Farmaci, ADME
og et bachelorprojekt om transportører Af Catalin Maria Frydendal
Omkring Farmaci og Absorption af stoffer i kroppen Farmaci er en bredspektret tværfaglig videnskab, som omhandler viden om lægemiddelstoffer samt deres fremstilling. Fra opdagelsen af et lægemiddelstof, dvs. et stof som har en terapeutisk effekt i kroppen, til at vi kan finde det i form af et lægemiddel på hylden på apoteket, er det en meget lang, tidskrævende og ikke mindst utrolig spændende proces. En af farmaceuternes mange områder er forståelsen af, hvordan fx et lægemiddelstof formuleret som et oralt lægemiddel, dvs. et lægemiddel indtaget gennem munden fx en tablet, skal kunne medføre en effekt et andet sted i kroppen. Dette kræver både en forståelse af lægemiddelstoffet i sig selv, dvs. fysiske og kemiske egenskaber så som stabilitet, opløselighed og permeation, samt viden om, hvilke hindringer et lægemiddelstof kan møde på sin vej mod det sted i kroppen, hvor lægemidlet skal virke. Lægemiddelstoffet i tabletten møder allerede den første udfordring efter indtagelsen, da miljøet i maven fungerer som en del af vores naturlige forsvarssystem. Lægemiddelstoffet skal kunne være stabilt i maven, hvor pH værdien er lav. Fra maven transporteres lægemiddelstoffet videre med den fordøjede mad til tarmene. 32
Hjerneblod l
7/2017
Omkring Forfatteren: Jeg startede på farmaci på SDU i 2013. 23 år gammel. Nu er jeg igang med kandidaten (Teknologisk Farmaci). Ved siden af mit studie er jeg formand for Farmaceuternes Forening-SDU. Foreningen er en studenterorganisation, som varetager farmacistuderens faglige og sociale interesser med fokus på fællesskab på tværs af årgange. Jeg holder meget af at være kreativ, mine bedste ferier har været de mest primitive. Min ynglingsfarve er gul og lykketallet er 7. Catalin afsluttede sin bachelor i 2016, det er den, hun fortæller om i denne artikel.
Det er i tarmen, at størstedelen af optagelsen af kroppens næringsstoffer finder sted. Kroppen har ikke nogle præferencer for at behandle lægemiddelstoffet anderledes, end hvis stoffet var et fremmed, skadeligt stof eller et næringsstof. Den anatomiske, fysiologiske og farmakologiske viden om kroppen og lægemiddelstoffet selv er alt afgørende for forståelsen af, hvordan lægemiddelstoffet krydser den første barriere, tarmen. Lægemiddelstoffet skal krydse tarmvæggen for at nå blodet, hvor det med blodet kan blive transporteret videre i kroppen. Processen, hvormed lægemiddelstoffet krydser tarmvæggen betegnes som absorption, hvilket er det første led i beskrivelsen af, hvad kroppen gør ved lægemiddelstoffet, farmakokinetikken. ADME beskriver tilsammen farmakokinetikken af lægemiddelstoffet. Absorptionen (A) er efterfulgt af fordelingen af lægemiddelstoffet i kroppen, distribution (D), dernæst metaboliseringen (M) af lægemiddelstoffet dvs. omdannelsen af lægemiddelstoffet og til sidst udskillelsen af lægemiddelstoffet, som betegnes ekskretion/ udskillelse (E).
33
Transportører er vigtige for absorptionen Hvordan lægemiddelstoffet virker på kroppen, betegnes som den farmakologiske effekt. Det kan fx være bindingen til et enzym, receptor eller transportør i kroppen, som efterfølgende medfører en ønsket terapeutisk effekt. Virkningen af lægemiddelstoffer er derfor afhængig af stoffets tilgængelighed ved det virksomme sted fx enzymet, receptoren eller transportøren. Tilgængeligheden af lægemiddelstoffet betegnes som biotilgængeligheden. Biotilgængeligheden af lægemiddelstoffet beskriver, hvor stor en andel af den dosis, som man indtog igennem munden, der når frem til det virksomme sted, samt hvor hurtigt det forløber. En høj biotilgængelighed af et oralt lægemiddel betyder, at der er en stor andel af lægemiddelstoffets dosis i lægemidlet fx tabletten, som når frem til det ønskede sted. Et lægemiddelstofs biotilgængelighed afhænger af hvad kroppen gør ved lægemiddelstoffet dvs. farmakokinetikken. ADME egenskaberne er unikke for hvert lægemiddelstof. Det er fx ikke alle lægemiddelstoffer, som bliver absorberet over tarmvæggen på samme måde, da lægemiddelstoffer ikke er ens. De kan have forskellige størrelser og nogle er mere lipofile dvs. fedtelskende modsat andre, som er mere hydrofile dvs. vandelskende.
34
Hjerneblod l
7/2017
Transport over tarmvæggen kan ske på to forskellige måder, enten vha. transportører eller ved passiv bevægelse transcellulært eller paracellulært. Transportører er transmembrane proteiner dvs. de gennembryder cellemembranen. Deres funktion er at flytte molekyler fra/til cellens omgivelser og ind/ud af cellen. Små fedtelskende (hydrofobe) lægemiddelstoffer trænger nemt igennem en lipofil barriere som cellens plasmamembran og transporten drives af den koncentrationsforskel, som findes henover membranen, dvs. de transporteres nemt via. passiv bevægelse paracellulært og/eller transcellulært. De hydrofile (dvs vandelskende) lægemiddelstoffer er derimod mindre tilbøjelige til at kunne krydse tarmvæggen på baggrund af en koncentrationsforskel, hvorfor disse lægemiddelstoffer oftest bliver transporteret over tarmvæggen vha. transportører i cellens plasmamembran. Transportører karakteriseres på basis af deres virkningsmekanisme, selektivitet og specificitet for substrater samt drivkraft. Undersøgelsen af transportører og specielt transportører i tarmen er et felt i udvikling inden for forskningen og videnskabelig evidens er sparsomt for transportører, som er involveret i absorptionen af et lægemiddelstof i tarmen.
Proton koblet aminosyre transporter (PAT1)
Aminosyrer er en del af de essentielle næringsstoffer, som kroppen har brug for. Aminosyrer som L-prolin, sarcosin og glycin bliver transporteret via PAT1 Den proton koblede aminosyre transind i blodet, hvor de bliver tilgængelige porter (PAT1/SLC36A1) har vist sig at for kroppen som vigtige byggesten. være betydningsfuld for den høje biotilPAT1 transporterer protoner og subgængelighed af orale lægemiddelstoffer, strat i forholdet 1:1 i symport, hvilket som efterligner aminosyrer fx gaboxalol vil sige at de transporteres i samme og vigabatrin. retning over cellemembranen (figur 1). PAT1 tilhører superfamilien soulte Den høje biotilgængelighed af små carrier familiy (SLC) og mere specifikt hydrofile lægemiddelstoffer, som eftergruppen SLC36A. Transportøren findes bl.a. i tarmen, nyrerne og lungerne. PAT1 ligner aminosyresubstraterne for PAT1, kan muligvis forklares ved, at de også er kendt for at transportere små hydrobliver transporteret vha. transportører file aminosyrer med en affinitet mellem 2-20mM og høj kapacitet. Transportørens og potentielt PAT1. Ø affinitet for et stof beskriver, hvor godt stoffet og transportøren binder til hinanden. En lav talværdi af affinitet afspejler at bindingsevnen mellem stoffet og transportøren er god og affiniteten betegnes derfor som høj. En god bindingsevne antyder, at stoffet interagerer med transportøren. Stoffet skal binde til transportøren, inden det kan blive transporteret over membranen. Derfor giver en god interaktion mellem stoffet og transportøren anledning til, at man mistænker stoffet for at være et potentielt substrat (mere om substrat: læse infobox på næste side) for transportøren.
Figur 1: Den protonkoblede aminosyre transporter (PAT1) transporterer i symport protoner (H+) og substrater (lyserød fyldt cirkel) i forholdet 1:1.
35
Substrat: Et stof/molekyle/ substans som interagerer med fx en transportør, hvorved substratet bliver transporteret. Inhibitor: Et stof/molekyle/substans som hæmmer en proces fx transporten af et stof Mekanismen af PAT1 er karakteriseret ved, at den hastighed hvormed transportøren flytter substrater over membranen, er mætbar dvs. at den har en maksimal kapacitet. Desuden kan substrater og inhibitorer konkurrere om bindingsstedet til transportøren. Når substrater konkurrerer om bindingsstedet på transportøren, betegnes dette som kompetitiv inhibering. Altså hvis tilgængeligheden af to substrater er lige stor ved transportøren, vil det substrat med den laveste affinitet opnå en større biotilgængelighed end det andet substrat. Hvis to substrater binder lige godt til transportøren, men er tilgængelige for transportøren i to forskellige koncentrationer, så vil det substrat, hvor koncentrationen er størst, binde oftere til transportøren og derfor opnå en større biotilgængelighed.
Et bachelorprojekt med fokus på transportører Meldonium er et antiiskæmisk lægemiddelstof, som produceres af Grindex. Et antiiskæmisk lægemiddelstof er et lægemiddel som modviker iskæmi. Iskæmi er en utiltrækkelig blodforsyning til et væv og dermed også en mangelfuld ilttilførelse til vævet. Hvis vævet ikke får den tilstrækkelig ilttilførelse, så vil cellerne begynde at dø og vævet mister sin funktion. Dette ses bl.a. i hjertets muskulatur, myocardiet. Hvis en andel celler i myocardiet mister deres funktion, så har det fatale konsekvenser for hjertets optimale funktion. The World Anti-Doping Agency (WADA) tilføjede i januar 2016 Meldonium til den forbudte liste af stoffer. Stoffet vagte derfor en stor opsigt i medierne, da kendte sportsudøvere som tennisstjernen Maria Sharapova blev testet positivt ved en doping test pga. brugen af meldonium. Meldonium er et lille hydrofilt lægemiddelstof, der strukturelt efterligner kendte substrater for PAT1 (proteincoupled amino transporter) fx betain og beta-gaunidino propionic acid. Biotilgængeligheden af meldonium, som indgives oralt, er på 78 % og den maksimale koncentration i blodet opnås efter 1-2 timer, når der er indgivet dosis på 250 mg. I mit bachelorprojekt undersøgte jeg vha. in vitro studier, om meldonium er et substrat for PAT1. Til in vitro studierne anvendte jeg Caco-2-celler, som er celler, der er udviklet til at ligne tarmvæggen.
36
Hjerneblod l
7/2017
In vivo : Latinsk for “i levende”. Denne betegnelse refererer til eksperimenter i levende systemer. In vitro : Eksperimenter som udføres uden for en levende organisme fx i et reagensglas. In vitro studier for carriermedieret transport i Caco-2-celler Den carrier-medierede optagelseshastighed af aminosyren prolin (en aminosyre der transportes af PAT1) kan beskrives vha. Michaelis Menten-lignende kinetik (Ligning 1). Ligning 1
På figur 2 ses det, at den carrier-medierede optagelseshastighed af prolin er mætbar (se kurven flader ud). Dette er karakteristisk for den carrier-medierede transport og PAT1 kan derfor siges at være afhængig af dosis. Fittet i figur 2 er plottet efter ligning 2 og Vmax blev fundet til at være lig med 1.50 nmol∙min-1∙cm-2 med en affinitet/ km på 2.08 mM.
Den carrier-medierede optagelseshastighed af prolin angives ved V0 og substratkoncentrationen angives ved [S]. Vmax er den maksimale optagelseshastighed per areal af substratet og Km er Michaelis konstanten, som udtrykker transportørens affinitet for substratet. En lille andel af transporten af prolin kan være forårsaget af den passive transcellulære og/eller paracellulære transport, og derfor tages der Figur 2: højde for denne passive komponent, som Optagelseshastigheden af prolin i Caco-2-celler udtrykkes som Papp∙[S]. Papp er den som funktion af den totale prolin koncentration. tilsyneladende permeabilitetskoefficient. Ligning 2 Ligning 2 er et udtryk for den totale carrier-medierede optagelseshastighed, når kun transportører bidrager til transporten af prolin over tarmvæggen.
In vitro studier for carrier-medieret transport i Caco-2 celler
Aminosyren sarcosin er, ligesom prolin, et kendt substrat for PAT1 og ved at undersøge dets kompetitive inhibering på prolin, optaget i Caco-2-celler, kan man finde sarcosins affinitet for PAT1. Den kompetitive inhibering af prolin optaget med sarcosin beskrives vha. ligning 3, som er udledt fra ligning 1. Ø
37
Ligning 3
Ligning 3 udtrykker den Michaelis-Menten carrier-medierede optagelseshastighed som er afhængig af både koncentrationen af substratet prolin [S] og koncentrationen af den kompetitive inhibitor sarcosin [I]. Ki er inhibitions konstanten. Figur 3 viser hvordan optagelseshastigheden af prolin falder ved en stigende koncentration af den kompetitive inhibitor sarcosin. Affiniteten/IC50 blev fundet til at være 4.26 mM for sarcosin. Dvs. sarcosin interagerer med transportøren PAT1. Yderligere er det også karakteristisk for den carrier-medierede transport fx PAT1, at transporten kan inhiberes.
Figur 3: Optagelseshastigheden af prolin i Caco-2-celler som funktion af log til sarcosin koncentrationerne. Da det er påvist i tidligere studier, at sarcosin er et substrat for PAT1, kan man med sikkerhed sige, at sarcosin er en kompetitiv inhibitor. På samme måde kan man som med sarcosin undersøge, i hvor høj grad meldonium interagerer med PAT1 ved at finde affinitets/IC50 værdien for meldonium. Dette in vitro studie kan dog ikke alene påvise, at meldonium er et substrat for PAT1, men derimod om meldonium er en inhibitor og interagerer med transportøren samt i hvilken grad. o
38
Hjerneblod l
7/2017