Ciencia e Innovación Revista Científica Semestral Investigación, Desarrollo e Innovación Vol. 2, Núm. 1 / Enero – junio de 2019 ISSN-2594-150X
2019 ACTIVIDAD LARVICIDA DE EXTRACTOS DE HOJA DE Cinnamomum zeylanicum BLUME SOBRE LA GARRAPATA Rhipicephalus microplus CANESTRINI Carlos E. Ibarra-Martínez; Gerardo Bautista-Trujillo; Benigno Ruiz-Sesma; Paula Mendoza-Nazar; Carlos Tejeda-Cruz; María. A. Oliva-Llaven; Herbey Ruiz-Sesma; José C. Ibarra-Puon Ciencia e Innovación, Vol. 2, Núm. 1 / Enero – junio de 2019, pp. 275-286 Universidad Galileo Galilei Tuxtla Gutiérrez, Chiapas
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ACTIVIDAD LARVICIDA DE EXTRACTOS DE HOJA DE Cinnamomum zeylanicum BLUME SOBRE LA GARRAPATA Rhipicephalus microplus CANESTRINI ACTIVITY LARVICIDAL OF EXTRACTS OF Cinnamomum zeylanicum BLUME AGAINST THE CATTLE TICK Rhipicephalus microplus CANESTRINI Carlos E. Ibarra-Martínez1*; Gerardo Bautista-Trujillo1; Benigno Ruiz-Sesma1; Paula Mendoza-Nazar1; Carlos Tejeda-Cruz1; María. A. Oliva-Llaven1; Herbey Ruiz-Sesma1; José C. Ibarra-Puon2 Cuerpo Académico Producción Animal Tropical Sostenible. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Autónoma de Chiapas1. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Extensión Pichucalco, Chiapas. Universidad Autónoma de Chiapas 2.*Correo electrónico; cibarra1958@gmail. com.
RESUMEN El presente estudio tuvo como objetivo evaluar bajo condiciones de laboratorio la actividad ixodicida de extractos obtenidos de hoja de Cinnamomum zeylanicum Blume (Lauraceae) sobre la mortalidad de la larva de garrapata Rhipicephalus microplus Canestrini; se elaboraron los extractos acuosos y metanólicos a partir de material seco del órgano (hoja), los tratamientos evaluados fueron extracto crudo y sus diferentes concentraciones (100%, 75%, 50% y 25%). La técnica utilizada fue de inmersión larval modificada (TIL). El extracto metanólico fue el que mayor actividad demostró (94%) con valor de concentración letal media (CL50) de 100.44 ppm. Estos resultados muestran el potencial ixodicida de esta planta para ser consideradas como alternativa promisoria para la elaboración de productos naturales contra el manejo sustentable de la garrapata Rhipicephalus microplus Canestrini en la etapa larval. Palabras claves; Etnobotánica, Biotecnología, Control alternativo, ixodicida.
ABSTRACT The objective of this study was to evaluate, under laboratory conditions, the ixodicid activity of extracts obtained from the leaves of Cinnamomum zeylanicum Blume (Lauraceae) on the mortality of the Rhipicephalus microplus Canestrini tick larvae. The aqueous and methanolic extracts were made from dry organ material (leaf), the treatments evaluated were crude extract and their different concentrations (100%, 75%, 50% and 25%). The technique used was larval immersion (TIL). The methanolic extract showed the highest activity (94%) with mean lethal concentration (LC50) of 100.44 ppm. These results show the ixodicid potential of this plant to be considered as a promising alternative for the production of natural products against the sustainable management of the tick Rhipicephalus microplus in the larval stage.
Key words; Ethnobotany, Alternative Control. Ixodicid
Biotechnology,
Recibido: 01 de abril de 2019 Aceptado: 28 de abril del 2019 Publicado como ARTÍCULO CIENTÍFICO en Ciencia e Innovación 2(1): 275-286
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INTRODUCCIÓN
L
a garrapata Rhipicephalus (B) microplus Canestrini es el principal ectoparásito del ganado bovino en zonas tropicales transmisor de enfermedades hemoparasitarias como son Anaplasmosis (Anaplasma marginale) y Piroplasmosis (Babesia bovis, Babesia bigemina) que afectan al ganado bovino (Rodríguez et al. 2007). El control
de la garrapata se ha realizado mediante el uso productos químicos, como son los organofosforados (OP), amidinas (AM), piretroides sintéticos (PS) y lactonas macrocíclicas (LM) (Aguilar-Tipacamu y Rodriguez-Vivas, 2003; Fragoso y Soberanes, 2001). Sin embargo, el uso continuo e irracional de estos productos ha ocasionado la selección de cepas de garrapatas resistentes (Rodríguez et al. 2007). En México se han realizado estudios señalando la resistencia de la garrapata a productos químicos como son OP, PS, AM, Fipronil e Ivermectina (LM) (Fragoso et al. 1995; Soberanes et al. 2002; Miller et al. 2008; Pérez et al. 2010). Ante esta problemática se plantea el uso de nuevas alternativas de control de la garrapata, especialmente a través del uso de derivados vegetales con propiedad acaricida. Las características de estos productos incluyen bajo impacto a los ecosistemas, bajo riesgo de resistencia y baja toxicidad para los animales y humanos (Borges, et al. 2011; Olivo, et al. 2009); dentro de las especies botánicas evaluadas para este fin se encuentran especies de las familias Myrtaceae, Lauraceae, Rutaceae, Lamiaceae, Asteraceae, Apiaceae, Cupressaceae, Poaceae, Zingiberaceae, Piperaceae, Annonaceae, Meliaceae, Labiatae, Canellaceae (Borges et al. 2011; Kater, 2012), siendo la familia Lamiaceae la más estudiada contra garrapatas del género de Rhipicephalus, atribuyéndoles esta actividad a la presencia de metabolitos secundarios en su estructura vegetal, los cuales tiene actividad acaricida, insecticida y parasitida (Chungsamarnyart, et.al., 1991; Assis, 2010; citado por Monteiro, 2013). La familia Lauraceae se encuentra distribuida en las regiones tropicales y subtropicales del planeta, se conforma de 49 géneros y 2500 a 3000 especies (Werff y Richter, 1996; citado por Monteiro, 2013). El género Cinnamomum (Lauraceae) comprende cerca de 250 especies, que se caracterizan por ser arbustos y árbol de porte medio (Jantam et al., 2003; Jantam et al., 2008; citados por Monteiro, 2013). Cinnamomum zeylanicum Blume es una planta perenne que sus
principales componentes fitoquimicos son; Benzoato de Benzila, Linalol, E-Cinamaldeido,
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α-Pineno, β-Felandreno, Eugenol y Benzaldeido (Gende, et al. 2008; Mointero, 2017). Estudios
señalan que C. zeylanicum presenta actividad antibacteriana contra Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Serratia odorífera, antifúngica contra Cândida albicans (Unlu, et al., 2010), acaricida contra Tyrophagus putrescentiae e Suidasia pontifica (Assis, 2011), además de tener efecto antioxidante natural (Unlu, et al., 2010). A pesar de ello, existen pocos estudios
sobre la evaluación de la actividad acaricida de esta planta sobre la garrapata Rhipicephalus microplus Canestrini (Rosado-Aguilar, et al. 2017), ya que la mayoría de estos se concentran a la larva de mosquitos (Morales et al. 2004). Con base en lo anterior, y considerando que existe poca información sobre la actividad biocida de Cinnamomum spp, el objetivo de este estudio fue evaluar bajo condiciones de laboratorio la actividad ixodicida de extractos (acuosos y metanólicos) obtenidos de hoja de Cinnamomum zeylanicum Blume sobre larvas de garrapata del género Rhipicephalus microplus Canestrini, considerando como hipótesis que la acción de los extractos (acuoso y/o metanólico) obtenidos de hoja de Cinnamomum zeylanicum Blume tienen efecto ixodicida sobre la garrapata Rhipicephalus microplus (Canestrini) en su etapa larval.
MATERIALES Y METODOS. El estudio fue realizado en el Laboratorio de Biotecnología de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la UNACH, bajo condiciones naturales de 27± 1.5°C de temperatura y 85-86% de humedad relativa. El Laboratorio se localiza en la ciudad de Tuxtla Gutiérrez, Chiapas, México, con coordenadas (16°41’ 35.38” N; 93°50’ 51.55” O). Recolecta de garrapatas La recolecta y manejo de las muestras de garrapatas se hicieron tomando en consideración el protocolo sugerido por la FAO (2004), en horas de la mañana, de forma manual y período mínimo de 45 días sin tratamiento con ixodicidas químicos; se recolectaron hembras adultas ingurgitadas (teleoginas) procedentes de explotaciones ganaderas en el Municipio de Villaflores, Chiapas, México (16°20´39.8” N; 93°19´30.4”W). Las garrapatas se almacenaron en envases de plástico limpios, con orificios de ventilación y gasa húmeda en el fondo del envase, y se transportaron al laboratorio de Biotecnología de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Autónoma de Chiapas.
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Incubación. En el laboratorio, las garrapatas adultas (teleoginas) se depositaron en cajas Petri e incubaron en condiciones de laboratorio a temperatura de 27± 1.5°C y humedad relativa de 85% - 86% para permitir la ovoposición (Cen et al. 1998). Los huevos obtenidos se transfirieron a viales de cristal de 10 mL y fueron incubados bajo las mismas condiciones de temperatura y humedad al que estuvieron las teleoginas durante la ovoposición. Para los bioensayos se utilizaron larvas de 7-14 días de edad (Soberanes et al. 2002). Selección y obtención del material vegetal La recolecta del material vegetativo se llevó a cabo en el ejido Cristóbal Obregón, municipio de Villaflores (16°20´39.8” N; 93°19´30.4” O), Chiapas, México. El criterio tomado para la selección fue el siguiente; su capacidad alelopática, y revisión bibliográfica exhaustiva en revistas científicas sobre su propiedad biocida. La identificación taxonómica se llevó a cabo en el laboratorio de botánica de la Escuela de Biología de la Universidad de Ciencias y Artes de Chiapas. Las muestras (hojas) se tomaron de plantas adultas y tuvo un proceso de deshidratación en estufa marca Imperial III® a temperatura de 40°C durante 72 horas, posteriormente el material vegetal se molió en molino marca Ika Werker®, el material obtenido de cada planta fue empacado en bolsa de nylón, identificado y almacenado a temperatura ambiente hasta su utilización. Preparación de extractos. Extracto acuoso; se tomó una muestra de 1.5 g de material molido de cada planta a evaluar, y se colocó en un vaso precipitado, se adicionó 50 mL de agua destilada y se llevó a punto de ebullición (100°C) durante 20 minutos, se reposo durante 24 horas a temperatura ambiente. Las mezclas se filtraron con papel filtro Whatman #1, se depositaron en matraz Erlenmeyer cubierto con papel aluminio para evitar el efecto de la luz y se almacenaron a 4ºC hasta su uso, considerando un tiempo máximo de almacenamiento de 72 horas (Iannacone y Lamas, 2003). Las mezclas iniciales se consideraron solución madre, misma que se definieron como concentración 100% (30,000 ppm). Para los experimentos de dosisrespuesta, las concentraciones se redujeron por adición de disolvente a base de agua destilada con las siguientes proporciones 25%, 50% y 75% resultando las siguientes concentraciones
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22,500 ppm, 15,000 ppm y 7,500 ppm respectivamente, siendo 100 mL la cantidad aforada. Cada concentración se consideró un tratamiento, el control positivo fue Amitraz, y control negativo agua destilada. Extracto metanólico; se tomó una muestra de 50 g de material vegetal molido de cada planta a evaluar, se adicionó 300 mL de metanol y se dejó reposar durante 48 horas a temperatura ambiente. Posteriormente se hizo el filtrado con papel filtro Whatman #1. La evaporación del metanol se hizo través de un rotovapor BUCHI R300® a baja presión y temperatura de 45ºC. El material obtenido (pasta) se resuspendió con solución de agua destilada:Tween 20 (98:2 v/v). Las soluciones obtenidas se colocaron en matraz Erlenmeyer (250 mL) cubiertos con papel aluminio para protegerlos de la luz. Las mezclas se almacenaron a temperatura de 4°C hasta su uso. Para los bioensayos se tomó el equivalente a 1 gr de la pasta obtenida y se disolvió en 100 mL de una suspensión de agua destilada:Tween 20 (98:2 v/v), lo obtenido se consideró solución madre concentración 100% (10,000 ppm), para obtener concentraciones más bajas se redujeron por adición de disolvente a base de agua destilada:Tween 20 (98:2 v/v) en diferentes proporciones, 25%, 50% y 75% obteniéndose las siguientes concentraciones 7,500 ppm, 5,000 ppm y 2,500 ppm respectivamente, siendo 100 mL la cantidad aforada. Cada concentración se consideró un tratamiento, el control positivo fue Amitraz, y control negativo agua destilada:Tween 20 (98:2 v/v). Bioensayos Para evaluar la mortalidad de las larvas de garrapata de Rhipicephalus microplus se utilizó la técnica de inmersión larval modificada (Santamaría y Soberanes, 2001). Se tomaron 3 mL de cada extracto en sus diferentes concentraciones y fueron vertidos a cajas Petri que contenían papel filtro Whatman #1 para impregnarlo homogéneamente, posteriormente se tomaron 100 larvas de garrapatas de 14 días de edad y se depositaran en la caja Petri entre las dos secciones de papel filtro impregnado. La exposición de las garrapatas a los tratamientos fue por un período de 10 minutos. Después de la exposición, las garrapatas tratadas se transfirieron a sobres de papel filtro (paquetes) limpio y seco, donde se depositaron 20 larvas por paquete. Cada paquete de 20 larvas representó una repetición. Cada tratamiento tuvo cinco repeticiones, incluyendo el grupo control. Los paquetes se sellaron con broches metálicos e incubaron durante 48 horas bajo condiciones de laboratorio a una temperatura de 27± 1.5°C
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y 85%-86% de humedad relativa (Cent et al. 1998). El porcentaje de mortalidad (M) se determinó aplicando de la siguiente formula: M=(
#acaro vivos − #acaro muertos ) 100 #acaro vivos
La mortalidad corregida (MC) fue evaluada aplicando la fórmula sugerida por Abbott (1925) y recomendada por la FAO (2004); MC = (
%mort. Trat − %mort. control. ) 100 100 − %mort. control.
La eficacia de mortalidad fue clasificada de acuerdo a lo establecido en la modificación de la NOM-006-ZOO-1993 (DOF. 1994), donde se establece que un producto para ser considerado con capacidad ixodicida debe tener un mínimo de 80% de efectividad, como también considerando lo sugerido por Chungsamarnyart et al. (1991), quienes señalan que un producto tiene efectividad “alta” cuando presenta rangos de mortalidad de 86-100%. Diseño experimental y análisis estadístico El diseño experimental aplicado en el estudio fue completamente al azar. Previo al análisis los datos se checaron por homocedasticidad y normalidad, el análisis de los datos fue mediante ANOVA, la comparación múltiple de medias se hizo mediante la prueba de Tukey, el software utilizado fue SAS (siglas en ingles), versión 9.0 para Windows (Herrera y Barreras. 2005). La concentración letal media (CL50) fue calculado mediante análisis Probit, Polo Plus, versión 1.0 Le Ora software.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN Los efectos de los extractos vegetales en la mortalidad de larvas de R. microplus se muestran en el cuadro 1. Se observó que el extracto metanólico mostró mayor actividad con un rango de mortalidad de 85% a 94%, mientras que el extracto acuoso tuvieron una mortalidad del rango de 68% a 90%, con valores de CL50 de 100.44 mg/L y 1359.21 mg/L respectivamente (Cuadro 2). Considerando la modificación a la NOM-006-ZOO-1993 (DOF, 1994) y la clasificación de eficacia sugerida por Chungsamarnyart, et al. (1991), los resultados obtenidos con los
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tratamientos metanólicos se consideran con eficacia “alta”, en lo que respecta al extracto acuoso solo el Tratamiento 3 (T3) cumple este requisito.
Tratamiento.
Cuadro 1 Media ± error estándar de la mortalidad de larvas de R. microplus por efecto de los extractos de hoja de Cinnamomum zeylanicum con 48 hr de exposición. Cinnamomum zeylanicum
E. Acuoso
Pr > |t|
E. Metanólico
Pr > |t|
T1 Extracto Puro (100%) T2 75% Extracto+25% disolvente
(3% w/v) 70±0.32ab 68±0.49b
<.0001 <.0001
(10 mg/mL-1) 94±0.49a 90±1.05a
<.0001 <.0001
T3 50% Extracto+50% disolvente
90±0.32a
<.0001
94±0.58a
<.0001
T4 25% Extracto+75% disolvente
70±0.95ªb
<.0001
85±0.89a
<.0001
a82±0.37ab
<.0001
82±0.75a
<.0001
10 ±0.0c
0.0554
Control
Amitraz Agua destilada
0.0014 13 ±0.24c
Agua destilada+Tween20 (98:2
v/v) Medias con la misma letra dentro de columnas son iguales de acuerdo a la prueba de Tukey con una P < 0.05.
Cuadro Concentración letal (CLson 50) de extractos a base de hoja de C. zeylanicum Medias con2letras diferentes en unamedia columna estadísticamente diferentes (Tukey p≤ 0.05) sobre la larva de Rhipicephlus microplus después de 48 hrs de exposición. C. zeylanicum
E. Acuoso
E. Metanólico
CL50 (mg/L)
1359.21
100.44
(IC)
(44.97-1082.11)
(18.81-536.25)
n
5
5
Pendiente
0.268
0.727
SD
3,737
1.376
EE
0.755
0.371
R2
0,037
0.536
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Existe evidencia de actividad acaricida de Cinnamomum spp sobre Psoroptes cuniculi (Fichi et al. 2007ª), Tyrophagus putrescentiae (Assis, 2011), Dermanyssus gallinae (George et al. 2010ª), actividad larvicida sobre Aedes aegypti (Cheng, et al., 2004), Aedes albopictus, Culex quinquefasciatus y Armigeres subalbatus (Cheng, et al., 2009); Sin embargo, los efectos ixodicidas contra larvas de Rhipicephalus microplus no han sido estudiados en detalle (Rosado-Aguilar, et al. 2017), razón por la cual la discusión de los datos obtenidos no se pudo realizar de manera satisfactoria, nuestros resultados coinciden con el estudio de Monteiro, (2013) donde se reporta mortalidad de 100%, 99.8%, 99%, 98.9% sobre las larvas de garrapata Rhipicephalus microplus con aceite esencial de C. zeylanicum en concentraciones de 50, 25, 10, 5 mg/mL respectivamente, con valor de CL50 de 1.005 mg/mL. Sin embargo, no coincide con el estudio de Alvares, et al. (2008) donde se señala que la actividad ixodicida de los fitocomponentes decrece conforme la relación con agua es 1:1 v/v.
CONCLUSIÓN Con base a los resultados obtenidos en este trabajo de investigación se puede considerar que los extractos acuosos y metanólico de hoja de C. zeylanicum poseen actividad larvicida alta, tomando como referencia la clasificación sugerida por Chungsamarnyart, et. al. (1991) y la NOM-006-ZOO-1993, por lo que estas plantas pueden ser consideradas como alternativa promisoria para el desarrollo de productos naturales contra el manejo sustentable de la garrapata Rhipicephalus microplus en la etapa larval.
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