HbA1c Directo Plus by GT Lab

AVANCE Publicación de contenido científico editada por GT Laboratorio S.R.L.

HbA1c

Método Directo para determinar Hemoglobina A1c Inmunoturbidimetría exaltada por látex

Directo Plus

GT Lab ha introducido un sistema de detección directa de la hemoglobina A1c (HbA1c) que permite realizar la medición sin necesidad de determinar la hemoglobina total, consecuentemente empleando un solo canal en los analizadores automáticos. El método emplea anticuerpos monoclonales y una exaltación de la respuesta inducida por partículas de látex. La primer etapa de la reacción se basa en la unión inespecífica de las proteínas a las partículas de látex. En la segunda fase de la reacción actúan anticuerpos anti humanos altamente específicos que permiten la determinación directa de la HbA1c por turbidimetría. Los reactivos son presentados en forma líquida estables, los que pueden emplearse en analizadores capaces de usar dos reactivos por método. Si bien se proveen cuatro calibradores para cubrir todo el rango útil de la determinación, la notable linealidad del método permite trabajar rutinariamente con dos. Algunos analizadores permiten la realización totalmente automatizada de la determinación sin siquiera necesitar el paso de hemólisis.

HbA1c DIRECTO PLUS

INTRODUCCIÓN La HbA1c se forma por conjugación no enzimática de la glucosa al terminal N de la cadena beta de la hemoglobina durante la vida de los eritrocitos, reflejando la concentración media de glucosa en ese período, sirviendo como control en individuos diabéticos. La glucohemoglobina ha sido definida como la fracción rápida que eluye primero en columnas cromatográficas, fracción que incluye HbA1a, HbA1b y HbA1c. El presente método emplea una reacción inmunológica que determina directamente la HbA1c. Hasta la publicación del Estudio de Cuidado y complicaciones de la Diabetes (DCCT por su nombre en inglés: Diabetes Care and Complications Trial) en EEUU en 1993, la idea de un mejor control de la glicemia fue solamente una teoría. Este estudio comparó pacientes que tenían una terapia intensa con los que recibían un cuidado convencional de su diabetes tipo 1. El estudio determinó que aquellos mantenían un nivel menor de glicemia y niveles significativamente menores de HbA1c. Luego, estos pacientes demostraron tener valores de morbilidad y mortalidad mejores que los que habían recibido cuidados convencionales, reduciendo los niveles de retinopatías, nefropatías y neuropatías entre un 40 y un 75%. Así, los niveles de HbA1c fueron establecidos como un indicador crítico del control de glicemia en el largo plazo en pacientes con diabetes Tipo 1. A posteriori de la publicación de la DCCT, el Programa Nacional de Estandarización de la Glucohemoglobina de los EEUU (NGSP por su nombre en inglés: National Glycohemoglobin Standardization Program) estableció los intentos por estandarizar los resultados obtenidos por los diferentes métodos disponibles, refiriéndolos al empleado por el DCCT. Esto produjo una exitosa disminución en el bias entre métodos. Recientemente, la International Federation of Clinical Chemistry (IFCC) desarrolló y aprobó el método de referencia para la determinación de HbA1c. Se ha notado una diferencia entre los métodos de la IFCC y de la DCCT. Actualmente, la IFCC y el DCCT están trabajando en conjunto para proveer al los médicos y a los fabricantes de reactivos con recomendaciones actualizadas sobre la determinación

proporcional a la concentración de HbA1c en la muestra, la que puede cuantificarse por comparación con los resultados obtenidos con una curva de calibración. El anticuerpo antiHbA1c empleado está dirigido específicamente al residuo 2-deoxifructosa-valina de la HbA1c, epitope Fruc-VHLTPEK. COMPOSICIÓN DE LOS REACTIVOS PROVISTOS Lisante: azida de sodio 7 mmol/l. Listo para usar. R1: suspensión de partículas de látex 0.13%. R2a: buffer de glicina 80 mmol/l, pH 7.3. R2b: solución de anticuerpo monoclonal de ratón contra HbA1c y anticuerpo policlonal de cabra anti IgG de ratón en buffer glicina 20 mmol/l, pH 7.1. HbA1c Calibradores y Controles (provistos separadamente por GT Lab): Sangre humana liofilizada con concentración indicada en los rótulos del envase. PREPARACION DE LOS REACTIVOS DE TRABAJO R2T: este paso es crítico para el correcto funcionamiento del reactivo. Trasvase una pequeña porción de R2a (aproximadamente 1-1.5 ml) al envase de R2b, cierre nuevamente el envase y mezcle por inversión suavemente. Vuelque todo el contenido del frasco de R2b dentro del R2a, empleando pequeñas porciones de la mezcla R2T resultante para arrastrar restos que pudieran quedar en el frasco R2b. Calibradores: agregue 0.5 ml de agua destilada o deionizada CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD Kit de HbA1c: Conserve refrigerado (2-8ºC) sin congelar. La estabilidad alcanza la fecha de vencimiento indicada en la caja. R2T: 30 días refrigerado (2-8ºC). Calibradores: 30 días refrigerado (2-8ºC) o 6 meses congelado (-20ºC). MUESTRA Sangre. No es necesaria preparación alguna del paciente ni estar en ayunas. Obtenga la muestra de la manera usual empleando EDTA como anticoagulante. Homogeneice la muestra por inversión suave antes de ensayar. Nota: Algunos analizadores de química pueden ser programados para realizar el paso de la hemólisis en el instrumento mismo, proveyendo una alternativa de trabajo totalmente automatizada. El ejemplo aplicado a Hitachi puede verse al final de la presentación.

PRINCIPIO Nuestro método emplea una reacción antígena anticuerpos para determinar directamente el porcentaje de HbA1c en sangre humana. Tanto la hemoglobina total como la HbA1c tienen la misma tasa de absorción sobre partículas de látex, lo que da sustento a la primera reacción, producida al poner en contacto la muestra con el reactivo R1. Al agregar el reactivo R2, que contiene anticuerpo monoclonal anti–HbA1c de ratón, se forma un complejo látex-HbA1c-anticuerpo que es aglutinado por un anticuerpo de cabra anti-ratón, también contenido en R2. Resulta así el desarrollo de turbidez que es

VALORES DE REFERENCIA Pacientes no diabéticos: <6% Pacientes diabéticos controlados: <7% Cada laboratorio debe establecer su propio rango de valores normales. EVALUACIÓN DE DESEMPEÑO DE HBA1C DIRECTO PLUS Estudio de comparación Se realizó un estudio comparando los resultados obtenidos 3

HbA1c DIRECTO PLUS

con el presente método y un método comercial basado en HPLC. Se emplearon 30 muestras suministradas por un laboratorio que efectúa la determinación, con un rango de valores de 4.7-11.8%. El método HbA1c Directo Plus fue realizado en un Olympus AU400, empleado sangre entera como muestra y lisando directamente en el instrumento. Se obtuvo un coeficiente de correlación de 0.992 y una ecuación de regresión y = 0.86 x + 0.32. Los resultados se muestran en la TABLA I y están graficados en el GRAFICO I. Otro experimento se hizo sobre 24 muestras en un Hitachi 717 a los efectos de comparar la hemólisis efectuada en el aparato y como pretratamiento. Se obtuvo un coeficiente de correlación de 0.985 y una ecuación de regresión y = 0.98 x + 0.34 en un rango de valores de 4.4-10.4% (Tabla II y Gráfico II).

moglobinas F y E no han mostrado aun resultados suficientes para sacar conclusiones. Los datos obtenidos se muestran en las tablas V, VI y VI y en los gráficos III, IV y VII respectivamente. ESTUDIO DE LINEALIDAD El rango útil de linealidad de HbA1c Directo Plus se estableció a partir de una muestra comercial preparada para dar 25% HbA1c por HPLC, provista por Sandare Chemical of DeSoto, Texas.) El estudio arrojó un rango de uso de 2-16%. Los resultados se muestran en la TABLA IX. ESTABILIDAD DE LOS REACTIVOS, CALIBRADORES Y CONTROLES La vida útil de los reactivos HbA1c Directo Plus, medida en tiempo real, demostró ser de 18 meses en refrigeración. Del mismo modo, los Calibradores y Controles demostraron una estabilidad de 24 meses refrigerados.

ESTUDIOS DE PRECISIÓN La precisión del método GT Lab se evaluó empleando los Controles de HbA1c Directo Plus como muestra y de acuerdo a la modificación del protocolo EP5-T2 del National Clinical Controls and Laboratory Standards (NCCLS). La evaluación de precisión en el día se realizó corriendo dos muestras en duplicado 20 veces en el mismo día. La evaluación día a día se efectuó procesando dos muestras durante 20 días. Las determinaciones se efectuaron en un Hitachi 917 con hemólisis en el aparato. Los resultados obtenidos son los que se muestran seguidamente. En el día (n=20) Media..... 4.66 10.4 D.S..........0.06 0.13 C.V.%.......1.29 1.25

ESTABILIDAD DE CALIBRACIÓN DEL INSTRUMENTO La estabilidad de la calibración depende del instrumento, ya que es función de sus características específicas. Por ejemplo, el Beckman Coulter Cx tiene un sistema de medida basado en dos puntos de lectura. Estos sistemas tienen una estabilidad de calibración de 7 a 10 días. Los analizadores Hitachi, por su parte, toman solamente un punto de lectura al final de la reacción. Esto les da una estabilidad de calibración de 21 a 28 días. ADAPTACIONES A INSTRUMENTOS AUTOMÁTICOS Están disponibles adaptaciones para los siguientes analizadores: Abbott Aeroset Abbott Alcyon ATAC 8000 Beckman Coulter Cx Beckman Coulter Lx Dade Dimension Cobas Mira, Mira Plus Express 550 Hitachi 704, 717, 902, 911, 912, 914, 917 Pointe 180 Olympus AU400, 600, 640, 800 RA 500/1000/XT Selectra E Targa 3000 Tokyo Bokei Prestige 24i

Día a Día (n=20) Media.....4.69 9.52 D.S..........0.18 0.20 C.V. %.....3.84 2.10 Los datos a partir de los cuales se obtuvieron estos valores figuran en las tablas III y IV. ESTUDIOS DE INTERFERENCIAS Se estudió la interferencia por ácido ascórbico, bilirrubina, triglicéridos, hemoglobina acetilada y hemoglobina carbamilada, mediante una modificación del protocolo EP7-P del NCCLS. No se observaron interferencias por bilirrubina hasta 50 mg/ dl, ácido ascórbico hasta 50 mg/dl, triglicéridos hasta 2000 mg/dl, hemoglobina carbamilada hasta 7.5 mmol/l y hemoglobina acetilada hasta 5.0 mmol/l. Los datos se muestran en la TABLA V. ESTUDIO DE VARIANTES DE HEMOGLOBINA Las variantes de hemoglobina A2, C y S no mostraron interferencias en el uso de HbA1c Directo Plus. Los estudios con He4

HbA1c DIRECTO PLUS

ADAPTACIÓN A HITACHI 917 ANALYZE TEST NAME [HbA1c ] ASSAY/ POINT [1-POINT ] [10 ] [34 ] [0 ] [0 ] [0 ] WAVE (SUB/MAIN) [none ] [660 ] S. VOL. (NORMAL) [4.0 ] [4.0 ] [200] S. VOL. (DECREASE) [4.0 ] [4.0 ] [200] S. VOL. (INCREASE) [4.0 ] [4.0 ] [200] DILUENT [DW ] [99 ] REAGENT VOL (R1) [150 ] [0 ] [0 ] [0 ] REAGENT VOL (R2) [0 ] [0 ] [0 ] [0 ] REAGENT VOL (R3) [50 ] [0 ] [0 ] [0 ] REAGENT VOL (R4) [0 ] [0 ] [0 ] [0 ] ABS. LIMIT [25000 ] [0 ] [INCREASE ] PROZONE LIMIT: [-32000 ] [0 ] [LOWER ] CELL DETERGENT [Detergent ]

TWIN: [ ]

CALIBRATION CALIB TYPE [SPLINE ] [] POINT [5 ] SPAN POINTE [5 ] WEIGHT [0 ] AUTO TIME OUTN Auto change BLANK [0 ] CHANGE LOT: [0 ] SPAN [0 ] CHANGE BOTTLE: [ ] 2 POINT [0 ] FULL [0 ] SD LIMIT [999 ] DUPLICATE: [99] [32000 ] SENSITIVITY [-99999] [99999 ] S1ABS RANGE: [-32000 ]

[32000 ]

RANGE

TEST CODE [* ] CONTROL INTERVAL PANIC VALUE

UNITS []

: [% ] DATA MODE : [ON BOARD ] INST. FACTOR: [(Y=aX=b) : a=[1.0] b = [0.0] ] [-99999 ] [99999 ]

STANDARD CONCENTRATION STANDARD SOLUTION CONC [0.0 ] [* ] POSITION [* ] [* ] SAMPLE : [4.0 ] [4.0 ] PRE-DILUENT VOLUME [4.0 ] DILUENT [200 ] CALIB CODE: [0.0 ] [0.0 ]

*USER DEFINED [* ] [* ] [4.0]

[* ] [* ] [4.0 ]

[] [] []

[4.0 ] [4.0 ] [4.0 ] [4.0 ] [0.0 ] [200 ] [200 ] [200 ] [200 ] [0.0 ] [0.0 ] [0.0 ] [0.0 ] [ 0.0]

* Definido por el usuario. Se recomienta procesar 2 niveles de Control por día. Para obtener una performance óptima, se recomienda lavar las cubetas después del ensayo. Use la pantalla principal para agregar un lavado de celda emplando la aguja R1 en la posición Wash 3 (1D3) 5

HbA1c DIRECTO PLUS

GRAFICO 1 y = 0.32138 + 0.86426x R= 0.99236 11 10

HbA1c Directo Plus

9 8 7 6 5 4

HPLC Comercial

GRAFICO 2 y = 0.3375 + 0.98279x R= 0.98499 11 10

Hem贸lisis en el instrumento

9 8 7 6 5 4

Hem贸lisis fuera del instrumento 6

HbA1c DIRECTO PLUS

TABLA 1

HPLC Comercial 4.7 4.8 5.1 5.4 5.5 5.6 6.1 6.1 6.2 6.5 6.9 6.9 7.1 7.3 7.9 8.0 8.2 8.4 8.4 8.5 8.5 8.7 8.9 9.2 9.2 9.7 9.9 10.6 10.8 11.8

HbA1c Directo Plus 4.3 4.3 4.6 4.9 4.8 5.2 5.7 5.7 5.6 6.0 6.5 6.3 6.4 7.0 7.0 7.2 7.5 7.9 7.8 7.6 7.8 7.9 7.9 8.4 8.2 8.9 8.3 9.8 9.4 10.3

HPLC comercial HbA1c Directo Plus Mínimo 4.7000 4.3000 Máximo 11.800 10.300 Suma 230.90 209.20 Puntos 30.000 30.000 Mromedio 7.6967 6.9733 Mediana 7.9500 7.1000 RMS 7.9157 7.1569 Desvío Std 1.8807 1.6379 Variancia 3.5369 2.6827 Error Std 0.3433 0.29904 Oblicuidad 0.20291 0.058048 Kurtosis 0.93135 0.62994 Kurtosis -0.74823 -0.80780

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TABLA 2

Hemólisis Dentro 10.100 6.0000 6.2000 4.4000 7.1000 5.1000 7.3000 10.200 5.1000 7.6000 5.4000 10.400 5.3000 5.2000 5.6000 6.2000 5.1000 4.9000 5.1000 6.5000 5.8000 6.3000 5.6000

Fuera 4.6000 4.8000 9.9000 6.5000 6.8000 4.8000 Hemólisis 7.5000 Dentro Fuera 6.1000 Mínimo 4.4000 4.8000 7.8000 Máximo 10.400 10.600 10.500 Suma 151.10 156.60 5.3000 Puntos 24.000 24.000 7.6000 Promedio 6.2958 6.5250 5.5000 Mediana 5.7000 5.9000 10.600 RMS 6.5183 6.7389 5.3000 Desvío Std 1.7246 1.7208 5.3000 Variancia 2.9743 2.9611 5.6000 Error Std. 0.35204 0.35125 7.0000 Oblicuidad 1.4057 1.2642 5.4000 Kurtosis 0.93135 0.62994 4.8000 5.2000 6.5000 5.7000 6.6000 5.5000

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TABLA 3

Precisión intra día NIVEL I NIVEL II 4.6900 10.400 4.8000 10.400 4.7000 10.400 4.6000 10.500 4.7000 10.500 4.6000 10.100 4.7000 10.600 4.6000 10.300 4.6000 10.400 4.7000 10.600 4.6000 10.600 4.7000 10.400 4.7000 10.500 4.7000 10.300 4.7000 10.500 4.6000 10.400 4.6000 10.400 4.7000 10.600 4.6000 10.300 4.6000 10.600 Mínimo Máximo Suma Puntos Promedio Mediana RMS Desvío Std Variancia Error Std Oblicuidad Kurtosis

4.6000 4.8000 93.190 20.000 4.6595 4.6950 4.6599 0.059513 0.0035418 0.013308 0.38528 -0.67011

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10.100 10.600 208.80 20.000 10.440 10.400 10.441 0.13139 0.017263 0.029380 -0.63421 0.32063

TABLA 4

Precisión inter día NIVEL I 4.6000 4.7000 4.9000 5.0000 5.2000 4.6000 4.8000 4.5000 4.6000 4.6000 4.7000 4.7000 4.7000 4.6000 4.6000 4.5000 4.4000 4.6000 4.7000 4.7000 Mínimo 4.4000 Máximo 5.2000 Suma 93.700 Puntos 20.000 Promedio 4.6850 Mediana 4.6500 RMS 4.6883 Desvío Std 0.18144 Variancia 0.032921 Error Std 0.040572 Oblicuidad 1.2585 Kurtosis 1.6930

NIVEL II 9.9000 9.8000 9.5000 9.4000 9.6000 9.9000 9.2000 9.7000 9.5000 9.6000 9.6000 9.5000 9.3000 9.5000 9.5000 9.2000 9.3000 9.3000 9.5000 9.6000 9.2000 9.9000 190.40 20.000 9.5200 9.5000 9.5221 0.20417 0.041684 0.045653 0.25583 -0.53627

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TABLA 5

Estudio de interferencia Acido Ascórbico (mg/dL) HbA1c (%)

0 9.5

10 9.5

20 9.5

30 9.6

40 9.5

50 9.6

Bilirrubina (mg/dL) HbA1c (%)

0 9.5

10 9.5

20 9.4

30 9.5

40 9.5

50 9.5

Triglicéridos (mg/dL) HbA1c (%)

0 9.5

400 9.4

800 9.4

1200 1600 2000 9.4 9.4 9.4

Hb Acetilateda (mmol/L) HbA1c (%)

0 9.1

1 9.0

2.5 9.1

5 9.2

7.5 9.6

10 10.1

Hb Carbamilada (mmol/L) 0 HbA1c (%) 9.1

1 9.1

2.5 9.0

5 9.1

7.5 8.9

10 8.4

TABLA 6 Interferencia de Hemoglobina A2 GT Lab

HPLC

4.6 4.8 4.9 5.3 6.4 6.6 6.7 7 7.2 8.1 10.2

4.9 4.8 5 5.6 6.5 7.4 7.4 6.7 7.1 7.9 10.9

Estadísticas de Regresión Múltiplo R R cuadrado Intercepción Pendiente Observaciones

HbA1c DIRECTO PLUS

0.977427 0.955364 0.331388 0.918527 11

% HbA1c

GRAFICO III Interferencia de HbA2 12 10 8 6 4 2 0

GT Lab HPLC

9 10 11

% HbA1c

GRAFICO IV Interferencia de hemoglobina C 6 5 4 3 2 1 0

GT Lab HPLC

HbA1c DIRECTO PLUS

TABLA 7 Interferencia de hemoglobina C GT Lab 5.6 4.9 4.5 4.6

Estadísticas de Regresión

HPLC 5.4 5 4.9 4.8

Múltiplo R R cuadrado Intercepción Pendiente Observaciones

0.969748 0.94041 -4.30241 1.831325 4

TABLA 8 Interferencia de Hemoglobina S GT Lab

HPLC

4.3 4.4 4.5 4.8 5.0 5.1 5.2 5.2 5.3 5.4 7.3

4.7 4.4 4.2 5.2 5.1 4.9 5.4 4.9 5.5 4.6 6.3

Estadísticas de Regresión Múltiplo R R cuadrado Intercepción Pendiente Observaciones

0.830385 0.689539 -0.64029 1.151144 11

GRAFICO V Interferencia de Hemoglobina S

% Hgb A1c

8 6 GT Lab HPLC

4 2 0 1

8 13

HbA1c DIRECTO PLUS

9 10 11

TABLA 9

Estudio de linealidad Te贸rico 25.0 21.2 17.3 13.2 9.4 8.1 7.4 6.6 6.2 5.4 3.9 2.2

Recuperado 1 Recuperado 2 18.7 18.2 17.0 13.1 9.4 8.2 7.7 6.9 6.2 Error 4.0 2.2

18.6 18.2 16.9 13.4 9.5 8.3 7.7 6.9 6.4 5.4 3.9 2.2

Promedio 18.7 18.2 17.0 13.3 9.5 8.3 7.7 6.9 6.3 5.4 4.0 2.2

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Desv.% 74.8 85.8 98.3 100.8 101.1 101.2 104.1 104.4 101.6 100.0 102.6 100.0

www.gtlab.com.ar infoprofesional@gtlab.com.ar infocomercial@gtlab.com.ar TEL:+54 341 481.1002 Necochea 3274 - Rosario, Santa Fe - Argentina

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