N° 7 Agosto 2012
AVANCE
AVANCE Publicación de contenido científico editada por GT Laboratorio S.R.L. Necochea 3274 Rosario
Cloruros
Método colorimétrico con tiocianato de mercurio.
GT Lab ha introducido un método colorimétrico no titrimétrico, con el uso de un monoreactivo y sin requisito de precipitación previa, para determinar cloruros en fluidos biológicos. El método puede emplearse manualmente y en analizadores automáticos.
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Cloruros
AVANCE INTRODUCCIÓN La concentración de iones cloruros en distintos fluidos corporales, muy vinculada a la de iones sodio, tiene gran importancia dada su participación en la regulación osmótica de los fluidos extracelulares y en el balance ácido-base, siendo además parte esencial de los jugos gástricos. Una persona de unos 60 kg de masa tiene unos 100 g de cloro en su cuerpo, lo cual representa un 0,17%. La mayoría de los átomos de cloro del cuerpo humano están como iones cloruro. Por ello el organismo necesita incorporar cloruro de sodio (sal común) en la dieta. Los iones cloruro representan las dos terceras partes de la carga negativa de todos los aniones en la sangre. Juegan un papel esencial en el mantenimiento de la estabilidad de los fluidos corporales y en el correcto pH de los jugos gástricos. Ingerir iones cloruro, principalmente en forma de cloruro de sodio es indispensable para nuestra salud, especialmente si sudamos mucho y en los casos de diarreas. El cloro se almacena en el organismo en los tejidos subcutáneos y en el esqueleto. Los jugos gástricos contienen una solución de cloruros como ácido clorhídrico que mantiene una acidez indispensable para la digestión. La mejor manera, sin embargo de proporcionar el cloro indispensable al organismo es la sal común, aunque no debe abusarse de ella, puesto que al mismo tiempo que tomamos iones cloruro también entran iones sodio, un exceso de los cuales favorece la retención de agua en las células y puede crear problemas en el riñón. La carne, la leche y los huevos contienen también iones cloruro y son una fuente adecuada de éstos. El sudor, la orina y las heces son las tres maneras que tiene nuestro organismo de eliminar iones cloruro. Se trata de un perfecto, aunque delicado equilibrio entre el cloro que entra y el que expulsa; en el caso de que se elimine más cloro del que entra, es indispensable compensar esta pérdida. Los deportistas que eliminan mucho líquido, beben preparados especiales en los cuales se aporta un extra en iones cloruro, entre otras sustancias. La misma necesidad de reponer el equilibrio existe en casos de diarreas y vómitos.
tar la presión arterial y/o causar una acumulación de líquidos en personas con insuficiencia cardíaca congestiva, cirrosis o enfermedad renal. VALORES DE REFERENCIA Suero o plasma: 95 - 115 mmol/l LCR: 95 - 110 mmol/l Orina: 110 - 250 mmol/24h Sudor: Hasta 60 mmol/l Cada laboratorio debe establecer los valores normales correspondientes a su población. Cloremia anormal Alteraciones renales pueden producir elevación o descenso en su concentración. La detección de cloruros en sudor en fundamental en el diagnóstico de fibrosis quística, debido a la pérdida de dicho anión por esta vía. La hipercloremia puede deberse a: • Intoxicación con bromuro • Inhibidores de la anhidrasa carbónica (utilizados para tratar glaucoma) • Acidosis metabólica • Alcalosis respiratoria (compensada) • Acidosis tubular renal • Fibrosis quística Causas de hipocloremia son: • Enfermedad de Addison • Síndrome de Bartter • Quemaduras • Insuficiencia cardíaca congestiva • Deshidratación • Sudoración excesiva • Succión gástrica • Hiperaldosteronismo • Alcalosis metabólica • Acidosis respiratoria (compensada) • Síndrome de secreción inadecuada de hormona antidiurética (SIHAD) • Vómitos • Trastornos gastrointestinales • Medicación diurética
Cloruro en la Dieta El cloruro se encuentra en muchos productos químicos y otras sustancias en el cuerpo. Es una parte importante de la sal presente en muchos alimentos y que se usa para cocinar. El cloruro se encuentra en la sal de cocina o en la sal de mar como cloruro de sodio, al igual que en muchas verduras. Los alimentos con mayores cantidades de cloruro son, entre otros, las algas marinas, el centeno, los tomates, la lechuga, el apio y las aceitunas. El cloruro, junto con el potasio, también se encuentra en la mayoría de alimentos y generalmente es el ingrediente principal de los sustitutos de la sal. Es muy frecuente consumir más cloruro de lo necesario, en la forma de sal de cocina y sal en alimentos preparados. Demasiado cloruro de los alimentos salados puede incremen-
PRINCIPIO DE ENSAYO Los iones cloruro de la muestra desplazan iones tiocianato de su sal mercúrica. Estos, en presencia de iones férricos, forman un complejo coloreado cuyo color es directamente proporcional a la concentración de cloruros, pudiendo evaluarse fotométricamente. Este método no sigue la ley de Lambert-Beer, por lo que debe realizarse una curva de calibración. COMPOSICIÓN DE LOS REACTIVOS PROVISTOS Los reactivos se proveen listos para usar. 2
Cloruros
AVANCE Reactivo: Solución compuesta por: Tiocianato de mercurio…… 4 mmol/l Nitrato de hierro………………… 40 mmol/l Nitrato de mercurio…………… 2 mmol/l Ácido nítrico………………………45 mmol/l Estándar: Cloruro de sodio 125 mmol/l. El estándar ha sido referenciado al Standard Reference Material #909b (National Institute of Standards and Technology, EEUU).
• Acetazolamida • Cloruro de amonio • Andrógenos • Cortisona • Estrógeno • Guanetidina • Metildopa • Antinflamatorios no esteroides (AINES) Los fármacos que pueden disminuir las mediciones de cloruro sérico abarcan: • Aldosterona • Compuestos que contengan bicarbonatos • Diuréticos de asa • Diuréticos tiazídicos • Triamtereno Nunca deje de tomar un medicamento sin hablar primero con el médico.
CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD Conserve los reactivos refrigerados (2-8ºC) sin congelar. La estabilidad alcanza la fecha de vencimiento indicada en la caja. PRECAUCIONES Y ADVERTENCIAS SOBRE SU USO Los reactivos son para uso IN VITRO exclusivamente. El Reactivo es corrosivo y su contacto con la piel produce quemaduras. El tiocianato de mercurio es tóxico por inhalación, ingestión y contacto con piel y mucosas. Su toxicidad tiene efectos acumulativos. En caso de contacto con piel o mucosas, lave inmediatamente con abundante agua y consulte a un médico. La caja y los envases contenidos en este producto no deben ser reusados, debiendo descartarse como residuos peligrosos una vez empleados, de acuerdo a la legislación vigente. El personal que manipula los mismos debe ser debidamente capacitado para su manejo y descarte por la institución o laboratorio que lo emplea.
ENSAYO Curva de calibración: En 6 tubos de ensayos prepare diluciones del Estándar siguiendo el esquema siguiente: TUBO Agua destilada Estándar Concentración final (mmol/l)
1 100 0 0
2 90 10 12.5
3 75 25 31.2
4 50 50 62.5
5 25 75 93.7
6 0 100 125
Procese cada dilución de acuerdo a lo descripto en Procedimiento, más abajo. Grafique los datos de absorbancia obtenidos en función de las concentraciones respectivas sobre papel milimetrado.
REACTIVOS NECESARIOS PERO NO PROVISTOS QUALISET CALIBRADORES (Código 601205: 1 x 5 ml Nivel 2). MUESTRA Suero, plasma, líquido cefalorraquídeo (LCR), sudor u orina Suero/plasma heparinizado: Obtenga de la manera usual, libre de hemólisis. Separe el paquete globular por centrifugación dentro de los 30 minutos de obtenida la muestra. Orina: Recoja orina de 24 horas en recipientes libres de cloruros. Diluya la muestra 1/2 en agua destilada para su análisis y multiplique el resultado obtenido por 2. LCR: Los LCR deben ser límpidos. Condiciones de conservación de las muestras. Temperatura ambiente (15-25ºC): 24 horas Refrigerado (2-8ºC): 7 días Congelado (-20ºC): 3 meses
Procedimiento: PREVIAMENTE, ATEMPERE EL REACTIVO. En tres tubos marcados B (blanco), E (estándar) y D (desconocido) agregue:
Muestra
B ---
Reactivo 1 ml Mezcle e incube 5 minutos a 37ºC
D 3µl 1 ml
Mezcle. Incube 5 minutos a 37ºC o temperatura ambiente superior a 15ºC. Lea en espectrofotómetro o fotocolorímetro a 480 nm (440-500 nm), llevando a cero con Blanco de Reactivos. Color estable 30 minutos. CALCULOS Lleve la lectura así obtenida a la Curva de Calibración.
SUSTANCIAS INTERFERENTES Hemólisis y bilirrubinemia moderadas, no interfieren. La hiperlipemia puede causar turbidez al finalizar el ensayo. En tal caso, procesar una dilución de la muestra. Los fármacos que pueden incrementar las mediciones del cloruro sérico abarcan:
ADAPTACIONES PARA AUTOMATIZACIÓN El método es adaptable a analizadores automatizados. Están disponibles adaptaciones para diferentes instrumentos. En la Tabla I se indican los parámetros genéricos a emplear en automatización. 3
Cloruros
AVANCE CONTROL DE CALIDAD Se recomienda procesar juntamente con las muestras, sueros control normal y anormal para controlar el desempeño del ensayo. Se aconseja el uso de Qualiset Sueros Control Nivel 1 y 2 GT Lab (Códigos 602105 y 602205) Cada Laboratorio debe diseñar su propio sistema de Control de Calidad Interno y establecer las medidas correctivas si se superan los límites de tolerancia aceptables.
cubetas de caras paralelas con un paso de luz de 1 cm, es aproximadamente 1.2 mmol/l. d- Especificidad: La hemólisis y los anticoagulantes a excepción de la heparina, no interfieren. La bilirrubina hasta 120 mg/l, albúmina hasta 150 g/l y triglicéridos hasta 6 g/l no alteran significativamente los datos del ensayo. Los trabajos de Young han descrito varias drogas y otras substancias que interfieren con la determinación. e- Recuperación: La recuperación obtenida por agregado de cantidades conocidas de cloruro de sodio a muestras biológicas estuvo entre el 98,2 y el 103,4%, dentro del rango establecido en b-.
EVALUACION DE DESEMPEÑO a- Comparación con otros métodos: En el desarrollo del producto se efectuaron comparaciones de muestras contra métodos comerciales aprobados por ANMAT y tomados como referencia: un método colorimétrico importado de igual fundamento técnico y un método instrumental por ión selectivo. Los resultados se muestran seguidamente y en los Graficos 1 y 2. Equipo Importado colorimétrico D.O.
mmol/l
GTLab Ensayo
Cloruros Pool ml
Concentrado µl (*)
Std (100): Teórico
puro
Método por Ión selectivo
0,110
Lecturas
Resultados mmol/l
0,099
89,9
recuperación %
5,00
2
91,3
0,101
91,6
100,4
D.O.
mmol/l
mmol/l
5,00
5
93,3
0,102
92,7
99,3
0,222
BR
0,101
BR
BR
5,00
10
96,7
0,110
100,0
103,4
0,102
Std
0,098
Std
Std
5,00
20
103,5
0,111
101,3
97,9
0,077 0,041 0,098 0,080 0,067 0,048 0,095 0,077 0,073 0,051 0,078 0,063 0,097 0,100 0,077 0,087 0,077 0,073 0,081 0,088 0,070
95,0 49,7 120,5 97,6 81,5 59,0 116,1 94,9 89,2 62,9 95,7 77,1 119,5 122,7 94,7 106,3 94,2 88,9 98,8 108,3 86,2
0,077 0,040 0,094 0,080 0,065 0,048 0,092 0,074 0,068 0,047 0,074 0,063 0,092 0,092 0,074 0,080 0,075 0,074 0,082 0,085 0,070
97,6 50,4 120,1 102,3 83,3 61,0 117,7 94,0 87,0 60,4 94,8 80,0 117,2 117,4 94,2 101,6 96,1 94,6 104,4 108,1 89,4
102,7 53,6 121,9 100,4 88,8 60,3 116,7 90,6 86,3 59,6 94,8 80,9 119,4 118,8 93,6 100,5 99,2 93,8 103,9 110,8 89,8
5,00
30
110,2
0,119
108,3
98,2
5,00
40
117,0
0,128
116,0
99,2
5,00
50
123,7
0,134
121,9
98,6
f- Reproducibilidad: INTRA ENSAYO (n=10) Estándar 0,099 Muestra
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Contra colorimetrico Ecuación de regresión y= 0,958 x + 4,526 Coeficiente de correlación: 0,988
Lectura
mmol/l
Lectura
mmol/l
Lectura
mmol/l
0,048 0,048 0,047 0,047 0,046 0,048 0,047 0,048 0,048 0,047
60,8 60,2 59,3 59,3 58,4 60,2 59,3 60,4 60,5 59,5
0,071 0,073 0,073 0,071 0,073 0,073 0,071 0,072 0,073 0,071
90,1 91,7 92,1 89,6 91,8 91,7 90,0 91,1 92,7 89,4
0,088 0,086 0,086 0,086 0,085 0,088 0,085 0,087 0,087 0,087
110,7 108,8 108,1 109,2 107,6 111,3 107,1 109,9 109,6 109,7
Promedio SD mmol/l ± C.V. %±
Contra ión selectivo Ecuación de regresión y= 0,989 x + 0,365 Coeficiente de correlación: 0,993 b- Linealidad: La reacción cumple con la ley de Lambert & Beer entre 1 y 130 mmol/l. c- Sensibilidad: La sensibilidad en espectrofotómetro a 480 nm, leyendo en 4
Cloruros
59,8 5
93,3
91,0 0,102
92,7
109,2 99,3
AVANCE INTER ENSAYO (n=10) Muestra
Std
Lectura
mmol/l
Lectura
mmol/l
Lectura
mmol/l
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0,100 0,101 0,103 0,099 0,098 0,100 0,102 0,099 0,101 0,101
0,047 0,050 0,051 0,047 0,046 0,050 0,051 0,047 0,048 0,049
59,3 62,6 62,2 59,6 58,9 62,0 62,1 59,8 58,7 60,5
0,073 0,073 0,079 0,074 0,073 0,074 0,076 0,074 0,077 0,074
91,1 90,4 95,7 93,0 92,5 91,8 93,2 93,8 95,4 91,6
0,090 0,087 0,089 0,088 0,085 0,090 0,091 0,088 0,090 0,088
112,8 108,1 108,6 110,2 108,2 112,0 111,5 112,0 111,3 108,8
Promedio SD mmol/l ± C.V. %±
60,6
92,8
110,4
1,5 2,5
1,8 1,9
1,8 1,6
g- Inexactitud e Imprecisión: El tratamiento estadístico de la inexactitud e imprecisión están desarrollados más arriba en “Comparación con otros métodos” y en “Reproducibilidad”. Resultados incorrectos pueden obtenerse si no se respetan estrictamente las indicaciones dadas en el Manual de Instrucciones sobre Procedimientos de Uso, Calidad de la Muestra, uso de anticoagulante, etc. SUSTANCIAS DE REFERENCIA El estándar ha sido referenciado al Standard Reference Material #909b (National Institute of Standards and Technology, EEUU).
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AVANCE GRﾃ：ICO 1
GRﾃ：ICO 2
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AVANCE BIBLIOGRAFIA 1- DuBose TD Jr. Disorders of acid-base balance. In: Brenner BM, ed. Brenner and Rector’s The -Kidney. 8th ed. Philadelphia, Pa: Saunders Elsevier;2008:chap 14. 2- Escott-Stump S, ed. Nutrition and Diagnosis-Related Care. 6th ed. Philadelphia, Pa: Lippincott Williams & Wilkins; 2008. 3- Institute of Medicine. Food and Nutrition Board. Dietary Reference Intakes for Water, Potassium, Sodium, Chloride, and Sulfate. National Academy Press, Washington, DC, 2004. 4- Sarubin Fragaakis A, Thomson C. The Health Professional’s Guide to Popular Dietary Supplements. 3rd ed. Chicago, Il: American Dietetic Association; 2007. 5- Seifter JL. Acid-base disorders. In: Goldman L, Ausiello D, eds. Cecil Medicine. 23rd ed. Philadelphia, Pa: Saunders Elsevier; 2007:chap 119.
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