practicas de hematologia 1 by Juan Carlos Vázquez

25/09/2007 Título de la práctica: Reconocimiento y uso del material de laboratorio Fundamento de la práctica: Familiarizarse con el material de laboratorio, aprender como se utiliza, sus posibles usos y la localización de los distintos materiales dentro del aula. Materiales utilizados: Bateas Olla Autoclave Estufa de cultivos Estufa de secado del material Matraz aforado Embudo de líquidos y embudo de sólidos Matraz Erlenmeyer Mortero Cubetas para tinción Vaso de precipitados Pipetas, micropipetas Centrífuga Placa Petri Fotocolorímetro Fotodensitómetro Quitasato Frasco lavador Tubos Eppendorf Cámaras de Neubauer Microscopio Probeta Bureta Vidrio de Reloj Contenedor desechable Papel Parafilm Portapreparaciones Reflotrón Procedimiento: A continuación se señalan los materiales anteriormente citados que se observaron en el laboratorio y se citan ciertas características de ellos: Matraz aforado: Son generalmente de forma ovoide, fondo plano y cuello estrecho y alto con tapón esmerilado, construido en vidrio fino. En el cuello llevan un trazo circular que marca el aforo o enrase y que indica la capacidad del mismo. En las paredes se indica además de la capacidad del mismo, la

temperatura a la que debe utilizarse. Se utilizan para preparar soluciones valoradas o de concentración definida y para diluir muestras a volumen fijo. Probetas: Son vasos altos graduados, de forma cilíndrica con un pie que les confiere cierta estabilidad; las hay de tamaño variables, generalmente desde 5 cc hasta 1 litro. Presentan un pico que sirve para verter los líquidos más fácilmente. Su uso más frecuente es para medir y dispensar volúmenes de líquido que requieren poca precisión. Pipetas: Son tubos de vidrio de poco diámetro, abiertos a ambos lados, terminando en punta por el inferior de salida del líquido, regulando esta con el dedo índice, que rapa el orificio de la parte superior. Se utilizan pata transferir o verter un volumen determinado de líquido. Existen de varios volúmenes. Deben llevar grabada en su pared la capacidad y un código de color distinto según el volumen al que están calibradas. Micropipetas: Son pipetas utilizadas para transferir pequeñas cantidades de líquido. Contienen volúmenes desde 1 a 1000 microlitros y pueden ser de volumen fijo o variable. Buretas: Son largos tubos graduados con una llave en un extremo denominada robinete u otro elemento para detener el flujo de líquido y un extremo afinado en la punta para dispensar el líquido. En su parte superior está ligeramente ensanchada en forma de embudo a lo largo de ella va grabada la graduación, generalmente en cc y décima de cc. Se utilizan para dispensar volúmenes conocidos de líquido en un recipiente. Matraz Erlenmeyer: Son matraces de fondo redondo y cuello estrecho, llevan una escala volumétrica orientativa y se fabrican de varios tamaños. Los kitasatos son matraces Erlenmeyer que llevan una boquilla lateral para poder conectar a vacío. Se utilizan para filtración esterilizante de sustancias o muestras que contienen elementos que no soportan las altas temperaturas del autoclave. Vaso de precipitados: Son anchos de paredes anchas y cilíndricas. Presentan un pico que sirve para verter los líquidos más fácilmente. Se utilizan para la

preparación de reactivos como contenedores de soluciones que haya que someter a agitación mecánica. Embudos: Los más utilizados se emplean para transferir líquidos o sólidos a otros recipientes y como soporte del papel de filtro en el proceso de filtración. Mortero: Se utiliza para pulverizar y homogeneizar sustancias sólidas. Frascos lavadores: Se utilizan para contener agua destilada Vidrio de reloj: Láminas cóncavas para pesar sólidos. Cubetas de tinción: Se utilizan para teñir por inmersión. Tubos de ensayo: Se utilizan para contener la muestra o analizar o efectuar reacciones en ellos. Gradillas: Sirven de soporte para tubos de ensayo. Contenedor desechable: Se utiliza para retirar el material potencialmente contaminante Papel Parafilm: Se utiliza para tapar los tubos de ensayo. Baños de calentamiento: Se utilizan para mantener a temperatura constante material y sustancias que así lo requieran. Estufas: La estufa de desecación se utiliza para el secado del material, la estufa de cultivos se utiliza en microbiología para incubar los cultivos de microorganismos. Centrífugas: Se utilizan para separar sangre coagulada o celular del suero o plasma y para aclarar líquidos orgánicos. Fotocolorímertro: Se utiliza sobre todo para la determinación de hemoglobina. Cámara de Neubauer: Se utiliza para el recuento de glóbulos rojos, blancos y plaquetas. Procedimiento: Se ha examinado el material y se han aprendido nociones básicas sobre su utilización.

2/10/2007 Título de la práctica: Pipeteo Fundamento de la práctica: Aprender a utilizar todo tipo de pipetas Materiales utilizados: Pipeta de 10 cm3 Pipeta de 5 cm3 Pipera de 1 cm3 Pipeta Pasteur Vaso de precipitados Batea Chupete o prepipeta Tubos de Ensayo Gradilla Procedimiento: En primer lugar se procede a la elaboración de la solución que se va a pipetear; en una probeta de 1l. se vierten aproximadamente 1l. de agua, a continuación se echan una cierta cantidad de lugol (Yodo + Yoduro potásico), no hace falta verter un determinado volumen, ya que solo es para darle un color al agua y así poder apreciar mejor las cantidades pipeteadas. El procedimiento es sencillo, con las distintas pipetas se van cogiendo distintos volúmenes, dependiendo de la capacidad de cada pipeta, y se van echando en los tubos de ensayo, p ej. con una pipeta de 1 ml. procedemos a coger su valor máximo de medida,1 ml. ,observamos que no haya error de paralaje (es aquel que se produce en la lectura del aforo, al parecer que esta línea se mueve dependiendo de la altura a la que sea observada) y una vez comprobado esto se procede a pasar el volumen al tubo de ensayo. Hay que tener especial cuidado con las micropipetas que son las más sensibles y su mala utilización puede llevar a la pérdida del material.

4/10/2007 Título de la práctica: Observación de una muestra en el microscopio Fundamento de la práctica: Familiarizarse con el funcionamiento del microscopio, aprender a enfocar muestras en fresco, diferenciar en la muestra los Gr,,gb, y plaquetas Materiales utilizados: Microscopio Portaobjetos Cubreobjetos Lanceta Alcohol Gasa Procedimiento: 1. Con una lanceta se pincha al paciente en el dedo, normalmente el dedo índice, para que aumente el riego sanguíneo ha de calentarse la zona. 2. Antes de puncionar se limpia la zona con alcohol y se seca con una gasa estéril. 3. Se desecha la primera gota, una vez echa la extracción, la sangre se recoge en un capilar o tubo de ensayo. 4. Se deposita una gota de sangre en el portaobjetos 5. Inmediatamente después se coloca el cubre encima del porta, evitando la formación de bolsas de aire en la muestra. 6. Procedemos a colocar la muestra en el microscopio. 7. Accionando el revolver, seleccionar el objetivo adecuado. Se sabe que el objetivo esta correctamente seleccionado cuando se percibe un audible clic. Generalmente se empieza enfocando con un objetivo de poco aumento y luego se pasa a otro de mayor aumento. Si se hace esto, basta con mover ligeramente el micrométrico para enfocar la muestra con este ultimo objetivo. 8. Bajar completamente la platina y colocar la preparación sobre ella, teniendo cuidado de no ponerla al revés. 9. Accionando los tornillos reguladores de la platina, desplazar la preparación hasta situar la muestra sometida a estudio sobre el orificio de paso de luz. Encender la fuente de luz y regularla a una intensidad media para evitar que se sobrecaliente. 10. Situar el condensador: - Bajo, si se utiliza un objetivo de poco poder de ampliación (10 x). - En la mitad de su recorrido, si se emplea un objetivo de gran

poder de ampliación (40 x). - Alto, si se usa un objetivo de inmersión (100 x). También conviene ascender el condensador si se observa una muestra desecada y tenida, y descenderlo si se estudia una muestra "en fresco". 11. Mirando por fuera de los oculares, hacer ascender la platina con el tornillo macrométrico hasta que el objetivo este muy cercano a la preparación. Cuando se utiliza un objetivo de poco poder de ampliación, el aparato tiene un tope que impide un acercamiento excesivo de aquel a la preparación. Sin embargo, si se emplea el objetivo de inmersión, previamente hay que depositar una pequeña gota de aceite sobre la preparación y, posteriormente, hacer ascender la platina hasta que aquel toque el aceite pero no la preparación. 12. Ajustar la distancia interpupilar. 13. Moviendo el tornillo macrométrico, hacer descender lentamente la platina hasta que se vea, mirando por los oculares, la imagen de la muestra. Con el objetivo de inmersión, este nunca debe separarse tanto de la preparación como para perder el contacto con el aceite. 14. Afinar el enfoque con el tornillo micrométrico. 15. Desplazando horizontalmente la platina con movimientos en zig-zag, recorrer con el objetivo toda la preparación, para realizar una correcta observación de la misma. 16. Durante la observación, mover continuamente el tornillo micrometrico, para enfocar sucesivamente todos los pianos de la muestra. 17. Una vez finalizada la observación, hacer descender totalmente la platina y retirar la preparación. 18. Apagar la fuente de luz. Resultados: Los glóbulos rojos frescos son de color anaranjado verdoso sin movilidad intrínseca. Pueden observarse aislados o agrupados en "pilas de monedas", que son mas frecuentes en ciertas patologías de las proteínas plasmáticas. Los glóbulos blancos o leucocitos vivos si son células móviles, ya que tienen un extremo activo que produce seudópodos y facilita el desplazamiento. Los que tienen esta 6

capacidad mas desarrollada son los linfocitos. Las plaquetas no tienen movilidad y tienden a agregarse formando acúmulos. Interpretación de los resultados: En la muestra de sangre podemos observar la forma normal de los eritrocitos y las formas patológicas si las hubiera (drepanocitos, acantocitos, etc.). También es posible ver la presencia de parásitos hemáticos vivos, como puede ser el tripanosoma o las microfilarias.

9/10/2007 Título de la práctica: Realización y tinción de un frotis sanguíneo Fundamento de la práctica: Las extensiones sanguíneas se llevan a cabo deslizando un porta sobre otro en el que se ha depositado previamente una gota de sangre. Con esto se obtiene una fina capa de células sanguíneas que puede ser adecuadamente observada con el microscopio. En la tinción el frotis se sumerge durante un tiempo determinado, 5 inmersiones de 1 segundo en cada cubeta, y se utiliza un fijador que es el metanol. Materiales utilizados: Tubo con EDTA Portatubos Aguja Alcohol Algodón Compresor 2 Portaobjetos Guantes Pipeta Pasteur Solución alcohólica de metanol Solución tamponada de eosina Solución tamponada de azul de metileno Procedimiento: En primer lugar precederemos a la extracción de sangre para a continuación hacer la extensión o frotis sanguíneo, actuaremos de la siguiente manera: 1. Palpar el sitio donde queremos puncionar(venas cefálica, basílica o cubital media) 2. Desinfectar con alcohol. 3. Para escoger el lugar de punción, se escogen venas que sintamos, no venas que veamos. 4. El compresor, el cual debemos de colocar, no puede esta puesto mucho tiempo ya que puede provocar un éxtasis sanguíneo. 5. Realizar un análisis de la dirección de la vena. 6. Si pincho y no sale sangre puede ser debido a: • Pinchar al lado de la vena pero no la vena • Pinchar superficialmente • Pinchar la vena pero atravesada 7. Pinchar siempre en la dirección de la vena. Si se pincha mal, sacar el compresor, la aguja y volver a intentarlo. 8

Con jeringa se retira un poco el émbolo para saber si se ha pinchado bien viendo sangre. El puño se abre una vez encontrada la canalización de la vena. Este procedimiento se repite en todas las prácticas hechas en el laboratorio en las que necesitemos sangre. La técnica para realizar la extensión sería la siguiente: A. Con los dedos índice y pulgar de una mano, sujetar un extremo del porta normal (porta soporte), a nivel de sus bordes, y situarlo sobre una mesa. También puede apoyarse, simplemente, el porta soporte sobre el extremo del dedo corazón de la mano que lo sujeta. De esta forma, el porta soporte forma un ángulo con la mesa. B. Con una pipeta pasteur coger un poco de sangre problema, depositar una pequeña gota de esta (de unos 5 µl) en la cara superior de ese porta, a no menos de 2 cm del extremo opuesto al que agarra la mano. C. Colocar un extremo del porta esmerilado (porta difusor o extensor) un poco por delante de la gota de sangre y formando un ángulo de 45° con el porta soporte. Es conveniente utilizar siempre el mismo porta extensor, para adaptarlo a esta función. D. Desplazar suavemente hacia atrás el porta extensor, hasta que alcance la gota de sangre. E. Dejar que la gota se extienda, por capilaridad, a lo largo del extremo del porta extensor que toca el porta soporte. F. Antes de que la sangre alcance los bordes de ese extremo, deslizar el porta extensor hacia delante, con un movimiento firme y uniforme, y a una velocidad media. Este deslizamiento debe acabar, aproximadamente, a 1 cm del extremo final del porta soporte, con un movimiento de ascensión del porta extensor. G. Secar rápidamente la extensión, agitándola al aire, para que sus células no se distorsionen. H. Escribir el nombre del enfermo, en el porta que soporta la extensión. Una vez hecha la extensión comenzar con la tinción, usaremos la tinción panóptica: 1. Colocar la muestra en un cestillo para portas 2. Introducir la muestra en la primera cubeta para tinción que contiene metanol, esto fijará la extensión, 5 inmersiones de 1 segundo, escurrir.

3. Introducir la muestra en la segunda cubeta para tinción que contiene eosina, 5 inmersiones de 1 segundo también, escurrir. 4. Introducir la muestra en la tercera cubeta que contiene azul de metileno, 5 inmersiones de 1 segundo, escurrir 5. Lavar con agua y esperar a que seque. Resultados: Depositamos una gota de aceite de inmersión sobre el frotis y observamos con el objetivo de 100X. Analizamos si el frotis y la tinción están bien realizados. El frotis será correcto si: • Tiene las dimensiones adecuadas • No tiene artefactos provocados por anticoagulantes • No tiene artefactos provocados por técnicas defectuosas de extensión • No tiene artefactos provocados por defectuosa fijación o coloración • No tiene artefactos provocados por defectos del portaobjetos • Otros defectos a la hora de realizarlo, contaminación por polvo, hemólisis... La tinción será correcta si: • La tinción no es excesivamente rosada o azulada • Tiene ausencia de precipitados • Se diferencian bien las estructuras subcelulares en los leucocitos. Interpretación de los resultados: Dependiendo de la zona del frotis podemos leer, linfocitos, realizar la fórmula leucocitaria y visualizar neutrófilos y monocitos.

11/10/2007 Título de la práctica: Hematocrito Fundamento de la práctica: El HCT puede determinarse por métodos manuales o por métodos automáticos. Los métodos manuales consisten en la centrifugación de la sangre, aplicándola una fuerza de 2.000 a 5.000 g (macrometodo) o de 12.000 a 15.000 g (micrometodo). Los métodos automáticos pueden basarse en 2 principios: • El calculo matemático del HCT a partir de los valores de RBC y de volumen corpuscular medio, obtenidos electrónicamente con anterioridad. • El análisis de la sombra que produce la población eritrocitaria, al reflejarse en un campo oscuro. Con los métodos manuales también se cuentan, junto con el volumen de los hematíes, el de los leucocitos, el de las plaquetas y el del plasma que queda atrapado entre los hematíes. Por ello, el valor de HCT conseguido con métodos automáticos es mas exacto y suele ser 1 o 2 unidades mas bajo que el logrado con métodos manuales. Materiales utilizados: • Tubos capilares. Si la muestra es sangre capilar, estos han de estar heparinizados interiormente; mientras que si la muestra es sangre venosa y ha sido adecuadamente anticoagulada, pueden no estar heparinizados. Los heparinizados tienen una franja roja en uno de sus extremos. • Plastilina. • Algodón o gasas. • Una centrifuga de microhematocrito. Esta consta de una especie de plato horizontal -con unos surcos para colocar los capilares, y permite aplicar una fuerza centrifuga de 12.000 a 15.000 g durante un tiempo controlado automáticamente. Una regla milimetrada o un lector de microhematocrito. Procedimiento: 1°. La determinación ha de hacerse por duplicado. 2°. Llenar cada tubo capilar con la sangre, hasta las 3/4 partes de su longitud. El Llenado se efectúa por capilaridad y se realiza poniendo en contacto uno de los extremos del tubo capilar con la gota de sangre, o introduciéndolo en el tubo de sangre e inclinando este, posteriormente, para facilitar el proceso. 3°. Limpiar el exterior de cada tubo con un trozo de algodón o con una gasa. 4°. Sellar el extremo de cada tubo por el que ha entrado la sangre con plastilina. Para ello, se hace penetrar el tubo en la plastilina, o incluso se atraviesa esta con aquel.

5°. Colocar, debidamente equilibrados, los tubos en la centrifuga. En ella los tubos se sitúan con su extremo tapado hacia afuera, ajustados al borde exterior y adecuadamente encajados en sus surcos. 6°. Centrifugar los tubos a unas 12.000 g durante 5 minutos. Resultados: Puede realizarse de 2 maneras: • Midiendo las columnas formadas en el interior de cada tubo con una simple regla milimetrada y calculando, seguidamente, el porcentaje que le corresponde a la columna de eritrocitos, mediante una sencilla regla de tres • Mediante un lector de microhematocrito Interpretación de los resultados: El valor normal del HCT esta comprendido entre el 42 y el 47% en las mujeres, y entre el 45 y el 52% en los varones. Un valor bajo del HCT suele ser signo del padecimiento de una anemia. Sin embargo, hay falsos descensos del HCT ocasionados por hemodilucion Paradójicamente, el HCT suele ser normal en la fase más temprana de las hemorragias agudas, pues en estas se pierden células y plasma en la misma proporción. Un valor alto del HCT suele ser signo del padecimiento de una poliglobulina. Sin embargo, también hay engañosos ascensos del HCT producidos por hemoconcentracion (por ejemplo, el de la deshidratación). Se puede hacer un cálculo aproximado del n° de hematíes por mm3 de sangre, silos hematíes son de forma, tamaño y contenido en hemoglobina normal. La relación entre el n° de hematíes y el hematocrito es una constante K Hematocrito x K = N° hematíes / mm 3 siendo K = 110.000 Resultados obtenidos: Hemos obtenido un hematocrito de 44, por tanto la concentración de hematíes será 44 x 110.000= 440.000 hematíes/ mm 3 Para saber si se ha procedido correctamente, tendremos que comparar nuestro resultado con el obtenido en la cámara de recuento.

11/10/2007 Título de la práctica: Recuento de hematíes Fundamento de la práctica: Para el recuento en cámara de glóbulos rojos, se diluye la sangre problema en un líquido apropiado y posteriormente se deposita en la cámara de recuento, donde se cuentan las células presentes en algunos cuadrados de uno de los retículos. Materiales utilizados: • Unoppete de 1,99 ml. • Capilar de 10 μl • Una cámara de recuento Neubauer.. • Un cubre (hay unos cubres especiales para su use en recuentos con cámara). • Un microscopio. • Líquido de dilución. Este debe ser isotónico con el plasma, para evitar la alteración morfológica e incluso la lisis de los hematíes. El mas utilizado es el de Hayem, que se compone de las siguientes sustancias: - 2,5 g de sulfato sódico. - 0,5 g de cloruro sódico. - 0,25 g de cloruro mercúrico. - 100 ml de agua destilada. • Sangre capilar obtenida por punción del pulpejo de un dedo o sangre venosa procedente de una punción venosa y anticoagulada con EDTA. Procedimiento: 1. Situar un cubre sobre el retículo de la cámara. Para facilitar su adhesión a esta, se ejerce una ligera presión al tiempo que se desliza el cubre sobre las bandas laterales, previamente humedecidas con H2O, de su porción central. 2. Aspirar la sangre con la pipeta hasta llenarle al tope. 3. Limpiar cuidadosamente el exterior de la pipeta con un algodón y sin hacer bajar el nivel de sangre. 4. Se echa la sangre en el unoppete y se diluye con el líquido de Hayen. 5. Una vez disuelta se aspira con la pipeta el líquido necesario para la cámara. 13

Desechar las 3 primeras gotas emitidas por la pipeta. Estas corresponden al líquido presente en el tubo capilar largo de la pipeta de Thoma, que no esta mezclado con la sangre. 7. Depositar la siguiente gota entre la cámara y el cubre. Esto se realiza ubicándola en uno de los bordes no adheridos del cubre y dejándola que penetre por capilaridad, en el espacio existente entre ambas estructuras. Durante esta operación hay que evitar que se formen burbujas y que rebose la sangre diluida por fuera de los bordes del cubre. Para ello, se coloca la pipeta en posición casi vertical, se sitúa la punta de la pipeta en el borde apropiado, se disminuye algo la presión ejercida por el dedo índice sobre el otro extremo de la pipeta y se retira esta justo antes de que se llene completamente el espacio comprendido entre el cubre y la cámara. 8. Dejar reposar la sangre diluida, contenida en la cámara, durante unos minutos, para que las células presentes en ella puedan sedimentarse. 9. Enfocar el retículo con el objetivo de 40 x y con el condensador a baja altura, y verificar que la distribución de los hematíes es homogénea. 10. Contar los hematíes presentes en 80 cuadrados pequeños del cuadrado grande central. Esto se logra, por ejemplo, contando los hematíes que hay en los 4 cuadrados medianos de las esquinas y en el del centro. Resultados: Calcular el n° de hematíes que hay por mm3 de sangre. Para ello primero hemos de calcular el volumen de la solución en la que hemos contado los hematíes: Superficie de un cuadrado pequeño 0.05 x 0,05 = 0,0025 mm2. Superficie de 80 cuadrados pequeños 80 x 0,0025 = 0,2 mm2. Volumen de 80 cuadrados pequeños 0,2 x 0,1 = 0,02 mm2. Siendo R el n° de hematíes contados en los 80 cuadrados pequeños, vamos a calcular la cantidad de sangre de la que provienen estos hematíes, teniendo en cuenta que la dilución hecha es de 1/200, tendremos:

200,mm 3 de solución___________1 mm3= de sangre 0,02 mm 3 de solución__________x mm3 de sangre x = 1/110.000 mm 3 .de sangre 1110.000 mm 3 de sangre__________R hematíes I mm 3 de sangre________________Y hematíes Y=R•10.000. Esto quiere decir que debemos multiplicar el no de hematíes que hemos contado en los 80 cuadrados pequeños por 10.000 y obtendremos los hematíes por mm3 sangre. Interpretación de los resultados: La disminución del RBC se produce en las anemias y su aumento se da en las policitemias. VALORES NORMALES: Hombre: 4.600.000 a 5.180.000 hematíes/ mm3.de sangre. Mujer: 4.200.000 a 5.400.000 hematíes/ mm3.de sangre.

Cuadrado 1 5

Cuadrado 2 3 8

Cuadrado 3 4

Cuadrado 4 8 8

Cuadrado 5 95+85+88+77+97= 442 hemat铆es 200 mm3 soluci贸n----------1 mm3 sangre 0.02 mm3soluci贸n-------x mm3 sangre x= 1/10.000 mm3 sangre 1/10.000 mm3 sangre----442 hemat铆es

18/10/2007

Título de la práctica: Resistencia Globular Eritrocítica Fundamento de la práctica: El estudio de la fragilidad osmótica de los hematíes valora la resistencia de los eritrocitos a soluciones de presión osmótica decreciente, en condiciones constantes de pH y de temperatura. Para ello, se enfrentan los hematíes problema a soluciones tamponadas de cloruro sódico cuya concentración es decreciente a partir de 9 gramos por mil (soluciones hipotónicas). Cuando los eritrocitos están en contacto con soluciones hipotónicas, penetra agua a través de su membrana y se hinchan. Al hincharse los hematíes, una parte de la Hb que contienen puede salir al exterior a través de los poros de su membrana. Si la entrada de liquido es excesiva, los hematíes se rompen y dejan libre toda la Hb que engloban (hemólisis). En condiciones normales, un eritrocito puede aceptar sin hemolizarse una entrada de agua que incremente su volumen en un 70% como máximo. Esta prueba evalúa por tanto la capacidad que tienen los glóbulos rojos de soportar un incremento tenido acuoso (resistencia osmótica eritrocitaria o ROE). Dentro de una misma sangre la ROE de los hematíes varia de unos a otros. Materiales utilizados: • Tubos de hemólisis. • Pipetas de 1 o 2 ml. graduadas para medir cantidades del orden de 0,01 mL • Solución de NaCl al 1% (preparada mediante desecación del NaCl y agua destilada hervida de 5 a 10 minutos para eliminar el oxigeno) y agua destilada. • La muestra será sangre preferiblemente heparinizada. Procedimiento: Partiendo del sodio cloruro al 1% preparamos las siguientes diluciones: 10 ml a10,85%, 10ml al 0,75%..., es decir diluciones cada vez mas hipotónicas. Para ello se puede aplicar C1.V1= C2.V2 Se pipetea en 13 tubos de hemólisis 2ml de cada dilución en cada uno de ellos, a cada tubo añadimos 0,02 ml=20 microlitros de sangre. Mezclamos por inversión e incubamos a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se homogenizan suavemente y se centrifugan durante 5 minutos a 2000 r.p.m. LECTURA: Se anota la concentración del primer tubo donde comienza la hemólisis, que se percibe par la aparici6n de una tonalidad roja en la solua6n y la concentración primera del tubo donde se produce la hemólisis total, que se percibe por un intenso color rojo en la solución y escasa o ningún sedimento de hematíes. Resultados: VALORES NORMALES Resistencia mínima o inicial no debe aparecer a concentraciones superiores al 0,45% ya que indicaría que la resistencia osmótica estaría disminuida. Resistencia máxima o total en condiciones normales corresponde concentraciones inferiores al 0,3% 17

En general los hematíes más jóvenes (recién salidos de MO) son más resistentes que los viejos ya circulantes. Después de grandes hemorragias, la resistencia está aumentada debido a la mayor cantidad de células jóvenes en sangre.

A la hora de la lectura, según avanzamos en el número de tubos el depósito de hematíes es menor, llegando al número 13 donde no hay número de hematíes. La hemólisis va aumentando según disminuye la concentración. Hayamos la resistencia mínima en torno al 0,42-0,46 % y la resistencia máxima en torno al 0,30-0,34 %. Interpretación de los resultados: Cuando la ROE baja, aumenta la hemólisis en los tubos que contienen solución salina a mayor concentración. Esto sucede en la esferocitosis hereditaria, en la eliptocitosis u ovalocitosis congenita y en la estomatocitosis hereditaria, debido a que en estas enfermedades la superficie de los hematíes esta disminuida con respecto a su volumen, por lo que estos toleran peor la entrada de agua y tienen aumentada su fragilidad osmótica. Cuando la ROE sube, la aparici6n de la hemólisis se retarda y empieza a nivel de tubos que contienen solución salina a una concentración menor que lo previsto. Esto acontece con los reticulocitos y con los glóbulos rojos propios de la talasemia minor y de la anemia ferropenica, debido a que estas células tienen 18

incrementada su superficie en relaci贸n con su volumen, por lo que toleran mejor la entrada de agua y tienen disminuida su fragilidad osm贸tica.

8/11/2007 Título de la práctica: Recuento de Glóbulos blancos Fundamento de la práctica: Se efectúa igual que el de hematíes, con la diferencia de que usaremos la pipeta de blancos y el líquido de Turk para hacer la dilución. Debemos dejar la pipeta en reposo unos minutos para dejar que actué el agente hemolizante y destruya los hematíes. A continuación mezclaremos el contenido de la pipeta agitando un poco y desechando las primeras gotas cargaremos la cámara de la misma forma que para el recuento de hematíes. Seguidamente, después de dejar sedimentar las células, la llevaremos al microscopio y procederemos a hacer el recuento de la misma manera que se hace el de hematíes, contando en este caso los 4 cuadrados grandes de las esquinas. Materiales utilizados: • Una pipeta diluidora de glóbulos blancos, para recuento de glóbulos blancos. • Un tubo de goma con boquilla, adaptable a la pipeta diluidora. • Una cámara de recuento Neubauer. • Un cubre (hay unos cubres especiales para su use en recuentos con cámara). • Un microscopio. • Líquido de dilución. El liquido de dilución mas utilizado es el de Turck, que se compone de las siguientes sustancias: - 2 ml de acido acético glacial. - 1 ml de solución acuosa de violeta de genciana al 1%. - 100 ml de agua destilada. El acido acético produce la lisis de los eritrocitos sin alterar a los leucocitos. El violeta de genciana tiñe el núcleo de los leucocitos para que estos puedan observarse mejor. El violeta genciana puede ser sustituido por azul de metileno. • Sangre capilar obtenida por punción del pulpejo de un dedo o sangre venosa procedente de una punción venosa y anticoagulada con EDTA. Procedimiento: Es el mismo procedimiento que para el recuento de glóbulos rojos, pero se cuentan los 4 cuadrados, más grandes, de las esquinas de la cámara. Resultados: Volumen de 4 cuadrados grandes = 0,4 mm3. Siendo B en n° de leucocitos contados en los 4 cuadrados grandes y teniendo en cuenta que la dilución en este caso es de 1/20, tendremos: 20 mm 3 de solución _____________________________ 1 mm 3 de sangre

0,4 mm 3 de solución___________ x mm 3 de sangre x = 0,02 mm 3 de sangre 0,02 mm 3 de sangre_______________ B leucocitos 1 mm 3 de sangre_________________ leucocitos Y leucocitos = B • 50. Esto quiere decir que multiplicando por 50 el n° de leucocitos contados en 4 cuadrados gran - des obtenemos directamente el n° de leucocitos por mm'.de sangre. Interpretación de los resultados: La disminución del R.G.B se produce en las leucopenias, su aumento se da en leucocitosis. VALORES NORMALES: De 4.500 a 11.000 leucocitos /mm3.de sangre. 1 2 4 4 1

Cuadrado 1 1

Cuadrado 2 3 4

Cuadrado 3

Cuadrado 4

20 mm 3 de soluciรณn___________1 mm 3 de sangre 0,4 mm 3 de soluciรณn___________ x mm 3 de sangre x = 0,02 mm 3 de sangre 0,02 mm 3 de sangre_______________ 177 leucocitos 1 mm 3 de sangre_________________ Y leucocitos Y leucocitos = 177 โ ข 50= 8850. El resultado final del recuento de Glรณbulos Blancos es 8850 leucocitos/mm3 de sangre, los resultados estรกn dentro de la normalidad, de 4.500 a 11.000 leucocitos /mm3.de sangre.

13/11/2007 22

Título de la práctica: Determinación de la Hemoglobina Fundamento de la práctica: Se basa en la transformación de la hemoglobina en cianmetahemoglobina mediante los siguientes pasos: En primer lugar el Fe2+ de la hemoglobina, en presencia de ferricianuro potásico, se oxida a Fe3+, dando lugar a la metahemoglobina. Posteriormente, y en presencia de cianuro potásico, la metahemoglobina pasa a cianmetahemoglobina. Este es un compuesto estable, de color rojo, con un pico de absorción máximo a 540 nm y cuya concentración puede ser determinada por métodos calorimétricos empleando un patrón de concentración conocida. Materiales utilizados: • tubos de ensayo • Pipetas de seguridad • Espectrofotómetro o fotocolorimetro • Cubetas para colorimetría • Reactivo de Drabkin: -Ferricianuro potásico 20 mM -Cianuro potásico 43 mM -Conservantes y estabilizantes • Estándar equivalente a 20 mg de hemoglobina/dl. • Sangre total anticoagulada con EDTA. Procedimiento: Preparamos tres tubos rotulados como B y P y M. Tendremos gran precaución al pipetear el reactivo de Drabkin, ya que contiene cianuro potásico y es muy toxico.

Muestra (ml) Reactivo (ml)

5'0

0'01 5'0

El tubo B es el blanco de reactivos, porque el reactivo de Drabkin es de color amarillo y, aunque en condiciones normales su absorbancia debe ser cero, nos aseguramos de no incluir errores en la técnica. Lo utilizamos como blanco de la técnica y hacemos la lectura del problema frente a el. El tubo P es el patrón, se lee directamente, ya que esta preparado como cianmetahemoglobina equivalente a una concentración de hemoglobina de 20 g/dl. Dado que no precisa manipulación, y que es estable en condiciones de conservación adecuadas, no es necesario medir su absorbancia (D.O.) en cada determinaciónn. El M es la muestra, donde se mezcla el problema con el reactivo de Drabkin. 23

Encendemos el fotocolorímetro o el espectofotómetro y procedemos de la siguiente forma: 1. Introducimos la fecha 2. Pulsamos para la medición de absorvancias 3. Técnica colorimétrica monocomática 4. Utilizam os una longitud de3 onda de 546 que es la que más se acerca. 5. Seleccio namos para que

termostate una temperatura de 25 ºC 6. Esperamos 5 minutos mientras que está termostatando y luego procedemos a la medición de las absorvancias Cálculos: Los cálculos para saber la concentración son una simple regla de 3, ya que conocemos la concentración del patrón (indicada en la caja de él) y la absorbancia medida anteriormente. Procedemos así: Concentración patrón X= concentración muestra

15 g/dl patrón X= 13,1 g/dl muestra

absorbancia patrón absorbancia de la muestra

0.145 0,127

Interpretación de los resultados: Los valores normales son: Hombres: 14-18 g/dl. Mujeres: 11-16 g/dl. Niños: 10-14 g/dl.

La muestra medida daba como concentración 13,1 g/dl por lo tanto está dentro de la normalidad. En este caso, es preferible hablar de valores de referencia, ya que existen diferencias notables entre zonas geográficas y grupos étnicos donde existen ciertas anemias carenciales que afectan a un número elevado de la población.

15/11/07 Título de la práctica:

Determinación cuantitativa del hierro Fundamento de la práctica: En primer lugar, el hierro ferrico presente en la muestra y unido a la transferrina es liberado por la acción de guanidinio. Seguidamente, el hierro ferrico libre es reducido a ferroso por la hidroxilamina. Posteriormente, el hierro ferroso reacciona con la ferrozina para producir un complejo coloreado. Finalmente, la intensidad de formación del complejo coloreado es medida espectrofotometricamente. Material: • tubos de plástico de un solo uso. • Un rotulador de vidrio. • 2 pipetas graduadas de 1 ml. • 1 pipeta automática capaz de dispensar 200 µl. • Puntas de pipeta automática. • 3 cubetas de espectrofotometría. • Un espectrofotómetro. • Reactivos

R1 Tampon R2 Reductor R3 Color IRON CAL

Citrato pH 2,2 Acido ascorbico TPTZ

50 mmol/L 113,5 mmol/L _ 9,6 mmol/L

Patrón primario acuoso de Hierro 100 μg/dL __

Reactivo de trabajo (RT): Disolver el contenido de un vial de R 2 Reductor en un frasco de R 1 Tampón. Tapar y mezclar suavemente hasta disolver su contenido. Estabilidad del reactivo de trabajo: 1 mes en nevera (2-8 °C). R3: Listo para su uso.

Procedimiento: Es una técnica que se desarrolla en dos pasos

RT (mL) Patrón (μl) Muestra (μl) 1. 2. 3. 4.

Blanco 1,0 --

Patron 1,0 250 --

Muestra 1,0 250

Se vierte en la cubeta un poco de agua destilada y se mide su absorbancia Se prepara la muestra patrón y se mide su absorbancia Se prepara y se mide la absorbancia de la muestra problema Se añade una gota de R3 (TPTZ) a cada tubo, se mide su absorbancia de cada uno.

Longitud de onda: ..........595 nm (550-600) Cubeta:...............................1 cm paso de luz Temperatura .....................37°C / 30°C / 25°C Ajustar el espectrofotómetro a cero frente a agua destilada. Pipetear en una cubeta. Cálculos: Absorvancias medidas: Blanco 1º Medicion 0,000 2º con TPTZ 0,000 (A2- A1) Muestra (A2- A1) Patrón

Patron 0.515 0.021

Muestra 0.477 0.105

X 100 (conc. patrón) = μg/dl de Fe en muestra

(0,477- 0,105) Muestra X 100 (conc. patrón) = 83,3 μg/dl de Fe en muestra (0,515- 0,021) Patrón Interpretación de los resultados: VALORES DE REFERENCIA Hombres: 65 - 145 μg/dL (11,6- 31,3 μmol/L) Mujeres: 40 - 150 μg/dL (7,16 - 26,85 μmol/L). Estos valores son orientativos. Es recomendable que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia. El resultado obtenido ha sido 83,3 μg/dl de Fe en muestra, este resultado se encuentra dentro de los valores normales