Tai lieu SGART 2018 (final 1)

Mọi sao chép, trích dẫn phải được sự đồng ý của HOSREM hoặc tác giả.

HOSREM 2018

MỤC LỤC Báo cáo hội trường Lí lịch khoa học báo cáo viên hội trường .................................................................. 1 1.

Tổng quan về PGS / PGD ......................................................................................... 9 Huỳnh Gia Bảo

2.

Kết quả sàng lọc di truyền phôi tiền làm tổ và giải pháp chẩn đoán thể khảm, bất thường cầu trúc, vi mất đoạn trên phôi ngày năm bằng kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới tại Việt Nam ................................................ 23 Nguyễn Vạn Thông

3.

Ứng dụng PGD tại IVFMD: hiện trạng và xu hướng trong lĩnh vực thụ tinh ống nghiệm ...................................................................... 39 Lưu Thị Minh Tâm, Phạm Thiếu Quân, Huỳnh Gia Bảo

4.

Sinh thiết phôi ngày 4: mô hình tương lai .............................................................. 45 Nguyễn Nữ Hải Long, Mai Kim Châu, Lâm Sơn Bích Trâm, Vũ Đình Tuân

5.

Qui trình sinh thiết phôi ngày 5 và một số vấn đề lưu ý .......................................... 55 Võ Nguyên Thức

6.

Báo cáo trường hợp: bệnh nhân có chỉ định thực hiện xét nghiệm di truyền tiền làm tổ............................................................................................ 63 Nguyễn Ngọc Quỳnh, Mã Phạm Quế Mai

Lí lịch khoa học báo cáo viên hội trường

1

HUỲNH GIA BẢO bao.hg@myduchospital.vn

CHỨC VỤ - ĐƠN VỊ CÔNG TÁC Trưởng labo Phôi học, IVFMD, Bệnh viện Mỹ Đức

QUÁ TRÌNH ĐÀO TẠO VÀ BẰNG CẤP 2012

Thạc sĩ Di truyền học, Đại học Khoa học tự nhiên TPHCM

2011

Cử nhân tại chức Ngữ văn Anh, Đại học Khoa học xã hội và Nhân văn TPHCM

2006

Cử nhân Công nghệ sinh học, Đại học Khoa học tự nhiên TPHCM

CÁC HOẠT ĐỘNG CHUYÊN MÔN KHÁC  Cộng tác viên - Giảng viên hợp tác, Hội Nội tiết sinh sản và Vô sinh TPHCM (HOSREM)  Chuyên viên tư vấn thiết kế trung tâm thụ tinh trong ống nghiệm, Công ty TNHH Tư vấn Trợ sinh (A.R.T. Consulting, Ltd.)

BÀI ĐĂNG TẠP CHÍ, SÁCH VÀ BÁO CÁO KHOA HỌC 1. Tác giả và đồng tác giả các bài báo trên Fertility & Sterility (2015), Reproductive BioMedicine Online (2016), Human Reproduction Open (2017), NEJM (2018).

2. Tác giả và đồng tác giả các báo cáo nghiên cứu tại hội nghị quốc tế: ASPIRE ở Thái Lan (2010), ASPIRE ở Nhật Bản (2012), ASPIRE ở Úc (2014), ASPIRE ở Indonesia (2016), ASPIRE ở Malaysia (2017), ASPIRE ở Taiwan (2018), Hội nghị Công nghệ sinh học khu vực Châu Á (ARBS) lần 10 (2013) và lần 11 (2015), COGI (2014).

3. Báo cáo viên tại các hội nghị quốc tế: PRSFS ở Hồng Kông (2011), ASPIRE ở Úc (2014), ASPIRE ở Indonesia (2016).

4. Tác giả và đồng tác giả bài báo trên Tạp chí Công nghệ sinh học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam (2005), Thời sự Y học (2011), Tạp chí Phụ Sản (2012, 2013, 2014, 2015, 2016, 2017), Y học sinh sản (2012, 2013, 2014).

5. Tác giả và đồng tác giả các bài báo cáo oral và poster tại các hội nghị chuyên ngành hỗ trợ sinh sản trong nước. Giải ba “Giải thưởng Thành tựu và Triển vọng 2013”, Giải nhất “Giải thưởng Thành tựu 2014”, Giải nhất “Giải thưởng Thành tựu 2016”, Giải ba “Giải thưởng Thành tựu 2017”.

6. Đồng tác giả các sách: “Thụ tinh trong ống nghiệm” (2011), “Cẩm nang xét nghiệm chẩn đoán và xử lí tinh dịch người (WHO 2010)” (2011).

7. Báo cáo viên các hội nghị do HOSREM tổ chức: Giới thiệu Cẩm nang WHO 2010 (2010), Hội nghị Kĩ thuật Hỗ trợ sinh sản: Thành tựu và triển vọng (2011), Hội nghị Nam học và Vô sinh nam lần I-II (2012, 2013), IVF Experts Meeting 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 (2011, 2012, 2013, 2014, 2015, 2016, 2017); Hội thảo thực hành SGART lần IV, V, VI, VII, VIII, IX, X, XI (2011, 2012, 2013, 2014, 2015, 2016, 2017, 2018).

NGUYỄN VẠN THÔNG bsngvanthong@gmail.com

CHỨC VỤ - ĐƠN VỊ CÔNG TÁC  Phó khoa Giải phẫu bệnh - Tế bào - Di truyền, Bệnh viện Hùng Vương  Phụ trách đơn vị Chẩn đoán trước sinh và Di truyền, Bệnh viện Hùng Vương QUÁ TRÌNH ĐÀO TẠO VÀ BẰNG CẤP 2015

Bác sĩ Chuyên khoa cấp I, chuyên ngành Sản Phụ khoa

2006

Học Di truyền, Viện trường Lìege, Bỉ

2004

Học định hướng Giải phẫu bệnh

2002

Bác sĩ đa khoa, Đại học Y Dược TPHCM

BÀI ĐĂNG TẠP CHÍ, SÁCH VÀ BÁO CÁO KHOA HỌC 1. Huỳnh Thị Kim Phương, Huỳnh Kiều Thanh, Võ Trí Nam, Nguyễn Lê Tuấn Anh, Nguyễn Đức Hoàng, Phan Thị Phượng Trang, Nguyễn Vạn Thông, Phạm Hà Giang (2015). Xây dựng quy trình phát hiện đột biến vi mất đoạn NST giới tính Y trên bệnh nhân nam chẩn đoán mắc bệnh Azoospermia bằng kỹ thuật multiplex PCR. Tạp chí phát triển khoa học và công nghệ; tập 18, số T5-2015.

2. Nguyễn Vạn Thông, Phạm Hùng Vân, Kenji Abe (2015). Pathogenesis of Congenital Rubella Virus Infection in Human Fetuses: Viral Infection in the Ciliary Body Could Play an Important Role in Cataractogenesis. EbioMedicine; 59-63.

3. Phạm Hùng Vân, Nguyễn Vạn Thông, Nguyễn Thị Thanh Trúc, Đặng Duy Linh, Hoàng Hiếu Ngọc, Nguyễn Văn Trương, Kenji Abe (2013). Rubella epidemic in Vietnam: Characteristic of rubella virus genes from pregnant women and their fetuses / newborns with congenital rubella syndrome. J Clin Virol; 57(2):152-156.

4. Lê Quang Tín, Nguyễn Vạn Thông, Phạm Thị Vân Anh, Nguyễn Văn Trương (2012). Xây dựng qui trình kĩ thuật FastFISH trên tế bào nước ối nhằm chẩn đoán nhanh trong 4 giờ các bất thường lệch bội các nhiễm sắc thể 13, 18, 21, X, Y. Tạp chí Sức khỏe sinh sản, kì 2, số 3,2834.

5. Nguyễn Vạn Thông, Lê Thị Khánh Linh, Francois Devillard (2011). Nhân 1 trường hợp trisomy bán phần NST số 9 chẩn đoán bằng kĩ thuật FISH PAINTING và FISH TELOMERE. Tạp chí Phụ Sản; tập 9, số 3,123-126.

6. Nguyễn Vạn Thông (2011). Tổng quan: liệu karyotype có còn “chỗ đứng” trong chẩn đoán tiền sản hiện nay? Tạp chí Phụ Sản; tập 9, số 3-2011,24-29.

7. Nguyễn Vạn Thông, Khổng Hiệp, Hoàng Hiếu Ngọc, Phạm Hùng Vân (2011). Ứng dụng và kinh nghiệm sử dụng kĩ thuật chẩn đoán nhanh (FISH, MLPA và QF-PCR) các bất thường lệch bội nhiễm sắc thể thường gặp trong chẩn đoán trước sinh. Y học TPHCM; tập 15, số 2-2011,39-44.

8. Đặng Lê Dung Hạnh, Nguyễn Vạn Thông (2006). Đánh giá hiệu quả chương trình tầm soát hội chứng Down tại Bệnh viện Hùng Vương. Hội nghị Sản Phụ khoa Việt Nam. 9. Trần Thị Vân Anh, Nguyễn Vạn Thông (2005). Đặc điểm tế bào - giải phẫu bệnh của ung thư cổ tử cung. Y học TPHCM; tập 9, phụ bản số1,176-178.

Lí lịch khoa học báo cáo viên hội trường

3

10. Trần Sơn Thạch, Tạ Thị Thanh Thủy, Nguyễn Vạn Thông (2005). Mũi may B-Lynch cải tiến điều trị băng huyết sau sanh nặng do đờ tử cung. Hội nghị Việt - Pháp - Châu Á-Thái Bình Dương lần V.

LƯU THỊ MINH TÂM tam.ltm@myduchospital.vn

CHỨC VỤ - ĐƠN VỊ CÔNG TÁC Chuyên viên Phôi học, Đơn vị hỗ trợ sinh sản IVFMD, Bệnh viện Mỹ Đức

QUÁ TRÌNH ĐÀO TẠO VÀ BẰNG CẤP CHUYÊN MÔN 2014

Cử nhân Công nghệ sinh học chuyên ngành Y Dược, Đại học Khoa học tự nhiên TPHCM

BÀI ĐĂNG TẠP CHÍ, SÁCH VÀ BÁO CÁO KHOA HỌC Bài đăng Tạp chí Phụ Sản (2015) và báo cáo poster các hội nghị trong nước.

Lí lịch khoa học báo cáo viên hội trường

NGUYỄN NỮ HẢI LONG nguyennuhailong1985@gmail.com

CHỨC VỤ - ĐƠN VỊ CÔNG TÁC Chuyên viên Phôi học, Khoa Hiếm muộn, Bệnh viện Hùng Vương

QUÁ TRÌNH ĐÀO TẠO VÀ BẰNG CẤP 2008

Cử nhân Sinh học, Đại học Khoa học tự nhiên TPHCM

CÁC HOẠT ĐỘNG CHUYÊN MÔN KHÁC Hội viên, Hội Nội tiết sinh sản và Vô sinh TPHCM (HOSREM)

BÀI ĐĂNG TẠP CHÍ, SÁCH VÀ BÁO CÁO KHOA HỌC Đồng tác giả 3 bài báo cáo poster và 1 bài báo cáo hội trường.

5

VÕ NGUYÊN THỨC thuc.vn@myduchospital.vn

CHỨC VỤ - ĐƠN VỊ CÔNG TÁC Chuyên viên phôi học, IVFMD, Bệnh viện Mỹ Đức Phú Nhuận

QUÁ TRÌNH ĐÀO TẠO VÀ BẰNG CẤP 2011

BSc (Hons) in Biomedical Sciences, University of Bradford

Lí lịch khoa học báo cáo viên hội trường

7

NGUYỄN NGỌC QUỲNH quynh.nn@myduchospital.vn

CHỨC VỤ - ĐƠN VỊ CÔNG TÁC Đơn vị hỗ trợ sinh sản IVFMD, Bệnh viện Mỹ Đức

QUÁ TRÌNH ĐÀO TẠO VÀ BẰNG CẤP 2018

Thạc sĩ Sinh học - Valencia

2005

Cử nhân Sinh học chuyên ngành Vi sinh, Đại học Khoa học tự nhiên TPHCM

CÁC HOẠT ĐỘNG CHUYÊN MÔN KHÁC 

Tham gia huấn luyện đào tạo các lớp ngắn hạn, dài hạn tại IVF Vạn Hạnh, IVF Mỹ Đức. Phối hợp cùng Hội Nội tiết sinh sản và Vộ sinh TPHCM (HOSREM) tham gia hướng dẫn thực hành các khóa tinh dịch đồ, IUI, hỗ trợ thoát màng, kỹ thuật vi thao tác, trữ lạnh…

 

Thành viên của SGART, HOSREM Nghiên cứu viên hợp tác, Trung tâm Nghiên cứu Di truyền và Sức khỏe sinh sản, Khoa Y, Đại học Quốc gia TPHCM

BÀI ĐĂNG TẠP CHÍ, SÁCH VÀ BÁO CÁO KHOA HỌC 1. Báo cáo poster, báo cáo hội trường tại các hội nghị chuyên ngành trong và ngoài nước.

2. (Đồng tác giả) Thụ tinh trong ống nghiệm. NXB Giáo Dục (2011).

MÃ PHẠM QUẾ MAI maphamquemai86@gmail.com

CHỨC VỤ - ĐƠN VỊ CÔNG TÁC Phó Trưởng khoa Xét nghiệm, Bệnh viện Tân Sơn Nhất

QUÁ TRÌNH ĐÀO TẠO VÀ BẰNG CẤP 2011

Thạc sĩ chuyên ngành Di truyền - Tế bào - Phát triển và Tiến hóa, Đại học Paris Sud XI - Orsay, Pháp

2008

Kỹ sư Công nghệ sinh học, Đại học Nông Lâm TPHCM

BÀI ĐĂNG TẠP CHÍ, SÁCH VÀ BÁO CÁO KHOA HỌC 1. Đồng tác giả 3 bài trên các tạp chí khoa học quốc tế.

2. Tác giả và đồng tác giả 5 báo cáo khoa học đăng tải trên các tạp chí y học ở Việt Nam. 3. Tác giả và đồng tác giả 2 quyển sách về y học ở Việt Nam, chuyên ngành di truyền trong hỗ trợ sinh sản.

4. Báo cáo viên tại các hội nghị chuyên ngành y học sinh sản ở Việt Nam từ năm 2012.

5. Các báo cáo oral, poster tại các hội nghị quốc tế như ARSM, ASPIRE.

Tổng quan về PGS / PGD

9

TỔNG QUAN VỀ PGS / PGD Huỳnh Gia Bảo IVFMD, Bệnh viện Mỹ Đức

GIỚI THIỆU Kỹ thuật xét nghiệm tiền làm tổ (PGT) được ứng dụng để phát hiện các bất thường di truyền trong những phôi được tạo ra từ IVF trước khi được chuyển cho bệnh nhân. Kỹ thuật xét nghiệm bắt đầu với việc thực hiện IVF để tạo phôi, sau đó sinh thiết phôi và phân tích nhiễm sắc thể (NST) hoặc / và DNA bằng nhiều kỹ thuật sinh học phân tử khác nhau. Kỹ thuật xét nghiệm này được chia ra làm 2 ứng dụng gồm: (i) kỹ thuật xét nghiệm “sàng lọc” di truyền tiền làm tổ (PGS) nghiêng về hướng sàng lọc thể dị bội cho phôi mà cha mẹ là bình thường về NST và (ii) kỹ thuật xét nghiệm “chẩn đoán” di truyền tiền làm tổ (PGD) được dành cho nhóm đối tượng đặc biệt khi có một trong hai hoặc cả hai bố mẹ mang bất thường về số lượng hoặc / và cấu trúc NST hoặc mang đột biến đơn gen di truyền cụ thể đã được biết đến có nguy cơ truyền bất thường / đột biến này cho con của họ.

PGS Thành công trong các qui trình hỗ trợ sinh sản phụ thuộc vào sự lựa chọn phôi chuyển. Trong những thập niên trước, việc chọn lọc phôi, chuyển vào tử cung chủ yếu dựa vào tiêu chuẩn hình thái (các đặc tính biểu hiện và tốc độ phát triển của phôi) (Stein, 2011; Grada và Weinbrecht, 2013). Tuy vậy, có nhiều trường hợp sẩy thai dù những phôi chọn lọc có tiêu chuẩn hình thái tốt.

Nhiều nghiên cứu cho thấy khoảng 50% phôi từ IVF có bất thường lệch bội NST (aneuploidy) chính là nguyên nhân dẫn đến thất bại làm tổ và sẩy thai sớm trong IVF. Hầu hết các thể lệch bội do các sai hỏng trong quá trình giảm phân NST là một trong những nguyên nhân chính được ghi nhận gây thất bại làm tổ, sẩy thai sớm, thai chết khi sinh, thậm chí không được lưu ý, làm ảnh hưởng đến kết cục tỉ lệ trẻ sinh sống trong hỗ trợ sinh sản. Thể dị bội là phổ biến và có thể được xem là bình thường ở giai đoạn phôi sớm vì bản thân mỗi tế bào đều có cơ chế sửa sai của nó; trong những lần phân cắt đầu tiên của phôi, tùy mức độ và loại dị bội sẽ ảnh hưởng đến sự phát triển về sau (Amy Lee và cs., 2016). Hơn 35% sẩy thai tự nhiên và khoảng 4% thai chết khi sinh là do các sai hỏng về số lượng NST; chỉ còn khoảng 0,3% là trẻ sinh sống (Hassold và cs., 2001). Ngoài ra, thể lệch bội có nguồn gốc từ mẹ và xu hướng tăng khi người mẹ càng lớn tuổi. Tuy nhiên, ngay cả ở những bệnh nhân trẻ tuổi hơn thì tỉ lệ thể lệch bội vẫn có thể ảnh hưởng đáng kể đến sự thành

công của chu kỳ IVF. Điều này có thể ảnh hưởng đến thời gian, kinh tế, tinh thần và cảm xúc của bệnh nhân. Phụ nữ < 35 hay  35 tuổi sẩy thai chủ yếu vẫn là do phôi bị bất thường NST và cho dù sẩy thai sau có thai tự nhiên hay sau thụ tinh trong ống nghiệm (TTTON) thì nguyên nhân sẩy thai chủ yếu vẫn là do bất thường NST. Phụ nữ  35 tuổi sẩy thai có tỉ lệ bất thường NST cao hơn phụ nữ < 35 tuổi, do càng lớn tuổi thì tỉ lệ noãn bất thường càng tăng (Broekmans và cs., 2009).

Sẩy thai sau TTTON có tỉ lệ bất thường NST thấp hơn, có thể do việc chọn lựa phôi để cấy vào tử cung đã giúp loại bớt phôi bất thường. Ở những trường hợp sẩy thai liên tiếp, tần suất xuất hiện bất thường NST khoảng 5% với hai hoặc nhiều hơn hai lần sẩy thai; 1-2% với ba hoặc nhiều hơn ba lần sẩy thai (Bashiri và cs., 2012). Gần 30% phôi của phụ nữ trên 40 tuổi mang thể lệch bội, tăng lên gần 50% ở tuổi trên 43 và gần như 100% sau 45 tuổi (Fritz và cs., 2011). Hiện tượng thất bại làm tổ nhiều lần (repeated implantation failure – RIF) được định nghĩa khi phôi chuyển không có khả năng làm tổ sau một vài chu kỳ điều trị với số phôi tốt được chuyển một cách hợp lý. Tuy nhiên, không có tiêu chí chính thức xác định số lượng chu kỳ thất bại hoặc tổng số phôi chuyển.

Theo đó, các trung tâm khác nhau có thể sử dụng các định nghĩa khác nhau cho RIF. Theo một số tác giả, RIF được định nghĩa khi không có thai sau 2-6 chu kỳ TTTON; trong đó, có hơn 10 phôi tốt được chuyển. Ngày nay, với tỉ lệ thành công của các chu kỳ hiện tại và xu hướng chuyển 1-2 phôi, các tác giả đề nghị rằng nên xác định RIF sau khi thất bại 3 chu kỳ liên tiếp, trong đó, có từ một đến hai phôi tốt được chuyển trên mỗi chu kỳ. RIF là một hiện tượng phức tạp, có thể do những nguyên nhân đơn lẻ hay phối hợp. Ở những phụ nữ thất bại làm tổ nhiều lần do vô sinh thứ phát và sẩy thai liên tiếp, tỉ lệ bất thường NST lên đến 9,1%; trong khi nhóm phụ nữ được ghi nhận chỉ là vô sinh kèm thất bại làm tổ nhiều lần thì tỉ lệ này là 6,1% (De Sutter và cs., 2012).

Với kỹ thuật PGS, việc sàng lọc để loại bỏ phôi mang thể lệch bội là rất cần thiết cho các nhóm đối tượng bênh nhân trên, nhằm tầm soát để đảm bảo chỉ có phôi nguyên bội được chuyển vào lại tử cung trong điều trị IVF. Kỹ thuật PGS “không” tạo ra phôi khỏe mạnh và tăng chất lượng phôi. Tuy nhiên, phương pháp này giúp xác định chính xác phôi có bộ NST bình thường để chuyển vào buồng tử cung, giảm thời gian điều trị, giảm rủi ro sẩy thai (Fiorentino và Bono, 2014). Bên cạnh đó, việc sàng lọc di truyền tiền làm tổ trong IVF còn góp phần không nhỏ vào việc nâng cao tỉ lệ làm tổ của phôi.

PGD Kỹ thuật PGD đã được phát triển từ những năm 1980s nhằm giúp phát hiện các bất thường di truyền ở phôi từ những cặp vợ chồng có nguy cơ truyền các bệnh lý di truyền cho con, giúp họ có cơ hội sinh con bình thường mà không phải chấm dứt thai kỳ khi phát hiện các bệnh lý thông qua chẩn đoán tiền sản cổ điển. Trải qua hơn 30 năm nghiên cứu và ứng dụng, PGD đã trở thành một kỹ thuật quan trọng trong lĩnh vực hỗ trợ sinh sản trên toàn thế giới, giúp phòng ngừa các bệnh di truyền Mendel hay chuyển đoạn NST không cân bằng. Cùng với những tiến bộ trong kỹ thuật sinh thiết phôi, đông lạnh phôi và chẩn đoán sinh học phân tử thì việc ứng dụng PGD trong IVF càng dễ dàng hơn. Trong các báo cáo hằng năm về PGD toàn Châu Âu, số liệu tổng hợp từ báo cáo gần nhất của Hiệp hội Sinh sản Châu Âu (ESHRE), cho thấy đã có hơn mười nghìn trẻ ra đời từ 15 lần thu thập dữ liệu (De Rycke và cs., 2017). Tại khu vực Đông Nam Á, PGD đã được thực hiện hầu

Tổng quan về PGS / PGD

11

hết các nước, trong đó có cả Việt Nam. Vào năm 2009-2010, nhóm chuyên gia từ Đại học Y Dược TPHCM, Hội Nội tiết sinh sản và Vô sinh TPHCM và Trung tâm IVF Vạn Hạnh đã xây dựng thành công qui trình thực hiện PGD để chẩn đoán bất thường số lượng NST trên phôi người. Mục tiêu của đề tài nhằm xây dựng qui trình PGD trên phôi người ở Việt Nam và bước đầu đánh giá tỉ lệ lệch bội ở một số NST trên các phôi người bất thường. Đây là đề tài nghiên cứu cấp thành phố do Sở Khoa học Công nghệ TPHCM quản lý. Tháng 05/2009, các trường hợp thực hiện thành công kỹ thuật PGD đầu tiên ở Việt nam đã được các tác giả trên báo cáo (Hồ Mạnh Tường và cs., 2009). Hiện nay, lĩnh vực IVF kết hợp với kỹ thuật PGD đang có những bước tiến vượt trội và vững chắc giúp chẩn đoán và tầm soát các bệnh di truyền ở người. Lĩnh vực hỗ trợ sinh sản tại Việt Nam không chỉ đơn thuần là điều trị vô sinh mà đã tiến xa hơn, ghi nhận được nhiều thành tựu trong kỹ thuật PGD này.

Nhiều trường hợp được chỉ định PGD tại Việt Nam thay vì phải ra nước ngoài điều trị với chi phí rất cao như trước đây thì nay đã được chỉ định thực hiện tại một số trung tâm lớn trong nước với kết quả chính xác, nhanh chóng và tiết kiệm chi phí đáng kể cho các cặp vợ chồng.

Mục tiêu của bài là đưa ra cái nhìn tổng quan về các bệnh lý di truyền và tình hình ứng dụng kỹ thuật PGD trong việc chẩn đoán và tầm soát các bệnh lý này. Hiện nay, PGD trong IVF không chỉ giới hạn ở việc loại trừ các bệnh lý di truyền này, mà còn được mở rộng để loại trừ các bệnh lý di truyền khởi phát muộn do các yếu tố di truyền tiềm ẩn trên một số gen nhất định, gọi là kỹ thuật ECS (expanded carrier screening). Những gen này tuy không chắc chắn gây bệnh nhưng người mang các gen này có thể có nguy cơ cao bị một bệnh lý nhất định, ví dụ như tầm soát gen gây bệnh ung thứ vú BRCA1.

TỔNG QUAN Với sự thay đổi và phát triển nhanh chóng của kỹ thuật PGS / PGD, đặc biệt là các công nghệ kỹ thuật liên quan đến việc sử dụng nó và tăng khả năng tiếp cận của bệnh nhân, đòi hỏi phải xem xét lại và sửa đổi một số nguyên tắc ban đầu của các tiêu chí được quan tâm trong kỹ thuật PGS / PGD, bao gồm: 1. Kỹ thuật và nhân sự thực hiện.

2. Tiêu chuẩn nhận - loại bệnh nhân cho từng kỹ thuật.

3. Tư vấn di truyền và cung cấp thông tin cho bệnh nhân.

4. Những yêu cầu cơ bản của một trung tâm TTTON. 5. Sự vận chuyển vật liệu sinh học.

6. QC, QA và kiểm định.

Kỹ thuật và nhân sự thực hiện Sinh thiết và xét nghiệm tiền làm tổ ở giai đoạn phôi nang được xem là kỹ thuật mang lại kết quả di truyền chính xác nhất hiện nay với ưu điểm là nhiều tế bào được sinh thiết và chẩn đoán. Đồng thời, khi áp dụng phương pháp này, do khối phôi bào vẫn được bảo tồn nên sự phát triển tiếp theo của phôi không bị ảnh hưởng. Đối với sinh thiết phôi nang, khoảng 2-10 tế bào từ lá nuôi phôi (trophectoderm) được hút ra ngoài qua cửa sổ màng zona, sau đó liên kết giữa khối tế bào bên ngoài và bên trong sẽ được cắt bằng phương pháp cơ học hay bằng tia laser. Tuy nhiên, chuyển phôi tươi không thể thực hiện trong sinh thiết phôi nang nên sau khi sinh thiết, phôi nang phải được trữ lạnh để chờ chu kỳ chuyển phôi tiếp theo. Các nhà khoa học hiện đã và đang phát triển nhiều công nghệ trong kỹ thuật PGS để phục vụ cho sự chọn lựa phôi chuyển, để tăng sự thành công trong IVF. Tất cả 24 NST (22 NST thường cộng với 2 NST giới tính X và Y) có thể được sàng lọc trong vòng 24 giờ, bắt đầu chỉ từ các tế bào đơn lẻ nhằm đảm bảo chỉ có phôi nguyên bội được chuyển cho bệnh nhân. Điều này phù hợp cho khoảng thời gian của một chu kỳ IVF với chuyển phôi trữ và cả phôi tươi.

Các công nghệ hiện đại như: aCGH, SNP array, Karyolite BoBs và NGS đã tạo nên bước tiến trong việc phân tích bộ NST phôi dù đến nay các công nghệ mới này vẫn còn đang được đánh giá hiệu quả phân tích dựa trên các kết cục lâm sàng. Hiện nay, kỹ thuật PGS / PGD ứng dụng công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới NGS (next generation sequencing) được áp dụng để cải thiện tỉ lệ thành công trong các chu kỳ điều trị TTTON trên các nhóm bệnh nhân lớn tuổi, sẩy thai liên tiếp, thất bại làm tổ và đã từng có thai hoặc có con bị lệch bội số lượng NST. Nó kế thừa những ưu điểm của kỹ thuật array CGH với độ chính độ chính xác cao 99,9% (hệ thống Ion Torrent) do các vùng gen được giải trình tự hàng nghìn lần. Ứng dụng kỹ thuật NGS giúp giải quyết tốt vấn đề chẩn đoán di truyền phôi tiền làm tổ, sàng lọc chính xác những phôi có bất thường NST và gia tăng khả năng có thai cho những bệnh nhân đã trải qua các qui trình hỗ trợ sinh sản.

Song song đó, nhân sự thực hiện kỹ thuật PGS / PGD là rất quan trọng và cần được đảm bảo các yếu tố cần thiết như sau: 

Cần có sự công nhận bởi quốc gia về việc thực hiện kỹ thuật PGS / PGD hoặc tuân thủ theo các hướng dẫn thực hành chuẩn trên thế giới.



Có một trình độ phù hợp, được đào tạo để thực hiện sinh thiết và chuẩn bị blastomere.



Được huấn luyện đầy đủ qui trình lấy mẫu phôi và đặt tế bào vào ống PCR.



Cần có sự nhận thức liên tục về nguyên nhân có thể có của chẩn đoán sai và biện pháp phòng ngừa.



Cần có một mối quan hệ làm việc chặt chẽ với phòng xét nghiệm di truyền  nơi có sẵn chuyên gia tư vấn di truyền thích hợp (chuyên biệt cho tư vấn vô sinh) và các chuyên viên đã quen

Tổng quan về PGS / PGD

13

với kỹ thuật xét nghiêm này, đồng thời nắm rõ tiềm năng và hạn chế của kỹ thuật xét nghiệm di truyền tiền làm tổ. 

Có khả năng tư vấn đầy đủ về kỹ thuật PGS / PGD và xem xét kết quả trước khi thảo luận về kết quả với bệnh nhân.

Tiêu chuẩn nhận - loại bệnh nhân cho từng kỹ thuật Những trường hợp nên thực hiện kỹ thuật PGS như: 

Phụ nữ lớn tuổi ( 35 tuổi).



Cặp vợ chồng có tiền sử sẩy thai liên tiếp  2 lần, do từng đặc thù lâm sàng.



Cặp vợ chồng thất bại làm tổ nhiều lần với  3 lần chuyển phôi chất lượng tốt hoặc tổng số phôi đã chuyển  10 phôi, do từng đặc thù trung tâm.



Các cặp vợ chồng đã từng có thai hoặc có con bị lệch bội số lượng NST.

Những trường hợp nên thực hiện kỹ thuật PGD như: 

Các bất thường liên quan NST thường (số lượng hoặc cấu trúc): 

Bất thường số lượng: hội chứng Down, Edwards, Patau, trisomy X, Klinefelter, XYY, Turner…



Bất thường cấu trúc: hội chứng Angelman, Cri-du-chat, DiGeorge, Langer-Giedion, MillerDieker, Prader-Willi, Smith-Magenis, Williams-Beuren, Wolf-Hirschhorn…



Các bất thường cấu trúc khác như: mất đoạn (del), nhân đoạn (dup), chèn đoạn (ins), chuyển đoạn (t) không cân bằng…



Các đột biến di truyền đơn gen (thể trội hoặc lặn) phổ biến đã biết (Carrier Screening).



Bất thường liên kết NST giới tính (X-linked).



Hội chứng lặp lại các bộ ba nucleotide (base), mất hoặc thêm các base trên gen.



Ngoài ra, hiện nay, PGD còn mở rộng chỉ định là tìm tương hợp HLA, tạo một nguồn cung cấp tế bào gốc dây rốn hoặc từ tủy xương để chữa bệnh cho anh / chị / em ruột bị ảnh hưởng bệnh di truyền gen lặn như thalassemia β hoặc ung thư bạch cầu ác tính.

Tư vấn di truyền và cung cấp thông tin cho bệnh nhân Để có phôi sinh thiết cho PGS / PGD, bệnh nhân phải được tư vấn trước về điều trị bằng phương pháp TTTON và được tư vấn về những nguy cơ liên quan đến điều trị IVF. Sau khi noãn thụ tinh với tinh trùng, phôi được sinh thiết ở các giai đoạn khác nhau tùy trung tâm / quốc gia và sau đó, mẫu tế bào sẽ được phân tích, đánh giá di truyền học bằng các kỹ thuật hiện có. Sau khi có kết quả, phôi bình thường sẽ được chuyển vào tử cung người mẹ.

Một điều cần lưu ý trong các qui trình kỹ thuật dùng xét nghiệm di truyền tiền làm tổ phôi đều mang tính chất nghiên cứu (research use only – RUO), không phải là xét nghiệm chẩn đoán nên kết quả vẫn có khả năng âm tính giả và dương tính giả. Vì vậy, việc tư vấn trước chỉ định PGS / PGD cũng như sau khi có kết quả phân tích di truyền cần được chú trọng để giúp bệnh nhân có sự hiểu biết rõ ràng. Mặc dù đã thực hiện xét nghiệm tiền làm tổ chọn phôi không mang gen bệnh nhưng bên cạnh đó, chẩn đoán tiền sản là cần thiết để hạn chế khuyết điểm của PGS / PGD là thể khảm. Các chiến lược điều trị thay thế, như sử dụng các giao tử hiến tặng cũng phải được thảo luận.

Ngoài ra, trước khi yêu cầu thực hiện hoặc được chỉ định kỹ thuật PGD, các cặp vợ chồng nằm trong nhóm đối tượng đã mắc phải hoặc có nguy cơ cao mắc các bệnh lý di truyền trên nên tham khảo ý kiến của bác sĩ tư vấn di truyền để đánh giá nguy cơ di truyền sang con cái. Các xét nghiệm cần được thực hiện để xác nhận chẩn đoán người cha hoặc mẹ mang bất thường. Phương pháp đánh giá PGD hiện nay có thể giúp loại bỏ một số bệnh di truyền (ví dụ như bệnh Tay-Sachs, xơ nang, bệnh Huntington, chứng dystrophies liên kết với NST X). PGD được thực hiện trước khi mang thai, giúp cho các cặp vợ chồng dễ dàng hơn trong quyết định từ bỏ thai nếu thai đó được chẩn đoán mắc bệnh.

Hơn thế nữa, hàng nghìn trẻ sơ sinh đã được sinh ra sau PGS / PGD trên toàn thế giới. Cho đến nay, không có báo cáo về tỉ lệ dị dạng thai tăng lên hoặc các vấn đề nhận dạng khác.

Hạn chế khi thực hiện kỹ thuật PGS / PGD: 

Đối với PGS chỉ phát hiện các bất thường về số lượng NST, không thể phát hiện các bất thường về cấu trúc NST hay các đột biến gen.



Có thể bỏ sót tình trạng thể khảm. Đây là tình trạng mà trong cùng 1 phôi, có 2 dòng tế bào với bộ NST khác nhau.

Rủi ro khi thực hiện kỹ thuật PGS / PGD: 

Không có phôi đến giai đoạn ngày 5 để thực hiện PGS / PGD.



Ảnh hưởng của sinh thiết. Mặc dù các báo cáo trên thế giới hiện nay cho thấy sinh thiết phôi không có tác động xấu đến kết quả điều trị, nhưng kỹ thuật này vẫn có rủi ro chưa thể loại trừ.

Tổng quan về PGS / PGD

15



Không có kết quả PGS / PGD vì không có DNA, có thể do chất lượng kém của tế bào sau sinh thiết, xảy ra khoảng 5%.



Chẩn đoán không chính xác, có thể do phôi ở dạng thể khảm hoặc rủi ro trong quá trình xét nghiệm, dẫn đến kết quả dương tính giả (phôi bình thường nhưng chẩn đoán bất thường) hoặc âm tính giả (phôi bất thường nhưng chẩn đoán bình thường), xảy ra khoảng 10%.



Không có phôi bình thường để chuyển sau PGS / PGD.



Kết quả NST giới tính sẽ không được thông báo cho bệnh nhân, trừ trường hợp NST này bất thường.

Những yêu cầu cơ bản của một trung tâm thụ tinh trong ống nghiệm 

Cần có một phòng labo hỗ trợ sinh sản với thiết kế theo tiêu chuẩn phòng sạch để hạn chế sự nhiễm chéo vật liệu sinh học phân tử. Nếu có thiết kế phòng xét nghiệm di truyền, thì cũng nên xem xét tiêu chuẩn tương tự và nằm kế liền với labo hỗ trợ sinh sản.



Phải có qui trình nhận diện từng bệnh nhân và từng phôi, từng tế bào ở mức độ nguy cơ cao nhất có thể xảy ra, luôn luôn có 2 chuyên viên kiểm tra chéo ở từng bước từ chọn phôi  sinh thiết  rửa tế bào  nhận diện có tế bào trong tube  trữ phôi  lưu trữ  ghi nhận kết quả.



Cần có kiểm soát tỉ lệ có thai trung bình của nhóm bệnh nhân thực hiện kỹ thuật PGS / PGD, bao gồm: tỉ lệ có thai thấp nhất có thể chấp nhận với kỹ thuật PGD, so sánh tỉ lệ thai giữa nhóm bệnh nhân thực hiện và không thực hiện kỹ thuật PGS, so sánh tỉ lệ thai giữa nhóm bệnh nhân thực hiện kỹ thuật PGD và nhóm bệnh nhân bình thường không thực hiện sinh thiết phôi.



Cần có sự công nhận bởi quốc gia về việc thực hiện kỹ thuật PGS / PGD hoặc tuân thủ theo các hướng dẫn thực hành chuẩn trên thế giới.



Cần có sự nhận thức liên tục về nguyên nhân có thể có của chẩn đoán sai và biện pháp phòng ngừa.



Cần có một mối quan hệ làm việc chặt chẽ với phòng xét nghiệm di truyền  nơi có sẵn chuyên gia tư vấn di truyền thích hợp (chuyên biệt cho tư vấn vô sinh) và các chuyên viên đã quen với kỹ thuật xét nghiêm này, đồng thời nắm rõ tiềm năng và hạn chế của kỹ thuật xét nghiệm di truyền tiền làm tổ.

Sự vận chuyển vật liệu sinh học 

Khuyến nghị các trung tâm IVF và trung tâm xét nghiệm di truyền tiền làm tổ PGS / PGD có một thỏa thuận chính thức giải quyết các vấn đề pháp lý, bảo hiểm và trách nhiệm giải trình kết quả.



Trung tâm IVF và trung tâm xét nghiệm di truyền tiền làm tổ PGS / PGD nên thống nhất về một bộ các qui trình lâm sàng / labo trước khi vận chuyển bất kỳ mẫu bệnh phẩm nào. Nó được đề xuất theo khuyến cáo mà các hình thức tương tự đang được sử dụng cho tất cả các trung tâm IVF hiện nay. Cần chú ý đặc biệt đến những ai chịu trách nhiệm trong các giai đoạn khác nhau của qui trình giao nhận trong vận chuyển. Khuyến nghị các trung tâm IVF và trung tâm xét nghiệm di truyền tiền làm tổ PGS / PGD sử dụng sự chấp thuận chung.



Đối với mỗi trung tâm IVF thì có thể có hình thức khác nhau trong việc xác nhận các giao thức vận chuyển được sử dụng để đánh giá khoảng thời gian vận chuyển gần đúng với đặc thù từng trung tâm và đảm bảo việc vận chuyển các mẫu không làm ảnh hưởng đến hình thái tế bào hoặc sự toàn vẹn DNA.



Các trung tâm IVF gửi tế bào sinh thiết trong ống PCR nên được huấn luyện đầy đủ qui trình lấy mẫu phôi và đặt tế bào vào ống theo trung tâm xét nghiệm di truyền tiền làm tổ PGS / PGD qui định tại qui trình. Nếu không thể, thì trung tâm IVF nên sắp xếp các chuyên viên phôi học có một trình độ phù hợp và được đào tạo để thực hiện sinh thiết và chuẩn bị blastomere.



Trước khi chạy thử, qui trình vận chuyển vật liệu sinh học nên được đánh giá trước kỹ thuật sinh thiết với ít nhất một hoặc nhiều lần với từng trung tâm IVF khác nhau.



Khuyến cáo các trung tâm xét nghiệm di truyền tiền làm tổ PGS / PGD chịu trách nhiệm về thời gian vận chuyển. Các trung tâm IVF nên tuân thủ các qui tắc sao cho số chu kỳ vận chuyển tối đa mà trung tâm xét nghiệm di truyền tiền làm tổ PGS / PGD có thể thực hiện vào một ngày nhất định hoặc trong một khoảng thời gian nhất định.



Khuyến nghị các trung tâm IVF và trung tâm xét nghiệm di truyền tiền làm tổ PGS / PGD mô tả sự giao tiếp trong giao nhận một cách rõ ràng và đầy đủ bằng các chứng từ liên quan trong suốt các giai đoạn của việc vận chuyển vật liệu sinh học.



Trung tâm IVF và trung tâm xét nghiệm di truyền tiền làm tổ PGS / PGD phải đảm bảo rằng bệnh nhân đã được tư vấn đầy đủ về kỹ thuật PGS / PGD và đã hiểu rõ mọi việc trước khi thực hiện làm.



Khuyến cáo tất cả các kết quả chẩn đoán và bảng báo cáo kết quả được gửi bằng văn bản (fax, thư từ hoặc email) và không có kết quả chi tiết nào được thông báo qua điện thoại. Bảng báo cáo kết quả phải có định dạng cố định, rõ ràng và thân thiện (Harper và cs., 2010). Ngoài ra, khuyến cáo các chuyên gia có kinh nghiệm trong trung tâm IVF sẽ xem xét kết quả trước khi thảo luận về kết quả với bệnh nhân.

Tổng quan về PGS / PGD



17

Khuyến nghị các trung tâm IVF và trung tâm xét nghiệm di truyền tiền làm tổ PGS / PGD thống nhất về những người chịu trách nhiệm thu thập dữ liệu PGS / PGD và theo dõi trẻ sinh ra từ kỹ thuật này.

QC, QA và kiểm định Sự chứng nhận: 

Việc kiểm định, cùng với việc kiểm tra sự hoạt động thông qua đánh giá chất lượng ngoại kiểm, cung cấp phương tiện để đạt được và duy trì các tiêu chuẩn labo cao nhất. Chứng nhận là sự công nhận chính thức mà cơ quan có thẩm quyền cho một labo / trung tâm khi nó thể hiện khả năng thực hiện các yêu cầu được xác định và bao gồm tất cả các khía cạnh của quản lý, cùng với các yêu cầu kỹ thuật.



Phù hợp với việc kiểm định labo IVF, labo PGS / PGD phải đạt tiêu chuẩn cao nhất với các qui trình vận hành chuẩn tại chỗ và đội ngũ nhân viên được đào tạo phù hợp.

Quản lý chất lượng: 

Đảm bảo sự an toàn của bệnh nhân thông qua chất lượng của kết quả nên là mục đích của tất cả các labo trong y tế. Điều này chỉ có thể đạt được bằng cách thiết lập quản lý chất lượng trong labo. Quản lý chất lượng bao gồm tất cả các hệ thống và qui trình cần thiết để duy trì và nâng cao chất lượng.



QC, QA và cải tiến chất lượng đều là một phần trong quản lý chất lượng tổng thể và khuyến nghị hệ thống này sẽ được tích hợp vào trung tâm IVF và trung tâm xét nghiệm di truyền tiền làm tổ PGS / PGD (Soini và cs., 2006).



Các khía cạnh của quản lý chất lượng bao gồm: kiểm soát tài liệu, hướng dẫn chất lượng, chính sách chất lượng, giải quyết khiếu nại, cải tiến liên tục, nội kiểm và đánh giá sự quản lý.



Yêu cầu kỹ thuật bao gồm: nhân viên, điều kiện trong labo và môi trường, thiết bị, tất cả các giai đoạn của qui trình thực nghiệm, báo cáo kết quả và bảo đảm chất lượng (Harper và cs., 2010).

QC / QA nội bộ: 

QC / QA nội bộ nên là một quá trình diễn tiến (Thornhill và cs., 2005; PGDIS, 2008). Cần phải duy trì QC / QA nội bộ và các tài liệu, nội kiểm phải bao gồm xác nhận kết quả chẩn đoán và đánh giá mức chẩn đoán sai.



Các qui trình thử nghiệm lâm sàng nên bao gồm các hướng dẫn rõ ràng từ các bước xác nhận của việc đăng ký triển khai kỹ thuật mới, các tiêu chí chấm điểm, các qui trình báo cáo kế quả cũng như các hướng dẫn để tư vấn bệnh nhân về các kết quả chẩn đoán.



Tất cả các tài liệu của qui trình phải được kiểm soát để đảm bảo rằng phiên bản mới nhất đang được sử dụng.



Tất cả các qui trình cần được tiếp cận dễ dàng với các nhân viên có liên quan.



Nên ghi nhận các sai lệch từ qui trình.



Nếu xảy ra sai lệch thường xuyên, cần có cơ chế để thay đổi các qui trình phù hợp.



Tất cả các qui trình cần được xem xét và cập nhật ít nhất mỗi năm và tất cả các nhân viên liên quan được thông báo về bất kỳ sửa đổi qui trình nào.

Đánh giá chất lượng ngoại kiểm: 

Đánh giá chất lượng ngoại kiểm tạo ra một phần quan trọng trong quản lý chất lượng và rất cần thiết cho các qui trình hay kỹ thuật cần sự công nhận.



Khuyến cáo mỗi trung tâm trở thành một phần của một chương trình đánh giá chất lượng ngoại kiểm.



Khuyến cáo sự tham gia tự nguyện vào chương trình đánh giá chất lượng ngoại kiểm ít nhất mỗi năm một lần được đề cập (Thornhill và cs., 2005; Wilton và cs., 2009; Harper và cs., 2010).

TỒN TẠI VÀ THÁCH THỨC TRONG TƯƠNG LAI Đến hiện tại, thách thức lớn nhất trong kỹ thuật PGS / PGD chính là thể khảm và thông tin giáo dục bệnh nhân về tất cả nguy cơ cũng như hiệu quả mà kỹ thuật này mang lại. Phôi mang thể khảm được định nghĩa là sự hiện diện của hai hoặc nhiều dòng tế bào có kiểu gen khác nhau trong một phôi. Thể khảm được biết đến phổ biến ở phôi giai đoạn sớm và được cho là một trong những nguyên nhân mà PGS sử dụng phương pháp FISH không đưa ra được tiên đoán tăng tỉ lệ thành công của TTTON. Tuy nhiên, với các kỹ thuật mới hơn vừa ra đời thì PGS là một công cụ lý tưởng để nghiên cứu mức độ khảm ở các thời điểm khác nhau trong quá trình phát triển của phôi. Nó cũng có thể được sử dụng để chỉ ra liệu các tế bào được cho là khảm chỉ là một lệch bội hay nhiều lệch bội. Kết quả cho thấy thể khảm phổ biến trong suốt giai đoạn phôi ngày thứ 3 và thứ 4, nhưng ngày thứ 5, tỉ lệ khảm sẽ giảm rất nhiều. Lý do này bao gồm sự tăng trưởng vượt trội của các tế bào nguyên bội, phân bổ các tế bào nguyên bội trong ICM và / hoặc kích hoạt các gen mã hóa cho các trạm kiểm soát trong chu kỳ tế bào của phôi và cho phép sự chết theo chương trình của các tế bào thể lệch bội (Alfarawat và cs., 2011).

Việc báo cáo thêm về thể khảm trong phôi đã làm tăng những thách thức mới trong việc giải thích kết quả PGS và tư vấn bệnh nhân. Trước đây, phôi được chẩn đoán là nguyên bội hoặc lệch bội và trong hầu hết các trường hợp, chỉ phôi nguyên bội được xem xét để chuyển. Nhưng hiện tại, phôi mang thể khảm được coi là một kết quả thứ ba (Munne và cs., 2016) nên các chiến lược giáo dục bệnh nhân và tư vấn phải phát triển theo. Bệnh nhân cần được tư vấn kỹ càng về di truyền và

Tổng quan về PGS / PGD

19

những nguy cơ tiềm ẩn trong thai kỳ; đặc biệt trong những chu kỳ không có phôi nguyên bội để chuyển. Vì một số phôi thể khảm vẫn có khả năng cho ra đời trẻ khỏe mạnh (Greco và cs., 2015) nhưng cần phải giáo dục bệnh nhân rằng những phôi này tiềm năng làm tổ rất thấp và tỉ lệ sẩy thai cao hơn rất nhiều so với phôi nguyên bội (Fragouli và cs., 2011). Theo Hiệp hội Chẩn đoán di truyền tiền làm tổ quốc tế (PGDIS) cho thấy thể khảm tam bội các NST (1,3,4,5,6,8,9,10,11,12,17,19,20,22, X và Y) sẽ được ưu tiên chuyển hơn thể khảm tam bội các NST (2,7,13,14,15,16,18 và 21) vì ngoài nguy cơ các hội chứng tam bội (Down, Edwards và Patau) thì thể khảm các NST khác mang nguy cơ thai phát triển trong tử cung kém hoặc rối loạn thai kỳ nên việc tư vấn cả những nguy cơ này rất cần thiết.

KẾT LUẬN Sự phát triển và ứng dụng công nghệ phân tử mới cho phép lựa chọn phôi đã kích thích sự quan tâm hơn nữa đến giá trị và việc sử dụng PGS trong IVF. PGS có hiệu quả trong việc phát hiện thể tam bội thông thường và các dạng lệch bội khác và do đó làm giảm nguy cơ bất thường dị tật cho thai. PGD là một qui trình tương đối mới và nhiều nghiên cứu liên tục đang được thực hiện để mở rộng và cải thiện nó. Trong tương lai, mối liên hệ di truyền với các bệnh thông thường, ví dụ như: đái tháo đường, cao huyết áp, bệnh tim mạch, lạc nội mạc tử cung, ung thư… có thể được xác định và kỹ thuật PGD sẽ có thể dùng để sàng lọc được các bệnh di truyền này cho các thế hệ tương lai. Gần đây, ngành hỗ trợ sinh sản tại Việt Nam đã có những bước tiến vượt bậc trong việc ứng dụng kỹ thuật PGS / PGD mới này tại hầu hết các trung tâm trên cả nước và góp phần nâng cao hiệu quả điều trị, góp phần đáp ứng nhu cầu xã hội và phát triển các công nghệ y sinh học liên quan.

TÀI LIỆU THAM KHẢO 1.

Alfarawati S, Fragouli E, Colls P, Stevens J, Gutiérrez-Mateo C, Schoolcraft WB, Wells D (2011). The relationship between blastocyst morphology, chromosomal abnormality, and embryo gender. Fertility and sterility; 95(2),520-4.

2.

Ayman Grada and Weinbrecht Kate (2013). Next-Generation Sequencing: Methodology and Application. Journal of Investigative Dermatology; 133(8): e11. doi:10.1038/jid.2013.248.

3.

Coates Alison, Bankowski Brandon J, Kung Allen, Griffin Darren K, Munne Santiago (2017). Differences in pregnancy outcomes in donor egg frozen embryo transfer (FET) cycles following preimplantation genetic screening (PGS): a single center retrospective study. Journal of Assisted Reproduction and Genetics; 34:71-8.

4.

Coates Alison, Kung Allen, Mounts Emily, Hesla John, Bankowski Brandon, Barbieri Elizabeth, Ata Baris, Cohen Jacques and Munne Santiago (2017). Optimal euploid embryo transfer strategy, fresh versus frozen, after preimplantation genetic screening with next generation sequencing: a randomized controlled trial. Fertility and Sterility; 107:723-30.

5.

De Rycke M, Goossens V, Kokkali G, Meijer-Hoogeveen M, Coonen E, Moutou C (2017). ESHRE PGD Consortium data collection XIVXV: cycles from January 2011 to December 2012 with pregnancy follow-up to October 2013. Hum Reprod; 32(10):1974-94.

6.

Enciso M, Sarasa J, Xanthopoulou L, Bristow S, Bowles M, Fragouli E, Delhanty J, Wells D (2016). Polymorphisms in the MTHFR gene influence embryo viability and the incidence of aneuploidy. Hum Genet; 135(5):555-68.

7.

Fiorentino, Francesco, Bono Sara, Biricik Anil, Nuccitelli Andrea, Cotroneo Ettore, Cottone Giuliano, Kokocinski Felix, Michel Claude-Edouard, Minasi Maria Giulia and Greco Ermanno (2014). Application of next-Generation Sequencing Technology for Comprehensive Aneuploidy Screening of Blastocysts in Clinical Preimplantation Genetic Screening Cycles. Human Reproduction (Oxford, England); 29(12):2802-13. doi:10.1093/humrep/deu277.

8.

Fragouli E, & Wells D (2011). Aneuploidy in the human blastocyst. Cytogenetic and genome research; 133(2-4),149-159.

9.

Greco E, Minasi MG, Fiorentino F (2015). Healthy babies after intrauterine transfer of mosaic aneuploid blastocysts. New England Journal of Medicine; 373(21),2089-90.

10.

Harper J, Wells D, Simpson JL (2016). Current controversies in prenatal diagnosis 4: preimplantation genetic screening should be routinely offered to all preimplantation genetic diagnosis cases. Prenat Diagn; 36(1):25-8.

11.

Harper JC, SenGupta S, Vesela K, Thornhill A, Dequeker E, Coonen E, Morris MA (2010). Accreditation of the PGD laboratory. Hum Reprod; 25:1051-65.

12.

Harton GL, Magli MC, Lundin K, Montag M, Lemmen J and Harper JC (2010). ESHRE PGD Consortium / Embryology Special Interest Group - best practice guidelines for polar body and embryo biopsy for preimplantation genetic diagnosis/screening (PGD / PGS).

Human Reproduction; Vol.0, No.0,1-6.

13.

Hồ Mạnh Tường, Nguyễn Thị Thu Lan, Bùi Võ Minh Hoàng và cs (2009). Kỹ thuật chẩn đoán di truyền tiền làm tổ - Các trường hợp thành công đầu tiên ở Việt Nam. Báo cáo tại Hội nghị Việt Pháp, Hà Nội; tháng 05/2009.

14.

Konstantinidis M, Prates R, Goodall NN, Fischer J, Tecson V, Lemma T, Chu B, Jordan A, Armenti E, Wells D, Munné S (2015). Live births following Karyomapping of human blastocysts: experience from clinical application of the method. Reprod Biomed Online 2015; 31(3):394-403.

15.

Kung A, Munné S, Bankowski B, Coates A, Wells D (2015). Validation of next-generation sequencing for comprehensive chromosome screening of embryos. Reprod Biomed Online; 31(6):760-9.

16.

Kushnir Vitaly A, Darmon Sarah K, Albertini David F, Barad David H and Gleicher Norbert (2016). Effectiveness of in vitro fertilization with preimplantation genetic screening: a reanalysis of United States assisted reproductive technology data 20112012. Fertility and Sterility; 106:0015-0282.

17.

Maxwell Susan M, Colls Pere, Hodes-Wertz Brooke, McCulloh David H, McCaffrey Caroline, Wells Dagan, Munné Santiago and Grifo James A (2016). Why do euploid embryos miscarry? A case-control study comparing the rate of aneuploidy within presumed euploid embryos that resulted in miscarriage or live birth using next-generation sequencing. Fertility and Sterility; 106:1414-9.

18.

Munné S, Grifo J, Wells D (2016). Mosaicism: “survival of the fittest” versus “no embryo left behind”. Fertility and sterility; 105(5),1146-9.

19.

Munné Santiago and Wells Dagan (2017). Detection of mosaicism at blastocyst stage with the use of high-resolution nextgeneration sequencing. Fertility and Sterility; 107:1085-91.

20.

Munné Santiago, Cohen Jacques (2017). Advanced maternal age patients benefit from preimplantation genetic diagnosis of aneuploidy. Fertility and Sterility; 107:1145-6.

21.

Ottolini CS, Rogers S, Sage K, Summers MC, Capalbo A, Griffin DK, Sarasa J, Wells D, Handyside AH (2015). Karyomapping identifies second polar body DNA persisting to the blastocyst stage: implications for embryo biopsy. Reprod Biomed Online; 31(6):776-82.

22.

Preimplantation Genetic Diagnosis International Society (PGDIS) (2008). Guidelines for good practice in PGD: programme requirements and laboratory quality assurance. Reprod Biomed Online; 16:134-47.

Tổng quan về PGS / PGD

23.

21

Ravichandran Krithika, Guzman Luis, Escudero Tomas, Zheng Xuezhong, Colls Pere, Jordan Amy, Cohen Jacques, Wells Dagan, Munné Santiago (2016). Causes and estimated incidences of sex-chromosome misdiagnosis in preimplantation genetic diagnosis of aneuploidy. RBM Online; 33:550-9.

24.

Sermon K, Capalbo A, Cohen J, Coonen E, De Rycke M, De Vos A, Delhanty J, Fiorentino F, Gleicher N, Griesinger G, Grifo J, Handyside A, Harper J, Kokkali G, Mastenbroek S, Meldrum D, Meseguer M, Montag M, Munné S, Rienzi L, Rubio C, Scott K, Scott R, Simon C, Swain J, Treff N, Ubaldi F, Vassena R, Vermeesch JR, Verpoest W, Wells D, Geraedts J (2016). The why, the how and the when of PGS 2.0: current practices and expert opinions of fertility specialists, molecular biologists, and embryologists. Mol Hum Reprod; 22(8):845-57.

25.

Soini S, Ibarreta D, Anastasiadou V, Ayme ́ S, Braga S, Cornel M, Coviello DA, Evers-Kiebooms G, Geraedts J, Gianaroli L et al.; ESHG; ESHRE (2006). The interface between assisted reproductive technologies and%genetics: technical, social, ethical and legal issues. Eur J Hum Genet; 14:588-645.

26.

Spath Katharina, Wells Dagan (2015). Deep impact: sequencing embryo biopsy specimens at increasing depth. RBM Online; 31:13.

27.

Stein Lincoln D (2011). An Introduction to the Informatics of ‘next-Generation’ Sequencing. Current Protocols in Bioinformatics / Editoral Board, Andreas D Baxevanis... [et al.] Chapter 11 (December): Unit 11.1. doi:10.1002/0471250953.bi1101s36.

28.

Thornhill AR, deDie-Smulders CE, Geraedts JP, Harper JC, Harton GL, Lavery SA, Moutou C, Robinson MD, Schmutzler AG, Scriven PN

et al. (2005). Best practice guidelines for clinical preimplantation genetic diagnosis (PGD) and preimplantation genetic

screening (PGS). ESHRE PGD Consortium. Hum Reprod; 20:35-48.

29.

Thornhill AR, Handyside AH, Ottolini C, Natesan SA, Taylor J, Sage K, Harton G, Cliffe K, Affara N, Konstantinidis M, Wells D, Griffin DK (2015). Karyomapping-a comprehensive means of simultaneous monogenic and cytogenetic PGD: comparison with standard approaches in real time for Marfan syndrome. J Assist Reprod Genet; 32(3):347-56.

30.

Wilton L, Thornhill A, Traeger-Synodinos J, Sermon KD, Harper JC (2009). The causes of misdiagnosis and adverse outcomes in PGD. Hum Reprod; 24:1221-8.

Kết quả sàng lọc di truyền phôi tiền làm tổ và giải pháp chẩn đoán thể khảm, bất thường cấu trúc, vi mất đoạn trên phôi ngày năm bằng kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới tại Việt Nam

KẾT QUẢ SÀNG LỌC DI TRUYỀN PHÔI TIỀN LÀM TỔ VÀ GIẢI PHÁP CHẨN ĐOÁN THỂ KHẢM, BẤT THƯỜNG CẤU TRÚC, VI MẤT ĐOẠN TRÊN PHÔI NGÀY NĂM BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ THẾ HỆ MỚI TẠI VIỆT NAM

________________________ ________________________ ________________________ ________________________

Nguyễn Vạn Thông

Bệnh viện Hùng Vương

________________________ ________________________ 1

PGT (preimplantation genetic testing) IVF / ISCI

________________________

Sinh thiết phôi

________________________ Chẩn đoán di truyền

________________________

Chuyển phôi

________________________ ________________________ ________________________ 2



Kết quả PGS: phôi không lệch bội vẫn sẩy thai?

________________________ ________________________ ________________________

BẤT THƯỜNG CẤU TRÚC KHÔNG CÂN BẰNG ________________________ ________________________

THỂ KHẢM

________________________ 3

23

Nội dung

________________________



Các xét nghiệm di truyền chẩn đoán bất thường cấu trúc và vi mất đoạn nhiễm sắc thể (NST) trong PGT.

________________________



Các xét nghiệm di truyền chẩn đoán bất thường thể khảm NST trong PGT.

________________________



Số liệu thực tế tại Gentis.

________________________ ________________________ ________________________ 4

BẤT THƯỜNG CẤU TRÚC NHIỄM SẮC THỂ LÀ GÌ?

________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________ 5

Bất thường nhiễm sắc thể trong sẩy thai

________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________ 6

Kết quả sàng lọc di truyền phôi tiền làm tổ và giải pháp chẩn đoán thể khảm, bất thường cấu trúc, vi mất đoạn trên phôi ngày năm bằng kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới tại Việt Nam

Tần suất các bất thường nhiễm sắc thể / sau sinh

________________________ ________________________

N = 10.323 bất thường

________________________ ________________________ ________________________ ________________________ Welleslly et al. (2012). Rare chromosome abnormalities, prevalence and prenatal diagnosis rates from population-based congenital anomaly registers in Europe. EJHG; 20:521-6.

7

Tỉ lệ bất thường cấu trúc

________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________

Tỉ lệ: 8%.

Phát hiện trước sinh: 50%.

Sinh sống: 60%.

Welleslly et al. (2012). Rare chromosome abnormalities, prevalence and prenatal diagnosis rates from population-based congenital anomaly registers in Europe. EJHG; 20:521-6.

________________________ 8

________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________ 9

25

Mất đoạn

________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________ 10

Mất đoạn 

Chọc ối vì T21: 1/62.



Siêu âm kiểm: 18w, sứt môi chẻ vòm, hẹp van động mạch phổi.

________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________ 11

Mất đoạn nhiễm sắc thể 13

________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________

Kirchhoff M et al (2009).

12

Kết quả sàng lọc di truyền phôi tiền làm tổ và giải pháp chẩn đoán thể khảm, bất thường cấu trúc, vi mất đoạn trên phôi ngày năm bằng kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới tại Việt Nam

Mất đoạn  

________________________

Bé sinh non.

Theo dõi hội chứng Cri-du-chat.

________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________ 13

Mất đoạn

________________________ ________________________ 33Mb

________________________ ________________________ ________________________ ________________________

5p15.33-5p13.3 14

Cri-du-Chat – 5p

________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________

Kjær I and Niebuhr J (1999).

15

27

Lặp đoạn

________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________ 16

Thêm đoạn

________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________ 17

Thêm đoạn

________________________

 Bé sinh non 36 tuần.  Đa dị tật.

Kết luận: trisomy bán phần cánh ngắn NST 5.

________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________ 18

Kết quả sàng lọc di truyền phôi tiền làm tổ và giải pháp chẩn đoán thể khảm, bất thường cấu trúc, vi mất đoạn trên phôi ngày năm bằng kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới tại Việt Nam

Thêm đoạn

________________________ ________________________ 50Mb

________________________ ________________________ ________________________ ________________________

5p15.33-5p13.3 19

Chỉ định PGT (preimplantation genetic testing) PG screening

PG diagnosis



Chẩn đoán lệch bội (PGD-A), bố mẹ không có bất thường di truyền



Chẩn đoán bất thường di truyền đã biết trước từ bố và / hoặc mẹ.



De novo.





Giảm phân tạo giao tử: toàn bộ phôi.

Tùy thuộc kích thước vị trí đứt gãy của bố mẹ  lựa chọn kỹ thuật phù hợp.



Giai đoạn nguyên phân: khảm.

________________________ ________________________ ________________________ ________________________

thể

________________________ ________________________

BẤT THƯỜNG CẤU TRÚC KHÔNG CÂN BẰNG 20

Chuyển đoạn cân bằng

________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________ 21

29

Giảm phân

________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________ 22

Nguyên phân

________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________ 23

Quá trình sửa chữa

________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________

Lee Amy (2016). J Assist Reprod Genet.

24

Kết quả sàng lọc di truyền phôi tiền làm tổ và giải pháp chẩn đoán thể khảm, bất thường cấu trúc, vi mất đoạn trên phôi ngày năm bằng kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới tại Việt Nam

Các kiểu chẩn đoán thể khảm ở phôi ngày 5

________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________ 25

Các kỹ thuật di truyền trong PGS

________________________ ________________________ ________________________ ________________________ Bobs

________________________ ________________________ 26

Khả năng chẩn đoán các xét nghiệm PGT

________________________

FISH

BOB

aCGH

SNP array

NGS

+

+

+

+

+

+ Probe đặc hiệu

+/-

+ > 5M

+

+/++ > 5M / > 1M

________________________

Đột biến đơn gen

-

-

-

+

+

________________________

Đột biến denovo

-

-

-

-

+

________________________

Đột biến ty thể

-

-

-

-

+

Thể khảm D5

+/-

+/-

+

+

++/+++

Sàng lọc lệch bội Bất thường cấu trúc

________________________

________________________ 27

31

Số liệu thực tế tại Trung tâm Gentis?

________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________ 28

Tỉ lệ bất thường lệch bội nhiễm sắc thể theo tuổi mẹ trên phôi ngày 5 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 Tỷ lệ

________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________

< 35 30

35-40 42

>40 44

________________________ 29

Tỉ lệ bất thường theo NST

________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________ 30

Kết quả sàng lọc di truyền phôi tiền làm tổ và giải pháp chẩn đoán thể khảm, bất thường cấu trúc, vi mất đoạn trên phôi ngày năm bằng kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới tại Việt Nam

Tỉ lệ trả kết quả sinh thiết phôi ngày 5

________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________ N = 1.603 phôi

________________________ 31

Tỉ lệ các bất thường trên phôi ngày 5

________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________ N = 1.540 phôi

________________________ 32

Tỉ lệ bất thường số lượng nhiễm sắc thể

________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________ 33

33

________________________ ________________________ ________________________ ________________________ 2q25: 64Mb -6; -15; +9

________________________ ________________________ 34

________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________

3q23: 56Mb

________________________ 35

PGD: chuyển đoạn cân bằng

________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________ 36

Kết quả sàng lọc di truyền phôi tiền làm tổ và giải pháp chẩn đoán thể khảm, bất thường cấu trúc, vi mất đoạn trên phôi ngày năm bằng kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới tại Việt Nam

Thể khảm nhiễm sắc thể 2

________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________ 37

Thể khảm nhiễm sắc thể 8

________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________ 38

Thể khảm nhiễm sắc thể 5, 10, 18

________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________ 39

35

Hội chứng DiGeorge

________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________ 40

Hội chứng DiGeorge

________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________

AHA (2007).

41

Hội chứng DiGeorge - MLPA

________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________ 42

Kết quả sàng lọc di truyền phôi tiền làm tổ và giải pháp chẩn đoán thể khảm, bất thường cấu trúc, vi mất đoạn trên phôi ngày năm bằng kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới tại Việt Nam

Hội chứng DiGeorge - MLPA

________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________ 43

Hội chứng DiGeorge - FISH

________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________ 44

Bất thường vi mất đoạn bằng NGS

________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________ 45

37

Thông tin mang về 





________________________

Phân loại các bất thường NST: • Cân bằng.

• Không cân bằng: o Thêm: toàn bộ, bán phần, vi lặp đoạn. o Mất: toàn bộ, bán phần, vi mất đoạn.

Tỉ lệ bất thường cấu trúc không cân bằng trong trước sinh và sau sinh: 8%.

• Phát hiện trước sinh: 50%.

• Sinh sống: 60% Ba tình huống gặp bất thường cấu trúc / PGT: • Bố mẹ có chuyển đoạn cân bằng (PGD).

• De novo. o Giảm phân: toàn bộ. o Nguyên phân: thể khảm.

________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________ 46

Thông tin mang về

________________________



FISH, Micro array và NGS là 3 phương tiện có thể chẩn đoán bất thường cấu trúc / PGT.

________________________



Tuổi mẹ càng tăng, bất thường NST càng cao.

________________________



Các bất thường NST / PGT: gần tương đương nhau.



Tỉ lệ bất thường trên phôi ngày 5: •

Tỉ lệ bất thường NST: 28%.

•

Tỉ lệ bất thường cấu trúc: 7%.

•

Tỉ lệ bất thường thể khảm: 6%.

________________________ ________________________ ________________________ 47

CHÂN THÀNH CÁM ƠN

________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________ 48

Ứng dụng PGD tại IVFMD: hiện trạng và xu hướng trong lĩnh vực thụ tinh ống nghiệm

39

ỨNG DỤNG PGD TẠI IVFMD: HIỆN TRẠNG VÀ XU HƯỚNG TRONG LĨNH VỰC THỤ TINH ỐNG NGHIỆM Lưu Thị Minh Tâm, Phạm Thiếu Quân, Huỳnh Gia Bảo IVFMD, Bệnh viện Mỹ Đức

TỔNG QUAN “Chẩn đoán di truyền tiền làm tổ” viết tắt là PGD. Kỹ thuật này đã được phát triển từ những năm 1980 nhằm giúp phát hiện các bất thường di truyền ở phôi từ những cặp vợ chồng có nguy cơ truyền các bệnh lý di truyền cho con, giúp họ có cơ hội sinh con không mắc bệnh mà không phải chấm dứt thai kỳ khi phát hiện các bệnh lý thông qua chẩn đoán tiền sản cổ điển. Trải qua hơn 30 năm nghiên cứu và ứng dụng, PGD đã trở thành một kỹ thuật quan trọng trong lĩnh vực hỗ trợ sinh sản trên toàn thế giới, giúp kiểm soát các bệnh di truyền Meldel hay chuyển đoạn nhiễm sắc thể (NST) không cân bằng. Cùng với những tiến bộ trong kỹ thuật sinh thiết phôi, đông lạnh phôi và chẩn đoán phân tử thì việc ứng dụng PGD trong IVF càng dễ dàng hơn. Trong các báo cáo hằng năm về ứng dụng kỹ thuật PGD trên toàn Châu Âu, số liệu tổng hợp từ báo cáo gần nhất của Hiệp hội Sinh sản Châu Âu (ESHRE) cho thấy đã có hơn 10.000 trẻ ra đời từ 15 lần thu thập dữ liệu (De Rycke và cs., 2017). Tại khu vực Đông Nam Á, PGD đã được thực hiện hầu hết các nước, trong đó có cả Việt Nam. Vào năm 2009-2010, các nhóm chuyên gia lĩnh vực IVF tại Việt Nam đã xây dựng thành công qui trình thực hiện PGD để chẩn đoán bất thường số lượng NST trên phôi người và bước đầu đánh giá tỉ lệ lệch bội ở một số NST trên đối tượng phôi người. Cho đến hiện tại, lĩnh vực hỗ trợ sinh sản tại Việt Nam đã đạt được những bước tiến đáng kể, ghi nhận được nhiều thành tựu trong tất cả các kỹ thuật, kể cả kỹ thuật PGD. Như vậy, những đối tượng nào sẽ được chỉ định thực hiện IVF chủ động kết hợp PGD? Hiện nay, trên thế giới đang tập trung chỉ định thực hiện IVF kết hợp PGD cho các trường hợp bất thường về NST, rối loạn / đột biến đơn gen trên NST thường hoặc liên kết NST X. Cụ thể hơn, vì những bất thường về NST, bao gồm bất thường về số lượng và bất thường về cấu trúc xuất hiện trong ở khoảng 0,5-5% các cặp vợ chồng trong độ tuổi sinh sản và đặc biệt tăng lên đáng kể theo độ tuổi người mẹ. Đối với trường hợp bất thường về NST thì PGD phần lớn tập trung vào bất thường cấu trúc là hiện tượng chuyển đoạn thuận nghịch hoặc chuyển đoạn Robertson. Chuyển đoạn thuận nghịch (reciprocal translocations) xảy ra ở 1/500 cá thể và chuyển đoạn Robertson (Robertsonian translocation) với tỉ lệ 1/1.000 cá thể (Scriven và Ogilvie, 2014). Những cá thể mang các bất thường cấu trúc trên thường có kiểu hình bình thường, nhưng lại có khả năng tạo ra sự mất cân bằng NST trong quá trình phân chia của các giao tử, dẫn đến sự gia tăng các nguy cơ trong sinh sản như: tạo ra giao tử bất thường, sẩy thai liên tiếp hoặc thất bại làm tổ nhiều lần, kết thúc sớm quá trình mang thai hay thậm chí đứa trẻ sinh ra thừa kế các bất thường này (Harton và cs., 2010). Theo dữ liệu mới được ESHRE thu thập, PGD còn được chỉ định phổ biến cho nhóm rối loạn / đột biến di

truyáť n lạn trĂŞn NST thĆ°áť?ng nhĆ°: báť&#x2021;nh xĆĄ nang, teo cĆĄ tᝧy sáť&#x2018;ng vĂ cĂĄc háť&#x2122;i chᝊng liĂŞn quan Ä&#x2018;áşżn táşż bĂ o mĂĄu (Harper vĂ cs., 2010). Ä?áť&#x2018;i váť&#x203A;i cĂĄc ráť&#x2018;i loấn / Ä&#x2018;áť&#x2122;t biáşżn di truyáť n tráť&#x2122;i trĂŞn NST thĆ°áť?ng thĂŹ nhĂłm báť&#x2021;nh Ä&#x2018;ưᝣc quan tâm nhiáť u nhẼt bao gáť&#x201C;m: ráť&#x2018;i loấn dưᝥng cĆĄ, u sᝣi thần kinh vĂ báť&#x2021;nh Huntington. Ä?áť&#x2018;i váť&#x203A;i cĂĄc ráť&#x2018;i loấn di truyáť n liĂŞn káşżt NST X, PGD chᝧ yáşżu Ä&#x2018;ưᝣc tháťąc hiáť&#x2021;n cho chᝊng loấn dưᝥng cĆĄ Duchenne, báť&#x2021;nh ráť&#x2018;i loấn Ä&#x2018;Ă´ng mĂĄu (hemophilia) vĂ háť&#x2122;i chᝊng NST X dáť&#x2026; gĂŁy.

Thalassemia lĂ máť&#x2122;t trong nhĂłm cĂĄc báť&#x2021;nh di truyáť n do Ä&#x2018;áť&#x2122;t biáşżn Ä&#x2018;ĆĄn gen, cĂł biáť&#x192;u hiáť&#x2021;n Ä&#x2018;ạc trĆ°ng lĂ sáťą giảm hoạc khĂ´ng cĂł cᝧa máť&#x2122;t trong nhᝯng chuáť&#x2014;i globin cᝧa hemoglobin (Hb) và ảnh hĆ°áť&#x;ng Ä&#x2018;áşżn khoảng 4,8% dân sáť&#x2018; tháşż giáť&#x203A;i váť&#x203A;i nhᝯng di chᝊng nạng náť áť&#x; tháť&#x192; nạng hoạc tiáť m Ẋn truyáť n qua nhiáť u tháşż háť&#x2021; (Harton vĂ cs., 2011). Báť&#x2021;nh lĂ˝ di truyáť n nĂ y phân báť&#x2018; pháť&#x2022; biáşżn áť&#x; khu váťąc Ä?áť&#x2039;a Trung Hải vĂ Ä?Ă´ng Nam Ă , Ä&#x2018;ĂŁ Ä&#x2018;ưᝣc tháşż giáť&#x203A;i phĂĄt hiáť&#x2021;n, nghiĂŞn cᝊu tᝍ nhᝯng nÄ&#x192;m 1925. NhĆ° Ä&#x2018;ĂŁ biáşżt, phân táť­ Hb gáť&#x201C;m 4 tiáť&#x192;u phần. áť&#x17E; tráşť sĆĄ sinh, phân táť­ Hb bao gáť&#x201C;m chᝧ yáşżu hai chuáť&#x2014;i Îą globin vĂ hai chuáť&#x2014;i đ?&#x203A;ž globin. áť&#x17E; ngĆ°áť?i trĆ°áť&#x;ng thĂ nh bĂŹnh thĆ°áť?ng, 95% cĂĄc phân táť­ Hb tuần hoĂ n bao gáť&#x201C;m hai chuáť&#x2014;i Îą globin vĂ hai chuáť&#x2014;i β globin, máť&#x2014;i chuáť&#x2014;i chᝊa máť&#x2122;t nhân heam cĂł nhiáť&#x2021;m v᝼ váş­n chuyáť&#x192;n cung cẼp oxy cho cĂĄc mĂ´, cĆĄ quan trong cĆĄ tháť&#x192;. Gen trĂŞn NST sáť&#x2018; 16 cháť&#x2039;u trĂĄch nhiáť&#x2021;m cho táť&#x2022;ng hᝣp cĂĄc tiáť&#x192;u Ä&#x2018;ĆĄn váť&#x2039; Îą, trong khi cĂĄc gen trĂŞn NST sáť&#x2018; 11 kiáť&#x192;m soĂĄt sáťą sản sinh cĂĄc tiáť&#x192;u Ä&#x2018;ĆĄn váť&#x2039; β. Viáť&#x2021;c thiáşżu máť&#x2122;t tiáť&#x192;u Ä&#x2018;ĆĄn váť&#x2039; Ä&#x2018;ạc hiáť&#x2021;u sáş˝ xĂĄc Ä&#x2018;áť&#x2039;nh loấi thalassemia (vĂ­ d᝼ nhĆ° thiáşżu tiáť&#x192;u Ä&#x2018;ĆĄn váť&#x2039; Îą dẍn Ä&#x2018;áşżn Îąthalassemia). TĂšy theo sáť&#x2018; lưᝣng gen Ä&#x2018;áť&#x2122;t biáşżn sáş˝ cĂł cĂĄc biáť&#x192;u hiáť&#x2021;n báť&#x2021;nh khĂĄc nhau tᝍ nháşš Ä&#x2018;áşżn nạng nhĆ°: phĂš thai tᝍ trong b᝼ng máşš, thiáşżu mĂĄu nạng khi tráşť chĆ°a Ä&#x2018;áşżn 2 tuáť&#x2022;i, dáť&#x2026; nhiáť&#x2026;m trĂšng, suy timâ&#x20AC;Ś Ä?áť&#x2018;i váť&#x203A;i trĆ°áť?ng hᝣp mang cĂĄc bẼt thĆ°áť?ng trĂŞn Ä&#x2018;ĂŁ biáť&#x192;u hiáť&#x2021;n báť&#x2021;nh hoạc tiáť m Ẋn áť&#x; tháşż háť&#x2021; trĆ°áť&#x203A;c, sáş˝ Ä&#x2018;ưᝣc chᝧ Ä&#x2018;áť&#x2122;ng cháť&#x2030; Ä&#x2018;áť&#x2039;nh tháťąc hiáť&#x2021;n káťš thuáş­t sinh thiáşżt phĂ´i khi tháťąc hiáť&#x2021;n IVF káşżt hᝣp phân tĂ­ch, chẊn Ä&#x2018;oĂĄn DNA nháşąm láťąa cháť?n nhᝯng phĂ´i hoĂ n toĂ n khĂ´ng mang cĂĄc gen báť&#x2021;nh nĂ y, Ä&#x2018;ảm bảo cho tháşż háť&#x2021; sau kháť?e mấnh.

PGD lĂ máť&#x2122;t káťš thuáş­t tiĂŞn tiáşżn, hiáť&#x2021;n Ä&#x2018;ang Ä&#x2018;ưᝣc tháťąc hiáť&#x2021;n ráť&#x2122;ng rĂŁi trĂŞn tháşż giáť&#x203A;i vĂ tấi máť&#x2122;t vĂ i trung tâm chuyĂŞn ngĂ nh áť&#x; Viáť&#x2021;t Nam. Nhᝯng tiáşżn báť&#x2122; nhanh chĂłng trong di truyáť n háť?c phân táť­ Ä&#x2018;ang khuyáşżn khĂ­ch sáťą thay Ä&#x2018;áť&#x2022;i Ä&#x2018;ĂĄng káť&#x192; trong phĆ°ĆĄng thᝊc ngÄ&#x192;n ngᝍa cĂĄc báť&#x2021;nh di truyáť n thĂ´ng qua tiáşżn hĂ nh PGD. KhĂ´ng nhᝯng váş­y, káťš thuáş­t nĂ y còn hĆ°áť&#x203A;ng Ä&#x2018;áşżn cháť?n phĂ´i cᝊu tinh tĆ°ĆĄng hᝣp khĂĄng nguyĂŞn bấch cầu ngĆ°áť?i (HLA) váť&#x203A;i anh / cháť&#x2039; em cᝧa chĂşng Ä&#x2018;ĂŁ ra Ä&#x2018;áť?i nhĆ°ng mang báť&#x2021;nh, c᝼ tháť&#x192; sáş˝ sáť­ d᝼ng táşż bĂ o gáť&#x2018;c mĂĄu cuáť&#x2018;ng ráť&#x2018;n tᝍ nhᝯng phĂ´i cᝊu tinh nĂ y. Tuy nhiĂŞn, m᝼c Ä&#x2018;Ă­ch nĂ y vẍn còn Ä&#x2018;ang vẼp phải nhiáť u tranh cĂŁi Ä&#x2018;ấo Ä&#x2018;ᝊc khi Ä&#x2018;ᝊa tráşť ra Ä&#x2018;áť?i sau cháť&#x2030; Ä&#x2018;ưᝣc xem lĂ máť&#x2122;t cĂ´ng c᝼.

BĂŞn cấnh Ä&#x2018;Ăł, lÄŠnh váťąc IVF gĂłp phần tấo nĂŞn váş­t liáť&#x2021;u di truyáť n cung cẼp cho PGD, Ä&#x2018;Ăł chĂ­nh lĂ cĂĄc táşż bĂ o phĂ´i Ä&#x2018;ưᝣc sinh thiáşżt. Giai Ä&#x2018;oấn phĂ´i nang hiáť&#x2021;n nay Ä&#x2018;ang lĂ nguáť&#x201C;n thu DNA táşż bĂ o váť&#x203A;i nhᝯng Ć°u Ä&#x2018;iáť&#x192;m nhĆ°: cháť&#x2030; lẼy Ä&#x2018;i máť&#x2122;t vĂ i táşż bĂ o lĂĄ nuĂ´i phĂ´i (TE), nhᝯng táşż bĂ o nĂ y sáş˝ khĂ´ng tấo thĂ nh thai nhi vĂ do Ä&#x2018;Ăł, giảm rᝧi ro cᝧa sinh thiáşżt ảnh hĆ°áť&#x;ng Ä&#x2018;áşżn khả nÄ&#x192;ng phĂĄt triáť&#x192;n cᝧa phĂ´i hĆĄn cĂĄc giai Ä&#x2018;oấn trĆ°áť&#x203A;c Ä&#x2018;Ăł. NgoĂ i ra, cĂł rẼt nhiáť u táşż bĂ o áť&#x; giai Ä&#x2018;oấn nĂ y nĂŞn sáş˝ cĂł nhiáť u hĆĄn máť&#x2122;t táşż bĂ o cĂł tháť&#x192; Ä&#x2018;ưᝣc lẼy ra. XĂŠt nghiáť&#x2021;m trĂŞn c᝼m nháť? táşż bĂ o váť&#x203A;i nhau lĂ m tÄ&#x192;ng cĆĄ háť&#x2122;i phĂĄt hiáť&#x2021;n bẼt káťł tháť&#x192; khảm nĂ o tháť&#x192; hiáť&#x2021;n áť&#x; mᝊc Ä&#x2018;áť&#x2122; cĂł tháť&#x192; ảnh hĆ°áť&#x;ng Ä&#x2018;áşżn thai nhi. Sinh thiáşżt sáş˝ Ä&#x2018;ưᝣc tháťąc hiáť&#x2021;n vĂ o ngĂ y thᝊ 5, vẍn còn Ä&#x2018;ᝧ tháť?i gian Ä&#x2018;áť&#x192; xĂŠt nghiáť&#x2021;m trĆ°áť&#x203A;c khi chuyáť&#x192;n phĂ´i vĂ o ngĂ y thᝊ 6. NgoĂ i ra, cĂł tháť&#x192; chuyáť&#x192;n phĂ´i Ä&#x2018;Ă´ng lấnh, mĂ káşżt quả cᝧa chu káťł chuyáť&#x192;n phĂ´i trᝯ tháťąc sáťą cĂł tháť&#x192; cải thiáť&#x2021;n hĆĄn nᝯa táť&#x2030; láť&#x2021; thĂ nh cĂ´ng (Schoolcraft, 2013) vĂ káşżt c᝼c lâm sĂ ng (Maheshwar, 2013). BĂŞn cấnh Ä&#x2018;Ăł, sáťą tiáşżn báť&#x2122; trong cĂĄc káťš thuáş­t chẊn Ä&#x2018;oĂĄn di truyáť n Ä&#x2018;ĂŁ gĂłp phần Ä&#x2018;Ć°a chĂşng ta tiáşżn gần hĆĄn váť&#x203A;i viáť&#x2021;c phĂĄt hiáť&#x2021;n cĂĄc bẼt thĆ°áť?ng váť gen. Máť&#x2122;t cuáť&#x2122;c cĂĄch mấng trong cĂ´ng ngháť&#x2021; giải trĂŹnh táťą báť&#x2122; gen, Ä&#x2018;ĂŁ Ä&#x2018;Ăłng

Ứng dụng PGD tại IVFMD: hiện trạng và xu hướng trong lĩnh vực thụ tinh ống nghiệm

41

góp rất lớn trong PGD hiện tại chính là sự ra đời của kỹ thuật giải trình tự bộ gen thế hệ mới (NGS) với số lượng lớn các cặp mồi đặc hiệu trên từng NST và khả năng giải trình tự toàn bộ bộ gen. Yêu cầu lượng DNA để có thể khuếch đại là rất thấp (khoảng 1ng - 1 tế bào), do đó sẽ giúp giảm số lượng tế bào sinh thiết cần cho phân tích. Thời gian thực hiện giảm đáng kể và độ chính xác tăng cao rõ rệt.

Rõ ràng, đây là nhu cầu từ những cặp vợ chồng vô sinh đang tìm kiếm cơ hội thành công hoặc cải thiện khi quyết định điều trị IVF kết hợp sinh thiết phôi cho chẩn đoán di truyền, giảm nguy cơ đứa trẻ ra đời mang khuyết tật. PGD đã và đang có đóng góp cực kỳ quan trọng cho lĩnh vực IVF và ngược lại, IVF đưa chúng ta can thiệp gần hơn với việc ngăn chặn các đột biến di truyền xuất hiện ngay từ trong phôi. Tại IVFMD, từ năm 2016 đã bắt đầu triển khai kỹ thuật sinh thiết phôi phối hợp với trung tâm phân tích di truyền, góp phần giảm bớt gánh nặng cho không chỉ các cặp vợ chồng mà cho toàn xã hội.

QUI TRÌNH THỰC HIỆN Như vậy, trong một quy trình kết hợp PGD và IVF, các cặp vợ chồng sẽ bắt đầu với kích thích buồng trứng, thu nhận noãn, thụ tinh bằng kỹ thuật tiêm tinh trùng vào bào tương noãn (ICSI) sau khi được tư vấn về tất cả các nguy cơ. Noãn thụ tinh được nuôi cấy đến giai đoạn phôi nang (ngày 56), sau đó, DNA tế bào phôi được thu nhận bằng cách sinh thiết 3-5 tế bào TE và được vận chuyển đến công ty phân tích di truyền. Phôi được đông lạnh sau khi sinh thiết. Xét nghiệm di truyền được tiến hành nhằm tìm ra phôi không mang gen bệnh, phôi này sẽ được chuyển lại vào tử cung người mẹ, được theo dõi thai kỳ qua từng giai đoạn thông qua các kỹ thuật double test, triple test. Ở những chu kỳ thực hiện PGD cho bệnh thalassemia, các vật liệu di truyền từ tế bào phôi được tách chiết và khuếch đại tín hiệu bộ gen (WGA) đến bước đầu sang lọc loại bỏ các phôi mang bất thường lệch bội bằng kỹ thuật PGS. Sau khi xác định được các phôi nguyên bội bình thường về số lượng NST, WGA của các phôi này sẽ được tiếp tục phân tích tìm các vùng đột biến điểm α hoặc β đã được xác định từ kết quả karyotype bố mẹ trước đó bằng cách sử dụng các marker STR đặc trưng cho từng dạng đột biến đã biết. Những phôi thừa kế các đột biến của cả hai bố và mẹ sẽ không được lựa chọn cho chuyển phôi.

KẾT QUẢ Tại IVFMD, từ tháng 05/2016 đến nay, đã có 24 chu kỳ được tư vấn và điều trị TTTON kết hợp thực hiện kỹ thuật PGD từ 23 cặp vợ chồng ở thể mang gen bệnh; trong đó, có 18 cặp vợ chồng mang bất thường cấu trúc NST (chuyển đoạn tương hỗ, chuyển đoạn Robertson, thêm đoạn và đảo đoạn) sau karyotype với tiền căn sẩy thai liên tiếp hoặc thất bại làm tổ nhiều lần và 5 cặp vợ chồng mang các đột biến gen lặn liên quan đến bệnh lý thalassemia (2 cặp mang đột biến dạng -; 3 cặp mang đột biến dạng -β). Ngoài ra, trong đó có 1 cặp vợ chồng thực hiện 2 chu kỳ với mục đích tìm phôi không mang đột biến dạng -β và tương hợp HLA với con đầu mắc bệnh β-thalassemia thể nặng, riêng đối với trường hợp này thì không tìm được phôi nào tương hợp HLA với đứa trẻ trước đó.

Bảng 1. Đặc điểm nền và thông tin phôi học của nhóm bệnh thực hiện IVF + PGD Bất thường cấu trúc (n = 18)

Thalassemia (n = 6)

Nhóm chỉ định PGD (n = 24)

Tuổi (năm)

32,44  3,99

29,17  0,75

31,62  3,74

Thời gian vô sinh (năm)

3,56  2,23

3,00  1,79

3,42  2,10

Đặc điểm nền

Số chu kỳ IVF (%): 

1

77,8

83,3

79,2



2

5,6

16,7

8,3



3

16,7

-

12,5

Số trứng (n)

17,28  10,20

18,17  10,93

17,50  10,15

Số trứng ICSI (n)

13,67  8,00

16,67  10,84

14,42  8,64

Tỉ lệ thụ tinh (%)

87,32

94,84

89,20

Tỉ lệ tạo phôi nang (%)

40,16

56,23

44,18

Bảng 2. Kết quả phân tích di truyền trên phôi của nhóm bệnh mang bất thường cấu trúc NST Kết quả

n = 72

Thể nguyên bội (%)

58,3 (42/72)

Thể bất thường cấu trúc

9,7 (7/72)

Thể lệch bội (%):

27,7 (20/72)



Phức hợp (%)

55 (11/20)



Thể tam bội (%)

15 (3/20)



Thể đơn bội (%)

30 (6/20)

Không tín hiệu (%)

1,4 (1/72)

Thể khảm (%)

2,8 (2/72)

Ứng dụng PGD tại IVFMD: hiện trạng và xu hướng trong lĩnh vực thụ tinh ống nghiệm

43

Bảng 3. Kết quả phân tích di truyền trên phôi của nhóm bệnh mang đột biến thalassemia Kết quả phân tích bất thường số lượng NST

n = 37

Thể nguyên bội (%)

78,4 (29/37)

Thể lệch bội (%):

21,6 (8/37)



Phức hợp (%)

12,5 (1/8)



Thể tam bội (%)

50 (4/8)



Cấu trúc (%)

25 (3/8)

Kết quả phân tích bất thường đột biến thalassemia

n = 29

Không đột biến dạng đồng hợp tử trội (%)

34,5 (10/29)

Mang đột biến dạng dị hợp tử lặn (%)

62,0 (18/29)

Có đột biến dạng đồng hợp tử lặn (%)

3,45 (1/29)

Bảng 4. Kết quả lâm sàng ở những chu kỳ PGD chuyển phôi đông lạnh PGD (n = 18)

Bất thường cấu trúc (n = 16)

Thalassemia (n = 2)

Số phôi chuyển (n)

1,28

1,31 (21/16)

1,00 (2/2)

Tỉ lệ beta dương (%)

61,1 (11/18)

62,5 (10/16)

50,0 (1/2)

Tỉ lệ thai lâm sàng (%)

61,1 (11/18)

62,5 (10/16)

50,0 (1/2)

Tỉ lệ đa thai (%)

5,6 (1/18)

6,2 (1/16)

-

Tỉ lệ sẩy thai (%)

11,1 (2/18)

12,5 (2/16)

-

Tỉ lệ thai diễn tiến (%)

50,0 (8/16)

50,0 (8/16)

50,0 (1/2)

Tỉ lệ làm tổ (%)

52,2 (12/23)

52,38 (11/21)

50,0 (1/2)

Tỉ lệ trẻ sinh sống (%)

33,3 (4/12)

33,3 (4/12)

-

Kết quả

KẾT LUẬN Đây là những số liệu đầu tiên về kết quả lâm sàng thực hiện IVF kết hợp PGD tại trung tâm của chúng tôi trên nhóm đối tượng các bệnh nhân mang các bất thường cấu trúc trên NST và đột biến gen liên quan đến bệnh lý thalassemia. Đã có bốn em bé được sinh ra cho đến nay, tất cả bé đều khỏe mạnh, cho thấy độ tin cậy của kỹ thuật NGS cũng như sự an toàn của sinh thiết phôi nang

và qui trình đông lạnh phôi. Điều này cho thấy IVF - PGD - NGS có thể áp dụng cho quần thể có nguy cơ cao về bệnh di truyền, chẳng hạn như chuyển đoạn Robertsonian hoặc các đột biến đơn gen liên quan đến các bệnh lý nghiêm trọng cho thế hệ sau.

TÀI LIỆU THAM KHẢO 1.

Bouljenkov V (1994). Epidemiology of haemoglobinopathies. In WHO Regional Working Group on the Prevention and Control of Thalassemia in Asia, Bangkok, Thailand.

2.

De Rycke M, Goossens V, Kokkali G, Meijer-Hoogeveen M, Coonen E, Moutou C (2017). ESHRE PGD Consortium data collection XIV– XV: cycles from January 2011 to December 2012 with pregnancy follow-up to October 2013. Human Reproduction; 1974-94.

3.

Harper J, Coonen E, De Rycke M, Harton G, Moutou C, Pehlivan T, Traeger-Synodinos J, Van Rij M, Goossens V (2010). ESHRE PGD consortium data collection X: Cycles from January to December 2007 with pregnancy follow-up to October 2008. Hum Reprod.

4.

Harton GL, De Rycke M, Fiorentino F, Moutou C, SenGupta S, Traeger-Synodinos J, & Harper JC (2011). European Society for Human Reproduction and Embryology (ESHRE) PGD Consortium. ESHRE PGD consortium best practice guidelines for amplification-based PGD. Hum Reprod; 26(1),33-40.

5.

Harton GL, Harper JC, Coonen E, Pehlivan T, Vesela K, & Wilton L (2010). ESHRE PGD consortium best practice guidelines for fluorescence in situ hybridization-based PGD.Human Reproduction; 26(1),25-32.

6.

Maheshwar, A, Pandey S, Shetty A, Hamilton M, Bhattacharya S (2012). Obstetric and perinatal outcomes in singleton pregnancies resulting from thetransfer of frozen thawed versus fresh embryos generated through in vitrofertilization treatment: a systematic review and meta-analysis. Fertil Steril; 98(2):368-77.e1-9.

7.

Schoolcraft WB, Katz-Jaffe MG (2013). Comprehensive chromosome screeningof trophectoderm with vitrification facilitates elective single-embryo transfer forinfertile women with advanced maternal age. Fertil Steril; 100(3):615-19.

8.

Scriven PN, Ogilvie CM (2014). PGD for sex determination and chromosome rearrangements: FISH and emerging technologies.

In Preimplantation Genetic Diagnosis in Clinical Practice (65-81). Springer London.

Sinh thiết phôi ngày 4: mô hình tương lai

45

SINH THIẾT PHÔI NGÀY 4: MÔ HÌNH TƯƠNG LAI Nguyễn Nữ Hải Long, Mai Kim Châu, Lâm Sơn Bích Trâm, Vũ Đình Tuân Bệnh viện Hùng Vương

TỔNG QUAN Kỹ thuật chẩn đoán và sàng lọc di truyền tiền làm tổ (preimplantation genetic diagnostic – PGD và preimplantation genetic screening – PGS) ngày nay đóng một vai trò rất lớn trong kỹ thuật hỗ trợ sinh sản, đặc biệt đối với một số đối tượng bệnh nhân thất bại làm tổ nhiều lần, sẩy thai liên tiếp, có những bệnh di truyền đơn gen, bệnh di truyền liên quan đến nhiễm sắc thể giới tính. Với nhu cầu ngày càng gia tăng, sinh thiết phôi để chẩn đoán và sàng lọc di truyền tiền làm tổ trở thành kỹ thuật không thể thiếu đối với một trung tâm hỗ trợ sinh sản. Có nhiều giai đoạn để thực hiện sinh thiết như: sinh thiết thể cực, sinh thiết phôi giai đoạn phân cắt (phôi ngày 3) và sinh thiết phôi nang (phôi ngày 5). Trong đó, sinh thiết thể cực và sinh thiết phôi ngày 3 có những bất lợi đã được chứng minh là không đáp ứng nhu cầu sàng lọc; vì vậy, các trung tâm đang chuyển dần sang sinh thiết phôi giai đoạn ngày 5.

Các ưu điểm vượt trội của sinh thiết phôi ngày 5 là số tế bào sinh thiết nhiều hơn trong sinh thiết phôi ngày 3, tế bào sinh thiết là tế bào trophectoderm (TE) với kỳ vọng không ảnh hưởng đến sự phát triển trẻ sau này; tỉ lệ lệch bội trong phôi ngày 5 thấp hơn. Tuy nhiên, không phải phôi nào cũng chạm đến giai đoạn phôi nang, từ đó, tăng khả năng hủy chu kỳ do ít phôi; hay thời điểm để các phôi chạm được giai đoạn ngày 5 không giống nhau, dẫn đến bỏ sót các phôi không chạm được đến giai đoạn ngày 5 nhưng vẫn có khả năng mang thai và sinh sống. Về mặt kỹ thuật, việc sinh thiết phôi ngày 5 tương đối phức tạp, một số tế bào không được nguyên vẹn do phải sử dụng tia laser để cắt đứt các liên kết tế bào. Ngoài ra, nếu sinh thiết phôi nang, toàn bộ phôi phải đông lại dẫn đến tăng chi phí đông phôi, bệnh nhân phải chờ đến chu kỳ sau mới được chuyển phôi. Vậy giải pháp nào cho các hạn chế được nêu trên?

Sinh thiết giai đoạn phôi dâu (phôi ngày 4) đã được nghiên cứu từ năm 1990 trên chuột; khẳng định sinh thiết phôi giai đoạn morula sẽ giảm sức sống của phôi chuột (Krzyminska và cs., 1990).

Tuy nhiên, một nghiên cứu khác trên bò năm 2010, lại cho ra kết quả khá đối lập, sinh thiết phôi giai đoạn morula là tốt nhất (Abolfazl và cs., 2010). Một kết quả khác năm 2014, khẳng định qui trình sinh thiết phôi ngày 4 không tác động xấu trên phát triển phôi in vitro và in vivo (Nagashima và cs., 1989); có thể gia tăng số lượng tế bào phôi sinh thiết để thực hiện sàng lọc di truyền và bệnh nhân có đủ thời gian để chuyển phôi tươi ngày 5 / ngày 6.

Khoa Hiếm muộn, Bệnh viện Hùng Vương trong những tháng cuối năm 2017 và đầu năm 2018, sau khi tiến hành thực hiện sinh thiết một số phôi ngày 4 và chẩn đoán di truyền tiền làm tổ bằng máy giải trình tự gen thế hệ mới NGS; đã cho ra kết quả tương đối khả quan. Tất cả các phôi sinh thiết đều không thoái hóa sau quá trình sinh thiết, phát triển tiếp và có kết quả di truyền; 30% trong số đó cho kết quả nhiễm sắc thể bình thường. Tuy vẫn còn trong giai đoạn thử nghiệm với số lượng phôi còn khiêm tốn, nhưng chúng tôi hi vọng sẽ cho kết quả tốt hơn trong thời gian sớm nhất và đưa mô hình sinh thiết phôi ngày 4 trở thành mô hình sinh thiết phôi trong tương lai.

CÁC GIAI ĐOẠN SINH THIẾT VÀ KỸ THUẬT SINH THIẾT Có nhiều nguồn sinh thiết để thực hiện PGD / PGS: sinh thiết thể cực, sinh thiết phôi phân cắt, sinh thiết phôi nang. Chọn lựa nguồn sinh thiết và ngày thích hợp đòi hỏi sự kết hợp của các yếu tố sau: 

Thời điểm sinh thiết cho kết quả chẩn đoán và sàng lọc bất thường của phôi một cách chính xác.



Bất thường được xác định phản ánh đúng tình trạng bất thường của phôi.



Việc chẩn đoán không ảnh hưởng đến việc chọn lựa phôi để chuyển.



Qui trình sinh thiết không gây tổn hại cho phôi.

Sinh thiết thể cực Thể cực thứ nhất sẽ được lấy ra từ trứng và thể cực thứ hai từ hợp tử (hoặc cả hai thể cực sẽ được sinh thiết từ hợp tử). Vì thể cực không đóng vai trò nhiều trong sự phát triển của phôi nên gần như việc sinh thiết sẽ không gây tổn hại lên phôi. Bên cạnh thuận lợi là phân tích di truyền đủ thời gian để thực hiện trước khi chuyển phôi, yếu tố về y đức cũng được chấp nhận hơn ở một số quốc gia như Đức, Ý.

Sinh thiết phôi ngày 4: mô hình tương lai

47

Hình 1. Sinh thiết thể cực: (A) Quan sát rõ 2 thể cực của hợp tử; (B) Tạo lỗ mở trên màng zona bằng laser; (C) Hút lấy 2 thể cực; (D) Thể cực sau khi được sinh thiết Tuy nhiên, sinh thiết thể cực có những giới hạn sau: (1) PB có thể phân mảnh, kỹ thuật sinh thiết phức tạp và cần có 2 PB để phân tích chính xác; (2) không đánh giá được sự góp phần gen từ người cha trong quá trình phát triển phôi. Chỉ đánh giá được những bệnh do mẹ di truyền như bệnh do tính trạng trội hay bệnh di truyền liên kết với giới tính X (Geraedts và cs., 2011; Christopikou và cs., 2013). Bệnh do tính trạng trội chỉ đánh giá được một phần và thường kèm theo sinh thiết phôi giai đoạn phân cắt; (3) ứng dụng chủ yếu để phát hiện những bất thường từ mẹ hoặc chuyển đoạn trong trứng (Geraedts và cs., 2011; Christopikou và cs., 2013); (4) không thể phát hiện lỗi từ quá trình phân bào (mosaic and chaotic embryos).

Sinh thiết giai đoạn phôi phân cắt (phôi ngày 3) Sinh thiết phôi giai đoạn phân cắt được thực hiện tại giai đoạn phôi ngày 3. Đây là kỹ thuật tương đối đơn giản, được thực hiện lâu đời nhất và sử dụng rộng rãi cho PGS / PGD. Quá trình sinh thiết sẽ lấy 1-2 tế bào từ phôi 6-8 tế bào; những bất thường có nguồn gốc từ cha hoặc mẹ đều có thể phát hiện; thời gian phân tích di truyền cho phép theo dõi sự phát triển của phôi và bệnh nhân có thể được chuyển phôi tươi.

Hình 2. Sinh thiết phôi ngày 3: (A) Tạo lỗ mở màng zona; (B) Lựa chọn tế bào rõ nhân; (C) Hút tế bào ra khỏi phôi; (D) Tế bào được sinh thiết Chọn lựa ngày để chuyển phôi sau khi sinh thiết phôi ngày 3 cũng rất quan trọng, phôi có thể chuyển ở giai đoạn phôi dâu, nén hoặc phôi nang. Do quá trình sinh thiết phải tạo lỗ mở trên màng zona, nên khi thao tác trên phôi cũng cần phải thận trọng.

Sinh thiết phôi ngày 3 có những bất lợi sau: (1) sinh thiết phôi ngày 3 gây tổn hại đến quá trình phát triển của phôi và chất lượng phôi ngày 5 cũng như quá trình phát triển lâm sàng sau đó với tỉ lệ làm tổ có thể giảm 30-50% (Scott và cs., 2013); (2) chỉ sinh thiết và phân tích một tế bào.

Tăng nguy cơ chẩn đoán dương tính giả. Vì chỉ có một tế bào được phân tích; nếu có vấn đề trên một tế bào (ví dụ thể khảm), kết quả không biểu hiện chính xác phần còn lại của phôi; (3) nếu phôi phát triển chậm, việc sinh thiết có thể bị hủy.

Sinh thiết phôi ngày 5 Sinh thiết phôi ngày 5 (sinh thiết phôi nang) hiện nay được xem là kỹ thuật có nhiều ưu điểm nhất so với sinh thiết thể cực và sinh thiết phôi ngày 3. Với việc chỉ lấy một phần nhỏ của phôi nang (5-10 tế bào từ khối trophectoderm), không gây ảnh hưởng đến chất lượng phôi; nhưng số lượng vật liệu di truyền cho phân tích nhiều hơn so với sinh thiết phôi ngày 3 (chỉ 1 tế bào) dẫn đến sai sót do kỹ thuật sẽ ít hơn (thất bại khuếch đại hay tế bào không có nhân). Ngoài ra, tỉ lệ lệch bội trên phôi nang cũng đã được chứng minh là thấp hơn phôi phân cắt (Forman và cs., 2011; Yang và cs., 2012; Forman và cs., 2013; Scott và cs., 2013).

Sinh thiết phôi ngày 4: mô hình tương lai

49

Hình 3. Sinh thiết phôi nang: (A) Phôi nang thoát màng một phần thông qua lỗ mở màng zona được tạo từ ngày 3 hoặc ngày 4; (B) Hút một phần TE; (C) Tia laser cắt đứt liên kết tế bào; (D) Một cụm tế bào sau sinh thiết Hạn chế của sinh thiết phôi ngày 5: (1) không phải tất cả phôi đều chạm được đến giai đoạn phôi nang (< 50%); (2) ít phôi phân tích, tăng nguy cơ hủy chu kỳ; (3) phôi không chạm đến giai đoạn phôi nang vẫn có thể có thai và sinh sống; (4) thời gian phân tích di truyền bị hạn chế, đặc biệt với những trung tâm phải gửi mẫu cho một đơn vị trung gian đọc kết quả di truyền, bệnh nhân không thể chuyển phôi tươi; (5) kỹ thuật sinh thiết phức tạp, màng tế bào bị phá vỡ do sử dụng tia laser cắt đứt liên kết tế bào.

Sinh thiết giai đoạn phôi dâu (phôi ngày 4) Sinh thiết giai đoạn phôi dâu không được chấp nhận trong lịch sử Tương tự như sinh thiết giai đoạn phôi phân cắt (phôi ngày 3), phôi dâu cũng chưa chạm đến giai đoạn nén và tạo khoang, nên nguy cơ của giai đoạn sinh thiết này là lấy phải tế bào từ khối ICM (inner cell mass). Nghiên cứu trước đây trên chuột, Krzyminska và cộng sự (1990) đã khẳng định sinh thiết phôi dâu sẽ làm giảm ý nghĩa khả năng phát triển của phôi.

Chứng cứ ủng hộ cho sinh thiết giai đoạn phôi dâu Ngày càng nhiều nghiên cứu hơn đang ủng hộ cho quan điểm sinh thiết giai đoạn phôi dâu vì những lợi ích mang lại từ kỹ thuật này. Đầu tiên, Abolfazl S và cộng sự (2010) khẳng định giai đoạn phôi dâu là giai đoạn tốt nhất để sinh thiết phôi ở bò. Nghiên cứu tiếp theo của Caroline De Parpe và cộng sự (2013) đã có những thí nghiệm phân tích chi tiết về tính toàn năng của những tế bào từ khối TE, cho thấy chúng hoàn toàn có thể phát triển thành một phôi nang hoàn chỉnh có đầy đủ cả hai khối TE và ICM.

Nghiên cứu được thực hiện như sau: tác giả lấy tế bào TE ở những thời điểm khác nhau của phôi nang loại 4; phân lập và đặt vào trong màng zona trống và theo dõi phát triển sau hai ngày. Phát hiện của nghiên cứu: TE có thể sản sinh ra khối ICM đẹp; chúng trở thành phôi nang có khối ICM loại A. Điều này có ý nghĩa là khi lấy ra TE ra ngoài tín hiệu và tính toàn vẹn tế bào vẫn có thể tái tạo lại.

Hình 4. Mô hình thí nghiệm: (A) Phôi nang được đưa về tình trang trước nén và tái tạo khoang. Hút những phôi bào bên ngoài và tái xắp xếp vào bên trong màng zona, thể hiện huỳnh quang với NANOG; (B) Loại màng zona, tế bào bên ngoài được đánh dấu và đặt trong màng zona trống, thể hiện huỳnh quang với NANOG; (C) Phôi nang được đưa về tình trạng trước nén và tái tạo khoang. Những tế bào bên ngoài sẽ được đặt vào trung tâm của phôi không trở về vị trí ban đầu mà sẽ tái sắp xếp trong ICM và bắt đầu biểu hiện NANOG Một nghiên cứu khác đến từ Elena E Zakharova và cộng sự (2014), tác giả thực hiện sinh thiết giai đoạn phôi dâu, chứng minh hiệu quả trên 215 chu kỳ IVF / ICSI. Những số liệu cho thấy sinh thiết giai đoạn phôi dâu không ảnh hưởng đến sự phát triển của phôi, với 709 phôi được sinh thiết; trong đó, 645 phôi đạt đến giai đoạn phôi nang (90%); không có khác biệt tỉ lệ sinh sống giữa thực hiện sinh thiết và không thực hiện sinh thiết.

Khi so sánh tỉ lệ lệch bội và tỉ lệ có thai giữa sinh thiết giai đoạn phôi dâu và giai đoạn phôi nang, D Zander-Fox và cộng sự trong một báo cáo Aspire, Brisbane (2014) cho rằng không có sự khác biệt có ý nghĩa về tỉ lệ lệch bội giữa 2 nhóm phôi: 77,6% (phôi ngày 4) và 81% (phôi ngày 5). Tỉ lệ có thai giữa hai nhóm cũng không khác biệt có ý nghĩa: 43,5% (phôi ngày 4) và và 35,7% (phôi ngày 5). Kết luận của tác giả là sinh thiết ngày 4 không tác động lên sức sống của phôi và có thể được cân nhắc lựa chọn thay thế cho sinh thiết ngày 3 hay ngày 5 / 6.

Sinh thiết phôi ngày 4: mô hình tương lai

51

Khía cạnh kỹ thuật trong sinh thiết giai đoạn phôi dâu Sàng lọc di truyền tiền làm tổ được thực hiện thường qui trong điều trị IVF. Nếu như sinh thiết phôi 6-8 tế bào (phôi ngày 3) hoặc sinh thiết phôi nang (sinh thiết trophectoderm) được thực hiện thành công (Fasouliotis và cs., 1998; Swanson và cs., 2007); sinh thiết phôi dâu được xem như là không thể vì các tế bào trở nên nén và dính lại với nhau làm cho quá trình sinh thiết trở nên khó khăn (Findlay, 2000). Ở người, liên kết tế bào trong quá trình nén là do uvomorulin (E-cadherin)  một glycoprotein kết dính tế bào phụ thuộc canxi xuyên màng, neo với khung xương tế bào thông qua chất catenin (Kobielak và Fuchs, 2004; Alikani, 2005).

Môi trường không có Ca2+ có thể được sử dụng để giải nén phôi dâu, việc thay đổi cấu hình chỉ xảy ra với E-cadherin ngoại bào. Sẽ không có sự phá vỡ tính chất kết dính của E-cadherin và liên kết mới sẽ được hình thành nếu bổ sung lại Ca2+ (Pey và cs., 1998). Nhờ môi trường không có Ca2+; quá trình sinh thiết phôi dâu cho phân tích di truyền trở nên dễ dàng hơn và quá trình nén xuất hiện trở lại sau 2-3 giờ sinh thiết.

Hình 5. Sinh thiết giai đoạn phôi dâu: (A) Phôi dâu trước khi sinh thiết; (B-G) Các bước của quá trình sinh thiết; (H) Phôi 2 giờ sau sinh thiết

KINH NGHIỆM SINH THIẾT PHÔI DÂU TẠI BỆNH VIỆN HÙNG VƯƠNG Tại Bệnh viện Hùng Vương, việc sinh thiết và sàng lọc di truyền đều được tiến hành trên phôi hiến tặng, có chữ ký xác nhận của cả hai vợ chồng cho quá trình thử nghiệm. 

Phôi ngày 3 được rã và nuôi cấy lên ngày 4.



Tiến hành sinh thiết phôi ngày 4: lấy 2-5 tế bào và gửi đi phân tích di truyền.



Theo dõi sự phát triển tiếp theo của phôi.



Ghi nhận kết quả di truyền.

Kết quả bước đầu như sau: 

Toàn bộ phôi đều sống và có kết quả di truyền sau sinh thiết.



Tỉ lệ phôi cho kết quả di truyền bình thường là 30%; các phôi này đều phát triển đến ngày 5 và ngày 6.



Việc sinh thiết phôi ngày 4 không ảnh hưởng đến tiềm năng phát triển của phôi.

Với kết quả ban đầu, cho thấy rằng việc sinh thiết phôi ngày 4 hoàn toàn có thể trở thành lựa chọn thay thế cho sinh thiết phôi ngày 5 với kỹ thuật sinh thiết khá phức tạp, do phải chờ kết quả di truyền nên không thể chuyển phôi tươi. Cần có thêm thời gian và nghiên cứu nhiều hơn để khẳng định mạnh mẽ tính hiệu quả; tuy nhiên, chúng tôi nhận thấy mô hình sinh thiết phôi ngày 4 có thể trở thành mô hình tương lai trong việc chẩn đoán và sàng lọc di truyền tiền làm tổ.

TÀI LIỆU THAM KHẢO 1.

Abolfazl S, Sara B, Hassan N, Ebrahim A, Banafsheh H et al. (2010). Effects of Timing on Cell Biopsy from Precompacted Morula Stage Bovine Embryos on Subsequent Embryonic Development. J Reprod Infertil; 11:25-32.

2.

Alikani M (2005). Epithelial cadherin distribution in abnormal human preimplantation embryos. Hum Reprod; 20:3369-75.

3.

Caroline De Paepe, Greet Cauffman et al. (2012). Human trophectoderm cells are not yet committed. Human Reproduction; 740-9.

4.

Christopikou D, Tsorva E, Economou K et al. (2013). Polar body analysis by array comparative genomic hybridization accurately predicts aneuploidies of maternal meiotic origin in cleavage stage embryos of women of advanced maternal age. Hum Reprod; 1426-34.

5.

Elena EZ, Victoria VZ, Alexander SK (2014). Biopsy of human morulae-stage embryos: outcome of 215 IVF/ICSI cycles with PGS. PLOS One; 9: e106433.

6.

Fasouliotis SJ, Schenker JG (1998). Preimplantation genetic diagnosis principles and ethics. Hum Reprod; 13:2238-45.

7.

Findlay I (2000). Pre-implantation genetic diagnosis. Br Med Bull; 56:672-90.

8.

Forman EJ, Ferry KM, Gueye NA, Smith RD, Stevens J, Scott RT Jr (2011). Trophectoderm biopsy for single-gene disorder preimplantation genetic diagnosis (PGD) is signifcantly more reliable than day 3 blastomere biopsy. Fertil Steril; S222.

9.

Forman EJ, Hong KH, Ferry KM et al. (2013). In vitro fertilization with single euploid blastocyst transfer: a randomized controlled trial. Fertil Steril; 100-7.

10.

Geraedts J, Montag M, Magli MC et al. (2011). Polar body array CGH for prediction of the status of the corresponding oocyte. Part I: clinical results. Hum Reprod; 3173-80.

11.

Kobielak A, Fuchs E (2004). Alpha-catenin: at the junction of intercellular adhesion and actin dynamics. Nat Rev Mol Cell Biol; 5:614–25.

12.

Krzyminska UB, Lutjen J, O’Neill C (1990). Assessment of the viability and pregnancy potential of mouse embryos biopsied at different preimplantation stages of development. Hum Reprod; 5:203-8.

13.

Nagashima H, Kato Y, Ogawa S (1989). Microsurgical bisection of porcine morulae and blastocysts to produce monozygotic twin pregnancy. Gamete Res; 23:1-9.

14.

Pey R, Vial C, Schatten G, Hafner M (1998). Increase of intracellular Ca2+ and relocation of E-cadherin during experimental decompaction of mouse embryos. Proc Natl Acad Sci USA; 95:12977-82.

15.

Scott RT Jr, Upham KM, Forman EJ, Zhao T, Treff NR (2013). Cleavage-stage biopsy signifcantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial. Fertil Steril; 624-30.

Sinh thiết phôi ngày 4: mô hình tương lai

16.

53

Scott RT, Upham KM, Forman EJ et al. (2013). Blastocyst biopsy with comprehensive chromosome screening and fresh embryo transfer signifcantly increases in vitro fertilization implantation and delivery rates: a randomized controlled trial. Fertil Steril; 697-703.

17.

Swanson A, Strawn E, Lan E, Bick D (2007). Preimplantation genetic diagnosis: technology and clinical applications. Wis Med J; 106:145-51.

18.

Yang Z, Liu J, Collins GS et al. (2012). Selection of single blastocysts for fresh transfer via standard morphology assessment alone and with array CGH for good prognosis IVF patients: results from a randomized pilot study. Mol Cytogenet; 24.

Qui trình sinh thiết phôi ngày 5 và một số vấn đề lưu ý

________________________

QUI TRÌNH SINH THIẾT PHÔI NGÀY 5 VÀ MỘT SỐ VẤN ĐỀ LƯU Ý

________________________ ________________________

Võ Nguyên Thức Bệnh viện Mỹ Đức

________________________ ________________________ ________________________ 1

Nội dung trình bày

________________________ 

Sinh thiết phôi ngày 5.



Những yêu cầu của kỹ thuật.



Qui trình sinh thiết.



Một số vấn đề cần lưu ý.

________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________ 2

SINH THIẾT PHÔI NGÀY 5

________________________ 

Chọn lọc phôi tiềm năng phát triển đến ngày 5 (N5) (50-60%): •

Kết quả phân tích trên nhiều tế bào.

•

Tăng khả năng phát hiện thể khảm.



Dễ xác định hơn giữa TE và phân mảnh.



Giảm thiểu sự ảnh hưởng đến sự phát triển của phôi.

•

________________________ ________________________ ________________________

Chỉ sinh thiết một phần nhỏ của phôi.

________________________ ________________________ 3

55

NHỮNG YÊU CẦU CỦA KỸ THUẬT

________________________ Trang thiết bị Labo di truyền

________________________ Tỉ lệ tạo phôi N5

________________________ ________________________

Quản lý rủi ro

Trữ phôi N5

________________________

Kỹ thuật thao thác

________________________ 4

NHỮNG YÊU CẦU CỦA KỸ THUẬT

________________________ 

Trang thiết bị, dụng cụ

________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________ 5

NHỮNG YÊU CẦU CỦA KỸ THUẬT

________________________ 

Khẩu trang và mũ.



Áo thủ thuật.



Găng tay không bột.

________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________ 6

Qui trình sinh thiết phôi ngày 5 và một số vấn đề lưu ý

QUI TRÌNH SINH THIẾT

________________________ ________________________

Chuẩn bị môi trường

Chọn phôi N5

________________________ Hỗ trợ thoát màng

Rã phôi N5

Rã phôi N3, nuôi và chọn phôi N5

Chuẩn bị môi trường

Sinh thiết

Trữ phôi

________________________

Chuẩn bị môi trường

116 giờ ± 1

________________________

119 giờ ± 1

Trữ ngay

________________________ 7

QUI TRÌNH SINH THIẾT

________________________ 

Chọn phôi sinh thiết.

________________________ ________________________ ✖

________________________

✖

✖

________________________ ________________________ ✔

✖

✔

8

QUI TRÌNH SINH THIẾT

________________________ 

Hỗ trợ thoát màng.

Cơ học

________________________

Laser

________________________ ________________________ ________________________ ________________________ 9

57

QUI TRÌNH SINH THIẾT

________________________ 



Môi trường: • PBS 1% PVS (pha 0,5mL PBS 20x, 1mL 10% PVP và 8,5mL nước khử trùng và loại nuclease).

• Môi trường nuôi cấy phôi (Global Total LP).

• PVP (Lifeglobal).

Chuẩn bị đĩa.

________________________ ________________________

yExP-MD

Y

________________________

MĐ-PxEy

Môi trường nuôi cấy

PVP

________________________

PBS Môi trường nuôi cấy Đĩa sinh thiết

________________________ Đĩa rửa tế bào

10

Kỹ thuật sinh thiết

________________________ 

Cắt tế bào bằng kim.

________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________ 11

Kỹ thuật sinh thiết

________________________ 

Laser kết hợp với lực kéo cơ học.

________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________ 12

Qui trình sinh thiết phôi ngày 5 và một số vấn đề lưu ý

Kỹ thuật sinh thiết

________________________ 

Rửa tế bào (tubing).

________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________ 13

Kỹ thuật sinh thiết

________________________ 

Rửa tế bào (tubing).

________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________ 14

MỘT SỐ VẤN ĐỀ CẦN LƯU Ý

________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________ 15

59

Quản lý rủi ro

________________________ ________________________ Bản cam kết

________________________ ________________________ ________________________ Bảng kiểm qui trình

________________________ 16

Một số yếu tố ảnh hưởng đến kết quả

________________________ Khả năng

Cách khắc phục

________________________

Lây nhiễm với phôi vừa thực Thay kim (holding, Biopsy) mới hiện sinh thiết cho từng phôi Tinh trùng (IVF cổ điển)

Chỉ định ICSI khi thực hiện sinh thiết phôi

Lây nhiễm với tế bào cumulus

Tách trứng sạch

Phôi bào bị ép (extruded cells)

Loại bỏ / tránh trước khi sinh thiết

________________________ ________________________

Hạn chế laser tại cùng một Tế bào bị dính (kim sinh thiết, điểm, chọn mục tiêu bắn tại pipette, đĩa...) những điểm liên kết giữa hai tế bào

________________________ ________________________

Lưu trữ tạm ở -800C

Giao mẫu chậm

17

Một số yếu tố ảnh hưởng đến kết quả

________________________ Tế bào lysed

________________________

Tế bào nguyên vẹn

________________________ ________________________ ________________________ ________________________ 18

Qui trình sinh thiết phôi ngày 5 và một số vấn đề lưu ý

KẾT LUẬN

________________________ 

Trang thiết bị.



Hệ thống nuôi cấy ổn định.



Trữ-rã phôi N5.



Kĩ thuật (sinh thiết, rửa tế bào).



Quản lý rủi ro.

________________________ ________________________ ________________________ ________________________ ________________________ 19

61

Báo cáo trường hợp: bệnh nhân có chỉ định thực hiện xét nghiệm di truyền tiền làm tổ

63

BÁO CÁO TRƯỜNG HỢP: BỆNH NHÂN CÓ CHỈ ĐỊNH THỰC HIỆN XÉT NGHIỆM DI TRUYỀN TIỀN LÀM TỔ Nguyễn Ngọc Quỳnh(1), Mã Phạm Quế Mai(2) (1)

(2)

IVFMD, Bệnh viện Mỹ Đức

Phòng Xét nghiệm di truyền, Khoa Xét nghiệm, Bệnh viện Tân Sơn Nhất

GIỚI THIỆU Xét nghiệm di truyền tiền làm tổ là một kỹ thuật được sử dụng để xác định các khiếm khuyết di truyền trong phôi được tạo ra qua thụ tinh trong ống nghiệm trước khi mang thai. Chẩn đoán di truyền tiền làm tổ (PGD) đề cập cụ thể đến việc khi một hoặc cả hai cha mẹ có bất thường về gen di truyền và xét nghiệm được thực hiện trên phôi để xác định xem nó có mang bất thường về di truyền hay không. Ngược lại, sàng lọc di truyền tiền làm tổ (PGS) đề cập đến kỹ thuật mà các phôi được sàng lọc có nhiễm sắc thể (NST) bình thường.

PGD và PGS hiện nay đang là phương pháp lựa chọn duy nhất có sẵn để tránh nguy cơ cao về việc có một đứa trẻ mắc bệnh di truyền trước khi phôi làm tổ. Nó là một phương tiện nhằm ngăn ngừa bệnh di truyền, do đó loại bỏ tình trạng tiến thoái lưỡng nan trong việc chấm dứt thai kỳ sau chẩn đoán trước khi không thuận lợi.

Qui trình thực hiện PGD / PGS

Đặc điểm và các xét nghiệm cận lâm sàng của bệnh nhân (BN)

Tư vấn BN, chỉ định lâm sàng

Thực hiện PGS:

Thực hiện PGD:



Tuổi mẹ > 35 tuổi



Tiền sử sẩy thai liên tiếp  2 lần





Thất bại làm tổ nhiều lần với  3 lần chuyển phôi chất lượng tốt hoặc tổng  10 phôi chuyển của nhiều lần Các cặp vợ chồng đã từng có thai hoặc có con bị lệch bội số lượng NST



Cặp vợ chồng biết trước có bất thường số lượng NST như: hội chứng Down, Edwards, Patau, Trisomy X, Klinefelter, XYY, Turner



Bất thường cấu trúc NST



Các đột biến di truyền đơn gen



Bất thường liên kết NST giới tính (X-linked)



Đột biến vi mất đoạn



Phát hiện đa bội thể (3n, 4n…)

BN thực hiện IVF/ICSI, nuôi cấy phôi ngày 5 / ngày 6

Sinh thiết phôi, trữ phôi toàn bộ

Thực hiện xét nghiệm đánh giá di truyền tiền làm tổ phôi

Tư vấn chuyển phôi cho BN sau khi phân tích kết quả di truyền phôi

Có phôi với NST bình thường

Rã đông phôi, chuyển phôi

Không có phôi với NST bình thường

Tư vấn BN

Báo cáo trường hợp: bệnh nhân có chỉ định thực hiện xét nghiệm di truyền tiền làm tổ

65

BÁO CÁO TRƯỜNG HỢP Trường hợp 1: bất thường cấu trúc NST Bệnh nhân 27 tuổi, lập gia đình năm 2014, mong con 2 năm, chưa có con và đã có 2 lần thai lưu ở thời điểm thai 8 tuần. Bệnh nhân thực hiện NST đồ có kết quả 46,XX,irw (9) (p11q13) đảo đoạn vùng trung tâm trên NST 9 (pericentric inversion). Tần suất xuất hiện: 1-1,6% trong quần thể (Teo và cs., 1995). Gây bệnh: hiếm muộn, giảm khả năng sinh sản; tuy nhiên có kiểu hình bình thường. Bệnh nhân được điều trị bằng thụ tinh trong ống nghiệm và thực hiện PGD. Bệnh nhân được kích thích buồng trứng bằng phác đồ GnRH antagonist, chọc hút sau 36 giờ tiêm hCG. bệnh nhân có 30 trứng chọc hút, 27 trứng trưởng thành để tiến hành ICSI, 24 trứng thụ tinh. Phôi được nuôi cấy đến phôi ngày 5, có 15 phôi ngày 5; trong đó, có 5 phôi loại 1, 4 phôi loại 2 và 6 phôi loại 3. Tổng số 15 phôi ngày 5 được tiến hành sinh thiết phôi.

Cụm tế bào ở mỗi phôi được phân tích bằng phương pháp NGS (Illumina, Hoa Kỳ). Kết quả có 4/15 phôi bất thường NST.

Hình 1. Phát hiện phôi bất thường monosomy NST 16

Hình 2. Phát hiện phôi bất thường cấu trúc NST: -1(q32) (mất đoạn NST kích thước 48,68Mbp) Truờng hợp 2: tuổi vợ cao, sẩy thai liên tiếp Bệnh nhân 37 tuổi, lập gia đình năm 2012, có 1 lần thai lưu, 3 lần sẩy thai liên tiếp, không có bất thường NST. Tỉ lệ phôi bất thường lêch bội ở người sẩy thai liên tiếp và tuổi cao xảy ra từ 30% đến 57% (Regant và cs., 2010). Bệnh nhân được điều trị bằng thụ tinh trong ống nghiệm và thực hiện PGS.

Bệnh nhân được kích thích buồng trứng bằng phác đồ GnRH antagonist, chọc hút sau 36 giờ tiêm hCG. Bệnh nhân có 13 noãn chọc hút, 13 noãn trưởng thành để tiến hành ICSI, 13 noãn thụ tinh. phôi được nuôi cấy đến phôi ngày 5, có 9 phôi ngày 5; trong đó, có 5 phôi loại 2, 4 phôi loại 3.

Có 8 phôi ngày 5 được tiến hành sinh thiết phôi.

Cụm tế bào ở mỗi phôi được phân tích bằng phương pháp Karyolite BoBs (Perkin Elmer, Hoa Kỳ).

Kết quả có 4/8 phôi bất thường NST.

Hình 3. Phát hiện bất thường lệch bội NST: 45XO (hội chứng Turner)

Hình 4. Phát hiện bất thường lệch bội NST: trisomy 21 (hội chứng Down)

TÀI LIỆU THAM KHẢO 1.

Harton et al. (2010). ESHRE PGD consortium best practice guidelines for organization of a PGD centre for PGD/preimplantation genetic screening. Human Reproduction; Vol.00, No.0, 1-11.

2.

Regan et al. (2010). The investigation and treatment of couples with recurrent first-trimester and second-trimester miscarriage.

RCOG Green-top Guideline; No.17.

3.

Teo et al. (1995). Pericentric inversion 9 - incidence and clinical significance. Annals of the Academy of Medicine, Singapore; 24(2),302-4.