Food Safety Solutions #3 by INNOLAB

SPOILAGE ORGANISMS • PATHOGENS • GMOS • VIRUS • ALLERGENS

CULTURE MEDIA FORMATS TO SUIT EVERY LABORATORY ORIGINATED IN UNITED KINGDOM

Contact information: Thermo Fisher Scientific (Thailand) Co.,Ltd. 158/6 Aneckvanich Bldg. 6th Fl., Room B, D., Soi Sukhumvit 55, Sukhumvit Road, North Klongton, Wattana, Bangkok 10110 potchara.sungtong@thermofisher.com Tel +66 2 714 7835-6 Fax +66 2 714 7837

FOOD MICROBIOLOGY Solutions

Dehydrated Media: Principle and Backgrounds to Advance Technology Writer: POTCHARA SUNGTONG Business Manager - Thailand, Microbiology Division, Thermo Fisher Scientific potchara.sungtong@thermofisher.com

อีกในไม่กี่เดือนเรากำ�ลังจะผ่านปี 2559 ในแต่ละปี Thermo Fisher Scientific ได้พัฒนาและปรับปรุงสินค้าและบริการให้เข้ากับความ ต้องการในปัจจุบัน อย่างไรก็ตาม เราจำ�เป็นที่จะต้องทราบและเรียน รู้ถึงหลักการพื้นฐานของการตรวจเชื้อจุลินทรีย์ในอาหาร บทความใน ฉบับนี้ เราขอเสนอประวัติความเป็นมาของออกซอยด์ (Oxiod) และ หลักการพื้นฐานเบื้องต้นของอาหารเลี้ยงเชื้อชนิดผง

2016 will be ending within a few months. As each year passes, Thermo Fisher Scientific has developed and improved our services and products to serve today’s demands. However, we need to know and learn the basic principle of microbiological analysis in food. This issue, we would like to introduce history of Oxoid and principle of dehydrated media.

ความเชี่ยวชาญ

COMPETENCIES Oxoid is one of the world’s leading manufacturers and distributors of microbiological culture media and other diagnostic products. The corporate headquarters in Basingstoke, Hampshire is the main production and administrative site. Many other countries are supplied through specialist distributors. The Oxoid range of products is used in clinical and industrial laboratories to isolate and identify the bacteria or other organisms causing disease or spoilage. Microbiology solutions bring together the best in food quality and safety testing. They include market-leading molecular instrumentation, sample preparation capability and PCR technology for foodborne pathogen and quality indicator detection as well as traditional culture media and biochemical or immunological tests. With its industry insight, scientific expertise and access to market-leading technologies, the company is able to quickly develop new products and protocols.

โรงงานผลิต

PRODUCTION FACILITIES The Basingstoke factory is responsible for the manufacture of peptones (key ingredients in culture media made by enzymatic or acid hydrolysis of proteins), dehydrated culture media, antimicrobial susceptibility tests (used to decide which antibiotics will provide an effective treatment for a patient with a microbial infection) and a range of other microbiological and immunological tests and products. This necessitates the use of a wide range of production techniques and equipment capable of handling tons of peptone down to micrograms of antibody. Specialised equipment includes freeze driers, sterile filling lines and clean rooms, vacuum ovens, evaporators and spray driers.

ออกซอยด์เป็นหนึง่ ในผูน้ �ำ การผลิตและจัดจำ�หน่ายอาหารเลีย้ ง เชื้อและผลิตภัณฑ์สำ�หรับการตรวจวินิจฉัยอื่นๆ สำ�นักงานใหญ่ของ บริษัทตั้งอยู่ที่เมืองเบซิงสโตก แคว้นแฮมป์เชียร์ ซึ่งเป็นสถานที่ผลิต และสำ�นักงานหลักของฝ่ายบริหาร ส่วนการจัดจำ�หน่ายในประเทศอืน่ ๆ จะจัดการโดยตัวแทนจำ�หน่ายผูเ้ ชีย่ วชาญ ผลิตภัณฑ์ของออกซอยด์ใช้ ในห้องปฏิบตั กิ ารทางคลินกิ และอุตสาหกรรม เพือ่ การแยกและจำ�แนก แบคทีเรียหรือสิ่งมีชีวิตอื่นๆ ที่ทำ�ให้เกิดโรคหรือทำ�ให้เกิดการเน่าเสีย โซลูชันทางจุลชีววิทยามาพร้อมกับการทดสอบคุณภาพและ ความปลอดภัยของอาหารทีด่ ที สี่ ดุ ประกอบด้วยเครือ่ งมือทางโมเลคูลาร์ ความสามารถในการเตรียมตัวอย่าง และเทคโนโลยีพซี อี าร์ส�ำ หรับการ ตรวจวิเคราะห์เชื้อก่อโรคในอาหารและตัวบ่งชี้คุณภาพ ซึ่งล้วนเป็น ผู้นำ�ในตลาด รวมทั้งอาหารเลี้ยงเชื้อแบบดั้งเดิม และการทดสอบ ทางชีวเคมีและทางอิมมูโน ด้วยความรู้เชิงลึกเกี่ยวกับอุตสาหกรรม ความเชี่ยวชาญทางวิทยาศาสตร์ และเทคโนโลยีชั้นนำ�ในตลาดของ บริษัท ทำ�ให้สามารถพัฒนาผลิตภัณฑ์และวิธีการใหม่ได้อย่างรวดเร็ว โรงงานทีเ่ มืองเบซิงสโตกจะรับผิดชอบการผลิตเปปโตน (ส่วน ผสมหลักในอาการเลีย้ งเชือ้ โดยการไฮโดรไลซ์โปรตีนด้วยเอนไซม์หรือ กรด) อาหารเลี้ยงเชื้อแบบแห้ง ชุดทดสอบความไวต่อสารปฏิชีวนะ (ใช้เพื่อการตัดสินใจเลือกสารปฏิชีวนะที่จะให้การรักษาอาการติดเชื้อ ในผูป้ ว่ ยได้อย่างมีประสิทธิภาพ) และผลิตภัณฑ์และชุดทดสอบทางจุล ชีววิทยาและทางอิมมูโนอีกมากมาย การผลิตจำ�เป็นต้องใช้เทคนิคการ ผลิตและเครือ่ งมือทีห่ ลากหลายเพือ่ ให้สามารถจัดการเปปโตนปริมาณ หลายตันไปจนถึงแอนติบอดีปริมาณระดับไมโครกรัม เครื่องมือพิเศษ ได้แก่ เครื่องทำ�แห้งแบบฟรีซดราย ไลน์การบรรจุปลอดเชื้อและห้อง สะอาด เตาอบสุญญากาศ เครื่องระเหย และเครื่องสเปรย์ดราย

2 Food Safety Solutions by

ADVERTORIAL

คุณภาพ

ระบบการควบคุมและประกันคุณภาพทีเ่ ข้มงวดช่วยรับประกัน ว่าลูกค้าจะได้รบั ผลิตภัณฑ์ทเี่ ป็นไปตามรายละเอียดเฉพาะทางเทคนิค และข้อกำ�หนดที่ต้องปฏิบัติ ซึ่งสนับสนุนโดยการรับรอง ISO 9000 ที่ ออกซอยด์ได้รบั การรับรองตัง้ แต่ปี 2533 และมาตรฐานเครือ่ งมือแพทย์ ISO 13485 ที่บริษัทได้รับการรับรองเพิ่มเติมในปี 2547

การพัฒนาผลิตภัณฑ์

QUALITY A rigorous quality assurance and quality control system ensures that customers receive products meeting the technical specifications and regulatory standards required. This is backed up by the ISO 9000 registration held by Oxoid since 1990 and additional registration to ISO 13485 for medical devices since 2004.

แม้วา่ อาหารเลีย้ งเชือ้ แบบดัง้ เดิมถูกใช้มาเป็นระยะเวลานานและ ยังคงเป็นส่วนสำ�คัญในกระบวนการ ออกซอยด์น�ำ เสนอผลิตภัณฑ์ใหม่ อย่างต่อเนือ่ งเพือ่ เพิม่ ความเร็วของการแยกเชือ้ จากตัวอย่างทางคลินกิ อาหาร หรือตัวอย่างจากแหล่งอื่นๆ การเปลี่ยนแปลงพฤติกรรมการ กิน วิธีการผลิตอาหาร และสิ่งแวดล้อมทำ�ให้เชื้อจุลินทรีย์บางชนิดมี ความสำ�คัญยิ่งขึ้น เช่น Listeria, E. coli O157, Salmonella และ Legionella ผลิตภัณฑ์ออกซอยด์พัฒนาเพื่อการตรวจสอบจุลินทรีย์ เหล่านี้ในฐานะส่วนหนึ่งของการสาธารณสุข ผลิตภัณฑ์ที่เพิ่งวางตลาดไปประกอบด้วยอาหารเลี้ยงเชื้อที่ แสดงสี (Chromogenic) ในการตรวจสอบเชือ้ ก่อโรคในอาหาร ได้แก่ Oxoid Aura Image เครื่องอ่านสีอัตโนมัติเพื่อการทดสอบเนื้อเยื่อ ทางคลินิกด้านความไวต่อสารปฏิชีวนะ, O.B.I.S. ระบบการจำ�แนก เชื้อทางชีวเคมีแบบต่างๆ ออกซอยด์เป็นผู้แทนจำ�หน่ายระบบ BAX สำ�หรับการทดสอบคัดกรองเชื้อจุลินทรีย์ในอาหารด้วยวิธีพีซีอาร์ใน ยุโรปและออสเตรเลียอีกด้วย

PRODUCT DEVELOPMENT Although many traditional culture media have been in use for a considerable time and remain an important part of the range, Oxoid continues to introduce new products in order to improve and speed up the process of isolating organisms from clinical samples, food or other sources. Changes in eating habits, food production methods and to the environment have led to the increased importance of such organisms as Listeria, E.coli O157, Salmonella and Legionella. Oxoid products developed to detect these organisms are an important part of public health. Products launched recently include a range of chromogenic media for food pathogens; Oxoid Aura Image - an automated zone reader for susceptibility testing of clinical specimens; O.B.I.S. - a range of biochemical identification systems. Oxoid is also the distributor in Europe and Australia for the BAX system of PCR assays for microbial screening of food samples.

อาหารเลี้ยงเชื้อแบบแห้ง

DEHYDRATED MEDIA The formulation of all Oxoid culture media and the components can be divided into different roles or functions: 1. Nutrients: proteins/peptides/amino acids 2. Energy: carbohydrates 3. Essential metals and minerals: calcium, magnesium, iron, trace metals, phosphates, sulphates etc. 4. Buffering agents: phosphates, acetates etc. 5. Indicators for pH change: phenol red, bromocresol purple etc. 6. Selective agents: chemicals, antimicrobial agents 7. Gelling agent: usually agar There is often an overlap of functions of some media components. For example, protein hydrolysates will supply amino-nitrogen, energy, some metals/minerals and act as buffering agents. Phosphate buffers are important suppliers of minerals and agar contributes metals.

สารอาหาร เนื้อสกัด (อินฟิวชัน) ประกอบด้วยโปรตีนที่ละลายน้ำ� (กรด อะมิโนและเปปไทด์ขนาดเล็ก) และส่วนประกอบที่ละลายน้ำ� เช่น วิตามิน โลหะส่วนน้อย เกลือแร่ และคาร์โบไฮเดรต (ไกลโคเจน) อินฟิวชันหรือสารสกัดอาจอยู่ในกลุ่ม ‘เปปโตน’ แต่ปริมาณกรด อะมิโน-ไนโตรเจนมักจะต่�ำ จนไม่สามารถรักษาการเติบโตของแบคทีเรีย ปริมาณมากได้ จนกระทั่งมีการใช้กรดหรือเอนไซม์ในการไฮโดรไลซ์โปรตีน

NUTRIENTS

สูตรอาหารเลีย้ งเชือ้ และส่วนประกอบสามารถแบ่งได้ตามหน้าที่ หรือฟังก์ชันได้ดังนี้ 1. สารอาหาร: โปรตีน เปปไทด์ กรดอะมิโน 2. พลังงาน: คาร์โบไฮเดรต 3. โลหะและแร่ธาตุที่จำ�เป็น: แคลเซียม แมกนีเซียม เหล็ก โลหะที่ต้องการปริมาณน้อย ฟอสเฟต ซัลเฟต เป็นต้น 4. บัฟเฟอร์: ฟอสเฟต อะซีเตท เป็นต้น 5. สารบ่งชี้พีเอช: ฟีนอลเรด โบรโมครีซอลเพอร์เพิล เป็นต้น 6. สารคัดเลือก: สารเคมี สารปฏิชีวนะ 7. สารทำ�ให้เกิดเจล: มักใช้วุ้น (อะการ์) ส่วนประกอบหลายชนิดมีฟังก์ชันหลายด้าน ดังนั้น โปรตีน ไฮโดรไลเซตจะให้ทงั้ ไนโตรเจนจากกรดอะมิโน พลังงาน โลหะ/แร่ธาตุ บางชนิด และทำ�หน้าทีเ่ ป็นบัฟเฟอร์ไปพร้อมกัน ฟอสเฟตบัฟเฟอร์เป็น แหล่งที่ดีของแร่ธาตุ และโลหะที่อยู่ในอะการ์

Meat infusions contain water-soluble fractions of protein (amino-acids and small peptides) along with other water-soluble products such as vitamins, trace metals, minerals and carbohydrates (glycogen). Such infusions or extracts may have been regarded as `peptones’ but their amino-nitrogen content was usually too low to sustain the growth of large numbers of bacteria. It was not until deliberate attempts were made to hydrolyze proteins with acids or enzymes that sufficiently high www.thermofisher.com

ซึ่งสามารถให้ความเข้มข้นของโปรตีนที่ละลายน้ำ�ได้ (เปปไทด์) มี ปริมาณมากพอที่จะช่วยให้แบคทีเรียเติบโต อาหารเลี้ยงเชื้อมักมีส่วน ประกอบเป็นโปรตีนไฮโรไลเซตแบบผสม (เปปโตน) และเนื้อสกัด (สารสกัดจากเนื้อ) ความยากลำ�บากในการผลิตโปรตีนไฮโดรไลเซตเป็นที่ทราบ ดี จึงมีผู้เริ่มผลิตเปปโตนเพื่อจำ�หน่ายขึ้นในทศวรรษ 1920s เปปโตน แบบแห้งทำ�ให้มกี ารผลิตอาหารเลีย้ งเชือ้ แบบแห้งขึน้ ในทีส่ ดุ แม้วา่ เนือ้ จะเป็นโปรตีนชนิดแรกและเป็นแหล่งของโปรตีนที่ชัดเจนที่สุดสำ�หรับ กระบวนการไฮโดรไลซ์ โปรตีนชนิดอื่นๆ ก็ยังถูกนำ�มาทดลองและ มีโปรตีนบางชนิดมีขอ้ ได้เปรียบจำ�เพาะซึง่ ทำ�ให้มกี ารใช้ในอาหารเลีย้ ง เชือ้ มาจนถึงปัจจุบนั เช่น เคซีนไฮโดรไลเซตทีม่ สี ขี าวและมีทริปโตแฟน สูง และเปปโตนถัว่ เหลืองทีม่ คี าร์โบไฮเดรตพลังงานสูงเป็นตัวอย่างของ เปปโตนจากแหล่งที่ไม่ใช่เนื้อที่ได้รับความนิยม ส่วนประกอบทีเ่ ป็นสารอาหารของอาหารเลีย้ งเชือ้ จะถูกคัดเลือก อย่างถี่ถ้วนเพื่อให้ครอบคลุมความต้องการของเชื้อในตัวอย่าง เช่น โคลิฟอร์มหรือเชือ้ กลุม่ ไม่ใช้ออกซิเจน อาหารเลีย้ งเชือ้ ทัว่ ไป เช่น บลัด อะการ์ ในรูปแบบต่างๆ มักจะมีสว่ นประกอบของเปปโตนเพือ่ ให้มนั่ ใจ ว่ามีเปปไทด์ชนิดต่างๆ เพียงพอกับเชื้อจุลินทรีย์ที่น่าจะมีอยู่ อย่างไร ก็ตาม เชื้อบางประเภทอาจต้องการปัจจัยเพิ่มเติมในการเจริญซึ่งต้อง เติมลงไป เช่น ในอาหารเลี้ยงเชื้อ Legionella spp. ส่วนประกอบส่วนใหญ่ที่ใช้เป็นสารอาหารของจุลินทรีย์นั้นมี ส่วนประกอบไม่แน่นอน และต้องใช้การทดสอบอย่างมากและการ เลือกสรรอย่างละเอียดเพือ่ รับประกันระดับความสม่�ำ เสมอของผลิตภัณฑ์ อย่างเหมาะสม จะดีกว่าหรือไม่ทจี่ ะใช้เปปไทด์และกรดอะมิโนทีท่ ราบ แน่นอนในการผลิตอาหารที่ทราบส่วนประกอบแน่นอน? เมื่ออาหาร เลี้ยงเชื้อมีความสม่ำ�เสมอมากขึ้น กลับพบว่าประสิทธิภาพในการใช้ เป็นอาหารเลีย้ งเชือ้ ทัว่ ไปแย่ลง นอกจากนัน้ การใช้อาหารทีท่ ราบส่วน ประกอบแน่นอนจะมีราคาแพงกว่า การใช้อาหารเลีย้ งเชือ้ ทีท่ ราบองค์ ประกอบแน่นอนเป็นเป้าหมายทีเ่ ข้าใจได้ของนักจุลชีววิทยา แต่อาหาร เลี้ยงเชื้อที่ทราบส่วนประกอบแน่นอนยังไม่สามารถแสดงให้เห็นว่ามี ประสิทธิภาพเทียบได้กับอาหารที่มีองค์ประกอบที่ซับซ้อนของโปรตีน ไฮโดรไลเซตพืชและสัตว์ พลังงาน สารที่มักใช้ในอาหารเลี้ยงเชื้อเพื่อเป็นแหล่งพลังงานเพื่อเพิ่ม อัตราการเจริญของจุลินทรีย์คือกลูโคส โดยอาจใช้คาร์โบไฮเดรตอื่นๆ ตามต้องการ คาร์โบไฮเดรตที่เติมลงไปในอาหารเลี้ยงเชื้อ 5-10 กรัม ต่อลิตร มักเป็นสารตั้งต้นของกระบวนการทางชีวเคมีเพื่อตรวจสอบ การผลิตเอนไซม์จำ�เพาะในการจำ�แนกจุลินทรีย์ และมักมีการเติมตัว บ่งชี้ค่าพีเอชในสูตร โลหะและแร่ธาตุที่จำ�เป็น สารประกอบอนินทรีย์ของอาหารเลี้ยงเชื้อมีมากมาย และ สามารถแบ่งได้โดยใช้เกณฑ์เชิงกึ่งปริมาณ ส่วนประกอบทีม่ ปี ริมาณมาก (ปริมาณระดับ กรัม/ลิตร) : Na, K, Cl , P, S, Ca, Mg, Fe ส่วนประกอบที่มีปริมาณน้อย (ปริมาณ ระดับ มิลลิกรัม-ไมโครกรัม/ลิตร) : Zn, Mn, Br, B, Cu, Co, Mo, V, Sr เป็นต้น 4 Food Safety Solutions by

concentrations of water-soluble protein fractions (peptides) were made available for bacterial growth. Many nutrient media usually contain a mixture of protein hydrolysate (peptone) and meat infusion (meat extract). The difficulties associated with the production of protein hydrolysates were soon recognized and commercial suppliers of peptones became established by the 1920s. The commercial supply of dried peptone eventually led to complete culture media being produced in the form of dehydrated media. Although meat was the first and most obvious protein to hydrolyze, other proteins were tried later and some showed specific advantages which ensured their retention in culture media to this day. Casein hydrolysate with its pale color and high tryptophan content and soya peptone with its high energy carbohydrate content are popular examples of non-meat peptones. The nutrient components of culture media are carefully selected to recover the required spectrum of organisms in the sample e.g. coliforms or anaerobes. General purpose media such as blood agar in its various forms will often contain mixtures of peptones to ensure that peptides of sufficient variety are available for the great majority of organisms likely to be present. However, more demanding organisms will require supplemental growth factors to be added and examples of such requirements can be seen in media for Legionella species. Most of the components used for the nutrition of microorganisms are undefined and require extensive testing with careful selection to ensure a reasonable degree of uniformity. Would it not be better to use wholly defined peptides and amino-acids to produce a totally defined medium? Whilst such media would improve uniformity, experience has shown that they lack good performance as general purpose media. They would also be very expensive compared with undefined media. The use of totally defined culture media is an understandable goal of most microbiologists but defined media have yet to prove themselves equal in performance to currently used complex mixtures of meat and plant protein hydrolysates. ENERGY

The most common substance added to culture media as a source of energy to increase the rate of growth of organisms is glucose. Other carbohydrates may be used as required. Carbohydrates added to media at 5-10 g/L are usually present as biochemical substrates to detect the production of specific enzymes in the identification of organisms. It is usual to add pH indicators to such formulations. ESSENTIAL METALS AND MINERALS

The inorganic essential components of culture media are many and can be divided on a semi-quantitative basis: Typical macro-components (g/L): Na, K, Cl , P, S, Ca, Mg, Fe.

ADVERTORIAL

ดังทีก่ ล่าวมาแล้ว สูตรอาหารเลีย้ งเชือ้ อาจไม่ตอ้ งมีโลหะจำ�เพาะ และแร่ธาตุระบุในสูตร ในบางกรณี โลหะและแร่ธาตุที่จำ�เป็นเหล่านี้ จะมีอยู่ในไฮโดรไลเซต บัฟเฟอร์ หรืออะการ์ อยู่แล้ว บัฟเฟอร์ การรักษาพีเอชของอาหารเลี้ยงเชื้อให้อยู่ในช่วงที่เหมาะสม เป็นสิ่งสำ�คัญต่อการเจริญของจุลินทรีย์ที่ต้องการ การใช้สารประกอบ บัฟเฟอร์ท่ีมีค่า pK จำ�เพาะจะจำ�เป็นเป็นพิเศษเมื่อใช้คาร์ไฮเดรตที่ หมักได้เป็นแหล่งพลังงาน ฟอสเฟต อะซีเตท ซิเตรท สารประกอบสวิทเทอเรียน และ กรดอะมิโนจำ�เพาะเป็นตัวอย่างของบัฟเฟอร์ที่อาจเติมลงในอาหาร เลีย้ งเชือ้ ผลกระทบข้างเคียงของสารประกอบเหล่านีค้ อื ความสามารถ ในการสร้างสารประกอบคีเลต (หรือจับ) กับไดวาเลนต์แคตไอออน (C2+ และ Mg2+) เกลือโพลีฟอสเฟต ซึ่งบางครั้งอาจอยู่ในรูปโซเดียม ฟอสเฟต เป็นสารประกอบทีส่ ามารถจับกับแคตไอออนทีจ่ �ำ เป็น ทำ�ให้ จุลินทรีย์ไม่สามารถเข้าถึงสารอาหารได้ ผลของการจับกันหรือสารคีเลตจะพบว่าไปยับยั้งการเติบโต หรือทำ�ลายการเติบโตทั้งหมด จึงต้องมีการเติมสารสารประจุบวก เข้าไปในสูตรอาหาร อาหารเลี้ยงเชื้อจะเกิดความขุ่นเมื่อให้ความร้อน หรือวางอยู่ในที่ที่มีอุณหภูมิ 50 องศาเซลเซียสหลายชั่วโมง เกิดจาก อันตรกิรยิ าระหว่างฟอสเฟตกับโลหะ ฟอสเฟตทีต่ กตะกอนสามารถจับ กับ Fe ได้อย่างมีประสิทธิภาพและทำ�ให้ปริมาณของโลหะที่จำ�เป็นใน อาหารเลี้ยงเชื้อลดลง สารบ่งชี้ การเติมสารบ่งชีท้ มี่ สี เี ป็นวิธกี ารทีม่ ปี ระสิทธิภาพมากในการตรวจ จับการหมักของคาร์โบไฮเดรตจำ�เพาะในอาหารเลีย้ งเชือ้ สารประกอบ จะเปลี่ยนสีที่แตกต่างกันได้อย่างชัดเจนและรวดเร็วที่ค่าพีเอชวิกฤต สารประกอบส่วนใหญ่ที่ใช้เป็นสารพิษ เช่น ฟีนอลเรด โบรโมครีซอลเพอร์เพิล ฟุคชิน เป็นต้น และต้องใช้ทดสอบแบทช์/ ล็อตที่ความเข้มข้นต่ำ� จะใช้สายพันธ์ุจุลินทรีย์ที่ทราบความไวในการ ทดสอบคัดกรอง สารช่วยการคัดเลือก สารเคมีหรือสารปฏิชีวนะที่เติมลงไปในอาหารเลี้ยงเชื้อเพื่อให้ สามารถคัดแยกจุลินทรีย์ได้ สารช่วยการคัดเลือกจะถูกเลือกใช้และ เติมลงไปให้มีความเข้มข้นจำ�เพาะเพื่อยับยั้งการเจริญของจุลินทรีย์ ที่ไม่ต้องการในตัวอย่างที่มีจุลินทรีย์หลายชนิด ต้องใช้สารช่วยการ คัดเลือกที่ความเข้มข้นที่เหมาะสมเพื่อไม่ใช้ไปยับยั้งการเจริญของ จุลินทรีย์ที่ต้องการ สารช่วยการคัดเลือกทัว่ ไปได้แก่ เกลือน้�ำ ดี สารให้สี เซเลไนต์ เตตระไทโอเนต เทลลูไรต์ และเอไซด์ สารปฏิชีวนะที่มักใช้ในอาหาร เลี้ยงเชื้อเพื่อยับยั้งการเจริญของจุลินทรีย์หลายชนิด อย่างไรก็ตาม การชั่งน้ำ�หนักและการสลายตัวเนื่องจากความร้อนของสารปฏิชีวนะ ส่วนใหญ่ต้องการการดูแลเป็นพิเศษและการเติมหลังจากการฆ่าเชื้อ ความหลากหลายของจุลินทรีย์และความสามารถในการปรับตัวที่ไม่ จำ�กัดให้เข้ากับสภาวะที่เปลี่ยนไปของจุลินทรีย์ ทำ�ให้การใช้อาหาร เลี้ยงเชื้อเพื่อการคัดกรองแทบจะเป็นไปไม่ได้เลย

Typical micro-components (mg-µg/L): Zn, Mn, Br, B, Cu, Co, Mo, V, Sr, etc. As previously mentioned, a formulation may not have specific metals and minerals listed in its formulation. In such cases it is assumed that all the factors required are present in the hydrolysates, buffers and agar components. BUFFERING AGENTS

It is important that the pH of a culture medium is poised around the optimum necessary for growth of the desired micro-organisms. The use of buffer compounds at specific pK values is especially necessary when fermentable carbohydrates are added as energy sources. Phosphates, acetates, citrates, zwitterion compounds and specific amino-acids are examples of buffering agents that may be added to culture media. A side effect of such compounds is their ability to chelate (or bind) divalent cations (Ca2+ and Mg2+). Polyphosphate salts, sometimes present in sodium phosphate, are compounds which can bind essential cations so firmly that they are made inaccessible to the micro-organisms. The effect of these binding or chelating agents will be seen in diminished growth or failure to grow at all, unless care has been taken to supplement the essential cations in the formulation. Opacity forming in a medium, after heating or on standing at 50°C for several hours, is commonly caused by phosphate interaction with metals. Such phosphate precipitates can very effectively bind Fe and lower the available amount of this essential metal in the medium. INDICATOR SUBSTANCES

The addition of colored indicator substances is a very effective way of detecting fermentation of specific carbohydrates in a culture medium. Such compounds should change color distinctly and rapidly at critical pH values. Most of the compounds used e.g. phenol red, bromocresol purple, fuchsin, etc., are toxic and it is essential to use low concentrations of pre-screened batches/lots. Known sensitive strains of microorganisms are used in the screening tests. SELECTIVE AGENTS

Chemicals or antimicrobials are added to culture media to make them selective for certain microorganisms. The selective agents are chosen and added at specific concentrations to suppress the growth of unwanted organisms in a polymicrobial sample. It is, of course, essential to have established that the selective agents, at the appropriate concentration, will allow uninhibited growth of the desired organisms. Common chemical selective agents are: bile salts, dye-stuffs, selenite, tetrathionate, tellurite and azide. Antimicrobial agents are commonly used in mixtures when suppressing polymicrobial contaminating flora. However, the critical weighing and heat-lability of most antimicrobials www.thermofisher.com

สารทำ�ให้เกิดเจล แม้ว่าเจลาตินจะใช้ในอาหารเลี้ยงเชื้อจำ�เพาะบางชนิด และ บางครั้งจะใช้คาราจีแนน อัลจิเนต ซิลิกาเจล และโพลีอะคริลเอไมด์ เป็นสารทำ�ให้เกิดเจล สารที่โดดเด่นที่สุดคือ วุ้น (อะการ์) อะการ์ได้จากสาหร่ายทะเลอะกาโรไฟต์ ส่วนใหญ่จะเป็นสาหร่าย ในกลุ่ม Gelidium, Gracilaria และ Pterocladia spp. ถูกนำ� มาสกัดด้วยน้ำ�ที่อุณหภูมิสูงกว่า 100 องศาเซลเซียส ฟอกสี กรอง ทำ�ให้แห้ง แล้วบดเป็นผง อะการ์ไม่ใช่สารเฉื่อย มีส่วนเป็นสารอาหาร และ/หรือสารพิษในอาหารเลี้ยงเชื้อหรือไม่นั้น ขึ้นอยู่กับกระบวนการ ทางเคมีของผูผ้ ลิต อะการ์ส�ำ หรับงานจุลชีววิทยานัน้ ผ่านกระบวนการ ให้ได้เจลทีม่ ีพษิ ต่�ำ มีความใสสูง แร่ธาตุนอ้ ย และมีการกระจายตัวสูง ส่วนประกอบอื่นๆ มีส่วนประกอบอื่นๆ อีกมากมายที่ถูกเติมลงในอาหารเลี้ยง เชื้อเพื่อวัตถุประสงค์จำ�เพาะ เช่น ปัจจัยการเจริญ สำ�หรับเชื้อที่มี ความต้องการซับซ้อนยุ่งยาก สารประกอบที่ช่วยลดศักยภาพการเกิด ออกซิเดชัน-รีดักชัน (eH) สำ�หรับเชื้อกลุ่มที่ไม่ใช้ออกซิเจน (ไธโอไกลคอลเลตและซิสเทอีน) เลือดสำ�หรับตรวจวิเคราะห์เชือ้ ทีม่ เี อนไซม์ ย่อยเลือดและช่วยในการเจริญของจุลนิ ทรียท์ ไี่ วต่อผลิตภัณฑ์ออกซิเดชัน

อายุการเก็บของอาหารเลี้ยงเชื้อแบบแห้ง

วันหมดอายุที่ระบุบนฉลากผลิตภัณฑ์แบบแห้งของออกซอยด์ หมายถึงอายุการเก็บของผลิตภัณฑ์ทยี่ งั ไม่ได้เปิด ส่วนใหญ่มอี ายุ 3-5 ปี เมื่อเปิดแล้ว อายุการเก็บของอาหารเลี่ยงเชื้อแบบแห้งทั้ง เปปโตนและไฮโดรไลเซตจะลดลงโดยอัตโนมัติ อายุการเก็บจะขึ้นอยู่ กับความถีใ่ นการเปิดและสภาวะอากาศ ความเสือ่ มเสียของผลิตภัณฑ์ ที่ดูดน้ำ� (ไฮโกรสโคปิก) อาจจะพบได้ภายในหกเดือนหลังจากเปิด ควรตรวจสอบอาหารเลีย้ งเชือ้ แบบแห้งโดยละเอียดหลังจากเปิด ไม่กเี่ ดือนเพือ่ ตรวจสอบลักษณะทางกายภาพ และควรใช้เมือ่ ยังคงเป็น ผงอยูเ่ ท่านัน้ หากระยะเวลาหลังการเปิดบรรจุภณ ั ฑ์นานขึน้ ให้ท�ำ การ ยืนยันประสิทธิภาพของอาหารคัดแยกเชือ้ และอาหารที่ ‘มีอายุการเก็บ สั้นกว่า’ โดยใช้เชื้อสายพันธุ์ควบคุมบวกและควบคุมลบ เพื่อยืดอายุ การเก็บของอาหารเลีย้ งเชือ้ แบบแห้ง ให้ตรวจสอบบรรจุภณ ั ฑ์วา่ ไม่อยู่ ในพื้นที่ที่มีความชื้นสูง เช่น พื้นที่ใช้เครื่องออโตเคลฟ

คำ�แนะนำ�ในการฆ่าเชื้อสำ�หรับอาหารเลี้ยงเชื้อจาก ออกซอยด์

จะต้องพิจารณาคำ�แนะนำ�ดังต่อไปนีเ้ มือ่ จะทำ�การฆ่าเชือ้ อาหาร เลี้ยงเชื้อด้วยการออโตเคลฟ ที่พารามิเตอร์มาตรฐาน 121 องศา เซลเซียส นาน 15 นาที 1. พิจารณาวิธีการฆ่าเชื้อที่ผู้ผลิตอาหารเลี้ยงเชื้อกำ�หนด เพื่อให้ใช้อุณหภูมิที่เหมาะสม ระยะเวลาและอุณหภูมิที่แนะนำ�สำ�หรับ อาหารเลีย้ งเชือ้ ของออกซอยด์ได้มาจากผลการทดลองกับแบคทีเรียทน ร้อนที่มีปริมาตรถึง 1 ลิตร 2. ปริมาณความร้อนทีใ่ ห้ในการสเตอริไรซ์จะต้องสูงกว่าความ ร้อนทีต่ อ้ งการในการทำ�ลายเชือ้ จุลนิ ทรียส์ ว่ นใหญ่ทคี่ าดว่าจะพบ ค่าที่ เหมาะสมคือ ระยะเวลา 15±1 นาที ที่ 121±2 องศาเซลเซียส ควร มีการตรวจสอบคุณภาพเมื่อใช้อุณหภูมิที่อยู่นอกช่วง 119-123 องศา 6 Food Safety Solutions by

demand special care and post-sterilization addition. The wide variety of organisms and their almost infinite ability to adapt to changing conditions makes a truly selective medium unlikely. GELLING AGENTS

Although gelatin is still used for a few specific media and carrageenans, alginates, silica gel and polyacrylamides are sometimes used as gelling agents, the outstanding gelforming substance used in culture media is agar. Agar is obtained from agarophyte sea-weeds mainly Gelidium, Gracilaria and Pterocladia spp. It is extracted as an aqueous solution at greater than 100°C, decolorized, filtered, dried and milled to powder. Agar is not an inert gelling agent; it contributes nutrients and/or toxic agents to culture media, depending on the chemical processing carried out by the suppliers. Microbiological agar is specially processed to yield a low toxicity, high clarity, low mineral and high diffusion gel. OTHER COMPONENTS

There are many other substances added to culture media for specific purposes e.g. growth factors for fastidious organisms, eH-reducing compounds for anaerobic organisms (thioglycollate and cysteine), whole blood to detect hemolytic enzymes and encourage the growth of organisms which are vulnerable to oxidation products. SHELF LIFE OF DEHYDRATED CULTURE MEDIA The quoted expiry date on the label of Oxoid dehydrated products refers to the shelf life when the product remains in an unopened state. The total shelf life is typically 3-5 years. Once opened, the total shelf life of Dehydrated Culture Media, Peptones and Hydrolysates is automatically reduced. The shelf life will depend on the frequency of opening and the atmospheric conditions. Deterioration of particularly hygroscopic products may be observed within six months of opening. Dehydrated media should be examined carefully after several months of opening to ensure maintenance of physical integrity and should only be used if they still appear free-flowing. Confirmation of the performance of selective and ‘shorter shelf life’ media, using positive and negative microbiological control strains, should be considered after such extended periods of opening. In order to maximize the storage of Dehydrated Culture Media, ensure that containers are not stored in areas of high humidity, e.g. autoclave areas. STERILIZATION GUIDELINES FOR OXOID CULTURE MEDIA The following considerations should be taken into account when sterilizing media that are autoclaved following the standard parameters of 121°C for 15 minutes:

ADVERTORIAL

เซลเซียสเพื่อรับประกันความปลอดเชื้อและ/หรือประสิทธิภาพ 3. อาการเลี้ยงเชื้อบางชนิดจะเสียสภาพเมื่อได้รับความร้อน สูงเกินไป เช่น อาหารเลี้ยงเชื้อที่มีน้ำ�ตาลสูง หรือมีสารยับยั้ง เช่น ดีซอกซีโคเลตหรือเกลือน้ำ�ดี ความร้อนสูงเกินไปจะทำ�ให้คา่ พีเอชของ อาหารเลี้ยงเชื้อที่เตรียมได้ลดลง 4. เมื่อเตรียมปริมาณมากกว่า 1 ลิตร จะต้องอุ่นอาหารเลี้ยง เชื้อเพื่อให้อะการ์ละลายให้หมดก่อนที่จะฆ่าเชื้อโดยใช้ออโตเคลฟ ไม่ จำ�เป็นต้องต้มอาหารเลี้ยงเชื้อที่มีปริมาตรน้อยกว่านี้หากไม่มีเจลาติน หรือไม่ตอ้ งแบ่งอาหารเลีย้ งเชือ้ ลงในบรรจุภณ ั ฑ์สดุ ท้ายก่อนออโตเคลฟ 5. บรรจุภัณฑ์ที่เหมาะสมสำ�หรับออโตเคลฟคือฟลาสก์แบบ ฐานกว้าง หลีกเลี่ยงการใช้ขวดผิวบาง จะต้องมีระยะเฮดสเปซมาก พอเพื่อลดการสูญเสียอาหารเลี้ยงเชื้อ 6. อุณหภูมใิ นการฆ่าเชือ้ หมายถึงอุณหภูมขิ องออโตเคลฟ ไม่ใช่ อุณหภูมขิ องอาหาร สิง่ สำ�คัญคือระยะเวลาทีใ่ ช้ในการเพิม่ อุณหภูมจิ นไป ถึงอุณหภูมฆิ า่ เชือ้ จะต้องสัน้ ทีส่ ดุ เท่าทีจ่ ะทำ�ได้ รอบการฆ่าเชือ้ จะต้อง พิจารณาระยะเวลาในการถ่ายเทความร้อน เช่น ฟลาสก์บรรจุอาหาร เลี้ยงเชื้อขนาด 1 ลิตร จะต้องมีอุณหภูมิถึง 121 องศาสเซลเซียส ภายใน 15 นาที หลังจากตู้ออโตเคลฟมีอุณภูมิ 121 องศาเซลเซียส 7. จะต้องพิจารณาปริมาณอาหารเลี้ยงเชื้อที่อยู่ในออโตเคลฟ และอาหารเลี้ยงเชื้อที่มีอะการ์จะนำ�ความร้อนได้ไม่ดี 8. ตำ�แหน่งโพรบวัดอุณหภูมิของออโตเคลฟที่ดีที่สุดจะอยู่ที่ วาล์วหรือท่อเปิดทิ้ง เนื่องจากเป็นจุดที่เย็นที่สุดในเครื่อง และเป็น ตัวแทนพลวัตของกระบวนการให้ความร้อน 9. เมื่อสอบเทียบเครื่องออโตเคลฟ ควรขอคำ�แนะนำ�จากผู้ ผลิตเพื่อหารือเกี่ยวกับวิธีการสอบเทียบ 

Article info C.A. Oscroft and J.E.L. Correy. (1991). Guidelines for the Preparation, Storage and Handling of Microbiological Media. Technical Manual 33. Campden and Chorleywood Food & Drink Research Association.

1. Attention to the media manufacturers’ instructions for use must be observed in order to ensure optimal performance. The time and temperature recommendations for sterilization of Oxoid culture media are based on evidence from trials with heat resistant bacterial in volumes of up to one liter. 2. The amount of heat applied during sterilization is much greater than is necessary for destruction of the majority of organisms likely to be encountered. Tolerances of 15±1 minute combined with 121±2 °C are considered appropriate. Appropriate quality control checks should be carried out for temperatures which are outside 119-123°C, to ensure sterility and/or performance integrity. 3.Certain media are more susceptible to overheating, such as those with a high sugar content, or those which contain inhibitory agents such as sodium desoxycholate or bile salts. The result of over-heating is a reduction in pH of the final medium. 4. For volumes over 1 L, the medium should be preheated to dissolve the agar prior to autoclaving. It is not usually necessary to boil smaller volumes of media unless the medium contains gelatin, or the intention is to dispense the medium into final containers prior to autoclaving. 5. Suitable containers for autoclaving are widebottomed flasks - thin walled bottles should be avoided. Adequate headspace should be allowed in order to minimize loss of medium. 6. The sterilization temperature refers to the autoclave chamber not to the temperature of the medium. It is important that the time taken to reach the sterilizing temperature should be as short as possible. Sterilization cycles must take into account suitable heat penetration times e.g. a one-liter flask of medium should attain 121°C within 15 minutes of the chamber reaching that temperature. 7. The autoclave load and the relatively poor heat transferring properties of agar-containing media must be taken into account. 8. The autoclave temperature probe is best located in the valve or drain, as this is the coolest part of the chamber and best represents the dynamics of the heating process. 9. When validating an autoclave, it is strongly recommended that the manufacturer is consulted in order to discuss the relevant validation protocols. 

www.thermofisher.com

FOOD MICROBIOLOGY Solutions

Rapid & Simple Solaris™ Real Time PCR for Food Pathogen Detection Writer: PHANTIPA MOTTE Senior Field Application Specialist, Geneplus Co.,Ltd. phantipa@gene-plus.com

การตรวจเชื้อจุลินทรีย์ที่ปนเปื้อนในอาหารมีวิธีมาตรฐาน คือ เทคนิค การเพาะเชื้อ โคโลนีของเชื้อที่เจริญบนอาหารเลี้ยงเชื้อจะมีความแตก ต่างกัน เช่น สี ขนาด รูปร่าง ความต้องการสารอาหาร และอาจมี การนำ�ไปทดสอบทางชีวเคมีเพิม่ เติมเพือ่ ยืนยันความถูกต้อง เช่น การ ทดสอบการสร้างเอนไซม์คาตาเลส การสร้างเอนไซม์ออกซิเดส หรือ การทดสอบการสร้างอินโดล เป็นต้น อย่างไรก็ตาม เทคนิคการเพาะ เชื้อและการทดสอบทางชีวเคมียังมีข้อจำ�กัด เนื่องจากมีขั้นตอนที่ซับ ซ้อนและใช้เวลานาน โดยอาจต้องใช้เวลานาน 3-4 วัน จึงจะสามารถ รายงานผลได้ ปัจจุบนั เทคโนโลยีดา้ นอณูชวี วิทยาหรือโมเลคูลาร์ (Molecular biology) เข้ามามีบทบาทในการตรวจการปนเปื้อนของเชื้อจุลินทรีย์ ที่มีอยู่ในอาหารรวมถึงกระบวนการที่ใช้ในการผลิตอาหาร เนื่องจาก เป็นเทคโนโลยีที่มีความไวและความแม่นยำ�สูง ใช้เวลาไม่นาน หลัก การ คือ การตรวจหาสารพันธุกรรมหรือดีเอ็นเอของเชือ้ จุลนิ ทรีย์ หาก ต้องการจำ�แนกชนิดของแบคทีเรีย จะต้องเลือกตรวจลำ�ดับของดีเอ็น เอจำ�เพาะของแบคทีเรียชนิดแต่ละชนิด เช่น หากต้องการตรวจการ ปนเปื้อนของเชื้อ Salmonella spp. ในอาหาร เราก็ต้องเลือกตรวจ บริเวณลำ�ดับของดีเอ็นเอที่มีเฉพาะใน Salmonella spp. เทคนิค ที่ใช้ตรวจดีเอ็นเอมีหลายเทคนิค ได้แก่ พีซีอาร์ (PCR), เรียลไทม์ พีซีอาร์ (Real-Time PCR) และการหาลำ�ดับเบสของดีเอ็นเอ (DNA Sequencing) วิธีพีซีอาร์ และเรียลไทม์พีซีอาร์มักใช้ในการตรวจหา ดีเอ็นเอของเชื้อจุลินทรีย์ปนเปื้อน เนื่องจากให้ผลการตรวจที่รวดเร็ว สามารถตรวจตัวอย่างจำ�นวนมากได้ในคราวเดียวกัน มีความน่าเชื่อ ถือ และต้นทุนในการตรวจไม่แพงจนเกินไป

Determination of food-contaminated microorganisms employs the standard cell culture method. Colonies developed on media are different by color, shape, size, and nutrient needs. Further, colonies may be collected to perform biochemical tests such as catalase, oxidase, or indole production. However, analysis by those cell culture methods and biochemical tests has some limitations because they are excessively time-consuming and complicated. These may take 3-4 days to obtain analysis results. To date, molecular biology technology involves in microorganism tests in food and also food processes. The technique provides sensitivity and precision, with less time used. The principle is to determine microbe’s genetic materials or DNA. To identify bacteria species, specific DNA sequence of such bacteria has to be determined. For example, to determine contamination of Salmonella spp., the target is specific Salmonella’s DNA sequence. There are several molecular techniques such as PCR, real-time PCR, and DNA sequencing. PCR and real-time PCR are mostly used to determine DNA of contaminated microbes. This method is reliable, less expensive, less analysis costs, and it can be conducted with a number of samples at the same time.

พีซีอาร์คืออะไร? พีซีอาร์หรือ Polymerase Chain Reaction เป็นเทคนิค ที่ใช้ในการเพิ่มดีเอ็นเอ (DNA replication) โดยเลียนแบบกลไกที่ เกิดขึ้นในธรรมชาติ ปฏิกิริยาพีซีอาร์สามารถเพิ่มชิ้นส่วนของดีเอ็น เอจำ�เพาะในระยะเวลาอันสั้น ส่วนประกอบหลักของพีซีอาร์ ได้แก่ เทมเพลตดีเอ็นเอ (สายดีเอ็นเอของแบคทีเรียที่เราต้องการจะตรวจ), ไพรเมอร์ (โอลิโกนิวคลีโอไทด์ทม่ี คี วามจำ�เพาะกับชิน้ ส่วนของดีเอ็นเอ ที่เราต้องการจะตรวจ), dNTPs (ดีออกซีนิวคลีโอไทด์ ไตรฟอสเฟต อิสระ: A, T, C, G), บัฟเฟอร์, แมกนีเซียมคลอไรด์ และเอนไซม์ ดีเอ็นเอโพลีเมอเรส ปฏิกริ ยิ าพีซอี าร์เริม่ ต้นด้วยการกระตุน้ เอนไซม์ คือ การกระตุน้ ให้ดเี อ็นเอโพลีเมอเรสสามารถทำ�งานได้ หน้าทีส่ �ำ คัญของเอนไซม์ คือ การนำ�นิวคลีโอไทด์คสู่ ม (dNTPs) มาต่อท้ายทีบ่ ริเวณส่วนทีไ่ ม่สามารถ แปลรหัสเป็นโปรตีนด้าน 3’ (3’-untranslated region, 3’-UTR) ของ

WHAT IS PCR?

8 Food Safety Solutions by

PCR (polymerase chain reaction) is a technique to amplify DNA. It is similar to natural DNA replication. PCR produces DNA fractions in short period. PCR consists of template DNA (targeted bacterial DNA), primers (oligonucleotide specific to targeted DNA), dNTPs (free deoxynucleoside triphosphate: A, T, C, G), buffer, magnesium chloride, and DNA polymerase. PCR process initiates with enzyme activation which is DNA polymerase. It brings complementary nucleotides (dNTPs) to primer’s 3’-UTR (three prime untranslated region) to produce new DNA strand. The process then undergoes amplification cycles, normally 40 cycles are applied. A cycle includes 3 steps with

ADVERTORIAL

ภาพที่ 1: กระบวนการเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม

Figure 1: Diagram of DNA Amplification

ไพรเมอร์เพือ่ สร้างดีเด็นเอสายใหม่ขนึ้ จากนัน้ จะเข้าสูก่ ระบวนการเพิม่ ปริมาณ โดยทั่วไปจะอยู่ที่ 40 รอบ ใน 1 รอบของพีซีอาร์จะประกอบ ไปด้วย 3 ขัน้ ตอนหลักทีใ่ ช้อณ ุ หภูมแิ ตกต่างกัน ได้แก่ การทำ�ให้ดเี อ็น เสียสภาพเพื่อแยกเกลียวคู่ออกจากกัน (Denaturation) การทำ�ให้ ไพรเมอร์จับดีเอ็นเอต้นแบบ (Annealing) และการสังเคราะห์ดีเอ็น สายใหม่ต่อจากไพรเมอร์ (Extension)  การทำ�ให้ดเี อ็นเสียสภาพคือการเปลีย ่ นดีเอ็นเอทีม่ โี ครงสร้าง ทุตยิ ภูมหิ รือตติยภูมใิ ห้อยูใ่ นรูปปฐมภูมิ รวมทัง้ การคลายเกลียวของดี เอ็นเอสายคูใ่ ห้เป็นสายเดีย่ ว เพือ่ รอการเข้ามาจับของไพรเมอร์จ�ำ เพาะ (Specific primer) ในขั้นต่อไป ขั้นตอนนี้จะใช้อุณหภูมิ 94-95°C  การทำ�ให้ไพรเมอร์จับดีเอ็นเอต้นแบบคือการที่ไพรเมอร์ที่ จำ�เพาะกับชิน้ ส่วนของดีเอ็นเอเข้าไปจับกับชิน้ ส่วนดีเอ็นเอนัน้ ทีอ่ ณ ุ หภูมิ 50-60°C โดยอุณหภูมทิ ใี่ ช้ในขัน้ ตอนของการทำ�ให้ไพรเมอร์จบั ดีเอ็นเอ ต้นแบบนี้ มีความสำ�คัญมากต่อประสิทธิภาพของพีซีอาร์ ซึ่งไพรเมอร์ จำ�เพาะแต่ละคูจ่ ะอาจมีอณ ุ หภูมทิ เี่ หมาะสมต่อการจับกับชิน้ ดีเอ็นเอที่ แตกต่างกันออกไป  การสังเคราะห์ดเี อ็นสายใหม่ตอ ่ จากไพรเมอร์ (Polymerization หรือ Elongation) คือ การสร้างดีเอ็นเอสายใหม่ โดยดีเอ็นเอโพลี เมอเรสจะทำ�ให้เกิดการสร้างโพลีเมอร์ (Polymerization) ด้วยการ นำ�นิวคลีโอไทด์คู่สมกับชิ้นส่วนดีเอ็นเอ (dNTPs) มาต่อท้ายที่บริเวณ 3’-UTR ของไพรเมอร์เพื่อสร้างดีเอ็นเอสายใหม่ ในแต่ละรอบ ชิ้นส่วนของดีเอ็นเอจะถูกเพิ่มปริมาณขึ้นแบบ เอ็กโพเนนเชียลแล้วจะได้ส�ำ เนาของดีเอ็นเอเป้าหมายจำ�นวนมาก หรือ ที่เรียกว่าผลิตภัณฑ์พีซีอาร์ (PCR product) การตรวจวัดปริมาณ ผลิตภัณฑ์ที่เกิดขึ้นทำ�ได้โดยการย้อมด้วยสารเรืองแสง เช่น เอทิเดียม โบรไมด์ซึ่งจะแทรกตัวเข้าไปในร่องขนาดเล็ก (Minor groove) ของ ชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่เพิ่มปริมาณมาทั้งหมดนั้น ซึ่งเราสามารถมองเห็นได้ โดยการนำ�ไปดูภายใต้แสงยูวี เทคนิคพีซีอาร์ต้องอาศัยการย้อมด้วยสารเรืองแสง ซึ่งอาจไม่ สะดวกในการตรวจเชื้อจุลินทรีย์ที่ต้องตรวจตัวอย่างจำ�นวนมาก จึงมี การพัฒนาเทคนิคเรียลไทม์พซี อี าร์ ซึง่ มีองค์ประกอบและหลักการพืน้ ฐานเช่นเดียวกับพีซีอาร์ แต่มีความแตกต่างจากกัน ดังนี้ เทคนิคเรียลไทม์พซี อี าร์จะมีการเติมสารเรืองแสง (Fluorescence) ลงไปในปฏิกริ ยิ าตอนเริม่ ต้นด้วยเพือ่ ใช้เป็นตัวติดตามการเพิม่ ปริมาณ ของสารพันธุกรรม เมื่อมีดีเอ็นเอมากขึ้น ความเข้มของสารฟลูออเรส เซนซ์ก็จะเพิ่มขึ้นด้วย เทคนิคเรียลไทม์พีซีอาร์จะมีกลไกให้เลือกใช้หลายแบบด้วย กัน เช่น เทคนิค SYBR® Green, TaqMan® hydrolysis probe, Hybridization probe, Scorpion® probe, Molecular beacon และ Solaris™ probe

different temperatures; denaturation, annealing, and extension.  Denaturation: This process transforms tertiary or secondary form of DNA structure into primary structure; or transforms double helix strands to single strands. The single strand is targeted and to bind to specific primers. The temperature used is 94-95°C.  Annealing: The primers recognize and anneal to the targeted DNA sequence at 50-60°C. Annealing temperature is important to achieve PCR efficiency. Each pair of specific primers may need different optimum temperature to bind to DNA.  Extension (polymerization or elongation): It is the production of new DNA strand. DNA polymerase activates polymerization by bringing complementary DNA fragments (dNTPs) to primer’s 3’-UTR. Cycle by cycle, DNA is amplified exponentially. A lot of targeted DNA (PCR product) is generated. Enumeration of PCR products is performed by dyeing with fluorescence such as ethidium bromide. It attaches to minor groove of all amplified DNA fragments. It is visible under UV light. As PCR technique relies on fluorescence reagents, it may be inconvenient if there are large numbers of samples. Real-time PCR is developed based on similar compositions and principles. Some different points are; Fluorescence reagent is added to the reaction. It helps monitoring during process because its fluorescence intensity increases with increasing DNA. Several real-time PCR techniques are available with different mechanisms such as SYBR® Green technique, TaqMan® Hydrolysis Probe, Hybridization Probe, Scorpion® Probe, Molecular beacon, and Solaris™ Probe. PCR consists of 4 phases: lag phase, exponential phase, linear phase, and plateau phase. PCR technique determines DNA at plateau phase, while real-time PCR determines DNA quantity at exponential phase where it is most accurate. Fluorescence is necessary because exponential phase is not the end of the reaction. www.thermofisher.com

ปฏิกิริยาของพีซีอาร์แบ่งออกเป็น 4 เฟส ได้แก่ Lag phase, Exponential phase, Linear phase และ Plateau phase แล้วจะวัดปริมาณสารพันธุกรรมใน Plateau phase ส่วน เรียลไทม์พซี อี าร์จะวัดปริมาณสารพันธุกรรมในช่วงของ Exponential phase ซึ่งเป็นจุดที่มีความแม่นยำ�มากที่สุด จึงจำ�เป็นต้องเติมสาร ฟลูออเรสเซนซ์เพื่อติดตามการเกิดปฏิกิริยา เพราะในช่วงของ Exponential phase ปฏิกิริยายังไม่สิ้นสุด เรียลไทม์พีซีอาร์คืออะไร? เรียลไทม์พีซีอาร์ คือ เทคนิคการตรวจวัดการเพิ่มปริมาณสาร พันธุกรรมเชิงปริมาณ โดยมีสารฟลูออเรสเซนส์เป็นตัวติดตามการเกิด ปฏิกิริยาเพื่อตรวจวัดค่าในช่วง Exponential phase และสามารถ ติดตามปฏิกริ ยิ าในทุกรอบด้วย การตรวจวัดปริมาณสารพันธุกรรมด้วย เทคนิคเรียลไทม์พีซีอาร์สามารถทำ�ได้หลายวิธี SYBR® Green Real Time PCR อาศัยหลักการสารที่แทรก ในดีเอ็นเอ/การจับกับร่องขนาดเล็ก (Intercalating dye/minor groove binder) โดยสี SYBR® Green I จะแทรกตัวเข้าไปอยู่ใน ร่องขนาดเล็กของ dsDNA เมื่อมี dsDNA ของผลิตภัณฑ์จากพีซีอาร์ เพิ่มมากขึ้น ก็จะเห็นการเรืองแสงมากขึ้นนั่นเอง เทคนิคนี้มีข้อจำ�กัด เนื่องจาก SYBR® Green จะแทรกตัวใน dsDNA ทุกชิ้น ไม่ว่าจะ เป็น dsDNA ของดีเอ็นเอที่ต้องการตรวจหรือไม่ก็ตาม จึงต้องทำ�การ วิเคราะห์กราฟการละลาย (Melting curve analysis) เพือ่ ตรวจสอบ ว่าสัญญาณฟลูออเรสเซนซ์ทเี่ กิดขึน้ มาจากการเพิม่ ปริมาณของดีเอ็นเอ เป้าหมายหรือไม่ เพื่อป้องกันการอ่านผลบวกปลอม ทั้งวิธีพซี อี าร์และเรียลไทม์พซี ีอาร์ มีการกำ�หนดความจำ�เพาะ ของชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่ต้องการเพิ่มปริมาณด้วยไพรเมอร์จำ�เพาะ แต่ เทคนิคเรียลไทม์พซี อี าร์จะมีความจำ�เพาะ (Specificity) สูงขึน้ เพราะ ความจำ�เพาะถูกกำ�หนดด้วยไพรเมอร์และโพรบจำ�เพาะ (โพรบคือ โอลิโกนิวคลีโอไทด์ทมี่ คี วามจำ�เพาะกับชิน้ ส่วนของดีเอ็นเอทีเ่ ราต้องการ ตรวจและติดด้วยสารเรืองแสงไว้เพือ่ ใช้เป็นตัวชีบ้ ง่ ว่ามีการเพิม่ ปริมาณ ของสารพันธุกรรมขึ้น) TaqMan® Hydrolysis Probe เทคนิคนี้ประกอบไปด้วย ไพรเมอร์ที่จำ�เพาะ 1 คู่ และโพรบไฮโดรไลซิสจำ�เพาะ (Specific hydrolysis probe) 1 เส้น ต่อยีนเป้าหมาย 1 จุด โดยโพรบ ไฮโดรไลซิส TaqMan® จะอยู่ระหว่างไพรเมอร์ส่วนหน้า (Forward primer) และไพรเมอร์ส่วนหลัง (Reverse primer) คุณลักษณะของ ไฮโดรไลซิสโพรบ คือ ที่ปลาย 5’ จะติดด้วยสารเรืองแสงเรียกว่าส่วน รายงานผล (Reporter) และที่ปลาย 3’จะติดด้วยโมเลกุลที่เรียกว่า ส่วนยับยั้ง (Quencher) ในสภาวะที่โพรบเป็นเส้นที่สมบูรณ์ ถ้าส่วน รายงานผล 5’ ได้รับการกระตุ้นจากแหล่งพลังงาน เช่น หลอดไฟ ให้เข้าสู่สถานะกระตุ้นเกิดความไม่เสถียรจึงคายพลังงานออกมาส่วน ยับยัง้ จะดูดซับพลังงานทีส่ ว่ นรายงานผลคายออกมาเอาไว้ทงั้ หมด จึง ไม่สามารถเห็นการเรืองแสงของส่วนรายงานผลได้ เมื่อใดก็ตามที่มีการเพิ่มปริมาณของชิ้นส่วนดีเ อ็นเอเป้า หมาย โพรบไฮโดรไลซิสจำ�เพาะจะต้องถูกย่อยด้วยเอนไซม์ 5’ เอกโซนิวคลีเอส ทำ�ให้ส่วนรายงานผลเป็นอิสระจากส่วนยับยั้ง ส่วน รายงานผลไม่ถูกดูดซับพลังงานโดยส่วนยับยั้งอีก ทำ�ให้สามารถตรวจ วัดการเรืองแสงจากส่วนรายงานผลได้ ดังนั้น หากมีการเพิ่มปริมาณ ของดีเอ็นเอที่สนใจ จะมีส่วนรายงานผลที่เป็นอิสระเพิ่มขึ้นเรื่อยๆ ใน ทุกรอบของเรียลไทม์พีซีอาร์ Solaris™ Hybridization Probe เทคนิคนี้ประกอบด้วย 10 Food Safety Solutions by

WHAT IS REAL-TIME PCR?

Real-Time PCR is a technique for detecting the DNA quantification. The purpose of Real Time PCR is to measure the reaction in exponential phase. That’s reason why Real-Time PCR reaction need fluorescence. The fluorescence intensity is corresponding to a number of PCR product generated. It can also monitor every PCR cycle. Measuring genetic materials by using realtime PCR can be done with several methods. SYBR® Green Real Time PCR: It relies on intercalating dye/ minor groove binder. SYBR® Green I dye binds to minor groove of dsDNA. When dsDNA of PCR product increases, fluorescence intensity is increased accordingly. This technique is limited because SYBR® Green bind to every single piece of dsDNA whether it is targeted or not. Melting curve analysis is thus crucial to determine if fluorescence is increased due to increasing of targeted DNA, to prevent false positive reading. In both conventional PCR and real-time PCR SYBR® Green based technique, targeted DNA fragments are specified only by specific primers. However, real-time PCR Probe based technique provides more specificity because it employs specific primers and specific probe. (Probe is oligonucleotide which is specific to DNA fragments and is tagged with fluorescence as an indicator of increasing of genetic materials.) TaqMan® Hydrolysis Probe: This technique consists of a pair of specific primers and a piece of double hydrolysis probe per a targeted gene. TaqMan® Hydrolysis Probe anneals between the forward primer and the reverse primer. The 5’ terminal of hydrolysis probe is tagged with fluorescence called reporter, and the 3’ terminal is tagged with quencher molecule. In a complete probe, if the 5’ reporter is stimulated by external energy sources, such as a lamp, to excited state, it releases energy due to its instability. Quencher then absorbs energy released, so luminescence of reporter does not occur. Whenever there is an increase in targeted DNA quantity, specific hydrolysis probe will be digested by 5’ exonuclease, reporter is then independent from quencher. Energy from reporter is not absorbed by quencher any longer. Reporter’s fluorescence is measurable. So, if there is an increase in targeted DNA quantity, free reporter is increased in every PCR cycle. Solaris™ Hybridization Probe: This technique consists of a pair of specific primers and a piece of Solaris™ Hybridization Probe per a targeted gene. Solaris Probe is a modified probe to enhance binding ability to template DNA. Super base A and super

ADVERTORIAL

ภาพที่ 2: การวิเคราะห์ด้วยเทคนิคเรียลไทม์พีซีอาร์ Suretect™ ที่ง่ายดาย รวดเร็ว และเชื่อถือได้ Figure 2: Fast and Reliable with Simple Suretect™ Real Time PCR Analysis

ไพรเมอร์จำ�เพาะ 1 คู่ และไฮบริดโพรบ Solaris™ 1 เส้นต่อยีนเป้า หมาย 1 จุด โพรบ Solaris เป็นโพรบดัดแปลงเพื่อให้มีการจับกับ เทมเพลตดีเอ็นเอได้ดีขึ้น โดย Super base A และ Super base T จะจับกับเทมเพลตดีเอ็นเอได้เสถียรมากขึ้น ช่วยลดปัญหาความ อ่อนแอของพันธะ A=T และ Super base G จะลดปัญหาการจับคู่ กันเองของกวานีน (guanine-guanine self-association) ทีม่ กั เป็น อุปสรรคในการจับของโพรบในบริเวณทีม่ กี วานีนในสัดส่วนสูง (G rich) การตรวจสอบเชือ้ ก่อโรคในอาหารโดยใช้ชด ุ ตรวจสอบเรียล ไทม์พีซีอาร์ Suretect™ ชุดตรวจสอบเรียลไทม์พซี อี าร์ Suretect™ เป็นชุดตรวจสำ�เร็จรูป ทีใ่ ช้ตรวจการปนเปือ้ นของแบคทีเรียในอาหาร โดยอาศัยเทคนิคเรียลไทม์ พีซอี าร์ Solaris™ Probe ซึง่ เป็นเทคนิคทีใ่ ห้การตรวจวัดทีม่ คี วามถูก ต้องแม่นยำ�สูง Suretect จะตรวจสอบยีนเป้าหมาย 2 ชุด ในปฏิกริ ยิ า หลุมเดียวกัน (Duplex real-time PCR) ได้แก่ ยีนเป้าหมายที่เป็น เชื้อก่อโรคและยีนควบคุม (Internal amplification control, IAC) ซึ่งตรวจไว้เพื่อป้องการผลลบปลอม (False negative) ในชุดตรวจ 1 ชุด จะประกอบด้วยสาร Suretect™ Lysis ในหลอดขนาด 0.2 มิลลิลติ ร, ฝาปิดหลอด Suretect™ Lysis, เอนไซม์ Suretect™ Proteinase K, หลอด Suretect™ Salmonella PCR (มีเม็ดที่มี ส่วนประกอบทีจ่ �ำ เป็นในการเกิดปฏิกริ ยิ าผ่านการทำ�แห้งแบบแช่เยือก แข็ง -lyophilized bead), และ ฝาปิดหลอด Suretect™ PCR ขั้นตอนการตรวจด้วยชุด Suretect™ ถูกออกแบบมาให้ ง่ายต่อการใช้งาน มีขั้นตอนการดูดสารน้อย เพื่อลดความเสี่ยงในการ เกิดการปนเปื้อน เริ่มต้นจากการดูดเอนไซม์โปรตีเนสเคและสารช่วย เพิ่มจำ�นวน (Enrichment) มาเติมลงในหลอดย่อย (Lysis tube) แล้วนำ�ไปบ่มที่ 37 องศาเซลเซียส นาน 10 นาที และ 95 องศา เซลเซียส นาน 5 นาทีตามลำ�ดับ เป็นการสกัดดีเอ็นเอด้วยวิธกี ารย่อย (Lysis method) จากนั้น นำ�ดีเอ็นเอที่สกัดได้เติมลงใน Suretect™ Lyophilized assay bead แล้วนำ�เข้าเครื่องเรียลไทม์พีซีอาร์เพื่อ ตรวจวิเคราะห์ต่อไป 

base T bind to template DNA more stably. It reduces weakness of A=T bond. Super base G reduces guanineguanine self-association which is often a barrier of probe binding at G-rich region. SURETECT™ REAL TIME PCR FOR FOOD PATHOGEN DETECTION

Suretect™ Real Time PCR system is a ready-touse assay kit to detect bacterial contamination in food. It is based on Solaris Probe real-time PCR technique, which is a highly precise and accurate technique. Suretect detects two targeted genes in the same tube (Duplex real-time PCR), including pathogen’s targeted gene and IAC target (internal amplification control). It helps preventing false negative. A kit consists of Suretect™ Lysis reagent in 0.2 mL tube, Suretect™ Lysis tube caps, Suretect™ Proteinase K, Suretect™ Salmonella PCR tubes (Lyophilized bead is composed of required reagents), and Suretect™ PCR caps. Suretect™ test is designed for simple uses with less liquid transfer to reduce risk of contamination. It starts with transfer proteinase K and enrichment into lysis tube and incubates at 37°C for 10 min, and 95°C for 5 min, respectively. It is DNA extraction by lysis method. Extracted DNA is transferred to Suretect™ lyophilized assay bead and analyzed by real-time PCR instrument. 

www.thermofisher.com

food safety COMPLETE SOLUTIONS. COMPLETE CONFIDENCE. Find the solutions you need for each step of your microbiological food safety testing workflow.

MEDIA PREPARATION & SAMPLE ENRICHMENT Dehydrated Culture Media

Dry-Bags™ Enrichment Media

Available in a choice of pack sizes to suit your needs

Reduce time & labor when preparing media in-house

Prepared Media Available as prepared bottles, tubes & bags in volumes to suit your workflow

Maximize efficiency & reduce your QC burden with a choice of dehydrated or ready-to-use media & automated enrichment solutions.

SAMPLE PREPARATION & DETECTION For Reliable, Cost-effective Pathogen & Routine Organism Testing Use: Culture Media Quality assured, FDA & ISO compliant in dehydrated or prepared formats CAN BE USED WITH

Dynabeads™ & BeadRetriever™ System Best suited for testing beef & other products for E.coli O157:H7 & other STEC OR WITH

Pathatrix™ Auto System

Media Dispensing & Sample Blending Fast, accurate dispensing Powerful, reliable blending of of media with Diluflux™ samples with Homogenizer Automated Gravimetric Dilutor Laboratory Blender

Analyze even the most challenging samples with proven solutions fit for any & all food testing workflow preferences.

For Rapid, Quantifiable Pathogen Testing Of Complex Matrices Use: MicroSEQ™ Pathogen Detection System Batch process up to 96 samples WITH

PrepSEQ™ Rapid Spin Sample Preparation Kit Ideal for <50 samples per day OR WITH

Maximize throughput, ideal for >50 samples per day OR WITH

Pathatrix Auto System Reduce false positives & indeterminate results when testing challenging samples with low positivity rates

CONFIRMATION & IDENTIFICATION A range of options including O.B.I.S.™ Identification System, RapID™ Systems & MicroBact™ range or individual biochemical reagents

SureTect™ Real-Time System Small footprint, low noise instrument with simple, rapid direct lysis sample preparation process. Fit for continuous processing of 1-120 samples.

PrepSEQ™ Nucleic Acid Extraction Kit & MagMAX™ Express-96 Processor

Best for testing challenging samples with low positivity rates

Biochemical Identification

For Quick, Simple Pathogen Testing Use:

TaqMan™ custom assays,

CeeramTools™ virus kits, Imegen™ meat speciation & GMO tests can be run on the same open platform, Applied Biosystems™ 7500 Fast Real-Time PCR instrument

Differentiate and confirm micro-organisms with a range of products using biochemical, immunological or molecular characteristics. Immunological Identification

Molecular Identification

Quality Control Organisms

Latex tests and agglutinating sera for clearing or confirming presumptive positives with identification possible to genus, species or serotype level

TaqMan and RapidFinder™ Real-Time PCR assays for identification beyond genus and species level, e.g. specific Salmonella serovars and STEC O-groups

For ensuring consistency in media preparation & in test performance

For a more complete workflow, visit thermoscientific.com/foodmicrosolutions © 2015 Thermo Fisher Scientific Inc. All rights reserved. All trademarks are property of Thermo Fisher Scientific Inc. and its subsidiaries, unless otherwise specified. Taqman is a registered trademark of Roche Molecular Systems Inc., used under permission and license.

Contact information: Contact Information: Thermo Fisher Scientific (Thailand) Co.,Ltd. 993-048 microbiology@thermofisher.com USA +1 800 255 6730 158/6 Aneckvanich Bldg. 6th Fl., Room B, D., SoiLT2200A Sukhumvit 55, Sukhumvit Road, North Klongton, Wattana, Bangkok 10110 International +44 (0) 1256 841144 October 20152 714 7835-6 potchara.sungtong@thermofisher.com Tel +66 Fax +66 2 714 7837