba de diagnóstico para confirmar el agente causal.

Una prueba de sensibilidad antibiótica.

De esta forma, la elección del tratamiento se puede basar en el resultado de la CMI y en las indicaciones de la ficha técnica del producto.

También se observa que el uso continuado de un antibiótico, como es el caso de la tilosina, puede producir una pérdida de efectividad por el aumento de las resistencias. Teniendo en cuenta esto, y el limitado número de antibióticos disponibles para el control de esta enfermedad, debe llevarse a cabo una vigilancia para detectar tendencias de resistencia nuevas y emergentes.

Además, se deben intentar limitar los tratamientos con antibióticos en la medida de lo posible disminuyendo el riesgo de contagio y realizando una buena limpieza y desinfección de la granja, ya que esta bacteria es capaz de sobrevivir en las heces de los animales.

Hidalgo, A., Carvajal, A., Pringle, M., Rubio, P., & Fellström, C. (2010). Characterization and epidemiological relationships of Spanish Brachyspira hyodysenteriae field isolates. Epidemiology and infection, 138(1), 76–85. https://doi.org/10.1017/ S0950268809002817 Hidalgo, A., Carvajal, A., Vester B., Pringle, M., Naharro G. & Rubio, P., (2011). Trends towards Lower Antimicrobial Susceptibility and Characterization of Acquired Resistance among Clinical Isolates of Brachyspira hyodysenteriae in Spain. Antimicrobial agents and chemotherapy, 55 (7), 3330–3337. https:// doi.org/10.1128/aac.01749-10

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BIOSEGURIDAD

B

ESTRATEGIAS DE BIOSEGURIDAD FRENTE A VIRUS PORCINOS EN LOS PIENSOS

EE

Descarga el PDF

l comercio global de ingredientes para piensos susceptibles de estar contaminados con concentraciones significativas de virus porcinos es motivo de preocupación por la posible transmisión de enfermedades porcinas, ya que las partículas víricas viables pueden sobrevivir en los ingredientes de los piensos y en los piensos completos durante varias semanas o meses.

Sin embargo, no existe un sistema mundial de vigilancia y monitorización de virus porcinos en los ingredientes de los piensos. Por ello, se deben desarrollar e implementar protocolos de bioseguridad basados en el Análisis de Peligros y en Controles Preventivos en función del Riesgo en las cadenas de suministro de ingredientes para piensos, con el fin de prevenir la contaminación vírica.

Gerald C. Shurson1, Pedro E. Urriola1 y Declan C. Schroeder2 1 Departamento de Ciencia Animal, Universidad de Minnesota 2 Departamento de Medicina Veterinaria Poblacional, Universidad de Minnesota

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Nº 9 | Octubre 2023

Estrategias de bioseguridad frente a virus porcinos en los piensos

VIROLOGÍA

EL RETO DE MONITORIZAR LA CONTAMINACIÓN VÍRICA EN LOS PIENSOS Históricamente, la contaminación bacteriana, parasitaria, por priones y por virus de los subproductos animales y de los residuos de alimentos no cocinados o sometidos a un tratamiento térmico inadecuado se ha asociado a diversos tipos de enfermedades, lo que ha conducido al desarrollo y aplicación de estrategias eficaces de mitigación térmica y química como parte de los programas de control de calidad y seguridad de los piensos en la industria de los piensos2.

Sin embargo, la preocupación por la transmisión transfronteriza de virus porcinos a través del comercio y los viajes internacionales1 ha conducido a la realización de numerosas investigaciones para evaluar: La eficacia de los tiempos de almacenamiento prolongados.

Los procesos térmicos y de irradiación.

Los atenuantes químicos para inactivar los virus porcinos.

Las estrategias de descontaminación en las fábricas de piensos como parte de los programas de bioseguridad de las cadenas mundiales de suministro de piensos.

Los principales virus porcinos que suscitan preocupación por su posible transmisión a través de las cadenas mundiales de suministro de piensos son: Virus de la Diarrea Epidémica Porcina (PEDV) Virus de la Peste Porcina Africana (VPPA) Virus de la Peste Porcina Clásica (VPPC) Virus del Síndrome Respiratorio y Reproductivo Porcino (VPRRS) Senecavirus A (SVA) Virus de la Fiebre Aftosa (VFA)

69

BIOSEGURIDAD

Si bien, algunos informes han aportado pruebas de la contaminación en piensos e ingredientes para piensos con algunos virus (VPPA3, VPPC4 y SVA5,6) en granjas comerciales y fábricas de piensos, otros estudios no han logrado relacionar definitivamente los piensos potencialmente contaminados con la transmisión del VPPA3, el PEDV7-10 y el VPRRS11.

Por lo tanto, hay limitadas evidencias de casos que muestren vínculos claros entre los piensos contaminados con virus porcinos y los brotes de enfermedades en las granjas.

Desgraciadamente, no existe un programa mundial de vigilancia, seguimiento y testaje para determinar la prevalencia, frecuencia, concentraciones, viabilidad e infectividad de estos virus a lo largo de las cadenas de suministro de ingredientes para piensos. Como resultado, existe una gran incertidumbre sobre el riesgo relativo de transmisión de virus a través de los piensos en comparación con otros fómites y vías.

PROBABILIDAD DE TRANSMISIÓN DE VIRUS PORCINOS A TRAVÉS DE LA ALIMENTACIÓN Debido a esta gran incertidumbre, se han desarrollado modelos matemáticos para evaluar la probabilidad de transmisión del virus a través de los piensos.

Galvis et al.11 evaluaron la probabilidad relativa de transmisión del VPRRS a partir de nueve vías de transmisión y mostraron una asociación mínima entre la alimentación con subproductos animales y los brotes de VPRRS en granjas.

Schambow et al.12 desarrollaron un modelo cuantitativo de evaluación de riesgos para estimar la probabilidad de que se importaran anualmente a EE.UU. uno o más contenedores con harina de soja o maíz contaminados con VPPA. Estimaron que la probabilidad de que se importara un contenedor de maíz contaminado con VPPA era de 1 vez cada 50 años, pero para la harina de soja la probabilidad era de 1 vez cada 21-1.563 años.

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Nº 9 | Octubre 2023

Estrategias de bioseguridad frente a virus porcinos en los piensos

VIROLOGÍA

RIESGO DE TRANSMISIÓN DE VIRUS PORCINOS EN LAS MATERIAS PRIMAS Varios estudios de inoculación en laboratorio han demostrado que la mayoría de los virus porcinos de interés pueden sobrevivir en algunos ingredientes de piensos durante varias semanas o meses6,13-18. Sin embargo, el riesgo de transmisión del virus se basa en: La presencia de un peligro (virus).

La exposición del hospedador (cerdo).

Para que los piensos puedan ser una fuente de infección:

1

Alguno de los ingredientes utilizados en su elaboración debe estar contaminada con un patógeno vírico.

2

El virus debe sobrevivir a las condiciones de tiempo y temperatura de secado, procesado y almacenamiento.

3 5

Los virus deben estar en una forma viable que pueda provocar la infección cuando el cerdo los consuma.

4

El virus debe sobrevivir durante el transporte y el posterior almacenamiento en la fábrica de piensos.

El ingrediente contaminado con virus viables debe añadirse al pienso a una tasa de inclusión relativamente alta para proporcionar concentraciones de virus superiores a la dosis infecciosa mínima en la dieta final.

Por tanto, son muchas las condiciones de supervivencia de los virus que deben mantenerse desde el momento de la contaminación inicial de un ingrediente hasta que los cerdos consuman cantidades suficientes de virus viables para que se produzca la infección y, posteriormente, la enfermedad. No obstante, también es importante tener en cuenta que los virus pueden causar infecciones asintomáticas en los cerdos, lo que los convierte en portadores, existiendo una distinción importante entre infección y enfermedad.

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BIOSEGURIDAD

PROTOCOLOS DE BIOSEGURIDAD PARA MINIMIZAR EL RIESGO DE TRANSMISIÓN DE VIRUS PORCINOS EN LOS PIENSOS Debido al comercio global de ingredientes para piensos y al movimiento de ingredientes importados a fábricas de piensos y granjas porcinas, los programas de bioseguridad de los piensos para minimizar el riesgo de contaminación y transmisión de virus han surgido como un nuevo componente de los protocolos de seguridad y bioseguridad de piensos.

Antes del 2022, la Administración de Alimentos y Medicamentos de los EE.UU. (FDA) no consideraba a los virus como un peligro razonablemente previsible en la alimentación animal, a diferencia de las bacterias patógenas, los hongos y los parásitos. Sin embargo, la Guía de Análisis de Peligros y Controles Preventivos Basado en Riesgos (HARPC) para la industria alimentaria de la FDA ahora incluye a los virus como peligros razonablemente previsibles en las cadenas de suministro de piensos, lo que exige desarrollar un plan de control preventivo para evitar y vigilar la contaminación de los piensos con virus.

Según esta reciente guía, no está claro si los fabricantes de piensos necesitan un plan de control preventivo del VPPA o de cualquier otro virus porcino.

ACCEDER A Hazard Analysis and Risk-Based Preventive Controls for Food for Animals Guidance for Industry

Por ello, la necesidad de desarrollar e implementar un plan de control preventivo será determinada en función de la percepción de riesgo de la empresa como probable o posible de ocurrir en el tiempo si no se corrige.

En cualquier caso, no existen sistemas ni procedimientos analíticos estandarizados en los laboratorios comerciales para medir con facilidad y precisión la contaminación de los ingredientes y piensos con virus viables, para poder cumplir con los requisitos de seguimiento y acción correctiva de los planes HARPC. Existen muchas lagunas de conocimiento que deben abordarse para mejorar nuestra capacidad de prevenir y controlar la contaminación por virus en la alimentación porcina, incluyendo: Identificación de las condiciones de producción, procesamiento, transporte y almacenamiento que pueden conducir a la contaminación por virus de los ingredientes de los piensos.

Determinación de la probabilidad de contaminación de los piensos por virus porcinos.

Comprensión de las características químicas y físicas de los ingredientes de los piensos que permiten la supervivencia de diversos tipos de virus.

Comprensión de las características de los virus que permiten su supervivencia, así como aquellas que los hacen vulnerables a la inactivación y pérdida de infectividad.

Desarrollo y validación de ensayos altamente sensibles y específicos que cuantifiquen con precisión las partículas virales viables e infecciosas de diversos virus en distintos tipos de ingredientes de piensos.

Identificación de condiciones de tiempo y temperatura que inactiven eficazmente a los virus sin degradar el valor nutricional de los ingredientes.

Identificación de agentes químicos atenuantes que inactiven eficazmente los virus sin degradar el valor nutricional o la seguridad de los ingredientes.

Determinación de prácticas eficaces para descontaminar las fábricas de piensos.

Determinación de las concentraciones mínimas de virus y de las condiciones de alimentación que previenen la enfermedad cuando los cerdos consumen piensos contaminados.

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Estrategias de bioseguridad frente a virus porcinos en los piensos

VIROLOGÍA

A continuación, se resume el estado actual de los conocimientos sobre:

1

2 3 4 5 6

La necesidad de protocolos de bioseguridad para identificar las condiciones de producción, procesamiento, almacenamiento y transporte que pueden causar la contaminación por virus de los ingredientes de piensos y piensos completos.

Los retos de determinar la inactivación de los virus.

La supervivencia de los virus en los ingredientes para piensos durante el transporte y el almacenamiento.

Las dosis infectiva mínima.

Inactivación de virus porcinos mediante procesos térmicos y de irradiación, y atenuantes químicos en los ingredientes y piensos.

Eficacia de las estrategias de descontaminación vírica en fábricas de piensos.

CONDICIONES DE PRODUCCIÓN, PROCESAMIENTO, ALMACENAMIENTO Y TRANSPORTE QUE PUEDEN CAUSAR CONTAMINACIÓN VÍRICA EN INGREDIENTES Y PIENSOS La bioseguridad de las explotaciones porcinas es un componente esencial para prevenir la introducción y propagación de los patógenos causantes de enfermedades foráneas y endémicas, así como para mantener un alto nivel sanitario que optimice la productividad.

En este sentido, se han desarrollado directrices internacionales de bioseguridad encaminadas a minimizar la exposición de los animales a peligros externos que son rutas potenciales de transmisión de patógenos19.

Sin embargo, los protocolos de bioseguridad de las cadenas de suministro de piensos no se han incluido de forma rutinaria en los planes generales de bioseguridad de las explotaciones porcinas, a pesar de que los piensos son uno de los principales insumos externos y presentan cierto riesgo inherente de contaminación y transmisión de patógenos a las explotaciones.

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BIOSEGURIDAD

Las instalaciones de fabricación de piensos son un punto de recogida, almacenamiento, dosificación, mezcla y procesamiento de diversos tipos de ingredientes procedentes de muchas regiones antes de que los piensos acabados se suministren a múltiples granjas.

Por tanto, la bioseguridad de las fábricas de piensos debe ser una parte integral del programa general de bioseguridad de las explotaciones porcinas para prevenir la introducción de patógenos.

Cochrane et al.20 describieron los componentes clave del desarrollo de planes de bioseguridad para fábricas de piensos que incluyen: Análisis de peligros: implica la identificación y evaluación de peligros potenciales en los pasos del proceso utilizados en la producción de ingredientes de piensos.

Mitigación de peligros: incluye pasos para prevenir la entrada de peligros durante la recepción.

Mecanismos para evaluar la calidad, la seguridad y los procedimientos de bioseguridad utilizados por los proveedores en la producción de ingredientes, incluida la auditoría y la verificación de que se siguen los protocolos.

Protocolos de diseño y mantenimiento de las instalaciones que impidan o reduzcan la introducción de agentes patógenos.

Procedimientos rutinarios de limpieza que prevengan o reduzcan adecuadamente la introducción de patógenos.

Elaboración y aplicación de Procedimientos Operativos Normalizados (PONs) y programas de vigilancia de la bioseguridad que incluyan el abastecimiento, la recepción y el almacenamiento de ingredientes.

Desarrollo y aplicación de protocolos de bioseguridad e higiene personal para visitantes, empleados y conductores con el fin de controlar el acceso a las instalaciones.

Utilización de prácticas de fabricación eficaces para mantener los protocolos de bioseguridad de la instalación.

Transporte bioseguro de los piensos acabados utilizando contenedores sellados y prácticas de desinfección.

Introducción a través de las personas.

TRANSPORTE BIOSEGURO

Contaminación cruzada durante la producción, la carga y la entrega.

El transporte suele pasarse por alto en los protocolos de bioseguridad.

Sin embargo, los camiones, el calzado de los conductores, las bolsas y los contenedores han sido identificados como la principal vía de transmisión de patógenos asociados a los piensos en varios estudios3,7,8,11.

Uso de tratamientos térmicos.

Uso de tratamientos químicos aprobados.

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Si bien, los procedimientos de bioseguridad pueden variar en función del tipo de pienso producido, de la situación sanitaria del país o región donde se encuentre la instalación de fabricación de piensos y del origen de los ingredientes utilizados en la instalación, todo plan de bioseguridad para una instalación de fabricación de piensos debe incluir:

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LA LIMPIEZA, DESINFECCIÓN Y CALENTAMIENTO DE LOS CAMIONES UTILIZADOS PARA EL TRANSPORTE DE PIENSOS DEBEN SER PRÁCTICAS ESENCIALES EN LOS PROTOCOLOS DE BIOSEGURIDAD DE LA CADENA DE SUMINISTRO DE PIENSOS

Estrategias de bioseguridad frente a virus porcinos en los piensos

VIROLOGÍA

Los desinfectantes utilizados para inactivar bacterias pueden no ser eficaces para inactivar virus resistentes al medio ambiente, como el VPPA. Por ello, se ha evaluado la eficacia de varios desinfectantes para inactivar el virus de la PPA en diversas superficies ambientales84.

El tiempo y la temperatura mínima de calentamiento de los vehículos de transporte han sido evaluados por van Kessel et al.21, observándose la inactivación completa de varios virus y bacterias cuando se calentaron a 75 °C durante un mínimo de 15 minutos. Sin embargo, la presencia de materia fecal requirió tiempos de calentamiento más largos para lograr la inactivación completa de los patógenos.

Los componentes clave de los protocolos de transporte bioseguro son: Documentación que verifique que las instalaciones de fabricación y almacenamiento en el país de origen han sido descontaminadas.

Utilización de vías de circulación unidireccionales para los vehículos y contenedores sucios para impedir que se crucen con vehículos y contenedores vacíos, limpios y desinfectados con desinfectantes aprobados y eficaces.

Provisión de instalaciones de lavado y desinfección, debiendo exigirse su uso para todos los camiones y equipos utilizados para el transporte de piensos.

Después de la desinfección, carga y precinto de los recipientes de transporte en las instalaciones de fabricación antes de su transporte al lugar de destino.

Una vez cargados y sellados los ingredientes, asegurar que la entrada de los camiones al destino de entrega se realice por una entrada “limpia”.

Tras la descarga, registrar el tiempo y las condiciones de temperatura del transporte, teniéndolos en cuenta a la hora de estimar los tiempos de espera necesarios durante el almacenamiento en el lugar de destino.

Al llegar al destino, únicamente utilizar camiones vacíos, limpios y desinfectados para transportar ingredientes a granel para su cuarentena en un almacén temporal calefaccionado.

En el caso de los ingredientes en bolsas, utilizar paletas nuevas o debidamente limpias y desinfectadas.

Provisión a los usuarios finales de documentación sobre las condiciones de almacenamiento y los tiempos de retención de cada lote de cada ingrediente para piensos.

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BIOSEGURIDAD

DETERMINACIÓN DE LA INACTIVACIÓN DE LOS VIRUS MUESTREO La determinación precisa de las concentraciones de virus en los ingredientes para piensos comienza con la recogida de muestras representativas, pero los virus en piensos contaminados pueden no estar distribuidos uniformemente y estar presentes en bajas concentraciones.

Sin embargo, no se han validado métodos de muestreo para la recogida de muestras representativas de piensos para el análisis de virus.

Jones et al.23 inocularon muestras de harina de soja con 103 DICT50/g o 105 DICT50/g de PEDV y recogieron muestras mediante sondas individuales o muestreo combinado.

Encontraron que las muestras combinadas eran más sensibles para detectar ARN viral que las sondas y sugirieron la obtención de un mínimo de 10 submuestras para generar una muestra combinada para el análisis.

Elijah et al.24 evaluaron el uso de un procedimiento de muestreo de “patrón de doble X” para recoger submuestras con el fin de determinar las concentraciones del virus de la PPA en ingredientes a granel utilizando el procedimiento descrito por Jones et al.23 y también sugirieron que la recogida de 10 submuestras era necesaria para obtener resultados precisos.

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VIABILIDAD DE LOS VIRUS

INFECTIVIDAD DE LOS VIRUS

Las pruebas analíticas existentes para la detección precisa de partículas virales viables en los ingredientes de los piensos también plantean numerosos problemas25, ya que determinar la viabilidad de los virus representa un estándar de cuantificación que va más allá de la simple detección de ácidos nucleicos mediante PCR.

Las pruebas de infectividad no son del todo fiables y pueden generar datos erróneos ya que las partículas víricas necesitan interactuar con las células hospedadoras para completar el proceso de replicación y esta interacción puede dar lugar a una diversidad de cambios en la fisiología celular con el fin de producir la progenie viral. Por lo tanto, el término “infección” se utiliza generalmente para referirse a la producción de nuevas partículas víricas.

SI SE PUEDE ACABAR CON LA VIABILIDAD DEL VIRUS SE EVITARÁ SU INFECTIVIDAD

Dado que los métodos más comunes de cuantificación de virus se basan en la observación de la muerte celular, la infectividad se mide por la muerte celular observada.

Sin embargo, los virus pueden entrar en una célula, replicarse y provocar cambios en la fisiología celular, produciendo progenie pero que se produzca una muerte celular observable. En este caso, el virus podría clasificarse como viable pero no infeccioso26.

Para poder cuantificar con precisión la cantidad de partículas víricas viables capaces de causar infección si son ingeridas por los cerdos los métodos específicos de diagnóstico de virus deben tener25: Alta especificidad: capacidad para identificar con precisión los resultados negativos.

Alta sensibilidad: capacidad para identificar con precisión los resultados positivos.

Estrategias de bioseguridad frente a virus porcinos en los piensos

VIROLOGÍA

EL SESGO DE LA PCR A pesar de que las pruebas qPCR convencionales se utilizan habitualmente para determinar la cantidad de copias de ácido nucleico viral (ARN o ADN) por unidad de volumen o peso en una muestra de pienso, se corre el riesgo de malinterpretar sus resultados.

Los estudios de investigación suelen proporcionar valores Ct (ciclo umbral), que es el número de ciclos de PCR necesarios para detectar ARN o ADN viral, momento en el que los resultados pasan de negativos (no detectables) a positivos (detectables).

PARA LA CUANTIFICACIÓN, SOLO LOS VALORES DE CT INFERIORES A 35 SE CONSIDERAN FIABLES Aunque existe una relación entre los valores de Ct y la cantidad de virus en una muestra, no son equivalentes porque muchas variables analíticas y de obtención de muestras de piensos afectan a estos valores.

VARIABLES RELACIONADAS CON LA OBTENCIÓN DE MUESTRAS DE PIENSOS Obtención de una muestra representativa.

VARIABLES RELACIONADAS CON EL ANÁLISIS Eficacia de la extracción de ácidos nucleicos.

Tiempo de recogida tras la contaminación.

Cantidad de ácidos nucleicos virales en las muestras.

Tipo de matriz del ingrediente del pienso.

Diseño de secuencias de cebadores/sondas.

Concentración de ácidos nucleicos en la muestra.

Eficacia química del ensayo.

Condiciones de almacenamiento y transporte de la muestra antes de la prueba.

Método para determinar el valor Ct.

Por otro lado, las pruebas qPCR: No distinguen entre el ADN libre de virus dañados y el ADN de partículas víricas viables intactas.

No evalúan la infectividad del virus.

No siempre se correlacionan con las concentraciones víricas.

Para algunos virus, las metodologías de PCR se han modificado para crear pruebas de PCR de viabilidad que distinguen entre ADN viable y libre en las muestras de piensos27. Sin embargo, dependiendo del virus, la viabilidad no siempre equivale a infectividad28.

Asimismo, dado que los valores Ct son específicos de cada prueba, la comparación de los valores Ct puede dar lugar a interpretaciones erróneas.

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BIOSEGURIDAD

DETERMINACIÓN DE LA INFECTIVIDAD UE BDAES ADEI S ALIAS M L AI MIE N T OVVIIR L P R U EPBRAS E N TO R AA L Las pruebas de aislamiento viral se utilizan con frecuencia en estudios de investigación14 para evaluar su infectividad en cultivos celulares, pero no permiten inferir su infectividad si son ingeridos por cerdos29.

HEAMDASDOS RORCCIÓN P R U EPBRAUEDBEA HDE EM IÓN La prueba de hemadsorción (HAD50/ml) es comúnmente utilizada para calcular las concentraciones de virus mediante la incubación de una suspensión de glóbulos rojos con un cultivo celular infectado para medir el 50% de las réplicas que muestran la cantidad de hemadsorción de virus/ml de sangre30. Sin embargo, este método no ha demostrado ser suficientemente sensible para el diagnóstico definitivo del VPPA31.

DDIC I C TT 55 00 El ensayo más común para evaluar la infectividad de los virus es la determinación de la dosis infecciosa en cultivo de células 50% (DICT50)/g de muestra, que mide la cantidad de virus capaz de infectar el 50% de las réplicas en cultivo celular, pero esta técnica tampoco permite inferir directamente la infectividad en los cerdos.

E NO S AYO T UCIÓN E N S AY S DSE DE S USSUTSI TTIU CIÓN Recientemente, se han desarrollado ensayos de sustitución para algunos virus porcinos y, aunque resultan prometedores desde el punto de vista de la rentabilidad y la rapidez, aún no se han implementado de forma generalizada y, por tanto, no se han probado para garantizar que su sensibilidad y aplicabilidad a la hora de evaluar la infecciosidad de los virus específicos que pretenden simular sean aceptables.

N SOAYO C ERRDDO S B I O E BIOE N S AY S CSOCNONC E OS Los bioensayos con cerdos se han utilizado en algunos estudios85 para confirmar que los resultados positivos de PCR en muestras de piensos son capaces de causar infección, pero su aplicabilidad está limitada ya que requieren el uso de instalaciones para animales con un alto nivel de bioseguridad, son caros y su realización requiere mucho tiempo, además de que pueden no proporcionar resultados fiables y consistentes25.

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Estrategias de bioseguridad frente a virus porcinos en los piensos

VIROLOGÍA

¿QUÉ ENTENDEMOS POR INACTIVACIÓN? Es importante interpretar con precisión los resultados de los estudios de inactivación de virus.

El término “inactivación completa” de los virus debe evitarse porque presupone un riesgo 0 de infección en los cerdos que consumen piensos originalmente contaminados, algo que no es posible25.

Aunque se han realizado estudios para estimar las dosis infecciosas mínimas de diversos virus porcinos capaces de provocar enfermedad, hay incoherencias debido a la imprecisión de las actuales pruebas diagnósticas, lo que, unido a la necesidad de tener en cuenta el número de animales de una población que pueden estar expuestos, dificultan la labor de determinar la probabilidad de que se produzca un brote de la enfermedad.

Los datos de inactivación en los ingredientes de los piensos se describen a menudo como una reducción del 99,9% de los virus, lo que corresponde a una reducción de 3-log o 103 a partir de la concentración inicial y NO DEBE INTERPRETARSE COMO UN 0,1% DE PARTÍCULAS VIRALES QUE PERMANECEN EN LA MUESTRA. Dependiendo de la concentración inicial de virus, una reducción del 99,9% a través de tratamientos térmicos o químicos aún podría sobrepasar la dosis infecciosa mínima para un pienso contaminado y potencialmente resultar en una infección.

Existen limitaciones sustanciales entre los diversos ensayos de detección de virus, lo que dificulta la comparación de resultados y la evaluación precisa de la viabilidad e infectividad de los virus en los ingredientes y piensos.

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BIOSEGURIDAD

SUPERVIVENCIA DE LOS VIRUS EN LOS INGREDIENTES PARA PIENSOS DURANTE EL TRANSPORTE Varios estudios han evaluado la supervivencia de virus en ingredientes de piensos bajo diversos tipos de condiciones de transporte.

Un estudio inicial realizado por Dee et al.14 evaluó 6 ingredientes inoculados experimentalmente con virus porcinos (incluyendo VPPA, VPPC, PEDV, SVA y VPRRS), y almacenados bajo condiciones de temperatura y humedad relativa que simulaban condiciones de transporte transatlántico de 30 días o transpacífico de 37 días.

Se detectaron partículas virales infecciosas de: SVA, VPPA, PEDV y VPRRS en harina de soja convencional.

VPPA y PEDV en harina de soja orgánica.

SVA y PEDV en DDGS. SVA y PEDV en L-lisina HCl. SVA, VPPA y PEDV en cloruro de colina.

Estos resultados indican que los virus sobreviven en los piensos en condiciones simuladas de transporte transoceánico, pero esta supervivencia varía entre los virus y las matrices de los ingredientes de los piensos.

LA HARINA DE SOJA CONVENCIONAL PARECE TENER PROPIEDADES QUÍMICAS Y FÍSICAS QUE FAVORECEN LA SUPERVIVENCIA DE LA MAYORÍA DE LOS VIRUS También se han realizado simulaciones del transporte de larga distancia por camión de ingredientes para piensos inoculados con virus.

Por ejemplo, Dee et al.32 realizaron un estudio para determinar si el VPRRS, el PEDV y el SVA viables e infecciosos sobrevivirían a un transporte comercial en camión de 21 días durante más de 9.000 km tras su inoculación en harina de soja orgánica y convencional, cloruro de L-lisina, cloruro de colina y vitamina A. Todos los virus se mantuvieron infectantes en la harina de soja, mientras que el SVA infeccioso se encontró, además, en el cloruro de L-lisina y en la vitamina A. Los resultados de estos y otros estudios14-16,86-88 ponen de manifiesto que el tiempo, la temperatura y la humedad relativa del transporte transoceánico y en camiones no reducen la viabilidad e infectividad de los virus porcinos.

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Estrategias de bioseguridad frente a virus porcinos en los piensos

VIROLOGÍA

SUPERVIVENCIA DE LOS VIRUS EN LOS INGREDIENTES PARA PIENSOS DURANTE EL ALMACENAMIENTO CONDICIONES DEL ALMACENAMIENTO A pesar de que se ha demostrado que los tiempos de almacenamiento prolongados son una forma sencilla y eficaz de reducir las concentraciones de virus en los ingredientes y piensos cuando están contaminados, existen varios aspectos que deben tenerse en cuenta: Las instalaciones de almacenamiento representan un coste significativo, por lo que se requiere una rotación frecuente del inventario para minimizar los costes de adquisición de ingredientes y de fabricación de piensos.

Dependiendo del tiempo, la temperatura y las condiciones de humedad relativa de los distintos tipos de almacenamiento de piensos y de las características fisicoquímicas (por ejemplo, el contenido de humedad y la actividad del agua) de sus ingredientes, pueden producirse importantes problemas de seguridad de los piensos y pérdidas en el valor nutricional de los ingredientes.

Las altas temperaturas y humedad favorecen la proliferación de bacterias y mohos, y la producción de micotoxinas, lo que puede ser perjudicial para la salud y rendimiento de los animales.

Estas mismas condiciones también pueden provocar pérdidas significativas de calidad y valor nutricional debido a la reducción de la digestibilidad de las proteínas y los aminoácidos, la producción de productos secundarios de oxidación lipídica y la pérdida de potencia vitamínica.

Al utilizar esta estrategia de mitigación, debe tenerse en cuenta la necesidad de mantener un equilibrio entre un tiempo mínimo de almacenamiento para reducir costes y preservar el valor nutricional y un tiempo adecuado para una inactivación significativa de los virus.

Numerosos estudios17,18,33,34,36,37,38, han evaluado múltiples ingredientes y han mostrado claras diferencias en la supervivencia e inactivación de los virus porcinos en función del ingrediente, tiempo y temperatura, lo que implica que se necesitan diferentes recomendaciones para diferentes virus y diferentes tipos de ingredientes.

ES NECESARIO ESTABLECER UNA DEFINICIÓN ESTÁNDAR DE INACTIVACIÓN ACEPTABLE DE VIRUS BASADA EN LA CAPACIDAD DEL VIRUS RESIDUAL PARA CAUSAR INFECCIÓN

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BIOSEGURIDAD

FRECUENCIA DE CONSUMO DEL PIENSO CONTAMINADO La probabilidad de que un ingrediente contaminado con virus cause infección no solo depende de la concentración inicial de virus inoculado y del posterior nivel de inactivación y pérdida de infectividad durante el almacenamiento, sino que también depende de la frecuencia de consumo de pienso contaminado (es decir, una vez frente a múltiples eventos de alimentación)35,40 que superen las dosis infectivas mínimas de cada virus.

CARACTERÍSTICAS QUÍMICAS Y ESTRUCTURALES DE LOS INGREDIENTES La actividad del agua (aw) ha demostrado ser un factor determinante de la resistencia térmica de los patógenos bacterianos en los alimentos41, y los valores inferiores a 0,60 suelen considerarse adecuados para prevenir el crecimiento de bacterias y moho en los alimentos42.

Por su parte, Hemmingsen et al.43 señalaron que la harina de soja molida gruesa tiene mayor actividad de agua que la harina de soja molida fina, al igual que la cebada, torta o maíz molidas gruesa o finamente. Estos resultados sugieren que el tamaño de las partículas afecta a la actividad del agua de los ingredientes.

En vista de los resultados de estos y otros estudios38,89, es necesario seguir investigando para comprender los efectos relativos de las distintas características físicas y químicas de los ingredientes sobre la supervivencia de los virus porcinos, algo que podría ser útil para desarrollar modelos capaces de predecir las tasas de inactivación en distintas condiciones de tiempo y temperatura de las diferentes matrices de los piensos.

DOSIS INFECTIVA MÍNIMA Las estimaciones de las dosis infectivas mínimas (DIM) de varios virus porcinos se han determinado mediante el consumo de piensos inoculados o la inoculación oral directa en cerdos (Tabla 1).

Virus

TABLA 1

Resumen de las estimaciones de las dosis infectivas mínimas (DIM) de virus porcinos tras el consumo de piensos inoculados o la inoculación oral directa en cerdos.

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Dosis Infectiva Mínima

Referencia

Virus de la Peste Porcina Africana (VPPA)

104 >105,0 TCID50/cerdo

10, 46

Virus de la Peste Porcina Clásica (VPPC)

104,2 TCID50 - 105,5 TCID50 dependiendo de la cepa

44

Virus de la Fiebre Aftosa (VFA)

106,2 TCID50 - 107 TCID50 dependiendo de la cepa 105,5 TCID50/ml

35,47

Virus de la Diarrea Epidémica Porcina (PEDV)

105,6 TCID50/g

48

Virus del Síndrome Respiratorio y Reproductivo Porcino (VPRRS)

105,3 TCID50

49

Senecavirus A (SVA)

103,1 TCID50/ml para neonatos, 102,5 TCID50/ ml cerdos de peso de venta

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Estrategias de bioseguridad frente a virus porcinos en los piensos

VIROLOGÍA

La DIM no puede interpretarse como una concentración en la que un producto, si está contaminado, se considera seguro, o la concentración segura a partir de la cual no se producirá ninguna infección.

Estos valores solo representan la concentración mínima en la que, en las condiciones de los experimentos, ningún animal presentó signos de infección. De hecho, los animales podrían desarrollar la enfermedad si un número mayor de ellos estuviera expuesto a piensos contaminados.

Este hecho queda patente en el estudio realizado con pollitos donde se demostró que la alimentación con dietas sin niveles detectables de Salmonella en los piensos puede, aun así, provocar una infección cuando son ingeridos50.

Este fenómeno es posible debido a que la probabilidad de infección y el riesgo de transmisión de la enfermedad aumentan con el incremento de la exposición al patógeno, lo que implica que se debe tener en cuenta la mayor frecuencia de consumo de pienso que se produce en las explotaciones porcinas comerciales en comparación con las pequeñas infecciones experimentales.

ES IMPORTANTE INTERPRETAR CUIDADOSAMENTE LOS DATOS SOBRE DOSIS INFECCIOSAS Y FRECUENCIA DE CONSUMO DE PIENSOS CONTAMINADOS

INACTIVACIÓN DE VIRUS PORCINOS MEDIANTE PROCESOS TÉRMICOS Y DE IRRADIACIÓN DE INGREDIENTES PARA PIENSOS TRATAMIENTOS TÉRMICOS El tratamiento térmico puede ser un método eficaz para inactivar bacterias, virus y parásitos, dependiendo de la temperatura y la duración2, habiéndose demostrado su eficacia para inactivar completamente varios virus, incluyendo el VPPA, el VPPC y el VFA en matrices de productos cárnicos39.

La mayoría de los estudios realizados con ingredientes y piensos completos han evaluado la eficacia del tratamiento térmico para la inactivación del PEDV. Las temperaturas superiores a 130 °C han demostrado ser eficaces para reducir la supervivencia del PEDV en diversas matrices38,51 .

El tiempo y la temperatura utilizados durante el secado por pulverización de la proteína plasmática también resultaron eficaces para inactivar completamente el virus52.

Las temperaturas de acondicionamiento y peletización superiores a 54 °C fueron eficaces para reducir la cantidad y la infectividad del PEDV en los piensos para cerdos53.

83

BIOSEGURIDAD

TRATAMIENTOS DE IRRADIACIÓN Varios estudios han demostrado que la irradiación ultravioleta es un paso adicional de bioseguridad eficaz para inactivar aún más varios virus porcinos con envoltura (VPRRS, PEDV, SVA y VPPC) y sin envoltura durante el proceso de secado por atomización del plasma porcino líquido54.

En general, mostraron que los virus con envoltura son más sensibles a la irradiación ultravioleta C que los virus sin envoltura, pero la infectividad se reduce en al menos 4 logs. Además, aunque el secado por atomización inactiva eficazmente a VPPA y VPPC, la irradiación ultravioleta C durante el proceso de secado por atomización puede proporcionar una inactivación adicional de VPPA con una reducción de más de 4 log DICT50/ml55.

Los resultados de estos y otros estudios36,38,52,53,54,90,91,92 muestran que diversos tratamientos térmicos de tiempo y temperatura son eficaces para reducir, al menos parcialmente, las concentraciones virales en todas las matrices de piensos, pero la magnitud de la reducción varía considerablemente entre los tipos de ingredientes evaluados, los procesos térmicos utilizados, las concentraciones iniciales de virus, la sensibilidad o resistencia térmica del virus y el método de detección.

Como resultado, se necesitan estrategias adicionales de mitigación, como atenuantes químicos, para lograr mayores garantías de inactivación del virus en ingredientes y piensos para cerdos.

INACTIVACIÓN DE VIRUS PORCINOS MEDIANTE ATENUANTES QUÍMICOS EN INGREDIENTES PARA PIENSOS Se han realizado pocos estudios sobre la eficacia de distintos aditivos con propiedades atenuantes para inactivar el VPPA56,57, el VFA35, el PDCoV58, el VPRRS y el SVA59. La mayoría de los estudios sobre atenuantes químicos se han centrado en la eficacia de la inactivación del PEDV en ingredientes de piensos y piensos completos51,59-67.

En general, los resultados de estos estudios han demostrado que la mayoría de los aditivos para piensos evaluados aportan algún beneficio en la reducción de las concentraciones de virus porcino, que a menudo se basa en una reducción de las concentraciones de ácido nucleico a partir del análisis PCR. En el futuro será necesario realizar estudios para evaluar la eficacia de diversas combinaciones de tiempo y temperatura de almacenamiento prolongados, procesamiento térmico y por irradiación, y atenuantes químicos en la inactivación de diversos virus porcinos en diferentes matrices de ingredientes para piensos.

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Estrategias de bioseguridad frente a virus porcinos en los piensos

VIROLOGÍA

EFICACIA DE LAS ESTRATEGIAS DE DESCONTAMINACIÓN VÍRICA EN FÁBRICAS DE PIENSOS A pesar de usar protocolos de bioseguridad bien diseñados y aplicados en las fábricas de piensos, puede producirse contaminación con patógenos en las superficies de contacto con los piensos y fuera de ellas si se introducen ingredientes de piensos contaminados22,68.

Dada la interconexión entre las fábricas de piensos individuales que sirven a múltiples granjas en grandes áreas geográficas, puede originarse una fuente potencial adicional de transmisión de patógenos a través de fómites asociados con el personal, los vehículos y los equipos de fabricación y entrega de piensos.

Las estrategias de bioseguridad y mitigación para reducir el riesgo de contaminación por patógenos bacterianos y víricos en las fábricas de piensos se han evaluado y resumido basándose en un número limitado de estudios20,69. Las estrategias evaluadas incluyen: Los tiempos de retención prolongados durante el almacenamiento.

La reducción mecánica de la concentración de virus.

La limpieza química y la desinfección de superficies.

El procesamiento térmico y la irradiación.

La adición de aditivos y acidificantes para piensos contaminados con virus.

A este respecto, se han llevado a cabo numerosos estudios53,60,70-83, pero la eficacia limitada de las estrategias de descontaminación en las fábricas de piensos en el escaso número de estudios realizados pone de relieve la necesidad de cumplir protocolos estrictos de bioseguridad de la cadena de suministro de piensos para la prevención, ya que una vez que una fábrica de piensos se contamina con virus, es difícil eliminarlos completamente.

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VACUNACIÓN

CONCLUSIONES En comparación con otras vías de transmisión del virus, los piensos y sus ingredientes parecen contribuir menos a la transmisión de enfermedades, pero debido a la falta de un sistema de seguimiento y vigilancia, existe una gran incertidumbre sobre el alcance de la contaminación por virus porcinos en las cadenas mundiales de suministro de piensos.

Es necesario desarrollar e implementar protocolos de bioseguridad para mejorar nuestra capacidad de prevenir la contaminación y transmisión de virus asociada a la producción, procesamiento, almacenamiento y transporte de alimentos para cerdos.

Los componentes clave de los protocolos de bioseguridad de los piensos deben incluir prácticas de mitigación eficaces, como tiempos de almacenamiento prolongados, procesamiento térmico y por irradiación, y atenuantes químicos para garantizar la inactivación de los virus porcinos viables si están presentes.

Existen numerosos retos que deben superarse para mejorar nuestra capacidad de predecir con exactitud si los piensos contaminados con virus porcinos son capaces de causar una infección, incluidas las limitaciones de los métodos analíticos actuales para determinar la inactivación, viabilidad e infectividad de los virus en los piensos.

Artículo traducido y adaptado de: Shurson, G.C.; Urriola, P.E.; Schroeder, D.C. Biosecurity and Mitigation Strategies to Control Swine Viruses in Feed Ingredients and Complete Feeds. Animals 2023, 13, 2375 (CC BY 4.0).

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Nº 9 | Octubre 2023

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Estrategias de bioseguridad frente a virus porcinos en los piensos

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