AVANCE Publicación de contenido científico editada por GT Laboratorio S.R.L.
La enfermedad de
Estudio de la serología chagásica
CHAGAS MAZZA
GT Lab ha desarrollado un nuevo sistema para la detección de anticuerpos anti Trypanosoma cruzi (T. cruzi) por enzimo-inmunoensayo (ELISA), basado en el empleo de proteínas recombinantes conteniendo secuencias de aminoácidos correspondientes a los antígenos específicos del parásito. Los reactivos se provee en forma líquida, listos para usar y con largo período de validez. Estos reactivos están envasados en prácticos frascos gotero, permitiendo prescindir de la necesidad de usar pipetas en la técnica manual. Dicha técnica tiene incubaciones iguales en los distintos pasos, haciéndola de simple ejecución, reproducible y confiable. La fase sólida está basada en el uso de policubetas con pocillos fraccionables por unidad. Por lo tanto, esta técnica es adaptable tanto al uso manual como a sistemas automatizados. Incluso, la clara discriminación entre los resultados positivos y negativos permite una evaluación a simple vista del resultado.
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La enfermedad de Chagas Mazza
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INTRODUCCIÓN Se describen tres clases de vinchucas según su adaptación al ambiente: domésticas, semidomésticas y silvestres. Sin embargo, las vinchucas que antes eran de hábitos silvestres, se fueron adaptando gradualmente a la domesticidad humana. Por consiguiente, los lugares donde las vinchucas viven pueden clasificarse en viviendas humanas y naturales de animales (gallineros, palomares, conejeras). El insecto se refugia principalmente en las grietas de los pisos y paredes, detrás de muebles u objetos nunca cambiados de lugar, zonas que no son periódicamente limpiadas, bajo de la cubierta de techos o paredes con resquicios, especialmente entre el “empajado” de quinchos y ranchos y en grietas de paredes de adobe mal embarradas o sin revocar. Los depósitos poco removidos, donde se guardan baúles, cajones, etc., gozan también de su predilección. Ello asocia su desarrollo a condiciones de vida más precarias y vulnerables. Las mudanzas favorecen la dispersión de la vinchuca, que llega así a nuevas casas que se suponen relativamente aisladas. La presencia de la vinchuca es relativamente fácil de descubrir por sus deyecciones de color blanco amarillento y negro sobre las paredes. Para obtener alimentarse, la vinchuca llega hasta su presa generalmente mientras duerme, despliega su trompa e inserta los estiletes bucales en la piel de la víctima, lo cual es indoloro para ésta, que generalmente no lo detecta. En estas condiciones succiona sangre hasta saciarse (unos 0,5 ml), con lo que ni siquiera puede volar y regresa caminando lentamente hasta su refugio donde se esconde mientras haya luz, ya que es de hábitos nocturnos. De hecho, una de las defensas naturales contra las vinchucas en zonas rurales es mantener luces encendidas durante la noche. La vinchuca no nace infectada sino que se adquiere la parasitosis al alimentarse con sangre de animales infectados. Cuando uno de estos insectos que pica a una persona o animal enfermo, absorbe los parásitos presentes en la sangre. Estos se multiplican en el intestino del insecto, para salir al exterior con las materias fecales que se han tornado así en vehículo de infección. Luego, al picar a una persona sana y atiborrarse con sangre, defeca. Sus heces contienen gran cantidad de tripanosomas que se introducen en el organismo a través de soluciones de continuidad de la piel (heridas, escoriaciones al rascarse, la misma picadura) o por perforación de las mucosas (ocular, nasal, bucal). De hecho, lo habitual es que la víctima se rasque ante el ligero escozor que ocasiona la picadura, provocando la vía de entrada del parásito en su organismo.
Mientras estudiaba enfermedades palúdicas en estado de Minas Gerais, Brasil, el Dr. Carlos Chagas encontró enfermos que presentaban una sintomatología distinta de la que tenían cualquiera de las afecciones descriptas hasta entonces. Sus observaciones llevaron a concluir que se trataba de una dolencia con características propias y que constituía una enfermedad, a la que posteriormentte se la llamó “enfermedad de Chagas”. Más tarde, el Dr. Chagas descubrió el agente causal de la afección: un parásito unicelular microscópico al que denominó Trypanosoma cruzi (T. cruzi), que se encuentra en el intestino de un insecto conocido comúnmente como vinchuca, de cuya peligrosidad ya se tenían referencias desde el siglo XVI. Los estudios del Dr. Chagas permitieron descubrir, no solamente la enfermedad, sino su agente causal y su transmisor. A su vez, en la Argentina, el Dr. Salvador Mazza realizó el estudio de la enfermedad en un gran número de pacientes. La gran trascendencia de sus observaciones llevaron a que a esta enfermedad se la denomine “Mal de Chagas-Mazza”. La enfermedad tiene carácter muy grave en los lactantes sobre todo de corta edad, a los que le puede ocasionar la muerte. En efecto, el mal de Chagas es importante factor de mortalidad infantil en zonas endémicas. LA VINCHUCA Como todo insecto, es ovíparo. La hembra pone hasta 200 huevos de forma elíptica, de color claro, de alrededor de 1mm de largo, que tiene una tapita llamada opérculo. Estos huevos son depositados en la tierra, en las grietas de las paredes hechas de adobe, en los techos de paja, o en otros lugares más o menos ocultos. El período de incubación oscila entre los 10 y 40 días, dependiento de la temperatura ambiente. A medida que el embrión se desarrolla, los huevos adquieren una coloración rosada y es posible ver, por transparencia, los ojos de la futura vinchuca. Luego de nacer y hasta alcanzar el estado adulto, tiene lugar una metamorfosis de duración variable según la temperatura, la humedad y la alimentación. Inicialmente, el insecto tiene unos 3 mm de largo, muy parecido al adulto pero sin alas, fase en la cual se lo denomina “chiche pila”. Una semana después muda de piel, la ninfa aumenta de tamaño, pero sigue sin alas. Seguirán cuatro mudas más, cada una de ellas da origen a una ninfa más grande hasta que la quinta origina la ninfa mayor, alada y con su aspecto definitivo. Todo este proceso dura alrededor de siete meses en condiciones óptimas; siendo la vida del adulto es de unos 15 meses. Importa señalar que, desde su primera transformación, la vinchuca, siendo un insecto hematófago (aima=sangre y fhagein=comer), se alimenta de vertebrados de sangre caliente, como gallinas, palomas, caballos, etc. La distribución de la vinchuca es sumamente amplia, abarcando todo el territorio Latino Americano. Las zonas más afectadas en Argentina son las provincias de clima cálido o templado y seco.
LA INFECCIÓN Una vez en la sangre de la víctima, los tripanosomas continúan su crecimiento y al poco tiempo comienzan a reproducirse en forma extraordinaria y veloz. El parásito utiliza la sangre para propagarse en busca de células nucleadas, que detecta, e invade ciertos tejidos del cuerpo, preferentemente el corazón, el sistema nervioso, los músculos y el sistema digestivo, dependiendo del tipo de cepa de que 3
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se trate. Al morir la célula infectada o estallar por la cantidad de parásitos, el Trypanosoma cruzi que estaba en su citoplasma vuelve al torrente sanguíneo para migrar e infectar otras células. Naturalmente, el sistema inmunológico produce una rápida respuesta, y en un primer momento controla la infección generando una respuesta inmunológica que protege al huésped. La superficie del T. cruzi contiene una serie de moléculas llamadas mucinas, que cubren totalmente el parásito. Las mucinas no solamente protegen al parásito del ataque de los anticuerpos, sino que le sirven también para provocar una reacción en la membrana de otras células que permite su invasión. Para que las mucinas puedan proteger al t. cruzi, interaccionar e invadir otras células, es necesaria la presencia de un glúcido, el ácido siálico, que el parásito toma del huésped a través de la enzima transialidasa. El gran paso de las investigaciones sobre Chagas apuntó a identificar los genes que codifican la transialidasa. El objetivo es emplear la tecnología recombinante para diseñar moléculas que inhiban esta enzima, paralizando al parásito.
surgen como si brotaran del interior de la piel. Son poco dolorosos. El habón de inoculación tiende a desaparecer espontáneamente al cabo de 2 ó 3 meses, dejando una pigmentación característica. La elevación de la temperatura (37.5-39ºC o más en niños de corta edad) es constante en la fase aguda, tiene niveles moderador (37,5° a 39°) no guarda relación con la gravedad de la infección. En la fase aguda de la infección suele aparecer agrandamiento indoloro de los ganglios, el corazón suele presentar alteraciones variables de leves a graves y repercusión clínica o no, que generalmente desaparecen casi por completo. Durante este período es posible la observación microscópica de la parasitemia. Pasado el primer mes, el enfermo entra en el período de latencia, que puede durar años; la mayoría de los infectados permanece en este período por el resto de sus vidas. Durante este período no hay sintomatología; solamente se puede poner en evidencia la enfermedad por medio de análisis de sangre en el que se comprueba las alteraciones provocadas y, difícilmente, por observación microscópica de los tripanosmas. El período crónico es, por lo general, una manifestación tardía de la infección que aparece en casi un 15% de quienes han sido infectados. Sus manifestaciones están en relación directa con las alteraciones cardíacas, siendo sus síntomas más comunes las palpitaciones, disnea, dolores referidos al área cardíaca, dolor en la zona hepática y, sobre todo, manifestaciones alteraciones en el electrocardiograma, aun sin que haya síntomas clínicos. La mayor parte de los síntomas son indicación de daño cardíaco, que suele llevar a grados variables de insuficiencia cardíaca. Esto es un serio dato epidemiológico dada la alta incidencia de la infección en áreas endémicas. Otro dato de la gravedad de la situación es que la cardiopatía chagásica afecta a personas jóvenes con un organismo relativamente sano, que presentarán invalidez para la vida normal debido a la lesión cardíaca. La magnitud de la cardiopatía chagásica es variable y depende principalmente del grado de aumento del corazón, del tipo de trastorno del ritmo cardíaco, del grado de insuficiencia cardíaca y de la tendencia evolutiva de la infección. Otra manifestación clínica es la constipación crónica, asociada a megacolon. Como consecuencia de la enfermedad, la muerte puede sobrevenir súbitamente o bien luego de un tiempo de padecimiento inimputable a falla cardíaca, pudiendo el paciente morir tanto en la etapa aguda como en la crónica. El Mal de Chagas-Mazza no se contagia entre las personas directamente, salvo a través de transfusiones, pudiendo transmitirse de madre a hijo durante el embarazo. La Enfermedad de Chagas es responsable de unas 45.000 muertes por año. Diagnóstico de laboratorio: Existen diferentes metodología para el diagnóstico de laboratorio, entre las que se destacan las siguientes.
EVOLUCIÓN DEL MAL DE CHAGAS-MAZZA Esta enfermedad tiene una evolución en tres períodos: - Agudo - Latencia - Crónico El período agudo tiene una duración de unos 20 a 30 días, comenzando con un período de incubación (lapso que media entre la introducción del tripanosoma en el organismo y la aparición de los primeros síntomas) de alrededor de una semana. Le sigue una súbita irrupción de molestias que incluyen fiebre, escalofríos, cefalea, mialgias, malestar general e inapetencia. Suelen aparecer signos que delatan la puerta de entrada de la infección: son el complejo oftalmoganglionar y los habones de inoculación. El complejo oftalmoganglionar o signo de Romaña representa una manifestación de gran valor diagnóstico y permite el reconocimiento de gran número de casos de infección aguda en las zonas endémicas. Lamentablemente, se ve sólo en no más del 4% del total de formas agudas. Su comienzo, habitualmente repentino, manifiesta hinchazón elástica e indolora de los párpados superior e inferior de un solo ojo, que toman color morado (como un “ojo en compota”); conjuntivas rojas; hinchazón moderada del lado facial correspondiente al ojo afectado. Esta inflamación ocular desaparece lentamente con el curso de la fase aguda de la afección. Los habones de inoculación consisten en zonas de endurecimiento cutáneo que pueden aparecer en cualquier lugar del cuerpo, especialmente en las partes descubiertas. Estas zonas generalmente tienen un color rojo y alta temperatura local; 4
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- Diagnóstico parasitológico directo: Puede realizarse a través de la Observación microscópica en fresco, gota gruesa, método de concentración microstrout, xenodiagnóstico, hemocultivo y Biopsia. - Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) - Diagnóstico serológico: Se basa en diferentes técnicas para la detección de anticuerpos desarrollados por el huésped contra t. cruzi, a saber: - Inmunofluorescencia indirecta (IFI) - Enzimoinmuno ensayo (ELISA) - Hemaglutinación indirecta (HAI) - Aglutinación directa
1/5 con agua destilada. Este reactivo no cristaliza en heladera. La Solución Lavadora Diluida es estable seis meses a temperatura ambiente. CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD Conserve refrigerado sin congelar (2-8ºC). La estabilidad alcanza la fecha de vencimiento indicada en la caja. PRECAUCIONES Y ADVERTENCIAS SOBRE SU USO El producto es exclusivamente para uso Diagnóstico “IN VITRO”. El producto no presenta condiciones especiales de manipulación y descarte ya que NO POSEE en su composición MATERIALES POTENCIALMENTE INFECTIVOS, salvo los Controles Positivo y Negativo. Estos Controles han sido preparados a partir de muestras no reactivas para antígeno de superficie de hepatitis B y para anticuerpos vinculados a los virus de HIV 1 y 2 y de la hepatitis C, ensayados por métodos de tercera generación. Antes de su uso dichas muestras han sido inactivadas 20 minutos a 121ºC. No obstante, deben manipularse como cualquier muestra de pacientes, por ende, potencialmente infectiva (Ver Muestra Objeto del Diagnóstico). El producto debe conservarse y transportarse refrigerado, a temperatura comprendida entre 2-8ºC. La policubeta con Antígeno es sensible a la humedad. El sobre debe abrirse solamente después de que haya tomado temperatura ambiente. Los pocillos no usados deben guardarse cerrado el sobre con una cinta adhesiva y manteniendo el desecante provisto en su interior.
LA TRANSMISIÓN VERTICAL El diagnóstico en el recién nacido presenta características particulares debido a la gravedad de la infección y las dificultades asociadas tanto a la prevención como y al diagnóstico mismo, en estos casos. A los efectos de contribuir en este tema, se adjunta la revisión realizada por G.L. Piat et al. (Revista de Posgrado de la VI Cátedra de Medicina. N° 193 – Junio 2009)
CHAGAS ELISA. Reactivos GT Lab PRINCIPIO DEL ENSAYO La técnica emplea antígenos recombinantes para detectar anticuerpos anti T. cruzi. Una muestra de suero o plasma diluida se incuba en un pocillo conteniendo tales antígenos absorbidos a sus paredes. Si existieran anticuerpos en la muestra, éstos serán retenidos por los antígenos. Tras lavar el exceso de muestra, se agrega un suero anti inmunoglobulinas humanas conjugado a peroxidasa, que se une a las inmunoglobulinas capturadas en la etapa anterior. Tras un nuevo lavado, la peroxidasa así retenida por la fase sólida es revelada con tetrametilbenzidina y peróxido de hidrógeno. La reacción se detiene por acidificación del medio de reacción, estabilizando el color final que se lee a 450 nm.
MATERIALES NECESARIOS PERO NO PROVISTOS - Material volumétrico para medir los volúmenes indicados en ENSAYO. - Baño termostatizado a 37ºC. - Cronómetro o reloj alarma. - Tubos de hemólisis. - Papel milimetrado: para la curva de calibración. - Lámpara - Coagulómetro (opcional)
REACTIVOS PROVISTOS (listos para usar) - Antígeno: policubeta con 96 pocillos separables y utilizables individualmente, recubiertos con proteínas recombinantes con epitopes específicos del T cruzi. - Diluyente de Muestra: solución albúmina bovina en solución fisiológica. - Conjugado: suero anti-inmunoglobulinas humanas conjugado con peroxidasa. - Sustrato: solución de peróxido de hidrógeno y clorhidrato de tetrametil benzidina. - Stopper: solución 1 mol/l de ácido sulfúrico. - Control Positivo: dilución de suero reactivo para anticuerpos anti-T. cruzi. - Control Negativo: dilución de suero no reactivo para anticuerpos anti-T. cruzi. - Solución de Lavado Concentrada: solución concentrada de cloruro de sodio y Tween en buffer fosfato, para diluir al
REACTIVOS NECESARIOS PERO NO PROVISTOS Agua destilada o deionizada para diluir la Solución de Lavado Concentrada. MUESTRA Suero o plasma heparinizado. El plasma debe separarse dentro de los 30 minutos de extraída la sangre. Condiciones de conservación de las Muestras El suero o plasma puede conservarse refrigerado (2-10°C) durante 24 horas o congelado a -20°C durante un mes. En caso de emplear suero o plasma congelado, descongelar rápidamente en baño de 37ºC. Procesos de congelamiento y descongelamiento reiterados provocan falsos resultados. 5
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Sustancias interferentes La hemólisis dificulta la medición. Manipulación y descarte Las muestras de pacientes deben manipularse considerándolas potencialmente infecciosas, al igual que el material descartable y los utilizados en el ensayo, que hayan estado en contacto con las mismas, incluido el papel absorbente. El descarte debe hacerse de acuerdo a las buenas prácticas de laboratorio y a las regulaciones locales. Un procedimiento sugerido para descartarlos es el autoclavado a 121ºC durante una hora y el tratamiento de los líquidos residuales con hipoclorito de sodio durante una hora a una concentración final del 5%.
7- Mezcle aplicando suaves golpes laterales. Cubra los pocillos con una cinta autoadhesiva e incube 30 minutos a 37ºC. 8- Vuelque el contenido de los pocillos con un movimiento seco sobre un recipiente conteniendo hipoclorito de sodio 5%, cuidando de que el liquido no salpique. Manteniendo los pocillos boca abajo, golpee un par de veces sobre papel absorbente seco para escurrir el contenido. 9- Lave 5 veces con Solución Lavadora Diluida, tal como se explica más arriba. Tras el quinto lavado, deje escurrir bien sobre el papel un par de minutos. 10- Agregue a cada pocillo: Sustrato 100 μl 100 μl 100 μl (2 gotas) (2 gotas) (2 gotas) 11- Mezcle aplicando suaves golpes laterales. Incube 30 minutos a temperatura ambiente. 12- Agregue a cada pocillo: Stopper 50 μl 50 μl 50 μl (1 gota) (1 gota) (1 gota)
ENSAYO Procedimiento de análisis: Lea atentamente las instrucciones antes de iniciar el ensayo. Observe lo señalado en LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO. Deje que los reactivos tomen temperatura ambiente. 1- Abra el sobre y retire únicamente los pocillos a usar, cerrándolo inmediatamente. Tenga en cuenta que debe procesarse el Control Positivo por duplicado y Negativo por triplicado en cada corrida. 2-Proceda con siguiente esquema de pipeteo, teniendo en cuenta que las muestras deben agregarse sobre el Diluyente de Muestras, sin tocar las paredes del pocillo con la pipeta.
Diluyente de Muestras
Control Positivo Control Negativo Suero o plasma
Control Positivo 100 µl 10 µl ----- -----
13- Mezcle aplicando suaves golpes laterales. 14- Después de transcurridos 5 minutos, pero antes de los 30 minutos de agregado el Stopper, proceda a evaluar los resultados a simple vista o leyendo en un lector vertical a 450 nm, preferentemente en modo bicromático empleando un filtro de referencia entre 600-650 nm. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS Interpretación visual: Resultado No Reactivo: cuando una coloración desarrollada es inferior a la producida por los Controles Negativos. Resultado Reactivo: cuando se observa coloración amarilla franca. Si el color desarrollado es semejante al de los Controles Negativos, se debe efectuar una lectura instrumental. Interpretación Instrumental: Calcule el promedio de lecturas de los Controles Negativos (N) y, con él, calcule el cut-off (CO) como: CON + 0,1500 Resultado No Reactivo: cuando la lectura es inferior al CO. Resultado Reactivo: cuando la lectura es superior aI CO. Resultado Indeterminado: se recomienda considerar indeterminados los resultados de muestras que dan lecturas que difieren en menos del 10% del CO, procediéndose a repetir la determinación.
Control Muestras Negativo 100 µl 100 µl ----- ----10 µl ---------- 10 µl
3- Mezcle aplicando suaves golpes laterales. Cubra los pocillos con una cinta autoadhesiva e incube 30 minutos a 37ºC. 4- Vuelque el contenido de los pocillos con un movimiento seco sobre un recipiente conteniendo hipoclorito de sodio 5%, cuidando de que el líquido no salpique. Manteniendo los pocillos boca abajo, golpee un par de veces sobre papel absorbente seco para escurrir el contenido. 5- Lave 5 veces con Solución Lavadora Diluida. Cada vez, vuelque el contenido como se explicó en 4. Tras el quinto lavado, deje escurrir bien sobre el papel un par de minutos. Cada lavado puede hacerse: a) empleando un gotero o piseta, con el que se ha de llenar cada pocillo hasta cerca del borde, evitando que el líquido rebalse el mismo para que no se produzcan contaminaciones cruzadas b) empleando una pipeta multicanal, desde la que se agregarán 300 μl/pocillo. c) un lavador automático, agregando 300 μl/pocillo 6-Agregue a los pocillos: Conjugado 50 μl 50 μl 50 μl (1 gota) (1 gota) (1 gota)
ADAPTACIONES PARA AUTOMATIZACION El reactivo puede emplearse en instrumentos automáticos siguiendo las instrucciones del fabricante. EVALUACION DE DESEMPEÑO Comparacion con reactivos comerciales Evaluación ralizada en un laboratorio privado Comparación con un conjunto de reactivos comercial ELISA basado en antígenos recombinantes
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GT Lab
MARCA A No Reactivos Reactivos No Reactivos 158 0 Reactivos 1 35 Total 159 35
Total 158 36 194
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 1 Camargo ME, Takeda GF: “Diagnóstico de Laboratorio”, en “Doenca de Chagas” Braner Z, Andreda Z Ed., Guanabara Koogan: 175-198 (1079). 2 Kirchoff LV: News FA: “Chagas Disease in Latin American Immigrants”, J Amer Med Assoc 254:3058-3060 (1985). 3 Knecher LM, Lorenzo LE et al.: “Chagas Disease Screening in Blood Bank Employing Enzyme Immunoassay” Intl. J ParasitoI24/2:207- 211 (1994). 4 Pastini AC, Iglesias SR, et al.: “Immunoassay with recombinat Trypanosoma cruzi Antigen Potencially Useful for Screening 01 Donated Blood and diagnosing Chagas Disease”. Clin Chem. 44/10: 1893-1897 (1994). 5- Schumins GA: “Trypanosoma cruzi, the etiologic agent of Chagas Disease, status in the blood supply in endemic and non endemic countries”, Transfusion 31 :97-103 (1991)
Comparación con un conjunto de reactivos comercial basado en antígeno obtenido de lisado celular.
GT Lab
MARCA A No Reactivos Reactivos No Reactivos 144 0 Reactivos 5* 30 Total 149 30
Total 144 35 179
* 4 de estas muestras fueron comprobadas como reactivas por otros métodos (ELISA y hemaglutinación comerciales) y una dio no reactiva por otro ELISA y reactiva por hemaglutinación. ENSAYOS DE EVALUACION REALIZADOS EN HOSPITALES PÚBLICOS ESTUDIOS DE SENSIBILIDAD En un ensayo realizado en un laboratorio hospitalario sobre 50 muestras reactivas (25 sueros y 25 plasmas) provenientes de un panel de obtenido del “Instituto Nacional de Investigación de Chagas Dr. Mario Fatala Chaben”, se obtuvieron todos resultados reactivos, estimándose en esta muestra una sensibilidad del 100%. La reactividad de los datos de referencia está definida por dar reactivo para al menos dos de los tres métodos empleados (ELISA, hemaglutinación e inmunofluorescencia). En un ensayo realizado en el banco de sangre de un hospital de la ciudad de Rosario sobre 53 muestras de plasma probadamente reactivas por dos métodos (HAI y ELISA), se obtuvieron 52 resultados reactivos, estimándose en esta muestra una sensibilidad del 98.1%. ESTUDIOS DE ESPECIFICIDAD En un ensayo realizado en sobre 50 muestras no reactivas para los métodos de referencia (25 sueros y 25 plasmas) provenientes de un panel de obtenido del “Instituto Nacional de Investigación de Chagas Dr. Mario Fatala Chaben”, se obtuvieron todos resultados no reactivos, estimándose en esta muestra una especificidad del 100%. En otro ensayo, realizado en el laboratorio en un banco de sangre de la ciudad de Rosario sobre 28 muestras de plasma probadamente no reactivas por dos métodos (HAI y ELISA), se obtuvieron todos resultados no reactivos. Estudios realizados en un laboratorio privado sobre 19 sueros no reactivos para ELISA recombinante, no se obtuvo ningún resultado reactivo.
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La enfermedad de Chagas es una de las enfermedades parasitarias endémicas más importantes en América Latina, (3) extendiéndose desde el sur de los Estados Unidos hasta el sur de Argentina y Chile, (4) donde cerca de 20 millones de personas están infectadas y 60 millones están en riesgo de infección,(3) por medio de mecanismos alternativos de transmisión de Trypanosoma cruzi, en particular a través de la transmisión congénita.(5) Históricamente, la transmisión por vectores triatominos ha sido la fuente más común de infección. (6) La infección puede transmitirse también a través de transfusiones de sangre y trasplante de órganos, que es considerada la segunda forma más común de transmisión de T. cruzi. La tercera vía de transmisión es la infección congénita. (7) La cual es también epidemiológicamente relevante. Estudios recientes en Argentina han indicado que la probabilidad de transmisión vertical de la infección varía entre el 2,6% a 6,7%. A nivel de los hospitales públicos, el número de mujeres embarazadas chagásicas que reciben tratamiento en la Argentina es del 9%.(8) Se estima que por cada contagio de mal de Chagas debido a la transmisión vectorial, habría alrededor de 10 casos congénitos, usualmente asintomáticos, y por cada uno de estos casos congénitos que se detectan y notifican al Ministerio de Salud Pública, habrían entre 6 y 12 que no se descubren ni se tratan. (9) La transmisión vertical de T. cruzi no puede ser prevenida, porque las drogas actualmente disponibles para el tratamiento específico de las mujeres embarazadas infectadas por T. cruzi, como el Nifurtimox (LampitR, Bayer) y el Benznidazol (RadanilR, Roche), son tóxicas, y además se desconocen sus efectos en la mujer en edad reproductiva o embarazada. Es así que la transmisión vertical se plantea a futuro como una fuente continua de recién nacidos infectados aún cuando se halla eliminado completamente al vector y la transmisión transfusional. (10) Revista de Posgrado de la VIa Cátedra de Medicina. N° 193 – Junio 2009 17 Objetivo: Esta Revisión Bibliográfica tiene por objetivo revisar distintas publicaciones referentes a la enfermedad de Chagas en embarazadas teniendo en cuenta sus características más relevantes en epidemiología, etiopatogenia, clínica, diagnóstico, evolución y tratamiento.
CHAGAS CONGENITO REVISION DE UNA ENFERMEDAD CURABLE Y SUBESTIMADA Giselle Lillyan Piat, José Francisco Almirón, José René Romano Dr. Martín Fidel Romano
RESUMEN La enfermedad de Chagas es una patología propia de esta zona. La transmisión vertical de Trypanosoma cruzi ha ido aumentando su importancia a medida que la transmisión vectorial y transfusional han sido y son crecientemente controladas. Su relación con el embarazo se manifiesta por medio de diferentes síntomas, tanto en la madre como en el feto. La técnica del microhematocrito es el método parasitológico de elección para el diagnóstico de la infección congénita. El serodiagnóstico rutinario que detecta IgG contra T. cruzi sólo es útil luego de los 6 meses de edad del bebé. La detección de IgM específica mediante antígenos recombinantes y la PCR (Reacción en cadena de la Polimerasa) constituyen excelentes alternativas, pero resta considerar su factibilidad desde un punto de vista operacional y de costo-efectividad en las áreas endémicas afectadas. La transmisión vertical de T. cruzi no puede ser prevenida, pero el diagnóstico y tratamiento oportuno de la infección congénita alcanza curas cercanas al 100%. Palabras Claves: Enfermedad de Chagas, Chagas Congénito, Trypanosoma cruzi. SUMMARY Chagas disease is a pathology characteristic of this zone. Vertical transmission of Trypanosoma cruzi has been increasing importance as vector transmission and transfusion have been and are increasingly controlled. Its relation to pregnancy manifested by different symptoms, both the mother and the fetus. Microhematocrit technique is the method of choice for parasitologic diagnosis of congenital infection. The routine serodiagnosis detecting IgG against T. cruzi is only useful after the 6 month old baby. Detection of IgM specific recombinant antigens by PCR are excellent alternatives, but it remains to consider their feasibility from an operational and cost-ffectiveness in endemic areas affected. Vertical transmission of T. cruzi can not be prevented, but the diagnosis and treatment of congenital infection cures reaches close to 100% Keywords: Chagas disease, congenital Chagas disease, Trypanosoma cruzi.
MATERIALES Y METODOS Se utilizaron libros de texto específicos de Medicina y se realizó la recopilación de artículos de Internet a través de buscadores como el Servicio de la Editorial Elsevier, Secretaría de Ciencia y Técnica de la Nación, LILACS, MEDLINE con la asistencia del buscador específico PUBMED, IMBIOMED, La biblioteca Cochrane, SciELO, y MDConsult. Se utilizó bibliografía de hasta 10 años como máximo. Para esta búsqueda utilizamos las siguientes palabras claves: Chagas congénito, prevalencia de la enfermedad de Chagas en servicios de perinatología y serologías de la enfermedad de Chagas.
INTRODUCION Casi un siglo después de su descubrimiento, la enfermedad de Chagas sigue siendo un grave problema sanitario y económico (1), porello el Banco Mundial la clasificó como la enfermedad parasitaria más grave de las Américas.(2) 8
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DESARROLLO
tores tales como la edad materna, número partos anteriores, o el origen geográfico. (16) Clínica: Fase Aguda: La infección aguda de Trypanosoma cruzi a menudo no es percibida. (17) Los pacientes agudos sintomáticos presentan: fiebre, signos de puerta de entrada, edema, adenopatías satélites, hepatomegalia y esplenomegalia. La fiebre es frecuente, irregular, pero puede ser continua y alta. Se acompaña de anorexia, astenia, mialgias, cefalea y ocasionalmente artralgias. El cuadro febril suele persistir por un período de dos a cuatro semanas. Los signos de puerta de entrada o chagomas de inoculación, son lesiones cutáneas, más frecuentes en la cara y extremidades por ser los sitios más expuestos a las vinchucas. El signo de Romaña-Mazza, se presenta como edema bipalpebral, unilateral, de color rosado violáceo claro, indoloro y duro. Existen además, adenopatías satélites. (18) Fase Indeterminada: En el período latente, la sintomatología se apaga, hay multiplicación lenta de los parásitos y presencia de anticuerpos circulantes específiRevista de Posgrado de la VIa Cátedra de Medicina. N° 18 193 – Junio 2009 cos de la clase IgG. La curación, con eliminación del Trypanosoma, es rara. Esta fase puede durar toda la vida o pasar a la etapa crónica. (11) Fase Crónica: Décadas después de la infección primaria, el 30% de las personas pueden desarrollar una forma de enfermedad inflamatoria crónica conocida como la Cardiomiopatía Chagásica.(19) En sus primeras fases, la cardiomiopatía crónica chagásica presenta anormalidades del movimiento de la pared, que van desde hipoquinesias regionales hasta la formación de aneurismas. Estudios clínicos han demostrado que la presencia de esta lesión cardiaca es un factor de riesgo independiente para accidente cerebrovascular en pacientes con enfermedad de Chagas. (20) La cardiomiopatía es la más frecuente y grave manifestación crónica de la enfermedad de Chagas, por lo general produce arritmias auriculares y ventriculares, insuficiencia cardiaca, y fenómenos tromboembólicos resultantes en, al menos, 21 000 muertes cada año. (1) Otra porción de los enfermos chagásicos desarrollan los megasíndromes del esófago o del colon. Al alterarse la motilidad del esófago, se produce disfagia, dolor epigástrico o retroesternal y regurgitaciones. (11) Transmisión Congénita: Los casos de transmisión congénita de T. cruzi son en su mayoría asintomáticos o monosintomáticos y afectan gravemente a la supervivencia del recién nacido. (21) El Tripanosoma cruzi alcanza la circulación fetal por vía hematógena, como resultado de una placentitis, donde se encuentran focos inflamatorios agudos y/o crónicos, áreas de necrosis, presencia de células gigantes y parasitismo de las células trofoblásticas y de los macrófagos, constituyendo cuadros de vellositis e intervellositis de intensidad variable; también el parásito puede penetrar en forma actores como la edad materna, número
Definición y Patogenia: La tripanosomiasis americana (enfermedad de Chagas) es una zoonosis parasitaria causada por Trypanosoma (Schizotrypanum) cruzi. El reservorio natural lo constituyen los armadillos,marsupiales (Didelphis sp o tlacuaches), roedores, murciélagos y primates silvestres, además de ciertos animales domésticos como perros, gatos, incluso ratas (Rattus rattus) y los cobayos. La enfermedad tiene mayor prevalencia en las regiones rurales más pobres de América Latina. La infección es transmitida al hombre por los triatominos hematófagos, por transfusión de sangre contaminada o verticalmente de la madre infectada al feto. (11) En el caso de transmisión vectorial, los parásitos depositan sus heces en las heridas en la piel o la mucosa y estimulan una reacción inflamatoria local (inoculación chagoma o signo de Romaña), con una respuesta linforeticular. El tripomastigote circulante es envuelto por macrófagos, son tomados por el hígado, el bazo, los ganglios linfáticos, y los músculos esquelético y cardíaco para formar pseudoquistes de amastigotes. Con la ruptura de los pseudoquistes en el miocardio o plexos mioentéricos, ocurre una miocarditis aguda mediada por células TCD4 + y + TCD8 y las interleucinas (principalmente la IL-2 e IL-4). La reacción de la respuesta inflamatoria lleva a la destrucción de las células musculares y neuronas, que se mantiene por la presencia de T. cruzi o sus fragmentos y por el ADN del parásito, con una reacción de hipersensibilidad tardía, produciendo la dilatación de la microcirculación y la fibrosis, por lo tanto, la inducción de dilatación de las pupilas, la miocardiopatía crónica, arritmia, trastornos de la peristalsis, megaesófago, y megacolon. La forma congénita de la enfermedad de Chagas parece ocurrir únicamente en las mujeres embarazadas que tienen una lesión en el placenta que favorece la penetración de T. cruzi en lo que respecta a la vellosidades coriónicas, donde las formas de amastigotes se multiplican (probablemente en las células de Hofbauer) y, posteriormente, invaden la circulación fetal. Además la transmisión, puede tener lugar en el nacimiento o durante el paso por el canal del parto. (12) Estudios sugieren que la vivienda en las zonas de alta densidad vectorial, se asocia a una mayor parasitemia materna y a un severo aumento del riesgo de casos graves y mortales de enfermedad de Chagas congénita. (13) Es posible que las mujeres en la fase aguda chagásica tengan mayores probabilidades de transmitir la infección, teniendo en cuenta la intensidad de la parasitemia en estos casos, (14) asociada a una reducción de la producción de IFN-γ. (4) En la fase crónica, la baja parasitemia podría reducir al mínimo las posibilidades de transmisión transplacentaria. (14) Si bien el número de parásitos en madres infectadas, las cepas implicadas, factores placentarios, y / o la inmunidad materna podrá determinar la transmisión congénita de T. cruzi; (15) no es clara la asociación de este modo de transmisión con 9
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número partos anteriores, o el origen geográfico. (16) Diagnóstico: Puede ser realizado por diferentes técnicas. El diagnóstico parasitológico directo, puede ser a través de la Observación microscópica al fresco, Gota gruesa, Método de concentración: MicroStrout, Xenodiagnóstico, Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la Biopsia. (22) El diagnóstico serológico se realiza generalmente mediante pruebas convencionales: Inmunofluorescencia indirecta (IFI), enzima inmunoensayo (ELISA) y hemaglutinación indirecta (HAI). (23) Son utilizados 2 criterios para el diagnóstico: · Historia compatible con la epidemiología de la enfermedad. · Estudios microbiológicos. (24) Al menos 2 de técnicas positivas diferentes (parasitológicas directas y/o indirectas). (25) La infección materna por T. cruzi se evalúa con hemaglutinación indirecta y/o inmunofluorescencia. (26) Pero en la transmisión congénita, la detección directa de T. cruzi en los recién nacidos es más eficaz por el microhematocrito (o micro-Strout) técnica de concentración por el examen de sangre fresca. El examen histopatológico de la placenta, el xenodiagnóstico y el hemocultivo son más costosos y consumen mayor tiempo que otros métodos directos. (27) El diagnóstico serológico rutinario de T. cruzi en recién nacidos de madres seroreactivas tiene un bajo valor predictivo positivo porque la presencia de anticuerpos de tipo IgG contra T. cruRevista de Posgrado de la VIa Cátedra de Medicina. N° 193 – Junio 2009 19 zi en la mayoría de los casos se debe a la transferencia pasiva de anticuerpos IgG de origen maternal. En el bebé no infectado, estos anticuerpos normalmente desaparecen entre los 5 y 7 meses de edad. (28) Por el contrario, la detección de anticuerpos IgM contra el parásito en el bebé se considera evidencia concluyente de una infección por T. cruzi, a menos que dichos anticuerpos se hallasen presentes en la madre con anterioridad. Desafortunadamente, la detección de anticuerpos IgM contra T. cruzi en el bebé en ausencia de infección comprobada ocurre a menudo cuando se utilizan epimastigotes de T. cruzi como antígeno, pero no cuando se usan antígenos recombinantes. Los anticuerpos de tipo IgM contra T. cruzi en el bebé no siempre son detectables al nacimiento, quizás porque la infección es muy reciente, o la transmisión ocurrió en la primera parte del embarazo, o existe un exceso de IgG materna que suprime la síntesis fetal de IgM específica, o que el bebé no tenga una respuesta inmune normal. Por lo tanto, la falta de anticuerpos IgM contra antígenos derivados de epimastigotes de T. cruzi no excluye la posibilidad que el bebé se halle cursando una infección. Recientemente se han desarrollado pruebas que detectan IgA contra T. cruzi en el bebé, pero su sensibilidad necesita ser mejorada. (10) La técnica de PCR es una herramienta muy útil combinada con las técnicas convencionales de diagnóstico a la hora de evaluar parasitemia, pero esto depende en gran medida de que el parasito este en circulación sanguínea en el momento de la
toma de muestra destinada a la extracción de ADN para PCR, lo cuál es más probable en pacientes con infecciones recientes o agudas o reinfecciones. (29) Aparenta tener ventajas sobre las técnicas de diagnóstico de rutina y elevada sensibilidad, pero también es necesario considerar su factibilidad desde un punto de vista operacional y de costo-efectividad en el área endémica afectada. Aún se necesita desarrollar un método sencillo, sensible y específico que permita lograr un diagnóstico eficaz para el recién nacido. (10) Tratamiento: Las drogas comúnmente aceptadas para el tratamiento de la enfermedad de Chagas son Nifurtimox (Lampit®, Bayer) y el Benznidazol (Radanil ®, Roche). (1) Ambas tienen efecto tripanomicida, actuando contra las formas amastigote y tripamastigote de T. cruzi. Han demostrado ser efectivos en la fase aguda, crónica indeterminada y crónica determinada de la enfermedad. En Chagas congénito, se debe usar Nifurtimox en dosis de 8-10 mg/kg/día durante 60 días, fraccionado cada 8 ó 12 horas y Benznidazol en dosis de 5-7 mg/kg/día, durante 30 días. (30) Basados en principios y experiencias clínicas en enfermedad de Chagas congénito, éstas drogas son conocidas por reducir la gravedad de los síntomas y acortar el curso clínico y la duración de la parasitemia detectable. La cura parasitológica ocurre en el 60% a 85% de los pacientes en la fase aguda y en más del 90% de los lactantes infectados congénitamente tratados en el primer año de vida. Como el Benznidazol y el Nifurtimox están contraindicados en el embarazo y son bien tolerados en infantes, (31) el diagnóstico temprano de la infección por T. cruzi en recién nacidos, es de gran importancia para optimizar el tratamiento. (32) Estudios sobre el Nifurtimox y Benznidazol, muestran que la tasa de curación depende de la rapidez con que se inicie el tratamiento. (15) La respuesta terapéutica es evaluada con microhematocrito en los recién nacidos el cual suele negativizarse en el 100% de los casos a las tres semanas; (33) técnica muy útil, que puede contribuir a una mejor gestión de La enfermedad de Chagas congénita aun en las zonas rurales de América Latina. (34)
CONCLUSION Si bien la Enfermedad de Chagas es considerada una de las parasitemias mas graves de las Américas, es también una de las enfermedades mas subestimadas. La falta de detección precoz de los casos de Chagas congénito, lleva muchas veces a la evolución de los mismos a formas crónicas; con repercusiones económicas y sociales, y su consecuente deterioro en la calidad de vida, a las que se suma el costo elevado del tratamiento en esa fase. Diagnosticada en el embarazo, la enfermedad de Chagas congénita, es fácilmente tratable en recién nacidos, con tasas de curación de casi el 100% Lo que justifica nuestro interés en abordar el tema, más importante aún en nuestro sistema político de salud dirigido a garantizar la salud del hombre y elevar su calidad de vida. 10
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