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Bacteriospermia en porcino Eva Bussalleu, Lilian Sepúlveda, Mailo Briz y Sergi Bonet Technosperm, Biotecnología de la Reproducción Animal y Humana, Universitat de Girona www.technosperm.com
La bacteriospermia es una patología frecuente en el semen porcino fresco que puede repercutir en la calidad seminal y/o en el tiempo de conservación de las dosis seminales. Actualmente, la industria porcina requiere un elevado control microbiológico para evitar la transmisión de enfermedades bacterianas y víricas por inseminación artificial (IA). La recogida u obtención del semen para programas de inseminación artificial no es un procedimiento estéril y no se puede evitar la contaminación del mismo (Varner y cols., 1998; Althouse y cols., 2000; Althouse y Lu, 2005; Aurich y Spergser, 2007).
Fuentes de contaminación bacteriana de los eyaculados Básicamente hay dos grandes fuentes de contaminación: las de origen animal y las de origen no animal. La contaminación bacteriana
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47 puede ocurrir durante el proceso de recogida del semen, su procesamiento o durante el almacenamiento. Referente a la contaminación de origen animal (ya sea del propio verraco o bien del personal que participa en la recolección y el procesamiento) incluye la contaminación a partir de heces, fluido del prepucio, secreciones respiratorias, pelo y piel. En la categoría de contaminación del semen de origen no animal se incluye el agua, recipientes de recogida de semen no esterilizados, equipamiento en precarias condiciones higiénicas, sistemas de ventilación, objetos inanimados, etcétera (Althouse y Lu, 2005).
Bacterias más frecuentes en semen de porcino En los eyaculados, las bacterias contaminantes son básicamente gram-negativas, sobre todo de la familia de las enterobacteriáceas (Althouse y Lu, 2005). Entre las más comunes destacan Escherichia coli, Staphylococcus spp, Proteus spp, Pseudomonas spp, Klebsiella spp, Bacillus spp y Actinomices spp (Althouse y Lu, 2005; Cironei y cols., 2008). Hay diferentes investigaciones sobre la presencia de bacterias en el semen; en todos los estudios, las bacterias citadas se han hallado, pero también se han detectado otros géneros o especies; por ejemplo, Tamuli y cols. (1984) encontraron Enterobacter spp, Pasteurella spp y Citrobacter spp Danowski (1989), en sus estudios detectó la presencia de Staphyloccoccus spp, Pseudomonas spp, E.coli, Citrobacter spp, Providencia spp, Neisseira spp y Proteus spp. Otros autores, como Dagnall (1989) encontraron una gran diversidad de bacterias en los eyaculados: Citrobacter spp, Cornynebacterium spp, Streptoccous spp, Actinomyceslike spp, Bacteroides spp, Lactobacillus spp, Acinetobacter spp, Bacillus spp, Actinobacillus spp, Staphylococcus spp, Flavobacterium spp y Micrococcus spp. Otra bacteria también con un alta prevalencia en semen utilizado para IA es Chlamydia spp (Kauffold y cols. 2006). Aunque no se ha estudiado en profundidad, en los eyaculados de porcino también pueden sobrevivir bacterias anaerobias. En un estudio realizado en nuestro laboratorio comprobamos que Clostridium perfringens puede sobrevivir y causar alteraciones en la calidad espermática (datos no publicados).
Métodos de detección Para la detección de bacterias en semen hay dos grandes técnicas: el aislamiento por cultivo puro, o bien la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El aislamiento de bacterias por cultivo es un proceso complejo y laborioso que puede resultar fácilmente alterado por la presencia de antibióticos e inhibidores en el semen; además, también puede verse afectado por bajos niveles de microorganismos (Gradil y cols., 1994). Por este motivo, el uso de la PCR, una técnica muy rápida y sensible que permite la amplificación de una secuencia específica de un gen, es altamente recomendable para la detección de bacterias previa distribución y/o uso de las dosis seminales en las granjas. Para poder utilizar esta técnica se requiere de termocicladores y de encebadores específicos para cada bacteria. Actualmente, en muchos laboratorios también se dispone de técnicas de PCR cuantitativa para que, además de la detección de las bacterias, se pueda cuantificar la carga bacteriana. En nuestro laboratorio hemos adaptado las técnicas de PCR de Zhang y cols. (2007) y Yilmaz y cols. (2006) para la detección de E.coli enterotoxigéncia (ETEC) y E.coli verotoxigéncia (VTEC), ambas con elevada prevalencia en granjas. Con estas PCRs podemos detectar hasta 14 genes de virulencia presentes en estas dos cepas de E.coli (K88, K99, 987P, F18, F41, AIDA-I, Stx2e, STa, STb, LT, eaeA, EAST1, VT1 y VT2) (Bussalleu y cols., 2011).
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Figura 1. Porcentaje de espermatozoides viables (mean ± SEM) después de 11 días de almacenaje a 15ºC. Los distintos superíndices (a, b, c, d) significan diferencias significativas entre los tratamientos.
Figura 2. Porcentaje de espermatozoides móviles (mean ± SEM) después de 11 días de almacenaje a 15º C. Los distintos superíndices (a, b, c, d) significan diferencias significativas entre los tratamientos.
Efectos de la presencia de bacterias en dosis seminales Numerosos estudios han demostrado que los microorganismos tienen efectos directamente letales sobre los espermatozoides, ya sea afectando su estructura o la motilidad espermática (Diemer y cols., 1996) o provocando una reacción acrosómica prematura (Kohn y cols., 1998) o bien pueden deberse también a efectos indirectos, cómo la estimulación de la pro-
ducción de anticuerpos contra el glicocálix de los espermatozoides (Aurox y cols. 1991). Cabe destacar que la presencia de bacterias no sólo se limita al semen fresco, ya que se ha descrito la presencia de bacterias después del proceso de congelación-descongelación de semen en equinos (Corona y Cherchi, 2009). Además de la disminución de la calidad espermática, la presencia de microorganismos en semen puede provocar muerte embrionaria o fetal, endometritis e infecciones sistémicas en las hembras (Maes y cols., 2008). De todos modos, aunque las dosis estén infectadas, no siempre se produce la transmisión de patógenos, ya que las condiciones necesarias para que se produzcan infecciones en las hembras son complejas, debido al hecho de que existan factores inmunitarios o que no haya una dosis infectiva suficiente para que se produzca enfermedad (Maes y cols., 2008). Otro efecto de la presencia de bacterias en el semen puede ser el que describieron Maroto Martin y cols. (2010); en sus estudios concluyeron que si se usa semen contaminado con cepas de E.coli produciría aglutinación espermática por encima de un valor de 3.5 × 103 E.coli/ml y una reducción en el tamaño de los lechones. En nuestro laboratorio realizamos un estudio que consistió en inocular distintas concentraciones (desde 1×108 E.coli/ml hasta 1×102 E.coli/ ml) de ETEC y VTEC a dosis seminales destinadas a IA. Almacenamos las dosis durante 11 días a 15º C y cada 24 h analizamos la calidad espermática (concentración, motilidad, morfología y viabilidad). Además, comprobamos por PCR a los días 5 y 11 la presencia de ETEC y VTEC. Tal y como se muestra en las figuras 1 y 2, se observa una reducción de la viabilidad (Fig.1) (a partir de las 48h post-inoculación) y la motilidad (Fig. 2) (a partir de las 24h postinoculación) espermáticas en la dosis más elevada de E.coli (1×108 E.coli/ml). Sin embargo, no se observaron cambios significativos en el porcentaje de espermatozoides maduros sin malformaciones en la cabeza ni en la cola después de los 11 días de incubación a 15º C. Los efectos dañinos de las bacterias sobre la calidad espermática no son observados de manera inmediata, sino que se necesita un período de entre 24 y 48 horas para que se
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49 empiecen a notar los efectos (Althouse, 2008, Bussalleu y cols., 2011). Esto se explicaría por el hecho de que las bacterias se tienen que adaptar al nuevo ambiente y recuperarse del shock o los efectos dañinos que la transferencia al nuevo medio les haya podido causar. Tanto las bacterias como los espermatozoides son incapaces de regular su temperatura, siendo los espermatozoides más sensibles a los cambios de temperatura que las bacterias. Cuando la temperatura ambiental disminuye, se producen cambios en la fluidez de la membrana plasmática y también disminuye el metabolismo de las células, de modo que los espermatozoides quedan en estado de latencia (aumentando consecuentemente su tiempo de vida útil). Pero estos cambios de temperatura también benefician a las bacterias, que se pueden acomodar fácilmente a las temperaturas bajas y crecer en el semen (Althouse, 2008).
¿Cómo controlar o erradicar la presencia de bacterias en el semen? La contaminación microbiana de dosis seminales es difícil de controlar. La mejor manera es extremando cuidadosamente las medidas higiénicas durante el proceso de recogida y procesamiento del semen. Sin embargo, para reducir o minimizar la contaminación de las dosis, se añaden al semen distintos antibióticos, estipulados por la Directiva Europea 90/429/EEC, aunque algunos estudios han demostrado que más del 90% de bacterias aisladas del semen son resistentes a los antibióticos más comunes que se añaden al semen (Bolarín, 2011). Por este motivo, actualmente se están desarrollando metodologías para reducir la carga bacteriana de las dosis seminales, así como alternativas al uso de antibióticos. Por ejemplo, Morrell y Wallgren (2011) concluyeron que el uso de la técnica de Single Layer Centrifugation utilizando el coloide AndrocollTM-P, permite la obtención de dosis seminales libres de bacterias o con una reducción de la carga bacteriana, además de incrementar la proporción de espermatozoides con motilidad progresiva y morfología normal, aunque hacen falta todavía más estudios en este sentido.
Colonia de E.coli.
Conclusiones y perspectivas de futuro La utilización de la inseminación artificial (IA) es una técnica ampliamente extendida en las explotaciones de porcino y esto conlleva que se deba tener un elevado control sanitario de las dosis. Además, actualmente cabe añadir también que el hecho de que se exporte semen para IA a distintos países, ya sea semen fresco o semen congelado, requiere que el control sanitario se convierta en un parámetro de obligado análisis previa comercialización, tal cómo también han sugerido otros autores (Maroto Martín y cols., 2010). Otro parámetro importante a tener en cuenta es establecer en los centros de preparación de dosis seminales un estricto protocolo de higiene para minimizar la contaminación bacteriana de las dosis. Para la detección de la contamina-
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ción bacteriana en las dosis, actualmente ya existen distintos protocolos de PCR (además de los protocolos convencionales por aislamiento en cultivo puro) para la detección de distintas bacterias, pero se deben seguir desarrollando otros, tanto de PCR convencional cómo de PCR cuantitativa para las distintas bacterias que pueden sobrevivir en el semen.
Sección de testículo de verraco.
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Otra perspectiva de futuro en el campo del control sanitario del semen de porcino es el desarrollo de nuevas substancias o metodologías para minimizar el uso de antibióticos en las dosis, de modo que también se evitaría la aparición de futuras resistencias.
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