Lægemiddel mod
forhøjet blodtryk af Jesper Bork Bertelsen 25 år Har studerett 3½ år på SDU U og er nu på kandidaten ni farmaci maci 32
Hjerneblod z 5/2016
Kroppen er et meget komplekst og fantastisk biologisk apparat. Dens sammensætning sørger for, at vi mennesker er i stand til at holde os i live ved blandt andet at opretholde den korrekte balance af vand og salte. Nogle gange er kroppen dog ikke i stand til at opretholde denne fine balance, og det kan føre til forhøjet blodtryk. Mennesker med forhøjet blodtryk har ingen symptomer. Det er noget lægen kan måle ved blandt andet at sætte en trykmåler på armen. Mange tænker, at når det nu ikke kan ses, mærkes eller vides, uden at man måler det, er det så noget, vi bør tage alvorligt? Og frem for alt, hvad kan man da gøre? Svaret er ja, det skal man tage alvorligt, fordi det over tid vil give andre skader i kroppen at have et forhøjet blodtryk. Og hvad kan vi gøre? At spise sund og varieret kost kombineret med motion er et godt sted at starte. Derudover er der medicinsk behandling. Jeg læser farmaci og kan siges at være en kommende lægemiddelekspert. Netop derfor er jeg interesseret i den medicinske behandling. Der findes effektive lægemidler til behandling af forhøjet blodtryk, og der er nye lægemidler på vej. Det tager ca. 10 år fra et lægemiddel er færdigudviklet og testet, til det ender ude hos de patienter, som skal bruge det. Et af disse nye lægemidler, som har en meget lovende fremtid for sig, kaldes lige nu for Compound 21, C21. Det er et lægemiddel, vi bruger i vores forskning, fordi det er utrolig effektiv på grund af dets selektive virkning. Når et lægemiddel er meget selektivt, øger det sandsynligheden for, at man ikke oplever særlig mange bivirkninger, fordi det ikke vil påvirke andre dele af kroppen, men netop kun den faktor, vi ønsker at ændre på - og dermed opnås den bedste behandling med færrest bivirkninger. Hvordan virker C21? For at kunne svare på
det skal man kunne forstå, hvad der sker i en blodåre og inde i en celle. Alle organer i kroppen består af celler, og en blodåre består af flere forskellige slags, såsom muskelceller og binde- væv. Det cellelag på en blodåre, der vender ind mod blodet, består af et enkelt lag, som adskiller blod fra resten af blodåren, kaldet endotelceller. De har en helt bestemt evne til at bestemme hvor meget blod, der skal komme igennem blodåren ved at få musklerne omkring åren til enten at trække sig sammen og stramme om den eller slappe af og dermed tillade mere blod at komme igennem. Man kan se det lidt som en vandslange: Hvis man tænder for vandet, så løber der en konstant mængde vand ud. Hvis man klemmer på slangen, vil der komme den samme mængde vand ud, men strålen er nu blevet kraftigere. Det samme sker i blodårerne: Når hjertet pumper en bestemt og konstant mængde blod ud, vil en øget modstand i blodåren være skyld i, at trykket stiger og giver forhøjet blodtryk. Nu vender vi tilbage til vand- og saltbalancen. Et af de systemer, der er ansvarlig for denne balance, kaldes renin-angiotensin-systemet. Her dannes et peptidhormon kaldet angiotensin II, Ang II. Det vil interagere med en receptor kaldet angiotensin II-receptor, hvoraf der findes to typer, henholdsvis type 1 og 2. Hvis Ang II reagerer med Type 1-receptoren, vil den få blodåren til at trække sig sammen og øge trykket. Det er denne receptor, Ang II normalt interagerer med. C21 interagerer kun med type-2-receptoren, som en agonist, der aktiverer receptoren, hvilket resulterer i en afslapning af blodårerne og dermed også i et fald i blodtrykket. Den forskningsgruppe, jeg var i i Winsløwparken 21 3. sal, bestod af min professor Ulrike Muscha Steckelings, PhD-studerende Antonio Augusto Bastos Peluso og laborant Tenna Mortensen samt andre studerende, ¾ 33
jeg kunne samarbejde og dele erfaringer med. Det kræver gode samarbejdspartnere at lave god forskning, hvilket jeg følte var etableret i denne gruppe samt på hele afdelingen. Vores forskningsgruppe har til formål at undersøge Angiotensin II type-2-receptoren (AT2R), der har været kendt siden 1990. Selvom det kan virke som mange år, er der stadig mange
Her vises det, hvordan en blodåre er opbygget. Ind mod blodet er der et cellelag kaldet endotelceller. Herunder er to scenarier vist.
I scenariet på denne side reagerer cellen på Angiotensin II-stimulering, der resulterer i en stramning af blodåren.
34
Hjerneblod z 5/2016
detaljer, vi ikke kender endnu og et af mysterierne er, hvordan receptoren sørger for at regulere aktiviteten af et bestemt enzym. Enzymer er proteiner, der laver meget specifikke reaktioner i en celle, og dermed er ansvarlige for en bestemt produktionsproces. Enzymstrukturen er ofte opbygget sådan, at der findes et sted, hvor de kan udføre denne
reaktion, kaldet det aktive bindingssted. Aktiviteten af enzymet kan reguleres ved eksempelvis at sætte en fosfatgruppe på enzymet, for da at ændre dets konformation dvs. måden det er foldet på. Dette kan man sammenligne med en magnet: Enzymer er elektrisk ladede på overfladen og en fosfatgruppe er negativt ladet. Alt efter hvilken ladning den er tæt på, vil der enten ske en frastødning eller en tiltrækning, der ændrer dens form og struktur. Dette påvirker aktiviteten af enzymet, da ændringerne også kan ændre konformationen på det aktive bindingssted. AT2-receptoren regulerer aktiviteten på et enzym kaldet endothelnitrogenoxidsyntase, eNOS. Som dets navn også angiver, er det ansvarligt for nitrogenoxid-,
NO, produktionen i cellen. NO vil gå fra cellen og videre ind i muskellaget, der ligger rundt om blodåren. Musklerne kan være spændte eller afslappede ligesom vores muskler i armen. Det bestemmer, hvor stor diameteren på åren er og mængden af blod, som strømmer igennem. Når NO reagerer med musklen, vil det resul- tere i en afslapning af blodåren, så trykket, der var genereret, ophører, hvilket får diameteren på blodåren til at være større, så blodtrykket falder. Vi ønskede at undersøge, om eNOS blev aktiveret, når vi anvendte C21, ved at kigge på, hvorvidt fosforyleringerne var fjernet eller påsat. Nogle fosforyleringer vil resultere i en nedsat aktivitet, hvorimod andre fosforyleringer vil resultere i en aktivering. ¾
Her ses hvordan cellen reagerer på C21-stimulering: blodåren slapper af, hvilket resulterer i et blodtryksfald.
35
Metode Vi brugte forskellige metoder kaldet Western blots for at undersøge fosforyleringsstatussen på et givet tidspunkt og nitrogenoxid-målinger for at se hvad der skete, når vi tilsatte C21. Dette blev gjort på celler, vi dyrkede i laboratoriet. Cellerne var endothelceller og stammede fra et menneske. Cellerne blev taget fra den største blodåre, vi har i kroppen, kaldet aorta. Når cellerne var klar til stimulering, blev C21 tilsat i 5, 10 og 15 minutter. Det samme blev gjort ved en kontrolgruppe uden tilsætning af
Figuren viser hvordan LDS og reducing agent (1+2) behandler proteinet (3), hvorefter prøver tilsættes i en brønd på en gel. Der sættes strøm til, hvor de negativt ladede proteiner vil vandre mod den positive anode i bunden. Det medfører, at proteinerne bliver separeret, hvor de største proteiner vandrer kortest og de mindste længst. En membran , som proteinerne overføres til (4), kan man tilsætte nogle anti-stoffer, der specifikt binder til det protein, man vil undersøge, hvilket vil give et signal.
36
Hjerneblod z 5/2016
C21. Herefter frøs vi alle processerne i cellerne ved at tilsætte bestemte kemikalier. Desuden var der kemikalier til stede, der ødelagde cellevæggen og strukturen, men ikke proteinerne. Ved en efterbehandling har man kun proteiner i en gennemsigtig opløsning.
Western blot Western blots går ud på at separere proteiner fra hinanden ved hjælp af strøm. Det, man ønsker i første omgang, er, at få proteinerne foldet ud. Proteiner er bundet sammen og dermed
foldet på en bestemt måde ved hjælp af nogle meget stærke svovlbindinger, -S-S-. Disse svovlbroer bliver reduceret til -SHbindinger ved hjælp af et meget stærkt reduceringsmiddelt. Herefter tilsætter man litium-dodecylsulfat kaldet LDS. Det binder til proteinets overflade og gør den negativt ladet. Ligesom for magneten vil det føre til en frastødning mellem hvert LDS-molekyle på proteinet, hvilket medfører at proteinet bliver foldet ud. Man tilsætter et anti-stof, der binder specifikt til fosforyleringen, som man vil undersøge. Med yderligere behandling kan man få lys de steder, hvor antistoffet er bundet afhængigt af proteinmængden og mængden af fosforyleringer. Derfor holdes proteinmængden konstant og dermed er det kun variationen af fosforyleringsstatussen, der måles på. Vores undersøgelser viste, at fosforyleringen i det hæmmede eNOS faldt i forhold til kontrollen, når vi havde behandlet cellerne med C21, samt at der var et øget signal ved den fosforylering, der førte til en aktivering af eNOS. Disse reguleringer skete samtidig og var den første måling, der viste, at eNOS blev aktiveret ved tilsætning af dette lægemiddel, hvilket vi alle var meget fascinerede af og stolte over at have fundet.
Nitrogenoxidmålinger Cellerne blev dyrket i laboratoriet på nogle små runde glasplader. Når de var klar, tilsatte vi en sporstof kaldet DAF-FM. Det danner et kompleks med nitrogenoxid (NO), hvilket resulterer i dannelsen af et molekyle, der fluorescerer. Det betyder, at molekylet udsender lys, når man lyser på det med en bestemt bølgelængde. Dette gøres ved at sætte glaspladen med celler ind i et specielt fluorescerende mikroskop, hvor der optages en video af cellerne, imens der lyses på dem.
På et givent tidspunkt tilsatte vi C21, og observerede NO-produktionen. Vi kunne se, at produktionen blev højere, fordi det fluorescerende lys blev stærkere. Herefter var vi interesserede i, om signalet kunne stoppes. Dette gøres for at sikre sig, at det man ser i mikroskopet, i virkeligheden er det, som teorien og hypotesen siger. For hver hæmning af signalet blev der brugt nye celler, både alene og sammen med lægemidlet. Et molekyle, der stopper eNOS fuldstændig, kaldet L-NAME, var i stand til at stoppe signalet fra C21, hvilket betyder at den NO-produktion, som vi så i mikroskopet, var produceret af eNOS og ikke af andre enzymer. PD123319 er en antagonist, der modsat C21’s virkning går ind og hæmmer AT2-receptoren. Da den blev tilsat, hæmmede det også signalet, hvilket betyder, at C21 kun rammer AT2-receptoren og ikke andre receptorer, der kunne have givet det samme signal.
ECCR Efter at have afleveret mit bachelorprojekt blev jeg inviteret af min vejleder Ulrike Muscha Steckelings sammen med min medvejleder Antonio Augusto Bastos Peluso til Gardasøen i Italien. Her skulle vi deltage i en videnskabelig konference, der hed European Council for Cardiovascular Research (ECCR). Hertil lavede vi en poster, som er en stor plakat, der indeholder min bachelorrapport i en meget kort form med de videnskabelige resultater. Til denne konference var der forskere fra hele verdenen, som forsker inden for dette område. Det var utroligt spændende og meget lærerigt. De forskellige forskere fremlagde deres forskning, hvilket var inspirerende og meget interessant. Med en fantastisk udsigt, 20 grader i skyggen og masser af hygge kunne man ikke forlange mere. Dog kom overraskelsen den sidste dag, ¾ 37
vi var på konferencen, hvor de udpegede en udvalgt, hvor jeg står klar til at forklare, hvad poster, der var den bedste i sin kategori. Her- mine resultater viser til de interesserede, som til fik vinderen mulighed for at præsentere re- kom forbi. Jeg havde på forhånd forberedt en sultaterne foran forskerne i 5 minutter, hvor PowerPoint præsentation i tilfælde af at jeg forskerne efterfølgende kunne spørge ind til vandt. Det gik rigtig fint og jeg modtog et cerresultaterne. Min poster blev valgt, og jeg blev tifikat på, at jeg havde vundet og vores gruppe, som var taget til konferencen, var meget glade med det samme ramt af glæde og spænding. Billedet herunder er taget, lige før jeg blev og stolte.
38
Hjerneblod z 5/2016