PAULA RODRIGUES SAMPAIO by Héber Bensi

INSTITUTO FEDERAL DE EDUCAÇÃO, CIÊNCIA E TECNOLOGIA DE SÃO PAULO – CÂMPUS SÃO ROQUE

PAULA RODRIGUES SAMPAIO

PRODUÇÃO DA ENZIMA TANASE UTILIZANDO A FERMENTAÇÃO SÓLIDA E ESTUDOS INICIAIS DE AMPLIAÇÃO DE ESCALA

São Roque - SP 2016

INSTITUTO FEDERAL DE EDUCAÇÃO, CIÊNCIA E TECNOLOGIA DE SÃO PAULO – CÂMPUS SÃO ROQUE

PAULA RODRIGUES SAMPAIO

PRODUÇÃO DA ENZIMA TANASE UTILIZANDO A FERMENTAÇÃO SÓLIDA E ESTUDOS INICIAIS DE AMPLIAÇÃO DE ESCALA

Trabalho de Conclusão de Curso, apresentado como requisito

para

obtenção do título de

Licenciada em Ciências Biológicas sob orientação da Professora Dra. Vania Battestin Wiendl e Coorientação da Professora Dra. Silvana Haddad.

São Roque - SP 2016

S192 SAMPAIO, Paula Rodrigues. Produção da enzima Tanase utilizando a fermentação sólida e estudos iniciais de ampliação de escala. / Paula Rodrigues Sampaio. – 2016. 24 f.

Orientador: Prof. Dra. Vania Battestin Wiendl.

TCC (Graduação) apresentada ao curso Licenciatura em Ciências Biológicas do Instituto Federal de Ciência e Tecnologia de São Paulo – Campus São Roque, 2016.

1. Enzima 2. otimização 3. Fungo. I. SAMPAIO, Paula Rodrigues. II. Título.

CDD: 574

PAULA RODRIGUES SAMPAIO PRODUÇÃO DA ENZIMA TANASE UTILIZANDO A FERMENTAÇÃO SÓLIDA E ESTUDOS INICIAIS DE AMPLIAÇÃO DE ESCALA

Trabalho de conclusão de curso apresentado ao Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Estado de São Paulo – câmpus São Roque, para obtenção do título de Licenciada em Ciências Biológicas.

APROVADO EM: __/__/____

Banca examinadora

Prof. Dr.: ______________________________ Instituição:_____________________

Julgamento:____________________________ Assinatura:____________________

Prof. Dr.:______________________________ Instituição: _____________________

Julgamento:____________________________Instiuição:______________________

Prof. Dr.:______________________________ Instituição: _____________________

Julgamento:____________________________Instiuição:______________________

AGRADECIMENTOS A todos que contribuíram de forma direta ou indireta para realização deste trabalho de conclusão de curso. Ao meu pai em especial, sem ele nenhuma parte dessa trajetória seria possível! À orientação de Vania Battestin e Silvana Haddad que me auxiliaram sempre de forma positiva e me mostraram o caminho a ser seguido durante os experimentos. Aos técnicos de laboratório do IFSP – câmpus São Roque, em especial à Maira e à Christine, que estavam sempre dispostas a ajudar nos momentos mais complicados em laboratório. Aos meus amigos que sempre me acompanharam no dia a dia da faculdade e estavam sempre presentes nos dias em que as coisas davam certo ou não.

LISTA DE FIGURAS Figura 1: Fungos conservados em tubo de ensaio. .................................................. 13 Figura 2: Influência do tempo de fermentação na atividade enzimática. .................. 16 Figura 3: Influência da temperatura da reação enzimática com o substrato. ........... 17 Figura 4: Influência da concentração de ácido tânico na atividade da tanase......... 18 Figura 5: Influência de diferentes ciclos na atividade enzimática. ............................ 19 Figura 6: Influência do tempo de agitação (rpm) na atividade enzimática. ............... 20 Figura 7: Influência do tempo de agitação durante a fermentação. .......................... 21

SAMPAIO, Paula Rodrigues. Produção da tanase utilizando fermentação sólida e estudos iniciais de ampliação de escala. Dissertação (Trabalho de Conclusão de Curso em Licenciatura em Ciências Biológicas). São Roque – SP: Instituto Federal de Educação Ciência e Tecnologia de São Paulo – câmpus São Roque, 2016.

RESUMO Este trabalho teve como objetivo a produção da enzima tanase e estudos iniciais de ampliação de escala para essa produção utilizando a técnica de fermentação em estado sólido. A técnica de fermentação em estado sólido consiste no crescimento de microrganismos em substrato na ausência de água livre. A produção da enzima foi realizada utilizando-se resíduo de farelo de trigo como substrato e os microrganismos utilizados foram extraídos de meio natural para produzirem a enzima tanase. A enzima foi produzida primeiramente em pequena escala (reator de 250 mL) e nessa etapa foram selecionadas as variáveis que otimizaram o processo de produção da enzima. Posteriormente foram realizados testes de produção em reator de 1 L. A melhor atividade enzimática ocorreu com três dias de fermentação, com concentração de 15% de indutor no meio de fermentação, sendo a temperatura de reação enzimática considerada ótima a 70°C. Na etapa de estudos iniciais de ampliação de escala foi possível verificar que não houve um aumento da atividade enzimática da tanase quando comparado a produção em reator de 250 mL. Porém, os estudos indicaram que a remoção de calor na etapa de fermentação em que o fungo produz a enzima, favoreceu a produção da tanase.

Palavras-chave: Enzima, otimização, fungos.

SAMPAIO, Paula Rodrigues. Production of the tannase using solid fermentation and initial studies of scale expansion. Dissertation (Work of Completion of Course in Licenciatura in Biological Sciences). São Roque - SP: Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia de São Paulo - São Roque campus, 2016.

ABSTRACT This work aims at the production of the enzyme tanase and initial studies of scale expansion for this production using the solid state fermentation technique. The solid state fermentation technique consists of the growth of microorganisms in substrate in the absence of free water. The enzyme production was performed using wheat bran residue as substrate and the microorganisms used were extracted from natural medium to produce the enzyme tanase. The enzyme was first produced on a small scale (250 mL reactor) and in this stage the variables that optimized the enzyme production process were selected. Subsequently, production tests were carried out in a reactor of 1 L. The best enzymatic activity occurred with three days of fermentation, with a concentration of 15% of inducer in the fermentation medium, and the enzymatic reaction temperature was considered optimal at 70 °C. At the stage of initial scaling studies it was possible to verify that there was no increase in the enzymatic activity of tanase when compared to the production in a 250 mL reactor. However, the studies indicated that the removal of heat from the fermentation medium favored the production of the enzyme.

Keywords: Enzyme, optimization, fungi.

SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 8 2 REVISÃO DE LITERATURA .................................................................................... 9 2.1 Fermentação sólida, ampliação de escala e a produção de enzimas ................ 9 2.2 Enzima tanase ................................................................................................. 10 2.3 Tanase e suas aplicações ............................................................................... 10 3 MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................................... 12 3.1 Materiais e equipamentos utilizados ................................................................ 12 3.1.1 Reagentes ................................................................................................. 12 3.1.2 Equipamentos ........................................................................................... 12 3.2 Métodos ........................................................................................................... 13 3.2.1 Microrganismo ........................................................................................... 13 3.2.2 Conservação do fungo .............................................................................. 13 3.2.3 Preparo de soluções ................................................................................. 14 3.2.4 Preparo pré-inóculo ................................................................................... 14 3.2.5 Meio de fermentação sólido para produção da tanase utilizando reator de 250 mL e 1L ....................................................................................................... 14 3.2.6 Medida da atividade enzimática da tanase ............................................... 15 4 RESULTADOS E DISCUSSÕES ........................................................................... 16 4.1 Variação no tempo de fermentação ................................................................. 16 4.2 Variação da temperatura da reação enzimática com o substrato .................... 17 4.3 Efeito do indutor (ácido tânico) na atividade da tanase ................................... 18 4.4 Efeito da agitação em shaker na atividade da enzima ..................................... 19 4.5 Efeito do tempo de agitação em shaker na atividade da enzima ..................... 19 4.6 Estudos iniciais de ampliação de escala e efeito da agitação do meio de cultura durante a fermentação ............................................................................... 20 5 CONSIDERAÇÕES FINAIS ................................................................................... 22 6 REFERÊNCIAS ...................................................................................................... 22

1 INTRODUÇÃO O crescimento de fungos depende de diversos fatores, incluindo nutrientes necessários para o seu desenvolvimento, tais como fontes de carbono, nitrogênio, água, oxigênio e alguns sais. Nos processos de fermentação sólida (FES), as fontes de carbono e nitrogênio são definidas no preparo de cultivo. O oxigênio é disponibilizado pelo ar e a quantidade de água depende diretamente da umidade presente no meio de cultivo, além da umidade presente no ar. O processo de FES apresenta vantagens quando comparada a outros tipos de processos de fermentação, pois se utiliza de resíduos agroindustriais sólidos, diminuindo a disponibilidade desses resíduos ricos em nutrientes no meio ambiente, e uma menor quantidade de água, fazendo com que as chances de contaminação por bactérias sejam menores devido à baixa quantidade de água envolvida no processo (FONSECA, 2012). Apesar de ser mais vantajosa, a FES ainda não é aplicada em escala industrial, pois há muitas dificuldades relacionadas ao controle e manutenção das variáveis durante o processo, como a temperatura, o pH do meio, a quantidade de água disponível para o microrganismo, o processo de respiração microbiana, além de dificuldades relacionadas a homogeneização do substrato e reprodutibilidade. Essas dificuldades surgem devido à baixa quantidade de água no meio, à baixa condutividade térmica e heterogeneidade dos substratos sólidos, dificultando a homogeneização do substrato e reprodução do microrganismo (FONSECA, 2012). Reatores são equipamentos destinados a promover reações químicas de interesse em escala industrial. São recipientes controlados a fim de obter um produto de valor comercial. Grande parte dos artigos publicados sobre FES está diretamente relacionada com a produção de metabólitos em escala de laboratório, a utilização de biorreatores em escala industrial diminuiria consideravelmente os custos da produção de enzimas, porém a remoção de calor e a manutenção da umidade do substrato são comprometidas durante o processo (FONSECA, 2012). Os reatores de mistura são empregados em processos biotecnológicos, e trabalhos na literatura buscam determinar as melhores condições de agitação e aeração para operação destes reatores (MALDONADO, 2006). A elaboração de modelos cinéticos e o controle de bioprocessos surgiram para polir as condições de cultivo para posterior aumento da produtividade (CARMO, 2010).

2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 Fermentação sólida, ampliação de escala e a produção de enzimas A produção de enzimas por meio de processos de FES tem se mostrado muito interessante, já que nos tempos atuais há busca por tecnologias mais limpas que diminuam o impacto sobre o meio ambiente, já que muitos resíduos agroindustriais são reutilizados no processo. O processo de FES pode ser descrito como crescimento de microrganismos sobre substratos com presença mínima de água livre. Dois tipos de substratos podem ser usados nesse processo, um servindo apenas como fonte de energia e outro servindo como fonte de carbono e energia (ROCHA, 2010; COSTA 2012). Nos últimos anos, a maioria dos artigos publicados sobre FES estão relacionados com a produção de metabólitos em escala de laboratório, porém, poucos estão relacionados à ampliação de escala do processo (FONSECA, 2012). Para ampliação de escala do processo são utilizados fermentadores conhecidos como biorreatores, definidos como recipientes que buscam simular as condições do habitat natural de determinados microrganismos para que ocorra a produção de materiais desejados. Biorreatores de FES podem ser de leito fixo, de bandeja, ou tambor reativo, entre outros (ZANELATO, 2011). O uso de biorreatores em escala industrial diminui de forma considerável os custos da produção de enzimas, entretanto a remoção de calor e manutenção da umidade do substrato são obstáculos tecnológicos (FONSECA, 2012). Os estudos de FES dividem-se em duas etapas: a escala de frascos, em que as características metabólicas dos fungos, sua adaptação ao substrato e as melhores condições operacionais são encontradas; e a escala de reatores, que coloca em prática os conhecimentos adquiridos em menor escala. Os ensaios em menor escala podem ser realizados em placa de Petri, Erlenmeyers ou em sacos plásticos de polietileno. Nessa escala não há presença de aparelhos para agitação ou aeração forçada, são controladas apenas condições do substrato, do microrganismo, da solução inoculante e da temperatura. O uso de biorreatores deve prevenir a entrada de organismos contaminantes e evitar a emissão do microrganismo utilizado, produtos e substrato para o ambiente. Além disso, a arquitetura interna deve promover aeração eficiente para levar oxigênio para o

microrganismo, remover calor metabólico, manter a uniformidade do substrato, esterilização e recuperação da biomassa (AGUDELO, 2010).

2.2 Enzima tanase A tanino acilhidrolase (TAH), conhecida como tanase, é uma enzima extracelular, induzível e é produzida na presença de ácido tânico por bactérias, fungos e leveduras (SOARES et al., 2013). A tanase hidrolisa ésteres e ligações laterais de taninos hidrolisáveis, produzindo glicose e ácido gálico (BATTESTIN et al., 2004). A TAH apresenta-se estável em pH entre 3,5-8,0; com pH ótimo para sua atividade entre 5,5-6,5; sua temperatura de estabilidade está entre 30ºC a 70ºC, sendo sua atividade ótima detectada entre 30ºC e 50ºC e massa molecular entre 70kDa e 300kDa, suas características podem variar de acordo com meio de cultivo para a enzima e a linhagem de organismo utilizada. A enzima tanase é inibida por Cu2+, Zn2+, Fe2+, Mn+2 e Mg+2 e é inativada por ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA), 2- mercaptoetanol, sulfatos e cloreto de magnésio e cálcio (BATTESTIN, 2007). Segundo PINTO et al. (2005), todas as tanases oriundas de fungos são caracterizadas como glicoproteínas, sendo que o conteúdo de carboidrato pode variar de 25,4 a 66,2% do peso total da enzima. Não se sabe ao certo o papel exato da elevada quantidade de carboidratos, há hipótese de que seja uma maneira de proteger o núcleo proteico da ação de desnaturação e direcionar o substrato ao centro ativo da enzima (PINTO et al. 2005).

2.3 Tanase e suas aplicações Os taninos são moléculas abundantes em vegetais e agem no sistema de defesa contra possíveis microrganismos que de alguma forma possam prejudicar seu desenvolvimento. Os taninos são divididos em dois grupos com base em sua estrutura molecular, sendo taninos condensados e taninos hidrolisáveis. Os ácidos tânicos hidrolisáveis podem ser catalisados em reação de quebra por ácidos, bases e enzimas. A tanase é uma enzima que faz parte do mecanismo de ataque de

indivíduos microbianos na invasão da planta hospedeira, agem a partir da hidrólise de compostos fenólicos presentes no tecido vivo da planta ou em partes em decomposição. Os microrganismos do solo capazes de produzir a tanase são importantes na decomposição de matéria e na reciclagem de materiais vegetais ricos em taninos (PINTO, et al., 2005). Diferentes organismos são capazes de produzir a tanase, como fungos filamentosos, bactérias, leveduras e plantas. Os indivíduos identificados com maior capacidade de produção desta enzima, são os fungos filamentosos dos gêneros Aspergillus e Penicillium. Além disso, muitos organismos são capazes de produzir tanase, porém, nem todas são igualmente ativas em diferentes taninos hidrolisáveis. As tanases produzidas pelas leveduras são capazes de compor o ácido tânico apenas, já a enzima produzida pelas bactérias e fungos filamentosos são eficientes na hidrólise de ácido tânico e outros taninos hidrolisáveis presentes na natureza (PINTO, et al., 2005). Para a produção da tanase por parte dos microrganismos, é necessário a presença de um indutor. Desta forma, a presença de ácido tânico como indutor ou como fonte de carbono é fundamental para produção da enzima. Embora existam potencialmente muitas aplicações industriais para tanase, poucas são realmente aplicadas devido ao alto custo de sua produção. Sua aplicação na indústria alimentícia é vasta, incluindo produção de sucos e cervejas, além de contribuir na indústria de cosméticos, farmacêuticas e indústria química. É especialmente utilizada na produção de ácido gálico, na estabilização da cor do vinho, nos chás instantâneos, nos processos de tratamento de couro, na detanificação de alimentos e no tratamento de efluentes da indústria de couro (BATTESTIN, 2007). Uma das principais aplicações da tanase é no processamento de chás instantâneos, com função de eliminar complexos insolúveis indesejáveis. A tanase evita o uso de substâncias químicas para a eliminação do “creme de chá”, garantindo um produto final de boa qualidade e solúvel em água (SANDERSON et al., 1974 apud BATTESTIN, 2007). Na fabricação de vinhos, a tanase é utilizada na etapa de tratamento dos resíduos da uva favorecendo a remoção de compostos fenólicos, estabilizando e incrementando a qualidade dos vinhos. Por volta de 50% da coloração do vinho se

deve à presença de taninos, já que a oxidação destes componentes pode causar uma turbidez indesejável e perda da qualidade do produto final (BATTESTIN, 2007). A tanase pode ser utilizada para produção de ácido gálico, epigalocatequina e epicatequina, que são importantes antioxidantes. O ácido gálico pode ser empregado na indústria química e farmacêutica. É utilizado para síntese de propil galato que é amplamente utilizado como aditivo na indústria de alimentos, para síntese pirogalol que é utilizado como conservante na indústria de alimentos, e é utilizado para síntese de trimetropim que é um agente antibacteriano utilizado na indústria farmacêutica (BATTESTIN, 2007). Há também aplicação da tanase em rações para dietas animais, é um mercado que vem crescendo muito na última década. Os taninos podem apresentar efeitos antinutricionais, pois complexam com proteínas fazendo com que fiquem indisponíveis para absorção, desta forma reduzindo o valor nutricional da dieta. A utilização da enzima pode ser feita por contato direto dos extratos com material a ser tratado, hidrolisando os polifenóis e evitando uma polimerização indesejada ou pelo cultivo de linhagens de fungos sintetizadores da tanase em substratos ricos em taninos, os quais são degradados em substratos simples (BATTESTIN, 2007).

3 MATERIAIS E MÉTODOS 3.1 Materiais e equipamentos utilizados 3.1.1 Reagentes 

Reagentes químicos: ácido tânico, dodecil sulfato de sódio (SDS), trietanolamina, sais minerais e tampões.



Meios de cultura: Ágar de batata dextrose (PDA) e farelo de trigo.



Proteína: Albumina de soro bovino (BSA)

3.1.2 Equipamentos 

Espectrofotômetro Femto, Cirrus 80;



Banhos termostáticos Solab, SL 154;



Centrífuga Sislab/twister;



Estufa de Cultura Solab, SL 101;



Incubador Shaker SK-330-Pro.



Béquer



Pipeta de vidro e pipeta automática 1000 µL



Erlenmeyer 250 mL e 1000 mL

3.2 Métodos 3.2.1 Microrganismo Uma linhagem fúngica foi utilizada no presente estudo identificada como LAB1VW, extraída de casca da árvore conhecida popularmente como Ingá (Família: Fabaceae, Inga sp.) Todos os procedimentos foram realizados no Laboratório de Análises e Biotecnologia do IFSP – Câmpus São Roque.

3.2.2 Conservação do fungo A linhagem fúngica foi conservada em tubos de ensaio com meio PDA, inclinados,

para

aumentar

superfície

contato

para

microrganismo, e em temperatura de 10ºC.

Figura 1: Fungos conservados em tubo de ensaio.

crescimento

3.2.3 Preparo de soluções 

Solução de substrato

Foi preparada pela adição de 0,2% (p.v-1) de ácido tânico em tampão acetato 0,2 mol.L -1 pH 5,5. 

Solução albumina de soro bovino (BSA)

Foi preparada na concentração de 1 mg.mL-1 em tampão acetato 0,2 mol.L -1 pH 5,0, contendo cloreto de sódio 0,17 mol.L -1. 

Solução SDS – trietanolamina

Foi preparada pela adição de SDS 1% (p.v-1) e 5% (v.v-1) de trietanolamina em água destilada. 

Solução de FeCl3

Foi preparada pela adição de FeCl3 0,01 mol.L -1 em HCl 0,01 mol.L -1.

3.2.4 Preparo pré-inóculo A linhagens LAB1VW foi repicada em meio PDA inclinado, com suplemento de ácido tânico 0,2% (p.v-1), pH final do meio igual a 5,2 e incubadas em estufa à 32ºC por 120 horas para pré-indução da tanase.

3.2.5 Meio de fermentação sólido para produção da tanase utilizando reator de 250 mL e 1L Em frascos Erlenmeyers de 250 mL foram adicionados 20 g da mistura de resíduo de farelo de trigo na proporção inicial de 1:1, sendo resíduo de farelo de trigo acrescido de solução de sais e ácido tânico, ajustável até alcançar concentração final de 5%, 10% e 15% de ácido tânico. Na etapa de ampliação de escala, foi utilizado o Erlenmeyer de 1L e a composição de sais foi adicionada proporcionalmente ao tamanho do reator, bem como, a adição de farelo de trigo.

Tabela 1: Composição de sais presentes no meio de fermentação.

Sais

Quantidade (g/L)

NH4Cl

0,1

(NH4)2SO4

0,1

CaCl2.2H2O

0,01

K2SO4

0,01

MnSO4.H2O

0,002

FeSO4.7H2O

0,002

O meio de fermentação foi esterilizado à 120ºC por 20 minutos. Após a esterilização os frascos foram inoculados com 2 mL de solução de esporos e incubados a 32ºC em estufa de cultura bacteriológica por 72 horas (3 dias), 120 horas (5 dias) e 168 horas (7 dias). Após fermentação, foram adicionados 70 mL de solução tampão acetato 20 m mol. L-1 (pH 5), agitados a 150 rpm por 1 hora. A solução foi filtrada em algodão e após filtragem foi levada a centrífuga por 15 minutos a 3.000 rpm. No sobrenadante foi medida a atividade enzimática de acordo com metodologia proposta por Lekha & Lonsane (1994). Os taninos possuem a capacidade de complexar e precipitar proteínas de soluções aquosas (SILVA & SILVA, 1999). Segundo Carvalho (2007), as interações proteínas-taninos são afetadas pela estrutura dos taninos e pelo meio onde se encontram. Medindo a quantidade de proteínas e tanino precipitados foi possível constatar que a ligação entre o tanino e BSA depende do tipo de tanino envolvido. Verificou-se então que a ligação entre os taninos hidrolisáveis e a BSA é sensível à temperatura e à presença de solventes orgânicos, o que indica que a interação é predominantemente hidrofóbica (HARGEMAN et al., 1998 apud CARVALHO, 2007).

3.2.6 Medida da atividade enzimática da tanase A solução substrato foi preparada pela adição de ácido tânico 0,2 % (p.v-1) em tampão acetato 0,2 mol.L

-1

(pH 5,5). A reação foi realizada adicionando 0,3 mL da

solução de substrato com 0,5 mL de extrato enzimático bruto deixado em banho maria à 40ºC, 50ºC e 60oC por 10 minutos. Após a incubação, a reação foi paralisada pela adição de 3 mL de solução de BSA preparada na concentração de 1 mg.mL-1 de BSA e de cloreto de sódio 0,17 mol.L

-1

em tampão acetato 0,2 mol.L

-1

(pH 5), e em seguida, centrifugada a 3.000 rpm por 10 minutos. O precipitado foi ressuspendido em 3 mL de solução SDS-trietanolamina acrescido de 1 mL de

solução de FeCl3. A absorbância foi medida após 15 minutos a 530 nm de acordo com metodologia sugerida por Mondal et al. (2001). A curva padrão foi elaborada utilizando quantidades de ácido tânico comercial variando entre 0,02 e 0,14 mg. A atividade da enzima foi calculada pela mudança na absorbância a 530 nm de acordo com a equação: Abs530=Abscontrole-Absteste Sendo: Abs530= Absorbância medida Abscontrole= Substrato + Enzima desnaturada Absteste= Substrato + Enzima ativa

4 RESULTADOS E DISCUSSÕES 4.1 Variação no tempo de fermentação Os testes foram realizados para avaliar o melhor tempo de fermentação para produção da enzima. De acordo com a Figura 2 o melhor tempo foi o de três dias de fermentação apresentando uma atividade enzimática de 0,09 U/mL.

Atividade enzimática (U.mL-1)

0,1 0,09 0,08 0,07 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0 3

Tempo de fermentação (dias)

Figura 2: Influência do tempo de fermentação na atividade enzimática.

Observou-se que com sete dias de fermentação há diminuição de 1,5 vezes na produção da enzima tanase quando comparado a três dias de fermentação. O aumento no tempo de fermentação levou ao declínio na atividade enzimática. Uma das hipóteses para esse ocorrido é que com aumento no tempo de fermentação há produção de co-produtos resultante do metabolismo microbiano, esgotamento de nutrientes, levando a inibição do crescimento do fungo e consequentemente a baixa produção da enzima (WHITAKER, 1994; BIAZUS et al., 2006; AKPAN et al., 2005; ALVA et al., 2007).

4.2 Variação da temperatura da reação enzimática com o substrato Os testes foram realizados para avaliar a melhor temperatura para reação enzimática. De acordo com a Figura 3, a melhor temperatura de reação enzimática foi a de 70º C.

0,09

Atividade enzimática (U.mL-1)

0,08

0,07 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0 50

Temperatura de reação (ºC)

Figura 3: Influência da temperatura da reação enzimática com o substrato.

A atividade enzimática obtida a 70ºC aumentou 19 vezes quando comparado à temperatura de reação a 50º C. A temperatura em que há melhor atividade enzimática é chamada de temperatura ótima de reação, acima desta temperatura de reação a atividade tende a diminuir devido à perda de atividade catalítica que ocorre pela desnaturação térmica da enzima.

Quando uma proteína é sintetizada na célula, sua estrutura primária dobra-se, dando forma à proteína, desta forma, ela assume sua forma nativa. A desnaturação pode ser provocada, experimentalmente, por vários fatores que ocasionam o rompimento das ligações não-covalentes da forma proteica. Um dos fatores que está diretamente relacionado com a desnaturação é o aquecimento da proteína, sendo que a temperatura de desnaturação da maioria das proteínas encontra-se abaixo de 100ºC. A desnaturação pode ser irreversível, algumas proteínas, quando desnaturadas, apresentam-se insolúveis (MARZZOCO & TORRES, 2015).

4.3 Efeito do indutor (ácido tânico) na atividade da tanase Foram realizados testes para avaliar o efeito do ácido tânico na atividade da enzima tanase. De acordo com a Figura 4, a melhor concentração de ácido tânico para atingir uma boa atividade enzimática é de 15%.

Quando comparado a

concentração de 5%, houve o aumento de 1,5 vezes a produção da enzima tanase com concentração de 15%. A atividade da enzima está diretamente relacionada com a quantidade de ácido tânico adicionado no meio de fermentação, esta fonte de carbono favorece a produção da tanase.

Segundo Pinto (2003), em trabalho

preliminar em que não foi adicionado ácido tânico para produção da tanase não houve produção da mesma em nenhum tempo de fermentação.

Atividade enzimática (U.mL-1)

0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01

0 5

10 Concentração de ácido tânico (%)

Figura 4: Influência da concentração de ácido tânico na atividade da tanase.

4.4 Efeito da agitação em shaker na atividade da enzima Testes foram realizados para avaliar a melhor atividade enzimática em diferentes ciclos de extração. A agitação em shaker ocorreu sem interrupção durante o período de 90 minutos nos diferentes ciclos de rotação. De acordo com a Figura 5, o melhor ciclo é de 150 rpm, sendo que há o aumento de 2 vezes da atividade enzimática quando comparado ao ciclo em 300 rpm.

Atividade enzimática (U.mL-1)

0,07 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0 150

200 Rotação por minuto (rpm)

300

Figura 5: Influência de diferentes ciclos na atividade enzimática.

Para esse estudo de produção da enzima, a tanase foi sintetizada pelo fungo filamentoso, e a proteína produzida foi secretada no meio de fermentação sólido. A agitação faz com que a enzima passe da fase sólida (que é o substrato utilizado para o crescimento do fungo), para a fase aquosa (que é a solução de tampão acetato adicionada no meio após a fermentação). Agitações muito fracas permitem uma baixa extração da enzima do meio sólido. Por sua vez, uma agitação muito intensa pode desnaturar a proteína e a molécula pode perder seu poder catalítico.

4.5 Efeito do tempo de agitação em shaker na atividade da enzima Testes foram realizados para avaliar o tempo de agitação para extração enzimática. As agitações em shaker ocorreram sem interrupções em 150 rpm em todos os tempos testados. De acordo com a Figura 6, há um aumento de 1% na

atividade enzimática com 90 minutos de agitação em shaker quando comparada a atividade com 30 minutos.

Atividade da enzima (U.mL-1)

0,155 0,15 0,145 0,14 0,135

0,13 30

Tempo de agitação em minutos. Figura 6: Influência do tempo de agitação (rpm) na atividade enzimática.

Na Figura 6 percebe-se que, com o tempo de 60 e 90 min a atividade da enzima sofreu poucas alterações, com valores de atividade enzimática de 0,15 e 0,155 U/mL respectivamente.

A nível industrial, menores tempos de agitação

implicam em menores gastos de energia e consequentemente menores custos. Dessa forma, para estudos futuros, será utilizado o tempo de agitação de 60 minutos.

4.6 Estudos iniciais de ampliação de escala e efeito da agitação do meio de cultura durante a fermentação É sabido que durante a fermentação sólida há um aumento da temperatura interna do reator durante a fermentação. Isso pode resultar em redução da atividade enzimática, pois esse fenômeno está relacionado a diminuição do metabolismo do microrganismo. Diante disso, para esse experimento utilizando o reator de 1L, foram realizados testes para avaliar a influência da agitação durante o processo de fermentação durante três dias, a agitação foi feita utilizando um bastão de vidro e manualmente. De acordo com a Figura 7, agitando o meio de fermentação duas vezes ao dia, houve o aumento de 2,4 vezes na atividade enzimática comparado ao reator onde não ocorreu nenhuma agitação.

Atividade enzimátca (U.mL-1)

0,09 0,08 0,07 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0 0

2 Quantidade de agitação por dia

Figura 7: Influência do tempo de agitação durante a fermentação.

Com a agitação diária feita de forma manual há evaporação da água juntamente com o calor e assim, o ambiente encontra-se mais adequado para o funcionamento do metabolismo microbiano. Temperaturas altas podem interferir diretamente no funcionamento de moléculas vitais, como atividade de enzimas, crescimento celular e desnaturação de proteínas. Futuramente, para dar continuidade a esse trabalho, modelos cinéticos poderão ser realizados para controlar o sistema de produção dessa molécula. Com isso, novas variáveis de processo poderão ser analisadas para verificar a eficiência ou não da produção dessa enzima em reatores maiores. A remoção do calor em processo de FES pode ser feita através do resfriamento por evaporação da água. A quantidade de água presente do meio de cultivo, está diretamente relacionada com a quantidade de calor, produto do metabolismo do microrganismo, desta forma há o resfriamento evaporativo retirando a água do meio. A partir desse processo, determina-se o fluxo, a temperatura, a umidade relativa do ar circulante e a quantidade de calor que pode ser removido (FONSECA, 2012). A influência de modelos cinéticos e o controle dos bioprocessos, surgiram como forma de aprimoramento das condições de cultivo, podendo desta forma, aumentar o crescimento do microrganismo utilizado e consequentemente aprimorar a produção do produto alvo (CARMO, 2010).

5 CONSIDERAÇÕES FINAIS Os resultados finais deste estudo mostraram que a melhor atividade enzimática ocorre com três dias de fermentação, com concentração de 15% de indutor no meio de fermentação, sendo a temperatura de reação enzimática considerada ótima à 70°C. Essa característica se difere da caracterização geral da enzima tanase, já que segundo BATTESTIN (2007), sua temperatura considerada ótima de reação encontra-se entre 30º C e 50º C, esse fenômeno pode ser explicado devido a presença de moléculas denominadas isoenzimas, que são enzimas que se diferem na sequência de aminoácido, mas que catalisam a mesma reação química, O tempo de fermentação de 3 dias também é um fator positivo em relação a produção da tanase, pois é considerado um tempo curto para a produção da enzima. Muitos trabalhos relatam o tempo de produção da enzima de 5 ou até mesmo 7 dias de fermentação como tempo ótimo de produção. Quanto menor o tempo de fermentação, implica em menores custos de produção. Em relação ao efeito da agitação em shaker, considera-se o tempo de 60 minutos e a velocidade de agitação de 150 rpm as melhores condições para esse processo de fermentação. Na etapa de estudos iniciais de ampliação de escala foi possível verificar que não houve um aumento da atividade enzimática de tanase quando comparado a produção em reator de 250 mL. Observou-se que a agitação no meio de cultura durante a fermentação de duas vezes ao dia resultou em melhores resultados de atividade enzimática se comparado ao controle (sem agitação). Foi possível observar que o farelo de trigo se mostrou muito promissor para produção da enzima tanase. Esse substrato é abundante no Brasil e tem um baixo custo para sua aquisição.

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