MEDICINSKI POMOGNUTA OPLODNJA U ČOVJEKA by Hrvoje Zrnčić

Izdavač

HINUS Miramarska 13 b Zagreb e-mail – hinus@zg.t-com.hr Recenzenti

Prof. dr. sc. Velimir Šimunić Prof. dr. sc. Ernest Suchanek Prof. dr. sc. Oskar Springer Lektorica

Ivančica Ćurić Idejno rješenje naslovnice

Jurre Labaš, akademski slikar ISBN 953-6904-09-8

CIP – Katalogizacija u publikaciji Nacionalna i sveučilišna knjižnica – Zagreb UDK 618.177-089.888.11 MAĆAŠ, Ervin Medicinski pomognuta oplodnja u čovjeka / Ervin Maćaš. –Zagreb : Hinus, 2004. Bibliografija iza svakog poglavlja. – Kazalo. ISBN 953-6904-09-8 I. Oplodnja in vitro – Biokemijska istraživanja 440315179 Copyright © autor Sva prava pridržana. Niti jedan dio ove knjige ne smije se umnožiti, pohraniti ili prenijeti u bilo kakvom obliku, fotokopiranjem, elektronski, mehanički, presnimavanjem ili nekim drugim načinom, bez pismene privole izdavača.

Ervin Maćaš

MEDICINSKI POMOGNUTA

OPLODNJA U ČOVJEKA

HINUS 3

Predgovor Ideja o pisanju ove knjige rođena je u Švicarskoj dok je u Hrvatskoj još trajao rat, dok se domovinu materijalno pomagalo koliko se moglo. Namjera je bila da se domovini pomogne i u poslijeratnim godinama svojim znanjem i iskustvom i to na onom području na kojem se osijeća nedostatak stručnog štiva. Razlog zbog čega je knjiga tek sada ugledala svjetlo dana, treba svakako tražiti u prilikama u kojim je ona stvarana. Naime, nakon napornog radnog dana ostajalo je malo slobodnog vremena za pisanje knjige. Jedino slobodno vrijeme kada se moglo malo više vremena posveti pisanju bili su blagdani ili kraj tjedna. Ponekad se kralo za pisanje i nešto radnog vremena, ali to je bilo uvijek povezano s mogućim neugodnostima pisanja knjige na hrvatskom jeziku. Da je kojim slučajem napisana prije dvadesetak i više godina, sadržajno i tematski svela bi se na manje poglavlje o metodama spajanja gameta i razvoju embrija izvan tijela majke. Dinamičan razvoj cjelokupne znanosti, popraćen progresivnim napretkom kompjutorske i ostale tehnologije, uvjetovao je u području humane reprodukcije procvat srodnih postupaka koji se objedinjuju pod nazivom medicinski pomognuta oplodnja u čovjeka. Ovo je knjiga koja bi trebala mlađoj, ali i starijoj generaciji biologa, veterinara, agronoma i medicinara dati mogućnost stjecanja novog i upotpunjavanja već stečenog znanje iz ovog nadasve dinamičnog područja biologije. Kao prva tema odabrana je problematika u svezi muškog čimbenika bračne neplodnosti. Unatoč stagnaciji koju doživljava andrologija u posljednje vrijeme, u ovom poglavlju izvršena je sinteza starih i nekih novih spoznaja u obradi muškog čimbenika neplodnosti, te je time androloškim aspektima dan isti značaj kakav imaju preostale metode medicinski pomognute oplodnje u čovjeka. Nastojeći pridržavati se što više logičnog redoslijeda, kao druga tema nametnula se sama po sebi izvantjelesna oplodnja ili in vitro fertilizacija (IVF) u čovjeka. Bračna neplodnost nije se nikada liječila tako uspješno kao što se to danas čini metodama izvantjelesne oplodnje. Svakako da je uz modernizaciju cjelokupne laboratorijske infrastrukture, pronalazak novih, mnogo rafiniranijih metoda kulture embrija najzaslužniji za taj posljednji uspjeh cjelokupne metode in vitro fertilizacije. Glavni zadatak je što bolje informirati čitatelja o novinama koje su dovele do općeg progresa te metode, ali mu također ukazati koje su daljnje perspektive izvantjelesne oplodnje u čovjeka. Treća tema koju se mora obvezno uvrstiti u jedno od poglavlja ove knjige je metoda preimplantacijske genetske dijagnoze. Posebno je velik zaokret u ovom području napravljen u posljednjih pet godina, kad su izmišljene puno suptilnije metode molekularne biologije s kojima se dijagnosticira genetska abnormalnost u najranijim fazama razvoja embrija čovjeka. Od kakve je praktične vrijednosti ta vrsta dijagnostike, najbolje govori podatak da je do danas nakon nje rođeno tisuću i

više zdrave djece u roditelja koji su jedan, ili oba člana nositelji neke teške genetske nenormalnosti. Posljednje poglavlje ove knjige namijenjeno je metodama zamrzavanja i odmrzavanja embrija. Nema sumnje, pokraj medicinske, implementacijom postupka zamrzavanja i odmrzavanja embrija, medicinski pomognuta oplodnja u čovjeka je dobila svoju dodatnu pravnu, etičnu, ali i financijsko ekonomsku dimenziju. Naime, dovoljno je s jedne strane prisjetiti se opstetričnih komplikacija u svezi višeplodne trudnoće, te s druge strane enormnog izdavanja sredstava od strane obitelji (ali i cjelokupnog društva) u slučajevima rađanja dvojki, trojki ili četvorki nakon IVF. Kako se ipak zamrzavanjem prekobrojnih, te kontroliranim prijenosom manjeg broja embrija elegantno rješava većina gore navedenih problema, smatram da bi postupak zamrzavanja i odmrzavanja embrija morao bezuvjetno zauzeti dominatno mjesto u svakom programu medicinski pomognute oplodnje u čovjeka. Ova knjiga trebala bi dati mlađoj, ali i starijoj generaciji biologa, veterinara, agronoma i medicinara mogućnost stjecanja novog i upotpunjavanja već stečenog znanja iz ovog nadasve dinamičnog područja biologije. Posebno je paženo da literaturni podaci, koji korespondiraju dijelu teksta u kojem su navedeni, budu što aktualniji tako da se može slobodno reći da ova knjga predstavlja nedvojbeno jednu od najmoderni verzija štiva ove vrste. Na koncu, etičnost je bila glavna vodilja pri pisanju ove knjige. Upravo zbog nje nastojao sam izbjeći detalje koji bi svojim neetičnim ili senzacionalističkim sadržajem bili kontraproduktivni u popularizaciji ovakve vrste literature. Stoga su namjerno izostavljeni oni dijelovi koji se odnose na mogućnosti ostvarivanja majčinstva u vremešnih žena, kloniranja čovjeka, surogatstvo, ili pak selekciju spola u slučajevima kada to nije medicinski indicirano.

Sadržaj Androloški aspekti medicinski pomognute oplodnje u čovjeka............................ Uvod ..................................................................................................................... Makroskopsko ispitivanje sjemena....................................................................... Biokemijska analiza sjemena ............................................................................... Mikroskopsko ispitivanje sjemena ....................................................................... Određivanje ukupnog broja spermija u ejakulatu .......................................... Određivanje ukupnog broja pokretnih spermija u ejakulatu .......................... Određivanje morfoloških karakteristika spermija.......................................... Imunološki aspekti muške neplodnosti ................................................................ Test imunih kuglica........................................................................................ Test miješane antiglobulinske reakcije .......................................................... Test aglutinacije spermija .............................................................................. Testovi za provjeru fertilne sposobnosti spermija................................................ a) Kapacitacija spermija................................................................................. Obrada sjemena postupkom isplivavanjem spermija .............................. Postupak centrifugiranja sjemena............................................................ Obrada sjemena postupkom sedimentacije ............................................. Test jajnih polovica........................................................................................ Određivanje aktivnosti akrosina .................................................................... Test za provjeru penetracijske sposobnosti spermija ili «Zona-free hamster penetration test» ............................................................................................. Literatura .............................................................................................................. Izvantjelesna oplodnja ili in vitro fertilizacija ........................................................ Uvod ..................................................................................................................... Organizacija laboratorija za in vitro fertilizaciju.................................................. Identifikacija jajne stanice.................................................................................... Metode inseminacije jajne stanice........................................................................ Standardne metode inseminacije.................................................................... Metode inseminacije jajne stanice ICSI postupkom ..................................... Oplodnja i rani razvoj zametka u in vitro uvjetima .............................................. Razvoj blastociste................................................................................................. Prijenos zametka u materište ili embriotransfer (ET)........................................... Literatura ..............................................................................................................

Preimplantacijska genetska dijagnoza.................................................................... Uvod ..................................................................................................................... Embrionalni stadij u kojem se obavlja PGD ........................................................ Biopsija polarnog tjelešca .............................................................................. Biopsija zametka............................................................................................ Biopsija blastociste ........................................................................................ Metode genetskog ispitivanja ............................................................................... Fluorescirajuća in situ hibridizacija ............................................................... Polimerizirajuća lančana reakcija .................................................................. Literatura .............................................................................................................. 4. Principi i metode zamrzavanja u medicinski pomognutoj oplodnji u čovjeka Uvod ..................................................................................................................... Postupci zamrzavanja i odmrzavanja u medicinski pomognutoj oplodnji u čovjeka.................................................................................................................. Postupak polaganog zamrzavanja i odmrzavanja u mediju s 1.5 mol/L DMSO............................................................................................................ Postupak sporog zamrzavanja i brzog odmrzavanja u mediju s 1.5 mol/L PROH i 0. 1 mol/L sukroze............................................................................ Postupak sporog zamrzavanja i brzog odmrzavanja u mediju s 10% glicerola ......................................................................................................... Postupak ultrabrzog zamrzavanja i brzog odmrzavanja u medij s 3.5 mol/L DMSO i 0.25 mol/L sukroze.......................................................................... Postupak vitrifikacije ..................................................................................... Metoda sporog zamrzavanja dijelova kore jajnika ........................................ Zamrzavanja sjemena ili uzoraka dobivenog biopsijom testisa..................... Literatura .............................................................................................................. Kazalo ........................................................................................................................

Slika 10.II. Poluzrela jajna stanica uklopljena u polurahli kumulus ooforus s kompaktnom koronom radijatom

Slika 11.II. Nezrela jajna stanica s kompaktnim slojem stanica korone radijate i kumulusa ooforusa

1997). Po drugima, međutim, taj svojevrsni dismorfizam nije opasan za oplodnju i razvoj embrija, te ga kao takvog valja a proriori isključiti kao jednog od mogućih čimbenika za eventualni neuspjeh poslije ICSI (Balaban i sur., 1998).

Slika 14.II. Dismorfizam u jajne stanice čovjeka: (a) normalni tip jajne stanice s homogenom citoplazmom (polar body, Pb), (b) jajna stanica s granularnom citoplazmom, (c) jajna stanica popularno nazvana «volujsko oko», (d) tip jajne stanice s refraktilnim tjelešcem, (e) jajna stanica s glatkim tipom endoplazmatskog retikuluma (smooth endoplasmatic reticulum, SER), (f) jajna stanica s vakuolarnim tipom citoplazme (V); slike preuzete iz Van Blerkom i Henry, 1992

U želji da raspravu o jajnom dismorfizmom ne ograničimo samo na navedenu problematiku, recimo još na kraju da su još prije nekoliko godina Van Blerkom i Henry (1992) fenomen jajnog dismorfizma doveli u zajedničku vezu s pojavom aneuploidije. Oni su u gotovo 50% oocita s dismorfizmom citoplazme uočili jednu od nepravilnosti u broju kromosoma, a glavnu odgovornost za tu nesrazmjererno veliku učestalost aneuploidije, prebacili na više relevantnih

Tijekom ICSI, prvo se iz suspenzije, koja je dobivena obradom sjemena, u početni dio kapilare za injektiranje aspirira po mogućnosti morfološki normalno oblikovani spermij. Pokretanjem stolića invertnog mikroskopa kapilara za mikroinseminaciju se nakon toga brzo premjesti u otopinu PVP, u koju se neznatnim tlakom uspostavljenim na slobodnom kraju te kapilare, deponira aspirirani spermij. Naime, s teorijske točke gledišta oplodnja nakon ICSI je moguća jedino onda ako se u jajnu stanicu injektira vitalni spermij. S praktične strane, međutim, u tu svrhu se rabe samo pokretni spermiji, budući da se u nepokretnih nikada ne zna koji je od njih vitalan, a koji nije. Znači, jednom kada se pronađe pokretni spermij, on se neznatno prije ICSI u cilju redukcije njegova motiliteta prvo premjesti u otopinu PVP, a nakon toga uslijedi postupak njegove imobilizacije. Rep spermija se u tu svrhu dotakne vrsnim dijelom kapilare za mikroinjekciju, u koju se on na kraju aspirira negativnim tlakom uspostavljenim na distalnom kraju te kapilare, slika 17.II.a.

Slika 17.II. Četiri osnovne faze u odvijanju ICSI postupka, (a) imobilizacija spermija, (b) početna faza u mikroinseminaciji jajne stanice, (c) faza injektiranja i deponiranja spermija, (d) završna faza u mikroinseminaciji jajne stanice

Odmah čim imobilizacija spermija završi, jajna stanica se prihvati tzv. holding kapilarom u poziciji 9 h, a na suprotnoj strani, tj. u poziciji 3 h njoj se prvo približi (slika 17.II.b), i zatim pažljivo prođe kroz zonu pelucidu i oolemu

Slika 22.II. Četiri tipa humane blastociste: (a) normalni tip blastociste sa ekspandiranim blastocelom, (b) neekspandirani tip blastociste, (c) tip blastociste sa rudimentnim blastocelom, (d) tip blastociste sa dva do tri manja pseudoblastocela

Klinički rezultati ostvareni prijenosom blastociste u materište ponekad dostižu takve vrijednosti koje u stručne čitalačke publike izazivaju osjećaj respekta. U najboljim slučajevima, na primjer, uz učestalost trudnoće od 65%, stopa implantacije se penje na zavidnih 50% (Gardner i sur, 1998; Gardner i sur., 1998). Premda su ti rezultati na prvi pogled više nego impresivni, ako se međutim sagledaju cjelokupne okolnosti pod kojim je taj uspjeh ostvaren, onda ne bi trebali gledati uvijek previše s visoka na tu metodu PO. Uzmimo samo jedan primjer. Ne razvija se svako oplođeno jajašce do stupnja blastociste. Samo u rukama najboljih, gornja stopa razvoja se penje iznad 50% (Schoolcraft i sur., 1999), a u većine preostalih, ona rijetko kada premašuje vrijednosti od 40%. Od kakvog je pak kliničkog značaja gore navedeni podatak za tzv. low responer skupinu pacijenata, nije teško pogoditi. Naime, spomenuta skupina pacijenata iz fizioloških razloga nije u stanju producirati veći broj jajnih stanica, te je stoga vjerojatnost da se u njih uz spomenutu razvojnu stopu od 40% dobije pokoja blastocista, ravna gotovo ništici (Tsirigotis, 1998).

kapilara za pridržavanje jajne stanice ili tzv. holding kapilara. Tijekom mikromanipulacije, kapilarom za biopsiju se ulazi u lumen holding kapilare, pri čemu se s obje strane jajne stanice prođe kroz zonu pelucidu. Laganim potezom unatrag kapilara za biopsiju se konačno postavi u neposrednu blizinu polarnog tjelešca, koje se zatim pažljivo izdvoji iz perivitelinog prostora negativnim tlakom uspostavljenim na početnom dijelu kapilare za biopsiju, slika 4.III. Osim ovog tzv. mehaničkog postupka, zona pelucida se može perforirati također Tyrodovom otopinom ili laserom, te se tada shodno tome govori još o kemijskoj i fizičkoj metodi izoliranja polarnog tjelešca. Kod kemijske metode, jajna stanica se prvo prihvati holding kapilarom u poziciji 9 sati, a na suprotnoj strani njoj se približi kapilara promjera 5 µm ispunjena Tyrodovom otopinom. Zbog izrazito kiselog karaktera Tyrodove otopine (pH = 2.2), odmah nakon njenog oslobađanja na zoni pelucidi pojavljuje se manji otvor. Čim se to dogodi jajna stanica se ispere nekoliko puta u svježem mediju, te se na kraju premjesti u kapljicu medija u kojoj se obavlja biopsija polarnog tjelešca.

Slika 5.III. Aspiracija polarnog tjelešca nakon laserske perforacije zone pelucide

Napokon, kod treće ili fizičke metode, ugradnjom lasera u optički sustav invertnog mikroskopa biopsija polarnog tjelešca postala je bržom i praktičnijom, slika 5.III. Štoviše, budući da nema više traume koju jajna stanica doživljava tijekom mehaničke ili kemijske ekstrakcije polarnog tjelešca, glede konačnih IVF

Premda je metoda sporog hladenja u mediju s PROH i sukrozom uspješno etablirana u mnogim IVF centrima, stopa preživljavanja još uvijek varira od jednog do drugog IVF centra. Prema literaturnim podacima, na primjer, ona se kreće od prosječnih 56% do gotovo 90%, a uzrok ovakvom odstupanju treba isključivo tražiti u modifikacijama protokola zamrzavanja i odmrzavanja originalno predloženog od strane Lassalla i sur. (1985). Na primjer, Demoulin i sur. (1991) primjenjujući automatski umjesto ručnog načina indukcije kristalizacije postiže stopu preživljavanja od samo 56 %. Cohen i sur. (1988), s druge strane, izostavljajući terminalnu brzinu hlađenja od -50°C/min, ostvaruje stopu preživljavanja od 61 %. U programu IVF Sveučilišne bolnice u Zürich, međutim, primjenjujući originalni Lassallov protokol stopa preživljavanja dostiže razinu od gotovo 90% (Maćaš i sur., 1998).

Slika 10.IV. Zigota čovjeka u otopini 1.5 mol/L PROH 20 sati nakon in vitro inseminacije s pronukleusima u središtu stanice

Još od prvih dana primjene ove metode je spoznato, pretežno komparativnim ispitivanjima, da zameci koji se razvijaju iz zigota zamrznutih na niskim temperaturama nemaju podjednaku mogućnost induciranja trudnoće. Neki su s obzirom na to u izuzetno dobrom položaju, dočim drugi induciraju sporadično, tek tu i tamo poneku trudnoću. Oni s dobrim predispozicijama su prije svega

117

zameci koji se razvijaju iz zigote i u kojima se pronukleusi (muški i ženski), otprilike 18 do 22 h nakon konvencionalne in vitro inseminacije, zauzmu središnji položaj u stanici, slika 10.IV. Ako se pak u tom vremenu zigota zamrzne, tada valja računati sa stopom implantacije većom od 20% (Wright i sur., 1990). Dinamika pojavljivanja i nestanka pronukleusa ne mora se uvijek ostvariti u vremenskim okvirima koje smo gore naveli. Na primjer, svi oni koji se bave mikroinseminacijom jajne stanice, najvjerojatnije su već uočili da u usporedbi s IVF, pronuklearni stadij u ICSI zigota traje prosječno kraće vrijeme. U ne tako malom broju slučajeva se događa da pronukleusi iščeznu u singamiji (slika 11.IV.) nakon mikroinseminacije jajne stanice (18-20 h), pa je stoga upitno da li je u tom razvojnom stadiju ispravno zamrznuti takve zigote (Nagy i sur., 1994).

Slika 11.IV. Zigota čovjeka u fazi singamije

Trenutačno je ovaj problem predmetom novijih kliničkih ispitivanja, te se s obzirom na optimiziranje protokola zamrzavanja ICSI zigota u posljednje vrijeme započelo ozbiljno razmišljati o uvođenju metode vitrifikacije. Kako ćemo kasnije vidjeti, temperaturni pad koji se ostvaruje tijekom vitrifikacije toliko brz, tako da bi se praktički ovom metodom mogla gotovo svaka zigota zamrznuti u onom stadiju, koji je optimalan za nju. Koliko se daleko otišlo s tim eksperimentima teško je

118

Slika. 20.IV. Zamrzavanje spermija čovjeka metodom po Cohenu i sur. (1997)

Dosada smo imali isključivo primjere kada se u uzorcima dobivenim masturbacijom ili biopsijom testisa nađe dovoljno pokretnih spermija. Međutim, u ne tako malom broju slučajeva se događa da u takvim uzorcima ima ekstremno malo spermatozoida, pa se u cilju njihova pohranjivanja na niskim temperaturama najbolje poslužiti metodom koju je prije nekoliko godina izmislio Cohen sa sur. (1997). Interesantno je da i ovdje u cilju uspješne implementacije ove metode valja, slično testu jajnih polovica(hemi-zona) (vidi poglavlje Androloški aspekti medicinski pomognute oplodnje u čovjeka), osigurati dovoljan broj neoplođenih jajnih stanica čovjeka. Kada se pronađu, one se prvo oslobode stanica korone radijate, a zatim se pipetom za mikroinseminaciju uđe u njihovu unutrašnjost, te se aspirira cjelokupni sadržaj, slika 20.IV. Odmah nakon toga, istom se pipetom u prostor nastao aspiracijom citoplazme uštrca izvjesna količina test yolk medija zajedno s ono malo pokretnih spermija koliko ih se pronađe u uzorcima dobivenim masturbacijom ili biopsijom testisa. Tako uredno «upakirani» spermiji se na kraju premjeste u plastičnu slamčicu za zamrzavanje veličine 0.25 mL, te se konačno zamrznu standardnim postupkom. Nedavno su se postupci u odmrzavanju spermija rabili samo onda kada bi se ukazala potreba za intrauterinom inseminacijom (intrauterine insemination, IUI). U posljednje vrijeme, međutim, postupci u odmrzavanju spermija su se do te mjere intenzivirali, da praktički u androloškom dijelu IVF laboratorija ne prođe radni tjedan bez odmrzavanja spermija. Ukratko, u cilju odmrzavanja plastična slamčica za zamrzavanje sa spermatozoidima prvo se izvadi iz spremnika s tekućim dušikom, te se prenese u vodenu kupelj ugrijanu na +37°C. Pošto se odrežu oba kraja plastične slamčice za

134