Thiago Martins de Carvalho by Héber Bensi

INSTITUTO FEDERAL DE EDUCAÇÃO, CIÊNCIA E TECNOLOGIA DO ESTADO DE SÃO PAULO – CAMPUS SÃO ROQUE

Thiago Martins de Carvalho

ANTAGONISMO DO RECEPTOR DE ESTRÓGENO NA EXPRESSÃO DE GENES REGULADOS PELA TRIIODOTIRONINA EM LINHAGENS CELULARES DE ADENOCARCINOMA MAMÁRIO

SÃO ROQUE 2015

INSTITUTO FEDERAL DE EDUCAÇÃO, CIÊNCIA E TECNOLOGIA DO ESTADO DE SÃO PAULO – CAMPUS SÃO ROQUE

Thiago Martins de Carvalho

ANTAGONISMO DO RECEPTOR DE ESTRÓGENO NA EXPRESSÃO DE GENES REGULADOS PELA TRIIODOTIRONINA EM LINHAGENS CELULARES DE ADENOCARCINOMA MAMÁRIO.

Trabalho de conclusão de curso apresentado como requisito para obtenção do título de Licenciado em Ciências Biológicas sob orientação do Professor Doutor Sandro José Conde.

SÃO ROQUE 2015

Nome: Thiago Martins de Carvalho Título: Antagonismo do receptor de estrógeno na expressão de genes regulados pela triiodotironina em linhagens celulares de adenocarcinoma mamário.

Trabalho de conclusão de curso apresentado ao Instituto Federal de Educação, Ciências e Tecnologia do Estado de São Paulo – Campus São Roque, como requisito para obtenção do título de Licenciado em Ciências Biológicas.

APROVADO EM: ___/___/_____

Banca Examinadora

Prof. Dr ____________________

Instituição:___________________

Julgamento:__________________

Assinatura:___________________

Prof. Dr ____________________

Instituição:___________________

Julgamento:__________________

Assinatura:___________________

Prof. Dr ____________________

Instituição:___________________

Julgamento:__________________

Assinatura:___________________

AGRADECIMENTOS A produção desse trabalho demandou muito esforço e não teria finalizado sem auxílio de algumas pessoas e instituições, a elas a minha profunda e sincera gratidão. Primeiramente agradeço a minha família, especialmente minha mãe Maria Alcenira e irmã Liziane Martins que me criaram, me ensinaram o valor do trabalho honesto e não medem esforços para continuidade do meu desenvolvimento acadêmico. Agradeço ao meu orientador Prof° Dr.Sandro J. Conde que ao longo desses últimos meses foi imensamente atencioso comigo, me atendendo sempre, me corrigindo, contribuindo imensamente para produção desse trabalho e meu desenvolvimento como aluno e cientista, com sua vasta experiência, integridade profissional e bom humor. Agradeço as minhas parceiras de laboratório e amigas Beatriz Moraes e Gabriela Souza que compartilharam comigo muitas horas de trabalho, correrias no laboratório, preocupações com cronograma e boas risadas. Meninas, esse trabalho é nosso. Agradeço ao Centro de Estudar Acaia Sagarana que foi fundamental para minha entrada no meio acadêmico e contribui de forma significativa na minha formação contínua como estudante, docente e cidadão. Agradeço ao IFSP- campus São Roque por todo apoio no meu desenvolvimento acadêmico no qual participaram professores, técnicos de laboratório e demais servidores. Agradeço aos meus amigos e colegas que também contribuíram com momentos de descontração, troca de informações e de explicações informais do “ estranho” título do meu trabalho. Dentre os amigos agradeço especialmente a Iohana Barbosa, Hellen Santos e Ana P. Silva por todo apoio nesses últimos meses e anos, sempre estendendo a mão amiga e me ouvindo quando mais preciso. E para finalizar, agradeço especialmente aos professores Paulo R. da Cunha, Daniel V. Helene, Lisângela Kati do Nascimento e Fernando Santiago do Santos que são meus exemplos reais de excelentes professores e pesquisadores, detentores de vasta sabedoria, ética e profundo amor pelo que fazem. Conhecer e conviver com vocês me incentiva ser um professor e pesquisador cada vez melhor.

CARVALHO, T. M. Antagonismo do receptor de estrógeno na expressão de genes regulados pela triiodotironina em linhagens celulares de adenocarcinoma mamário. [Trabalho de Conclusão do Curso de Licenciatura em Ciências Biológicas]. Instituto Federal de São Paulo- São Roque,2015.

RESUMO Sabe-se que o estrógeno (E2) e o status hormonal da paciente influenciam a proliferação e o tratamento do câncer de mama (CaM). Quanto ao hormônio triodotironina (T3), apesar dos estudos epidemiológicos serem ainda contraditórios em relação a sua influência no câncer de mama, estudos laboratoriais demonstram sua capacidade de aumentar a proliferação de células de CaM com receptor de E2 (ER) positivo, induzindo a expressão de genes normalmente estimulados por E2 (PR, TGFA). Ações não genômicas dos hormônios tireoidianos são descritas na membrana plasmática, no citoplasma e em organelas celulares. O Fulvestrant (ICI), devido suas ações antagonistas dos receptores de estrógeno, tem demonstrado grande relevância no tratamento do câncer de mama com o advento da hormoterapia. Portanto o objetivo teórico/científico desse projeto é determinar a participação do receptor de estrógeno na ativação gênica pela triiodotironina em linhagens celulares de adenocarcinoma de mama (MCF-7). A partir dos dados obtidos não se verifica a relação entre o ICI, os hormônios E2 e T3 na expressão dos genes CLDN6 e FBLN1 em linhagem de celular de MCF-7, indicando que o bloqueio do receptor de estrógeno não está envolvido na expressão desses dois genes. Entretanto, ressalta-se a necessidade de diminuição do erro entre os resultados das triplicatas, com o aumento do número de triplicatas e maior homogeneidade entre quantidades de RNA extraídos e mensurados, garantindo maior confiabilidade na expressão gênica dos diferentes tratamentos.

Palavras chave: tumores estrógeno dependentes, ativação pela triiodotironina, ICI, câncer de mama, linhagem celular MCF-7.

CARVALHO, T. M. Estrogen receptor antagonism in the expression of genes regulated by triiodothyronine in cell lines of mammary adenocarcinoma. [Academic Coursework in Biological Sciences]. SĂŁo Paulo Federal Institute.SĂŁo Roque, 2015.

ABSTRACT It is known that estrogen (E2) and the patient hormonal status influence the proliferation and treatment of breast cancer. Although epidemiological studies of triiodothyronine are still contradictory in relation to their influence on breast cancer, laboratory studies have demonstrated its ability to increase proliferation of breast cancer cells that show E2 receptor (ER) positivity, by inducing expression of genes normally stimulated by E2 (PR, TGFA). Non-genomic actions of thyroid hormones are described

the

plasma

membrane,

the

cytoplasm

and

cell

organelles.

Fulvestrant(ICI), due to its estrogen-receptor antagonism has demonstrated great relevance to breast cancer treatment as a component of hormone therapy. Thus, this work aimed to determine the estrogen receptor involvement in gene activation by T3 in MCF-7 breast cancer cell lines. From the data obtained, was not verified the relationship between the ICI and E2 or T3 hormones on the expression of CLDN6 and FBLN1 genes in MCF-7 cell lines, suggesting that estrogen receptor is not involved in the expression of these two genes. However, it emphasizes the need to reduce the error between the results of the triplicate, with the increase of samples and greater homogeneity among amounts of RNA extracted and measured, ensuring greater reliability in gene expression of different treatments.

Keywords: estrogen dependent tumors, activation by triiodothyronine, ICI, breast cancer, MCF-7 cell line.

LISTAS DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1. Linhagem celular com 20% de confluência ...............................................25

Figura 2. Linhagem celular com 80% de confluência ...............................................25

Figura 3. Gráfico da expressão gênica do CLDN6 em células MCF-7 nos tratamentos de 10 minutos (A), 30 minutos (B), 1 hora (C) e 48 horas (D)....................................26

Figura 4. Gráfico da expressão gênica do FBLN1 em células MCF-7 nos tratamentos de 10 minutos (E), 30 minutos (F), 1 hora (G) e 48 horas (H)....................................27

Figura 5. Gráficos da expressão Gênica do FBLN1 e CLDN6 sob ação dos hormônios E2 (I) e T3 (J).)............................................................................................................29

Figura 6. Gráfico da proliferação de linhagem celular MCF-7 em tratamento com T3 e ICI (K).........................................................................................................................29

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Descrição dos tratamentos: composição e concentração.........................20 Tabela 2. Esquema de tratamentos em modelo de três fatores................................21

LISTA DE ABREVIATURAS

AMPc - Adenosina Monofosfato Cíclico DMSO - Sulfóxido dimetilo ER - Receptor de estrógeno E2 - Estrógeno GPCR - G protein–coupled receptors ICI - Cell Cycle Inhibition IP3 - Inferon Inositol Trifosfato MAPK - Mitogen activated protein kinases MEK - Mitogen Kinase MISS - Membrane initiated steroid signaling NcoR - Corepressor nuclear do receptor PKA – Proteina Kinase A PKC - Proteína quinase C Raf 1 - Rapidly Accelerated Fibrosarcoma Ras - Proteína Ras RXR - Retinoid X receptor SMRT- Silencing mediator of retinoid acid and thyroid hormone receptor TGFA – Transforming Growth Factor Alpha. TR e – Receptor de triiodotironina TER – Elementos responsivos tiroidianos T3 - Triiodotironina T4 - Tiroxina

SUMÁRIO

1.INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 10 2.HIPÓTESE ............................................................................................................. 13 3.OBJETIVO.............................................................................................................. 14 4. MATERIAIS E METÓDOS..................................................................................... 15 4.1 Materiais permanentes ..................................................................................... 15 4.2 Materiais de consumo ...................................................................................... 15 4.3 Cultura Celular ................................................................................................. 16 4.3.1 Descrição e Descongelamento .................................................................. 16 4.3.2 Manutenção e Expansão das Linhagens Celulares ................................... 17 4.3.3 Tripsinização .............................................................................................. 17 4.3.4 Contagem .................................................................................................. 18 4.3.5 Congelamento ........................................................................................... 18 4.3.6 Medidas de Controle .................................................................................. 18 4.3.7 Plaqueamento ............................................................................................ 19 4.4 Diluição das drogas.......................................................................................... 19 4.5 Tratamento da linhagem celular ....................................................................... 20 4.6 Extração de RNA total...................................................................................... 21 4.6.1 Homogeinização ........................................................................................ 21 4.6.2 Fase de Separação.................................................................................... 22 4.6.3 Precipitação do RNA .................................................................................. 22 4.6.4 Lavagem do RNA....................................................................................... 22 4.6.5. Redissolvendo o RNA ............................................................................... 22 4.6.6 Quantificação ............................................................................................. 23 4.6.7 Transcrição Reversa .................................................................................. 23 4.6.8 Reação da polimerase em cadeira ............................................................ 23 5. RESULTADOS ...................................................................................................... 25 5.1 Cultura Celular ................................................................................................. 25 5.2 Expressão gênica............................................................................................. 26 6. DISCUSSÃO ......................................................................................................... 28 7.CONSIDERAÇÕES FINAIS ................................................................................... 31 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................... 32

1.INTRODUÇÃO

Em tecidos mamários os hormônios tireóideos são necessários para o desenvolvimento de alguns tumores de ratos estrógeno-dependentes (SORRENTINO et al, 1976). A controvérsia sobre o papel desses hormônios, tanto na etiologia quanto no tratamento do câncer de mama é bastante grande. Kapdi & Wolfe, (1976) e Mustacchi & Greenspan (1977) encontraram uma associação entre ingestão de hormônios tireóideos e aumento do risco de câncer mamário. Por outro lado, Vorherr (1987) descreve um aumento na sobrevida em pacientes hipertireóideas com câncer de mama e sugere que o hipertireoidismo parece proteger contra o desenvolvimento de câncer de mama por aumentar a globulina ligadora de hormônios esteróides e por diminuir a atividade estrogênica sobre o tecido mamário. Se, por um lado, observações clínicas e epidemiológicas (VORHERR,1987; TURKEN et al, 2003) reforçam uma relação entre disfunção da glândula tireóide com a presença de adenocarcinoma de mama (CaM), os estudos são contraditórios no que se refere ao tipo de patologia tireoidiana e como essa influência pode ocorrer. Novos locais de ligação do estrógeno (E2) foram identificados na membrana de células endometriais, os quais induziam a formação de Adenosina Monofosfato Cíclico – AMPc (PIETRAS et al,1977), importante mensageiro secundário que envolvido com modulação de processos fisiológicos. Estudos posteriores também evidenciaram a presença de receptor de estrógeno (ER) fora do núcleo celular, o qual medeia sinais rápidos originados da membrana ou do citoplasma (LOSEL et al, 2003; WATSON et al, 2005).Essa ação não genômica do ER ou membrane-initiated steroid signaling (MISS) ocorre após minutos da adição do E2(KELLY et al, 2001; MARINO et al, 2002).Esses receptores foram encontrados nos tecidos ósseos, neural, uterino, gorduroso, nas células endoteliais, células tumorais de mama e hipófise (RASMUSSON et al, 1987; WATSON et al, 2005; HO et al, 2002; CHABAN et al, 2004). Quanto ao hormônio tireoidiano, sabe-se que o T3 regula a expressão de genes nucleares pela ligação aos receptores de hormônio tireoidiano TR alfa e TR beta. Os receptores de hormônio tireoidiano (TR) reconhecem específicos elementos responsivos tireoidianos (TRE) nos promotores de genes alvos e ativam ou reprimem a transcrição na presença do hormônio. Assim, as ações nucleares do T3 são

sensíveis a inibidores da transcrição e tradução e tem uma latência de horas a dias (YEN,2001). Foi evidenciado de que o hormônio tireoidiano pode exercer suas ações por vários mecanismos: além da via clássica de ação por TR/TER e ativação nuclear (MOELLER et al, 2011). Ações não genômicas dos hormônios tireoidianos são descritas na membrana plasmática, no citoplasma e em organelas celulares. In vitro, independente da síntese protéica, T4 induz IP3 e sinalização pelo cálcio aumentando os efeitos de interferon- via PKC e PKA (DAVIS et al, 1989; LIN et al, 1997). Além disso, T4 ligado a agarose, que não permite a passagem através da membrana, apresentou atividade MAPK por um receptor de membrana do hormônio tireoidiano associado à proteína G (LIN et al, 1999). Esse receptor leva à fosforilação rápida da serina de TRs nucleares (DAVIS et al, 2000). Este modelo proposto por Davis e colaboradores para a ação não genômica mediada na superfície celular através do hormônio tireoidiano envolve tanto a cascata da MAPK como a quinase-PI3(LIN et al, 1999; STOREY et al, 2002).Neste modelo, em um período de tempo entre 10-30min, T4 liga-se a GPCR da superfície celular(LIN et al, 1999)ativando PKC, Ras, Raf1 e MEK resultando na fosforilação de tirosina, ativação e translocação nuclear de MAPK, que, por sua vez, fosforila um resíduo de serina no segundo dedo de zinco do TR(DAVIS et al, 2000; SHIN et al, 2001).Esta fosforilação resulta na dissociação do TR de seus co-repressores SMRT e NcoR, diminuindo a atividade das proteases, aumentando a atividade transcricional (JONES et al, 1994; TING et al, 1997) e pode também regular heterodimerização com RXR (KATZ et al, 1995). No que se refere ao câncer de mama, pouco se sabe sobre a maneira como o T3 modula o seu receptor no tecido tumoral. Foi demonstrada por Burke & McGuire (1978) a presença de receptores para T3 no núcleo de uma linhagem de células derivadas de câncer de mama humano (MCF-7). Cerbon et al (1981) comprovaram a presença de receptores nucleares para T3 em câncer de mama, embora não tenha sido observada correlação alguma com a concentração de outros receptores hormonais (E2 e progesterona) ou estadiamento do tumor. Shao et al (1995) demonstraram que o T3 potencializa a ação do E2 nas linhagens de câncer de mama ER positivo. Sabe-se que o E2 e o status hormonal da paciente são importantes para a proliferação e o tratamento do câncer de mama (JESEN et al, 2001). Quanto ao T3,

apesar dos estudos epidemiológicos serem ainda contraditórios em relação a sua influência no câncer de mama (VORHERR,1987; THOMAS et al, 1983; ROSEN et al, 1978; SARAIVA et al, 2005), estudos laboratoriais demonstram sua capacidade de aumentar a proliferação de células de CaM com ER positivo, induzindo a expressão de genes normalmente estimulados por E2 (NOGUEIRA et al, 1996). Figueiredo et al (2014) utilizaram uma plataforma de microarray com mais de 4600 etiquetas de seqüências expressas, sobre as células MCF-7 submetidas aos tratamentos com E2 ou T3. Nessa plataforma foi observado que 393 genes apresentaram expressão alterada em ambos tratamentos, sendo que três deles apresentaram um alto nível de expressão diferencial em ambos tratamentos: Anphiregulin (AREG), Fibulin 1 (FBLN1) e Claudin 6 (CLDN6). Recentemente evidenciou-se que E2 e T3 promovem a proliferação celular das linhagens de câncer de mama MCF-7 e T47 e esta proliferação foi supressa pela coadministração de ICI, antagonista do receptor de E2 (HALL et al, 2008). Nesse mesmo trabalho foi evidenciado que o T3 foi capaz de induzir a atuação da expressão gênica através do elemento responsivo ao E2 nas células MCF-7. Esses autores também demonstraram que o T3 pode aumentar o efeito do E2 na proliferação celular de câncer de mama dose-dependente. Em concordância com esses achados CONDE et al (2008) evidenciaram que o tamoxifen inibe a expressão gênica do fator de crescimento α (TGFA) em cultura primária de carcinoma humano tratado com triiodotironina. Considerando-se os dados de influência do hormônio tireoidiano em carcinoma mamário, somando-se trabalhos de Conde et al ( 2008, 2011) e Saraiva et al (2005) que observaram uma maior frequência de hipertireoidismo em pacientes menopausadas portadoras de câncer de mama juntamente com o fato de análogos dos hormônios tireoidianos exercerem ativação da via PI3K, torna-se relevante estudar como as expressões de FBLN1 e CLDN6, já observadas pelos mesmos autores, que são controladas pela ação do hormônio tireoidiano em modelos com baixa deriva genética como linhagens celulares MCF-7. Dessa forma, procura-se delimitar melhor a ação do hormônio e sua aplicabilidade durante a terapêutica do carcinoma mamário.

2.HIPĂ&#x201C;TESE

O Fulvestrant (ICI) como antagonista dos receptores de E2 pode bloquear genes regulados pela triiodotironina em linhagens celulares de adenocarcinoma mamĂĄrio.

3.OBJETIVO

O objetivo teórico/científico desse projeto é determinar a participação do receptor de estrógeno na ativação gênica pela triiodotironina em linhagens celulares de adenocarcinoma de mama MCF-7.

4. MATERIAIS E METÓDOS

4.1 Materiais permanentes 

Tanque de Nitrogênio Líquido;



Tubos Polietileno;



Banho Maria;



Frascos Plásticos de Cultura Celular;



Câmara de Fluxo Laminar;



Tubos Eppendorf;



Micropipetas Gilson;



Ponteiras;



Centrifuga;



Geladeira;



Freezer;



Tubos Falcon;



Bandejas de Amostras;



Estufa;



Autoclave;



Espectofotometro ( Nanodrop).

4.2 Materiais de consumo 

Células MCF- 7;



Meio de Crescimento RPMI (Gibco, Cat. n 31800-014);



Soro Fetal Bovino (Gibco, Cat. n10082-147);



Antibiótico/ Antimicótico (Gibco, Cat. n 15240-062);



Tripsina (tripsina 0,2% e EDTA 0,02% - Gibco);



Etanol 70%;



DMSO;



Hormônios (T3 e E2).

4.3 Cultura Celular

4.3.1 Descrição e Descongelamento

As células MCF-7, utilizadas ao longo do projeto, são mantidas em tubos polietileno, em concentrações de aproximadamente 1x106 células por ml, congeladas e mantidas em nitrogênio líquido. Cabe salientar que as linhagens inicialmente cultivadas foram gentilmente cedidas pela Profa° Célia Regina Nogueira, do Laboratório de Biologia Molecular da FM/UNESP, das quais se extraiu clones utilizados nas demais culturas do projeto. O cultivo inicia-se com descongelamento das células. Para tanto, os tubos de polietileno, nas quais estão armazenadas as células, são retirados do nitrogênio líquido, colocados rapidamente em uma bandeja de amostras e mantidos em banho maria sobre temperatura de aproximadamente 37° C, temperatura ideal para crescimento celular. Paralelamente é realizada a esterilização da câmara de fluxo laminar e das pipetas com etanol 70% e radiação ultravioleta por 15 minutos, separação das ponteiras e tubos falcon autoclavados e aquecimento a 37°C dos componentes que compõem a cultura: RPMI, Soro Fetal Bovino (SFB) e Antibiótico/ Antimicótico(A/A); para a diminuição da morte das células por choque térmico. Após o descongelamento, as células são transportadas para câmara de fluxo laminar, onde são transferidas para um tubo falcon de 15ml, recebem 4ml de RPMI e 1ml de SFB. O tubo falcon fechado é centrifugado por 2 minutos a 2500 rpm (rotações por minutos). Após a centrifugação é possível observar um pellet de células no fundo do tubo falcon. Em seguida, as células são ressuspendidas com auxílio da micropipeta, transferidas para garrafa plástica pequena (40ml), onde recebem as quantidades complementares do meio de cultura, resultando em 4,5ml de RPMI, 0,5ml de SBF e 50µl de A/A por garrafa pequena. A garrafa com as células e meio cultura é fechada e conduzida até uma estufa com uma taxa de 5%/95% de CO2/O2 a 37oC respectivamente, onde permanece durante seu crescimento.

4.3.2 Manutenção e Expansão das Linhagens Celulares

As garrafas com meio de cultura foram mantidas na estufa e a cada dois dias o meio de cultura foi trocado para que os nutrientes que favorecem o crescimento celular não se esgotassem. Para tanto, sempre ao trocar o meio foi necessário aquecer a 37° C os componentes do meio de cultura, preparar o ambiente estéril da câmara de fluxo laminar e separar os materiais autoclavados. Em seguida, retirar com micropipeta o meio de cultura da garrafa, tomando cuidado para não encostar no fundo da garrafa onde as células permanecem aderidas, descartar o meio antigo, e colocar as quantidades de meio de cultura adequadas para o tamanho de cada garrafa, podendo ela ser pequena, média ou grande, nas quais seus tamanhos são respetivamente 40 ml, 150 ml e 450ml. Após a troca do meio de cultura, a garrafa retorna para estufa, onde permanecem estáveis até uma nova troca do meio cultura. Quando atingem confluência superior a 75%, as células são tripsinizadas para passagem para uma nova garrafa, seguindo com crescimento da linhagem, ou congelada novamente. A passagem para outra garrafa ocorre quando a quantidade de células requer mais espaço para sua proliferação. Ao serem descongeladas as células são inicialmente cultivadas em uma garrafa pequena, mas ao atingirem uma concentração superior a 1,5 x 106células/ml são transferidas para garrafa média e posteriormente, quando atingem uma maior concentração, para uma garrafa grande. A concentração de células por ml é determinada por uma estimativa, após contagem em hemocitômetro (câmara de Neubauer).

4.3.3 Tripsinização

Antes de atingirem confluência total nas garrafas, as células são submetidas à tripsinização. Em ambiente esterilizado da câmara de fluxo laminar, o meio de cultura é retirado da garrafa e descartado. Lava-se com 2ml de DPBS o meio, em seguida coloca-se aproximadamente 1 ou 2 ml de tripsina diretamente na parede da garrafa onde estão aderidas. Com a garrafa fechada, são realizados movimentos circulares com a garrafa para que a tripsina aja sobre células. A tripsina digere parte da

membrana plasmática assim rompendo a fixação das células no fundo da garrafa. A ação da tripsina, por ser bem agressiva, deve durar poucos minutos até células desafixarem da garrafa. Rapidamente a substância túrbida de tripsina e células deve ser colocada em um tubo falcon de 15 ml com 4 RPMI e 1 SFB, ambos que interrompem a ação da tripsina. Tubo falcon é centrifugado por 2 minutos a 2500 rpm. Retornando ao ambiente do fluxo laminar, o sobrenadante formado é descartado, o pellet de células formado é ressuspendido com 4ml de RPMI e colocado em nova garrafa onde recebe os componentes do meio de cultura nas concentrações adequadas.

4.3.4 Contagem

Após tripsinização, retira-se uma alíquota de 100µl de células em ependorf onde recebem 300µl de triplam blue. Essa solução é colocada câmara de Neubauer e a partir da contagem das células, infere-se a concentração de células por ml.

4.3.5 Congelamento

Após a tripsinização é possível estocar parte das culturas celulares produzidas, acrescentando SFB 30% (Gibco) e dimetilsulfóxido (DMSO – Sigma) 10% em alíquotas de 2ml, contendo cerca de 10 6 células/ml, que serão transferidas para tubos de polietileno, colocados em estantes de isopor com gelo e congelados a –70C por 24h e depois estocados em nitrogênio líquido.

4.3.6 Medidas de Controle

Diversas medidas foram adotadas para evitar a contaminação das células durante sua manipulação como utilização de luvas, lavar bem as mãos e punhos com água e etanol 70%, não interromper a passagem de ar da câmara de fluxo laminar, autoclavar materiais que entram em contato com as células, sempre passar álcool nas mãos e materiais ao inseri-los no ambiente da câmara de fluxo laminar, não utilizar ponteiras que encostassem em superfícies dos materiais utilizados ao se manipular

as células, utilizar uma ponteira para cada componente do meio de cultura e lacrar as tampas dos frascos com parafilme.

4.3.7 Plaqueamento

Nessa etapa as células foram preparadas para o início dos tratamentos. Para o plaqueamento foram utilizadas placas de seis poços, com uma área crescimento de 9,03cm2. Foi realizada a contagem das células em câmara de Neubauer, para que fossem divididas de maneira a ficarem com um valor de 1x10 5 células em cada poço. No momento do plaqueamento o SFB usado durante todo o cultivo celular é substituído por SFB filtrado, que consiste num soro livre de hormônios e outras substâncias que possam interferir na ação dos hormônios e drogas durante o tratamento. Depois das células serem plaqueadas em todos os poços, a placa foi levada para a estufa, onde permaneceu por dois dias, para que as células crescessem e atingissem a confluência, para então dar-se o início dos tratamentos.

4.4 Diluição das drogas

Antes de começar os tratamentos foram realizados os cálculos para a diluição do CHX e dos hormônios utilizados. Utilizou-se nesse experimento o hormônio Triiodotironina (T3) na concentração supra-fisiológica (10-8M), o estrogênio (E2) na concentração de (10-7M) e o inibidor de síntese proteica CHX, na concentração de (50μM). Para diluição do E2 foi necessário fazer uma solução mãe primeiramente, para essa solução foram pesados 8,17 mg do hormônio em balança de precisão, e esse valor foi diluído em 10 ml de etanol (C2H6O). O mesmo ocorreu no caso do T3, onde foram pesados 10,1 mg, para diluição em 25 ml de Na(OH) a 1N. E para a diluição do ICI em 7,5ml de DMSO, foram pesadas 9,1 mg da droga. Todo o processo de diluição foi realizado em fluxo laminar para evitar uma possível contaminação e na ausência de luz, pois os compostos são fotossensíveis. Nesse projeto foram feitos seis tratamentos com combinações entre eles e em diferentes tempos, organizado da seguinte forma: Controle, T3, CHX, T3+CHX, E2,

E2+ CHX, sendo todos esses tratamentos realizados em quatro diferentes tempos: 10 minutos, 30 minutos, 1 hora e 48 horas. Para a droga e os hormônios ficarem na concentração ideal para os tratamentos eles foram adicionados ao meio de cultura a ser utilizado durante os tratamentos, sempre tomando o cuidado para não ultrapassarem o limite de 0,1% da concentração total do meio, para não prejudicarem o cultivo celular. Em cada tratamento foram adicionadas as quantidades de meio de culturas e das soluções mães preparadas anteriormente conforme exposto na tabela 1. Tabela 1. Descrição dos Tratamentos: composição e concentração. TRATAMENTO

Meio de Cultura

Hormônio

ICI

Ausente

Ausente (7,5µl de DMSO)

7,5µl de T3

Ausente (7,5µl de DMSO)

7,5µl de E2

Ausente (7,5µl de DMSO)

Ausente

(7,5µl de ICI)

7,5µl de T3

(7,5µl de ICI)

7,5µl de E2

(7,5µl de ICI)

13,5 ml de

Controle

RPMI+1,5ml SFB+ 150µl de A/A. 13,5 ml de

ICI

RPMI+1,5ml SFB+ 150µl de A/A. 13,5 ml de

T3+ ICI

RPMI+1,5ml SFB+ 150µl de A/A. 13,5 ml de

E2 + ICI

RPMI+1,5ml SFB+ 150µl de A/A.

4.5 Tratamento da linhagem celular

A linhagem celular foi plaqueada em garrafas para cultura de 150cm 3, até a confluência de 40%. As culturas serão mantidas à 37 o C em uma atmosfera

umidificada com 95% O2/5% CO2 durante os intervalos de tempo de 10 minutos, 30 minutos, 1 hora e 48 horas com E2 (10-7M), T3 (10-8M), E2 (10-7M) + ICI (1µM), T3 (10-8M) + ICI (1µM), ICI (1µM). Optou-se pelo ICI 182.780 nesse trabalho porque esse anti-estrogênio é puro e não tem ação própria como o tamoxifeno. Todos os tratamentos empregados foram realizados em triplicata. Em seguida serão conservadas em nitrogênio líquido até que se realize a extração de RNA total. Haverá a troca, no início do tratamento, do SFB inativado pelo tratado com carvão dextrana, além da troca do RPMI pelo RPMI sem fenol vermelho. Na tabela 1 é evidenciado o esquema de tratamento em três fatores (2x3) para a análise dos blocos completos casualizados. Esse esquema será empregado às células MCF-7. Tabela 2. Esquema de tratamentos em modelo de dois fatores. TRATAMENTOS

Ausência de

Estrógeno (10-8M)

Triiodotironina (10-8M)

Controle

E2 (10-8M)

T3 (10-8M)

ICI (1µM)

E2 (10-8M) + ICI (1µM)

T3 (10-8M) + ICI (1µM)

Hormônios

Ausência de Droga ICI (1µM)

4.6 Extração de RNA total

O RNA total foi extraído, utilizando-se TRIZOL Reagente (Gibco) de acordo com o seguinte protocolo. Detalhes da técnica estão a seguir:

4.6.1 Homogeinização

As células foram lisadas diretamente na garrafa de cultura, adicionando-se 1 ml de TRIZOL Reagente (Gibco) para cada 10cm2 de garrafa passando-se o lisado através de uma pipeta várias vezes.

4.6.2 Fase de Separação

As amostras de homogenato foram incubadas durante 5 min a 15 – 30ºC para permitir a completa dissociação dos complexos das nucleoproteínas. A seguir foi adicionado, então, 0,2 ml de Clorofórmio (Merck) por 1 ml de Trizol (Gibco). Os tubos fechados foram agitados manualmente por 15 segundos. Após incubação a 15 – 30ºC durante 2 a 3 minutos, as amostras foram centrifugadas durante 15 minutos (a 12000 x g, à temperatura de 2 – 8ºC). Após esse procedimento, a mistura ficou separada em 3 fases: a mais inferior rosa, a fase intermediária e a superior aquosa. O volume da fase aquosa é constituído por aproximadamente 60% do volume do Trizol (Gibco) usado para o homogenato, no qual está contido o RNA.

4.6.3 Precipitação do RNA

A fase aquosa foi transferida para novo tubo e foi colocado 0,5 ml de álcool isopropílico (Merck) para cada 1 ml de Trizol (Gibco). As amostras foram incubadas a 15 – 30ºC durante 10 minutos e centrifugadas a 12000 x g durante 10 minutos a 2 – 8ºC. Um pellet formado no fundo do tubo, é o precipitado de RNA.

4.6.4 Lavagem do RNA

Após remoção do sobrenadante, o pellet de RNA foi lavado com 1ml de etanol 75% (Nuclear) por 1 ml de Trizol (Gibco). As amostras foram agitadas e centrifugadas durante 5 minutos a 7500 x g a 2 – 8 ºC.

4.6.5. Redissolvendo o RNA

No final do procedimento, retirou-se o sobrenadante por inversão do tubo e secou-se com cotonete autoclavado as suas paredes, sem perturbar o pellet. O RNA foi dissolvido com 30 L de água ultrapura (Gibco) ou água ultrapura tratada com dietilpirocarbonato (DEPC), passando-se a solução várias vezes pela ponteira de uma micropipeta. As amostras foram incubadas durante 10 minutos a 55 – 60 ºC. Realizouse a técnica de fenol-clorofórmio para deixar o RNA livre de reagentes.

4.6.6 Quantificação

Nessa etapa é usado o aparelho “Nanodrop” para quantificar e aferir a qualidade do RNA, obtendo-se uma concentração de RNA em ng/µL, observa-se também a qualidade do RNA com uma relação entre absorbância do feixe de luz a 260nm e 280nm, que quantificam ácidos nucléicos e proteínas, respectivamente.

4.6.7 Transcrição Reversa

Obteve-se o cDNA utilizando o kit High-Capacity cDNA Reverse Transcription. Usam-se todos os componentes do Kit: 10x RT Buffer (2µL), 25x dNTP Mix (100mM)(0.8µL),

10x

Random

Primers(2µL),

MultiScribeTM

Reverse

Transcriptase (1µL), Nuclease-free H2O (4.2µL). As quantidades dos componentes para cada reação de cDNA foram realizadas seguindo o protocolo do kit High-Capacity cDNA. Depois do preparo do “mix” de componentes e da diluição do RNA seguindo o protocolo, usa-se termociclador para dar início as reações em três etapas sendo a primeira a 25ºC por 10 minutos, a segunda a 37ºC por 120 minutos e a terceira a 85ºC por 5 minutos, conforme orientação do fabricante. Após o término da reação, as placas são armazenadas em freezer -80ºC, até serem levadas para a UNESP – Botucatu para realização do PCR em tempo real.

4.6.8 Reação da polimerase em cadeira em tempo real

Usa-se uma outra placa de 96 poços e adiciona-se os seguintes componentes, que estarão no gelo até que se descongelem: Master Mix 10 µL, Primer 1 µL, H20 5 µL e mais 4 µL da amostra de cDNA. Após a pipetagem dos componentes e da amostra numa placa, coloca-se essa placa no aparelho de PCR em tempo real e pelo computador o aparelho é programado para que não se perca o desenho da placa (onde se localiza as amostras, em cada poço). Dentre as etapas da reação destacamse: aquecimento da amostra a 94oC para que a fita de DNA se desnature (se separe); o próximo passo é resfriar as amostras à 54oC para que os primers comecem a se

anelar ao início das duas fitas simples, servindo de iniciadores da enzima polimerase; após esse passo aquece-se novamente as amostras à 72oC (temperatura ideal para o funcionamento da DNA polimerase), para a duplicação da fita. A DNA polimerase inicia, após o final do primer, a colocar os nucleotídeos livres na fita de DNA ligandoos por complementaridade, formando assim uma nova fita dupla. Retira-se as amostras do programa e, ao final do experimento, obtém-se os gráficos de expressão gênica. Esses gráficos são gerados pela emissão de fluorescência que as sondas Taq-Man liberam ao serem clivadas durante a síntese da nova fita, na ação exonuclease da DNA-polimerase. O aparelho utilizado foi o “StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems”, da Life Technologies. Esse aparelho é ideal para trabalhar com sondas TaqMan na detecção de fluorescência na faixa de 300 a 600 nm. Durante a reação de PCR Real-time, a emissão de fluorescência começa a ser detectada pelo aparelho a partir de uma intensidade mínima, que se inicia, normalmente, a partir do décimo ciclo da reação, dependendo da quantidade inicial de moléculas presente na amostra biológica. Dessa forma, a fluorescência traduzida pelo aparelho na forma gráfica é proporcional à quantidade de moléculas expressas inicialmente. Tomando por base um gene que possua expressão estável durante qualquer fator empregado no experimento (controle interno da reação) é possível realizar a expressão relativa do gene alvo nas diferentes intervenções. Nesse trabalho foi utilizado, como controle interno da reação, o gene GAPDH devido à sua estabilidade para amostras de carcinoma mamário e os genes CLDN6 e FBLN1 como alvos.

5. RESULTADOS

5.1 Cultura Celular

Foram descongeladas e cultivadas diversas linhagens de células MCF-7 entre março e novembro de 2015, registrando imagens das culturas em diferentes estágios de confluência. Observam-se na figura 1 as células com 20% de confluência e na figura 2 as células com 80% de confluência.

Figura 1- Células MCF-7 com 20% de confluência

Figura 2- Células MCF-7 com 80% de confluência

As culturas produzidas no segundo semestre de 2015 se mantiveram vivas ao longo de todas as passagens necessárias para seu cultivo, e nas análises pelo microscópio, não foram encontrados corpos estranhos que pudessem caracterizar contaminação do meio. Infere-se, portanto, uma boa viabilidade de linhagem celular ao longo das semanas de uso sem perda de material e/ou contaminação, uma vez que ocorreram todas as medidas de controle acima citadas de forma efetiva. Ao longo das semanas de crescimento celular notou-se também um baixo índice de crescimento das células nas primeiras semanas, ao serem descongeladas e um alto índice de crescimento após atingirem confluência superior à 80%. Após atingirem a primeira confluência na garrafa pequena, na qual levam cerca de duas semanas, seu crescimento é elevado, chegando à confluência de 80% em somente uma semana, mesmo em garrafas com maior área.

Observou-se também que as células plaqueadas a partir da quinta passagem podem perder a capacidade de adesão na superfície da placa, soltando ao receber o tratamento. Dessa forma resulta na perda de material durante o tratamento.

Figura 3 - Gráficos da expressão gênica do CLDN6 em células MCF-7 nos tratamentos de 10 minutos (A), 30 minutos (B), 1 hora (C) e 48 horas (D).

5.2 Expressão gênica

Para atender as demandas projetadas para objetivo desse trabalho é necessário a observação e discussão dos gráficos A a H das figuras 3 e 4 , dos genes CLDN6 e FBLN1. As comparações de variação significativas se dão entre o grupo controle (representando pela linha tracejada), e os tratamentos com ICI e um dos hormônios e os demais tratamentos com droga ou hormônio. Os gráficos A, B, C e D correspondem aos resultados da expressão gênica do CLDN6 em células MCF-7, tratadas com T3, E2 e ICI nos tempos de 10 minutos, 30 minutos, 1hora e 48 horas. Os resultados obtidos demonstram que não há diferença estatística entre os cinco tratamentos e o grupo controle (linha tracejada).

Os gráficos E, F, G e H correspondem aos resultados da expressão gênica do FBLN1 em células MCF-7, tratadas com T3, E2 e ICI nos tempos de 10 minutos,30 minutos, 1hora e 48 horas. Os resultados obtidos demonstram que não há diferença estatística entre os cinco tratamentos e o grupo controle.

Figura 4 - Gráficos da expressão gênica do FBLN1 em células MCF-7 nos tratamentos de 10 minutos (E), 30 minutos (F), 1 hora (G) e 48 horas (H).

Nos ANEXOS A, B, C e D estão resultados da expressão gênica dos genes estudados e seus dados estatísticos que compõem as tabelas A a H.

6. DISCUSSÃO

Em todos os tratamentos, os resultados obtidos não demonstram expressões estatisticamente significativas entre os controles e os tratamentos com E2, T3 e ICI, ou seja, evidenciam que não há relação entre hormônios e a droga estudada com genes CLDN6 e FBLN1. Entretanto, devido ao alto erro entre as triplicatas, pode-se inferir que um aumento no número amostral poderia acentuar diferenças não observáveis com as amostras obtidas. O gene Fibulin 1 (FBLN1) é um membro da família fibulin de proteínas da matriz extracelular e se liga a muitas proteínas nesse ambiente incluindo fibronectin, laminin1, fibrinogênio, agrecan e versican. Alguns estudos mostram seu envolvimento na motilidade celular e crescimento independente de ancoragem das células tumorais (AGRAVES et al, 2003), e sua super-expressão tanto em tecidos tumorais de mama como em linhagens celulares de câncer de mama (GREENE et al, 2003; PUPA et al, 2007). Já foi observada a expressão de FBLN1 no tratamento com E2 em células MCF-7 (BARDIN et al, 2005) e em linhagens celulares de câncer ovariano ER positivas (CLINTON et al, 1996). No entanto, o nosso grupo foi o primeiro a demonstrar sua expressão em linhagens celulares de câncer de mama submetidas ao tratamento com T3 (FIGUEIREDO et al,2014). Claudin 6 (CLDN6) é um membro da família Claudin envolvido na formação de junções GAP (TSUKITA et al, 1999). Embora Offner et al (2005) tenha relatado sua expressão em linhagens celulares de câncer de mama, seu papel na carcinogênese permanece controverso (SOINI et al, 2004; SOBEL et al, 2005). Wu et al (2010) demonstraram que células com altos níveis de expressão de CLDN6 crescem lentamente e com alta taxa de morte celular em comparação ao controle, sugerindo que esse gene possa funcionar como um supressor tumoral. Sua subexpressão pode contribuir para a progressão maligna em certos tipos de cânceres de mama (QUAN et al, 2003). Em trabalhos anteriores, nosso grupo também foi o primeiro a demonstrar sua expressão alterada na presença de E2 e T3 em linhagens celulares de câncer de mama (FIGUEIREDO et al,2014). Nogueira et al (2014) evidenciou uma expressão alterada na presença de E2 e T3 dos genes CLDN6 e FBLN1 em linhagem celular de MCF-7 estatisticamente significativo (P < 0.05) conforme pode ser observar na Figura 5.

Figura 5 - Gráficos da expressão Gênica do CLDN6 e FBLN1 sob ação dos hormônios E2 (I) e T3 (J). Retirado de Nogueira et al (2014).

Nesse contexto, Hall et al (2008) verificaram a indução da proliferação da linhagem celular MCF-7 quando tratadas com T3, e a supressão dessa proliferação, com relevância significativa, em tratamentos com ICI. Verificaram também que com o aumento da concentração de ICI nos tratamentos, a supressão da proliferação celular ocorreu de forma mais significativa, conforme pode ser observado no gráfico K presente na figura 6.

Figura 6 - Gráfico da proliferação de linhagem celular MCF-7 em tratamento com T3 e ICI (K). Retirado de Hall et al (2008).

As expressões alteradas dos genes FBLN1 e CLDN6 em trabalhos prévios os tornam bons candidatos para avaliação da influência hormonal em modelos celulares de câncer de mama, considerando-se tanto sua ação molecular quanto sua expressão em tais modelos. Em nosso trabalho não foi possível atingir uma diferença estatística entre os tratamentos, mas ressaltamos que isso não deve estar relacionado com uma ausência de ação desses hormônios, ou mesmo do antagonista de receptor de estrógeno – ICI, no metabolismo dessas células. Sugerimos que o aumento do número amostral (aumento das replicatas) pode ressaltar diferenças não observáveis

pela rigorosidade do método estatístico, adequado para o trabalho em questão (método de análise de variância complementado pelo teste de comparações múltiplas de Tukey).

Dessa forma, os dados contidos nesse trabalho servirão de base para

uma complementação por experimentos futuros, buscando diminuir o erro entre os tratamentos pelo aumento do “N” amostral.

7.CONSIDERAÇÕES FINAIS

A partir dos dados obtidos não se verifica a relação entre o ICI, os hormônios E2 e T3 na expressão dos genes CLDN6 e FBLN1 em linhagem celular MCF-7, indicando que o bloqueio do receptor de estrógeno não está envolvido na expressão desses dois genes. Ressalta-se a necessidade de diminuição do erro entre os resultados das triplicatas, com o aumento do número de triplicatas e/ou maior homogeneidade entre quantidades de RNA extraídos e mensurados, garantindo maior confiabilidade na expressão gênica dos diferentes tratamentos.

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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ANEXO A EXPRESSÃO GÊNICA DE CLDN6 DAS TRIPLICATAS DOS TRATAMENTOS

TRIPLICATAS 1a T

2a T

3a T

DADOS Media

Min

Max

TRATAMENTOS Cont - 10m T3 - 10m ICI - 10m T3+ICI - 10m E2 - 10m E2+ICI - 10m

1 1,8099 5,2587 4,7841 1,2619 2,037

1 7,824 2,274 1,951 7,7189 1,3699

1 1,0781 3,508 3,3675 6,1483 1,7035

1 3,5706 3,6802 3,3675 5,0431 1,7035

1 1,0781 2,274 1,951 1,2619 1,3699

1 7,824 5,2587 4,7841 7,7189 2,037

Cont - 30m T3 - 30m ICI - 30m T3+ICI - 30m E2 - 30m E2+ICI - 30m

1 0,7151 4,8171 1,3197 1,4664 1,2574

1 0,7504 0,4876 0,1299 2,8922 3,9022

1 1,1116 2,6523 6,8168 1,0613 1,0976

1 0,859 2,6523 2,7555 1,8066 2,0857

1 0,7151 0,4876 0,1299 1,0613 1,0976

1 1,1116 4,8171 6,8168 2,8922 3,9022

Cont - 1h T3 - 1h ICI - 1h T3+ICI - 1h E2 - 1h E2+ICI - 1h

1 2,0061 14,132 9,0045 3,7233 13,077

1 1,0316 0 2,0861 1,0497 1,6457

1 0,5551 0 5,5453 2,3865 5,3972

1 1,1976 14,132 5,5453 2,3865 6,7068

1 0,5551 14,132 2,0861 1,0497 1,6457

1 2,0061 14,132 9,0045 3,7233 13,077

Cont - 48h T3 - 48h ICI - 48h T3+ICI - 48h E2 - 48h E2+ICI - 48h

1 6,4504 1,6629 2,2518 1,7207 1,9538

1 1,5445 1,2846 6,2566 2,3284 8,1297

1 0,9062 0,9062 4,2542 1,1129 5,0417

1 2,967 1,2846 4,2542 1,7207 5,0417

1 0,9062 0,9062 2,2518 1,1129 1,9538

1 6,4504 1,6629 6,2566 2,3284 8,1297

OBS: Os tratamentos com o “-“ não apresentaram resultados no PCR.

ANEXO B EXPRESSÃO GÊNICA DE FBLN1 DAS TRIPLICATAS DOS TRATAMENTOS

TRIPLICATAS

DADOS

1a T

2a T

3a T

Media

Min

Max

TRATAMENTOS Cont - 10m T3 - 10m ICI - 10m T3+ICI - 10m E2 - 10m E2+ICI - 10m

1 0,98578 0,84226 5,14372 0,95652 0,92299

1 3,99672 0,44478 0,40701 3,73653 0,33245

1 0,87164 3,19886 2,77537 2,34652 0,62772

1 1,95138 1,4953 2,77537 2,34652 0,62772

1 0,87163726 0,44477752 0,40701493 0,95651639 0,3324504

1 3,9967 3,1989 5,1437 3,7365 0,923

Cont - 30m T3 - 30m

1 1,08432

ICI - 30m

1,34498

T3+ICI - 30m

1,09381

1 1,16356 3 0,19532 6 0,2037

1 0,96143 5 0,77015 3 0,67199

1 1,06977 3 0,77015 3 0,6565

E2 - 30m

1,10731 4 1,11401

1,41258 2 0,13113

0,89827

1,13938 9 1,11040 6

1 0,96143494 5 0,19532642 5 0,20370019 6 0,89827028 8 0,13113010 2

1 1,1635 6 1,3449 8 1,0938 1 1,4125 8 2,0860 8

ICI - 1h

1 1,16033 9 1,43222

T3+ICI - 1h

1,39715 1,1237

1 0,53367 2 0,77914 6 1,76126 8 0,40642

1 1,1603 4 1,4322 2 1,7612 7 1,1237

E2+ICI - 1h

1,05290 2

1 0,72416 7 0,77914 6 1,08824 8 0,79560 9 0,62563

1 0,47848903 5 0,12607264 6 0,10632691

E2 - 1h

1 0,47848 9 0,12607 3 0,10632 7 0,85670 6 0,49936

Cont - 48h T3 - 48h

1 1,23847 5 0,57874 2 0,39060 1 0

1 1,11765 5 0

1 0,94152 2 0

1 0,9415221

2,11080 8 0

3,83101 5 0,65374 5

1 1,09921 7 0,57874 2 2,11080 8 0,65374 5

E2+ICI - 30m

Cont - 1h T3 - 1h

ICI - 48h T3+ICI - 48h E2 - 48h

2,08607 9

0,32462 7

0,40642048 8 0,32462678 4

0,57874222 5 0,39060069 0,65374538 7

1,0529

1 1,2384 8 0,5787 4 3,8310 2 0,6537 5

E2+ICI - 48h

0,47995 5

0,47995510 7

0,4799 6

OBS: Os tratamentos com o “0“ não apresentaram resultados no PCR.

ANEXO C DADOS ESTATÍSTICOS DA EXPRESSÃO GÊNICA DE CLDN6 NOS DIFERENTES TEMPOS DE TRATAMENTOS. TRATAMENTOS DE 10 MINUTOS T3 - 10m ICI - 10m T3+ICI E2 - 10m 10m DADOS Media 3,570645224 3,680218933 3,367519686 min 1,078077864 2,273993843 1,950987843 max 7,823951435 5,258653266 4,78405153 erro p 4,25330621 1,578434333 1,416531844

DADOS Media min max erro p

1,70348477 1,36994209 2,03702744 0,33354267

TRATAMENTOS DE 30 MINUTOS T3 - 30m ICI - 30m T3+ICI E2 - 30m 30m

E2+ICI 30m

0,859019921 2,65232702 2,755453545 1,8066397 0,715054309 0,487554837 0,129863081 1,0613246 1,111594658 4,817099202 6,816821638 2,8921735 0,252574737 2,164772182 4,061368093 1,0855337

2,08571555 1,0976249 3,90215109 1,81643554

T3 - 1h DADOS Media min max erro p

5,0430613 1,2619387 7,7189484 2,6758871

E2+ICI 10m

TRATAMENTOS DE 1 HORA ICI - 1h T3+ICI - 1h E2 - 1h

1,197581853 14,13200482 5,545282223 2,38653 0,555084658 14,13200482 2,086097046 1,0497262 2,006088141 14,13200482 9,004467399 3,7233339 0,808506288 0 3,459185177 1,3368039

T3 - 48h

TRATAMENTOS DE 48 HORAS ICI - 48h T3+ICI - 48h E2 - 48h

E2+ICI - 1h 6,70675725 1,64567498 13,0773619 6,37060469

E2+ICI - 48h

DADOS Media 2,967032897 1,284579598 4,25417313 1,7206773 5,0417173 min 0,906212691 0,906212691 2,251774673 1,1129203 1,95377036 max 6,450389898 1,662946506 6,256571587 2,3284344 8,12966424 erro p 3,483357001 0,378366907 2,002398457 0,607757 3,08794694 OBS: Os tratamentos com o “0“ não apresentaram resultados no PCR.

ANEXO D DADOS ESTATISTICOS DA EXPRESSÃO GÊNICA DE FBLN1 NOS DIFERENTES TEMPOS DE TRATAMENTOS.

T3 - 10m

TRATAMENTOS DE 10 MINUTOS ICI - 10m T3+ICI - 10m E2 - 10m

DADOS Media 1,951380406 1,495296512 2,775369041 min 0,87163726 0,44477752 0,407014927 max 3,996722602 3,198855974 5,143723154 erro p 2,045342196 1,703559462 2,368354114

T3 - 30m

2,346523142 0,956516385 3,736529898 1,390006756

TRATAMENTOS DE 30 MINUTOS ICI - 30m T3+ICI - 30m E2 - 30m

DADOS Media 1,069772804 0,770153179 0,656499919 1,139388805 min 0,961434945 0,195326425 0,203700196 0,898270288 max 1,163563324 1,344979933 1,093809962 1,412582261 erro p 0,09379052 0,574826754 0,437310042 0,273193456

T3 - 1h DADOS Media min max erro p

TRATAMENTOS DE 1 HORA ICI - 1h T3+ICI - 1h E2 - 1h

0,724166802 0,779146426 1,088248119 0,795608893 0,478489035 0,126072646 0,10632691 0,406420488 1,160338875 1,432220206 1,761267634 1,123699873 0,436172073 0,65307378 0,673019515 0,328090979

T3 - 48h

TRATAMENTOS DE 48 HORAS ICI - 48h T3+ICI - 48h E2 - 48h

E2+ICI - 10m 0,627720535 0,332450399 0,92299067 0,295270136

E2+ICI - 30m 1,110406288 0,131130102 2,08607912 0,975672832

E2+ICI - 1h 0,625629593 0,324626784 1,052902128 0,427272536

E2+ICI - 48h

DADOS Media 1,099217442 0,578742225 2,110808056 0,653745387 0,479955107 min 0,9415221 0,578742225 0,39060069 0,653745387 0,479955107 max 1,238475338 0,578742225 3,831015422 0,653745387 0,479955107 erro p 0,139257896 0 1,720207366 0 0 OBS: Os tratamentos com o “-“ não apresentaram resultados no PCR.