Cultiu “in vitro” de plantes ornamentals
Alumna: Paula Bassagañas Òdena Grup: 2n de Batxillerat Institut: INS el Calamot Data: 09 /01/2012 Tutor: Marga Domènech
Agraïments Voldria donar les gràcies especialment a la UPC per posar els medis i les infraestructures necessàries per dur a terme l’estudi, i a Nuria Cañameras, professora de la universitat per al suport en el descobriment d’aquesta tècnica. D’altra banda voldria agrair també l’ajuda a totes les noies amb qui vaig realitzar l’estudi, amb qui he compartit dades, coneixements i un estiu entranyable. Gràcies també a la meva tutora del treball de recerca Marga Domènech per tota l’ajuda, i el temps invertit en el meu projecte, i per la il·lusió que juntes hem compartit. I per últim i no menys important voldria donar les gràcies als meus pares per que han estat en moltes ocasions la llum al final del túnel, la mà que m’ha ajudat a seguir i sobretot per transmetre’m l’afany per aprendre.
2
ÍNDEX 1. Introducció ....................................................................................................... 4 2. Què és el cultiu “in vitro”? ................................................................................ 5 2.1. Fonaments del cultiu “in vitro” ................................................................... 6 2.2. Per a què serveix el cultiu “in vitro” ........................................................... 8 2.3. Història del cultiu “in vitro” ...................................................................... 11 2.4. Futur del cultiu “in vitro” ........................................................................... 12 3. Quina és la seva metodologia de treball? ...................................................... 14 3.1. Estris i equipaments necessaris .............................................................. 14 3.2. Condicions de treball ............................................................................... 28 3.3. Metodologia ............................................................................................. 30 3.3.1. Elaboració de varis medis de cultiu .................................................. 30 3.3.2. Selecció de les espècies .................................................................. 34 3.3.3. Neteja i desinfecció dels individus seleccionats............................... 37 3.3.4. Micro propagació de les plantes ....................................................... 39 3.3.5. Seguiment del seu desenvolupament. .............................................. 40 4. Resultats ........................................................................................................ 41 4.1. Resultats obtinguts .................................................................................. 41 4.2. Anàlisis dels resultats .............................................................................. 43 4.3. Conclusions ............................................................................................. 46 5. Glossari.......................................................................................................... 49 6. Bibliografia ..................................................................................................... 51 7. Annexos ......................................................................................................... 52
3
1. Introducció
De vegades sembla que la ciència està a anys llum de la vida real. Les paraules com transgènic, micropropagació, nanociència etcètera encara són difícils de pronunciar, encara són difícils de digerir. Ben bé com si una barrera entre la realitat i la ciència ficció s’hagués interposat entre nosaltres i un món que cada dia se’ns presenta més misteriós.
Una d’aquestes tècniques innovadores i gairebé desconegudes és el cultiu “in vitro”, que tot i això és molt present en el nostre dia a dia. Segur que heu anat a comprar alguna planta ornamental. Doncs bé les probabilitats que aquesta fos provinent d’un cultiu “in vitro” són elevades . Sense anar més lluny si haguéssiu comprat una orquídia aquesta probabilitat estaria a prop del cent per cent.
I aquesta proximitat entre el món de ficció i el món real és el que m’ha empès a fer aquest treball. Per realitzar-lo he fet l’estudi a la UPC utilitzant aquest mètode, m’he documentat a la biblioteca de la mateixa UPC, i he cercat a Internet, que és on he trobat més informació, ja que és una tècnica relativament recent i l’arxiu bibliogràfic no és gaire ampli.
Els objectius d’aquest treball eren bàsicament tres. En primer lloc aprendre a treballar en un laboratori, en segon lloc descobrir què és el cultiu “in vitro” i en què és basa. I per últim la pregunta: quines hormones s’han de combinar amb el medi de cultiu per tal que un vegetal tingui el màxim desenvolupament possible?
4
2.
Què és el cultiu “in vitro”? El cultiu “in vitro” és una tècnica que permet mantenir i/o fer desenvolupar
el material vegetal en condicions d'asèpsia* sota unes condicions ambientals controlades( nutrició, llum, temperatura, humitat relativa...)
De manera que a partir d’un òrgan com pugui ser una fulla, o d’una gemma* en podem obtenir centenars d’individus. I això com veurem més endavant comporta moltes avantatges sobre el conreu normal.
Per a dur a terme aquest procediment es seguiran cinc fases. La primera fase o fase 0, consisteix en la tria de la planta mare. Aquesta tria s’efecturà tenint en compte criteris com la productivitat, la presència de microorganismes endògens, la resistència etc.
La següent fase s’anomena establiment del cultiu. Segons quina planta triem necessitarà unes sals minerals* i unes hormones* determinades. De manera que elaborarem un medi adequat on la planta pugui créixer ràpidament.
La fase II consisteix en la multiplicació dels propàguls, és a dir aquells òrgans o parts de la planta que hem decidit cultivar ( fulles, gemmes, tiges...) Col·locarem cada propàgul en contacte amb un medi.
A continuació en la fase III prepararem els cultius per a que tolerin les condicions “ex vitro”. Això vol dir que s’aniran adaptant les condicions de llum, temperatura, humitat, etc. Segons les condicions en les que es trobaran les plantes quan es plantin en un hivernacle o camp de conreu.
I per últim la fase IV s’anomena aclimatació, i consisteix en plantar la planta en condicions “normals”. Primer tapada, per que són especialment sensibles a plagues i microorganismes, desprès parcialment tapades i finalment destapades del tot. Aquest procés pot ser més o menys llarg depenent de l’espècie.
5
En el nostre estudi només hem arribat fins a la fase II ja que el que ens interessava era veure quin medi de cultiu i quins reguladors del creixement produïen un major desenvolupament. Cal tenir en compte que saber això és essencial, ja que per a dur a terme les següents fases , les plantes hauran de tenir com a mínim 2 cm de llarg.
2.1. Fonaments del cultiu “in vitro” El cultiu “in vitro” es basa en la totipotencialitat cel·lular. És a dir la capacitat d’una cèl·lula per donar lloc a un organisme en cas que les condicions ambientals li siguin favorables. En els animals és difícil trobar cèl·lules totipotents, ja que és concentren en els teixits embrionaris.
En canvi en les plantes podem trobar fàcilment teixits indiferenciats amb la capacitat de dividir-se. Aquest teixit l’anomenem meristema i està format per cèl·lules petites, iodimètriques, de paret fina, de nucli actiu i amb vacúols* petits i escassos.
Per tal de mantenir estable aquest teixit indiferenciat les cèl·lules es divideixen per mitosi*. De manera que es formaran dues cèl·lules, una de les quals es manté com a cèl·lula inicial, i l’altre serà una cèl·lula derivada i per tant diferenciada.
6
Trobem diferents tipus de teixit meristemàtic depenent el lloc on es trobi i la funció que realitzi. Els que es situen a la punta del tall o les arrels els anomenarem meristema primari, promeristema o meristema apical.
En segon lloc trobem els meristemes secundaris que es distribueixen al llarg de tota la planta i que s’encarreguen del creixement radial, és a dir de l’engruiximent del tall i de les arrels. Procedeixen de cèl·lules adultes que han recuperat la capacitat de divisió.
Un cop hem parlat d’aquests dos tipus ens cal aprofundir-hi. Així doncs començant pels promeristemes direm que a partir del meristema apical del tall i de l’arrel es desenvolupen tots els teixits* primaris com per exemple el xilema i el floema.
Normalment el meristema apical de l’arrel es troba protegit per una estructura de cèl·lules diferenciades anomenada còfia. Mentre que el meristema apical del tall està protegit per un primordi foliar* que l’emboliquen formant gemmes.
7
En aquests meristemes podem distingir tres capes de cèl·lules que es classifiquen segons el teixit* que originin: procàmbium, protoderma, i meristem fonamental. Gràcies a aquests teixits es poden formar per ordre d’aparició el sistema de teixits vasculars, el sistema de teixits dèrmics i el sistema de teixits de creixement.
Aquests meristemes tenen diverses funcions,però les que més destaquen són l’auto perpetuació, la creació de cèl·lules somàtiques* i l’establiment dels patrons de desenvolupament dels òrgans. Les dues primeres funcions estan clarament relacionades amb el sistema de divisió cel·lular.
Aprofundim en els meristemes secundaris. Aquests contribueixen a fer les arrels i el tall més ample i donen lloc a un creixement radial, també anomenat creixement secundari. Aquests meristemes es troben distribuïts a tota la planta de manera que produeixen un seguit de capes concèntriques que engrosseixen l’eix.
2.2. Per a què serveix el cultiu “in vitro” Aquesta és una tècnica molt estesa tant en laboratoris com en la indústria i té diverses finalitats. Les més importants són: 1. Germinació de llavors: procés pel qual una llavor o espora surt d’un període de dormició
8
2. Multiplicació vegetativa: mètode que consisteix en multiplicar una planta a partir dels seus òrgans 3. Obtenció de plantes lliures de microorganismes: això evita la mort prematura de la planta, que la planta no sigui productiva, o que perdi algunes de les seves qualitats.
4. Producció
d’haploides:
organismes
que
posseeixen
una
dotació
cromosòmica formada per una sola sèrie (n) de cromosomes. Com que gràcies al cultiu “in vitro” les podem reproduir ràpidament el que es fa és completar l’altre sèrie cromosòmica de forma artificial i aquesta es podrà utilitzar i transformar genèticament.
5. Estudis fisiològics diversos: és a dir estudis dedicats a aquesta subdisciplina de la botànica que es dedica a l’estudi del funcionament dels òrgans i teixits. Això a la pràctica repercuteix directament sobre l’agricultura i l’horticultura, ja que s’estudien els requisits climàtics, la maduració dels fruits, necessitat de nutrients etc.
6. Obtenció d’híbrids: organismes vius procedents de l'encreuament sexual entre dues espècies diferents. Amb l’objectiu d’obtenir fruits amb millors atributs, com més dolçor, més consistència, més color... Un exemple d’aquest encreuament és el pluot, que és el resultat de la unió d’un préssec i una cirera.
7. Obtenció de metabòlits secundaris: són compostos químics sintetitzats per les plantes que compleixen funcions no essencials, de forma que la seva absència no és letal per a elles. Són compostos molt utilitzats en la industria, ja que d’aquests se n’extreuen ceres, coles, pigments, saboritzants i fins i tot medicines i verins.
9
2.2.1.Avantatges Les avantatges a nivell científic és poden resumir en els següents punts: - Descendència igual a la planta mare ( clons) - Ràpida multiplicació: en pocs mesos tenim centenars de nous individus - Baixa necessitat de la planta mare: tan sols es necessita un individu per obtenir molta descendència - Propagació d’espècies de difícil multiplicació: per a plantes que tenen problemes d’adaptació al clima, al sòl, amb poca resistència etc. - Espai reduït per a la multiplicació: no es necessiten grans camps de conreu. - Programació de la producció - Material sa - Propagació de noves espècies i cultivars - Intercanvi de material genètic: per tal d’obtenir espècies més resistents i amb millors atributs.
2.2.2. Desavantatges Malgrat els avantatges que presenta i la seva utilitat el cultiu “in vitro” té algunes limitacions: - Necessitat d’una extraordinària planificació - Inestabilitat genètica - Hiperhidricitat - Efecte subcultiu - Contaminacions endògenes i exògenes - Enfosquiment dels medis de cultiu.
10
2.3. Història del cultiu “in vitro” Quan podem començar a parlar de cultiu “in vitro”? Quan s’inicia la seva història? Quins experiments i quines persones l’han fet possible? Segurament el cultiu “in vitro” és el resultat de moltes dècades de investigació, però bé hem de començar i acabar en algun punt.
Doncs bé, en primer lloc, cal parlar d’un científic australià que va plantar les bases de la biologia actual, i per tant del cultiu “in vitro”: Gottlieb Haberlandt. Aquest científic nascut el 1854 va presentar el 1907 un principi que ja hem comentat, la totipontencialitat. I el va enunciar del la següent manera:
“En teoria totes les cèl·lules de les plantes són capaces de donar lloc a una planta completa”
Si avancem en la historia aviat podrem trobar dues grans escoles pioneres en el cultiu “in vitro” En primer lloc cal destacar l’americana dirigida pel Dr. White que al 1934 publicà el cultiu indefinit de l’arrel del tomàquet i en segon lloc la francesa encapçalada pel professor Gautheret que va treballar en el cultiu “in vitro” de teixits vegetals per androgènesis.
Hem d’assenyalar també que el punt de vista d’ambdues escoles era ben diferent. Mentre que la americana utilitzava aquesta metodologia per intentar solucionar problemes reals la francesa l’utilitzava per
conèixer els aspectes
fonamentals de la histodiferenciació* cel·lular.
Cap
d’aquests
dos
científics
extraordinaris
va
aconseguir
però
desenvolupar un medi de cultiu que permetés el creixement d’una planta a partir de fulles, arrels o qualsevol altre òrgan vegetal. No va ser fins al 1962 que el misteri va ser resolt pels científics Toshio Murashige i Folke K. Skoog.
11
Skoog va ser un científic suec especialitzat en els reguladors del creixement vegetal, i que va viure a EE UU durant gran part de la seva vida. La seva carrera va ser especialment prolífica durant la seva estada a la universitat de Wisconsin-Madison. I que les seves investigacions van avançar notablement quan Carlos Miller va descobrir la kinetina i la benziladenina.
Murashige va ser un dels seus alumnes més destacats i junts van fer el descobriment més important per al cultiu del teixit vegetal. La tesis de Murashige buscava trobar una hormona que permetés un creixement més ràpid de la planta del tabac. Però en comptes d’això Murashige i Skoog van descobrir un medi a base de sals que en permetia el seu desenvolupament en asèpsia.
2.4. Futur del cultiu “in vitro” El cultiu “in vitro” és avui en dia una tècnica en investigació, però que té molt bones expectatives de futur. Ara mateix, s’observen però alguns inconvenients que en dificulten l’estudi i la utilització sóc del parer que tindrà un paper molt important en les societats futures.
Els inconvenients que en frenen el desenvolupament són bàsicament tres. En primer lloc i més important és econòmic. De moment és més barat cultivar en camps que no en laboratoris, doncs es necessita personal especialitzat i unes instal·lacions molt complertes.
Aquest primer problema es podrà veure compensat quan aquesta tècnica es pugui mecanitzar o quan pugi el preu de cultivar en camps ( augment dels salaris precaris en zones com Àsia, Àfrica o Amèrica del Sud). Aquests són alguns dels esdeveniments que podrien afavorir el cultiu “in vitro”.
12
El segon obstacle que troba és el desconeixement del medi de cultiu adequat per al desenvolupament de la planta. Ja que moltes plantes no poden ser cultivades exitosament ja que no es coneix el medi de cultiu adequat. Aquest és potser el problema de més fàcil solució, doncs és qüestió de temps que es vagin trobant els medis de cultiu adequats. Tot i que sinó s’hi inverteixen diners (problema inicial) tampoc es podrà resoldre aquest primer problema.
I per últim tenim un problema de difícil solució; els bacteris* i fongs* patògens. Com ja sabem en l’aire hi ha centenars de microorganismes i aquestes plantes hi són especialment sensibles. A més cal seleccionar molt bé les plantes mare per tal d’evitar el fongs o virus* endògens.
Avui en dia aquest obstacle és difícil de saltar, ja que és molt complicat i costós crear un espai completament asèptic. Això s’agreuja pel fet que quan una planta es veu afectada és molt probable que contamini a la resta.
Com es pot comprovar encara queden algunes barreres a superar abans que el cultiu “in vitro” sigui una tècnica extensa a tot el món, però si continua avançant a aquest ritme no trigarà a integrar-se en molts àmbits de les nostres vides.
13
3. Quina és la seva metodologia de treball?
3.1. Estris i equipaments necessaris
1. Pipetes
Una pipeta és un tub amidat que permet mesurar el volum fix o variable del líquid que aboca. Per a la seva utilització cal col·locar una propipeta a l’extrem contrari per on entren i surten els líquids. Aquesta propipeta ens ajuda a succionar i abocar la quantitat desitjada de líquid.
Utilitzem la pipeta per succiona un líquid extret d’un recipient inicial i abocar certa quantitat d’aquest líquid a un recipient final. De manera que primer succionem aquest líquid d’un recipient amb la propipeta i després aboquem la quantitat necessària en un altre.
Per utilitzar la pipeta i la propipeta cal tenir dues normes presents. En primer lloc mai s'ha de posar la pipeta dins del recipient original del líquid o solució, ja que podríem fer que aquest líquid quedés contaminat o la dissolució canviés la relació entre el solut i el dissolvent.
Per tant sempre posarem abans el líquid o dissolució en un altre recipient com per exemple un vas de precipitats. En segon lloc cal advertir que sempre es mantindrà la pipeta en posició vertical per tal d’evitar el contacte entre el líquid i la propipeta.
14
2. Vidre de rellotge
El vidre de rellotge és una làmina de vidre de forma circular concavoconvexa - convexocòncava. Es diu així perquè s’assembla als vidres dels antics rellotges de butxaca. S'utilitza en química per evaporar líquids, pesar productes sòlids o com a coberta de vasos de precipitats.
15
3. Varetes d’agitació
Una vareta de vidre, agitador de vidre o vareta agitadora és un fi cilindre massís de vidre que serveix per a remenar dissolucions, per barrejar productes químics i líquids en un laboratori
Acostumen a ser peces d'uns 5-6 mm de diàmetre, i de 200 a 500 mm de longitud utilitzades dins de l'equip de laboratori [2] amb la funció de remoure els soluts afegits al dissolvent en un matràs o got de precipitats i afavorir la seva dissolució .
4. Embut
L’embut és un estri amb forma de con invertit. Es buit per dins i a l’extrem inferior acaba amb un coll. S’utilitza per transvasar líquids i per a a filtració per gravetat ( col·locant un filtre a l’extrem superior)
16
5. Matràs aforat
El matràs aforat és un recipient amb forma de pera, fons pla i un coll llarg i prim. Està fabricat de vidre, vidre borosilicatat o polipropilè. Normalment tenen una marca al coll que n’indica la quantitat de líquid que conté si aquest està en una temperatura donada ( usualment 20ºC).
6. Proveta
La proveta és un instrument volumètric, que permet mesurar volums superiors i més ràpidament que les pipetes, encara que amb menor precisió. Està format per un tub generalment transparent d'uns centímetres de diàmetre, i té una graduació (una sèrie de marques gravades) des de 0 mil·lilitres fins al màxim de la proveta indicant diferents volums.
La part inferior està tancada i té una base que serveix de suport, mentre que la superior està oberta que permet introduir el líquid a mesurar i sol tenir un bec|pic que permet abocar|vessar el líquid mesurat. Generalment mesuren volums de 25 o 50 mil·lilitres, però existeixen provetes de diferents mides; fins i tot algunes poden mesurar un volum de 250 mil·lilitres
17
7. Tubs d’assaig
Els tubs d’assaig van ser molt importants en les pràctiques. Consisteix en un tub estret i llarg de vidre, obert per l'extrem superior i amb l'extrem inferior tancat i de forma arrodonida. Va ser en aquest continguts on vam dipositar les gemmes i els òrgans de les plantes per a que es desenvolupessin.
18
8. Vas de precipitats
Un vas de precipitats és un instrument per a contenir líquids, utilitzat habitualment en el laboratori. Té forma cilíndrica, amb un fons pla; se'n poden trobar de capacitats diverses, des d'un mil·lilitre fins a diversos litres. Normalment és de vidre o plàstic i sol estar graduat.
Malgrat tot, per la seva pròpia naturalesa, aquesta graduació és poc exacta, i per tant és recomanable no utilitzar-lo per a mesurar volums de substàncies. S'utilitza, doncs, sobretot per a transportar líquids a un altre recipient, com ara a una proveta o a un tub d'assaig.
Resistent als canvis bruscos de temperatura, té múltiples usos en el laboratori: escalfar, dissoldre...
9. Espàtules
L’espàtula de laboratori es fabriquen en metall i en diferents formes, algunes duen els dos caps acabats en pala i d'altres duen un cap acabat en cullera. S’utilitzen per agafar quantitats de substàncies ja siguin grans o petites i transportar-les.
19
10. Pinces
Les pinces són un estri amb dues parts mòbils que d'una manera o altre es poden moure per subjectar entremig a un altre objecte. Les pinces són un cas específic de palanca de tercer tipus, en les que l'objectiu no és aplicar més força sinó tindre més precisió.
Al laboratori s’utilitzen per manipular objectes o substàncies sòlides molt petites i que necessiten gran precisió, per transportar tubs d’assaig o portaobjectes prop del foc...
20
11. Bisturí
El bisturí és un instrument en forma de ganivet, petit de fulla molt prima d’un o dos talls. S’utilitza molt en cirurgia i en les autòpsies, però en el nostre cas el fem servir per tallar els fragments vegetals seleccionats.
12. Gradeta
Una gradeta és un instrument de laboratori que té per finalitat mantenir-hi els tubs d'assaig o d'hemòlisi drets .
21
13. Paper de plata
El paper de plata s’utilitza per embolicar els estris que posteriorment es col·locaran a l’autoclau.
14. Agitador Magnètic
L’agitador magnètic és una barra magnètica coberta de plàstic (tefló) que és col·loca dins d'un recipient on trobem un solut i un dissolvent. Aquest es posa damunt d'una plataforma circular la qual té un imant rotatori o un conjunt d'electroimants disposats de forma circular.
Aquest imant o conjunt d’imants creen un camp magnètic giratori. Això permet barrejar les dues o més substàncies de forma fàcil, ràpida i homogènia i a més depenent del model ens permet escalfar els elements que es dissolguin més fàcilment.
22
15. pH-metre
El pH-metre realitza la mesura del pH* per un mètode potenciomètric. Aquest mètode es basa en el fet que entre dues dissolucions amb diferent concentracions d’ions hidrogen (H+) s'estableix una diferència de potencial. Aquesta diferència de potencial determina que quan les dues dissolucions es posen en contacte es produeixi un flux d'H+, o en altres paraules, un corrent elèctric.
A la pràctica, la mesura del pH és relativa, ja que no es determina directament la concentració de H+, sinó que es compara el pH d'una mostra amb el d'una dissolució patró de pH conegut. Per a això s'utilitza un elèctrode de pH.
Quan l'elèctrode entra en contacte amb la dissolució s'estableix un potencial a través de la membrana de vidre que recobreix l'elèctrode. Aquest potencial varia segons el pH. Per determinar el valor del pH es necessita un elèctrode de referència, el potencial no varia. L'elèctrode de referència pot ser extern o pot estar integrat en l'elèctrode de pH
23
Com els elèctrodes de vidre de pH mesuren la concentració de H + relativa a les seves referències, han de ser calibrats periòdicament per assegurar la precisió. Per això s'utilitzen buffers de calibratge (dissolucions reguladores de pH conegut).
16. Nevera
L’ús de la nevera en un laboratori és bàsicament mantenir les dissolucions i d’altre elements a una temperatura baixa i constant.
D’aquesta manera
els
mantenim fora de perill ( materials inflamables) i també en les condicions òptimes per al posterior treball.
24
17. Balances de precisió
Hi ha molts tipus de balances però al laboratori fem servir les balances analítiques. Aquestes balances són digitals i tenen un marge d’error mínim per tant podrem prendre mesures molt precises. Usualment també poden desplegar la informació en diferents sistemes d’unitats.
Estan protegides per unes vitrines que tanquen la balança per tal de protegir-la de possibles corrents d’aire, de la pols o de variacions de la temperatura per tal de fer la balança encara més precisa. Normalment és accessible per davant o pels laterals, per poder manipular la mostra.
18. Autoclau
L’autoclau és un dispositiu que serveix per esterilitzar els estris del laboratori. S’utilitza vapor d’aigua a alta pressió i temperatura. Gràcies a la pressió i a la temperatura el vapor arriba a 121ºC i l’aigua no arriba a bullir. Això provoca la desnaturalització de les proteïnes dels microorganisme.
25
Els autoclaus son capaços de generar o permetre l’entrada de vapor, però n’impedeixen la sortida fins a obtenir uns 103 kPa de pressió. Normalment a 103kPa i 121ºC el temps òptim per a l’esterilització és d’uns 15-20 minuts.
19. Cambra de flux laminar
Les cambres de flux laminar són receptacles mantinguts en condicions d’esterilitat gràcies a l’establiment d’una pressió d’aire net cap a l’exterior de manera que les manipulacions que es puguin fer en el seu interior siguin fetes en condicions estèrils. S’aconsegueix que l’aire de dins de la cambra de cultiu sigui estèril gràcies a que s’ha fet passar prèviament per un filtre de 0,5µm de diàmetre de porus. La qualitat d’una cambra de flux es mesura pel nombre de partícules més grans que 0,5µm per metre cúbic d’aire filtrat.
26
20. Esterilitzador o incinerador de partícules
L’esterilitzador “Sterilbio” és un instrument que ens permet incinerar pinces, bisturís i d’altres estris petits de laboratori a una temperatura de 900ºC en menys de 10 segons.
27
3.2. Condicions de treball
Per a dur a terme el cultiu “ in vitro” cal treballar en unes condicions molt estrictes i ser molt meticulós. Hi ha una sèrie de normes i condicions que no es poden passar per alt i que s’han de realitzar al peu de la lletra.
Un dels requisits més importants és el de treballar en un ambient el més estèril possible, ja que així impedirem les contaminacions en les plantes. Com s’ha esmentat són plantes extremadament vulnerables als microorganismes.
3.2.1. Normes per l’esterilitat.
La resta de condicions i normes venen donades en gran part per aquesta primera. La segona norma marca que sempre abans de posar-nos a treballar ens rentarem les mans amb sabó, i també la part del braç inferior.
És important tenir el cabell recollit, per tal que no ens impedeixi la visibilitat, que ens interrompi en un moment en que es necessita precisió, i per tal de minimitzar el riscos de que possibles fongs o bacteris entrin en contacte amb les mostres.
També evitarem dur polseres que no es puguin treure i arracades. Aquesta és molt important a l’hora d’entrar a la cambra de flux laminar. Ja que ens molestaran al treballar i tenen adherits molts microorganismes.
Quan s’entra a la cambra de flux laminar s’ha de mantenir la porta tancada i entrar-hi sense cap article subjecte a contaminació. Les mans i braços han d’estar nets i s’han d’anar ruixant amb alcohol al 70% per desinfectar-los.
28
3.2.2. Normes de prevenció de riscos laborals
Aquestes són normes per tal de tenir l’entorn en un estat estèril. Però hi ha un altre seguit de normes que fan referència a la nostra salut i que també són de molta importància per evitar els riscos.
La primera a seguir és portar sempre pantalons llargs i sabates tancades. Evitant les xancletes, els pantalons curts o faldilles. Aquesta és una norma molt important ja que evitarà el contacte de la pell amb substàncies tòxiques o nocives.
No utilitzar tampoc les pipetes sense la propipeta, de manera que les nostres mans no entrin en contacte amb cap de les substàncies amb les que treballarem. També queda prohibit posar-se les mans a la boca sense haver estat rentades .
En cas que hi hagi alguna ferida s’ha de portar tapada. S’ha de saber on hi ha la farmaciola i si hi ha algun incident comunicar-ho immediatament al professor, per evitar que la lesió s’agreugi.
També s’ha de parar especial atenció a l’incinerador de partícules situat a les cambres de flux laminar. És important mantenir el bisturí o pinces 20 segons dins de l’aparell i no sobrepassar aquest temps, sinó l’estri estarà massa calent i ens cremarà.
Aquestes són les normes bàsiques i les condicions en les s’ha de treballar. És. De vital importància que es duguin a terme al peu de la lletra sense excepcions, i amb la màxima rigorositat
29
3.3. Metodologia
3.3.1. Elaboració de varis medis de cultiu
Per a fer l’estudi elaborarem 6 medis cadascun dels quals tindrà una composició igual de sals minerals i vitamines* i s’ajustarà a un pH* d’entre 5,7 i 5,8. La única cosa que variarà seran les hormones de cada medi i les seves proporcions.
Les quantitats de cada substància són extretes del cultiu de Murashigue i Skoog del 1962, però amb algunes modificacions que s’han introduït gracies a estudis més recents.
Per a dur a terme la correcta elaboració dels medis, seguirem el següent procediment: 1. Omplir un vas de precipitats amb 250 ml d’aigua destil·lada
2. Afegir les sals minerals en ordre, per tal d’afavorir la seva completa dissolució
3. Omplir dos matrassos aforats ( un de 100 i un de 200 ml) amb la dissolució obtinguda en el punt 2
4. Acabar d’omplir els matrassos anteriors amb aigua destil·lada i enrasar a 100 i 200 ml.
5. Un cop tenim els matrassos enrasats s’aboquen les solucions en un vas de precipitats i es barregen.
6. S’aboca el contingut en tres vasos de precipitats de 100 ml cadascun
30
7. Diluïm a cada vas les hormones corresponents a cada medi.
8. Com que no volem 100 ml sinó 500ml de cada medi ara posarem el medi dins un matràs aforat de mig litre i omplirem la diferència amb aigua destil·lada. Repetim el procés amb tots els medis.
9. Posem la solució a l’agitador magnètic per homogeneïtzar-la.
10. Seguidament utilitzarem el pH-metre per comprovar el pH de la solució. Si és massa baix hi afegirem un compost bàsic fins a assolir pH 5,7-5,8. En canvi si es massa alt hi afegirem una solució àcida fins a obtenir el pH.
11. Afegir l’agar* en cadascun dels vasos de precipitats.
12. Per tal que l’agar es dissolgui en el medi de cultiu i no formi grumolls, escalfarem el medi a una temperatura de 90ºC
13. S’omplen els diferents tubs d’assaig amb la mateixa quantitat de medi de cultiu. I es classifiquen segons el medi.
14. S’introdueixen els tubs d’assaig a l’autoclau. 15. Es deixen refredar els tubs d’assaig en posició inclinada fins que el medi s’endureix ( textura gelatinosa). D’aquesta manera si precipita aigua aquesta no ofega la planta.
31
De manera que tots els medis tindran la següent composició: Número de la
Sal mineral
Pes (mg/L)
Quantitat solució
solució
mare (ml/L)
1
1650
10
2
1900
20
3
6,2
5
0,83 0.25 0.025 4
170
10
5
440
10
6
370
10
7
Microelements
5 22,3 8,6 0,025 5
8 37,3 27,8
9
Vitamina B1
0,5
5
Vitamina B6
0,5
5
Àcid nicotínic
0,5
5
Glicocol·la
2
20
Inositol
100
Pesar
Sacarosa
30000
Pesar
Hormones
32
BAP
5
Agar
10.000
Aquests són les sals i altres compostos que conformen el medi mare. Però a més a més a cada medi hi afegirem les següents hormones:
Medis
NAA(
KIN
BAP
0
0
0
0
1
0
0
5
2
0
5
0
3
5
0
0
4
2,5
0
2,5
5
2,5
2,5
0
La hormona NAA ( àcid naftalenacètic) és una auxina que s’encarrega de la regulació
del
creixement
vegetal.
Es
concentra
principalment
a
les
meristemàtiques, i produeix una elongació de les cèl·lules. La seva principal funció és l’arrelament.
Les auxines són un tipus d’hormones que juguen un paper essencial en la coordinació de molts processos de creixement i de comportament en el cicle vital de les plantes. Les auxines i el seu paper en el creixement vegetal van ser revelades per primera vegada pel científic hol·landès Frits Went.
L’hormona KIN (kinetina) i l’hormona BAP són citoquinines que s’encarreguen de la divisió cel·lular en teixits no meristemàtics. A més del seu paper com a reguladores del creixement d’altres òrgans també s’encarreguen de l’obertura dels estomes.
Les citoquinines també són un grup d’hormones que regulen el creixement vegetal, i van ser descobertes a la dècada del 1950. Va ser gràcies a aquestes que Skoog i Murashige van dur a terme el seu descobriment. 33
3.3.2. Selecció de les espècies
Per dur a terme el cultiu “in vitro” hem seleccionat dues plantes diferents. Això ens permetrà poder comparar els resultats i deduir si ambdues espècies reaccionen igual davant dels diferents cultius.
-
Violeta Africana
La primera espècie amb la que tractarem serà la Violeta Africana ( Saintpaulia)
que és una planta ornamental de la família de les gesneriàcies.
Tenen les fulles verdes, vellutades, rectes o ondulades i les flors petites o dobles i amb varietat de colors.
La família de les gesneriàcies són un grup de plantes tubiflores* en la seva majoria d’origen tropical i que consten amb més de 1100 espècies. En general són herbàcies de fulles simples i oposades i de flors hermafrodites pentàmeres i zigomorfes i de fruits en càpsula o en baia.
Dins d’aquesta família les Violetes Africanes són especialment valorades pel seu interès ornamental. En concret utilitzarem l’espècie Saintpaulia Ionantha que es caracteritza per unes flors de color lilós, i fulles arrodonides i carnoses de tacte vellutat.
La Saintpaulia Ionantha és una planta de clima tropical que acostuma a florir a l’estiu. Tot i així pot tenir diverses floracions en qualsevol època. Existint sempre entre elles un cicle de descans de com a mínim sis setmanes.
Un cop aparegudes les flors de petites dimensions aquestes creixeran tant en grandària com en nombre. Solen aparèixer en grupuscles de sis exemplars (simples o dobles) sorgint de talls que neixen entre les fulles.
34
Pel que fa al reg s’ha de ser especialment curós, ja que és una planta molt sensible a l’excés d’aigua, i acostuma a podrir-se. Així doncs mai s’ha de regar directament al tall ni les flors. Tampoc convé mullar les fulles.
El millor serà posar el test sobre un plat amb aigua durant vint minuts per tal que n’absorbeixi tan sols la necessària. Durant l’estiu i primavera cal regar-la dos cops per setmana, a la tardor un cop per setmana i a l’hivern un cop cada 15 dies. Mantenint sempre la humitat elevada.
També és fonamental que no rebi els raigs de llum directament, sobretot a l’estiu. Malgrat tot ha d’estar ben il·luminada i durant l’hivern i tardor es pot deixar a prop de la finestra. És bo que se li afegeixi fertilitzant a l’aigua de reg cada tres setmanes durant la primavera i l’estiu.
Alguns dels problemes més freqüents d’aquesta espècie són els fongs, que poden podrir les fulles, les plagues de mosca blanca que es troben al revés de les fulles i altres tipus d’insectes o plagues com l’àcar o les cotxinilles.
Per realitzar el cultiu vam fer servir dues violetes comprades al Jardiland. Per tant no podem tenir la garantia que no tinguessin bacteris o fongs exògens. Aquesta dada serà de vital importància a l’hora d’analitzar els resultats.
-
Potus
Aquesta segona espècie és una planta enfiladissa, de la família de les aràcies, amb tiges de fins a 20 m de llargada, fulles ovals o cordiformes, de 30 cm, de color verd clar brillant amb taques grogues, les adultes molt més grans i irregularment pinnatífides, i flors amb una espata d'uns 15 cm de llargada que només neixen en les plantes adultes.
35
La família de les aràcies són un conjunt de plantes que engloben 110 gèneres que comprenen unes 2000 espècies de plantes herbàcies, arbustives o fins i tot arborescents, i lianes. La majoria provenen de països intertropicals; algunes, però, venen de la regió mediterrània i l’Europa mitjana.
És una planta que es troba en interiors i en llocs on el clima i l’entorn no afavoreixen el seu desenvolupament. Això provoca que la planta no pugui arribar al seu estadi adult i no arribi a florir. Malgrat tot en estat salvatge si que ho acostuma a fer. Les flors apareixen a finals de primavera o durant l’estiu.
La planta necessita una bona il·luminació, però s’ha d’evitar l’exposició continuada als raigs de sol, ja que podrien cremar les fulles. La temperatura mai ha de baixar dels 10ºC per que comencen a perdre fulles. La seva temperatura òptima es troba entre els 15-20ºC.
A aquesta planta li agrada molt la humitat, i es bo polvoritzar-li les fulles un o dos cops per setmana. D’altra banda la freqüència de reg també és molt important per evitar la putrefacció de les plantes. No regarem mai cada “x” dies, sinó que comprovarem l’estat del substrat. Un cop aquest ja estigui sec des de l’anterior reg, tornarem a regar la planta.
Les fulles de la planta s’han de netejar habitualment, tot passant un tros de cotó fluix humit. Això afavorirà la brillantor natural de la planta. D’altra banda cada tres setmanes s’aplicarà fertilitzant líquid juntament amb l’aigua de reg.
A la
primavera els talls s’han de podar per tal que la planta creixi de manera proporcionada.
Algunes de les problemàtiques més habituals del potus són les fulles grogues causades per la manca de reg, les fulles arrugades, causades pel fred, i fulles amb taques marrons provocades per un excés d’aigua. També són susceptibles a plagues com l’aranya vermella, la cotxinilla, fongs i bacteris.
36
El potus utilitzar per realitzar el cultiu “in vitro” era propietat de la tutora del treball i com que ja hi havia realitzat altres experiments podem assegurar que no tenia cap tipus de microorganisme endogen.
3.3.3. Neteja i desinfecció dels individus seleccionats.
Abans de començar amb la desinfecció caldrà que realitzem una tria de les parts o òrgans de la planta amb que realitzarem el cultiu. De la Violeta en farem servir les fulles i del potus les gemes.
Per poder treballar millor amb les fulles de la violeta les tallarem d’una manera concreta. Així doncs per evitar els resultats distorsionats tallarem la punta de la fulla i la seva base. I per tal de fer porcions més petites la tallarem per la meitat i cada meitat la tallarem altre cop per la meitat.
D’aquesta manera obtindrem porcions més o menys quadrades i de mida regular, evitant els possibles trossos que poguessin distorsionar els resultats. Evitarem també la inclusió a l’assaig de fulles poc sanes, amb taques o poc turgents.
Per preparar el potus el que prioritzarem és la conservació de la gema i l’eliminació del tall innecessari. Per tal d’assegurar-nos que no llancem la gema tan sols ens cal anar traient les fulles de la planta i tallar uns quants centímetres per sobre i per sota de la posició on hi havia la fulla.
De manera que ens quedaran trossos cilíndrics amb una anella de to més blanc al centre. Un cop fet tot això cal assegurar que eliminem la brutícia més superficial de totes les porcions.
37
Per tal de fer-ho cal posar els trossos en dos coladors classificats per espècies. Posem els coladors sota l’aigua i anem agafant un per un cada tros del recipient. Amb un raspall fregarem tota la superfície de la porció suaument per tal de no malmetre-la, li passarem altre cop aigua i la posarem en un nou recipient.
Posteriorment prepararem una dissolució d’hipoclorit de sodi a l’1% per tal de desinfectar la planta. Es fa servir el lleixiu de la marca “Floquet” que té una concentració d’hipoclorit de sodi de 40g/L.
Com que volem un 1% d’hipoclorit de sodi per cada 100ml i el lleixiu tan sols conté la concentració esmentada, per tal de fer la dissolució correcta, per cada 100ml d’aigua hi haurem d’afegir 25ml de lleixiu.
Ens interessa fer 600ml de concentració, per tant necessitarem 150ml de lleixiu. Aquesta quantitat és necessària per a dur a terme el següent pas.
Seguidament agafarem les plantes ja netejades, la dissolució, els recipients que hem posat a l’autoclau, i juntament amb el tween 20 ho durem a la cambra la fluxe laminar.
El Tween 20 és un tensoactiu que redueix la tensió superficial de l’aigua. Aquest farà que la dissolució realment “mulli” les plantes. Sinó degut a aquesta tensió superficial no penetraria en les parts més internes de la planta.
Un cop a la cambra de flux laminar agafem unes quantes fulles i les posem als recipients autoclavats. Un cop fet això acabem d’omplir el pot amb la dissolució i hi afegim unes gotes de Tween 20.
Finalment hi posem el imant de l’agitador magnètic i engeguem l’aparell. Deixarem que el contingut es barregi durant uns 20-30 minuts i retirarem el pot. Seguirem el mateix procediment en ambdues espècies.
38
3.3.4. Micropropagació de les plantes
La micropropagació de les plantes és una pràctica que multiplica el material vegetal molt ràpidament. De manera que a partir d’un sol exemplar se’n poden obtenir centenars.
En el nostre cas multiplicarem la violeta africana i el potus que ja han estat prèviament desinfectats. Cal tenir en compte que els organismes resultants seran extremadament sensibles a bacteris, fongs i virus. Aquests provocaran la mort de la planta, deguda a que es menjaran el seu medi de cultiu, i/o li provocaran problemes de desenvolupament.
Es per això que cal augmentar al màxim les mesures preventives. De manera que cal ruixar tota la cambra amb alcohol d’un 70%, tenir les mans i els braços nets, i haver posat tot el material ( bisturí, paper, pots, tubs d’assaig...) a l’autoclau.
Un cop fet tot això es desembolicarem els materials autoclavats vigilant a no tocar-lo amb les mans. Tan sols tocarem amb les mans les pinces i paper que posteriorment llençarem.
Un cop tot estigui dipositat tindrem: a la banda dreta una pila de trossos de paper mil·limetrat, l’incinerador de partícules, i els trossos de violeta africana o potus, i a l’esquerra tindrem les pinces i bisturís.
39
En primer lloc agafarem un tros de paper mil·limetrat i col·locarem un tall de violeta al damunt. Hem de tallar fragments d’un centímetre quadrat. És necessari, ja que d’aquesta manera evitarem distorsionar els pesos resultants.
Cal també treure els trossos de fulla que tinguin taques, i les vores necrosades pel lleixiu. En el cas del potus no es tindrà tan en compte el fet que mesurin exactament el mateix. Caldrà en canvi fixar-se que la gema quedi conservada, visible i en bon estat.
En segon lloc quan ja hem fet els trossos com hem descrit, caldrà col·locarlos en els tubs d’assaig, on prèviament havíem posat el medi. Recordem que els hem d’haver autoclavat, i que tindrem classificats els tubs segons el medi.
Aquest procediment el farem de manera estricta, tal com s’exposarà a continuació. El primer pas serà agafar el tub d’assaig i orientar-lo cara al corrent del flux, per no alterar la direcció de l’aire.
Seguidament agafarem un tros de qualsevol de les dues espècies i la clavarem suaument al medi. S’ha de preveure que el tros verd de la violeta ha de quedar cap per amunt, i que el potus s’ha de posar en posició vertical.
Per tal que la tècnica de la persona, no afecti l’estudi es distribuiran els tubs d’assaig de forma aleatòria. Es numeraran els medis.
3.3.5. Seguiment del seu desenvolupament.
Es va fer un seguiment setmanal dels següents paràmetres: presència de fongs i/o bacteris, la brotació de la gemma, el nombre d’arrels i el nombre de brots. A més a més un cop acabat l’estudi es va fer un control del pes de les plantes i la mida de les seves fulles.
40
4. Resultats 4.1. Resultats obtinguts
Els resultats els classificarem de manera que s’especificarà en primer lloc quin ha estat el pes mitjà de les tiges i fulles de cada una de les espècies per una banda i per l’altre s’exposaran els resultats de les arrels.
Resultats sobre la violeta africana: 1. Dades generals Dades totals sobre la Saintapaulia ionantha Pes total de les fulles i tijes Pes total de les arrels Pes total dels medis
0,328 1,488 2,224
2. Dades ampliades sobre les tiges i fulles: Pesos de la part aérea MEDI Medi 0 Medi 1 Medi 2 Medi 3 Medi 4 Medi 5 Total
Saintpaulia ionantha PES TOTAL
PES PROMIG
0,059 0,061 0,101 0,010 0,089 0,009 0,328
0,010 0,008 0,010 0,010 0,013 0,001 0,008
3. Dades ampliades sobre les arrels Pesos de la part subterrania MEDI Medi 0 Medi 1 Medi 2 Medi 3 Medi 4 Medi 5 Total
Saintpaulia ionantha PES TOTAL 0,000 0,000 0,028 0,204 0,342 1,331 1,904
PES PROMIG 0,000 0,000 0,009 0,025 0,085 0,102 0,056
41
Resultats sobre el potus: 1. Dades generals Dades totals sobre l'Scindapus aureus Pes total de les fulles i tijes Pes total de les arrels Pes total dels medis
2,665 0,473 3,138
2. Dades ampliades sobre tiges i fulles: Pesos de la part aèria MEDI Medi 0 Medi 1 Medi 2 Medi 3 Medi 4 Medi 5 Total
Scindapus aureus PES TOTAL
PES PROMIG
0,176 1,330 0,000 0,641 0,518 0,000 2,665
0,035 0,332 0,000 0,049 0,074 0,000 0,123
3. Dades ampliades sobra la part subterrània. Pesos de la part subterrània MEDI Medi 0 Medi 1 Medi 2 Medi 3 Medi 4 Medi 5 Total
Scindapus aureus PES TOTAL 0,000 0,127 0,000 0,067 0,279 0,000 0,473
PES PROMIG 0,000 0,042 0,000 0,008 0,046 0,000 0,032
42
Resultats globals: 1. Sobre la part aerea Pesos de la part aèrea
Saintpaulia ionantha MEDI Medi 0 Medi 1 Medi 2 Medi 3 Medi 4 Medi 5 Total
Scindapus aureus
PES TOTAL PES PROMIG PES TOTAL PES PROMIG 0,059 0,010 0,176 0,035 0,061 0,008 1,330 0,332 0,101 0,010 0,849 0,077 0,010 0,010 0,641 0,049 0,089 0,013 0,518 0,074 0,009 0,001 0,713 0,065 0,328 0,008 4,227 0,075
2. Sobre la part subterrània Pesos de la part subterrània
Saintpaulia ionantha
Scindapus aureus
MEDI Medi 0 Medi 1 Medi 2 Medi 3 Medi 4 Medi 5 Total
PES TOTAL PES PROMIG PES TOTAL PES PROMIG 0,000 #¡DIV/0! 0,000 #¡DIV/0! 0,000 #¡DIV/0! 0,127 0,042 0,028 0,009 0,212 0,021 0,204 0,025 0,067 0,008 0,342 0,085 0,279 0,046 1,331 0,102 0,171 0,016 1,904 0,056 0,856 0,027
4.2. Anàlisis dels resultats
En les gràfiques següents es compararan diversos paràmetres. Cal tenir en compte que la diferència de pesos entre ambdues espècies és deu tant a que el potus es va propagar a partir de la gema, com a que la violeta té un període de creixement més curt (l’estudi dura 6 setmanes)
1.
És comparen les parts àrees d’ambdues espècies i s’observa un
paral·lelisme interessant en el medi 2, ja que és en el que més s’ha desenvolupat
43
la violeta africana i és el segon amb més desenvolupament del potus. Una altra semblança és que en ambdues espècies el medi 3 és un dels menys efectius
En canvi hi ha una important diferència entre ambdues espècies en el medi 5, en el qual la violeta ha tingut un desenvolupament pràcticament nul, i en el qual el potus en canvi ha patit un creixement important.
2.
En la següent gràfica és comparen els pesos promitgos de les dues
espècies i s’observen algunes semblances amb l’anterior gràfica. Aquestes són, que el medi 1 continua tenint molta rellevància, i que en el medi 5 és manté el contrast entre ambdues espècies.
Les diferències entre la gràfica anterior i aquesta es troben basicament en el medi 4. Mentre que el medi 4 semblava un dels que menys desnvolupament tenia en dades absolutes, quan n’analitzam el pes promig es veu com és el tercer amb més desenvolupament.
44
3.
La pròxima gràfica ens mostra el tant per cent que representa el pes
promig de la part aerea i el pes de la part subterrania de la Saintapaulia ionantha. Aquesta gràfica és molt útil perque evidencia les diferències entre el creixement de les dues parts en cada medi.
Així doncs observem que el medi 0 i 1 no han fet creixer les arrels, mentre que en el medi 4, el pes de les arrels representa gairebé un 90% del pes total. En el medi 2 la part subterrania està més o menys al voltant del 50% del pes total, i en el medi 3 aquest percentatge puja fins al 70%.
45
4.
En aquesta gràfica observem les mateixes dades que en l’anterior
però referides al potus. En primer lloc si les comparem veurem que tant en el medi 0, com en el medi 1 el potus i la violeta han patit un creixement de les arrels nul, o pràcticament nul. Mentre que tal com veiem en el medi 4 de la violeta la part subterrània d’aquest ha patit el major desenvolupament.
Tot i així el creixement de la part subterrània no ha estat en el potus tan representatiu com en la violeta.
4.3. Conclusions
De totes les dades recollides les més destacables són els pesos de les plantes, que ens ajuden a veure quina hormona ha propiciat el major desenvolupament de cadascuna de les parts de la planta.
46
Cal destacar que tal com era d’esperar el medi 0 ha estat el que ha obtingut uns resultats més negatius. Això es deu a la falta d’hormones. És per aquest motiu que no han crescut arrels en cap de les dues espècies.
La manca d’arrels es deu a que en aquest mètode les plantes es nodreixen per difusió facilitada, i per tant no necessiten les arrels per a res. De manera que només es desenvoluparan en cas que afegim alguna hormona que en reguli el creixement. En el medi 1 s’ha esdevingut un fet inesperat. Contra pronòstic no ha desenvolupat arrels en cap de les dues espècies, cosa que és estranya, per què hi vam afegir només hormona BAP, que precisament s’encarrega del creixement de les arrels.
D’aquest fet n’extreiem que aquesta hormona no és efectiva en cap de les dues espècies, o que en tot cas no ho és si no es barreja amb una auxina ( NAA). Ja que com podem apreciar en el medi 4 sí que hi ha fet efecte.
D’altra banda observem també que el medi 1 ha tingut un creixement espectacular respecte a la resta, cosa que només s’explica per la mort de la resta d’individus que fan que la mitja quedi distorsionada.
Si ens fixem ara en el medi 2, que contenia tan sols kinetina veurem que el desenvolupament de les arrels ha estat una mica més elevat, però malgrat que la seva funció era precisament el creixement d’arrels, no ha assolit tampoc els nivells màxims.
Així doncs podríem dir que els millors resultats per a les arrels han estat el medi 4 i 5, en els que s’ha barrejat una part igual d’auxines i citoquinines. En canvi per al creixement de la part aèrea la millor combinació és la presència d’auxines, o l’absència de citoquinines en el medi.
47
En termes generals la complexitat del món vegetal és veu resumida a l’hora de realitzar el cultiu “in vitro” ja que una planta no depèn només de les hormones. Malgrat tot com hem pogut comprovar si que hi mantenen una relació molt important.
Caldria destacar que els resultats del treball han estat molt positius, ja que hem acomplert l’objectiu principal: saber quines hormones eren les més adequades per a cultivar “in vitro” el potus i la violeta africana. Malgrat tot en aquest camp encara queden molts camins per recórrer. I un dels més importants és l’investigació dels reguladors del creixement, i la síntesi de noves hormones artificialment. Aquesta és una via a través de la qual segurament aquesta tècnica millorarà amb el temps.
D’altra banda aquest treball m’ha permès entrar en un laboratori, i treballar amb estris nous i completament desconeguts per a mi, com l’autoclau, l’agitador magnètic, el pH-metre etc. M’he submergit en un món nou i desconegut, que durant l’estiu m’ha anat obrint les portes.
I finalment he estudiat una nova tècnica, molt recent i amb moltes aplicacions pràctiques que sembla que influirà de formes insospitades en el nostre futur.
Amb tot això voldria concloure aquest treball de recerca que m’ha servit per aprendre a estimar un món que fins ara se’m feia estrany i llunyà, la biotecnologia, i que m’ha ajudat a descobrir el que d’aquí pocs mesos serà la meva carrera.
48
5. Glossari
Agar: és una substància que prové de les algues sidoses, i que s’utilitza per a solidificar lleugerament el medi de cultiu. Asèpsia : és un mètode preventiu de les infeccions per tal d’evitar la presència de microorganismes patògens en espais on s’han d’evitar ( laboratoris, sales d’operacions...) Bacteris: són microorganismes unicel·lulars que poden tenir gran quantitat de formes (esfèrics, helicoïdals, com pals...) i són procariotes, és a dir la seva estructura cel·lular és més simple que la de les cèl·lules dels humans. Elèctrode: té un potencial d’equilibri estable i conegut, i a partir d’aquest podem deduir el potencial d’equilibri d’altres dissolucions Fongs - llevats: són un regne d’organismes de cèl·lules eucariotes, pluricel·lulars i de digestió externa. Gemma: és una estructura que conté gran quantitat de cèl·lules indiferenciades a partir de la qual la planta pot originar fulles, tiges etc. Histologia: és la ciència que estudia tot el que te a veure amb els teixits orgànics: la seva estructura microscòpica, el seu desenvolupament, i les seves funcions. Hormones: és una proteïna o esteroide que en els éssers pluricel·lulars s’encarrega de coordinar i regular l’activitat conjunta de les cèl·lules. Iodomètric: que prové o conté iode. Infecció: és la colonització d’un organisme hoste per espècies exteriors (microorganismes) que són perjudicials per al funcionament normal i la supervivència de l’hoste. Els microorganismes que les provoquen s’anomenen microorganismes patògens. Mitosi: és un procés de divisió cel·lular que origina dues cel·lules filla idèntiques a la cèl·lula mare. pH: és una mida que mesura l’acidesa o alcalinitat d’una dissolució. Té una escala de l’u al catorze. Quan la dissolució té un pH major que set és bàsica, i quan el pH és menor que set és àcida. Primordi foliar: és una estructura que protegeix les gemmes apicals de l’exterior. 49
Sals minerals: són molècules inorgàniques que en els èssers vius es troben tant dissoltes com precipitades. Tenen diverses funcions, com amortir els canvis de pH, formen part de l’estructura òssia, col·laboren en processos metabòlics... Teixits: és un grau d’organització entre una cèl·lula i un òrgan, els diferents teixits es caracteritzen per presentar un tipus de cèl·lules determinat i una localització concreta en una mateixa espècie. Tubiflores: conjunt de plantes integrat per plantes herbàcies, arbustives o rarament arbòries. Vacúols: és un orgànul cel·lular que té com a funció principal acumular aigua dins de la cèl·lula. També té funció excretora i secretora de substàncies. Virus: són estructures molt senzilles formades per material genètic i envoltats per una càpsula proteica. Per reproduir-se necessiten una cèl3lula viva i per tant es consideren paràsits endocel·lulars obligats.
50
6.
Bibliografia
Per a realitzar aquest treball m’he documentat bàsicament mitjançant dos llibres i pàgines web, de les quals he extret la major part de la informació. Així doncs per temes he extret la informació de:
1. Sobre les plantes i les seves parts: ENCICLOPÈDIA CATALANA: <www.enciclopedia.cat> ORQUIDEAS: SU CULTIVO “IN VITRO”. <http://www.lanzarote.net/ogro/gocarticuloinvitrojmsv.htm> 2. General: INFOJARDIN. <http://articulos.infojardin.com/Frutales/cultivo-in-vitroreproduccion.htm> BENÍTEZ BURRACO, Arturo. Avances recientes en biotecnologia vegetal e ingeniería genética de plantas. Barcelona: Reverte, 2005 3. Sobre les hormones: HIPERTEXTOS DE BIOLOGIA <http://www.biologia.edu.ar/plantas/hormona.htm> PDF SOBRE REGULADORS DEL CREIXEMENT: <http://www.inta.gov.ar/balcarce/actividad/capacita/agron2007/regulcrec/Re tamalesGraficaColor.pdf> MONOGRAFIAS.COM. Cultivo “in vitro” del Solanum nigrum “Tomatillo del diablo” con y sin hormonas < http://www.monografias.com/trabajos89/cultivo-invitro-solanum-nigrumtomatillo-diablo/cultivo-invitro-solanum-nigrum-tomatillo-diablo.shtml>
51
7. Annexos
Annex 1: Pesos dels medis de cultiu Data d'observació: 06-09-2011 Espècie: Saintapaulia ionantha M-2 Pes de fulles i tijes Pes de les arrels 1 0,004 0,0144 2 3 0,0061 4 5 6 0,0006 0,005 7 0,0045 8 9 0,016 10 0,0082 11 0,0055 12 0,0382 0,0083 13 14 15 0,0098 16 0,0077 17 18 Pes total del medi 2 0,1283
Data d'observació: 06-09-2011 Espècie: Saintapaulia ionantha M-0 Pes de fulles i tijes Pes de les arrels 1 0,0077 2 0,0135 3 4 5 6 7 0,007 8 9 10 11 12 0,0085 13 14 0,0091 15 0,0128 16 Pes total del medi 0 0,0586
Data d'observació: 06-09-2011 Espècie: Saintapaulia ionantha M-3 Pes de fulles i tijes Pes de les arrels 1 0,0085 2 3 4 5 6 7 0,049 8 0,0001 9 10 0,0183 11 0,0122 12 13 0,0126 14 0,0121 15 16 17 18 0,0099 0,0911 Pes total del medi 3 0,2053
Data d'observació: 06-09-2011 Espècie: Saintapaulia ionantha M-4 Pes de fulles i tijes Pes de les arrels 1 2 3 0,0009 4 5 6 0,0082 0,127 7 8 0,0334 0,0745 9 0,0077 10 0,0169 0,0938 11 12 13 14 0,0068 15 0,0154 0,0465 16 Pes total del medi 4 0,4311
52
Data d'observació: 06-09-2011 Espècie: Saintapaulia ionantha M-1 Pes de fulles i tijes Pes de les arrels 1 2 0,0069 3 4 5 0,0063 6 7 0,0135 8 9 10 0,0067 11 12 0,0073 13 0,0061 14 15 0,0063 16 0,0075 17 Pes total del medi 1 0,0606
Data d'observació: 06-09-2011 Espècie: Scindapus aureus M-0 Pes de fulles i tijes Pes de les arrels 1 2 3 4 5 0,048 6 7 8 9 10 11 0,056 12 13 0,011 14 15 0,027 16 0,034 17 Pes total del medi 0 0,176
Data d'observació: 06-09-2011 Espècie: Saintapaulia ionantha M-5 Pes de fulles i tijes Pes de les arrels 1 0,0009 0,1491 2 3 4 0,0001 0,1527 5 0,0155 6 0,0042 7 0,1212 8 0,1228 9 10 0,0001 0,2034 11 0,0141 12 0,0154 13 0,0005 0,1153 14 0,0001 0,1337 15 0,0076 16 17 0,1553 18 0,0001 0,1279 Pes total del medi 5 1,34
Data d'observació: 06-09-2011 Espècie: Scindapus aureus M-1 Pes de fulles i tijes Pes de les arrels 1 2 0,079 0,103 3 1,097 0,010 4 0,083 5 0,071 0,014 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Pes total del medi 1 1,457
53
Data d'observació: 06-09-2011 Espècie: Scindapus aureus M-2 Pes de fulles i tijes Pes de les arrels 1 0,0680 0,0034 2 0,1025 0,0083 3 0,0847 0,0463 4 0,0520 0,0081 5 0,1024 0,0208 6 0,0862 0,0118 7 0,0828 0,0295 8 0,0852 0,0362 9 0,0786 0,0302 10 0,0719 0,0177 11 0,0351 12 13 14 15 16 17 18 Pes total del medi 2 1,0617
Data d'observació: 06-09-2011 Espècie: Scindapus aureus M-3 Pes de fulles i tijes Pes de les arrels 1 2 0,0355 0,0012 3 0,0453 4 5 0,0765 0,0114 6 0,0492 0,0176 7 0,0508 0,0040 8 0,0343 9 0,0374 10 0,0672 11 12 0,0361 0,0028 13 14 0,0714 0,0143 15 0,0485 0,0065 16 0,0668 0,0096 17 0,0221 Pes total del medi 3 0,70851
Data d'observació: 06-09-2011 Espècie: Scindapus aureus M-4 Pes de fulles i tijes Pes de les arrels 1 0,0880 0,1108 2 0,0244 0,0653 3 0,0653 4 5 6 0,0888 0,0296 7 8 9 0,0952 0,0431 10 0,0645 0,0124 11 12 13 0,0177 14 0,0920 15 16 Pes total del medi 4 0,7971
Data d'observació: 06-09-2011 Espècie: Scindapus aureus M-5 Pes de fulles i tijes Pes de les arrels 1 0,0498 0,0343 2 0,0563 0,0264 3 0,0485 0,0028 4 0,0644 0,0325 5 0,0622 0,0000 6 0,0933 0,0178 7 0,0773 0,0050 8 0,0529 0,0247 9 0,0335 0,0013 10 0,1032 0,0177 11 0,0713 0,0083 12 13 14 15 16 17 Pes total del medi 5 0,8835
54
Annex 2: Gràfiques Saintapaulia ionantha
55
Annex 3: Gràfiques Scindapus aureus
56
Annex 4: Vídeos Vídeo 1: Estris, equipaments i material Vídeo 2: Procediment: elaboració d’un medi de cultiu Vídeo 3: Procediment: protocol de desinfecció Vídeo 4: Procediment: micropropagació
57