INFORME ANALISIS DE COLIFORMES
RECUENTO EN PLACA
SIEMBRA EN PROFUNDIDAD
SERVICIO NACIONAL DE APRENDIZAJE - SENA CENTRO NACIONAL DE HOTELERIA, TURISMO Y ALIMENTOS
INFORMES DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA
PRESENTADO POR: JUDITH CATALINA LEON NIﾃ前 HOLMAN EDUARDO GONZALEZ BALLESTEROS JOSE LUIS MEDINA
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MARCO TEORICO
Existen diversos métodos para cuantificar el número de microorganismos presentes en muestras líquidas y sólidas. Algunas de las técnicas más comunes se encuentra el recuento directo por microscopia de fluorescencia, así como los procedimientos basados en diluciones en serie, haciendo crecer microorganismos en medios de cultivo sintéticos sólidos o líquidos, como el recuento en placa de Unidades Formadoras de Colonias (UFC) o la estimación por el método del Número Más Probable (NMP). Aproximadamente el 95% del grupo de los Coliformes presentes en heces están formados por Escherichia coli y ciertas especies de Klebsiella. Ya que los Coliformes Fecales se encuentran casi exclusivamente en las heces de los animales de sangre caliente, se considera que reflejan mejor la presencia de contaminación fecal. Éstos últimos se denominan termotolerantes por su capacidad de soportar temperaturas más elevadas. Esta es la característica que diferencia a Coliformes Totales y Fecales. La capacidad de los Coliformes fecales de reproducirse fuera del intestino de los animales homeotérmicos es favorecida por la existencia de condiciones adecuadas de materia orgánica, pH, humedad. Desde hace mucho tiempo se han utilizado como indicador ideal de contaminación fecal. Su presencia se interpreta como una indicación de que los organismos patógenos pueden estar presentes y su ausencia indica que el agua o el alimento estudiado se hallan exentos de organismos productores de enfermedades.
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OBJETIVOS 1. Comprender y realizar adecuadamente la determinación de coliformes totales en un alimento, mediante la cuenta en placas vertidas. 2. Interpretar los resultados obtenidos, de acuerdo con las normas aplicables. 3. Reconocer y manipular correctamente las herramientas y equipos de laboratorio, para el correcto desarrollo de la práctica. 4. Reconocer las formas y colores de los microorganismos según el medio de cultivo utilizado y las normas técnicas aplicables para esta práctica. 5. Evaluar que la concentración de los microorganismos se encuentren en los límites permitidos según la normatividad vigente.
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MATERIALES UTILIZADOS •
Medio de Cultivo EMB – Eosina - Azul de Metileno - Lactosa
•
Solución de Agua Peptonada 0.1%
•
Espátula
•
Erlenmeyer
•
Frascos Shott
•
Gradillas
•
Micropipeta
•
Pipetas
•
Pipeteador
•
Probetas
•
Tubos de Ensayo
•
Cajas de Petri EQUIPOS Y UTENCILIOS UTILIZADOS
•
Incubadora
•
Balanza Analítica
•
Mechero de Bunsen
•
Trípode
•
Malla
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METODO Se realizó la práctica de Laboratorio para análisis de coliformes por recuento en placa y utilizamos la técnica de siembra en profundidad. Objetivo: Determinar coliformes totales y fecales en una muestra de hojas de lechuga fresca. Procedimiento: Se realiza limpieza del área de trabajo y de los materiales a utilizar durante la misma Se preparan 120 ml de medio de cultivo EMB, pesando 4.26 g y se diluyen en 120 ml de agua en un frasco shott, seguidamente se lleva a ebullición con ayuda de un mechero de bunsen, sobre un trípode con placa. Se prepara 108 ml de agua Peptonada, pesando 0.918 g de Nacl y 0.108 g de peptona, se disuelven en un frasco shott. Con ayuda de una pipeta graduada se transfieren 9 ml de agua Peptonada a 2 tubos de ensayo los cuales se deben marcar como 10-2 y 10-3, la solución restante de peptona se debe identificar como 10-1. Después de preparar el medio requerido y el juego de diluciones, se esteriliza el material junto con los tubos de ensayo, las cajas de Petri envueltas en papel kraft y las puntas de la micropipeta. Se esteriliza nuevamente el área de trabajo con una solución de alcohol al 1% y se enciende el mechero. Después de esterilizar se atempera el juego de diluciones, el medio EMB y las cajas de Petri se identifican en la tapa de cada una con la dilución que corresponde 10 -1 - 10-2 o 10-3, teniendo en cuenta que cada dilución se realiza siembra por duplicado. Se pesan 10 g de lechuga cortada en trozos y se transfieren en el frasco shott identificado como 10-1 se tapa el frasco y se agita constantemente para que se disuelvan los microorganismos que contenía. Luego se toma con la micropipeta 1 ml de la primera dilución y se transfiere al tubo identificado como 10-2, se tapa y agita hasta homogenizar totalmente la muestra, seguidamente se toma con la micropipeta 1 ml de la segunda dilución y se transfiere al tubo identificado como 10 -3, se tapa y agita hasta homogenizar totalmente la muestra. Seguidamente, se toman las cajas petri previamente marcadas con 10-1, 10-2 y 10-3 y utilizamos las micropipeta para agregar 1 ml de muestra de las diluciones teniendo en cuenta que corresponda la dilución con la identificación de cada caja de petri, esta operación se realiza junto al mechero para evitar contaminación cruzada en el ambiente en el momento de la siembra. Después se procede a servir el medio agar EMB más o menos 20 ml cada caja, se homogeniza suavemente para que la muestra y el medio se mezclen, se deja gelificar y se tapan. Para finalizar se llevan a incubación a 35º C de 24 a 48 horas.
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CUADRO DE RESULTADOS ANÁLISIS
RECUENTO EN PLACA N DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES
MICROORGANISMO
Coliformes Totales Coliformes Fecales
MÉTODO
CARACT. DILUCIÓN N° DE MICROSCÓPICA COLONIAS Caja 1: 10-1 Morf. 1: Morfotipo 1 – 4 UFC/g ESCHERICHIA COLI, colonia con brillo metálico a la luz reflejada y con centro oscuro hasta negro a la luz transmitida Siembra en Morfotipo 2 Morf. 2: profundidad ENTEROBACTER, 10 UFC/g colonia con centro pardo grisáceo a la luz transmitida sin brillo metálico Morfotipo 3 Morf. 3: SALMONELLA Y 5 UFC/g SHINGELLA, colonias transparentes de color ámbar Caja 2: Morfotipo 1 – ESCHERICHIA COLI, colonia con brillo metálico a la luz reflejada y con centro oscuro hasta negro a la luz transmitida Morfotipo 2 ENTEROBACTER, colonia con centro pardo grisáceo a la luz transmitida sin brillo metálico Morfotipo 3 SALMONELLA Y SHINGELLA, colonias
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Morf. 1: 4 UFC/g
Morf. 2: 28 UFC/g
Morf. 3: 7 UFC/g
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IMAGEN
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transparentes de color ámbar Caja 1: 10-2 Morfotipo 1 – ESCHERICHIA COLI, colonia con brillo metálico a la luz reflejada y con centro oscuro hasta negro a la luz transmitida Morfotipo 2 ENTEROBACTER, colonia con centro pardo grisáceo a la luz transmitida sin brillo metálico Morfotipo 3 SALMONELLA Y SHINGELLA, colonias transparentes de color ámbar Caja 2: Morfotipo 2 ENTEROBACTER, colonia con centro pardo grisáceo a la luz transmitida sin brillo metálico Morfotipo 3 SALMONELLA Y SHINGELLA, colonias transparentes de color ámbar
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Morf. 1: 3 UFC/g
Morf. 2: 5 UFC/g
Morf. 3: 2 UFC/g
Morf. 2: 4 UFC/g
Morf. 3: 3 UFC/g
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Caja 1: 10-3 Morfotipo 2 ENTEROBACTER, colonia con centro pardo grisáceo a la luz transmitida sin brillo metálico
Morf. 2: 6 UFC/g
Morfotipo 3 SALMONELLA Y SHINGELLA, colonias transparentes de color ámbar
Morf. 3: 1 UFC/g
Caja 2: Morfotipo 2 ENTEROBACTER, colonia con centro pardo grisáceo a la luz transmitida sin brillo metálico
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Morf. 2: 1 UFC/g
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DISCUSIÓN DE RESULTADOS Analizando los resultados obtenidos se realiza una revisión de las maneras en las cuales esta hortaliza pudo contaminarse con este tipo de coliformes.
1. Este tipo de contaminantes muchas veces viene desde el beneficio es decir en el eslabón primario, resultado de las malas prácticas agrícolas – BPA. Muchos de estos cultivos son regados con aguas contaminadas, tomadas de ríos, los cuales muchas veces tienen desembocadura de desechos fecales tanto animales como humanos. Estas aguas no son sometidas a ningún tipo de tratamiento para poder ser utilizadas para tal fin. 2. Otro punto de contaminación se puede presentar debido a la mala manipulación de la hortaliza y transporte en condiciones inadecuadas, muchas veces no son utilizadas canastillas debidamente higienizadas, por el contrario se ha usado en algunas ocasiones costales de fique los cuales no son apropiados, ya que generan focos de contaminación, además que maltratan el producto. 3. Cuando se recibe este tipo de hortalizas como materia prima en la industria los procesos de higienización pueden ser inadecuados o deficientes, lo cual contribuye al desarrollo de microrganismos, ya que algunos de estos son capaces de sobrevivir a procesos de desinfección y multiplicarse en un almacenamiento a temperaturas inadecuadas. Algunas de los microorganismo que pueden estar presentes en las hortalizas frescas son: Escherichia.coli, enterotoxigénica, E.coli enterohemorrágica, especies de Shigella, Salmonella, Listeria,ampilobacter, Clostridium y Staphylococcus, entre otras.
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RECOMENDACIONES Algunas recomendaciones pertinentes para el manejo de este tipo de materia prima pueden ser: •
Utilizar y/o consumir sólo productos vegetales de primera calidad, sin signos de deterioro, como golpes, manchas, mohos o restos de parásitos.
•
Lavar bien los vegetales con agua potable, eliminando todo resto de suciedad, tierra o partes deterioradas, seguidamente realizar desinfección sumergiéndolos en abundante agua con algunas gotas de cloro o hipoclorito de sodio, dejar actuar aproximadamente 5 minutos y lavar con abundante agua.
•
La higiene personal es un punto muy importante para evitar contaminación cruzada en el alimento.
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CIBERGRAFIA
http://www.monografias.com/trabajos89/determinacion-coliformes-totalesfecales/determinacion-coliformes-totales-fecales.shtml#ixzz3BezaLVeM http://www.anmat.gov.ar/alimentos/Guia_de_interpretacion_resultados_microbologicos.pdf
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