Af Henrik Thoke 8
“forskellige forskere har igennem tiden argumenteret for at vand, med sine mange unikke egenskaber, samt det at det udgør klart størstedelen af cellen, ikke bare skal opfattes som et inaktivt opløsningsmateriale som liv nu engang eksisterer i”
9
L
IV ER MEGET SVÆRT AT DEFINERE. PÅ TRODS AF, AT DER FINDES MANGE FORSKELLIGE DEFINITIONER, ER DER INGEN, DER HELT FYLDESTGØRENDE KAN REDEGØRE FOR, HVAD DER ER LEVENDE, OG HVAD DER ER DØDT. DE FLESTE KAN DOG VÆRE ENIGE OM, AT EN CELLE ER DEN MINDSTE STRUKTURELLE, FUNKTIONELLE OG BIOLOGISKE ENHED, DER ER KENDT I ALLE LEVENDE ORGANISMER.
Celler er mellem 1-100 mikrometer Cellen er et kaotisk system, hvor store, og blev opdaget af Robert Hooke mange ting inde i cellen skal synge i kor i 1665. Små 200 år efter blev teorien, der for at holde den i live og være social med siger, at levende organismer består af en andre celler. For at forstå dette virvar, har til flere celler, udviklet. Vi har således, på forskere været nødt til at se på enkelte overfladen, et ganske enheder og processer lidt godt billede af, hvad ad gangen. det kræver at holde en celle i live. Stort set alle Men hvad er en celle cellulære processer har så? Og hvad gør cellen en velbeskrevet meforskellig fra de omgivkanisme: Ioner flyder elser, den befinder sig gennem kanaler, soluti? Biologer har i flere ter (opløste stoffer, f.eks. århundrede beskrevet sukker opløst i vand) den som en ”klumpet, transporteres ind og homogen (ensartet), ud af cellen gennem gelatineagtig substans” pumper, nogle kompo(Dujardin, 1835), der nenter kan flyttes rundt ikke lader sig opløse og Cellestruktur af kork i mikroskop. af ’molekylære motorer’ blande, hvis man komBilledet er håndtegnet af Robert osv. mer den ned i vand. At Hooke omkring 1665. cellen ikke blander sig med Man kan derfor godt vand, førte til den idé, at undre sig over, at vi, trods denne enorme cellen er omgivet af en vandimpermeaviden, stadig er stort set ude af stand til bel (uigennemtrængelig) film. Mange at kurere sygdomme eller finde ud af, varianter blev foreslået, f.eks. forestillede hvad der f.eks. præcist gør, at en celle Kühne (1864) sig et lag af stivnet protein, pludselig bliver til en cancercelle. Svaret mens Schülze (1863) forestillede sig, at skal måske findes i vores måde at behan- det yderste af selve cellen var størknet dle komplicerede systemer (som en celle (så det dannede en beskyttende skorpe). må siges at være!) på. Man forestiller sig i dag typisk cellen som værende omgivet af et lipid (fedt) Hjerneblod 10
2/2014
Ydre af cellen
}
phosphorlidpid dobbeltlag
hoved t r æ l Po Upolære haler
Indre af cellen
Transportprotein
holipid
Phosp
Figur 1: En cellemembran. Man betragter typisk cellen som bestående af et lipid (fedt) dobbeltlag (blå), der adskiller det indre af cellen (cytoplasma) fra det ydre. Al kommunikation imellem cellen og omgivelserne, sker igennem de forskellige proteiner.
dobbeltlag, og den mest kendte variant af denne er Singer og Nicholsons model fra 1972 (den flydende mosaikmodel, se f.eks. figur 1). Lipidlaget er uigennemtrængeligt, og alt der skal bevæge sig ind og ud af cellen, skal derfor hjælpes på vej. Værktøjskassen til at løse og forklare ting i cellen med (f.eks. problemet med hvordan en ion kan bevæge sig ind i cellen), er ofte at finde et protein og finde ud af præcis, hvordan/hvorfor det gør, som det gør og kan det, som det kan (se figur 1). Allerede på gymnasieniveau lærer man, hvordan natrium-kalium-pumpen kan pumpe natriumioner ud af cellen og kaliumioner ind i cellen. Denne adskillelse kræver energi i form af ATP. Ionerne forsøger på grund af ladnings og koncentrationsforskelle at modvirke denne adskillelse, og da membranen har forskellige ”lækkekanaler” og ikke altid slutter helt tæt, er det altså nødvendigt konstant at pumpe for at opretholde forskellen. Og Na+/Ka+ pumpen er ikke alene, men er blot et af mange proteiner (pumper/kanaler m.m), der lever deres
liv på cellemembranen. Proteinerne udgør ca. 50 % af hele cellemembranen. Forskerne har således fundet et protein, der specifikt kan føre netop én ting ind og ud af cellen, alt fra vand til giftstoffer, for at opretholde denne uligevægt. Og det er faktisk netop sådan, min biologilærer i gymnasiet lærte mig om forskellen mellem liv og død: En celle er konstant i dynamisk uligevægt, og hvis cellen når til ligevægt (hvilken den vil gøre, når cellen/proteinerne stopper med at pumpe) svarer det til ’død’. For at forstå transport- og koncentrationsforskelle i cellen benytter vi i det følgende en almindelig gryde som gennemgående model. Hvis man f.eks. smider salt ned i den ene side af en gryde med vand, ved vi, at salten diffunderes (flyttes) til den anden side, til der er lige meget salt overalt. Hvis vi skal forhindre dette, er vi nødt til at placere en saltbarriere. Læg mærke til, at der i denne beskrivelse ligger en antagelse om, at det indre af cellen (cytoplasma) ikke er (meget) ▶ Vand & den levende tilstand 11
forskelligt fra væske, der omgiver cellen, ligesom de to ender af gryden indeholder ’den samme type’ vand. Måske fordi vand er så stor en del af vores hverdag, glemmer vi at tænke over, hvor specielt vand faktisk er, og hvor mange unikke måder det kan opføre sig på.
Lidt mere om vand Vand (H2O) udgør 70-80 % af enhver given celle, og det er svært at forestille sig liv uden vand. Vand er et unikt molekyle: det er lille, men har et højt fryse- og kogepunkt, et højt dipolmoment (stor elektrisk ladningsforskel), og danner hydrogenbindinger (se faktabox). De fleste ved, at vand kan forekomme som is, flydende vand og vanddamp. De første to adskiller sig især ved, hvordan det enkelte vandmolekyle kan bevæge sig i forhold til de andre. I en iskrystal er vandmolekylerne ’låst’ fast til hinanden, hvorimod de i flydende vand kan bevæge sig mere frit i forhold til hinanden. I modsætning til andre molekyler af samme størrelse, har vand både et højt smelte- og kogepunkt. Det skyldes primært styrken af hydrogenbindingerne imellem vandmolekylerne Hjerneblod 12
2/2014
(se faktabox). Det er en dyr proces for vand at bryde hydrogenbindinger, og der skal derfor meget energi (høj temperatur) til, før vand begynder at smelte/ fordampe. Vand vil så gerne danne hydrogenbindinger, at hvis man smider et molekyle ned i en mængde vand, der hverken kan danne hydrogenbindinger eller er elektrisk uladede (faktisk kalder man den type molekyler for hydrofobe: vandskyende), vil vandet placere sig omkring molekylet således, at det stadig kan danne flest muligt hydrogenbindinger (se billede 2). Vandet bliver således ”låst” fast, på samme måde som is er. Omvendt kan en elektrisk ladet overflade også strukturere vand, da vandet rigtig gerne vil placere sig således, at f.eks. en positiv ladning er i kontakt med oxygenets (delvist) negative ladning.
faktabox
Elektrisk dipolmoment
er en målestok for separationen af positive og negative ladninger i et system af elektriske ladninger. Vand har et dipolmoment, da oxygenerne er meget elektronegative end hydrogen og derfor trækker mere i elektronerne mere. Oxygenmolekylerne er derfor delvist negative, og hydrogenerne er delvist positive.
faktabox
Hydrogenbinding
er en slags tiltrækkende kraft imellem molekyler (eller dele af molekyler), en binding som dannes imellem et svagt elektropositivt hydrogenatom og et af de elektronegative atomer som ilt, kvælstof eller fluor. Hydrogenbindinger varierer i styrke fra meget svage (1-2 kJ/mol) til ekstremt stærke (150 kJ/mol).
g
in bind or gen
Hyd
Ovenstående er blot en grov skitse af, hvordan vand strukturerer sig, og det er vigtigt at sige, at der findes molekyler, der er meget vandstrukturerende, og nogle der ikke er. Et godt eksempel på ”struktureret” vand, kan man forestille sig ved at tage noget ribsgele. Størstedelen af molekylerne er vand (og stort set) resten er sukker, men man ville normalt ikke kalde geleen våd, på samme måde som en cola (der også er vand og sukker). Det skyldes, at der i gele findes en række af molekyler der er enormt vandstrukturerende ▶
hydrogenbinding
H
H
O
O
H
H
O
H
H
ikke-polært molekyle
H
H
O
O
Denne ’binding’ af vand er typisk ikke noget, der påvirker andre vandmolekyler end dem lige nær overfladen (klassisk vil man sige, at vand strukturerer sig ca. 3 vandmolekyler ud i forhold til en ladet overflade, men i særtilfælde kan de gøre det meget længere).
H
H
(Flydende) vand findes altså også på forskellige - mere eller mindre - bundne former, hvilket hænger sammen med det, man kalder aktivitet. Vand med en høj aktivitet bevæger sig frit, og vand med en lav aktivitet bevæger sig næsten ikke.
H
O
H
Figur 2: Det ses her hvordan vand kan arrangere sig omkring et ikke polært molekyle.
Vand & den levende tilstand 13
Figur 3: Illustrations af hvordan vand strukturer sig ved en elektrisk ladet overflade.
+ +Elektrisk + +ladet ++ + + + overflade Vand og celler Hvordan ser vand i en celle så ud? I en celle er der typisk ca. 2 nm (1 nm = 1 milliardedel meter) mellem overflader (hvilket er ca. 10 vandmolekyler). Vandet er derfor uden tvivl anderledes end vand i en gryde. Det er faktisk noget som alle er klar over, også uden at vide det. Tag f.eks. et hønseæg (der blot er en enkelt celle). Hvis du slår den ud, vil du så kalde det indre for flydende? Måske halvtflydende? Spørgsmålet er nu, om dette har en betydning for vores forestilling om cellen: Placeres en klump ribsgele i et glas vand, vil det ikke umiddelbart opløses og tilsætning af salt til vandet vil ikke/meget langsomt trænge ind i midten af klumpen. Man kunne endog forestille sig, at nogle ting automatisk ville trænge ind i geleen og ophobe sig i koncentreret form, imens andre ville holde sig ude, blot fordi de er forskellige miljøer. Vores oprindelige intuition omkring, at det indre af cellen (cytoplasma) er (næsten) det samme som det ydre, er altså ikke en tilstrækkelig model. Den er for enkel. Det kunne måske endda forklare, hvorfor der er mere af en type Hjerneblod 14
2/2014
salt inde i cellen og mindre udenfor, helt uden at der behov for pumper og kanaler. Det virker altså som en vigtig pointe, at alene de fysiske/kemiske egenskaber ved cellen og vandet, kan stå for/hjælpe med nogle af de mange processer, som ellers alene tilskrives proteiner. Det er ikke en ny tankegang, og forskellige forskere har gennem tiden argumenteret for, at vand med sine mange unikke egenskaber, samt det forhold at det udgør klart størstedelen af cellen, ikke bare skal opfattes som et inaktivt opløsningsmateriale som liv nu engang eksisterer i. Der findes endog forskere, der betragter de enkelte proteiners funktion som at skifte fra vandstrukturerende, til ikke vandstrukturerende, når de skifter form – altså en tanke, hvor proteinernes funktion indirekte er at ændre vandes struktur og ting (f.eks. flytning af salt) så sker som følge deraf. Forskellen på liv og død ville i det billede være overgangen fra struktureret vand til totalt ustruktureret, hvor man ikke kan gå tilbage igen. Jeg vil ikke udtale mig om, hvad der er det rigtige billede her. Sandheden ligger
formentligt et sted i midten, som det ofte viser sig. Det lader dog til at der er nogle uløste og svært forståelige problemer med vores ”gryde”-billede af cellen og omgivelserne. Hvis celler hele tiden mister ioner grundet kanaler, skal cellen konstant pumpe ioner ud igen for at være i ligevægt. Det kræver energi. Natrium pumpen alene er f.eks. estimeret, på basis af oxygenforbrug, til at kræve 45-50 % af alt cellens energi (Whittham, 1961), imens moderne tekstbøger siger, det er mellem 30-35 %. I begge tilfælde en enorm mængde energi at smide efter blot en af cellens mange funktioner. Andre forskere har vist, at hvis man forgifter en celle, så den ikke længere har noget energi til rådighed, vil cellen alligevel
Model A
opretholde koncentrationsforskelle af natrium og kalium (Ling, 1962), på trods af det ville kræve 15-30 gange mere energi end der totalt er til rådighed (hvis vi benytter ”grydebilledet”). Der er altså stadig helt centrale ting, der ikke er forstået, og at vi ofte ignorerer vands egenskaber skyldes, at det er meget nemmere at antage, at cellen og omgivelserne opfører sig som to ender af en gryde, adskilt af en membran. Jeg forsøger at gå lidt den anden vej og se om jeg kan sige noget om vandets tilstand og så ’glemme’ alle de specifikke ting som enkelte pumper/kanaler/proteiner kan gøre. ▶
Model B
Figur 4: Illustration af “grydemodellen”. I begge situationer opretholdes der en koncentrationsgradient af salt (rødekugler) fra den ene side af gryden til den anden side - men på forskellig vis. I model A er årsagen en membran med et pumpe-protein. Bemærk at vandet på begge sider af membranen opfattes som værende stort set ens. I model B er der ingen membran med pumpe. Her opretholdes salt koncentrationensforskellen alene af de fysiske/kemiske egenskaber ved at vandet i den ene ende af gryden (svarende til det indre af cellen, vandmand) er mere ordnet a la en gelé i forhold til den anden ende (svarendee til det ydre miljø af cellen, blå).
Vand & den levende tilstand 15
Fluorescerende prober & vandaktivitet I levende celler er det dog utroligt svært at sige noget om vandets tilstand, og især at måle på det! I min forskning tager jeg udgangspunkt i polaritetssensitive fluorescerende molekyler (se faktabox), der bl.a. kan ’måle’ vands aktivitet. Det gør de ved at lyse blåt, når vandet har lav aktivitet (eller der er meget lidt vand tilstede), og grønt, når vandet har høj aktivitet (se billede 3). Problemet er, at disse molekyler er følsomme over for en lang række forhold. Mit job er ved simple systemer (det kunne f.eks. være mere og mere tyktflydende væsker, man kunne lave ved at tilsætte mere og mere sukker eller protein – eller hæve/sænke temperaturen), at undersøge disse molekylers respons. Et såkaldt spektrofluorimeter kan så fortælle mig præcist, hvilket lys proberne udsender under givne betingelser, hvilket så forhåbentlig i sidste ende kan fortælle mig noget om vandets struktur. I min dagligdag bruger jeg således meget tid på at måle, veje, omrøre og ikke mindst tænke. Trods en del af arbejdet i laboratoriet kan virke kedeligt udefra, føles det ikke sådan. Dels er det en fed følelse, at man hele tiden bliver bedre – der er ingen tvivl om, at laboratoriearbejde er et håndværk – men mindst lige så fedt er det selv at kunne planlægge sine forsøg, og se om de virker. At få lov til helt frit at stille spørgsmål og så få tid til at lede efter svar! Hjerneblod 16
2/2014
Det tager noget tid og hårdt arbejde at komme igennem universitetet, og man skal være indstillet på, at der selv bag simple systemer gemmer sig ligninger, teoretisk fysik, kemi, matematik og biologi. Belønningen er så forståelse af verden og et job, hvor man sagtens kan bruge en hel dag på at sidde og diskutere, og chancen for at være med helt fremme. Der er et stykke vej fra mine simple systemer til en kompliceret celle, men det er vigtigt at forstå, hvad man gør for at kunne tolke på resultater i mere komplicerede systemer, som f.eks. celler. Alligevel startede vi for nyligt et samarbejde med en anden forsker fra universitetet. Han har fundet ud af, at hvis man tager gærceller, og derefter forgifter dem på en speciel måde, der ødelægger deres metabolisme, resulterer det i, at gæren begynder skiftevis at producere og ødelægge nogle af de molekyler, de bruger i deres metabolisme – de oscillerer. Straks tænkte vi, at nogle af de molekyler måske kunne strukturere vand (og få proberne til at lyse blåt), og når de blev nedbrudt, ville vandet bliver mere ustruktureret (og proberne ville så lyse grønt). Vi havde altså her en helt unik chance for at undersøge, om cellevand altid er ens, så vi tilsatte proberne til gærcellerne og forgiftede dem. Og vil I tro det – mine prober skifter lige så fint fra blå til grøn og tilbage igen, samtidig med at molekylerne blev dannet og nedbrudt! Hvad det så betyder må fremtiden vise… ■
BLÅ
GRØN
Figur 5: De fluorescende prober skifter fra grøn ved høj vandaktivitet /rent vand, til blå ved lav vandaktivitet. Vandaktiviteten ændres her ved brug af et molekyle kaldet PEG (polyethylenglycol), hvor højere koncentration af PEG, resulterer i at vandet bliver meget tyktflydende.
faktabox
Fluorescerende molekyler er en bestemt type af de molekyler, man kan lyse på, hvorefter de udsender lys med en anden farve. Jeg lyser f.eks. med ultraviolet lys (meget lav bølgelængde) og får lys igen der er et sted mellem blåt og grønt. Polaritetssentisitve molekyler kan måle på, om dipolmomentet i det omgivende opløsningsmiddel bevæger sig.
Vand & den levende tilstand 17
Tre prøver med det fluorescerende stof Acdan opløst i vand (venstre), ethanol (midten) og dichlormethan (højre). Prøverne står på en UVlampe, der endnu ikke er tændt.
Hjerneblod 18
2/2014
UV-lampen er tÌndt, og det kan observeres, hvordan Acdan giver forskelligt respons i de tre forskellig opsløsningsmidler.
Vand & den levende tilstand 19
GĂŚrceller med Acdan
Hjerneblod 20
2/2014
HENRIK SEIR THOKE, 25 ĂĽr, LĂŚser nanobioscience og er ved at skrive speciale. hetho08@student.sdu.dk
Vand & den levende tilstand 21