6-Ε-073 Αρχές & Υπολογισμοί στην Συνταγοτεχνία & Κλινική Φαρμακευτική - ΚΕΦΑΛΑΙΟ

Λχλνληαο ηελ παξαπάλσ εμίζσζε σο πξνο ηελ κάδα, m=C.V

⇒

Ζ αλαπαξάζηαζε κε εηθφλεο παξαθάησ επηδεηθλχεη ηε θπζηθή δηαδηθαζία πνπ εκπιέθεηαη ζηελ αξαίσζε

Πξφζζεζε λεξνχ κέρξη 250 mL

m = 50 mg V = 50 mL C = 1 mg/mL

΢ρήκα 5.1

m = 50 mg V = 250 mL C = 0.2 mg/mL

Αλαπαξάζηαζε ηεο δηαδηθαζίαο ηεο αξαίσζεο δηαιύκαηνο

Ο θαξκαθνπνηφο αξρίδεη κε έλα δηάιπκα πνπ πεξηέρεη 50 mg θαξκάθνπ δηαιπκέλνπ ζε 50 mL ζπλνιηθνχ φγθνπ δηαιχκαηνο. Με άιια ιφγηα, ην αξρηθφ δηάιπκα ραξαθηεξίδεηαη απφ: αξρηθή κάδα δηαιπφκελεο νπζίαο (θαξκάθνπ), m or m1 = 50 mg αξρηθφ φγθν δηαιχκαηνο, Vor V1 = 50 mL αξρηθή ζπγθέληξσζε, C or C1 = 1 mg/mL

Ο θαξκαθνπνηφο κεηά πξνζζέηεη πεξίπνπ 200 mL λεξνχ γηα λα θάλεη ηνλ ηειηθφ φγθν ηνπ δηαιχκαηνο ίζν κε 250 mL. Σν ηειηθφ δηάιπκα ραξαθηεξίδεηαη απφ: ηειηθή κάδα, mf or m2 = 50 mg

144

ηειηθφο φγθνο δηαιχκαηνο, Vf or V2 = 250 mL ηειηθή ζπγθέληξσζε, Cf or C2 = 50 mg/250 mL = 0.2 mg/mL

Πξνζέμηε φηη ε κφλε παξάκεηξνο πνπ παξακέλεη ζηαζεξή θαηά ηελ αξαίσζε είλαη ε κάδα ηνπ θαξκάθνπ. Απηή ηελ δηαηήξεζε ηεο κάδαο ηεο δηαιπφκελεο νπζίαο θαηά ηελ αξαίσζε, κπνξνχκε λα ηελ εθθξάζνπκε καζεκαηηθά σο, m = mf C . V = Cf . Vf

⇒

(5-2)

Ζ εμίζσζε 5-2 κπνξεί λα ρξεζηκνπνηεζεί γηα λα ππνινγηζηνχλ αιιαγέο ζηελ ζπγθέληξσζε ηεο δηαιπφκελεο νπζίαο (θαξκάθνπ) θαη ζηνλ φγθν ηνπ δηαιχκαηνο πνπ ζπκβαίλνπλ θαηά ηελ αξαίσζε ελφο δηαιχκαηνο.

Παξάδεηγκα 5.1 Τπνινγίζηε ηελ ζπγθέληξσζε ηεο δηαιπφκελεο νπζίαο ζην ηειηθφ δηάιπκα πνπ πξνθχπηεη απφ ηελ αξαίσζε ηνπ αξρηθνχ δηαιχκαηνο (΢ρ. 5.1), ζε ηειηθφ φγθν 100 mL.

Λχζε ΢ηάδην 1: Οξίζηε αξρηθέο θαη ηειηθέο ζπγθεληξψζεηο φπσο ππνδεηθλχεηε παξαθάησ: m1 = 50 mg V1 = 50 mL

⇒

C1 = 1 mg/mL

V2 = 100 mL C2 = ?

145

΢ηάδην 2: Τπνινγίζηε ηελ ηειηθή ζπγθέληξσζε κε ηελ εμίζσζε 5-2, C1 . V1 = C2 . V2. ⇒

C2 

C1  V1 1 mg / mL  50 mL   0.5 mg / mL V2 100 mL

Πξνζέμηε φηη αξαηψλνληαο ην ηειηθφ δηάιπκα ζε φγθν δηπιάζην ηνπ αξρηθνχ, έρεη σο απνηέιεζκα ηελ κείσζε ηεο ηειηθήο ζπγθέληξσζεο ζην κηζφ.

Παξάδεηγκα 5.2 Πνηά είλαη ε ζπγθέληξσζε ηνπ θαξκάθνπ πνπ βξίζθεηαη ζε φγθν 10 mL ηνπ αξρηθνχ δηαιχκαηνο ζην ΢ρ. 5.1;

Λχζε Πξνζέμηε φηη ην πξφβιεκα απηφ δελ είλαη έλα πξφβιεκα αξαίσζεο. Γεδνκέλνπ φηη δελ γίλεηαη θακία αξαίσζε, ε ζπγθέληξσζε ηνπ θαξκάθνπ ζην ηειηθφ κίγκα παξακέλεη ε ίδηα. Πξνζδηνξίδνπκε πξψηα ηελ κάδα ηνπ θαξκάθνπ ζην δεδνκέλν φγθν θαη ζηε ζπλέρεηα ρξεζηκνπνηνχκε ην ελ ιφγσ φγθν γηα ηνλ ππνινγηζκφ ηεο ζπγθέληξσζεο ηνπ θαξκάθνπ. ⇒

⇒

50 mg X  50 mL 10 mL

C2 

⇒

X = 10 mg

1 0 mg  1 mg / mL 10 mL

Πφζε πηζηεχεηε φηη είλαη ε ζπγθέληξσζε ηνπ θαξκάθνπ ζε 2 mL, 5 mL, 20 mL ή 24.978 mL ηνπ αξρηθνχ δηαιχκαηνο ηνπ ΢ρ. 5.1; Πνιχ ζσζηά, είλαη πάληνηε ίζε κε 1 mg/mL.

146

΢πκπέξαζκα Ζ ζπγθέληξσζε ηνπ θαξκάθνπ ζε φιν ηνλ φγθν ηνπ δηαιχκαηνο είλαη ε ίδηα. Ζ δηαιπφκελε νπζία βξίζθεηαη κνξηαθψο θαη νκνηνγελψο ή νκνγελψο δηαζπεηξφκελε κέζα ζην δηάιπκα θαη επνκέλσο, κηθξφηεξνο φγθνο ηνπ δηαιχκαηνο πεξηέρεη αλαινγηθά ιηγφηεξε κάδα ηνπ θαξκάθνπ. Ωο απνηέιεζκα, ε ζπγθέληξσζε ηνπ θαξκάθνπ ζε κηθξφηεξα θιάζκαηα ηνπ φγθνπ παξακέλεη ζηαζεξή, φπσο θαίλεηαη ζην Παξάδεηγκα 5.2. Ζ απάληεζε ινηπφλ ζην εξψηεκα, πνπ ζε αξθεηνχο θνηηεηέο απνηειεί δηαρξνληθή ζχγρπζε, "πνηα είλαη ε ζπγθέληξσζε ηνπ θαξκάθνπ ζηε δφζε” είλαη, ... ε ίδηα κε εθείλε ηνπ αξρηθνχ δηαιχκαηνο.

Παξάδεηγκα 5.3 Τπνινγίζηε ηελ ζπγθέληξσζε ηνπ θαξκάθνπ ζε αινηθή θνξηηθνζηεξνεηδνχο πνπ παξαζθεπάδεηαη κε αλάκεημε 10 g αινηθήο πδξνθνξηηδφλεο (hydrocortisone) 10 % κε 40 g ιεπθνχ petrolatum (παξαθίλε).

Λχζε Αλ θαη ην πξφβιεκα αθνξά ζηεξεέο δνζνινγηθέο κνξθέο κπνξνχκε λα ρξεζηκνπνηήζνπκε ηελ εμίζσζε 5-2, επεηδή ε κάδα είλαη εθηαηηθή ηδηφηεηα δει. ε ηειηθή κάδα είλαη ην άζξνηζκα ησλ επηκέξνπο καδψλ (νη εθηαηηθέο ηδηφηεηεο φπσο ή κάδα θαη ν φγθνο εμαξηψληαη απφ ηελ έθηαζε ή πνζφηεηα ηνπ ζπζηήκαηνο), θαη επεηδή ην θάξκαθν ζεσξείηαη φηη δηαζπείξεηαη νκνηφκνξθα ζηελ αινηθή. Ζ κεγάιε δηαθνξά εδψ είλαη φηη ν φγθνο ηνπ δηαιχκαηνο, σο φξνο, αληηθαζίζηαηαη απφ ηε κάδα ηνπ κίγκαηνο ηεο αινηθήο. ΢εκεηψζηε φηη ε ζπγθέληξσζε ηνπ θαξκάθνπ ζηελ αινηθή εθθξάδεηαη σο % w/w, δει.

147

⇒

ό 10% w / w 

10 g ό 100 g ή

Ζ πνζφηεηα ηνπ θαξκάθνπ ζε νξηζκέλε κάδα ηεο αινηθήο κπνξεί λα ππνινγηζηεί σο αθνινχζσο ρξεζηκνπνηψληαο, m=M.C m = κάδα ηνπ θαξκάθνπ M = κάδα ηνπ κίγκαηνο C = ζπγθέληξσζε ηνπ θαξκάθνπ ζην κίγκα ηεο αινηθήο

Γεδνκέλνπ φηη ε κάδα ηνπ κείγκαηνο εθθξάδεηαη ζε γξακκάξηα θαη ν παξνλνκαζηήο ηεο κνλάδαο ηεο ζπγθέληξσζεο είλαη επίζεο ζε γξακκάξηα, ε κάδα ηνπ θαξκάθνπ εθθξάδεηαη επίζεο ζε γξακκάξηα, φπσο ζα επαιεζεχζνπκε παξαθάησ. Ζ κάδα ηνπ θαξκάθνπ ζηελ αινηθή παξακέλεη ζηαζεξή κεηά ηελ αξαίσζε ηεο αινηθήο, ⇒

m = mf

⇒

C . M = Cf . Mf

Αιιά M10 g

θαη

or

m1 = m2 (5-2)

C10 % w/w

Ζ ηειηθή ή νιηθή κάδα ηνπ κίγκαηνο απνηειείηαη απφ 10 g ηεο αινηθήο 10 % πνπ αλακηγλχεηαη κε 40 g Petrolatum (βάζε αινηθήο). ⇒

Mf40 g + 10 g = 50 g

Υξεζηκνπνηψληαο ηελ εμίζσζε 5-2, 10 % . 10 g = Cf . 50 g ΢εκείσζε:

148

⇒

Cf = 2 % w/w

΢πρλά νη θνηηεηέο ζπγρχδνπλ ηελ κάδα ηνπ θαξκάθνπ (m) κε ηελ κάδα ηνπ κίγκαηνο (M) επεηδή θαη ηα δπν θέξνπλ ηηο ίδηεο κνλάδεο κέηξεζεο (g). Δλαιιαθηηθώο, κπνξνχκε λα ππνινγίζνπκε ηελ κάδα ηνπ θαξκάθνπ ζην ηειηθφ κίγκα θαη λα ηελ δηαηξέζνπκε κε ηελ ζπλνιηθή κάδα ηνπ κίγκαηνο ή ηεο αινηθήο. ⇒

Ζ κάδα ηνπ θαξκάθνπ ζηελ αινηθή είλαη ην γηλφκελν ηεο ζπγθέληξσζεο ηνπ

θαξκάθνπ ζηελ αινηθή (10 %) θαη ηεο κάδαο ηεο αινηθήο πνπ ρξεζηκνπνηήζεθε (10 g): m=M.C

⇒ ⇒

κάδα θαξκάθνπ, m = 10 g αινηθήο ∙ 10g πδξνθνξηηδφλεο/100 g αινηθήο = 1 g

Θπκεζείηε φκσο φηη θαηά ηελ αξαίσζε ε κάδα ηνπ θαξκάθνπ παξακέλεη ζηαζεξή, δειαδή,

m = mf

αιιά

m = C . M

θαη

mf = Cf . Mf

Με ηελ βνήζεηα ηεο εμίζσζεο 5-1, C = m/V = m/Mf = 1 g/50 g = 2 % w/w

Παξάδεηγκα 5.4 Τπνινγίζηε ηελ ζπγθέληξσζε ηνπ θαξκάθνπ X ζε 4 f δηαιχκαηνο, εάλ αξαίσζε 1 tsp ηνπ δηαιχκαηνο απηνχ ζε 250 mL ηειηθνχ φγθνπ καο δίλεη ζπγθέληξσζε ηνπ θαξκάθνπ X ίζε κε 0.005 %.

Λχζε Ζ πξψηε ελέξγεηα πνπ ζπκβνπιεχσ ην θνηηεηή λα θάλεη πάληα ζε ηέηνηνπ είδνπο πξνβιήκαηα, είλαη έλα ζρεδηάγξακκα ην νπνίν λα ζπλνςίδεη φιεο ηηο ζρεηηθέο δηαδηθαζίεο αξαίσζεο πνπ γίλνληαη.

149

αξαηψλεηαη ζε 1 tsp

250 mL, 0.005 %

Μπνξνχκε λα αλαδηαηππψζνπκε ηελ εξψηεζε σο εμήο: Γφζε ηζνδχλακε κε έλα θνπηαιάθη ηνπ ηζαγηνχ (1 tsp) απφ ηνλ αξρηθφ πεξηέθηε ησλ 4 fl oz (~120 mL), αξαηψλεηαη ζε 250 mL (έλα πνηήξη λεξφ). Πνηά είλαη ε ζπγθέληξσζε ηνπ θαξκάθνπ ζηνλ αξρηθφ πεξηέθηε;

΢ηάδην 1: Λήςε ηεο δφζεο

[ΓΔΝ γίλεηαη αξαίσζε] ΢ηάδην 2: αξαίσζε C1 = ?, V1= 5 mL

150

V2 = 250 mL, C2 = 0.005 %

Δθφζνλ δελ γίλεηαη αξαίσζε ζην ζηάδην 1, ε C1 αληηπξνζσπεχεη ηελ ζπγθέληξσζε ηνπ θαξκάθνπ ζηνλ αξρηθφ πεξηέθηε ησλ 4 fl oz. Με ηελ βνήζεηα ηεο εμίζσζεο 5-2 βξίζθνπκε ηελ C1, φπσο ππνδεηθλχεηαη παξαθάησ: C1 . V1 = C2 . V2

⇒

C1 

C 2  V2 0.005 %  250 mL   0.25 % V1 5 mL

5.1.2. Πνιιαπιέο ζηε ΢εηξά Αξαηώζεηο (Serial dilutions) θαη ν ΢πληειεζηήο Αξαίσζεο (Dilution Factor, DF) Ο ζπληειεζηήο αξαίσζεο (DF) είλαη ν ιφγνο ηεο αξρηθήο πξνο ηελ ηειηθή ζπγθέληξσζε, ν νπνίνο είλαη θπζηθά ηζνδχλακνο κε ην ιφγν ηνπ ηειηθνχ πξνο ηνλ αξρηθφ φγθν. Γηα δηαιχκαηα,

DF 

Ci V f  C f Vi

(5-3)

Γηα ηα κίγκαηα θφλεσλ ή εκηζηεξεέο θαξκαθεπηηθέο κνξθέο φπσο αινηθέο ή θξέκεο

DF 

Ci M f  Cf Mi

Ο ζπληειεζηή αξαίσζεο, DF, δελ έρεη κνλάδεο κέηξεζεο, δηφηη είλαη αλαινγία δχν αξηζκψλ πνπ έρνπλ ηηο ίδηεο κνλάδεο. Ζ ρξεζηκφηεηά ηνπ έγθεηηαη ζην φηη καο επηηξέπεη ηελ ζχλζεζε ελφο αξαησκέλνπ δηαιχκαηνο ρσξίο θακία γλψζε ζρεηηθά κε ηε ζχλζεζε ηνπ αξρηθνχ δηαιχκαηνο ή ηνπ κείγκαηνο θαη ρσξίο θαλ αλαθνξά ζηηο ζπγθεθξηκέλεο ζπγθεληξψζεηο ή φγθνπο πνπ εκπιέθνληαη (ην έλα απφ ηα δπν). ΢ηελ έξεπλα θαη γεληθά ζηελ αλαιπηηθή ρεκεία, ρξεζηκνπνηνχκε πνιιαπιέο δηαδνρηθέο αξαηψζεηο ζηελ ζεηξά γηα ηελ θαηαζθεπή πξφηππσλ θακππιψλ πνπ

151

ρξεζηκνπνηνχληαη γηα ηνλ πξνζδηνξηζκφ ηεο ζπγθέληξσζεο ησλ θαξκάθσλ ζε δνζνινγηθέο κνξθέο θαη ζε βηνινγηθά πγξά. ΢ηηο πνιιαπιέο δηαδνρηθέο αξαηψζεηο, ν DF είλαη ίζνο κε ην γηλφκελν ηεο αξαίσζεο γηα θάζε αξαίσζε. Ο ζπληειεζηήο αξαίσζεο (DF) ηεο ππν-X-πιάζηαο αξαίσζεο ηεο αξρηθήο ζπγθέληξσζεο είλαη ην Υ. Δπίζεο, ν DF ηεο Y (επαλαιήςεηο), ππν-X-πιάζηαο αξαίσζεο είλαη XY. Πην ζπγθεθξηκέλα, ν DF 5 ππνδεθαπιάζησλ (ππν-10-πιάζησλ) δηαδνρηθψλ αξαηψζεσλ είλαη 105. Οη εξεπλεηέο ησλ βηνινγηθψλ επηζηεκψλ εθθξάδνπλ ζπρλά ηηο δηαδνρηθέο αξαηψζεηο σο θιάζκαηα. Γηα παξάδεηγκα, αξαίσζε 10-θνξέο (ππν-10-πιάζηα) γξάθεηαη σο 1/10 ή 1:10. ΢ε απηέο ηηο πεξηπηψζεηο, ν DF είλαη ίζνο κε ην αληίζηξνθν ηνπ θιάζκαηνο. Δπίζεο, απηφο ν ηξφπνο ρξεζηκνπνηείηαη θαη ζηηο αξαηψζεηο (κε δπλακνπνίεζε) ησλ νκνηνπαζεηηθψλ ζθεπαζκάησλ. Οη αξαηψζεηο φκσο πνπ αλαγξάθνληαη ζηηο ζπληαγέο νκνηνπαζεηηθψλ γηαηξψλ ρξεηάδνληαη πξνζνρή ζηελ αλάγλσζε ηνπο. Π.ρ. αξαίσζε 3Υ ζηελ νκνηνπαζεηηθή ζεκαίλεη αξαίσζε 103 ε νπνία πνιιέο θνξέο αλαγξάθεηαη σο 1:1000 ή 10-3. Δπηζηεκνληθά, αξαίσζε 3Υ ζεκαίλεη αξαίσζε ηεο αξρηθή ζπγθέληξσζεο 3 θνξέο (ππν-3-πιάζην) θαη φρη 1000 θνξέο. Οη θαλφλεο ησλ αξαηψζεσλ ζηελ νκνηνπαζεηηθή, ππάξρνπλ, είλαη μεθάζαξα γξακκέλνη θαη σο θαξκαθνπνηνί θξνληίδνπκε λα εμνηθεησζνχκε κε ηνπο θαλφλεο απηνχο πξηλ λα εθηειέζνπκε νκνηνπαζεηηθέο ζπληαγέο. Μηα άιιε δηαθνξά ησλ νκνηνπαζεηηθψλ ζθεπαζκάησλ είλαη φηη ζε αξθεηά απφ ηα ζθεπάζκαηα δελ ππάξρεη ε έλλνηα ηνπ δξαζηηθνχ ζπζηαηηθνχ νχηε ε ζπγθέληξσζε ηνπ αξρηθνχ (κεηξηθνχ) ζθεπάζκαηνο αθνχ πνιιέο θνξέο ηα ζθεπάζκαηα απηά είλαη εθρπιίζκαηα δξνγψλ πνπ πεξηέρνπλ ρηιηάδεο νπζίεο. Αμηφινγν είλαη ην γεγνλφο φηη πνιιέο θνξέο ζπληαγνγξαθνχληαη αξαηψζεηο κεγαιχηεξεο ηνπ 24Υ (δει. 1024). Απηφ ινγηθά ζεκαίλεη φηη ζην ηειηθφ ζθεχαζκα δελ ππάξρεη νχηε έλα κφξην νπζίαο αθνχ ε

152

αξαίσζε μεπεξλά ηνλ αξηζκφ ηνπ Avogadro 6.024 1023 κφξηα/mol. Σν θηινζνθηθφ ππφβαζξν ηεο νκνηνπαζεηηθήο είλαη αξθεηά ελδηαθέξνλ αιιά δπζηπρψο ην επηζηεκνληθφ απέρεη αθφκε ηεθκεξίσζεο. Παξφιν πνπ ε νκνηνπαζεηηθή δελ είλαη αληηθείκελν κειέηεο απηνχ ηνπ βηβιίνπ, ηνλίδνπκε φηη νη ππνινγηζκνί αξαηψζεσλ πνπ δηδάζθνληαη ζην βηβιίν απηφ φρη κφλν ζα ζαο βνεζήζνπλ λα θαηαλνήζεηε ηηο αξαηψζεηο ησλ νκνηνπαζεηηθψλ ζθεπαζκάησλ αιιά λα αληεπεμέιζεηε ζε νπνηεζδήπνηε αξαηψζεηο άιινπ επηζηεκνληθνχ ή επαγγεικαηηθνχ πεδίνπ. ΢ην θάησ-θάησ, νη αξαηψζεηο είλαη πάληνηε αξαηψζεηο.

Παξάδεηγκα 5.5 Να ππνινγίζεηε ηνλ ζπληειεζηή αξαίσζεο (DF) θαη ηε ζπγθέληξσζε ελφο δηαιχκαηνο πνπ πξνέθπςε απφ 3, ππνδεθαπιάζηεο (ππν-10-πιάζηεο) δηαδνρηθέο αξαηψζεηο ηνπ αξρηθνχ δηαιχκαηνο.

Λχζε DF = 10 . 10 . 10 = 103 =1000

⇒

Cf = C/1000 = 10-3 C

Παξάδεηγκα 5.6 Να πεξηγξάςεηε πσο ζα θαηαζθεπάζεηε θακπχιε αλαθνξάο (standard curve) κε ηελ νπνία ζα πξνζδηνξίζεηε ηελ ζπγθέληξσζε ηνπ κεθαηλακηθνχ νμένο (mefenamic acid) ζην αίκα αζζελνχο, ρξεζηκνπνηψληαο απνζεκαηηθφ ή κεηξηθφ δηάιπκα (stock solution) κεθαηλακηθνχ νμένο ζπγθέληξσζεο 40 g/mL. Ζ δηαιπηφηεηα ηνπ κεθαηλακηθνχ νμένο ζην λεξφ είλαη 0.04 mg/mL.

153

Λχζε Οη ππνινγηζκνί πνπ εκπιέθνληαη ζηελ θαηαζθεπή κηαο θακπχιεο αλαθνξάο εμαξηψληαη θπξίσο απφ δχν θξίζηκεο απνθάζεηο: (1) ην εχξνο ηεο ζπγθέληξσζεο ηνπ θαξκάθνπ πνπ ζα θαιχςεη ε πξφηππε θακπχιε ή ε θακπχιε αλαθνξάο θαη (2) ν φγθνο ηνπ θάζε δείγκαηνο. Ζ ζπγθέληξσζε ηνπ κεηξηθνχ δηαιχκαηνο δελ κπνξεί λα μεπεξλά ηελ δηαιπηφηεηα ηνπ θαξκάθνπ. Γηα αξρή, ζα ήηαλ θαιή ηδέα ε θακπχιε αλαθνξάο λα θαιχπηεη έλα εχξνο ζπγθέληξσζεο ηνπιάρηζηνλ 10 θνξέο πην αξαηφ απφ ηελ ζπγθέληξσζε ηνπ απνζεκαηηθνχ δηαιχκαηνο ή ηνπιάρηζηνλ 10 θνξέο πην ππθλφ απφ ηελ κηθξφηεξε ζπγθέληξσζε αλίρλεπζεο ηνπ θαξκάθνπ. Ζ ζπγθεθξηκέλε απφθαζε πνπ ζα πάξεηε εμαξηάηαη απφ ηελ δηαιπηφηεηα ηνπ θαξκάθνπ θαη ηελ επαηζζεζία ηνπ αλαιπηηθνχ νξγάλνπ. Όζν πην επαίζζεηε είλαη ε κέζνδνο αλίρλεπζεο ηνπ θαξκάθνπ ηφζν πην κηθξή ζπγθέληξσζε θαξκάθνπ απαηηείηαη γηα ηελ αλίρλεπζε ηνπ θαη επνκέλσο κπνξνχκε λα δνπιέςνπκε κε πνιχ αξαηά δηαιχκαηα. Ο φγθνο θάζε δείγκαηνο εμαξηάηαη απφ ην αλαιπηηθφ φξγαλν. Θεσξψληαο φηη ην φξγαλν πνπ ρξεζηκνπνηείηαη εδψ είλαη έλα θαζκαηνθσηφκεηξν ππεξηψδνπο/νξαηνχ θσηφο (UV) θαη φηη ε απνξξφθεζε ηνπ θσηφο θάζε δηαιχκαηνο κεηξηέηαη ζε θπςειίδα ρσξεηηθφηεηαο 1 mL, ε θακπχιε αλαθνξάο ζα θαηαζθεπαζηεί κε 5, ππνδηπιάζηεο δηαδνρηθέο αξαηψζεηο ηνπ απνζεκαηηθνχ δηαιχκαηνο. Ο φγθνο ησλ αξαησκέλσλ δηαιπκάησλ θαζνξίδεηαη ζην 1 mL.

΢ηάδην 1: Παξαζθεπή απνζεκαηηθνχ (κεηξηθνχ) δηαιχκαηνο (stock solution). Επγίδνπκε 4 mg κεθαηλακηθνχ νμένο θαη ηα δηαιχνκε ζε 100 mL κε λεξφ (C = 0.004%).

154

΢ηάδην 2: Γηαδνρηθέο αξαηψζεηο (Serial dilutions) Μεηαθέξνπκε 1 mL απφ ην απνζεκαηηθφ δηάιπκα ζε 1 mL χδαηνο ζηνλ πξψην δνθηκαζηηθφ ζσιήλα απφ ηα αξηζηεξά θαη αλαθηλνχκε θαιά γηα λα αλακηρζνχλ ηα δπν πγξά. Απφ ην αξαησκέλν δηάιπκα (1νο ζσιήλαο) κεηαθέξνπκε 1 mL θαη αλακεηγλχνπκε θαιά κε 1 mL λεξνχ, θ.ν.θ. Ζ αξαίσζε ζηνλ πξψην ζσιήλα ζα είλαη 1 πξνο 2 ή 1/2, ζην δεχηεξν ζσιήλα 1/4 θαη νχησ θαζεμήο. Ο ηειηθφο φγθνο ηνπ ηειεπηαίνπ δηαιχκαηνο είλαη 2 mL γηαηί ην δηάιπκα απηφ δελ ρξεζηκνπνηείηαη ζε πεξαηηέξσ αξαηψζεηο. Ζ κέζνδνο ηεο δηαδνρηθήο ζε ζεηξά αξαίσζεο ηνπ κεθαηλακηθνχ νμένο απεηθνλίδεηαη ζην ΢ρήκα. 5.2.

Μεηξηθφ δ/κα κεθαηλακηθνχ νμένο 0.04 mg/mL

1 mL 1 mL

΢ρήκα 5.2

1 mL

1 mL

1 mL

5 ππν-2-πιάζηεο δηαδνρηθέο αξαηώζεηο

155