Amibiasis y la Biología de Entamoeba histolytica by José Araujo

Amibiasis y la BiologĂa de Entamoeba histolytica

Amibiasis y la Biología de Entamoeba histolytica

Editorial académica española 2020 Amibiasis y la Biología de Entamaba histolytica Copyright José Araujo Blanco . Haydee Urdaneta ©

ISBN: 987-620-0-42237-8

Amibiasis y la BiologĂa de Entamoeba histolytica

Amibiasis_

Y la BiologĂa de Entamoeba histolytica

Amibiasis y la Biología de Entamoeba histolytica

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Y la Biología de Entamoeba histolytica

José Araujo Blanco y Haydeé Urdaneta

Amibiasis y la Biología de Entamoeba histolytica El Libro Biología de la Amibiasis, fue escrito como material de apoyo para los cursos de pre y postgrado del área de Ciencias de la Salud, Ciencias Biológicas y Biomedicina, es el producto de años de estudio e investigaciones sobre el tema de los autores e investigadores. Universidades e Institutos Involucrados desarrollo y revisión de este libro

-Universidad del Zulia -Facultad Experimental de Ciencias FEC LUZ (Venezuela) -Instituto de Investigaciones Clínicas Americo Negrette -Universidad Experimental Francisco de Miranda (UNEFM); Venezuela -Centro de Investigaciones en Ciencias Básica (CICBa) -Unidad de Microscopía Electrónica UNEFM (UMEUNEFM) -Laboratorio de Microbiología Ambiental UNEFM -Universidad de los Andes (ULA) (Venezuela) -Instituto de Inmunología Clínica (IDIC) -Laboratorio de Inmunoparasitología IDIC-ULA -Universidad del Magdalena, Colombia -Cátedra de Microbiología Ambiental Unimagdalena Autores: José Amable Araujo Blanco Jaab19@gmail.com Haydee Urdaneta Romero hurdaneta84@hotmail.com Portada: © 2020 José Araujo #prof.josearaujo #josearaujoblanco Diseño y diagramación: José Araujo 5

Amibiasis y la Biología de Entamoeba histolytica

PRÓLOGO

Este libro tiene como propósito, recrear de manera sencilla, al lector de conceptos y descubrimientos sobre la amibiasis como enfermedad, clínica, patología, diagnóstico y tratamiento, así como los diversos aspectos de la biología de la entamoeba histolytica como agente causante de la enfermedad. Este libro está diseñado para los cursos de pre y posgrado sobre la amibiasis. Su base se fundamenta en la amplia trayectoria de los investigadores en el estudio y diagnóstico de la amibiasis tanto a nivel nacional como internacional. En el uso de una cepa axénica autóctona y con referencia mundial de Entamoeba histolytica agente causante de la amibiasis. El texto incluye una revisión sobre la estructura, taxonomía actual y ciclo de vida de esta especie. Posteriormente se revisa la epidemiología y prevalencia mundial y regional, de esta infección seguidamente se muestra el desarrollo histórico y una reseña histórica estructurada sobre los hallazgos de la biología del parasito y la enfermedad, destacando algunos aspectos microbiológicos y conocimientos poco abordados, como el cultivo, y la patogenia amibiana, que actualmente son de gran interés. Luego una visión general sobre la respuesta inmunitaria contra el parasito tanto humoral como celular, destacando la capacidad de evasión de la respuesta inmunitaria del parasito y su acción sobre el complemento. Seguidamente explicamos la capacidad de duplicación y ciclo celular del parasito, el secuenciamiento completo del genoma aspecto de interés para elucidación de nuevos descubrimientos sobre la biología del parásito. Por último mostramos las propiedades antigénicas del parásito y un esbozo de nuestras experiencias y avances sobre el diagnóstico, con información novedosa sobre los métodos, paso a paso para el diagnóstico inmunológico y molecular -como componente practico- en el texto. Por último el tratamiento y las nuevas investigaciones que apuntan a la resolución de esta enfermedad.

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Tabla de Contenido Amibiasis Epidemiología y Prevalencia Taxonomía de Entamoeba histolytica Estructura y Biología del Parasito Ciclo de vida Reseña Histórica Patogenia del parásito Zimodemos del parasito Medio del Cultivo Respuesta Inmunitaria a la amibiasis Mecanismos de evasión de la respuesta inmunitaria del parásito División Nuclear y Ciclo celular Genómica del parásito Propiedades antigénicas del parásito Diagnóstico de la amibiasis Tratamiento de la amibiasis

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Life´s architecture: cells grow with ¨tensegrity¨

Amibiasis La amibiasis es una enfermedad cosmopolita causada por el protozoario entérico Entamoeba histolytica, uno de los más primitivos eucariontes, especie parásita que afecta al hombre, Urdaneta H 1997, WHO/Paho/Unesco 1997, Araujo J 2008 la organización mundial de la salud (OMS) la define, como una infección producida por E. histolytica que habita normalmente en el intestino grueso, que puede invadir la mucosa intestinal produciendo ulceraciones y lograr localizaciones extraintestinales, al diseminarse a otros órganos Ravdin Jl 1989 como lo demuestran estudios realizados en casos Cunha AS 1991 gastroenterológicos y en casos extraintestinales. Lyche KD 1997 El termino ameba, amoeba y amiba son símiles, en lo sucesivo utilizaremos amiba para rerirnos a la amibiasis, amebiasis o entameobiosis . 8

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Epidemiologia y Prevalencia

Esta enfermedad parasitaria mundialmente, posee una alta morbilidad y mortalidad Walsh JA 1889 a. La infección por E. histolytica ha sido estimada en un 10% de la población mundial, ocurriendo aproximadamente de 50.000 a 100.000 muertes al año, siendo la tercera causa de muerte por parasitosis superada por la malaria y la Schitosomiasis Walsh JA 1986 b, Araujo J 2008. La amibiasis se observa frecuentemente en los países tropicales Gonzales A 1994, con prevalencias puede variar entre 0.8% al 60% Guerrant RL 1986, Walsh JA 1986a, WHO/Paho/Unesco 1997 . En algunas regiones tropicales pueden alcanzar tazas de hasta de un 80% Ungar BL 1985 constituyendo un serio problema de salud pública Ortiz L 1986, Mendoza F 1985 . José Araujo 2020, #prof.josearaujo #joseraujoblanco.

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Según especialistas de la Organización Mundial de la salud (OMS) hay aproximadamente 500 millones de personas que desarrollan colitis con abscesos extraintestinales, entre 40.000 y 110.000 muertes son atribuidas a casos de amibiasis, ocupando el decimocuarto lugar entre las 24 infecciones más importantes en el mundo WHO/Paho/Unesco 1997. Las muertes por infección con E. histolytica se manifiestan principalmente como abscesos hepáticos o colitis fulminante Walsh JA 1986 a, Guerrant RL 1986. La amibiasis es uno de los principales problemas de salud pública en América Latina, debido a las inadecuadas condiciones sanitarias y presencia de cepas altamente virulentas en combinación con una incidencia de infecciones sintomáticas Martínez PA 1988. Existe un grave riesgo asociado a portadores asintomático especialmente aquellos encargados del cuidado, crianza, preparación y servicio de alimentos. Los efectos patogénicos y la expresión clínica de la amibiasis dependen de factores relacionados con el hospedador y el parásito, variando marcadamente en las diferentes áreas geográficas, condiciones sanitarias y socioeconómicas de la población Araujo J 2008. Los factores relacionados con la expresión clínica en el hospedador son: el estado nutricional, los hábitos sexuales, y la respuesta inmunológica y humoral. Estudios pediátricos demuestran que la amibiasis invasiva puede ocurrir en niños Fuchs EC 1988 y en personas mal nutridas Wanke C 1988 e individuos tomando corticosteróides. En los Estados Unidos se presentan prevalencias de 4 - 25.5% en los grupos de alto riesgo Petri y Ravdin 1988 especialmente entre los retardados mentales, homosexuales, Markell EK 1984, Nagakura K 1990 pacientes con inmunodeficiencia adquirida Moura H 1989, Smith JM 1982 y en emigrantes recientes de áreas endémicas como México 10

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ya que probablemente por el conocimiento sobre que el 5.95% de lapoblación Mexicana es portadora de anticuerpos de contra E. histolytica Guerrero M 1972. Utilizando métodos clásicos, como la microscopia óptica reportan un 12% en pacientes sin disentería amibiana, infectados con E. histolytica Gonzales A 1994. Otros estudios que incluyen el método convencional de microscopía más el análisis serológico, muestran prevalencias de 15.4% en sectores rurales de del Noreste de Brasil Goncalves JF 1990. Aunque en Brasil la prevalencia es variable de acuerdo a la región de estudio y sus prevalencias oscilan desde 7.5% a 60%. 11

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Siguiendo el esquema diagnóstico antes mencionado han sido evaluadas, poblaciones urbanas y rurales en el Salvador que mostraron una prevalencia de 15.9% Harrison H 1981. Otros países muestran las siguientes prevalencias: Argentina 6.0% Cuadrado RR 1967, Cunha AS 1977, Colombia 33% Healy GR 1971 Bangladesh 29% Haque R 1994.

La Amibiasis en el Mundo La amibiasis es un problema de salud pública en América Latina

La amibiasis es frecuente en países tropicales

Numero que ocupa entre las infecciones más importantes del mundo.

3ra Causa de muerte por parasitosis de la población mundial se ha infectado con E. histolytica y presentado algún caso clínico

10%

La OMS reporta 500 millones de personas con colitis 40.000 son casos extraintestinales 110.000 muertes José Araujo 2020, #prof.josearaujo #joseraujoblanco.

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En Venezuela, la amibiasis es, señalada en casi todas las regiones tanto en las grandes ciudades como en el medio rural observándose un incremento en la frecuencia de las formas disentéricas, especialmente en niños y un mayor vicerotropismo con producción de absceso hepático en adultos Homez J 1995. En Venezuela la amibiasis es una infección parasitológica de alta significancia patológica, debido al amplio espectro clínico presente. En el Estado Zulia se reportan prevalencias del 4.4% al 26.6% aunque en diferentes estdios realizados en zonas marginales esta presenta una prevalencia de 46.6%, lo que muestra como la prevalencia va en aumento de zonas urbanas a rurales, producto de la disminución al acceso de los servicios básicos, en especial al agua, cuyo tratamiento y distribución disminuye, al igual que aumenta su contaminación, por la forma de almacenaje e higiene para preparar los alimentos, lo que influye y notablemente en la infección con este parásito y su recurrencia Aguirre A 1997, Chacin-Bonilla L 2000, 1981, 1982, 1992 , motivo por el cual se presumía valores altos en las poblaciones indígenas, ya que viven en condiciones depauperadas, aunque los estudios microscópicos y serológicos mostraron una prevalencia de 10% Araujo J 2001. Por otro lado las variaciones de prevalencia están sujetas al grado de saneamiento ambiental, clima, nivel socioeconómico y cultural, hábitos de higiene y técnicas utilizadas para el diagnóstico lo que los convierte en un en un problema multifactorial Ravdin Jl 1989, WHO/Paho/Unesco 1997, Araujo j 2008.

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Amiba / José Araujo 2020, #prof.josearaujo #joseraujoblanco

Taxonomía histolytica

Entamoeba

La taxonomía es una disciplina cambiante sobre todo en estos últimos años, gracias a las técnicas utilizadas actualmente, por lo que la clasificación de base de este parasito siempre estará en constante cambio. A pesar de esto Entamoeba histolytica es siempre considerado un protozoario, ya sea (protista) por su característica de eucarionte heterótrofo y unicelular, como muestra el árbol filogenético de eckel 1866 o en la clasificación propuesta por Whittaker en 1969 de cinco reinos (Reino Monera, Reino Protista, Reino Animal, Reino Fungí y Reino Vegetal) o según el árbol filogenético universal construido a partir de las secuencias de los ARN ribosomal, 16S y 18S donde 14

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existen tres dominios (Bacterias, Archea, Eukarya). En la actualidad la clasificación taxonómica varia con frecuencia dependiendo del estudio, método y cepa utilizada es por esto que se sugiere revisar con frecuencia el banco mundial de genes para evidenciar las diferentes clasificaciones taxonómicas tomando en cuenta que el campo de la sistemática es muy cambiante y dinámico por lo que grandes cambios pueden ocurrir próximamente. Sin embargo mostramos la siguiente clasificación y sus explicaciones: Clasificación basada en un estudio a la cepa HM-1:IMSS Eukaryota (Dominio) Amoebozoa (Phylum –Filo-) Evosea (Phylum) Archamoebae (filo) Entamoebidae (familia) Entamoeba (genero) Entamoeba histolytica (especies) Entamoeba dispar Entamoeba moshkovskii Entamoeba bangladeshi Esta clasificación llamada Eukaryota o Eukarya (verdadero núcleo) es el dominio que incluye a todos los organismos constituidos por células con núcleo verdadero. El filo amoebozoa (figura 1) incluye a todos los organismos que tienen células que generan seudópodos, en este se encuentran todos los seres ameboides incluye los antiguos phylum Sarcodina o Rhizopoda ya que no se consideran en lo actual como grupos no naturales. 15

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Los estudios estructurales y genéticos identificados de esta taxa lo identifican como uno de los grupos caracterizados en su filogenia a partir del ARNr, como uno de los primeros precursores eucariotas en el proceso de evolución.

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Figura 1. Árbol filogenético donde se identifica la ubicación del filo amebosoa. Tomado y modificado de: Wikiespecies: Amoebozoa. José Araujo 2020, #prof.josearaujo #joseraujoblanco

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Entamoeba histolytica se encuentra dentro del filo amebozoa en la división interna del grupo Evocea, a su vez dentro del grupo conosa (figura 2) Cavalier-Smith, 1998.

│Figura 2. Distribución de las ramas taxonómicas del filo Amebosoa. Tomado y modificado de: Wikiespecies: Amoebozoa. José Araujo 2020, #prof.josearaujo #joseraujoblanco

Los amebozoos son el grupo característico de protistas ameboideos que se desplazan por el movimiento interno de su citoplasmas son unicelulares, con seudópodos de tipo lobópodo presentes en diversos hábitat con nutrición heterótrofa utilizando como estrategia de alimentación a la fagocitosis / trogocitosis, algunos simbióticos y otros parásitos entre los que destaca E. histolytica.

│

Figura 3 Identificación la división de Archamoeba dentro del filo amebosoa. Tomado y modificado de: Cavalier-Smith, T., Fiore-Donno, A. M., Chao, E., Kudryavtsev, A., Berney, C., Snell, E. A., & Lewis, R. (2015). Multigene phylogeny resolves deep branching of Amoebozoa. Molecular Phylogenetics and Evolution, 83, 293-304. José Araujo 2020, #prof.josearaujo #joseraujoblanco

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Las Archeoamebas (figura 3) son protistas anaeróbicos de vida libre o endobióticos que constituye el linaje anaeróbico principal del supergrupo Amoebozoa, dentro de este se encuentra la familia entamoebidae sus representantes son predominantemente endobióticos algunos flagelado y representan un linaje separado, de ramificación profunda de la familia Entamoebida.

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Figura 4 Arbol filogéntico del super grupo Archamoebae. Tomado y modificado de; Pawlowski, J., & Burki, F. (2009). Untangling the Phylogeny of Amoeboid Protists 1. Journal of Eukaryotic Microbiology, 56(1), 16-25. José Araujo 2020, #prof.josearaujo #joseraujoblanco.

Estudios filogenéticos multigénicos muestran que dos eventos evolutivos únicos, uno la transferencia horizontal del sistema de fijación de nitrógeno de las bacterias y dos la transferencia de la vía de activación del sulfato a los derivados mitocondriales son procesos que muestran la antigüedad de este la taxa Archamoebae Pánek T 2016. El Infraphylum Archamoebae (figura 4) es un grupo de protistas que evolucionaron antes de la adquisición de las mitocondrias por los eucariotas. En este grupo se encuentran géneros representativos que son parásitos y comensales de animales como (Entamoeba y Cavalier-Smith 1993; 1998 Endolimax) , de igual manera tenemos a la Clase Archamoebea Cavalier-Smith 2004. Es por esto que E. histolytica se considera un microorganismo que pertenece a un linaje que divergió muy temprano 18

Amibiasis y la Biología de Entamoeba histolytica Orosco E 2000

durante la evolución de los eucariontes . Los organismos sin mitocondrias como E. histolytica hipotéticamente se separaron de los organismos mitocondriados antes de que estos formaran varios reinos o más recientemente llamados dominios. Así E. histolytica sería reliquia viviente, descendiente de los primeros organismos aparecidos justo antes de que ocurriera la simbiosis con la protomitocondria Hasegawa M 1993 por esta razón se les denomina a los protozoarios amitocondriados archezoas Cavalier-Smith 1993.

Este

endo

parásito

pertenece

familia

Entamobidae, cuyos miembros todos son parásitos

Orosco

E 2000

. Estudios filogenéticos basados en la comparación de las secuencias de la subunidad pequeña del DNA ribosomal (srDNA) proponen que E. histolytica pertenece a la familia Entamoebidae la cual comprende únicamente el género Entamoeba, en el cual se encuentra E. histolytica que causa la disentería amébica en humanos. Son endosimbióticos y carecen de flagelos. El movimiento es generalmente monopodial y relativamente rápido. El estudio filogenético realizado para determinar la posición de E. histolytica en el escalafón evolutivo ha mostrado diferentes divergencias de acuerdo a los estudios y los análisis realizados. Las (srDNA) tienen desventajas al comparar a E. histolytica con organismos de diferentes porcentajes en los nucleótidos, guaninacitosina en su DNA ya que E. histolytica es rico en adenina-timina, por lo que para poder ubicarlo, se han hecho estudios filogenéticos basados en las proteínas conservadas a través de la evolución

Hasegawa M 1993

. 19

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Estudios de aminoácidos con el factor de alargamiento 1α (EF- α) de ocurrencia universal en todos los organismos vivos a podido colocar a E. histolytica en genero Entamoeba. La interpretación de los datos obtenidos hasta ahora a partir de los árboles filogenéticos es variable y depende del gen o proteína que se use por lo que para realizar la clasificación taxonómica se deben realizar estudios evolutivos, tomar en cuenta características morfológicas, fisiológicas y genéticas Orosco E 2000. Estudios realizados sobre la filogenia (figura 5) de entamoeba han mostrado que era posible agrupar los elementos morfológicos en los quistes como la presencia de 4 núcleos y la sub unidad menor de ARNr para agrupar en un árbol filogenético Silberman J, 1999.

│Figura 5

Ubicación de E. histolytica en relación a otras amebas. Agrupadas por la característica de poseer 4 núcleos en su forma evolutiva de quiste. Nótese la cercanía entre E. dispar, E. histolytica y E. moshkovskii. Tomado y modificado de Silberman, J. D., Clark, C. G., Diamond, L. S., & Sogin, M. L. (1999). Phylogeny of the genera Entamoeba and Endolimax as deduced from small-subunit ribosomal RNA sequences. Molecular biology and evolution, 16(12), 1740-1751. José Araujo 2020, #prof.josearaujo #joseraujoblanco

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Otros estudios han mostrado que las agrupaciones entre la cantidad de núcleos y subunidad pequeña del ARNr no son útiles (figura 6), debido a la incorporación de nuevos datos que generan divergencia Ponce F 2010.

│

Figura 6 Relación filogenética entre especies del género Entamoeba mediante análisis de la secuencia del ARNr 16s, según Stensvold (2010). Este árbol confirma el propuesto por Ponce-Gordo (2007) en lo que se refiere a la no correlación entre los agrupamientos y el número de núcleos en los quistes maduros, es decir, en la no coincidencia entre los grupos genéticos y los grupos morfológicos. Tomado y modificado de (Ponce F, 2010). José Araujo 2020, #prof.josearaujo #joseraujoblanco

Anteriormente Entamoeba hartmanni fue descrita como parecida a E. histolytica, pero esta, es mucho más pequeña al ser analizada en sus ambas formas evolutivas (figura 7). Algunos autores pensaban que eran la misma ameba, sin embargo posteriormente se consideró como un organismo diferente asociado a la flora humana como E. coli y E. gingivalis. Los trabajos de esa época entre los 50 y los 70 rechazaron o no tomaron en cuenta la existencia E. dispar y E moshkovskii, por falta de información al respecto. 21

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│Figura 7

Árbol filogenético de Entamoeba histolytica Tomado y modificado de: Weedall, G. D., & Hall, N. (2011). Evolutionary genomics of Entamoeba. Research in microbiology, 162(6), 637-645. José Araujo 2020, #prof.josearaujo #joseraujoblanco

Posteriormente con el avance de las técnicas inmunológicas y moleculares se recogió suficiente información para establecer al ¨Complejo de Entamoeba histolytica¨ que incluye la incorporación de tres especies morfológicamente similares ya que no pueden ser diferenciadas en sus quistes o trofozoítos al realizar el análisis microscópico, estas son: Entamoeba histolytica caracterizada como patógena, Entamoeba dispar la cual se considera como inocua y Entamoeba moshkovskii esta última aislada en Rusia de las aguas residuales y que parasita al hombre. Los cambios recientes muestran nuevos linajes y especies que abren aún más la frontera en el conocimiento de la amibiasis tal es el recién descubrimiento de Entamoeba bangladeshi Royer 2012, estudiada en niños, con o sin diarrea pero que fueron positivos a quistes tetranucleados y que no respondieron a las pruebas moleculares de PCR y 22

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pruebas inmunológicas, dando negativos para E. histolytica, E. dispar y E. moshkovskii, esta nueva especie es morfológicamente similar a E. histolytica en las etapas de quiste y trofozoítos está más emparentada con E. ecuadoriensis la cual se considerado asociada a E. histolytica ha sido encontrada en el alcantarillado. E. moshkovskii E. ecuadoriensis E. Bangladeshi E. dispar

(Aso)

CEh

E. histolytica

E. hartmanni

│

Figura 8 Árbol filogenético de Entamoeba histolytica incluyendo a la nueva especie Entamoeba, en la actualidad cuatro especies muestran al CEh: Complejo de Entamoeba histolytica ► y una especie (Aso) se considera asociada dentro del complejo. José Araujo 2020, #prof.josearaujo #joseraujoblanco.

Es por esto que el complejo de E. histolytica (figura 8) en la actualidad incluye a las cuatro especies que son [E. histolytica, E. dispar, E. moshkovskii y E. bangladeshi], cabe destacar que una de las ramas más cambiantes es la taxonomía, puesto que a medida que se avanza en tecnología, esta ofrece nuevos datos, la información filogenética ha demostrado la presencia y existencia de más de tres parásitos morfológicamente iguales con quistes tetranucledos que parasitan al humano pero que divergen genéticamente al hacer el análisis filogenético. A pesar de los diversos estudios sobre E. histolytica aún quedan muchas preguntas sobre la evolución de las especies de Entamoeba, relacionadas con la compleja arquitectura del genoma y la estructura de las poblaciones Neal RA 1988, Weedall, 2011; Royer, 2012, Stensvold 2010; 2011. . 23

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mitosoma

Estudios Filogenéticos en las secuencias de la sub-unidad pequeña del ARN ribosomal (ARNr) proponen que Entamoeba histolytica pertenece a un linaje que divergió muy temprano en la evolución de eucariontes. E. histolytica es un organismo amitocondriado, en su defecto posee mitosomas.

ARNr

No posee mitocondrias

Sulfato Activación

Posee mitosomas

A B

Núcleo

Lípidos

Sulfolipidos

RER

Pseudopodos (Falsos pies) Tienen función de locomoción y nutrición Pseudopo de tipo Lobópodo

C Filamentos de actina Proteínas de conexión

Miosina II Formina

Integrinas

Membrana Plasmática

Entamoeba histolytica, es un protozoario microaerofílico parásito que posee mitosomas. Los mitosomas son orgánulos antiguos y se encuentran relacionados con las mitocondrias no realizan el ciclo del ácido tricarboxílico y la fosforilación oxidativa. Los roles biológicos de los mitosomas de Entamoeba han sido un enigma de larga data. La activacion del sulfato solo ocurre en los mitosomas esta activación de sulfato coopera con las enzimas citosólicas, como sulfotransferasas (SULT), para la síntesis de sulfolípidos, uno de los cuales es el sulfato de colesterilo el cual desempeña un papel importante en la enquistación del parasito. Se ha demostradola capacidad de intercambio de la 3′-fosfoadenosina 5′-fosfosulfato (PAPS) con ATP. Se muestra que los SULT en E. histolytica poseen localización citosólica, lo que sugiere que, el PAPS, que se produce a través de la activación del sulfato mitosomal, se transloca al citosol y se convierte en un sustrato para los SULT. Por el contrario, el ATP, que se produce a través de las vías citosólicas, se transloca a los mitosomas y es un sustrato necesario para la activación del sulfato. Los hallazgos sugieren que las proteínas encontradas funcionan como un antiportador PAPS / ATP y desempeña un papel crucial en la vinculación de la vía de activación del sulfato mitosomal con los SULT citosólicos para la producción de sulfolípidos

│Figura 9

E. histolytica: A.-El ribosoma (Orozco, 2000); B.-El mitosoma (Mi-ichi, 2015) C.- Los trofozoítos de E. histolytica se mueven gracias a sus pseudópodos, cuando los pseudópodos detectan el medio extracelular se unen a la superficie por medio de integrinas, y se desencadena una señalización que hace que los componentes de la matríz intracelular se desplacen hacia el lugar de adhesión, este proceso está mediado por las proteínas actina y miosina las cuales se polimerizan y despolimerizan uniéndose a las integrinas por medio de proteínas intermedias (Mejias M 20202), José Araujo 2020, #prof.josearaujo #joseraujoblanco.

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│

Figura 10 Formas Evolutivas de Entamoeba histolytica, tomado y modificado de CDC Public Health Image Library (PHIL) / A) Trofozoítos en superficie micrografía bar – 10μm; B) Trofozoítos observado en microscopio óptico; C) Trofozoítos con eritrocitos fagocitados, trofozoítos eritrofágico, D) Trofozoítos microscopía electrónica de barrido, E) Prequiste, F) Quiste tetranucleado. José Araujo 2020, #prof.josearaujo #joseraujoblanco.

Formas Evolutivas y Estructura de E. histolytica. Este microorganismo es un protozoario caracterizado como un eucarionte primitivo que ha sobrepasado las barreras del tiempo y posee descendientes en la actualidad presentes en todo el mundo. Aunque se considera a su estructura simple, este a parasitado al hombre por más de 10 décadas y quizás mucho antes de su primer reporte en 1860 por Lambal, es por eso que en la actualidad un grupo de investigadores y expertos en la materia lo consideran una especie de interés para el estudio biológico (figura 10). 25

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Aun queda mucho por descubrir sobre este parásito que sigue sorprendiendo al mundo con su capacidad y versatilidad sobre el ecosistema o medio donde se encuentre, este parásito exhibe características que lo colocan como un endoparásito de allí su clasificación en el género Entamoeba, quienes producen seudópodos en algún estadio de su vida. Estamos frente a un antiguo habitante de esta tierra quien logra con éxito la conquistas de diversos habitas modificando su estructura evolutivamente, y mostrando tres formas estructuralmente diferenciables; el trofozoítos, prequiste y quiste (figura 10).

│

Figura 11 A) Trofozoítos de Entamoeba histolytica, B) Trofozoítos que han fagocitado células sanguíneas que son degradadas en su interior conocidos como trofozoítos eritrofágicos / Tomado y modificado de imágenes de CDC Public Health Image Library (PHIL). José Araujo 2020, #prof.josearaujo #joseraujoblanco.

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El trofozoíto de E. histolytica

El trofozoíto de E. histolytica es el modelo evolutivo más estudiado, (figura 10, 11, 15, 16, 19, 26) además de ser considerado como la forma vegetativa, -es decir la forma evolutiva que presenta todas la propiedades y funciones vitales-. Es con esta forma evolutiva, con la que se clasifica a E. histolytica dentro del dominio Eucarionte o Eukarya en árbol filogenético actual (Whitaker 1969).

V M Membrana Plasmática V

V V

N PC Núcleo

│Figura 12

Ultra estructura de un trofozoítos de E. histolytica, citoplasma que contiene N: Núcleo; PC: Pared Celular; V: Vacuolas; VN: Vacuola nutritiva, ►: Limite de la membrana plasmática del trofozoítos. Tomado y modificado de: El-Hashimi, W., & Pittman, F. (1970). Ultrastructure of Entamoeba histolytica trophozoites obtained from the colon and from in vitro cultures. The American Journal of Tropical Medicine and Higiene, 19(2), 215-226, José Araujo 2020, #prof.josearaujo #joseraujoblanco.

En general E. histolytica se clasifica como una célula eucariota, por poseer un núcleo definido, en su interior es posible encontrar una serie de vacuolas que 27

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contiene enzimas que le permiten degradar diversos elementos que son fagocitados hacia la matriz intracitoplasmática generando vacuolas nutritivas. El citoplasma (figura 12 y 13) está delimitado por membrana plasmática, de igual manera, este eucariota posee un núcleo delimitado por una membrana o pared celular, que lo delimita. Este protozoario posee un solo núcleo por lo que es considerado una célula uninucleada.

│

USA GAFAS 3D Figura 13 Micrografía 3D en la siguiente imagen puedes hacer una inmersión hacia el interior celular identificando su ultra estructura. José Araujo 2020, #prof.josearaujo #joseraujoblanco.

Se ha reportado que hasta un 20% de los trofozoítos pueden presentar dos núcleos mostrando células dinucleadas (figura 14) incluso casos de trofozoítos multinucleados -con más de dos núcleosaunque esto puede ser producto de la fase del ciclo celular en que se encuentra esta célula. 28

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│Figura 14 Tomado

Entamoeba histolytica, trofozoítos dinucleado observado a microscopio óptico,

y Modificado de CDC Public Health Image Library (PHIL).

José Araujo 2020,

#prof.josearaujo #joseraujoblanco.

Las amibas cumplen (figura 15) todas sus funciones vitales utilizando algunos organelos presentes en el citoplasma, propios de una célula eucarionte aunque en este aspecto la especie E. histolytica posee propiedades únicas, ya no posee mitocrondias y RER. Esta forma evolutiva muestra las características clásicas de los protozoarios, es decir -organismos eucariontes heterótrofos y unicelulares-. Las estructuras observables en el estudio microscópico muestran a un protozoario cuyas células son asimétricas, ya que no poseen eje ni plano de simetría alguna, y sus formas son disímiles entre sí muy activas con tamaños de 10 a 60 micras de diámetro. Amiba

Células Sanguineas

│Figura 15

Figura de una célula de Entamoeba histolytica, en forma evolutiva de trofozoítos con presencia de pseudópodos. Tomado y modificado de 7activestudio / NUTRITION IN AMOEBA / visita el video en el siguiente enlace suscríbete y haz clic en la campanita https://www.youtube.com/watch?v=5_4Y0tTHqyk José Araujo 2020, #prof.josearaujo #joseraujoblanco.

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Los procesos y funciones vitales se hacen en todo el cuerpo de este protozoario delimitado por la membrana plasmática, quien realiza las reacciones con ambiente en el que se relaciona. Es por esta razón que la membrana juega un papel crucial en la regulación, intercambio y metabolismo. Algunos autores sugieren que el microambiente creado en cultivos axénicos, induce cambios fenotípicos y genotípicos en los trofozoítos relacionados con cambios en su virulencia Orosco 2000 .

│

Figura 16 A) Microfotografía de trofozoíto de Entamoeba histolytica en vivo. Movimiento ameboide se observa la presencia de un pseudópodo que le permite la locomoción. / Tomado y modificado de imágenes de CDC Public Health Image Library (PHIL) / Armed Forces Institute of Pathology (AFIP). José Araujo 2020, #prof.josearaujo #joseraujoblanco.

La membrana plasmática

La membrana plasmática de esta amiba exhibe una plasticidad impresionante con un dinamismo (figura 16), frente a la frecuente producción de pseudópodos producto de prolongaciones citoplasmáticas que permiten la locomoción. 30

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│

Figura 17 A) Microfotografía de trofozoítos de A) Entamoeba histolytica y B) Entamoeba dispar., A1 y B1 muestran la ultra estructura de la membrana y los cambios internos del cito esqueleto / Tomado y modificado Talamás-Lara, D., Talamás-Rohana, P., Fragoso-Soriano, R. J., Espinosa-Cantellano, M., Chávez-Munguía, B., González-Robles, A., & Martínez-Palomo, A. (2015). Cell-matrix interactions of Entamoeba histolytica and E. dispar. A comparative study by electron-, atomic force-and confocal microscopy. Experimental cell research, 337(2), 226-233, José Araujo 2020, #prof.josearaujo #joseraujoblanco

En el caso de E. histolytica los pseudópodos presentes son de tipo lobopodios que incluyen un tipo específico de locomoción dentro de las amibas, cuyas estructuras estas están orientadas frontalmente, y los filopodios estructuras presentes en los trofozoítos, que se cree, tengan función de comunicación con otros trofozoítos o el ambiente, tal vez con propiedades fisiológicas de conductividad. 31

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La membrana del parasito es una estructura crucial (figura 17) puesto que esta constituye su barrera con el exterior pero a la vez le permite al cuerpo ameboide desarrollar diversos movimientos para cumplir las diversas actividades vitales. Esta membrana contiene proteínas un bicapa lipídica rica en colesterol con una concentración molar de 0,97 de colesterol com presencia de ATPasa dependiente de Ca ++, y posee un fosfolípido inusual un esfingofosfonolípido ceramidaamino-etil-fosfonato que es un lípido complejo resistente a la acción de la fosfolipasas Aleym 1980 La membrana contiene un conjunto de proteínas transmembranales y periféricas extrínsecas e intrínsecas. Las proteínas transmembranales le permiten el transporte de diversos compuestos de forma selectiva desde el interior de microorganismo hacia el exterior o viceversa. Muchas proteínas de la membrana participan en diversos eventos, como adhesión, secreción, presentación y recambio. En la membrana podemos encontrar proteínas transmembranales como la sub unidad pesada de la lectina Gal/GalNAc, Hgl y sus genes EH1_012270. EHI_042370, EHI_046650, EHI_077500 y EHI_133900, así como el complejo de proteínas transmembranales con dominio interno kinasas las TMKB1-9; TMKB3-96; TMKC-39. Las lectinas permiten reconocer azucares con una elevada especificidad como la Gal/GalNAc Nakada 2020. Entamoeba histolytica posee diversas proteínas periféricas como el complejo proteico EhCPADH implicado en la virulencia formado por la cisteína proteasa EhCP112 y la adhesina EhADH, ambos son proteínas periféricas, la primera globular y las segunda con dominios Bro1 y V. La proteína Calreticulina es una proteína mutifuncional asociada a los iones de calcio y 32

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puede ser considerada un antígeno. La membrana muestra diversas proteínas que funcionan como antígenos que son mostrados y presentados generando respuesta inmunológica, sin embargo así como son presentados los diversos antígenos y sus determinantes antigénicos también son recambiados, E. histolytica tiene todos los miembros del complejo ESCRT-III que juega un papel esencial en la remodelación de la membrana Galindo 2018, método que sirve para burlar al sistema inmune del hospedero. Algunas proteínas de membrana pueden ser utilizadas como marcadores de patogenicidad como la proteína STIRP una proteína rica en serina, treonina e isoleucina, que se expresa exclusivamente en las cepas virulentas de Entamaba histolytica o la proteína SREHP que es una proteína inmunogénica, rica en serina MacFarlane, 2007 al igual que otros antígenos como la proteína Arial una proteína rica en aspargina, y la proteina EhI_116360. La membrana participa en el transporte así los lipofosfoglucanos de la membrana también participa en la secreción de diversas proteínas con actividades estructurales y catalíticas que son transportadas por diversas vesículas y son liberadas al medio externo como enzimas que catalizan reacciones a conveniencia del parasito como proteasas, hidrolasas, y diversas liasas, así como complejos proteicos como el ameboporo que es transportado por la membrana hasta el exterior para causar daño en la membrana de la célula blanco. La membrana transfiere estimulos al resto de la célula e irritabilidad con capacidad para responder a estímulos ambientales o provocar cambios fisiológicos en la que se puede considerar la región posterior 33

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llamada uroide que es un apéndice al que se le atribuyen funciones defensivas

Brusca-Brusca 2005; Orosco 2000

El proceso de nutrición por endocitosis (figura 18) induce la fagocitosis / trogocitosis que inducen al recambio de la membrana para la formación de fagosómas que es producto de una endocitosis previa. Provenientes de la exocitosis y excreción vacuolar por endocitosis, además de la formación de parches o casquetes en los polos de la célula amibiana y que poco tiempo después del contacto. Los ligandos que se acumulan en un punto focal y que son movilizados al uroide, la formación de casquetes y parches probablemente es utilizado para un movimiento selectivo de componentes de la membrana. En la actualidad se estudian nuevos receptores y adhesinas que pueden estar involucrados en la patogenia la principal es la lectina Gal/GalNAc, que posee una subunidad mayor Hgl que es una proteína transmenbrana que es codificada por 5 genes EH1_012270. EHI_042370, EHI_046650, EHI_077500 y EHI_133900, por otro lado tenemos las TMK que estan involucradas en la fagocitosis: TMKB3-96, TMIG31-9 y TMKC-36, otra proteína transmembrana que puede un receptor de superficie es la EHI_098510 presente en la membrana e identificada por proteómica. También en este proceso de reconocimiento para la consecuente patogenia puede estar involucrada la calreticulina, esta es una proteína que se transloca a la superficie celular y sirve como señal en procesos apoptóticos también se puede unir a la C1q que es un componente del complemento, sus funciones están aún en estudio Nakada 2020. 34

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│Figura 18 Ilustración del proceso de reconocimiento endocítico, en el que se realiza una trogocitosis, El proceso ocurre cuando E. histolytica rompe, ingiere e internaliza fragmentos de células humanas previo a su muerte, este proceso es conocido como “trogocitosis amebiana”. El proceso incluye un reconocimiento celular entre el parasito y la célula diana por medio de receptores de membrana que desencadenan y proceso rápido y dinámico del citoesqueleto generando la ruptura de fragmentos de la membrana y de la célula diana, que son internalizados por las amebas, esto eleva el calcio intracelular en éstas y una vez que la célula muere, la ingestión de fragmentos cesa, y la célula es ingerida totalmente para su digestión. Tomado y modificado de: Modification de Chew on this: amoebic trogocytosis and host cell killing by Entamoeba histolytica (Ralston, 2015). José Araujo 2020, #prof.josearaujo #joseraujoblanco

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De igual manera se sugiere una actividad extra que puede ser compensada por sistema de transmisión de señal altamente efectivo que probablemente sirve como mecanismo de evasión contra los reconocimientos exteriores del sistema inmunitario humoral o celular, mecanismo que lleva consigo la exocitosis de componentes de la membrana y otras proteínas, ya sean antígenos, lingandos, como adhesinas, lectinas, y otras enzimas que pueden participar en la lesión de la célula blanco, como la cistein proteasa, colagenasas, ATPasas, fosfolipasas, hidrolasas, quinasas y neuroamidasas el ameboporo y hemolisinas. Y en otro caso la amiba puede promover la endocitosis de las porciones expuestas ya sea para redistribuir sus componentes o eliminarlos y evitar el reconocimiento, en fin el -talón de Aquiles amibiano- es su membrana ya que gracias a ella se mueve, se nutre, reconoce a otras células y se defiende del medio exterior Orozco 2000.

El Citoplasma

El citoplasma de los trofozoítos amibianos presenta dos áreas definidas relativamente: una porción externa hialina, transparente, sin gránulos, que revive el nombre de ectoplasma, y una porción interna granular que contiene diversas inclusiones (figura 19), algunas de ellas vacuolas fagocíticas, denominada endoplasma Fonte 2000 . La organización citoplasmática antigua pero eficiente ya que ha permitido que este parásito considerado como una reliquia evolutiva, sea capaz de perpetuarse durante todo el proceso evolutivo del planeta. Esta estructura citoplasmática no posee inclusiones citoplasmáticas como aparato de Golgi, y retículo endoplasmático rugoso aparente RER, codifica 36

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los elementos básicos de la maquinaria de transporte de vesículas común a otras células eucariotas, con los complejos de cubierta COPI, COPII, clatrina y retrómero Loftus, 2005 .

▼

Endo

▼

Ecto

►

N► Endosoma

Psdo

│

Figura 19 Foto microscópica de trofozoítos de Entamoeba histolytica observada a microscopio óptico, presentando los elementos característico de esta forma evolutiva en la que cumple todas sus funciones vegetativas, Endo: Endoplasma; Ecto: Ectoplasma; Endoso: Endosoma; Psdo: pseudópodo, V: Vacuola, tomado y modificado https://eol.org/pages/491174/media AJ Cann from UK, José Araujo 2020, #prof.josearaujo #joseraujoblanco

E. histolytica no poseen su citoplasma mitocondrias por los que se hace ausente el ciclo de Krebbs, a pesar de que su principal fuente de energía son los carbohidratos (figura 20), es por esto que la principal vía de producción de ATP se hace por medio del catabolismo de la glucosa través de la glucolisis o vía de Meyerhof- Embden de donde derivan precursores del citoesqueleto y otras macromoléculas glucosadas 37

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como LPPG (lipopeptidofosfoglicano)

Saavedra, 2019

A diferencia de otros eucariontes este no puede degradar de forma aeróbica la glucosa hasta dióxido de carbono y agua y en estas circunstancias se metaboliza a través de una producción de glucólisis fermentativa con la producción de etanol y en menor medida, acetato como productos finales. En el proceso metabólico se a descrito el uso de pirofosfato como donante en varias reacciones. Una reversibilidad termodinámica en todas las reacciones y presencia de enzimas fermentativas similares a bacterias anaerobias. Lo que impone un control del flujo fermentativo glugolítico Saavedra, 2019. De igual manera se ha demostrado que E. histolitica puede utilizar fructosa como fuente de energía, reconociendo también que la comida humana y las bebidas a menudo contienen más fructosa que glucosa. El proyecto genoma había revelado un gen que codifica un homólogo para E. histolytica de fructokinasas bacterianas esto puede mostrar que las amebas podrían cambiar su metabolismo de uso glucosa a fructosa comoo fuente de energía Matt 2018.

│

Figura 20 Representación gráfica del metabolismo de E. histolytica Reacciones enzimática de la glucólisis donde la fermentación es las principales vías de generación de energía. Las flechas verdes representan enzimas codificadas por genes. Las flechas rotas indican enzimas no encontradas en los datos del genoma. La flecha amarilla apunta a la activación del metronidazol, visite: https://www.nature.com/articles/nature03291 José Araujo 2020, #prof.josearaujo #joseraujoblanco.

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│Figura 21

a) Imagen del ectoplasma y endoplasma, b) Perfil de dos Zonas, dos distintas regiones, la región de rugosidad entre los puntos 2 y 4 tiene una longitud máxima de 440.81 nm. Se muestra el endoplasma en donde se pueden encontrar la presencia de orgánulos debajo de la membrana delgada. La región lisa corresponde al ectoplasma y representa la estructura celular cortical. Su extensión, es aproximadamente 9000 nm. La naturaleza suave se origina por la interacción entre el filamento de actina y las proteínas de unión que induce una red rígida isotrópica y establece una estructura de citoplasma similar a un gel uniforme. Esto juega un papel crucial en El movimiento de la amiba, ya que es muy sensible a pequeñas cantidades de presión osmótica, que conducen a la extensión o retracción de pseudópodos. Las extensiones de pseudopodos y el movimiento celular son procesos complejos y dependen de actina local. Tomado y Modificado de Joshi, N.V. ; Medina, H. ; Urdaneta, H. ; Barboza, J. Nanoimagin and ultra structure of Entamoeba histolytica and its pseudopods by using Atomic Force Microscope, Scaning and force Microscopies for Biomedical Applications II SPIE 3922, 2000. José Araujo 2020, #prof.josearaujo #joseraujoblanco

El citoesqueleto componente importante del citoplasma de E. histolytica sobre todo por sus actividades motrices, en el cual se han caracterizado tres proteínas principales, actina, miosina y tubulina, estudios de la presencia y topografía de estas tres proteínas han determinado la participación de estas en la motilidad y la división del parásito, la actina se visualiza de forma paralela dispuesta irregularmente en todo el parásito, la misiona de forma de filamentos gruesos perpendicular a la membrana citoplasmática y principalmente en el ectoplasma, la presencia de la tubulina se hace de forma despolimerizada Voigt, 1999.

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│Figura 22 a) Muestra el área del citoplasma donde se presenta la extensión. b) revela la topografía donde hay presencia de actina y proteínas asociadas con el aumento de la altura que va de 200 nm a 700 nm dentro de una distancia 1.5 u, lo que muestra la alta concentración hacia el borde de la célula. Joshi, N.V. ; Medina, H. ; Urdaneta, H. ; Barboza, J. Nanoimagin and ultra structure of Entamoeba histolytica and its pseudopods by using Atomic Force Microscope, Scaning and force Microscopies for Biomedical Applications II SPIE 3922, 2000. José Araujo 2020, #prof.josearaujo #joseraujoblanco

El citoesqueleto tiene una serie de funciones importantes en la motilidad del parásito, la muerte dependiente del contacto y la fagocitosis de las células epiteliales intestinales del huésped Voigt, 1999. Además se abre la posibilidad de que la contracción perpendicular a la membrana citoplasmática de actina y miosina por flujo mayor iones de calcio, intervenga en la formación quistes Marques-Monter H 1989. Estudios topográficos a través de microscopia de avanzada sobre amibas axénicas de muestran una actividad en los seudopos en función de cambios topográficos en los cuerpos cromatoides (figura 22 y 23) Joshi NV y Urdaneta H 2000. 40

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CC ►

│

Figura 23 Fotografía microscópica de prequiste de una célula de E. histolytica aumento 900X, muestra teñida de negro de corazol, reveló la presencia de CC►: Cuerpos cromatoidales o núcleos, VG▼: Vacuola de glucógeno, que contiene nutrientes, se observa como un cuerpo teñido de forma oscura. Tomado y modificado de CDC Public Health Image Library (PHIL), Dr. Healy, 1964. José Araujo 2020, #prof.josearaujo #joseraujoblanco.

El Prequiste

El prequiste es una célula inmóvil, de forma ovalada o redonda de 10 a 20 micras de diámetro, aún sin cubierta quística y con algunas inclusiones citoplasmáticas (figura 23 y 26). Con relación a la fase de trofozoítos, aparecen dos nuevas estructuras en él citoplasma del prequiste una vacuola de glucógeno más o menos grande y de bordes difusos, que aporta requerimientos energéticos para la maduración del quiste, y unos cuerpos refringentes, de forma cilíndrica y de tipo cristalino que reciben el nombre de cuerpos cromatoidales. El núcleo muestra un tamaño superior a la fase precedente y su cariosoma no es tan compacto Menchaca, 2014, Barron 2008 .

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│

Figura 24 Representación gráfica de un quistes de Entamoeba histolytica en sobre células del epitelio intestinal, Tomado y modificado de: Fab Lab ULL https://www.youtube.com/watch?v=VRMv_lzhMZc&t=30s Araujo 2020, #prof.josearaujo #joseraujoblanco

El Quiste

El quiste es la forma evolutiva de resistencia (figura 24 y 26), que posee este parasito esta forma evolutiva ha sido encontrada fosilizada en la materia fecal de los dinosaurios, es por esto que es posible demostrar la antigüedad de estas reliquia viviente y la efectividad de la estrategía evolutiva de esta forma de sobrevivencia Poinar 2006. Esta forma evolutiva es encontrar en la meteria fecal de vertebrados en especial del hombre y en su ciclo biológico constituye la forma infectante de este parásito, capaz de transmitirse por vía oral Cabello R 1999 . Actualmente es posible obtener las diversas forma evolutivas del ciclo de Entamoeba histolytica en cultivo axénico in vitro modificando el ambiente y los componentes de los medios de cultivos axénicos. Se puede obtener enquistamientos del parásito y de nuevo enquistar al protozoario cerrando así el ciclo evolutivo del parásito in vitro. Esto posible a partir del cultivo de 42

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│Figura 25

Fotografía microscópica de quiste de E. histolytica y E. coli. Se observa presencia de dos organismos amebianos en sus etapas quísticas de su desarrollo. En este plano focal, el quiste de Entamoeba histolytica más pequeño (arriba), contiene cuatro núcleos característicos de la especie y dos cuerpos cromatoides de punta roma, en la forma evolutiva de mayor tamaño se pueden detectar seis núcleos carácter de Entamoeba coli (abajo), el cual también posee dos cuerpos cromatoides. Tomado y modificado de CDC Public Health Image Library (PHIL) / Dr. Healy, 1964. José Araujo 2020, #prof.josearaujo #joseraujoblanco.

de trofozoítos en óptimas condiciones, sometidos a gas con CO2 e incubados a 37°C por 7 días. Una vez trascurrido este tiempo se obtienen abundantes estructuras en esta fase y forma evolutiva Urdaneta H 1988; Barrón 2007 . En general, los quistes son células inmóviles, de formas ovaladas o redondas o redondas tetranucleados (figura 25 y 26) y miden entre 10 y 16 micras de diámetro los quistes de E. histolytica a diferencia de los trofozoítos de la misma especie, tienen tamaño y forma relativamente uniformes David B y Marcos R 1989 . Apenas se observa inclusiones citoplasmáticas en los quistes. La vacuola de glucógeno, remanente de la etapa anterior, se observa en los quistes inmaduros y prácticamente no existen en los quistes maduros (el glucógeno ha sido consumido en el proceso de maduración del quiste), este contiene de uno a cuatro núcleos característica de la especie un quiste tetranucleado David y Marcos 1989, Barron 2008. 43

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Entamoeba histolytica Formas evolutivas 15µ

30µ

60µ

v Núcleo

v Uroide

v.f End

Trofozoíto

Ecto

Ectoplasma

Endoplasma

15µm

La Entamoeba histolytica no posee aparato de Golgi 10µm Quiste tretanucleado 20µm

Quiste

Vacuola de Glucógeno

15µm

Cuerpos cromatoidales 10µm

Núcleo

Prequiste

│Figura 26 Ilustración de las diversas formas evolutivas de Entamoeba histolytica.

Trofozoíto que muestra v (vacuola) V.f. (vacuola fagocítica) End (endoplasma) Ect (ectoplasma); Uroide. Quiste: forma evolutiva tetranucleada; Prequiste: célula uninucleada con presencia de cuerpos cromatoidales y vacuola de glucógeno. José Araujo 2020, #prof.josearaujo #joseraujoblanco.

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Ciclo de Vida

Este eucarionte exhibe un ciclo de vida sencillo (figura 30, 32) y eficiente que carece de etapas sexuales y hospederos intermediarios. Básicamente, el ciclo de vida del protozoario pasa por sólo dos fases: forma infectante de quiste y la de trofozoítos, forma vegetativa. Las condiciones que desencadenan el enquistamiento y desenquistamiento, son estudiadas gracias al genoma.

│Figura 27

Ciclo de Vida de E. histolytica fase de quiste maduro tetranucleado, tomado de Fab Lab ULL https://www.youtube.com/watch?v=VRMv_lzhMZc&t=30s, . José Araujo 2020, #prof.josearaujo #joseraujoblanco

La infección es adquirida, casi exclusivamente, por la ingestión de quistes tetranucleados (figura 27). Estos son resistentes a los efectos del pH ácido del estómago del hospedero la desenquistación debe ocurrir más adelante, en el intestino delgado. En este segmento del tubo digestivo, la alcalinidad del medio o la acción de determinadas enzimas digestivas, o ambas circunstancias, debilitan la pared del quiste y emerge del mismo una amiba multinucleada, denominada metaquiste (figura 28). Por división citoplasmática, esta estructura da lugar a 45

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cuatro pequeñas amibas, llamadas trofozoítos metaquísticos una nueva división, esta vez nuclear y citoplasmática, dan origen a ocho trofozoítos similares a los precedentes.

│Figura 28 Ciclo de Vida de E. histolytica desenquistamiento, tomado de Fab Lab ULL https://www.youtube.com/watch?v=VRMv_lzhMZc&t=30s, #prof.josearaujo #joseraujoblanco

José

Araujo

2020,

Los trofozoítos metaquísticos incapaces de colonizar el intestino delgado, son arrastrados por las heces y llegan al intestino grueso. En esta región, utilizando el amplio arsenal de moléculas con actividad lítica presente en su membrana celular y en su citoplasma, estos trofozoítos se alimentan de bacterias y otras células en contacto con su superficie, además alteran las condiciones normales de la microbiota intestinal. De este modo los pequeños trofozoítos metaquísticos aumentan de tamaño y alcanzan las dimensiones definidas de los trofozoítos maduros de la especie (figura 26). En la luz y en las criptas de la mucosa del intestino grueso los trofozoítos amibianos 46

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continúan multiplicándose por simple división binaria y eventualmente, por circunstancias aún desconocidas, pueden invadir la pared de esta visera e incluso, hacer migraciones a órganos y tejidos distantes. Paradójicamente, la invasión de los tejidos del hospedero por los trofozoítos de E. histolytica que no es necesaria para su ciclo de vida, no da lugar a quistes y por tanto no contribuye a la diseminación y perpetuación de la especie.

│

Figura 29 E. histolytica fase de trofozoíto en espacio intestinal, tomado de Fab Lab ULL https://www.youtube.com/watch?v=VRMv_lzhMZc&t=30s, . José Araujo 2020, #prof.josearaujo #joseraujoblanco

En la mayoría de los casos la E. histolytica vive como un comensal en el colon (amibiasis asintomático o luminal), y sin embargo en algunos casos, los trofozoítos forman un complejo con ayuda de las bacterias comensales, adhiriéndose a las células de la mucosa a través de lingandos semejantes a las lectinas e invadiendo el tejido al liberar una carga de enzimas proteolíticas que alteran la integridad de la mucosa. 47

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CICLO DE VIDA DE Entamoeba histolytica Desenquistamiento

QUISTE

Presentes en las heces Resistentes Infectivos

Enquistamiento

TROFOZOÍTO

Enquistación Motilidad Replicación

│Figura 30 Ciclo de Vida E. histolytica José Araujo 2020, #prof.josearaujo, #joseraujoblanco Una vez invadida la mucosa del intestino grueso, los trofozoítos entran a la corriente sanguínea de los vasos mesentéricos y alcanzan otros órganos, como el hígado a través de la vena porta. En la circulación sanguínea, los trofozoítos pueden dirigirse hacia otros órganos como las vísceras intestinales, el pericardio y los pulmones, o por recirculamiento sanguíneo ellos pueden alcanzar el cerebro, causando la amibiasis cerebral Kretschmer RR 1993. Sin embargo la evolución de los trofozoítos amibianos en la luz intestinal sigue con más frecuencia, la perpetuación de su especie en donde al encontrarse en el colon, y en condiciones que aún no se conocen pero aparentemente adversas para los trofozoítos, estos comienzan a eliminar sus vacuolas alimenticias, entre otras inclusiones citoplasmáticas, para confluir en una masa esférica el prequiste. Posteriormente, esta célula se cubre de una pared protectora y se convierte en un quiste maduro (figura 30). Este, como los trofozoítos que lo preceden, sólo posee un núcleo. 48

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│Figura 31 Ciclo de Vida de E. histolytica enquistamiento en espacio intestinal, tomado de Fab Lab ULL https://www.youtube.com/watch?v=VRMv_lzhMZc&t=30s,. José Araujo 2020, #prof.josearaujo #joseraujoblanco

Dos divisiones nucleares sucesivas, que dan origen a un quiste tetranucleado, caracterizan su proceso de maduración (figura 31). Se pueden encontrar trofozoítos, prequistes y quistes en diferentes fases de maduración enlas heces humanas. De éstos, la única forma infectante por vía oral es el quiste maduro (quiste tetranucleado), que en dependencias de las condiciones ambientales, puede permanecer viable semanas y hasta meses. En las materias fecales humanas se pueden encontrar trofozoítos, prequistes y quistes, sin embargo, los dos primeros mueren por acción de los agentes físicos externos y en caso de ser ingeridos son destruidos por el jugo gástrico. En el medio ambiente los quistes pueden ser trasportado por condiciones de baja salubridad y por efectos de fecalismo en agua alimentos, ropa, utensilios de comida contaminados e incluso las manos, hasta llegar a la boca y completar el ciclo al llegar de nuevo al intestino. 49

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Ciclo de vida

│

Figura 32 Ciclo de vida del parasito entérico Entamoeba histolytica, quistes inmaduros, Tomado y modificado de /www.drrondonpediatra.com/amebia.gif./ José Araujo 2020, #prof.josearaujo, #joseraujoblanco.

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Reseña Histórica El descubrimiento del protozoario E. histolytica se atribuye a Lambal, quien en lo que antes se conocía como entonces Checoslovaquia en (1873) la publicación muestra la identificación microscópica de un microorganismo observado en las heces de un niño en la ciudad de Praga que padecía la denominada diarrea infantil (figura 33). El estudio muestra la existencia de un agente microscópico protozoario que emitía seudópodos presente en esas heces, sin embargo, considero que este protozoario no era patógeno por si solo y lo clasificó como "asociado a casos de patología intestinal".

│

Figura 33 Ciudad, Praga, arquitectura, República Checa, Europa, históricamente, paisaje urbano, edificio, centro histórico, punto de referencia. Tomado y Modificado de https://www.pxfuel.com/es/free-photo-qdydo. José Araujo 2020, #prof.josearaujo, #joseraujoblanco.

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Lesh (Lösch) en (1873) descubre al parásito, en el caso se describe una diarrea persistente 1873, por parte de J. Markow un agricultor de 24 años, del territorio de Arcangel quien viajo al capitolio en búsqueda de trabajo (figura 34). Este trabajo escrito en ruso fue el primer reporte en el que se relaciona la presencia del parásito la disentería y las ulceraciones intestinales Lesh 1975; Cabello R 1999. Unos años más tarde, con la publicación del trabajo de Kartulis en (1886), se demuestra el carácter patógeno de E. histolytica y su efecto como agente causal directo de la disentería. Quincke y Roos en (1893) reportaron la existencia de diferentes especies de amibas que podían vivir en el colon del humano, Estos investigadores realizaron estudios que permitieron deducir el ciclo biológico de quiste como la forma infectante del parásito, al ser

ingerido por el hombre Diadmond LS 1975

Selpulveda B y

│Figura

34 A) Rostro de Investigadores: Fedor Aleksandrovich Lesh (Lösch) Fisiólogo Ruso, tomado de https://uk.wikipedia.org/ B) Dr. Fritz Schaudinn 1905, foto del archivo del Instituto Bernhard-Nocht-Institut für Tropenmedizin (Valle, 2014) C) Emil Brumpt parasitólogo francés, https://commons.wikimedia.org/., #prof.josearaujo.

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E. histolytica, identificaron al quiste como la forma infectante del parásito, al ser ingerido por el hombre Selpulveda B y Diadmond LS 1975

El nombre definitivo y caracterización de este protozoario fue asignado por Schaudinn en (1903) por la capacidad que este protozoario de lisar el tejido (histo = tejido, lytica = lisar) y hasta la actualidad es el trabajo que se toma como referencia para la identificación de E. histolytica

WHO/Paho/Unesco 1997, Cabello R

1999.

Brumpt 1925 un parasitólogo planteó la posible existencia de 2 protozoarios morfológicamente idénticos, uno patógeno y otro no a los que llamo Entamoeba histolytica y E. dispar Brumpt E 1925. En 1978 Diamond reportó el medio axénico para amibas y gracias a los métodos clásicos bioquímicos genéticos e inmunológicos, sé a podido reescribir a E. histolytica Diamond LS 1993 por Diamond, LS y Clark, RG. (1993), adelantar en el estudio inmunológico, como la relación de cooperación celular estudiada por Wang W. en (1994), y Inmuno-cromatografías estudiadas por Bhaskar S. en 1996 Wang W 1994, Bhaskar S 1996. El primer trabajo realizado sobre el genoma de Entamoeba histolytica fue hecho por un grupo de la india por Bhattacharya 2000. Posteriormente fueron realizados, trabajos con más alcance a nivel genético y sus relaciones en las diversas áreas de las omicas como los presentados en la prestigiosa revista nature por B. Loftus y su equipo en el 2005. 53

Amibiasis y la Biología de Entamoeba histolytica

En el 2005 Lorenzi su equipo aportaron nueva información sobre entre el genoma y proteínas de interés, al igual que le trabajo de Clark en 2007, Los cambios recientes muestran nuevos linajes y especies que abren aún más la frontera en el conocimiento de la amibiasis tal es el recién descubrimiento del equipo de Royer en 2012 de Entamoeba bangladeshi estudiada en niños con o sin diarrea pero que fueron positivos a quistes tetranucleados y que no respondieron a las pruebas moleculares de PCR y pruebas inmunológicas, dando negativos para E. histolytica, E. dispar y E. moshkovskii, esta nueva especie es morfológicamente similar a E. histolytica en las etapas de quiste y trofozoítos Roger 2012 En el 2019 Anjan Debnath mostró un trabajo sobre los recientes progresos en materia de amibiasis, en la que se incluyen diversos trabajos relacionados con las nuevas técnicas de biología molecular para el estudio de la Entamoeba histolytica. Avances en el estudio de la biología de Entamoeba histolytica Lambal

1860

Descubrió del parásito.

Lesn

1875

Asoció la disentería al parásito.

Kartulis

1886

Determinó el carácter patógeno del parásito.

Quinke y Ross

1893

Identificaron al quiste como forma infectante.

Shaudin

1903

Brumpt

1925

Diamond

1978

Asignó el nombre definitivo al parásito y caracterizó la capacidad de lisar tejido. Planteó la existencia de dos protozoarios morfológicamente idénticos. Reportó el medio axénico para amibas.

Diamond Clark Urdaneta

1993

Bhattacharya

2000

Reescribieron las isoformas en Entamoeba histolytica y Entamoeba dispar. Reportó las primeras cepas axénicas en Venezuela (Figura 35). Secuenciación del genoma de Entamoeba histolytica.

Loftus

2005

Genoma de Entamoeba y sus implicaciones metabólicas

Araujo

2008

Amibiasis: Importancia de su diagnóstico y Tratamiento

1995

Amibiasis y la Biología de Entamoeba histolytica

Los diversos avances significativos se esperan del campo de la biología molecular y en especial de la ómica y su papel en el estudio y aprovechamiento de este sobre la salud, así como la filogenética que mostrara las nuevas ubicaciones taxonómicas y asociaciones y polimorfismos de las especies. Los trabajos relacionados con estas diversas ramas como la genómica, transcriptómica, proteómica, metabolómica, epigenómica y nutrigenómica y del procesamiento multimómico darán mayor información y herramientas para manipular la expresión génica en el parásito así como la búsqueda de nuevos fármacos, vacuna y la cura de la amibiasis, posiblemente vegan del uso de nuevas tecnologías moleculares como las enzimas CRISPR / Cas9 a E. histolytica Cui 2016. De igual manera estas diversas herramientas permitirán el conocimiento más exhaustivo de la patogenia e inmunidad del parasito, eventos de reconocimiento e interacción con el epitelio y otras células así como el complejo proceso de respuesta inmune o capacidad de respuesta y evasión del sistema inmunitario por parte del parasito.

│Figura 35 La Dra. Haydeé Urdaneta es una Bióloga, Pionera en el diseño de métodos de diagnóstico de la Amibiasis es la primera y hasta la fecha la única investigadora capaz de axenizar una cepa de Entamoeba histolytica en Venezuela, cultivo del cual se han realizados diversos trabajos internacionales que la caracterizan como es una cepa de referencia Mundial IULA-1092:1; IULA-0593:3 Foto tomada de Prueba Coproelisa-Eh ULaUNiversidad

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│Figura

36 E. histolytica invadiedo el espacio intestinal, este parasito tiene caácidad para desarrollar una serie eventos mutifactoriales que conllevan a la patogenia de la amibiasis que incluye adherencia, penetración e inavción de la matriz colónica con la consecuente injuria del tejido colonico y los colonocitos. Tomado de Fab Lab ULL https://www.youtube.com/watch?v=VRMv_lzhMZc&t=30s, José Araujo 2020, #prof.josearaujo #joseraujoblanco

Patogenia del Parásito

La enfermedad puede presentarse de dos maneras de acuerdo a los síntomas presentados: una asintomática (portadores sanos) Ash LR 1987, y otra sintomática sin evidencia de invasión tisular, y sintomática con evidencia de evidencia de invasión tisular Ortiz-Ortiz L 1994a, Cabello R 1999. Anterior mente producto de las reuniones mundiales sobre amibiasis se consideraron la posible existencia de dos protozoarios morfológicamente idénticos, Entamoeba histolytica (patógena) descrita por Schaudin en (1903) y Entamoeba dispar (no patógena) descritas por Brumpt en 1925 Brumpt E 1925, WHO/Paho/Unesco 1997, Cabello R 1999 . Sin embargo en la actualidad el horizonte se está expandiendo con la reintroducción de E. moshkovskii y la nueva aparición de E. bangladeshi 56

Amibiasis y la Biología de Entamoeba histolytica

dentro del complejo de E. histolytica (CEh). La infección amibiana se produce por la ingestión de quistes resistentes (forma infectante no móvil), esta forma infectante cambia a su nuevo esadio evolutivo cuando las condiciones del medio son favorables en la luz intetsinal de allí emergen los trofozoítos (forma vegetativa y móvil); una vez que el quiste alcanza el tubo digestivo, la pared quística es parcialmente digerida por enzimas proteolíticas presentes en el jugo gástrico y en las secreciones pancreáticas del hospedero, se transforma en metaquistes que más allá del duodeno liberan trofozoítos metaquísticos, de tamaño pequeño y que avanzan hacia el colon alimentándose de los detritos presentes en el contenido intestinal Said-Fernández 1990 , Silva EF 1991, Matijasevic AE 1996. En el colon estos trofozoítos metaquísticos (figura 36) se establecen como comensales por algún tiempo, que puede variar entre nueve y doce meses (las razones de este tiempo de comensalismo todavía son objeto de estudio) sin invadir los tejidos, ni producir cualquier tipo de cuadro clínico, muchas veces sin estimular la respuesta inmunológica en el hospedero; o puede, en circunstancias no completamente conocidas, invadir el intestino grueso, causando varios tipos de patologías locales o extraintestinales Said-Fernández 1990 , Silva EF 1991 , Matijasevic AE 1996 . Se han sustentado diversas opiniones en cuanto a la naturaleza patógena de la amiba, de estas opiniones de las cuales derivan derivado tres hipótesis para explicar porque solo el 10% de los infectados desarrollan la enfermedad. 1.- La amiba sería una especie patogénica que produce siempre lesiones intestinales con o sin 57

Amibiasis y la Biología de Entamoeba histolytica

síntomas clínicos. 2.- La amiba sería un comensal que reside normalmente en el colon y que en ocasiones, por razones no totalmente conocidas pudiera convertirse en un patógeno invasor, o por un fenómeno de conversión fenotípica McKerrow J 1994, Spiece W 1992. 3.- La amiba estaría constituida en realidad por dos especies morfológicamente idénticas; una patógena invasora, exhibiendo varios grados de virulencia, y otra no-invasora con capacidad de producir erosión superficial de la mucosa Diamond y Clark 1993 , Clark y Diamond 1994 , Jackson y Ravdin 1996 . Las dos primeras afirmaciones implicarían que los pacientes asintomático y/o "portadores sanos" de E. histolytica se hallan en riesgo de desarrollar la enfermedad en cualquier momento, además de constituir un problema de salud pública al diseminar el agente causal Pérez- Tamaño R 1994, Matijasevic AE 1996. En la actualidad, la acumulación de evidencias bioquímicas, inmunológicas y genéticas han mostrado que la tercera hipótesis sería la correcta Petri W 1993 , Jackson y Ravdin 1996 , Moody S 1997 , Sehgal BR 1996 , Spiece W 1992 , Strachan W 1988 , Tannich E 1991 , Petri W 1994 , Aguirre y Urdaneta 1997

. De esta manera se reivindica ha Brumpt quien en 1925 explicó que los humanos pueden ser infectados por dos especies diferentes que producen quistes tetranucleados semejantes en su morfología y tamaño, distinguiéndolas por su capacidad de producir enfermedad en los humanos y gatos infectados experimentalmente. El patógeno invasor lo identificó como Entamoeba disenterie que sería sinónimo de la E. histolytica 58

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(Schaudinn 1903) y el no invasor lo denominó Entamoeba dispar Brumpt E 1925, Matijasevic AE 1996, Diamond y Clark 1993, Clark y Diamond 1994 .Aunque Brumpt no fue capaz de distinguir morfológicamente estas dos especies, sus observaciones han generado numerosos debates por varias décadas sobre la verdadera identidad de estas dos formas de amibas. Por lo que en las sucesivas reuniones mundiales sobre amibiasis se consideraron la posible existencia de dos protozoarios morfológicamente idénticos, Entamoeba histolytica (patógena) y Entamoeba dispar (no patógena) descritas por Brumpt en 1925 Brumpt E 1925, WHO/Paho/Unesco 1997, Cabello R 1999 . Algunas características se han propuesto como marcadores de patogenicídad de E. histolytica, como la aglutinación con concanavalina A (ConA) adherencia a células epiteliales, colagenolisis, efecto citopático, fagocitosis, trogocitosis celular, producción de abscesos hepáticos en animales de experimentación, resistencia al complemento y la presencia de zimodemos específicos Pérez- Tamayo 1994, Orozco ME 1980, Ravdin JI 1989, Sargeaunt PG 1978, Sargeaunt PG 1982 .Los mecanismos de agresión de los trofozoítos son fenómenos multifactoriales complejos que incluyen daño a las membranas plasmáticas de las células blanco, ingestión de esas células y degradación intracelular de las células ingeridas. La secuencia de eventos en la patogenia de la amibiasis incluye colonización del intestino por el parásito, adherencia a la mucosa del colón, penetración e invasión de la matriz celular de la mucosa colónica Martinez-Palomo 1985 , con una extraordinaria capacidad del parásito para destruir por completo todas las estructuras tisulares con la que se pone en contacto Gonzales A 1994, Ravdin JI 1985 . 59

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La unión de Entamoeba histolytica con su célula blanco es el punto de partida para realizar posteriormente su actividad lítica, este proceso esta mediado por un receptor y su ligando, el receptor es una proteína y el ligando es un grupo de carbohidratos.

│

Figura 37 Proceso de adhesión o unión entre una amiba y una célula blanco mediante la lectina que posee un dominio de unión y reconocimiento al heterodímero de Gal / Gana, José Araujo 2020, #prof.josearaujo, #joseraujoblanco

Los receptores de superficie celular son proteínas ancladas a la membrana que se unen al ligando en la parte exterior de la célula, en este caso el receptor es de tipo lectina, el cual es una proteína (figura 37) que se unen a azúcares específicos con la finalidad de reconocimiento molecular y celular Chadee K 1987, Petri WA 1987 . La lectina de reconocimiento y adherencia presente en E. histolytica se une a un heterodimero formado por D-galactosa / N-acetil-D-galactosamina este heterodímero está presente en diversos tipos de células como las bacterias, y diversas células eucariotas como los glóbulos rojos y las células del epitelio intestinal Petri WA 1987 . 60

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La molécula de adherencia en la superficie del parasito posee un dominio de unión al dímero D-galactosa / N-acetil-D-galactosamina uniéndose específicamente a este disacárido con una alta especificidad y afinidad moderada (figura 38).

Gal

GalNAc

│

Figura 38 Se muestra un dinero Gal/GalNAc formula D-Galp-(1->3)-d-GalpNAc A= Imagen SVG, B) forma estructural C) modelo en 3D en Esferas Van der Waals, heterodimero generado en http://molview.org/ José Araujo 2020, #prof.josearaujo, #joseraujoblanco.

El ligando reconocido por el receptor es un grupo de carbohidratos, un heterodimero de Gal/GalNAc que puede estar presente en la superficie de diversas células, como las células procariotas que incluyen a las bacterias, y células eucariotas como los glóbulos rojos, células epiteliales, intestinales, neuronas entre otros. En el caso de del epitelio intestinal encontramos a las mucinas, que son un grupo de proteínas de alto peso molecular altamente glicosiladas que exhiben hacia el exterior celular diversos grupos de carbohidratos. Las mucinas pueden ser secretadas y por su naturaleza poseen una gran capacidad para formar geles, constituyendo así barreas físicas y químicas que juegan un papel inhibitorio. En otro caso existen mucinas (figura 39) unidas a la membrana celular de las células intestinales por medio 61

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de un dominio hidrofóbico que favorece su retención en la membrana, estas muestran diversos carbohidratos como el heterodimero de D-galactosa / N-acetil-Dgalactosamina o Gal / GalNAc.

│

Figura 39 Representación de mucinas presentes en el epitelio intestinal con residuos de Gal / GalNAc o D-galactosa / N-acetil-D-galactosamina que son reconocidas por la lectina de E. histolytica. José Araujo 2020, #prof.josearaujo, #joseraujoblanco

La galactosa es un azúcar formado por seis átomos de carbono o hexosa, que forma parte de diversos glucolípidos y las glucoproteínas de las membranas celulares y N-acetilglucosamina (GlcNAc) es un amino azúcar bien conocido por las importantes funciones estructurales que desempeña en la superficie celular, presente el glicocalix celular que es componente típico de la superficie de células eucariotas, sin embargo también es un componente fundamental del peptidoglicano de la pared celular bacteriana, es por ello que el parasito puede reconocer tanto las células blanco de la mucina como las bacterias presentes en medio digestivo humano. 62

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Hgl 170kDa Pseudo receptor rico en cisteina

Igl 150 kDa

Asociación no covalente

igl

35kDa S-S S-S

CRD Homología con CD59

GPI

CITOPLASMA

Glicosilfosfatidilinositol

│

Figura 40 Representación de la lectina de E. histolytica que reconoce Gal / GalNAc D-galactosa / N-acetil-D-galactosamina, José Araujo 2020, #prof.josearaujo, #joseraujoblanco.

La lectina de Entamoeba histolytica es una molécula de superficie (figura 40) con una subunidad pesada (Hgl) es una proteína transmembranal de 170 KDa con un dominio de reconocimiento de carbohidratos (CDR) y una sub unidad ligera (igl) de 31/35 KDa unidad a la membrana por glicosilfosfatidilinositol (GPI), esta dos sub unidades se encuentran unidas por un puente de disulfuro, también se encuentra una unidad intermedia (Igl) de 150 KDa anclada a la membrana por (GPI) y se asocia a la subunidad pesada de forma no covalente. 63

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La Sub unidad pesada posee una zona de homología con CD59 lo que permite que el parasito inhiba el complejo de ataque a la membrana (C5b-C9) del complemento, lo que le permite una evasión de la respuesta inmune además de la adhesión celular y reconocimiento. El dominio de reconocimiento de los azucares puede inducir la formación de TNF-alfa y óxido nítrico (NO) sobre los macrófagos de médula ósea. Se cree que la exposición de estas lecitinas a los macrófagos induce la expresión del receptor TLR 2 con la producción de citoquinas proinflamatorias. Que es producto de la homología de la región carboxílica de la integrina b2, lo que genera una reorganización del citoesqueleto celular las lectinas se encuentran en zonas con residuos ricos en colesterol y esfingolípidos conocidos como balsas lipídicas que participan de alguna forma en el proceso de adhesión en los trofozoítos. Este tipo de receptores realizan transducción de señales regulando además el papel de los demás receptores de membrana del parasito afectando su virulencia que permite activar células del sistema inmunitario como neutrófilos, macrófagos y células NK. Para que E. histolytica pueda llegar a las células blanco primero debe degradar el moco y de la mucinas esto es llevado por un conjunto d enzimas proteolíticas, glicosidas y cisteinproteasas, que incluyen desde mayor grado a β-Nacetil-d-glucosaminidasa y luego otras como α-d-glucosidasa, β-dgalactosidasa, β-1-fucosidasa y α-Nacetil-d-galactosaminidasa. Cerca de más de 50 genes están relacionados con este proceso de degradación para que el parasito. 64

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Los más representativos son EhCP-A1, EhCP-A2, EhCP-A5 y EhCP-A7 siendo estos los generadores de enzimas proteolíticas en más de un 90%. El proceso de degradación es controlado por los carbohidratos degradados de las mucinas son una fuente de carbono para las amibas, y la actividad de las enzimas glicosidasas se relacionan con el crecimiento y reproducción de trofozoítos. De igual manera se conoce que el parasito interactúa con las bacterias y las mejor reconocidas son ingeridas y también se reconoce el papel de bacterias intestinales en el aumento del metabolismo energético del trofozoítos y de la patogenicidad de parasito de hecho infecciones mixtas con bacterias entero patógenas como Shigella dysenteriae y Escherichia coli bacterias pueden aumentar la clínica del paciente. De igual manera se reconoce que trofozoítos en cultivo pueden perder su virulencia para al ser expuestos de nuevo bacterias como Escherichia coli, Salmonella typhi o Salmonella parathyphi aumentan su patogenia, de este modo el parasito puede degradar las capas de mucinas Nakada-Tsukui, 2016; Bracha, 1982; Galvan, 2008; Wittner 1970, 2008. Otra molécula relacionada con la adhesión es una molécula de 112 KDa usando mutantes deficientes de adhesión quienes ha mostrado actividad de cistein proteinasa que participan en la invasión de tejidos Rigothier, 1992. Seguidamente La muerte celular también está asociada a la introducción de calcio hacia la células diana como estrategia para lograr su desequilibrio y consecuente daño, atribuida como una acción mediada por la lectina de E. histolytica Ravdin en 1988 , de hecho mutantes URE3-BP a nivel de la expresión de calcio pueden aumentar la invasión en vivo Gilchrist, 2009 . 65

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Secuencia de la patogenia A

Entamoeba histolytica

Adherencia a la mucosa colónica Mucosa Sub mucosa

Pequeña ulcera

C Ulcera botón de camisa Mucosa Sub mucosa Aumento de la lesión

│Figura 41

Secuencia del proceso de adhesión y ataque de una célula del epitelio intestinal, A) el parasito supera la barrera de la musa y logra colonizar adhiriéndose al epitelio intetsinal, B) El parasito descarga su maquinaria enzimática y logra hacer un proceso de disrupción celular, provocando una ulcera, esto se traduce en sangrado que puede ser evidenciado en las heces del paciente C) El parasito sigue en su proceso de destrucción célula y se genera un daño tal que el parasito sigue destruyendo la capa en este caso se hace de bajo de la lámina superior extendiéndose este daño de forma lateral generando la típica ulcera botón de camisa. José Araujo 2020, #prof.josearaujo #joseraujoblanco.

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Cuando el parasito se adhiere a los enterocitos (figura 41) lo hace por medio de del dominio de la cisteinproteasa CPA5 (figura 42) presente en la superficie de Entamoeba histolytica el cual se une a la integrina RGD (arginina- glicina- aspártico), como principal unión al colon junto a la integrina avß3 en los enterocitos desencadenando una señalización de la PI3 quinasa / AKT induciendo respuestas proinflamatorias de NFkB generando un inflamasoma, constituido como un complejo citosólico multiproteíco que tiene función de sensor para el daño celular. Además la CPA es conversora de la pre-IL- 1β en IL-1β, en su forma activa, como citoquina proinflamatoria Faust, 2012. Amiba Enterocitos

Amiba Dominio de la cisteinproteasa CPA5

Integrina RGD Ruptura Enterocitos

│Figura 42

Reacción entre el dominio de la cisteín proteasa presente en la superficie de E. histolytica y el tripéptido de la integrina RGD de la célula blanco. José Araujo 2020, #prof.josearaujo, #joseraujoblanco.

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El parasito utiliza la lectina de Gal/GalNAc y la LPPG presentes en su superficie para unirse a las células epiteliales (figura 43), mediante el dominio de reconocimiento de carbohidratos de la subunidad pesada por medio de los receptores Toll-like de tipo 2 y 4 (TLR2 y TLR 4). Amiba

Enterocitos

AMIBA Lectina

LPPS

TLR2

TLR4

ENTEROCITO

│

Figura 43 Reconocimiento la lectina de Gal/GalNAc y la LPPG de superficie de E. histolytica a los receptores Toll-like de tipo 2 y 4 (TLR2 y TLR 4) de la célula atacada. José Araujo 2020, #prof.josearaujo, #joseraujoblanco.

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De esta manera se activa una vía de señalización clásica dando lugar a la producción de citoquinas proinflamatorias IL-1β, IL-6, IL-8, IL-12, IFN-γ y TNF-α. Junto a la activación de NF-κβ. De igual manera se ha observado aumento de receptores TLR y citoquinas proinflamatorias junto al daño celular generado por los trofozoítos, con un aumento en la infección en presencia de TNF-α y disminución de la misma al aumentar el IFNγ Galván-Moroyoqui 2011. El parasito genera prostaglandina E2 (PGE 2) y este se une al receptor 4 de la prostaglandina E (EP4) en las células intestinales alterando las uniones de los enterocitos con consecuente aumento de la secreción de cloro luminal, esto hace que mejore la infiltración del de los trofozoítos, activando una cascada para la activación de NFκB de IEC induciendo la producción de IL-8. A su vez la PGE 2 genera agotamiento de la barrera protectora de moco producto de la hipersecreción de mucina, por ser un potente secretor de esta sustancia Nakada-Tsukui 2016 . La destrucción de la célula epitelial viene mediada por luego del reconocimiento de Gal/ GalNAc y produce la activación de la calpaina, una cisteínproteasa, que escinde la calpastatina el cual a su vez es el inhibidor endógeno de la calpaina, posteriormente el aumento de la calpaina, activa la caspasa 3, implicada en la apoptosis de la célula Kim, 2007. Se trata de muerte celular dependiente de contacto y se genera tanto en las células epiteliales como las células del sistema inmune y hepatocitos. Luego de la apoptosis se genera la fagocitosis amebiana, mediado por la expresión de fosfatidilserina (PS) que junto a elementos de complemento C1q ayudan a la fagocitosis por medio de una unión a EhC2PK y la calreticulina 69

Amibiasis y la Biología de Entamoeba histolytica

respectivamente

Begum, 2015

Apoyando a estos procesos tenemos el mecanismo de muerte por endocitosis, conocido como trogocitocis amebiana. En este se produce cuando las células amebianas de Entamoeba histolytica se unen a las células y posterior al reconocimiento vía lectina de Gal/ GalNAc se produce un proceso de señalización que incluye PI3K y EhC2PK, que actúan en la polimerización de actina, generando un nuevo reordenamiento de los filamentos de actina, con un consecuente aumento de en la concentración de calcio intracelular. De esta manera EhC2PK quien es una quinasa que inicia la ingestión. El proceso incluye la ingestión de fragmentos de material de la célula atacada, este proceso hace que se pierda la integridad celular y la célula atacada muere. Posteriormente la ameba se disocia de la célula y procede a iniciar el proceso de trogocitosis en otra célula Ralston, 2015. El complejo Proteico EhCPAH contiene dos proteínas de interés la EhDH112 es una adhesina de 75KDa glicoproteína involucrada en el proceso de fagocitosis y la cisteína EhCP112 involucrada en el proceso de fagocitosis y en el efecto citopático Garcia‐Rivera, 1999; AzuaraLiceaga, 2005 . Seguidamente tenemos la proteína de membrana de 220 KDa L220, esta interviene en el proceso de eritrofagocitosis y en la activación o desactivación de la respuesta inmune mediante los linfocitos T y es características de E. histolytica.

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Amiba

SREHP Dominio N-terminal

Dominio C-terminal

│

Figura 44 Proteína transmembranal SREHP es una proteína transmembranal presente en l superficie del parasito E. histolytica que interviene en los procesos de fagocitosis / trogocitocis y los procesos de muerte celular de las células atacadas. Tomado y modificado de Manochitra, (2017). In-silico prediction and modeling of the Entamoeba histolytica proteins: Serine-rich Entamoeba histolytica protein and 29 kDa Cysteine-rich protease. PeerJ, 5, e3160. José Araujo 2020, #prof.josearaujo, #joseraujoblanco.

La proteína rica de serina SREHP (figura 44) es una proteína inmundominante importante en proceso de adherencia y en proceso de apoptosis celular, se trata de una proteína transmembranal no citoplasmatica que posee un dominio catalítico para la recepción en la fagocitosis y los procesos de apoptosis Vats, 2005. Esta molécula sirve como un potente quimioatrayente para trofozoítos amebianos, es una proteína extracelular por lo que es fácilmente accesible 71

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para el sistema inmunitario del huésped, posee un péptido señal útil en el proceso de patogénesis en el que se ha encontrado determinantes antigénicos Manochitra, 2017 .

│Figura

45 Fotomicrografía con cambios histopatológicos, que reflejan una infección por amebiasis intestinal. Se trata de la forma morfológica de la típica úlcera en forma de botón de camisa de la mucosa intestinal. Tomado de CDC Public Health Image Library (PHIL) / Dr. Mae Melvin. José Araujo 2020, #prof.josearaujo, #joseraujoblanco.

Una vez que la E. histolytica ha logrado producir disrupción de la monocapa de colonocitos (figura 45), empieza a generarse una pequeña ulcera casi microscópica que avanza atravesando la mucosa y que se extiende lateralmente a la submucosa a medida que el parásito destruye la matriz extracelular y las células 72

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de la submucosas, la lesión puede proseguir por debajo de la submucosa produciendo la típica ulcera en botón de camisa Pérez-Tamaño R 1994, Matijasevic AE 1996. La expansión de la úlcera continua lateralmente en la submucosa de tal, manera que la mucosa llega a sufrir necrosis en el espesor total, generándose úlceras de mayor tamaño. Cuando las lesiones son muy extensas como consecuencia del compromiso vascular de múltiples capilares, se presenta una manifestación de la amibiasis intestinal muy poco frecuente pero capaz de amenazar la vida del paciente, denominada Colitis Fulminante o Colitis Necrotizante

Matijasevic AE 1996

El parásito puede alcanzar la circulación venosa y por vía porta puede llegar al hígado u otros órganos pudiendo producir diversos abscesos extraintestinales, si la invasión es por la circulación arterial pueden producir oclusión trombótica de los capilares Matijasevic AE 1996 . Pruebas experimentales disponibles sugieren varios mecanismos implicados en la necrosis tisular amibiana, uno mediado por el contacto célula - célula como por ejemplo la habilidad para atraer y destruir leucocitos polimorfonucleares neutrófilos, y otro que depende directamente de los efectos de sus productos tóxicos sobre los componentes tisulares; ella puede usar la combinación de ambos mecanismos Pérez-Tamaño R 1994, Bruckner D 1992, Gitler y Mirelman 1986 . En la lisis mediada por contacto de E. histolytica las cepas patógenas poseen por lo menos dos propiedades importantes: una potente quimiotáxis positiva para los leucocitos polimorfonucleares neutrófilos y la capacidad 73

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de destruir a tales células en grandes cantidades

Gitler y

Mirelman 1986, Pérez-Tamaño R 1994.

Petri en 1987 demostró que una de las moléculas responsables por el efecto quimiotáctico de la amiba sobre los neutrófilos es la proteína de adherencia que es inhibida por la galactosa Gal / GalNAc también conocida como (GIAP) Petri WA 1987, Ravdin y Muphy 1992 de igual forma se ha demostrado recientemente que componentes solubles del parásito estimulan la producción de IL-8 (potente agente quimiotáctico para los PMN) por las células del colon Tsutsumi V 1988, Yu y Chadee 1997. Estos hallazgos explican la intensa acumulación de leucocitos polimorfonucleares neutrófilos (PMN) alrededor de las amibas en las primeras etapas del absceso hepático experimental Pérez-Tamayo 1991, Chadee y Meerovitch 1984 . En cuanto a la capacidad de la amiba de destruir grandes cantidades de células (como los neutrófilos) se han realizado experimentos in vitro done se evidenció la capacidad fagocítica de la E. histolytica, pudiendo fagocitar cada amiba al menos 140 células. No obstante, el tratamiento de las adhesinas amibianas con inhibidores específicos demostró tener un efecto inhibitorio efectivo sobre su capacidad fagocítica, pero no sobre su habilidad para destruir células de mamíferos, lo que permite suponer la acción de otros mecanismos líticos Pérez- Tamaño R 1994, Martinez-Palomo 1985, Gitler y Mirelman 1986 . Existen otros dos mecanismos específicos de E. histolytica para destruir células, como son la producción del ameboporo y la fosfolipasas A Gitler y Mirelman 1986 , Bruckner D 1992 , Petri W 1993 , Pérez-Tamayo 1991 , Martinez-Palomo 1985 , Lynch EC 1982 , Dodson y Petri, 1994

. 74

Amibiasis y la Biología de Entamoeba histolytica

│

Figura 46 Cristalografía del Ameboporo de Entamoeba histolytica, Representación en forma de cinta del dímero, se muestran los residuos responsables de las interacciones electrostáticas y las hélices 1 y 2 que forman la superficie hidrofobia. La figuras de nubes moleculares muestran el potencial electrostático de la superficie molecular de la estructura hexamérica modelada, el potencial positivo es de color azul y el potencial negativo en rojo. Tomada y modificada de Leippe, M., Bruhn, H., Hecht, O., & Grötzinger, J. (2005). Ancient weapons: the three-dimensional structure of amoebapore A. Trends in parasitology, 21(1), 5-7. / Hecht, O., van Nuland, N. A., Schleinkofer, K., Dingley, A. J., Bruhn, H., Leippe, M., & Grötzinger, J. (2004). Solution structure of the pore-forming protein of Entamoeba histolytica. Journal of Biological Chemistry, 279(17), 17834-17841. José Araujo 2020, #prof.josearaujo, #joseraujoblanco

El ameboporo (figura 46) es un agregado multiproteínico, intracitoplasmático, de alto peso molecular (92 kDa) formador de canales iónicos y se observan como pequeñas partículas intracelulares altamente electrodensas que al parecer no están confinadas dentro de vesículas citoplasmática Lynch EC 1982 , Gitler y Mirelman 1986 . 75

Amibiasis y la Biología de Entamoeba histolytica

Este ameboporo (figura 47) es liberado cuando interactúan las adhesinas amibianas con los residuos de N-acetil-galactosamil de las glicoproteínas de superficie de las células blanco, en ese momento ocurre una redistribución de las glicoproteínas de superficie de la amiba aumentando la permeabilidad de la membrana al calcio, con la consecuente liberación del ameboporo e inserción de éste en el punto preciso del contacto de las dos células Pérez- Tamaño R 1994 , Gitler y Mirelman 1986 , Lynch EC 1982 , Dodson y Petri 1994 , Bruckner D 1992 .

│Figura 47

Cristalografía del Ameboporo de Entamoeba histolytica/ esta proteína es importada desde el parasito hacia la membrana de la célula atacada de esta manera desestabiliza la integridad de esta y media su destrucción. Tomada y modificada de Leippe, M., Bruhn, H., Hecht, O., & Grötzinger, J. (2005). Ancient weapons: the threedimensional structure of amoebapore A. Trends in parasitology, 21(1), 5-7. José Araujo 2020, #prof.josearaujo, #joseraujoblanco.

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Se generan así múltiples canales que conducen a la rápida difusión de iones a favor de los gradientes de concentración con la lógica oposición de los sistemas de transporte activo de la célula dañada originándose un agotamiento del ATP intracelular pérdida sodio y potasio, retención de agua, formación de vacuolas citoplasmáticas, aumento del calcio intracelular posteriormente la muerte de la célula Pérez- Tamaño R 1994, Gitler y Mirelman 1986, Lynch EC 1982, Bruckner D 1992 . El otro mecanismo consiste en la liberación de enzimas amibianas donde se encuentran las fosfolipásas que pueden dañar a las células por medio de la acción directa sobre los fosfolípidos de las membranas de las células blanco; o por Ia generación de sustancias líticas y subproductos hidrolíticos que en algunos casos son parecidos a neurohormonas (por Ej. serotoninas componentes amibianos que participan en la síntesis y liberación de prostaglandinas) potentes estimulantes de las paredes intestinales al actuar sobre el AMP cíclico lo que produce alteraciones en el metabolismo de calcio en el huésped y liberación de sodio a la luz intestinal que inducen a la excreción de agua, también actúan directamente sobre la membrana celular al abrir canales de calcio, lo que origina cambios electrolíticos, estos procesos pueden explicar junto a la acumulación de eritrocitos por los procesos de destrucción de tejidos por las proteasas la disentería abimibiana en pacientes infectados con E. histolytica Pérez- Tamaño R 1994 , Bruckner D 1992 , Cabello R 1999 . La amiba secreta fundamentalmente dos tipos de fosfolipasas, una independiente del calcio y otra dependiente de este catión, la cual parece ser la de mayor actividad lítica.

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El tratamiento con quelantes del calcio disminuye Ia producción de esta fosfolipasa y por ende, la acción lítica mediada por contacto de la amiba sobre la célula blanco Samuelson J 1995, Bruckner D 1992. La amiba posee otros productos tóxicos que son secretados y pueden actuar sobre las células y/o tejidos, por mecanismos independientes del contacto Tsutsumi V 1984, Pérez-Tamaño R 1994, Velázquez C 1997 . Entre de esos productos citotóxicos (proteinasas) se encuentran diversas enzimas capaces de degradar componentes intercelulares del tejido conectivo tales como fibronectina, laminina,colágeno (Tipo I, III y V) y glucosaminoglicanos. Además se han descrito por lo menos una metaloproteinasa, una colagenaza y una proteinaza aspartica (Catepsina O) Lushbaugh WB 1984, Pérez- Tamaño R 1994. De estas enzimas las cistein proteasas son las más importantes por su mayor actividad proteolítica Bruckner D

1992, Martínez-Palomo 1985, Petri W 1993, Pérez-Montfort 1987, López-Revilla 1992, Lin JY 1995.

Zimodemos del Parásito Para referirnos a los zimodemos estos fueron utilizados para diferenciar amibas patógenos y no patógenas. Puesto que las infecciones amibianas podrían ser causadas por dos especies diferentes de amibas Aguirre y Urdaneta 1997, WHO/Paho/Unesco 1997 una capaz de producir, la enfermedad invasora denominada Entamoeba histolytica, Schaudinm 1903, y otra sin potencialidad patógena Entamoeba dispar, Brump 1925. esta teoría está sustentada por el estudio de los patrones de migración por corridas electroforéticas de proteínas de trofozoítos un conjunto de cuatro isoformas 78

Amibiasis y la Biología de Entamoeba histolytica

enzimáticas amibianas específicas que participan en el catabolismo de los carbohidratos de amibas (glucosa fosfato isomerasa; L-malato oxidoreductasa; fosfoglucomutasa y hexoquinasa) en los que se ha encontrado diferencias específicas para amibas patógenas y no patógenas identificadas por Sargeunt y Willian quienes las denominaron como (zimodemos) (Zymo= enzima, demos= población) y que ha utilizado para el diagnóstico de la amibiasis, considerados por algunos autores como los mejores parámetros para medir la patogenicidad de las diferentes cepas de E. histolytica Sargeaunt P 1978, Aguirre A 1997, Bhaskar S 1996, Kraoul L 1997, Perez Tamayo 1994 . Los zimodemos de las cepas de E. histolytica, reportados para las amibas patógenas tienen patrones isoenzimáticos diferentes a los de amibas no patógenas en la hexocinasa (HK) y fosfoglucomutasa (PGM). En las amibas patógenas la enzima hexoquinasa (HK) presenta dos bandas de migración rápida, la enzima fosfoglucomutasa (PGM) presenta una banda de corrimiento en posición beta. En las amibas no patógenas la enzima hexoquinasa (HK) presenta bandas una corrimiento lento la enzima fosfoglucomutasa (PGM) presenta una banda de corrimiento en posición alfa, una de las bandas de la (PGM), la banda de migración rápida, está ausente en las amibas no patógenas y sólo se presenta en las amibas patógenas. Esto hace difícil establecer métodos de diagnóstico que permitan definir si una cepa es o no patógena. Investigaciones controversiales sugerían que el zimodemo de las cepas amibianas puede variar en la correlación directa con cambios en la virulencia 1986

Vargas A

. 79

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Se han descrito hasta 22 zimodemos, de los cuales nueve (II, Ila, VI, VII, X, XI, XII, XIV y XIX) son patógenos, y los 13 restantes no patógenos. Numerosos estudios confirman que el zimodemo II es el más frecuentemente asociado con la virulencia de la cepa y a este pertenecen muchas de las cepas patógenas descritas actualmente hasta ahora, no hay evidencias que indiquen una relación de causa efecto entre los zimodemos y la virulencia de la amiba, por lo que éstos se usan sólo como características bioquímicas de las cepas amibianas y no como parámetros de su virulencia, ya que dichos zimodemos son interconvertibles

Aguirre A 1997

Mirelman y sus colaboradores reportaron que las cepas amibianas no patógenas CDC 0784:4 y SAW 1734R clAR pueden convertir su zimodemo de no patógeno a patógeno y viceversa cuando se cambian las condiciones del medio de cultivo. Estos autores disminuyeron gradualmente la cantidad de bacterias en el medio de cultivo de amibas no patógenas y cuando las amibas empezaron a crecer en el cultivo sin las bacterias (cultivo axénico) el zimodemo cambió a patógeno. Posteriormente, después de crecer un cultivo a partir de una sola célula, reincorporaron al cultivo amibiano la flora bacteriana (cultivo xénico) y las "nuevas" amibas patógenas, después de 7 días en presencia de las bacterias, tenían nuevamente zimodemo no patógeno Mirelman y col sugieren que la eliminación de bacterias puede producir diferencias en el microambiente amibiano provocando cambiosmetabólicos y en su patogenicidad

Mirelman D 1986

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La virulencia de las amibas se recupera al pasar las amibas por el hígado de hámsteres. Esto podría deberse a la regulación diferencial de algunos genes, como los que codifican para las isoenzimas glicolíticas. Sin embargo, es necesario contar con marcadores genéticos durante el cambio de zimodemos para explicar la interconversión y eliminar la posibilidad de contaminación entre los cultivos amibianos, ya que esta posibilidad es la fuente de escepticismo entre la mayoría de los investigadores que no creen en el intercambio de zimodemos y el cambio de expresión de la virulencia de las amibas. Recientemente, se ha iniciado el estudio de los genes de las enzimas glicolíticas, lo que permitirá estudiar mejor los mecanismos involucrados en la regulación de su expresión encontraron cuatro genes que codifican para HK, dos de ellos fueron reportados como exclusivos de amibas patógenas y los otros dos de amibas no patógenas. Estos resultados correlacionan con los diferentes zimodemos de la hexoquinasa 1995; Sargeaunt y Williams 1978

Ortner S

Una posibilidad es que, debido a cambios de los medios aun no definidos, existan varios genes para cada enzima y estos se amplifiquen preferencialmente. Como el número de cepas con zimodemo no patógeno cultivadas en forma axénica es pequeñísimo, de hecho sólo existe una reportada, es posible también suponer que el medio de cultivo y la presencia de bacterias influyan en la expresión de proteínas, incluyendo a las isoenzimas utilizadas para generar los zimodemos. En lo actual el método no es muy utilizado debido a la limitación de este método que requiere el cultivo previo de las amibas lo que demora el diagnóstico y, por ende, el tratamiento del paciente

Espinosa-Cantellano M 1997

. 81

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Medio de Cultivo Estudios sobre los requerimientos del parásito para poder vivir y los efectos que este produce, produjeron la necesidad de reproducir el micro ambiente en el que se desenvuelve este parásito por lo que 1978 Diamond quien cultivaba diferentes Entamoebas logrando en primer lugar aislar amibas de reptiles para luego después de varios ensayos poder Medio de Cultivo TYI S 33 1 lograr amenizar a un patógeno gástrico como es E. histolytica el medio de cultivo es el TYI-S-33. Existen tres tipos de sistemas para el cultivo de especies de Entamoeba: el cultivo xénico dónde el parásito es crecido en la presencia de una flora indefinida; el cultivo monoxenico dónde el parásito es crecido en la presencia de una sola especie de socio, generalmente antes de eliminar todas las bacterias los trofozoítos son crecidos en un medio con una sola bacteria como Fusobacterium symbiosum u otro socio (figura 48) Orosco-Orosco E. 2000 protozoario como Crithidia fasciculata .

│Figura 48

Micrografía de Crithidia fasciculata por Microscopía electrónica de barrido. Barras, a = 10 µm; b = 2 μm; Inserciones, imágenes de microscopía de luz por microscopía de contraste de interferencia diferencial (DIC); Barra, 10 μm. Tomado de Azeredo, C. M 2013. José Araujo 2020, #prof.josearaujo, #joseraujoblanco

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El cultivo axénico dónde el parásito es crecido en la ausencia de cualquier otra célula metabolizante. (El término cultivo polixénico a veces se usa erróneamente como un sinónimo para el xénico; sin embargo los medios polixénicos sólo deben referirse a los cultivos dónde las identidades de todas las especies son conocidas

Dougherty EC 1959

Estos protista parasitarios son todos aislados de fuentes ricas en las bacterias y hongos como las heces u otros fluidos orgánicos, para llegar de un medio xénico a la axenixación definitiva se deben tomar en cuenta el control y eliminación de las bacterias y hongos u otro microbio presente en un medio xénico lo que es crucial para el éxito al cultivar los parásitos de interés. Por debe existir un equilibrio entre las necesidades de la flora bacteriana y el eucarionte E. histolytica nunca ha sido axenisada, o crecida sin establecerse primero en cultivos xénicos con otros organismos y normalmente con un complejo ente la flora bacteriana. La Axénización de E. histolytica es un proceso laborioso y largo dónde el cultivo xénico del organismo se adapta primero al crecimiento en un medio monoxénico, normalmente con un kinetoplástido flagelado como un socio, antes de cambiar de un estilo de vida de fagocitosis a uno dónde los nutrientes se obtienen grandemente de por medio de pinocitosis Diamond L 1968

por lo que en este caso el proceso entero puede tomar a menudo meses. Un problema constante que enfrenta aquellos que confían en los cultivos axénicos es que es un trabajo siempre constante e indetenible. La proporción 83

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constante de los requerimientos del medio es crucial para el mantenimiento del medio, incluso las marcas con las que se trabajan influyen profundamente en el medio al apoyar el crecimiento de los organismos. Algunos componentes como la Tripticasa (el Compendio de Caseína y Peptona), el extracto de levadura y suero son los componentes que en su mayoría se ven normalmente afectados, pero la calidad del agua destilada e incluso el tipo de vidrio usado para hacer el cultivo en tubo, como el vidrio de (borosilicato) puede causar problemas Diamond 1983. Por esta razón se recomienda a aquellos que deseen emprender un cultivo axénico de estos organismos, que prueben la habilidad de cada nueva porción de reactivo que apoyar el crecimiento antes de empezar a usarlo Home page of E. histolytica. Debido al avance para producir cultivos de amibas sin otros microorganismos, denominados cultivos axénicos Diamond L. 1961, Diamond LS 1993, Guimares S 1991, Urdaneta H 1994, Urdaneta H 1995 se ha podido purificar y obtener extractos proteicos amibianos y caracterizar las proteínas para diferenciar cepas y producir antígenos, que permitan evaluar sus propiedades Baskar S 1996, Diamond inmunodiagnósticas o inmunoprofilaxis L. 1961, Diamond LS 1993, Guimares S 1991 . En 1995, reportamos el aislamiento y axénización de dos cepas axénicas de E. histolytica procedentes de pacientes sintomáticos a las que se denominó IULA: 1092:1 e IULA:0593:2. Hemos realizado todos los estudios necesarios para caracterizar dichas cepas

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Los diversos cultivos fueron evaluados por microscopia electrónica, para su caracterización, pruebas en animales de laboratorio para evaluar su patogenicidad, y diversas pruebas inmunológicas y moleculares que incluyen Estudios de perfiles electroforéticos que han demostrado la presencia del zimodemo de tipo II, característico de cepas patógenas reportadas internacionalmente. Así mismo han demostrado ser de alta virulencia, produciendo abscesos hepáticos amibianos en todos los animales inoculados. Además presentan un complejo patrón de reactividad frente a los sueros positivos y un antígeno marcador de patogenicidad reconocido por el monoclonal HU-511.El análisis isoenzimático, y la evaluación de los complejos antigénicos de sus membranas nos han permitido mas de tres décadas realizar pruebas diagnosticas, así como avanzar en el estudio genotípico y molecular Evaluando sus componentes genómicos el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y aplicado pruebas moleculares e inmunológicas a la vez como él (PCR-SHELA), revelando que estas cepas muestran una organización geonómica propia de las cepas patógenas de referencia. De igual manera el mantenimiento de esta cepa nos permitió evaluar los casos clínicos de diversas partes de y poblaciones de Venezuela y otros países comparando la homología de estos cultivos con otros de referencia a nivel mundial, desde el Instituto de Inmunología Clínica. Donde se presta asesoría científica para diagnostico clínico, o para investigadores del que deseen desarrollar estudios sobre esta cepa única en el país Araujo J 2008. 85

Amibiasis y la Biología de Entamoeba histolytica

│

Figura 49 Ilustración Microscópica de células amaeboides sobre el lumen celular Tomado y modificado de Stocktrek Images / Science Source. José Araujo 2020, #prof.josearaujo, #joseraujoblanco

Respuesta Inmunitaria en la Amibiasis La respuesta inmunológica (figura 49) en la amibiasis ocurre después de la invasión, donde el hospedero capaz de responder, a una reacción provocada por el parásito. Los mecanismos de la respuesta producto de esta invasión ligada a la serie de eventos que reaccionan frente a este parásito. La existencia de protección del hospedero contra la amibiasis invasora, no está clara, pero varias evidencias experimentales indican que tanto el hombre como los animales desarrollan algún grado de inmunidad protectora. Al parecer, la respuesta inmunológica contra E. histolytica ocurre como resultado de la evolución de un proceso infeccioso, la invasión de los tejidos por parte de este parásito, lo que resulta un problema central para el entendimiento del fenómeno inmunológico Sin 86

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embargo, no se conoce completamente el papel de la respuesta inmunológica en el control de la enfermedad WHO/Paho 1997, Ortiz L 1994a, Martínez A 1994 . En humanos la enfermedad persiste a pesar de existir inmunidad mediada por anticuerpos específicos circulantes o por células, adquiridas en el transcurso de Lyche

Jensen

1997

la exposición al parásito .Varias evidencias epidemiológicas sugieren algún grado de inmunidad protectora a nuevos episodios de absceso hepático amibiano (0.04%), después de la infección primaria. En modelos animales se ha demostrado inmunidad protectora previa a la exposición al parásito, por inyección de antígenos amibianos o por inmunización pasiva con anticuerpos anti amiba Sepúlveda y Martínez-Palomo 1982, Meerovitch y Chadee 1988 . En experimentos de inmunosupresión selectiva, se ha demostrado que la inmunización pasiva con altas concentraciones de anticuerpos a ratones con Inmunodeficiencia Severa Combinada puede bloquear la formación de abscesos hepáticos amibianos Cieslak PR 1992, Zhang T 1994, Seydel KB 1996. Aunque no está bien claro el papel protector de la respuesta inmunológica humoral o celular, hay consenso en que ambas se presentan durante una infección por E. histolytica patógena y que ocurre solamente después de que la amiba ha invadido los WHO/Paho 1997, Ortiz L 1994a, Martínez A 1994 tejidos enfermedad . Las infecciones y reinfecciones con amibas patógenas siempre cursan con anticuerpos circulantes y respuesta inmunológica celular

Mesa I 1994

Aunque, en episodios transitorios de infecciones amibianas con cepas no patógenas pocas veces se 87

Amibiasis y la Biología de Entamoeba histolytica

detectan anticuerpos en el suero, posiblemente porque las amibas no han invadido o no han tomado contacto con el epitelio mucoso del intestino. El estudio de la respuesta inmunológica en individuos infectados contra los antígenos de la E. histolytica se ha podido llevar a cabo gracias al avance de las técnicas de cultivo axénico y de la purificación de antígenos a partir de parásitos cultivados en estos medios

Diamond LS 1961

│Figura 50 IgG, un modelo molecular de un anticuerpos de inmunoglobulina G (IgG), el anticuerpo más abundante encontrado en el cuerpo sintetizado por las células B del plasma. Los anticuerpos IgG se unen a patógenos extraños para inmovilizarlos y evitar que se unan a otros patógenos. IgA, un modelo molecular de la inmunoglobulina A1 (IgA1), es la inmunoglobulina principal que se encuentra en las secreciones mucosas (lágrimas, saliva, sudor, etc.) y las secreciones del tracto genitourinario, el tracto gastrointestinal y el epitelio respiratorio. IgM, un modelo molecular de inmunoglobulina M (IgM), un anticuerpo que responde a los antígenos durante la exposición inicial de una infección. La IgM es producida por las células B y es el anticuerpo más grande en el sistema circulatorio, con múltiples inmunoglobulinas unidas covalentemente para formar un pentámero. IgE, un modelo molecular de inmunoglobulina E (IgE), un isotipo de anticuerpo que se encuentra solo en mamíferos, que desempeña un papel en enfermedades alérgicas como asma, alergias alimentarias, dermatitis, sinusitis, así como reacciones anafilácticas a medicamentos, picaduras de abejas y otros alérgenos. También es responsable de la defensa inmune contra los parásitos. Tomado y modificado de Stocktrek Images / Science Source. José Araujo 2020, #prof.josearaujo, #joseraujoblanco

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Respuesta Inmunitaria Humoral La invasión de los tejidos por los trofozoítos de E. histolytica inducen a una respuesta humoral (figura 50) demostrable por métodos inmunológicos usuales, en general los títulos de anticuerpos específicos más elevados se presentan en etapas iniciales de la enfermedad invasora, pudiendo persistir por años a bajos títulos después de la cura de la enfermedad Kretschmer 1994

. La amibiasis invasora produce respuesta inmunológica humoral que generalmente se detectan una semana después de la aparición de los síntomas en animales de experimentación y en humanos. En la infección amibiana se ha encontrado la producción de diferentes inmunoglobulinas La Principal inmunoglobulina encontrada en pacientes con amibiasis (figura 51) es la IgG, sin embargo también es posible encontrar la IgM, IgA, IgE. La IgA fue encontrada por primera vez en la bilis de las ratas infectadas intracecalmente con trofozoítos de Entamoeba histolytica, también se ha encontrado en la leche y calostro humano. De igual manera la amibiasis invasora produce respuesta rápida de inmunidad humoral con anticuerpos específicos (sobre todo del tipo IgG) generalmente los anticuerpos se detectan una semana después de la aparición de los síntomas en animales de experimentación y en humanos. Pacientes con amibiasis intestinal muestran alta presencia de IgA secretora e IgG sérica mientras que en pacientes amibiasis hepáticas podemos encontrar IgG e IgA así como IgM e IgE. Estas detecciones pueden ser realizadas aplicando diversos tipos de técnicas inmunodiagnósticas como Dye test, Fijación del complemento, Inmunofluorescencia indirecta, 89

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Aglutinación directa, Hemaglutinina indirecta, Reacción intradérmica, RIA, en especial ELISA e Inmunoblot, Copreoelisa-Eh e PCR-SHELLA

Kaur 2004, Kretschmer RR 1994, Ortiz

L 1994a, Urdaneta, 1991; 1994; 1996; 1998, 2007; Araujo 2008.

Detección de Anticuerpos: Amibiasis

HEPATICA

IgM e IgG

IgG e IgA

IgA Secretoria

IgG Sérica INTESTINAL │Figura 51 Anticuerpos detectados en la Amibiasis, Tomado de Herramientas Modernas Para el Diagnóstico, Haydee Urdaneta Romero, Universidad de los Andes Facultad de Medicinas, Instituto de Inmunología Clínica, 2007 . #prof.josearaujo, #joseraujoblanco.

Dentro de las subclases de inmunoglobulina IgG predomina la lgG2 e lgG4. Se sabe que en pacientes con amibiasis extraintestinal la respuesta preponderante es por anticuerpos de la subclase IgG4, y que este mismo hecho se ha apreciado en pacientes con amibiasis Kretschmer RR 1994

intestinal crónica (figura 52). Entre tanto, no se conoce el papel que cumple la IgE en esta infección Guerrero M 1972, Perez-Montfort 1987. Por otro lado, los niveles de IgG pueden o no tener efectos protectores sobre la susceptibilidad a infecciones amebianas dependiendo de las principales subclases de IgG inducidas por infección (IgG1 e IgG2 inducidas por Th2 y Th1, respectivamente) Kaur, 2004; Bernin 2014 . 90

Amibiasis y la Biología de Entamoeba histolytica

Este aumento en los niveles globales de las inmunoglobulinas podría deberse a la activación policlonal, de las células productoras de anticuerpos, así como a la producción de enormes cantidades de diferentes familias de anticuerpos específicos contra la amibiasis. Se ha estudiado el comportamiento de este tipo de respuesta en pacientes con disentería amibiana, donde el 80% presentaban coproanticuerpos, mientras que los mismos anticuerpos se presentaron en el 4% de los pacientes con otras infecciones parasitarias intestinales e incluso en individuos sanos. En otros estudios de una población de niños con amibiasis intestinal se obtuvo, en el 80%, la presencia de coproanticuerpos anti-amiba por hemaglutinación indirecta (IHA), títulos que después de tres semanas disminuyeron en el 55% de los individuos, mientras que los niveles de anticuerpos en el suero se incrementaron significativamente. Estos datos sugieren que durante el curso inicial de la amibiasis intestinal invasiva existe una respuesta local secretoria que es transitoria, la cual permite la destrucción de la mucosa permitiendo la invasión de las amibas a través de la pared intestinal lesionada, con la subsecuente producción de anticuerpos circulantes

Ortiz L

1994 a

Diversos autores coinciden en señalar que los títulos de anticuerpos no están necesariamente correlacionados con la protección del hospedero, ni con la severidad de la enfermedad o con la extensión del daño tisular; además la reinfección ocurre en presencia de anticuerpos específicos anti-amiba, igualmente se mantienen elevados por meses o años después de haberse controlado la infección. Lo que sugiere que la 91

Amibiasis y la Biología de Entamoeba histolytica

inmunidad humoral no sería la protectora en la infección por E. histolytica Kretschmer RR 1994. Aún en ausencia de infecciones recurrentes los anticuerpos se han encontrado tres años después de la infección inicial, posiblemente debido a la persistencia de antígenos de amiba en el sistema fagocítico Ortiz

1994a

mononuclear . En un estudio seroepidemiológico realizado en México usando aproximadamente 20.000 muestras de sueros se encontró que el 5.95% eran portadores de anticuerpos anti-amiba. Observaciones

similares

Hudler H 1984

han

realizado

Colombia y en Venezuela . A pesar de que los anticuerpos no protegen al humano contra las reinfecciones, se ha observado mediante estudios in vitro que los anticuerpos puede inhibir el crecimiento o neutralizar la virulencia de la E. histolytica, así como también inhibir la eritrofagocitosis y la acción citotóxica mostrada por la amiba en los cultivos celulares 1984

Hudler H

Los anticuerpos anti-amiba tienen efectos citotóxicos sobre los trofozoítos de la E. histolytica tanto Guerrero M 1972

in vitro como in vivo . Los trofozoítos tratados con sueros inmunes pierden su motilidad y se transforman en corpúsculos esféricos mostrando alteraciones citoplasmáticas caracterizadas por vacuolizaciones e hialinizaciones. Además, la incorporación de anticuerpos a los cultivos de amibas causa inhibición de su crecimiento, mientras que la inoculación, de animales susceptibles con parásitos tratados previamente con anticuerpos, no 92

Amibiasis y la Biología de Entamoeba histolytica

ocasiona la formación de absceso hepático

Ortiz L 1994a

La unión de anticuerpos poliespecíficos de conejo sobre la superficie de la amiba provoca la redistribución de estos, lo que conduce a la formación de capas de anticuerpos que subsecuentemente son internalizados o liberados, mecanismo que utiliza el parásito para protegerse de la acción de los anticuerpos y de la actividad lítica del complemento. Alternativamente los anticuerpos que se unen a la membrana del parásito pueden ser digeridos in situ por la acción de proteasas no específicas. Estas modificaciones de la. Membrana puede ser un importante mecanismo mediante el cual la E. histolytica evada los efectos deletéreos de los componentes humorales del sistema inmunológico. De toda la población de las amibas originalmente susceptibles a los efectos citotóxicos del suero inmune, entre el 50 y el 75 % se pueden hacer resistentes. De acuerdo a lo antes expuesto, se ha postulado que para que la E. histolytica pueda sobrevivir dentro del hospedador deben ocurrir sobre su superficie la redistribución y liberación de los antígenos junto con la regeneración de la membrana plasmática

Ortiz L 1994a

El rol protector de la IgA e IgE en la amibiasis intestinal se desconoce. Por otra parte, no se sabe con certeza si las infecciones amibianas asintomáticas son debidas a una respuesta inmunológica especifica en el intestino, tampoco existen pruebas concluyentes de que los anticuerpos secretores desempeñen una función protectora, a pesar de que se pueden detectar coproanticuerpos en el 80% de los pacientes con disentería amibiana. De hecho, se ha descubierto que 93

Amibiasis y la Biología de Entamoeba histolytica

Amibiasis hepática / Absceso hepático Amebiano

Amibiasis Intestinal / Disentería Amebiana

La IgA secretora está presente en pacientes con amibiasis intestinal, puede ser degradada rápidamente, mediante la enzima Cistein proteasa de E. histolytica.

IgA Se desconoce su rol en la protección de la enfermedad

IgE

AMIBA

Las Inmunoglobulinas ▲IgG1-IgG4, amebiasis extra intestinal. IgG4 contribuye en más de un 1/3 de la respuesta inmune total, seguido de IgG2, IgG3 e IgG1

64% de Sensibilidad en pacientes con enfermedad invasora

Se pueden detectar IgA e IgG copro anticuerpos en el 80% de los pacientes con disentería amibiana La Principal inmunoglobulina encontrada en pacientes con amibiasis.

IgG

IgM

IgG

IgG 3

IgA

IgE 1

IgM

│Figura 52 Representación gráfica de la respuesta humoral frente a la invasión de Entamoeba histolytica en casos de amibiasis intestinal y disentería amibiana. Amibiasis hepática y absceso hepático, y curso de los niveles de inmunoglobulinas en la respuesta contra la amibiasis en humanos, #prof.josearaujo, #joseraujoblanco.

los trofozoítos de E. histolytica son capaces de degradar la IgA secretora, probablemente utilizando varias proteínas diferentes a las descritas en distintas cepas bacterianas La respuesta de la IgA de las mucosas ocurre durante la amibiasis invasiva como evidencia de la presencia de anticuerpos en el calostro y en la saliva. Esto no es evidencia de que la amibiasis intestinal ocurra con más frecuencia o sea más severa en individuos con deficiencia de IgA. Porque los trofozoítos 94

Amibiasis y la Biología de Entamoeba histolytica

de E. histolytica degradan rápidamente la IgA humana secretoria, lo cual sugiere que la Cistein proteasas del parásito forma una potente defensa contra la respuesta de inmunidad humoral del hospedero

Ravdin JI 1995

La interacción de la IgA con E. histolytica es de naturaleza dinámica. Claramente, durante la amibiasis invasiva son producidos anticuerpos IgA anti-amibianos en las superficies de las mucosas mientras que no es muy entendido el rol de la IgA en la eliminación de E. histolytica del intestino; estudios prospectivos de población y modelos experimentales de inmunidad en la amibiasis intestinal son muy necesarios

Ravdil JI 1995

│

Figura 53 Ilustración Microscópica de eritrocitos fagocitados, que participan en la respuesta inmune dentro del cuerpo. Tomado y modificado de Stocktrek Images / Science Source. José Araujo 2020, #prof.josearaujo, #joseraujoblanco.

Respuesta Inmunitaria Celular Algunos estudios indican que la respuesta inmunológica primaria es predominantemente celular (figura 53), esto es evidencia de que en la inmunidad 95

Amibiasis y la Biología de Entamoeba histolytica

mediada por células participa de alguna manera en el comienzo del proceso infeccioso. Esto ha demostrado que la administración de drogas inmunosupresoras favorecen el desarrollo experimental del Absceso hepático amibiano (AHA) por amibas en hámster 1986; Rosales 2002

Ortíz L

Al invadir los trofozoítos la mucosa intestinal sobreviene una respuesta inmunológica convencional para esta primera respuesta tal vez participan las células inflamatorias aisladas en el lugar de la invasión, especialmente las que se encuentran en el margen de las úlceras amibianas en donde se presenta de manera inevitable el primer contacto entre los antígenos amibianos y el sistema inmunológico

Kretschmer 1993

En la amibiasis existe la participación de la respuesta inmunológica mediada por células a nivel local, ya que están presentes los ingredientes básicos (como la presencia de fagocitos mononucleares y de linfocitos T citotóxico / supresor en los exudados de la mucosa, los cuales están en contacto con la amiba en los alrededores de la úlcera). Además, la reactividad local (blastogénésis inicial) de los folículos linfoides de la submucosa y de los nódulos linfoides mesentéricos, la desorganización de la zona paracortical son eventos que están a favor de la existencia de la inmunidad mediada por células

Ortiz L 1994a, Rosales 2002

Aunque, el papel de la inmunidad mediada por células en la infección por E. histolytica ha sido estudiada en humanos, la mayoría de las investigaciones se ha llevado a cabo en animales de experimentación particularmente en modelos con absceso hepático. Para realizar estudios epidemiológicos de individuos infectados. La presencia 96

Amibiasis y la Biología de Entamoeba histolytica

de anticuerpos en pacientes con amibiasis invasora, indican que la respuesta de inmunidad celular, más que la humoral, podría participar en la protección contra la infección

Mesa I 1994

La participación de los linfocitos T en la resistencia a la E. histolytica se ha demostrado in vitro evaluando sus efectos sobre las amibas Salata y Ravdin 1986 e in vivo en modelos animales en los cuales se ha demostrado la exacerbación de las lesiones amibianas al deprimir la inmunidad celular por medio de tratamientos con esteroides, timectomía neonatal, esplenectomía, radiaciones, anticuerpos antilinfocitos, o antimacrófagos Ghadirian E 1982, Ghadirian E 1983.

E. histolytica coloniza el intestino adhiriéndose al mucus colónico, por medio del dominio de reconocimiento de carbohidratos de la lectina Gal/GalNAc a través del receptor tipo toll (TLR) 2 y 4, que activa NFκB y conduce a la producción de citosinas de inflamación como IL-1β, IL-6, IL-8, IL-12, IFN-γ y TNFα activando NFκB y conduciendo a la producción de inflamación citosinas, incluidas IL-1β, IL-6, IL-8, IL-12, IFN-γ y TNF-α. Posteriormente el parasito lisa las células de la mucosa epitelial para luego invadir la lámina propia. En la mucosa inflamatoria de modelos animales infectados, se observa una prominente infiltración de neutrófilos Yi y Chadee 1997 y la producción de interleukinas proinflamatorias. Entre ellas la IL-1 y la IL-8, potente citokina con capacidad de atraer y activar neutrófilos Seydel KB 1996, Yi y Chadee 1997, Rosales 2002 . En los tejidos, en contacto con la E. histolytica, alrededor de las lesiones y en los exudados de las mucosas están presentes los ingredientes básicos de la respuesta celular como son los fagocitos mononucleares y de los linfocitos T citotóxicos; también se activan 97

Amibiasis y la Biología de Entamoeba histolytica

eventos en favor de esa inmunidad mediada por células como la reactividad local (blastogénesis) de los folículos linfoides de la submucosa y de los nódulos linfoides mesentéricos

Ortiz L 1994 a

La interacción de linfocitos de pacientes convalecientes de un absceso hepático por la E. histolytica resulta en la lisis del parásito

Salata RA 1985, Ravdin

JI 1989

en contraste, las células normales o aisladas de pacientes con amibiasis aguda, no son citotóxicas para las amibas

Salata RA 1986

La habilidad de los macrófagos y de los linfocitos T para resistir y destruir los trofozoítos de amiba ha sido demostrada repetidas veces; se ha demostrado in vivo e in vitro, que el neutrófilo es la primera célula del sistema inmunológico que interactúa con la amiba invasora, que puede ser destruido por ellas y que la liberación de su contenido exacerba el daño al hospedador. En ratones con Inmunodeficiencia Severa Combinada (ISC) depletados de neutrófilos, el daño al hígado es mucho más severo que en los ratones de los grupos controles Seydel KB 1996. Otros estudios han demostrado que las células epiteliales humanas producen citokinas inflamatorias (IL-1 e IL-8) en respuesta a la infección por E. histolytica Seydel KB 1996

. En otro trabajo científico se demostró que la expresión de citokinas inflamatorias puede ser inhibida por N-acetil galactosamina, molécula que previene el ataque a las células epiteliales por parte de la E. histolytica. La invasión de la amiba a los tejidos puede estar precedida o asociada a cierto de grado de supresión de 98

Amibiasis y la Biología de Entamoeba histolytica

las células T; es así como los pacientes con amibiasis invasora muestran negativa la respuesta de hipersensibilidad retardada durante la fase aguda y sin tratamiento, pero se tornan positivas después de la recuperación. Igual ocurre con los ensayos de inhibición de la migración de los macrófagos, los cuales son negativos durante las fases iniciales de la enfermedad y positivos Ortiz L 1994a

después del tratamiento . En animales de experimentación se observan bajos índices CD4/CD8 en etapas tempranas de la amibiasis invasora

Salata RA 1986

En células esplénicas y nódulos linfoides inoculados con antígenos amibianos se observó que a los 5 días postinoculación los niveles de IL-4, IL-2 y factor de necrosis tumoral alfa (TNFα) eran muy bajos, pero la respuesta linfoproliferativa muy alta, a los 20 días postinoculación se observó una supresión de la producción de citokinas y de la respuesta linfoproliferativa; entre los días 30-60 solo se incrementó la producción de IL-2 (figura 54). En animales que fueron tratados y curados, se observó a los 20 días que los niveles de IL-4 y TNFα eran bajos, mientras que la IL-2 y la resistencia a la infección estaban elevados, lo que habla a favor de que la respuesta protectora fuera fundamentalmente tipo Campbell y Chadee 1997

Th-1 . Estudios in vivo e in vitro demuestran que los macrófagos activados producen óxido nítrico (NO) y ejercen un efecto amebicida contacto-dependiente

Lin y Chadee 1992, Wang W 1994

La producción de NO por parte de los macrófagos es esencial en la defensa del hospedero contra la amiba. El tratamiento con anticuerpos anti-TNFα inhiben 99

Amibiasis y la Biología de Entamoeba histolytica

la liberación de TNFα, la producción de NO y la actividad amebicida por parte de los macrófagos murinos activados

Lin JY 1994

E. histolytica debe adherirse a la célula blanco para ejercer su actividad lítica, la adherencia está mediada por una región rica en cisteina de 170 kDa, subunidad de la lectina inhibible por la galactosa Gal-lectin 1987,

Petri

Chadee K

1987

, esta molécula es un antígeno inmunodominante que es reconocida por el 90% de los sueros de pacientes con amibiasis Petri 1987. Los linfocitos aislados de pacientes tratados o de animales inmunizados con la Gal-lectin, producen interleukina 2 (IL-2) e interferón gamma (IFN). Los macrófagos murinos de médula, ósea estimulados por la molécula Gal-lectin producen TNFα y NO con actividad citotóxica para las amibas (figura 54). La célula que aparentemente confiere la resistencia natural a la amibiasis es el macrófago. Por otro lado, se encontró que los macrófagos de sangre periférica las células del bazo y las células mononucleares perifonéales de hámster previamente inmunizados, mataban a los trofozoítos de E. histolytica. Los componentes de E. histolytica pueden inducir directamente la expresión del gen de IL-8 en las células epiteliales del colon humano y este hecho fue demostrado por la observación de la acumulación de IL8 en RNA mensajero y la secreción incrementada de la proteína IL-8. La regulación elevada del gen IL-8 en las células T 84 en respuesta a los componentes de este protozoario es causada probablemente por la acumulación de IL-8 en RNA mensajero a través de un mecanismo de transcripción y esto induce a una respuesta en la iniciación de la inflamación amibiana 10 0

Amibiasis y la Biología de Entamoeba histolytica

aguda en el intestino del huésped antes del contacto célula- célula o antes de la colitis amibiana

Yu 1997

Los neutrófilos aparecen para jugar un rol proyectivo, especialmente en las primeras etapas de infección, con estos resultados, mientras este efecto protectivo es mediado directamente por las amibas patógenas hacia los neutrófilos por un rol cambiante y que físicamente contiene el absceso hepático amibiano hay que seguir investigando

Seydel KB 1996

Interacción entre los Leucocitos Polimoronucleares Neutrófilos y E. histolytica. La interacción del parásito E. histolytica con los leucocitos resulta una reacción interesante pues ambas células son equiparables en tamaño forma y funciones básicas como: locomoción, quimiotaxis, adherencia, citólisis y fagocitosis / trogocitosis. Se ha encontrado que trofozoítos axénicos de E. histolytica tienen la habilidad para destruir neutrófilos, monocitos y macrófagos sin algún efecto en la viabilidad del parásito Salata

1986

(figura 54) El parasito produce el factor inhibidor de la locomoción de monocitos (FILM) este tiene actividad antiflamatoria e inhibe la producción de óxido nítrico y el estallido respiratorio modulando a los macrófagos y neutrófilos Rico 2003. El encuentro más importante se observa entre el trofozoítos de amiba y los leucocitos neutrófilos que por lo común constituyen la primera línea de defensa de las células inflamatorias; la interacción de estas dos células provoca en primer lugar la atracción de los neutrófilos hacia las amibas, después el neutrófilo se adhiere a la 10 1

Amibiasis y la Biología de Entamoeba histolytica

amiba virulenta, extiende sus seudópodos y los ancla firmemente sobre el parásito; pocos minutos después la motilidad, la actividad de superficie y la apariencia general del leucocito empieza a cambiar bruscamente, se inicia una desgranulación rápida y extensa que convierte al leucocito en una vesícula inmóvil, redonda y casi vacía con solo unos cuantos gránulos adheridos a su pared celular interna, siendo finalmente fagocitado Rosales 2002 . Todos estos eventos ocurren bajo condiciones anaeróbicas estrictas, sin pérdida de la viabilidad amibiana. Ni siquiera más de mil neutrófilos por amiba, ni la presencia de anticuerpos antiamibianos o del complemento impiden que la amiba virulenta destruya los leucocitos

Kretschmer RR 1993

A pesar de estos datos contradictorios, está claro que la destrucción de los neutrófilos contribuye substancialmente a producir daño en el hospedero por la liberación de elementos oxidativos y no oxidativos como proteinazas neutras, catepsinas, lisosimas, etc.; logrando las amibas resistir la acción de estos productos

Kretschmer RR 1993

Por su parte los polimorfonucleares eosinófilos y basófílos no logran ser más efectivos que los PMN para eliminará las amibas, más aun los eosinófilos son fagocitados por la amiba in vivo, mientras que los basófílos de pacientes con abscesos amibianos son más propensos a liberar su contenido histaminico después de la exposición al antígeno amibiano, en comparación con basófílios no expuestos

Kretschmer RR 1993

10 2

Amibiasis y la Biología de Entamoeba histolytica

Muertes de células por contacto

AMOEBA PGE2

H2O2 / O2 IL-1 y la IL-8

FILM NEUTROFILO PGE Incapacidad del neutrófilo para lisar la E. histolytica por presencia superoxido dismutasas, oxido reductasas y otros mecanismos.

LPS

MACROFAGO

220 KDa

Factor de supresión

ENTEROCITO Disminución de proliferación ▼ IFN gamma ▲ IL-4 IL-10

LINFOCITOS

Alteración presentación de antígenos, ▲PGE2, ▼FNT alfa, ▼IL-1, ▼ON, ▼H2O2-O2

│Figura

54 Ilustración de Interacción entre E. histolytica, macrófagos, linfocitos T y neutrófilos. LPS: Lipopolisacáridos, FILM: Factor inhibidor de la locomoción del monocito; IFN: interferón, FNT: Factor de necrosis tumoral. ON: óxido nítrico, IL: interleucina, PGE2: prostaglandina E2. Tomado y modificado de www.revmed.unal.edu.co/.../v6n1s/v6sup1r1.htm José Araujo 2020, #prof.josearaujo, #joseraujoblanco

Respuesta mediada por el complemento

Los trofozoítos de E. histolytica activan el complemento por via clásica y alternativa, pueden inducir al componente B y Bb al igual que activan la vía clasica hacia C3b a sus membranas sin la existencia de anticuerpos específicos (figura 55). Este proceso puede facilitar la opsonizacion y destruccion celular por celulas fagocíticas, sin embargo no siempre de esta manera debido a los mecanismos que posee el parasito para evadir la respuesta inmunitária, sin embargo este proceso puede tener un papel protector que evita la diseminación de trofozoítos al intestino 10 3

Amibiasis y la Biología de Entamoeba histolytica

La interacción entre E. histolytica y el complemento resulta interesante, puesto que se ha observado repetidamente desde hace algunos años la activación de la vía clásica y alterna del complemento, siendo más intensa la primera e incluso sin la participación de anticuerpos específicos contra la superficie de la amiba Calderón y Schreiber 1985

la resistencia a la lisis mediada por el complemento ha sido considerado como un marcador in vitro de la virulencia amibiana

Reed S 1986

Tanto E. dispar como E. histolytica activan la vía alternativa del sistema del complemento in vitro. Además, ha sido demostrado que anticuerpos anti Entamoeba histolytica activan la vía clásica de este sistema. Sin embargo, E. histolytica, sobre todo las cepas más virulentas, evade los efectos biológicos que se derivan de la acción de los fragmentos C3a, C3b y C5a resultantes de la activación del sistema del complemento Nakada Tsukui 2016. El C3 es la molécula en que convergen las vías de activación, clásica y alternativa, del sistema del complemento Su estructura la forman dos cadenas polipeptídicas, ß unidas una a otra por puentes disulfuros. Las proteasas amebianas dependientes de cisteína rompen el enlace peptídico entre los aminoácidos 78 y 79, Ser y Asn respectivamente de la cadena α con la formación de los fragmentos C3a (segmento amino-terminal de la cadena α) y C3b (formado por el resto de la molécula C3). C3a es un péptido con actividad de anafilotoxina y, por tanto, promotor de inflamación. Varios estudios han demostrado que inmediatamente después de la formación de C3a, las proteinazas cisteín dependientes 10 4

Amibiasis y la Biología de Entamoeba histolytica

de E. histolytica continúan rompiendo enlaces peptídicos de la misma con la aparición de fragmentos aún más pequeños, que en modelos in vitro de inflamación; por ejemplo, la agregación de plaquetas de cobayo, no conservan la actividad biológica de aquella molécula. Se ha reportado la degradación por medio de proteinazas sobre la molécula C5a, la más potente de las anafilotoxinas, también devenida de la activación del sistema del complemento. Una vez formado el fragmento C3b, la activación secuencial de los componentes terminales del sistema del complemento (de C5 hasta C9) puede llevar a la integración la cascada enzimática que lleva a la formación del complejo de ataque (membrane attack complex) MAC (C5b-9) y a la lisis de la célula sobre la cual se desarrolla esta cascada de reacciones. Esto es lo que parece ocurrir cuando esta cadena de eventos tiene lugar sobre la superficie de la membrana citoplasmática de trofozoítos de E. dispar (figura 55). Sin embargo, cuando el proceso de formación del MAC se produce sobre la superficie de trofozoítos de E. histolytica. En particular en el caso de las cepas más virulentas, la secuencia de eventos no termina en la lisis amibiana. Dos explicaciones, ambas con bases experimentales y no necesariamente excluyentes, han sido adelantadas para contribuir a la comprensión de este fenómeno. La resistencia de E. histolytica a la lisis mediada por el complemento es una propiedad genética de este protozoario, pues una molécula de su superficie, la lectina Gal/GalNAc, media la inhibición de la formación del MAC. Esta consideración está basada en el parecido 10 5

Amibiasis y la Biología de Entamoeba histolytica

estructural de la lectina, demostrada mediante análisis secuencial y el uso de anticuerpos monoclonales, con la molécula CD 59, un inhibidor del MAC en células sanguíneas humanas, de esta manera no se puede realizar la unión del C9 al complejo C5b678 del complemento (figura 55). La resistencia de cepas de E. histolytica a la lisis mediada por el complemento es una propiedad adquirida por estas cepas en su interacción con el hospedero. Este planteamiento encuentra soporte en dos hallazgos: -El más alto ritmo de eritrofagicitosis de las cepas más virulentas, resulta en una más amplia incorporación de las moléculas, regulatorias (por Ejemplo, CD 59) a su superficie. -Cepas de E. histolytica susceptibles a la acción del complemento, se hacen resistentes a este mecanismo lítico cuando son incubadas con una fuente de proteínas reguladoras, por ejemplo, suero humano. Calderón y colaboradores en 1985 midieron la activación del complemento por la amiba y observaron que el trofozoítos cuando se incuba con suero humano normal es capaz de fijar 5 a 6 veces más moléculas de C3b que cuando se incuba con suero inactivado por el calor. Esta fijación por lo general produce lisis de la mayoría de los trofozoítos; donde se observa que las cepas virulentas generalmente resisten la lisis por el suero humano fresco, a diferencia de las cepas no virulentas, sin embargo, no se observa diferencias significativas en la activación del complemento por ambas cepas Reed S 1986, Calderón 1986. Por otra parte, trofozoítos que han perdido la 10 6

Amibiasis y la Biología de Entamoeba histolytica

susceptibilidad a la lisis del complemento mediante la exposición a una serie de tratamientos con suero humano normal (SHN), han demostrado resistencia a la destrucción por dicho suero y suero de hámster, además presentan un aumento en la capacidad de producir absceso hepático amibiano en hámster

Calderón J

1985

. Esto fue interpretado como una evidencia que la resistencia a la lisis por el suero normal también incrementa la virulencia de la cepa, además esta resistencia pareciera ser un evento adquirido más que una propiedad intrínseca (genética). Varias evidencias señalan la adquisición de resistencia al complemento in vitro por el efecto de incubación con cantidades crecientes de suero humano normal, e in vivo al ser pasadas por hígado de hámster. Más recientemente demostraron la adquisición de resistencia al complemento por la incorporación a la membrana de las amibas susceptibles de proteínas reguladoras del complemento, puesto que la resistencia a la lisis se revierte después que cesa el tratamiento con el suero humano normal. Se ha encontrado que la resistencia de las amibas a la acción lítica el complemento pudiera variar dependiendo de las condiciones de ensayo, incrementándose en cultivos por largos periodos de tiempo con bajas concentraciones de suero, igualmente el hallazgo de cepas no patogénicas resistentes a la lisis por la vía alterna del complemento y no por la clásica, manifiesta la necesidad de estudios más detallados de los mecanismos de activación del complemento por el parásito, o al menos, de los procesos puestos en práctica por la amiba para evadir la lisis mediada por este sistema. 10 7

Amibiasis y la Biología de Entamoeba histolytica

E. histolytica posee la capacidad de inhibir la lisis mediada por el complemento bloqueando el ensamblaje de las proteínas C8-C9 o complejo de ataque a la membrana (MAC). Se ha señalado que una adhesina de membrana inhibible por la galactosa comparte una secuencia de aminoácidos idéntica con la proteína de superficie CD-59 un inhibidor del MAC en las células sanguíneas humanas

Matisajevic AE 1996

Amiba

AMIBA Vía clásica

Vía Alterna

Vía Lectinas Complejo antígeno anticuerpo

Cistein proteasa

C1q

C3(H2O)

C1r C1s

MBL MASPs

degradación C3a residuos Ser y Asn en las posiciones 78 y 79

Factor B

C4 + C2 C4b

C5aR

C2a

C3 convertasa

C3b C3

Factor D

C3 convertasa

C3a

C3b

Anafilotoxina C4b

C2a

C3aR

C3b

Lectina Gal/GalNAc

C3b

inhibe la unión

C5 C5a

Opsonización

C5a

CD59

Anafilotoxina Diversas células del sistema inmunitario

C5b

C6 C9

MAC

Lisis

C7 C8

│

Figura 55 Represetación esquemática de la via del comlemento, Entamaba histolytica, posee proteasas que degradan dos fuertes anafilotoxinas la C3a y la C5a, disminuyendo los efectos quimioatrayentes. La lectina de adherencia Gal/GalNAc posee una zona de unión similar al CD59 que inhibe la unión de las proteínas C8 y C9, evitando la formación del complejo de ataque a la membrana MAC, Jose Araujo 2020, José Araujo 2020, #prof.josearaujo, #joseraujoblanco

10 8

Amibiasis y la Biología de Entamoeba histolytica

MECANISMOS DE EVASIÓN DE LA RESPUESTA INMUNITARIA DEL PARÁSITO. E. histolytica es capaz de interactuar con todos los componentes de la respuesta inmunológica in vitro y por ende, probablemente in vitro. La E. histolytica evade exitosamente la respuesta de inmunidad humoral del hospedero A través de mecanismos que no parecen incluir variación antigénica, sin embargo, existen evidencias de que ocurren rápidas redistribuciones de las proteínas de membrana de la amiba en presencia de anticuerpo, es decir, una redistribución sobre la superficie donde existen anticuerpos adheridos, lo que conduce a la formación de casquetes que sé internalizan o dispersan, protegiendo a la amiba de destrucción por los mismos anticuerpos o de la lisis mediada por el complemento. Las amibas tienen la capacidad de renovar y sintetizar su membrana, incluso se ha calculado que puede renovar su membrana celular por completo en aproximadamente veinte minutos. Por otro lado, los anticuerpos que se unen a la membrana de las amibas pudieran ser digeridas por potentes proteasas inespecíficas

Peréz-Monfort 1994

Se ha señalado que el trofozoítos posee una cistein proteasa, similar a la responsable de la degradación de la IgA, capaz de inhibir la acción quimiotáctica y vasodilatadora de C3a y C5a, mediante la lisis de las mismas

Matisajevic AE 1996

Se ha visto que algunos de los parásitos que internalizan o dispensan los complejos inmunes que se colocan sobre las membranas, recuperan su motilidad 10 9

Amibiasis y la Biología de Entamoeba histolytica

después de casi dos horas y ya no se vuelven a inmovilizar por suero inmune, de igual forma se han observado que las que primero forman casquetes y luego internalizan los anticuerpos unidos no logran fijar más anticuerpos y nos son susceptibles a inmovilización repetida, indicando que el parásito posee una capacidad moduladora de antígenos de superficie

Peréz-Monfort 1994

E. histolytica como se mencionó anteriormente posee la capacidad de inhibir la lisis mediada por el complemento bloqueando el ensamblaje del complemento de ataque a la membrana mediante las moléculas de superficie que tienen ciertas secuencias de aminoácidos idénticas a moléculas regulatorias del complemento presentes en las células humanas. Además, se ha señalado que la amiba carece de ácido siálico, el cual es usado por las bacterias para evadir la vía alterna del complemento. La supresión de la función de las células T y de los factores antiinflamatorios dirigidos contra los componentes inflamatorios tardíos. Los mecanismos de evasión que usa la amiba contra los fenómenos de inmunidad celular pueden ser muy críticos y relevantes que los observados en la inmunidad humoral en cuanto a la protección del hospedero, es decir, para determinar el balance entre comensalismo y la invasión

Peréz-Monfort 1994.

Propiedades antigénicas del parásito Se han estudiado diferentes antígenos de cepas axénicas E. histolytica:como células enteras, homogeneizados de fracciones subcelulares (particuladas ysolubles), fracciones antigénicas de pesos moleculares específicos (PM) y productos de secreción-excreción Kretschmer RR 1993. 11 0

Amibiasis y la Biología de Entamoeba histolytica

El entendimiento de las reacciones inmunes durante la amibiasis, se complica por el gran número de componentes antigénicos que posee E. histolytica, la caracterización de dichos componentes, ha representado una de las principales metas en el estudio de este parásito. Los primeros estudios que definieron las principales características de E. histolytica usaron extractos totales del protozoario obtenidos de cultivos polixénicos, contaminados con hongos y bacterias. Con el desarrollo del método de cultivo axénico fue posible producir antígenos sin tales contaminantes, lo que ha permitido estudiar mejor las propiedades que definen y distinguen a las cepas de E. histolytica. Basándose en estudios inmunoelectroforéticos de los extractos acuosos de amibas cultivadas axénicamente virulentas y no virulentas, se ha llegado a la conclusión, que la estructura antigénica de la E. histolytica contiene entre 14 y 32 componentes antigénicos y el grado de variabilidad con que se presentan éstos antígenos se debe al recambio periódico desde la membrana al citoplasma o viceversa, además del ocultamiento de antígenos de superficie. Esto podría explicar la aparición de reinfecciones en individuos que sufrieron de un proceso intestinal agudo y a la invasión intestinal en pacientes con elevados títulos de anticuerpos anti - E. histolytica, ya que los anticuerpos sintetizados no tienen especificidad contra los nuevos antígenos expresados sobre la superficie de la amiba, lo que constituye un mecanismo de evasión de la inmunidad mediada por los anticuerpos Gonzalez 1994

Martinez A

. 11 1

Amibiasis y la Biología de Entamoeba histolytica

Existen otras evidencias experimentales que demuestran la complejidad estructural de la amiba: la cromatografía del extracto amibiano crudo con gel sephadex G-200 revela 5 fracciones, de las cuales 3 fracciones (I, II y III) de alto peso molecular inmunoprecipitaron, y de éstas, la fracción I hemaglutina con sueros reactivos. La inmunización de cobayos con las 3 fracciones indujeron protección contra la amibiasis experimental, cuando fueron sometidos a la infección por E. histolytica la fracción I de PM 650 kDa produjo el mayor grado de protección (entre el 90 al 100%) aun cuando las 3 fracciones compartían antígenos por inmunoprecipitación RR 1993

Kretschmer

En otro extracto soluble entero de la cepa NIH-200 de E histolytica, igualmente se encontraron las 5 fracciones antes mencionadas, las cuales presentan un PM comprendido entre 9-150 kDa cuando se corrían electroforéticamente en geles de poliacrilamida bajo condiciones desnaturalizantes con SDS (SDS- PAGE). El mismo extracto soluble presentó 7 polipéptidos inmunoabsorbido col anticuerpos IgG humano antiamiba, y 8 bandas por western blot. Debido a su gran complejidad, la E. histolytica es un organismo antigénicamente poco uniforme, por lo que se requieren de muchos estudios basados en el seguimiento de antígenos altamente purificados e inmunogénicos con el propósito de ser utilizados en el estudio serológico de la amibiasis Kretschmer RR 1993, Tachibana H 1991 . Parkhouse y col en 1978 consideraron que los antígenos de superficie de la E. histolytica son de mayor interés inmunológico, como la glicoproteína de 81 kDa 11 2

Amibiasis y la Biología de Entamoeba histolytica

radiomarcada con iodo-125

Parkhouse M 1978

Posteriormente, otros investigadores marcaron 12 glicoproteínas de superficie identificadas por autorradiografía comprendidas entre 12 a 200 kDa, datos que contribuyen a hablar en favor de la complejidad de la membrana de E. histolytica. Joyce y Ravdin en 1988 identificaron 6 proteínas de superficie entre 19.5 a 170 kDa por iodinación competitiva de lactoperoxidasa, cuyo extracto fue sometido con inhibidores de proteasas y corrido en SDSPAGE. De las 6 proteínas de superficie, 3 (37, 90 y 170 kDa) presentan una estructura proteica con carbohidratos (glicoproteínas) el cual es demostrado mediante la unión específica a la Con A; y 2 de ellas (37 kDa y 90 kDa) fueron reconocidas por el suero de pacientes con absceso hepático Kretschmer RR 1993, Joyce y Ravdin 1988 .El uso de anticuerpos monoclonales ha permitido definir antígenos de superficie de naturaleza proteica, así como también es posible que reconozcan un determinante antigénico de superficie de la membrana de E. histolytica. Una de estas proteínas es la de 96 kDa Torian BE 1987, Urdaneta H 1996. Por otra parte, a través de diferentes métodos se han identificado otras proteínas de superficie (entre 112 a 220 kDa) involucradas en la adhesión in vitro de los trofozoítos de E. histolytica a eritrocitos humanos, células epiteliales y ováricas de hámster. Entre la que se encuentra una lectina de adherencia Gal/GalNAc de 170 kDa la cual se denomina de esta forma por ser inhibida por el ácido N-acetil-D-galactosamina (GalNAc) y por la galactosa (Gal) Martinez A Gonzalez 1994, Mesa I 1987. La proteína de 112 kDa es denominada "adhemiba" Martinez A Gonzalez 1994 . 11 3

Amibiasis y la Biología de Entamoeba histolytica

Existen otras proteínas de membrana que tienen la propiedad de formar canales de difusión, por lo que se ha denominado "amebaporo". Gracias a esta propiedad, se ha sugerido que la proteína se puede insertar en la membrana de la célula blanco y funcionar como un ionóforo Martinez A Gonzalez 1994. La propiedad antigénica de tales materiales resulta desconocida pero se ha observado que los pacientes convalecientes de una amibiasis invasiva regularmente presentan anticuerpos contra estas lectinas Kretschmer RR 1993. Se han sugerido la presencia de carbohidratos sobre la superficie del parásito debido a que la Con A aglutina la amiba a través de los residuos de mañosa o glucosa, y a la activación de la vía alterna de complemento. A partir del fosfoglicano lipopéptido (LPPG con un contenido de carbohidratos del 85% y de proteínas del 8% y el resto de lípidos y fosfatos) obtenido de cepas de E. histolytica virulenta (HM1-IMSS) y no virulenta (HK-9), se ha purificado un antígeno rico en polisacárido (ARP) de superficie constituido por glucosa, galactosa y xilosa, libre de glucógeno, el cual reacciona fuertemente con el suero de pacientes con absceso hepático Kretschmer RR 1993. La baja inmunogenicidad de los antígenos de E. histolytica se ha atribuido al ocultamiento intracelular de los mismos, a la rapidez excesiva del recambio de proteínas desde el citoplasma a la superficie y viceversa, así como también a la expresión periódica de los antígenos de superficie. Además, se encuentra la baja expresión in vitro de antígenos de superficie en cepas de amiba que in vivo son metabólicamente activas Kretschmer RR 1993. En general, los lípidos son pobres inmunógenos, sin embargo se ha identificado un lípido altamente 11 4

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inmunogénico, el aminoglicofosfolípido el cual representa aproximadamente el 3.8% del total de lípidos amibianos. Los anticuerpos específicos contra este lípido no reaccionan con los lípidos totales del medio de cultivo, pero si reaccionan cruzadamente con el LPFG, lo que hace suponer que la fracción lipídica del LPFG presenta un epítope similar con el Martinez A 1994 aminoglicofosfolipido . Otro de los materiales que han tenido especial atención en el repertorio antigénico de la amiba, son los antígenos citoplasmáticos que corresponden a todas aquellas proteínas que no son reveladas por el marcaje de superficie de las membranas externas. Existe una serie de antígenos citoplásmicos bien definidos, cuyo origen está en las organelas del citoplasma, tales como Martinez A 1994

las fracciones lisosomales y ribosomales . Estas fracciones se obtienen por ultracentrifugación diferencial de homogeneizados de E. histolytica. La fracción lisosomal se caracteriza por su contenido en fosfatasa ácida y por microscopía electrónica revela precipitaciones electrondensas cuando se expone al suero de pacientes con abscesos hepáticos. El material es inmunogénico (aún en primates) y protege contra la amibiasis experimental. Entre tanto, en la fracción ribosomal se han encontrado las proteínas ácidas y básicas comprendidas entre 14 a 112 kDa y carece de una proteína de 54 kDa, la cual se encuentra normalmente en todos los sistemas procarióticos y eucarióticos estudiados hasta la fecha y se desconoce el significado de su ausencia Kretschmer RR 1993 . Otra proteína de origen citoplasmático, diferente a las otras proteinasas de la E. histolytica, es la de 60 kDa 11 5

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con actividad cistein proteasa involucrada en la modificación de la actividad de la vía alterna del complemento al degradar el C3 en dos fracciones activas (C3α y C3ß), así como también es capaz de inducir la producción de anticuerpos específicos en pacientes con absceso hepático amibiano

Rangel A 1996

También, se ha encontrado que la E. histolytica cultivada axénicamente libera complejos de toxinas proteicas (exotoxinas) que son proteínas citoplasmáticas y forman parte de los productos metabólicos, las cuales pueden inhibirse con sueros normales o inmunes, demostrándose indirectamente que las exotoxinas son capaces de inducir una respuesta inmunológica de tipo humoral. Entre las exotoxinas se encuentran las enzimas comprendidas entre 23 a 25 kDa; la de 30 KDa está relacionada con una lectina inductora de la producción de anticuerpos específicos Kretschmer RR 1993, Martinez A 1994. Estas proteínas se unen fuertemente a través de uniones hidrofóbicas o pasivas a la albúmina del suero bovino presente en el medio axénico sobre la amiba. Pero no se conoce in vivo si la E. histolytica es capaz de parecerse o captar antígenos propios del hospedador como lo hacen otros parásitos, en particular el S. mansoni, el cual atrapa sustancias del grupo sanguíneo y antígenos de histocompatibilidad del hospedador para ser usados como mecanismo de evasión Kretschmer RR 1993. El estudio de los antígenos específicos de la forma enquistada de la E. histolytica no se ha llevado a cabo porque los quistes no se han podido obtener in vitro. Se ha observado que los antígenos específicos del quiste de E. histolytica reaccionan cruzadamente con los de E. invadens, la amiba de los reptiles Kretschmer RR 1993. 11 6

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La caracterización de los diferentes elementos antigénicos del género E. histolytica así como sus propiedades inmunógenas y patogénicas han sido estudiados por diferentes métodos con miras a orientar y diseñar pautas y procedimientos diagnósticos, así como la producción de vacunas, estrategia clave en los programas de prevención de enfermedades infecciosas. El 90% de los sueros de pacientes con absceso hepático amibiano reconocen principalmente ocho péptidos con pesos moleculares entre 46-220 kDa, muchos de ellos reconocen fundamentalmente dos péptidos de superficie de 130 y 96 kDa Mesa I 1994, Urdaneta H 1996 . Los antígenos de superficie son de especial interés, por ser ellos, los que posiblemente desencadenen una respuesta protectora que ayude a detener la invasión de la amiba hacia los tejidos del hospedador o las reinfecciones.

División y Ciclo Celular

Ha sido difícil de estudiar el mecanismo de la división nuclear de E. histolytica debido a que los componentes nucleares no pueden ser visualizados por microscopía de luz por ser tan pequeños y además fue difícil obtener cultivos sincrónicos por mucho tiempo. En la división nuclear procede sin disolución de la membrana nuclear, fue recientemente identificado el huso acromático por Gómez-Conde E 1996. y no se han encontrado centríolos. Estructuras que pudieran corresponder a los cromosomas han sido reportadas por diferentes autores, pero no hay consenso sobre su número. Se han detectado por MET, en núcleos a en división, entre 12 y 16 estructuras que pudieran ser cromosomas por su electrodensidad, apariencia de cromatina, asociación con microtúbulos y movimiento 11 7

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durante el ciclo celular

Gómez-Conde E 1996

Basados en estudios de videomicroscopía y tinciones específicas de DNA proponen que exista un centro organizador de microtúbulos (MTOC) y seis cromosomas y. Apareciendo en núcleos con división, en los que los cromosomas duplicados pudieran haberse ya separado. En experimentos de electroforesis en campos pulsados (PFGE) se ha resuelto un número variable de bandas y de acuerdo a estudios de hibridación con sondas de telómeros, genes ribosomales y otros genes, se han propuesto la presencia de seis a ocho moléculas de DNA lineales de diferentes tamaños que contienen genes estructurales y posibles secuencias teloméricas.

La fase D es equivalente a la M • • • • •

• 3-5 h

• 1-2 h Fase G2 Fase S

• 4-6 h

Profase, núcleo ovoide Metafase, DNA condensado Anafase Temprana, alargamiento del núcleo Anafase Tardía, distribución uniforme de cromosomas Telofase, separación del núcleo

Fase D Fase G1 • 4-5 h

│

Figura 56 Represetación de las fases del ciclo celular del parasito Entamaba histolytica, Fase G1 entre 4-5 horas, Fase S de 4-6 horas, la Fase G2 entre 3 y 5 horas, y la Fase D equivalente a la Fase M con 5 estapas características, Jose Araujo 2020, José Araujo 2020, #prof.josearaujo, #joseraujoblanco

11 8

Amibiasis y la Biología de Entamoeba histolytica .

Estas moléculas podrían corresponder cromosomas sin embargo, falta clonar el centrómero y los telómeros que deberán poseer para ser llamados cromosomas. Hay además en el núcleo de este parásito moléculas de DNA circular de diferente tamaño. La división nuclear de E. histolytica se lleva a cabo de manera parecida a la de los eucariontes superiores (figura 56); se han reportado cuatro fases: profase, anafase temprana, anafase tardía y telofase por Orozco y col. (1988) y recientemente Gómez-Conde y col. (1997) encontró que existe también una metafase en la cual se forma un huso acromático Gómez-Conde E 1996, Orozco ME 1988.

Para estudiar el ciclo celular en E. histolytica se usaron cultivos de trofozoítos sincronizados con colchicina; cada ciclo puede variar de acuerdo a las condiciones del cultivo celular entre 13 a 15 h. Se han identificado una fase G1 con una duración de 4-5 h, una fase S de 4-6 h, una fase G2 de 3-5 h y una fase equivalente a la fase M la fase D de 1-2 h Orozco ME 1988.

En la mitosis (fase D), durante la profase, el núcleo presenta forma ovoide, el material periférico (RNA) está condensado, el DNA se localiza en la parte central (endosoma) y aparece un corpúsculo pequeño en la superficie del núcleo, el cual aumenta de tamaño a medida que avanza la división. La metafase descrita por Gómez Conde se caracteriza porque el DNA aparece condensado y simétricamente organizado en el centro del núcleo. Seis corpúsculos con apariencia de cromosomas aparecen 11 9

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duplicados; en la parte central hay un corpúsculo asociado a los cromosomas y positivo para las tinciones de DNA, el cual podría corresponder al centro organizador de microtúbulos (MTOC)

Gómez-Conde E 1996

El RNA se condensa en los polos nucleares. El anafase temprana se caracteriza por un alargamiento del núcleo, se inicia la separación equitativa de los cromosomas. Durante la anafase tardía, los cromosomas terminan su distribución uniforme y se inicia el movimiento de éstos hacia los polos. El RNA se encuentra ya distribuido cerca de la membrana nuclear del núcleo en división. En la telofase (figura 56) hay un alargamiento del núcleo para iniciar la separación del núcleo hijo. Continúa la migración del DNA hacia los polos de lo que serán los dos núcleos hasta que éstos se separen por estrangulamiento. El movimiento de los rnicrotúbulos durante la división nuclear de E. histolytica se estudió por Solis y Barrios (1991), quienes además reportaron dos tipos de vesículas intranucleares organizadas en grupos, presentes durante la división nuclear, y localizadas cerca de la periferia del núcleo Solis y Barrios 1991

. A la división nuclear sigue la cariocinesis, es decir, la división celular.

Genómica del parásito Los trofozoítos amibianos en cultivo cambian frecuentemente sus fenotipos, pierden la virulencia en cultivos axénicos, la cual recuperan si se pasan por hígado de hámster, disminuyen o aumentan su capacidad de fagocitosis / trogocitosis y presentan una resistencia variable a la lisis por complemento humano, y la más interesante es que las clonas obtenidas de una población clonal también presentan estos cambios. Sin 12 0

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duda alguna, la gran variabilidad de E. histolytica, tanto entre cepas como entre poblaciones clonales, se puede explicar en buena medida mediante el estudio de la organización y la expresión genética.

Contenido del DNA

Los datos sobre su contenido de DNA y ploidía son confusos. Por experimentos de cinética de complejidad del DNA (curvas Cot), basados en la separación de las cadenas de DNA y su velocidad de renaturalización a baja temperatura, el tamaño del genoma haploide de los trofozoítos de E. histolytica es aproximadamente 0.033 pg (107.5 pb) y su contenido de DNA nuclear en fase serni-log es de 0.45 pg. Lo que indicaría que la amiba es 14n. Sin embargo, varios grupos han encontrado que la cantidad de DNA de cepas y clonas cultivadas axénicamente varía Albach RA 1989, Gelderman AH 1971, López-Revilla y Gómez 1978 . En la cepa HK9 el contenido de DNA varía de 0.452.21 pg / célula, lo que equivaldría a un genoma amibiano de 40 a 400 Mb se ha encontrado que la cepa HK9 tiene 3.5 pg, la clona A (cepa HMI:IMSS) tiene 10.32 pg, la clona L-6 (cepa HMI:IMSS) tiene 4.52 pg, la clona C2 (cepa HMl:IMSS) tiene 6.4 pg, y la cepa HM38 tiene aproximadamente 10 pg de DNA/ trofozoíto López-Revilla y Gómez 1978 . En 1995 Dvorak y col demostraron que por citometría de flujo (FMC) encontraron que E. histolytica es hipoploide durante la fase exponencial de crecimiento, ya que tiene 20% menos de DNA con respecto a la obtenida durante la fase diploide, la cual, según estos autores es de 0.24 pg de DNA / célula Dvorak 12 1

Amibiasis y la Biología de Entamoeba histolytica JA 1995

La gran diversidad en la cantidad de DNA reportada por muchos autores podría ser explicada por fenómenos de amplificación y pérdidas de DNA debido a condiciones del medio de cultivo. Es sabido que cambios en los reactivos del medio en que se cultivan estos parásitos producen estrés en las células y éste podría estar implicado en las variaciones en la cantidad de DNA, las cuales a su vez podrían estar relacionadas con los cambios de virulencia de las cepas amibianas.

│

Figura 57 Ilustrasion de Polimorfismos de E. histolytica detectado por PCR tomado y modificado de www.lshtm.ac.uk/.../clarklab/histolytica2.html #prof.josearaujo, #joseraujoblanco.

Secuenciación Completa del Genoma de Entamoeba histolytica La secuenciación del genoma (figura 58) tiene un papel importante en la investigación para conseguir mejores, diagnósticos moleculares, el metabolismo y diversas pistas que permitan conseguir indicios para el tratamiento así como para la producción de una vacuna 12 2

Amibiasis y la Biología de Entamoeba histolytica

efectiva. En este punto se ve beneficiado el proceso por un conjunto de herramientas derivadas de la omicas para el análisis post genómico y expresión de genes utilizando microarrays o secuencia transcriptómica completa. Para ello y como resultado se han generado base datos que pueden ser utilizadas y reutilizadas para el provecho de los investigadores tal es el caso de la base de datos en línea EuPathDB, el cual es un excelente recurso de hecho los beneficios obtenidos de estos han aumentado considerablemente nuestra comprensión de la biología de estos organismos, conocimiento que puede usarse para combatir las enfermedades que causan. A demás de los estudios y métodos de biología molecular que han permitido con la utilización de sondas específicas, para la diferenciación de las dos especies

TACHIBANA H 1991

, y su aplicación diagnostica o en SILBERMAN JD 1999 ROGER AJ 1999

estudios de biología evolutiva . El secuenciamiento completo del genoma de E. histolytica se ha podido identificar mediante el uso de computadoras los diversos genes presentes

BHATTACHARYA

A 2000a BHATTACHARYA A 2000b

así como también los genes involucrados en proteínas con funciones de adherencia CHENG

2001

polimorfismo 2002 .

al igual que la determinación de (figura 57) de diversas cepas PRAKASH A

La secuenciación del genoma es importante en la investigación científica ya que permite, avances el diagnóstico molecular, el metabolismo y permite conseguir indicios para el tratamiento y la producción de una vacuna efectiva. En este punto se ve beneficiado el proceso por un conjunto de herramientas derivadas de la omicas para el análisis post genómico y expresión 12 3

Amibiasis y la Biología de Entamoeba histolytica

de genes utilizando microarrays transcriptómica completa.

secuencia

Para ello y como resultado se han generado base datos que pueden ser utilizadas y reutilizadas para el provecho de los investigadores tal es el caso de la base de datos en línea EuPathDB, el cual es un excelente recurso de hecho los beneficios obtenidos de estos han aumentado considerablemente nuestra comprensión de la biología de estos organismos, conocimiento que puede usarse para combatir las enfermedades que causan. A demás de los estudios y métodos de biología molecular que han permitido con la utilización de sondas específicas, para la diferenciación de las dos especies

TACHIBANA H 1991

, y su aplicación diagnostica o en

estudios de biología evolutiva

SILBERMAN JD 1999 ROGER AJ 1999

El secuenciamiento completo del genoma de E. histolytica se ha podido identificar mediante el uso de computadoras los diversos genes presentes

BHATTACHARYA

A 2000a BHATTACHARYA A 2000b

así como también los genes involucrados en proteínas con funciones de adherencia CHENG

2001

al igual que la determinación polimorfimos de diversas cepas PRAKASH A 2002.

El tamaño del genoma haploide de los trofozoítos de E. histolytica es de 0.033 pg (107.5 pb) y el DNA nuclear en fase semilogaritmica es de 0.45 pg, indicando 14 n. sin embargo, varios grupos han encontrado que esto puede variar en cepas y clones en cultivos axénicos Albach RA 1989, Gelderman AH 1971, López-Revilla y Gómez 1978.

12 4

Amibiasis y la Biología de Entamoeba histolytica

La secuencia completa del transcriptóma ha permitido, el uso evaluar e identificar genes no identificados, intrones, y regiones no traducidas 5´y 3´, por sus implicaciones en la correcta expresión espacial y temporal de los genes, en donde se han identificado 100 ARN nucleolares de interés Zamorano, 2008; Hon, 2013; Kaur, 2012 . Se cree los modelos diseñados para el estudio de genomas se enfocan en secuencias que codifican proteínas y dejan de lado las regiones no traducidas, así como que estos procesos están diseñados para sistemas con poca divergencia y no son tan útiles en genomas como el del E. histolytica estos modelos, sus anotaciones y avances pueden ser estudiados en la base de dato online EuPathDB usted puede revisar el sitio https://eupathdb.org/eupathdb/ y el recurso de https://amoebadb.org/amoeba/. En la búsqueda de la generar restauraciones y curaduría de a escala de genoma, en esta última instancia cabe destacar que el papel de trabajo manual, es necesario aun, para la corrección genómica, y para que estas herramientas puedan ser útiles en el presente o un futuro cercano, lo cierto que la generación de información de este tipo requiere de trabajo colaborativo y asociado a nivel mundial. De hecho muchos nuevos resultados en el futuro estarán ligados a las redes sociales y trabajo colaborativo producto de webinar, sin dejar de lado que también en un futuro cercano la edición genética será posible sin restricciones. 1291 textos sobre genes de E. histolytica y 305 de E. dispar, este proyecto https://amoebadb.org/amoeba/ permite evaluar diversos aspectos del genoma y los 12 5

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genes estudiados como diversos textos de los genes y sus anotaciones, modelos genéticos, curación e identificadores, ubicación genómica, taxonomía, ortología, variación genética, transcriptómica, análisis de secuencia, análisis de estructura, características y propiedades proteicas, orientación y localización de proteínas, predicción de funciones, caminos e interacciones, proteómica todo un banquete de información para los equipos que estudian el genoma de E. histolytica. Pronto veremos que los diversos proyectos de ensamblaje de las secuencias genómicas de Entamoeba histolytica, harán posible el ensamblaje total del genoma de microorganismo parasito. Esto será posible con el mejorado herramientas moleculares entre la que se secuenciación de bibliotecas de BAC artificial bacteriano) útiles en el inserto tamaños de inserto (cientos de kilobases).

de diversas incluyen. La (cromosoma de grandes

Las desventajas actuales se basan que en el alto contenido de A-T lo que disminuyó la secuenciación de bibliotecas BAC, e impidió el estudio de estos vectores de clonación para la generación de una genotéca genómica más robusta en el proyecto de secuenciación original Loftus, 2005. También métodos como el mapeo HAPPY el cual se aplica para evaluar la síntesis y la orientación de varias secuencias de ADN a través de un genoma particular, y se basa en la probabilidad diferencial de que dos o más secuencias de ADN se separen y que muestran la probabilidad de un evento de recombinación entre dos loci genéticos en el mismo cromosoma siendo directamente proporcional a la distancia entre ellos, nos 12 6

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mostraran avances en la compresión del genoma. Sin embargo hasta ahora la información de este tipo aún requiere nuevos hallazgos al igual que la herramienta de los mapas de restricción de moléculas de ADN individuales, el cual está en proceso si utilidad debido a las diversas secuencias cortas que se generan para luego ser ensambladas en los diversos mapas de restricción Schwartz, 1993. Unos de los principales problemas del estudio del genoma es su enorme ADN repetitivo que en algunos momentos tiene varia kilobases de largo, entre elementos transponibles y repetitivos lo que puede producir regiones inestables que hacen en sí mismo inestable al cromosoma entre las modificaciones por ruptura e incorporaciones Lorenzi, 2010. Entre los datos que poseemos hasta ahora destacan que a pesar de que E. histolytica y E, dispar son morfológicamente idénticos sus genomas son evolutivamente bastante distantes Weedall, 2001, desde el punto de vista funcional conocemos que las familias multigenes expandidas codifican grandes cantidades de proteínas quinasas y fosfatasas, destacando la importancia de la señalización celular en respuesta a señales ambientales Clark, 2007, Anamika, 2008. Así como una familia de aproximadamente 100 genes están relacionados con proteínas transmembrana, quinasas, que consisten en un dominio extracelular y solo uno relacionado con dominio de quinasa intracelular Beck, 2005, Mehra, 2006. Además los miembros de esta familia de quinasas pueden tener papeles en la fagocitosis y en la virulencia Abhyankar, 2012 al igual que otras quinasas como (Eh C2PK) Somlata, 2011. La evidencia muestra

GTPasas, que controlan el 12 7

Amibiasis y la Biología de Entamoeba histolytica

tráfico vesicular en la célula, presentes tanto en el genoma de E. histolytica como en el de E. invadens SaitoNakano, 2005, Nakada-Tsukui, 2010 . Las funciones de otras grandes familias de genes, incluida una familia de GTPasas similares a AIG1 y proteínas similares a BspA (proteínas homólogas a proteína de unión a bronectina bacteriana fi que contiene un dominio repetido rico en leucina Lorenzi, 2010, Davis, 2006, siguen siendo desconocidos. Expresión diferencial entre las proteínas de tipo AIG1 sugiere que la familia puede tener un papel en la virulencia o en la adaptación al intestino medio ambiente Davis, 2007; Gilchrist, 2006. Por otro lado la cisteína secretada las proteasas juegan un papel en la virulencia amebiana, y una virulencia clave de la cisteína proteasa. Otro factor clave de virulencia, el Complejo de lectina Gal / GalNAc, consta de subunidades pesadas, intermedias y ligeras codificado por familias multigénicas las familias que codifican genes de subunidades pesadas y ligeras difieren en tamaño entre E. histolytica, E. dispar y E. invadens, e intermedias Los genes de la subunidad pesada se encuentran solo en E. histolytica y E. dispar pero no en E. invadens Clark, 2007. La proteína rica en lisina y ácido glutámico (KERP1) es un factor de virulencia exclusivo de E. histolytica Seigneur, 2005 existe variación intraespecífica entre genomas de Entamoeba, varios estudios han descrito intraespecificación la cual puede ser estudiada con marcadores de polimorfismo (figura 57). Inusualmente, el genoma de E. histolytica parece no contener microsatélites, aunque posee secuencias simples repetitivas, que no son útiles como marcadores, otros como el loci tRNA-STR se ha utilizado como marcador genético en E. histolytica y E. dispar Zaki, 2001¸ Feng, 2012. 12 8

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AMIBA

Receptor CXX de Kinasas

Receptor de Kinasas NCR

Proteina no fosforilada

Receptor CXC de Kinasas

Proteina fosforilada Proteina fosforilada

Receptor 7TM

Proteina no fosforilada

│

Figura 58 E. histolytica posee tres tipos de serina / treonina quinasas receptoras: un grupo tiene repeticiones CXXC en el dominio extracelular; un segundo tiene repeticiones CXC; y un tercero tiene repeticiones no ricas en cisteína (NCR). E. histolytica tiene tirosina quinasas citosólicas (TyrK), pero no receptores de tirosina quinasas. Algunas serina / treonina fosfatasas (S / TP) tienen un dominio LRR adjunto. CaBP, proteína de unión a calcio; DAG, diacilglicerol; G, proteína G; GAP, proteína activadora de GTPasa; FMAM, factor de intercambio de nucleótidos de guanina; IP 3 , inositol-1,4,5-trisfosfato; PI (3) K, fosfatidilinositol-3-OH quinasa; PIP 2 , fosfatidilinositol-4,5-bisfosfato; PIP 3, fosfatidilinositol-3,4,5-trifosfato; PKC, proteína quinasa C; PLC, fosfolipasas C; PTEN, homólogo de fosfatasa y tensina; TyrP, tirosina fosfatasa; Receptores 7TM, receptores de siete transmembranas, Predicción de las señales de mecanismos de señales de transducción basados en el análisis del genoma de Entamoeba histolytica tomado y modificado de www.nature.com/.../fig_tab/nature03291_F2.html Loftus, B., Anderson, I., Davies, R., Alsmark, U. C. M., Samuelson, J., Amedeo, P., ... & Nozaki, T. (2005). The genome of the protist parasite Entamoeba histolytica. Nature, 433(7028), 865-868, Jose Araujo 2020 #prof.josearaujo, #joseraujoblanco.

12 9

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Diagnóstico de la Amibiasis Diagnóstico Clínico La enfermedad presenta síntomas gastrointestinales que varían, desde dolor abdominal bajo con diarrea blanda, hasta formas más graves con fiebre alta, disentería, heces mucosanguinolentas, tenesmo y dolor abdominal intenso; indicando que el parásito ha invadido los tejidos más allá de la luz intestinal. Los adultos pueden también presentar colitis fulminante, ameboma o apendicitis amibiana

Ortíz-Ortiz L

1994 b

Entre las formas clínicas de amibiasis invasora, la más grave es el absceso hepático amibiano, el cual puede traer devastadoras consecuencias para el hospedero, puesto que aparte de los síntomas mencionados, con frecuencia se observa una masiva necrosis del tejido, la cual progresa si el paciente no es tratado. La amibiasis invasora puede afectar también el cerebro, pulmón, piel, y con menor frecuencia, el útero Ortiz L 1994a, Ortíz- L 1994 b . El criterio clínico establece una serie de síntomas asociados a las dos formas clínicas de la infección, la intestinal que se manifiesta fundamentalmente con colitis amibiana, diarrea y disentería o y la extraintestinal, debido a la capacidad invasiva de este parásito que puede dirigirse a otros tejidos y causar daño en ellos como en el hígado, donde se manifiesta clínicamente con malestar general, fiebre, hepatomegalia; en el pulmón que se manifiesta con tos, expectoración con esputo, dolor toráxico, lesiones en la piel donde se observan ulceras, de tipo necróticas que pueden abarcar la piel y tejido subcutáneo; y en otras 13 0

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localizaciones debido a que E. histolytica puede llegar a cualquier sitio del cuerpo, existen aunque raras veces localizaciones cerebrales donde suelen ser mortales, con destrucción de tejido cerebral denominada neningoencefalitis amibiana Cabello R 1999 , Araujo 2002, 2008.

│Figura

59 Prof. José Araujo investigador en amibiasis sus trabajos sobre aplicación de pruebas diagnósticas en diversas poblaciones ha permitido desarrollar nuevos enfoque diagnósticos con el uso de cepas de Entamoeba histolytica / Sus reconocimientos como investigador en microbiología le han valido el premio como ganador del premio en Ciencia y Tecnología a sus trabajos de investigación. José Araujo 2020, #prof.josearaujo, #joseraujoblanco

Diagnóstico Parasitológico

El diagnóstico parasitológico ha sido de vital importancia sobre todo porque con este se ha podido 13 1

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identificar al parásito en muestras biológicas, el diagnostico coproparsitológico requiere de métodos que sean simples, sensibles, específicos y reproducibles (figura 59). En la actualidad, el diagnóstico clínico de la infección amibiana requiere de confirmación parasitológica mediante la identificación microscópica de alguna forma evolutiva del parásito en las heces y es importante señalar que es útil para el analista la presencia de trofozoítos eritrofagos e identificación de sangre oculta en las heces Araujo, 2008, Beaver PC 1984. La presencia de falsos positivos ya sea porque los trofozoítos se confunden con macrófagos Ravdin Jl 1995, WHO/Paho/Unesco 1997 , por la presencia de otras estructuras en las heces, como quistes inmaduros de E. coli además de otras amibas al hacer el diagnóstico diferencial Kretschmer RR 1993 . Destrucción por procesos de autólisis de trofozoítos cuando existe demora en la realización del examen microscópico de heces de un paciente con disentería amibiana, originando falsos negativos, y la excreción intermitente de quistes hace necesario realizar un examen seriado de muestras fecales en días diferentes, con el fin de detectar, por lo menos el 80% de las infecciones Ungar BLP 1985, Walsh JA 1986 b. Este procedimiento presenta desventajas, en cuanto a su baja sensibilidad y especificidad debido a la posible confusión de células plasmáticas y amibas no patógenas además requiere de personal bien entrenado para identificar las diferentes formas evolutivas Ash LR 1987, González A 1990, Lyche KD 1997 .

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Figura 60 Prof. Jose Araujo investigador realizando análisis de muestras para su diagnóstico. Jose Araujo 2020 #prof.josearaujo, #joseraujoblanco

Diagnóstico Inmunológico Se han evaluado varias pruebas inmunológicas como herramientas diagnósticas para la detección de anticuerpos y antígenos en diferentes fluidos orgánicos: la reacción de fijación complemento, la hemaglutinación indirecta, la contra- inmunoelectroforesis, la fijación en látex, la reacción de inmunofluorescencia indirecta, la doble inmunodifusión, radioinmunoensayo, Inmunoblot y el ensayo Inmunoenzimático (ELISA) Garduño EJ 1989 , Kraoul L 1997 , Pal S 1996 , Restrepo MI 1996 , Shenai BR 1996 , Ungar BLP 1985 , Urdaneta H 1991 , Urdaneta H 1994

Se han diseñado pruebas inmunológicas que permiten la detección de antígenos amibianos en heces u otros fluidos biológicos, utilizando anticuerpos de captura policlonales y monoclonales Bhaskar S 1996 , Lyche KD 1997, Urdaneta H 1996 , Urdaneta H 1991, pruebas que son más 13 3

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sensibles y específicas que la microscopía y el análisis de Zimodemos Haque R 1994, además, tienen la ventaja de que no requieren de personal especialmente entrenado y permiten al mismo tiempo procesar un volumen elevado de muestras. La técnica de ELISA es (figura 60) uno de los métodos inmunodiagnóstico de la amibiasis más utilizado, por su alta sensibilidad y especificidad (95%100%), especialmente útil para las formas invasoras de la amibiasis, fundamentalmente durante la fase inicial del absceso hepático amibiano Kraoul L 1997, Pal S 1996 , Restrepo MI 1996, Shenai BR 1996 y para las formas invasoras en los pacientes sin diarrea, y que posean pocos anticuerpos circulantes, la sensibilidad disminuye con sueros de pacientes con infecciones amibianas no invasoras. Es de importancia establecer relaciones entre las técnicas de estudio parasitológico en sus diferentes formas evolutivas y el estudio inmunológico a traves de técnicas sensibles como que permitan estudiar áreas con alta relevancia como sectores rurales e indígenas, en el estado ZULIA, se han estudiado comunidades Indígenas Yucpas de la Sierra de Perijá que viven en condiciones de insalubridad las cuales muestran una prevalencia de 10%. Por otro lado hemos establecido un esquema diagnostico que nos permite utilizar la cepa de referencia como una herramienta para el diagnóstico de la amibiasis a bajo costo y con resultados comparables con pruebas microscópicas para disminuir el rango de error y poder tomar, medidas correctivas en todo caso esto se constituye como punto inicial de un proyecto a escala mayor para implementar mejores estrategias para paliar este mal en Venezuela Araujo J 2001, 2008. 13 4

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Evaluación de Niveles Totales Metodología para realizar esta prueba

IgG(s)

Se deben sensibilizar placas de microtitulación de poliestireno (Corning fondo plano) con ETPA como antígeno a concentración de 2 μg por pozo diluido con 100 μl de buffer carbonato - bicarbonato pH 9.6 , para luego ser incubadas por 18 horas a 4 °C tapadas y protegidas para evitar la evaporación. A la par se preparará el buffer de lavado PBS al 0.05% de Tween 20 (PBS - T) y PBS-T al 2% de caseina (PBS-TC). Las placas se lavaran con PBS -T a pH 7.2 sin rebozar en los pozos y palmando cada cubeta vigorosamente sobre un papel absorbente, a cada a pozo se le añadirá 100 μl de PBS -T y caseina al 2% (PBS - TC) y serán incubados por 1 hora para bloquear los sitios libres de proteínas en el plástico. Las placas serán lavadas de nuevo con PBS - T, para ser utilizadas o para ser almacenadas a –20 °C. Posteriormente los sueros a temperatura ambiente, se diluirán en (PBS - TC) y colocados en cada pozo, a razón de las siguientes diluciones 1:64, 1:256, 1:1024, 1:4096 en volúmenes de 100 μl por pozo que luego lavaran 5 veces con PBS - T. Posteriormente se colocará el conjugado IgG (humano) peroxidasa en una dilución de 1:1000 con PBS - TC en volúmenes de 100 μl en cada pozo se Incubará por una hora a 37 ºC, y lavando 5 veces las placas con PBS - T y añadiendo en cada pozo una solución de sustrato conteniendo buffer citrato-fosfato pH 5 y OPD al 0.02 % con H2O2 al 30 %, para incubar protegido de la luz por 45 min a temperatura ambiente. La reacción se detendrá mediante la adición de 50 μl de ácido sulfúrico H2SO4 al 20%. Para luego leer las placas en el espectrofotómetro de ELISA utilizando un filtro de lectura a 492 nm, la interpretación se realizará usando la hoja de protocolo para ELISA. Los resultados obtenidos serán de tipo colorimétrico y cualitativo, para tomar como positivas aquellas muestras en las que ocurrirá un cambio de color de una anaranjado más oscuro a otros de menor intensidad. El (cut off) es el valor de densidad óptica que determina si la prueba realizada es positiva o negativa. Para la obtención del (cut off) se sumaran las diluciones del control negativo y al promedio, se le sumaran ± dos desviaciones estándar. Se consideran positivos los valores de densidad óptica de las muestras problema que estuviesen por encima del cut off, y negativo si el valor obtenido en densidad óptica de una muestra problema estuviese por debajo del cut off Araujo J 2001.

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Diagnóstico Molecular

Nuevos métodos diagnósticos se basan en la detección de antígenos en las heces varias técnicas biología molecular. En la actualidad la técnica que cobra mayor uso es la reacción en cadena de la polimeraza (PCR múltiplex) este método permite amplificar una sonda de fragmentos específicos de DNA de especies (E. histolytica y E. dispar) usando dos pares de primers específicos y desarrollando una reacción mixta Stanley 2003.

Reacción en cadena de la polimeraza PCR múltiplex Metodología para realizar esta prueba Es necesario obtener muestras fecales preservadas a -20 º C sin preservador químico, para su posterior procesamiento para luego tomar 0.5 gr de heces descongeladas y se colocan en tubos Eppendor de 1,5 ml,lavar con 1ml de PBS y luego se filtrar por una gasa. El filtrado obtenido se centrifuga a 3.000 rpm por 5min y se resuspende con 500μl de Buffer de lisis (LSB, esto es colocado en un tubo de 2ml con perlas de zirconio y 500μl de fenol. Colocar la mezcla en un vortex por 2 min y se centrifugar a 12.000 rpm por 15min y recuperar la fase acuosa, se extrae concloroformo/alcoholisoamílico,yel DNAesprecipitadocon isopropanol. El sedimento será resuspendido en 100μl de buffer TE Amplificación. La amplificación se efectuará en un volumen total de 50μl en tubos plásticos de 0.5ml utilizando un termociclador para la amplificación. Se prepara una mezcla de reacción que contiene un volumen de 250μM de cada dNTP´s, 40 pmoles de cada primer, 15mM MgCl2 y 125 unidades de TAQ polimerasa con 10μl de la solución de DNA extraída anteriormente y se efectuaron 30 ciclos de desnaturalización a 94 ºC por 30min, la hibridación a 55ºC y la extensión a 72ºC por 30 min, incluyendo los controles de DNA de E. histolytica, DNA de E.dispar, y DNA de E. histolytica y E. dispar. Los productos amplificados pueden ser visualizados por coloración con bromuro de etidio en una electroforesis en gel de 10% de poliacrilamida Núñez 2001.

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Tratamiento Para decidir un tratamiento antiamibiano es necesario haber realizado un diagnóstico completo de las formas clínicas, epidemiológicas, parasitológicas, e inmunológicas de la amibiasis de que se trate, ya que los fármacos antiamibianos se clasifican según el sitio donde los agentes actúan en el organismo humano. Así, hay antiamibianos de acción en intestino grueso que reciben el nombre de antiamibianos luminales; el siguiente grupo comprende a los medicamentos que actúan a nivel luminal, pero tienen mayor actividad en las paredes del colon; algunos de los fármacos de acción intestinal ejercen su actividad antiamibiana tanto en la luz como en la pared del intestino grueso. Los antiamibianos de acción extraintestinal se caracterizan porque se concentran en tejidos de órganos diferentes al intestino, logrando altas concentraciones tisulares (algunos obtienen su mayor concentración en hígado). También hay antiamibianos mixtos, que logran concentraciones terapéuticas contra Entamoeba histolytica tanto en intestino como fuera del mismo. Una buena opción de tratamiento de las formas intestinales agudas y crónicas, es la administración de antiamibianos del tipo de los derivados dicloroacetamídicos como la etofamida, que actúa directamente sobre E. histolytica a nivel luminal, no se absorbe después de la administración oral por lo que se alcanzan altas concentraciones del medicamento que se mantienen hasta tres días después de su administración, es inactiva sobre la flora bacteriana y 13 7

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hongos intestinales, se elimina por las heces, no tiene efecto antabuse y no se le atribuyen efectos teratogénicos.

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Figura 61 Representación grafica del Metronidazol medicamento útil contra infecciones parasitarias que incluyen protozoarios como E. histolytica, a) Forma estructural , b) Modelo de líneas y esferas, C) Modelo de Esferas de Van der Waals, generados en http://molview.org/ José Araujo 2020, #prof.josearaujo, #joseraujoblanco.

El metronizadol (MTZ) (figura 61) sigue siendo el medicamento más comúnmente usado para la amibiaisis y otras parasitosis. Los avances en la síntesis de nuevos fármacos han usado esta moelcula como base para desarrollar nuevos conjugados que ha sido probados contra el parasito como el 1H-1,2,3-triazoletethered de metronidazol-isatina sustituidos como 9d y 10a mediante la reacción de cicloadición azida-alquino de Huisgen (figura 62), han sido probados como amebicidas mostrando ser 2.3 veces más potentes que el MTZ original Kumar 2018

│Figura 62

Representación gráfica de conjugados con metronidazol Kumar, 2018. José Araujo 2020, #prof.josearaujo, #joseraujoblanco

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A pesar que el metronidazol es el compuesto más utilizado este puede exhibir una serie de efectos secundarios y baja eficacia contra los portadores de quistes asintomáticos. Además, se ha documentado la resistencia al metronidazol para bacterias y protozoos que comparten metabolismo energético anaerobio Mori 2018 . Para el tratamiento de portadores de quistes, la combinación de metronidazol y paromomicina se recomienda actualmente como un régimen estándar. Sin embargo, ambos compuestos tienen un efecto teratogénico y varios efectos secundarios adversos, como náuseas, vómitos y un sabor metálico Ohnishi 2014. Estudios comparativos demuestran que es el secnidazol (figura 63) presenta mayor tolerancia y efectividad sobre el metronidazol, por lo que se recomienda el secnidazol además es solo requiere de una dosis Cabello R 1999, Urdaneta H 1996.

│Figura 63

Representación gráfica del Secnidasol medicamento útil contra la amibiasis de dosis única a) Forma estructural, b) Modelo de líneas y esferas, C) Modelo de Esferas de Van der Waals, generados en http://molview.org/ José Araujo 2020, #prof.josearaujo, #joseraujoblanco.

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