Practicas de hematologia 2 by Juan Carlos Vázquez

8/01/08 Título de la práctica: Determinación cuantitativa del hierro Fundamento de la práctica: En primer lugar, el hierro ferrico presente en la muestra y unido a la transferrina es liberado por la acción de guanidinio. Seguidamente, el hierro ferrico libre es reducido a ferroso por la hidroxilamina. Posteriormente, el hierro ferroso reacciona con la ferrozina para producir un complejo coloreado. Finalmente, la intensidad de formación del complejo coloreado es medida espectrofotometricamente. Material: • tubos de plástico de un solo uso. • Un rotulador de vidrio. • 2 pipetas graduadas de 1 ml. • 1 pipeta automática capaz de dispensar 200 µl. • Puntas de pipeta automática. • 3 cubetas de espectrofotometría. • Un espectrofotómetro. • Reactivos

R1 Tampon R2 Reductor R3 Color IRON CAL

Citrato pH 2,2 Acido ascorbico TPTZ

50 mmol/L 113,5 mmol/L _ 9,6 mmol/L

Patrón primario acuoso de Hierro 100 μg/dL __

Reactivo de trabajo (RT): Disolver el contenido de un vial de R 2 Reductor en un frasco de R 1 Tampón. Tapar y mezclar suavemente hasta disolver su contenido. Estabilidad del reactivo de trabajo: 1 mes en nevera (2-8 °C). R3: Listo para su uso.

Procedimiento: Es una técnica que se desarrolla en dos pasos

RT (mL) Patrón (μl) Muestra (μl)

Blanco 1,0 --

Patron 1,0 250 --

Muestra 1,0 250

1. Se vierte en la cubeta un poco de agua destilada y se mide su absorbancia 2. Se prepara la muestra patrón y se mide su absorbancia 3. Se prepara y se mide la absorbancia de la muestra problema 4. Se añade una gota de R3 (TPTZ) a cada tubo, se mide su absorbancia de cada uno. Longitud de onda: ..........595 nm (550-600) Cubeta:...............................1 cm paso de luz Temperatura .....................37°C / 30°C / 25°C Ajustar el espectrofotómetro a cero frente a agua destilada. Pipetear en una cubeta. Resultados: Absorvancias medidas: Blanco 1º Medicion 0,000 2º con TPTZ 0,000 (A2- A1) Muestra (A2- A1) Patrón

Patron 0.515 0.021

Muestra 0.477 0.105

X 100 (conc. patrón) = μg/dl de Fe en muestra

(0,477- 0,105) Muestra X 100 (conc. patrón) = 83,3 μg/dl de Fe en muestra (0,515- 0,021) Patrón Interpretación de los resultados: VALORES DE REFERENCIA Hombres: 65 - 145 μg/dL (11,6- 31,3 μmol/L) Mujeres: 40 - 150 μg/dL (7,16 - 26,85 μmol/L). Estos valores son orientativos. Es recomendable que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia. El resultado obtenido ha sido 83,3 μg/dl de Fe en muestra, este resultado se encuentra dentro de los valores normales

17/01/08 Título de la práctica: Fórmula leucocitaria Fundamento de la práctica: La formula leucocitaria o recuento diferencial leucocitario (RDL) consiste en la determinación del porcentaje que representa cada uno de los tipos de leucocitos con respecto al total de ellos. Material:

• •

• • •

Microscopio. Papel y lápiz o un registrador automático de células. Este último consiste en un aparato que tiene unas teclas. Cada tecla representa a un tipo de leucocito y hace una anotación cada vez que es presionada. Cuando el número de anotaciones llega a 100, suena una alarma. Aceite de inmersión Extensión de sangre teñida Papel de óptica

Procedimiento: 1. Preparar el microscopio para que tenga el condensador alto y el diafragma abierto. 2. Enfocar la preparación con el objetivo de 10 x. 3. Comprobar que la preparación es buena y elegir una zona en la que los hematíes no estén superpuestos y los leucocitos se encuentren uniformemente distribuidos. 4. Enfocar esa zona de la preparación con el objetivo de inmersión. 5. Observar esa zona de la preparación mientras se describe un recorrido en forma de almenas o de greca. Resultados: • Las células contadas pueden anotarse mediante un registrador automático de células; pero esto también puede hacerse mediante un lápiz y papel. Para ello se dibujan unas columnas que representen cada un tipo de leucocito, y se traza una raya en la columna correspondiente cada vez 3

•

que se ve un leucocito, o también se puede utilizar el método que se ve en la figura anterior. Cuanto mayor es el número de leucocitos contados, mas exacta es la determinación. Sin embargo, en la practica solo se cuentan 100 leucocitos o, como máximo, 200. Si se encuentra un mayor numero de linfocitos que de neutrófilos (en el adulto) o más de un 10% de eosinófilos o más de un 12% de monocitos, el RDL se hace contando 200 leucocitos y dividiendo, posteriormente, el resultado obtenido entre 2.

Interpretación de los resultados: Hay que tener en cuenta que hasta los 4 años de vida se observa una inversión de la formula leucocitaria, es decir, normalmente se encuentran en sangre periférica más linfocitos que neutrófilos. Las alteraciones cuantitativas de los leucocitos se reseñan en la siguiente tabla: VALORES obtenidos NEUTROFILOS SEGMENTADOS

2.000-8.000/mm3 46

VALORES NORMALES 2.000-8.000/mm3 45-75

NEUTROFILOS EN CAYADO

EOSINOFILOS BASOFILOS MONOCITOS

LINFOCITOS

0-9 %

0-800/mm 5

0-800/mm 0-5 %

0-200/mm 1

160-1.000/mm 4

VALORES BAJOS

Neutrofilia

Neutropenia

Desviacion a la

izquierda

derecha

Eosinofilia

Eosinopenia

Basofilia

Basopenia

Monocitosis

Monocitopenia

Linfocitosis

Linfopenia

0-200/mm 1-2 % 3

1.000-5.000/mm3 34%

VALORES ALTOS

160-1.000/mm 3-8%

1.000-5.000/mm3 20-44 %

En esta imagen se expresa el lugar y la forma de hacer el recuento diferencial 4

17/01/08 Título de la práctica: Determinación de la Hb A2 Fundamento de la práctica: La fase estacionaria de una CLS puede ser empaquetada en forma de columna, en este caso se dice que la cromatografía es en columna. Mediante el empleo de una microcolumna preparada a base de una resina apropiada y mediante un mecanismo de intercambio de aniones, la Hb A2 puede ser separada de las otras hemoglobinas y del resto de sustancias presentes en la sangre, para, posteriormente, ser cuantificada espectrofotométricamente. En esta determinación, después de preparar un hemolizado, las hemoglobinas son retenidas por una resina de intercambio aniónico. Tras ello, la hemoglobina A2 se eluye de una forma especifica, bajo estrictas condiciones de pH y fuerza i6nica. Finalmente, la hemoglobina A2 se cuantifica mediante lectura espectrofotométrica a 415 nm. Material:

• Tubos de recogida de sangre que contengan heparina o EDTA como anticoagulante. • Pipetas Pasteur. • Pipetas graduadas de 2, 5 y 10 ml. • Una prepipeta o pera de aspiración. • Micropipetas automáticas capaces de dispensar 50, 100 y 200 µl. • Puntas de micropipeta (amarillas). • Un rotulador de vidrio. • Tubos de ensayo. • Una gradilla. • Un espectrofotómetro ajustable a 415 nm. • Cubetas de espectrofotómetro. • Papel y un bolígrafo. • Agua destilada o desionizada. • Reactivo, tampón biológico 15mol/l, detergente 0,1 g/l, pH 7,6 • Microcolumnas Contienen una resina de intercambio aniónico equilibrada. En ella quedan retenidas las hemoglobinas.

Procedimiento: 1. A partir de la sangre problema se ha de preparar un hemolizado que contenga la Hb libre en solución. Este hemolizado se prepara de la

siguiente forma: a) Pipetear en un tubo de ensayo 50 µl de sangre y 200 µl de reactivo. b) Agitar bien. Este hemolizado se utilizara en la separación y lectura de la Hb A 2. 2. A partir del hemolizado anterior se debe preparar una dilución que contenga la Hb a una concentración menor. Esta dilución del hemolizado se prepara de la siguiente manera: a) Pipetear en un tubo de ensayo 50 μ1 de hemolizado y 12 ml de agua destilada. b) Agitar bien. Esta dilución del hemolizado se empleará en la lectura de la Hb total. (Paso 9) 3. Destapar la parte superior de la microcolumna, romper a continuación la lengüeta inferior y bajar el disco superior hasta el nivel de la resina, evitando comprimirla, con la ayuda del extremo piano de una pipeta. 4. Dejar gotear hasta que el líquido alcance el nivel del disco, desechando el eluído. 5. Aplicar cuidadosamente sobre el disco superior 50 μ1 de hemolizado y se desecha el eluído. 6. Cuando haya penetrado todo el hemolizado añadir, procurando arrastrar los posibles restos del mismo, 200 µl de reactivo y se desecha el eluído. 7. Colocar la microcolumna sobre un tubo de ensayo y añadir: 3,0 ml de reactivo y se recoge el eluído (fracción de HbA2) 8. Agitar bien y leer la absorbancia de la fracción Hb A2 a 415 nm. frente a agua destilada (AHbA2). 9. Agitar bien la dilución del hemolizado, preparada previamente y que contiene toda la Hb. 10. Leer a 415 nm. y frente a agua destilada, la absorbancia de la Hb total (AHbT). Resultados: Tubos

Absorbancia

Blanco

0,000

HbA2

0,079

Hbt

0,683 V HbA2 = 3 ml. V Hbt = 12 ml. Una vez efectuadas las medidas de absorbancia, se calcula el porcentaje que representa, en la muestra, la HbA 2 con respecto al resto de las

hemoglobinas. Para ello, se utiliza la siguiente formula: AHbA2 x VHbA2 x 100= % HbA2 AHbt x VHbt 0,079 X 3 x 100= 2,89 % HbA2 0,683 X 12 Interpretación de los resultados: Los valores normales de Hb A2 en la sangre periférica están comprendidos, entre el 1,3% y el 3,7% del total de la hemoglobina presente en aquella. Un aumento del porcentaje normal de la HbA 2 detectada en la sangre, que oscila entre el 4 y el 10%, suele darse en la β-talasemia. Cuando se encuentra un porcentaje de Hb A 2 sanguínea superior al 10%, es probable que ello se deba a la existencia en la sangre de hemoglobinas anómalas (Hb E, Hb C, Hb Koln, etc.) que tienen un punto Isoelectrico* (pl) similar al de la Hb A2 y que, debido a ello, son eluídas junto con esta, por lo que falsean la determinación. Los resultados obtenidos se encuentran dentro de los valores normales por lo tanto no hay una β-talasemia. La β-talasemia es una hemoglobinopatia hereditaria caracterizada por una producción disminuida de cadenas globínicas β. Estas cadenas forman parte de la estructura de la hemoglobina A). En el rasgo β-talasémico la concentración de hemoglobina A2 en sangre se encuentra elevada ya que se produce un aumento de la síntesis de hemoglobinas no constituidas por cadenas β. En el diagnóstico del rasgo β-talasémico, deben tenerse en cuenta tanto los niveles de hemoglobina A2 como el historial familiar y los datos de laboratorio, incluyendo el hierro en suero y la capacidad de fijación del hierro, la morfología de los hematíes, la hemoglobina, el hematocrito y el volumen corpuscular medio. El diagnóstico clínico no debe realizarse teniendo en cuenta el resultado de un` único ensayo, sino que debe integrar los datos clínicos y de laboratorio.

17/01/08 Título de la práctica: Determinación del grupo sanguíneo en porta Fundamento de la práctica: Consiste en observar la aglutinación de los hematíes enfrentados a una serie de antisueros conocidos y de reconocida eficacia, para determinar el grupo ABO del individuo. Material: • 2 portaobjetos o tarjeta visualizadora de fondo blanco. • Un rotulador de vidrio. • Una pipeta pasteur desechable. • Palillos mezcladores. • reloj. • Suero anti-A. • Suero anti-B. • Suero anti- AB • Sangre capilar o sangre total anticoagulada, citratada u oxalatada.

Procedimiento: 1. Coger dos portaobjetos. Marcar una con la letra A, otra con letra B y otra con las letras A y B 2. Depositar una gota de suero anti-A (azul) en la sección A del portaobjetos, una gota del suero anti-B (amarillo) en la sección B, y otra gota de anti-AB (transparente) eN la sección AB. 3. Situar una pequeña gota de sangre (aproximadamente la mitad del volumen usado de antisuero) junto a la gota de antisuero. 4. Mezclar ambas gotas en cada sección utilizando un palillo distinto en cada una de ellas y formando un circulo de 2 a 2,5 cm de diametro. 5. Hacer oscilar suavemente el portaobjetos hacia delante y hacia detrás, durante dos minutos. 6. Observar la presencia o ausencia de aglutinación.

Lectura de resultados: Hay aglutinación cuando aparecen unos grumos rojos que flotan en un liqui do claro. En el caso contrario, los hematíes permanecen en forma de suspen sión homogénea de color rojizo. La presencia o ausencia de aglutinación puede confirmarse mediante exa men microscópico de las mezclas. En general estas pruebas son muy eficaces ya que la presencia de plasma en la muestra aumenta la velocidad de la reacción y el tamaño de los grumos. El resultado puede observarse en unos segundos, aunque conviene reexaminar la reacción del anti-A al cabo de 2 minutos para comprobar que no se ha pasado por alto ninguna reaccion debil. Estas suelen ocurrir en menos de un 1 % de las muestras analizadas. Interpretación de los resultados: El grupo eritrocitario que se le asignara, atendiendo a los resultados obtenidos, se puede ver en el cuadro siguiente: Hematíes y suero anti-A + +

Hematíes y suero anti-B Grupo eritrocitario A + B + AB 0

+ = presencia de aglutinacion - = ausencia de aglutinacion En el caso de que el grupo obtenido sea el A, los hematíes problema deberán ser ensayados de nuevo con lectina anti-A1; de forma que si se produce aglutinación, el sujeto pertenecerá al subgrupo A1.

17/01/08 Título de la práctica: Determinación celular en tubo Fundamento Los hematíes problema contienen las sustancias antigénicas del sistema ABO y se enfrentan a sueros conocidos que poseen anticuerpos frente a esos antígenos. El resultado final es la presencia o no de aglutinación en los hematíes reaccionantes. Materiales: • • • • • • • • • •

Tubos de centrifuga Rotulador de vidrio Pipetas Pasteur Centrifuga Gradillas Suero anti-A Suero anti-B Suero anti-AB Solucion salina fisiologica. Sangre total anticoagulada. Para esta técnica es preferible usar una suspensión de los hematíes problema.

Procedimiento: 1. En primer lugar realizamos el lavado de los hematíes problema. Para ello rotulamos convenientemente un tubo de centrifuga y añadimos 1 ml de la muestra de sangre. Completamos el tubo con solución salina y agitamos para suspender los hematíes. Centrifugamos 4 minutos a 2000 r.p.m. y decantamos el sobrenadante. 2. A los hematíes del tubo les añadimos una cantidad suficiente de solución salina como para obtener una suspensión al 2%. Esto es aproximado, aunque debemos establecer los limites entre el 2 y el 4% 3. Rotular tres tubos de ensayo bien limpios con las letras A, B y AB. 4. Añadir a cada tubo una gota de la suspensión de hematíes al 2%. 5. Añadir dos gotas de suero anti-A en el tubo A, dos gotas de anti-B en el tubo B, y dos gotas de anti-AB en el tubo AB. 6. Centrifugamos todos los tubos durante 1 minuto a 1.000 r.p.m. o 30 segundos a 3.400 r.p.m (centrifuga de inmunohematologia). Lectura de resultados Después de centrifugar, golpeamos suavemente el fondo de cada tubo para desprender el sedimento y observar macroscópicamente la presencia o ausencia de aglutinación. 10

Reacción negativa: Los hematíes se resuspenden homogeneamente. Reacción positiva: Se observa un botón de hematíes que permanecen unidos una vez desprendido el sedimento. Interpretación clínica: Se realiza igual que en la técnica en porta. Es importante destacar que los restos de detergente o sustancias extrañas en los tubos pueden ocasionar falsos negativos. También pueden darse falsos positivos, principalmente por dos motivos: • Aglutinación no especifica: Se debe a la presencia de acido hialuronico en la sangre, procedente de la gelatina de Wharton del cordón umbilical, y se elimina añadiendo una gota de hialuronidasa a la suspensión de hematíes. • Fenomeno de Rouleaux: Consiste en una agrupación no específica de hematíes, que adoptan una imagen de pilas de monedas. Las sustancias que mas frecuentemente originan este fenómeno son: el fibrinógeno, las gammaglobulinas, el dextrano y la polivinilpirrolidona. Estos fenómenos pueden evitarse con el lavado previo de los hematíes problema.

17/01/08 Título de la práctica: Determinación del grupo Rh en porta Fundamento La técnica está basada en la detección del antígeno D sobre la superficie de los hematíes problema, empleando como reactivo un suero monoclonal huma no que contiene anticuerpos anti-D. En el caso de que los hematíes contengan el antígeno D se producirá una tinación que puede observarse a simple vista. Material: • Portaobjetos • Pipetas Pasteur. Rotulador de vidrio. • Palillos agitadores. • Suero anti-D. • Sangre total anticoagulada. Procedimiento 1. Depositar una gota de suero anti-D sobre el porta 2. Situar una pequeña gota de sangre (aproximadamente la mitad del volumen usado de antisuero) junto a la gota de antisuero. 3. Mezclar ambas gotas utilizando un palillo distinto en cada una de ellas y formando un círculo de 2 a 2,5 cm de diametro. 4. Hacer oscilar suavemente el portaobjetos hacia delante y hacia detrás, durante dos minutos. 5. Observar la presencia o ausencia de aglutinación. Lectura de resultados: Esperamos dos minutos antes de dar el resultado de la prueba. Aglutinación positiva: Aparición de grumos rojos sobre un fondo claro. No deben confundirse con pequeños coágulos de fibrina presentes en la muestra. Aglutinación negativa: La mezcla da lugar a una suspensión homogénea de los 12

hematíes. La mezcla de sangre con albúmina bovina debe dar siempre aglutinación negativa. En caso de no ser así, no podemos informar del resultado de la prueba. Interpretación de los resultados Los resultados se interpretan según el siguiente cuadro: Agutinación Interpretación n Rh negativo + Rh positivo + = Aglutinación positiva -= Aglutinación negativa

17/01/08 Título de la práctica: Determinación del grupo Rh en tubo Fundamento: Al igual que en la prueba en portaobjetos, intentamos poner de manifiesto la presencia del antígeno D en la superficie de los hematíes mediante su enfrentamiento a un suero anti-D. Material necesario • Tubos

de centrífuga.

• Rotulador

de vidrio.

• Gradilla. • Pipetas

Pasteur. • Centrífuga. • Suero anti-D. • Albúmina bovina al 30%. • Solución salina fisiológica (al 0,9%) • Hematíes problema preparados en suspensión al 5%.Antes de proceder a suspender los hematíes debemos lavarlos tres veces en solución salina fisiológica. Para ello tomamos un volumen aproximado de 0,5 ml de la sangre problema y la llevamos a un tubo de centrífuga. Completamos el tubo con solución salina y agitamos suavemente para resuspender los hematíes. Centrifugamos durante 4 minutos a 2.000 r.p.m. Posteriormente retiramos el sobrenadante y repetimos el proceso dos veces más. El sedimento hemático resultante se resuspende en la cantidad de solución salina necesaria para obtener una suspensión al 5%. Procedimiento: 1. Rotulamos dos tubos limpios con las letras D y A. 2. En el tubo D añadimos una gota de suero anti-D y el tubo A ponemos una gota de albúmina bovina al 30%. 3. A cada tubo le añadimos una gota de la suspensión de hematíes al 5%. Agitamos suavemente para mezclar el contenido de los tubos. 4. Centrifugamos durante 1 minuto a 1000 r.p.m. o 30 segundos a 3.500 r.p.m. Lectura de resultados Con el pulpejo de los dedos medio y anular golpeamos suavemente el fondo de los tubos para despegar el botón hemático. Se considera aglutinación positiva si se forman grumos de color rojo en un líquido claro. Por el contrario, si se resuspenden homogéneamente los hematíes, decimos que la

aglutinación es negativa. El tubo con albúmina es un control negativo, y debe dar siempre ausencia de aglutinación. En caso de no ser así. El resultado de la prueba no es válido. Interpretación clínica de los resultados: Si el tubo D presenta aglutinación y el tubo A no, decimos que el paciente es Rh positivo. Si no se produce aglutinación en ninguno de los dos tubos procedemos a incubar ambos a 37° C durante media hora. Posteriormente centrifugamos a 1.000 r.p.m. durante un minuto y observamos si existe o no aglutinación. En el caso de persistir la negatividad comprobaremos que el paciente no posee un DU (D débil) mediante una prueba de Coombs indirecta. Si después de todos estos pasos el resultado es la no aglutinación, informaremos que el paciente es Rh negativo.

24/01/08 Título de la práctica: Determinación sérica del grupo ABO Fundamento: El suero de un individuo sólo debe contener anticuerpos frente a los antígenos que no están presentes en sus propios hematíes. Por ello, al hacer reaccionar este suero con hematíes conocidos del grupo A y del grupo B, sólo producirá aglutinación en el caso de ser enfrentado a eritrocitos con antígenos distintos a los de sus propios hematíes. Esta técnica puede realizarse tanto en porta como en tubo, aunque se prefiere la determinación en tubo porque la centrifugación de los hematíes intensifica el fenómeno de aglutinación. Material necesario Tubos de centrífuga. • Pipetas Pasteur. • Baño de agua. • Centrífuga • Reloj. • Rotulador de vidrio. •

•

Gradilla.

Hematíes del grupo A • Hematíes del grupo B. • •

Hematíes del grupo 0.

•

Hematíes de la sangre problema

•

Suero obtenido mediante coagulación de la sangre en baño de agua a 37 °C durante 20 a 30 minutos. Posteriormente centrifugamos durante 10 minutos a 3.000 r.p.m. y extraemos el sobrenadante con ayuda de una pipeta Pasteur.

Procedimiento: 1. Para evitar falsos negativos por la presencia de complemento activo en el suero, es aconsejable la inactivación previa de la muestra. Esto se realiza manteniendo el suero en un baño de agua a 56 °C durante 10 minutos. Con esto evitamos los fenómenos de hemólisis debidos al complemento. 2. Lavamos tres veces los hematíes propios de la sangre problema con solución salina isotónica según la técnica descrita en la práctica XVIII. Posteriormente preparamos una suspensión de estos hematíes al 5% en

solución salina. 3. Rotulamos un tubo de centrífuga con la letra A1, otro B, otro O y otro C. 4. Añadimos a cada tubo dos gotas del suero problema inactivado. 5. Depositamos una gota de la suspensión de hematíes que se corresponda con la letra del tubo rotulado. En el tubo C añadimos una gota de la suspensión de los hematíes propios de la sangre problema, ya que nos servirá de control negativo. 6. Agitamos suavemente y centrifugamos a 1.000 r.p.m. durante 1 minuto. Lectura de resultados Golpeamos suavemente el extremo inferior de los tubos para despegar el sedimento hemático. Si aparecen unos grumos rojos flotando en un líquido claro indica que existe aglutinación. En el caso contrario, los hematíes se resuspenden homogéneamente dando lugar a un líquido de color rojizo. Interpretación clínica de los resultados: El grupo eritrocitario que se asignará, atendiendo a los resultados obtenidos, se puede ver en el siguiente cuadro, aunque nosotros solo utilizamos un tubo para el grupo A genérico: Tubo Al Tubo A2 Tubo B Tubo Tubo C Ac presentes Grupo O en el suero eritrocitario + Anti-B A1 - o +* + - Anti-B y anti-A1 " A2 + + Anti-A B + + + Anti-A y anti-B O - o +" +

AB Ninguno 1 Ninguno o AntiA2 B A1 Autoanticuerpos Ininterpretable

+ = Aglutinación - = No aglutinación * = Este anti-Al se encuentra sólo en un 2% de los individios A2. " = Este resultado se observa sólo en el 25% de los individuos A2B. Es difícil confirmar el grupo sanguíneo por esta técnica en el caso de los recién nacidos, ya que sus anticuerpos no están bien desarrollados aún. También encontramos dificultades en los pacientes con agammaglobulinemia, ya que carecen de anticuerpos, y en aquellos que poseen otros anticuerpos específicos o inespecíficos capaces de reaccionar con los antígenos del grupo ABO.

Discrepancias entre la prueba celular y la sérica En el caso de no obtener el mismo resultado en ambas pruebas debemos proceder de la siguiente manera: 1. Repetir ambas pruebas. 2. En el caso de persistir la discrepancia, se obtendrá una nueva muestra de sangre y se realizarán ambas pruebas utilizando hematíes lavados y resuspendidos correctamente a la concentración óptima de cada técnica. 3. Efectuar una prueba de Coombs directo sobre los hematíes para detectar posibles autoanticuerpos. 4. Realizar la prueba sérica utilizando un panel de screening con hematíes A1, A2, B, O. Causas de la discrepancia entre la prueba celular y sérica Las causas más frecuentes obedecen a tres tipos distintos: 1. Errores técnicos: • Identificación incorrecta de las muestras o anotación de los resultados. • No añadir todos los reactivos y muestras correspondientes. • Contaminación de los reactivos o hematíes del panel de screening. • Proporción inadecuada de muestra y reactivos. • Sobrecentrifugación o centrifugación insuficiente. • No valorar la hemólisis considerándola como aglutinación negativa. 2. Problemas con la muestra: • Presencia de autoanticuerpos. • Antígenos A o B débiles, congénitos o adquiridos. • Especificidad B adquirida en pacientes A1., por una infección bacteriana. Inmunodeficiencias congénitas o adquiridas.

29/01/08 18

Título de la práctica: Detección del carácter secretor de los antígenos del grupo sanguíneo ABH de la saliva Fundamento de la práctica: Esta práctica consiste en poner en contacto la saliva de la persona sometida a estudio con sueros que contienen anticuerpos dirigidos específicamente contra los antígenos del sistema ABH que se cree que pueden ser secretados. Seguidamente, se pone en contacto la mezcla anterior con hematíes que presentan en su superficie el antigeno estudiado. Por ejemplo, si una persona es del grupo A, se pone en contacto con su saliva, en primer lugar con un suero anti-A y, posteriormente, con hematíes del grupo A. Una persona secretora tiene presentes en su saliva los antígenos del sistema ABH que se encuentran en la superficie de sus hematíes. Debido a ello, al poner en contacto su saliva con sueros que contienen anticuerpos dirigidos específicamente contra estos antígenos, no se verifica un bloqueo de estos últimos. Por consiguiente, al añadir a la mezcla anterior, los hematíes susceptibles de ser aglutinados, no se producirá una aglutinación de los mismos. Por el contrario si la persona no es secretora, no tiene presentes en su saliva los antígenos del sistema ABH que se encuentran en la superficie de sus hematíes. Debido a ello, al poner en contacto su saliva con sueros que contienen anticuerpos dirigidos específicamente contra estos antígenos, no se verifica un bloqueo de estos últimos. Por consiguiente al añadir a la mezcla anterior, los hematíes susceptibles de ser aglutinados se producirán una aglutinación de estos últimos. Como en esta prueba lo que indica positividad (posesión de carácter secretor) es la ausencia de aglutinación y lo que indica negatividad (carencia de carácter secretor) es la aparición de aglutinación se dice que es una técnica de inhibición de la hemoaglutinación. Material necesario: • Tubos de ensayo apropiados para centrifugación • Un rotulador de vidrio • Pipetas Pasteur • Un cronómetro • Una centrífuga • Un baño de agua • Ractivos: Suero fisiológico Lectina anti-H Suero anti-A Suero anti-B Hematíes de tipo A y B adecuadamente lavados y suspendidos al 3-5% en suero fisiológico Saliva de una persona no secretora, adecuadamente procesada

Muestra: 19

De 2 a 5 ml de saliva, recogida en un recipiente apropiado o, directamente, en un tubo de ensayo. Esta saliva debe ser procesada de la siguiente forma: Calentar la saliva, poco tiempo después de su recolección, durante 10 minutos, en un baño de agua previamente ajustado a temperatura de ebullición. Con esto se pretende la destrucción de las enzimas salivares. Centrifugar durante 5 minutos, a unas 3500 r.p.m. Tras esto se ha de obtener un sobrenadante claro. Recoger el sobrenadante y transferirlo a un tubo de ensayo limpio, previamente rotulado con las siglas "MS" (de muestra de saliva) y con la fecha de procesamiento. Conservar la muestra de saliva, convenientemente procesada, a 2-8 grados, hasta el día de su análisis. También puede congelarse la muestra, durante períodos largos de tiempo. Técnica: 1°- Rotular un tubo de ensayo con la letra C (de control) y otra con la letra T (de test) 2°- Situar, en ambos tubos, 1 gota de lectina o del antisuero capaz de reaccionar con el antígeno que se pretende detectar (H,A o B). El antisuero o lectina a utilizar depende del grupo ABO al que pertenece la persona investigada. 3°- Añadir una gota de la saliva procedente de una persona no secretora, en el tubo C, y una gota de la muestra en el tubo T. 4°- Agitar el contenido de ambos tubos hasta obtener una buena mezcla de las substancias 5°- Incubar ambos tubos, a temperatura ambiente (20-25 grados), durante 10 minutos 6°- Agregar a cada tubo una gota de la suspensión de hematíes que presenta el antígeno sometido a estudio 7°- Agitar el contenido de ambos tubos hasta obtener una buena mezcla de todas las sustancias que contienen 8°- Incubar los dos tubos, a temperatura ambiente, durante 5 minutos 9°- Inmediatamente después, centrifugar el contenido de ambos tubos, a unas 3500 r.p.m., durante unos 20 segundos 10°- Mediante un suave golpeteo ejercido con los dedos resuspender el botón sedimentario formado en el fondo de cada uno de los tubos Lectura de los resultados: Hay aglutinación cuando aparecen unos grumos rojos que flotan en un líquido claro. En el caso contrario los hematíes se resuspenden homogéneamente, dando lugar a un líquido de color rojizo. En esta prueba, la presencia de aglutinación es considerada como un resultado negativo y la ausencia de aglutinación indica un resultado positivo. Un resultado negativo se produce en personas no secretoras y un resultado positivo en personas secretoras Si los aglutinados formados son débiles, una vigorosa agitación durante la resuspensión del botón sedimentario, puede dispersarlos y dar lugar a una errónea lectura del resultado.

Pueden aparecer falsos positivos o negativos a consecuencia de una contaminación de los reactivos, un inadecuado almacenamiento de los mismos, una incorrecta incubación o centrifugación, una omisión de alguno de los reactivos y en determinados procesos patológicos. • Saliva A (Paula): no hay aglutinación por lo que es una persona secretora. • Saliva B (Fátima): se aprecia aglutinación tras ejercer un suave golprteo por no que no es secretora. Interpretación de los resultados obtenidos: El 80% de las personas de raza caucásica son secretoras. La detección del carácter secretor de una persona puede tener interés en el ámbito de la medicina legal. Así pues, por ejemplo, si se encuentra esperma en el lugar donde se ha cometido un acto delictivo y se determina analíticamente el carácter no secretor del individuo del que procede este líquido corporal, posteriormente, se puede descartar la autoría del hecho criminal por parte de un sospechoso, en el caso de que, tras el estudio de la saliva de éste, se establezca su carácter secretor. En el 90% de la población, también se encuentra una gran cantidad de antígenos Lewis (a o b), en la saliva. En el 10% restante de la población, no se encuentran antígenos Lewis en la saliva. Atendiendo a la presencia o ausencia en la saliva de antígenos de los sistemas ABH y Lewis, se clasifica a los individuos en cuatro grupos distintos: • Individuos secretores ABH y que también expresan antígenos del sistema Lewis. Representan el 70% de la población. • Individuos no secretores ABH, pero que expresan antígenos Lewis (principalmente el a). Constituyen el 20% de la población. • Individuos secretores ABH, pero que no expresan antígenos Lewis. Representan el 9% de la población. Individuos no secretores ABH y que tampoco expresan antígenos Lewis. Constituyen el 1% de la población.

20/02/08 Título de la práctica:

Recuento de reticulocitos Fundamento de la práctica: Podemos observar los reticulocitos al microscopio óptico mediante la tinción con colorantes vitales, azul de metileno o azul de cresil brillante. Estos colorantes dan lugar a la precipitación de los restos de ARN, y se observan como filamentos de color azul intenso en el interior de la célula. Dado que el ARN del reticulocito desaparece a los pocos días de entran en la sangre, su recuento servirá como medida del número de células que libera la médula ósea. Esto es, el número de reticulocitos en sangre circulante es, probablemente el mejor y más sencillo indicador de la eritropoyesis. Un aumento puede interpretarse como indicación de una elevada demanda de nuevos eritrocitos y un correcto funcionamiento de la médula ósea. Por el contrario cuando la demanda disminuye o la médula ósea falla en sus funciones, la cifra de reticulocitos baja. Según el grado de maduración que posea el reticulocito presentará un modelo de reticulocito distinto, de ovillo denso en el caso de los más inmaduros o de gránulos escasos para los más maduros. Se pueden clasificar en cuatros grupos distintos. Materiales utilizados: • Microscopio óptico • Aceite de inmersión • Pipeta Pasteur • Portas Muestra Un tubo ya preparado el cual ya contiene los colorantes (azul de cresil brillante). Y sangre anticoagulada con EDTA. (Debido a que los reticulocitos también maduran in vitro, es aconsejable que la sangre utilizada se haya extraído recientemente, como máximo 6 horas antes de su análisis). •

Procedimiento: 1°- Añadir tres gotas de sangre a uno de los tubos ya preparados que contienen 100 microlitros de colorante estabilizado. 2°- Mezclar bien e incubar durante 10-15 minutos a temperatura ambiente. 3°- Volver a mezclar la suspensión 4°- Con la pipeta Pasteur aspiramos lo suficiente para hacer por lo menos con la mezcla un par de extensiones. (O más si sobra) 5°- Dejar secar al aire 6°- Una vez realizado todo esto se pasa a observar al microscopio con el objetivo de 100x con aceite de inmersión. (Las preparaciones conservan su coloración si se mantienen alejadas de la luz)

Resultados Con una gota de aceite de inmersión observamos la extensión con el objetivo de 100 x. Los hematíes se habrán teñido de color verde amarillento y los reticulocitos se diferencian porque presentan en su interior unos hilos finos de color azul. Se deben contar 1.000 hematíes en total, y el cálculo del porcentaje de reticulocitos es el siguiente: N° de reticulocitos contados x 100 % reticulocitos = N° de hematíes contados Para descartar errores en la técnica, debemos realizar dos extensiones y hacer el recuento en ambas, de manera que la diferencia entre ellas sea igual o menor a 5 reticulocitos. El resultado final es la media de los dos porcentajes obtenidos. 61 hematíes 61 x 4 = 244 hematíes en 1 campo 1 campo ------ 244 hematíes X campos------ 1000 hematíes X= 4,09 campos Reticulocitos observados en 4 campos: 4+4+3+2 = 13 reticulocitos 13 reticulocitos----- 1000 hematíes X reticulocitos ------ 100 hematíes X= 1,3 % Interpretación clínica de los resultados: En adultos y niños los valores normales están entre 0,5 y 1,5%. Se produce reticulopenia o disminución en la cifra de reticulocitos, en casos de aplasia medular, anemia ferropénica, anemia megaloblástica y anemias que cursan con dificultad en la eritropoyesis. Por el contrario, hay reticulocitosis en anemias hemolíticas y post-hemorrágicas, donde se aumenta el nivel de producción de hematíes para contrarrestar su pérdida. La cantidad de reticulocitos expresada en tanto por ciento es un valor relativo referido a una cifra normal de hematíes. Por ello, cuando existe una anemia con disminución en la cantidad de hematíes se compensa con un aumento en el número de reticulocitos y debemos corregir su valor en tanto por ciento para poder considerarlo real. La corrección se hace en base al valor hematocrito (HCT) del paciente, y se calcula de la siguiente forma:

% de reticulocitos corregido =

% reticulocitos

HCT. Paciente x HCT. Normal

Si existe una anemia muy intensa, aparece en sangre periférica un número de reticulocitos mayor del que correspondería por regeneración eritroblástica. Esto se debe a que el estímulo eritropoyético compensador va acompañado de un período de maduración intramedular más corto y una etapa de maduración en sangre periférica más larga. Esto se conoce como "desviación reticulocitaria" y se observa en el frotis por la aparición de hematíes grandes con un color azulado (macrocitos policromáticos). Para evitar pensar que hay una capacidad regenerativa medular intensa se debe hacer una segunda corrección del % de reticulocitos en función de los días que tarda en madurar el reticulocito en sangre periférica, y a esto se le llama índice de producción reticulocitaria (IPR). Se obtiene con la siguiente fórmula:

IPR = periférica

% reticulocitos corregido días de maduración en sangre

Los días que tarda en madurar el reticulocito están reflejados en la tabla 6.XVI-1., cuyos valores se han obtenido experimentalmente. Hematocrito Tiempo de del paciente maduración (%) (días) 45 1 35 1'5 25 2 15 2'5 El IPR nos da un valor numérico de la estimulación hematopoyética por encima de la actividad de la línea base normal. Un IPR mayor de 3 nos indica un aumento de la actividad eritropoyética medular, mientras que un IPR menor de 2 indica una escasa actividad eritropoyética.

19/02/08 Título de la práctica: Determinación del fenotipo y genotipo del sistema Rh

Fundamento de la práctica: Podemos investigar el genotipo del sistema Rh enfrentando los hematíes problema a distintos antisueros dirigidos contra los antígenos que comprenden el sistema Rh. La existencia o no de estos antígenos en la superficie de estos hematíes se detecta por una reacción de aglutinación. Los resultados de estas reacciones se trasladan a una tabla donde podemos ver los posibles genotipos correspondientes. Materiales utilizados: • Tubos de centrífuga • Centrífuga • Rotulador de vidrio • Pipetas Pasteur desechables • Gradilla • Reactivos: Suero anti-D Suero anti-E Suero anti-C Suero anti-e Suero anti-c Solución salina fisiológica • Suspensión de hematies lavados, al 5% en ssf. Procedimiento: 1°- Procedemos al lavado de los hematíes y a preparar su suspensión al 5%. 2°- Rotulamos cinco tubos de centrífuga, cada uno con las letras D,E,C,e,c. 3°- En cada tubo añadimos una gota del antisuero correspondiente y una gota de la suspensión de hematíes al 5%. Homogeneizamos suavemente. 4°- Centrifugamos todos los tubos durante un minuto a 1000 r.p.m. Resultados: Golpeamos suavemente con el pulpejo de los dedos medio y anular en el fondo de los tubos para despegar el sedimento hemático. El resultado positivo es la presencia de aglutinación, y se observa con la presencia de grumos rojos sobre un líquido claro. La ausencia de aglutinación es un resultado negativo, y se observa como la suspensión homogénea de los hematíes en un líquido rojizo. Se ha procedido a realizar la determinación de una muestra X y la aglutinación solo ha apericido en anti-c y anti-e, comparando con la tabla significa que el paciente será dce/dce por consiguiente Rh-.

Interpretación clínica de los resultados: Un resultado positivo indica la presencia del antígeno del sistema Rh buscado en ese tubo. El resultado negativo indica lo contrario. Los cinco resultados obtenidos expresan el fenotipo de la sangre analizada y se comparan con los contenidos en la tabla de fenotipos y genotipos del sistema Rh. Una vez encontrada la hilera coincidente, se mira en ella el posible o posibles genotipos correspondientes. Esto es así porque si la sangre analizada es Rh negativa (D-), se puede determinar su único genotipo posible con respecto al sistema Rh. Sin embargo, si la sangre es Rh positiva (D+), existen varios genotipos posibles que dan lugar al fenotipo previamente detectado.

29/01/08 Título de la práctica:

Lavado y suspensión de hematíes Material: • Pipeta Pasteur • Pipeta de 5 ml. • Tubos de centrífuga • Sangre total • S.S.F Procedimiento: 1. El tubo que contiene la sangre se centrifuga a 3000 r.p.m. durante 10 min. 2. Retiramos el plasma de la sangre total con una pipeta Pasteur. 3. Con otra pipeta añadimos, más o menos, la misma cantidad de S.S.F. 4. Centrifugamos a 3000 r.p.m. durante 10 min. 5. Retiramos el sobrenadante 6. Se repiten los dos pasos anteriores dos veces más, hasta que el sobrenadante sea transparente. Resultados: Para una suspensión al 5% en un frasco de 10 ml. Se harán los siguientes cálculos: 100 ml. Suspensión------------ 5 ml. De hematíes 10 ml. Suspensión-------------- X X= 0,5 ml hematíes y 9,5 ml. De S.S.F.

08/01/08 Título de la práctica: 27

Capacidad total de fijación del hierro (CTFH) Fundamento: La transferrina sérica se satura con un exceso de Fe3+ y el exceso no fijado se elimina por precipitación con carbonato magnésico, determinándose a continuación la cantidad total de hierro presente. La diferencia entre la capacidad de fijación total de hierro hallada (CFTH) y el hierro sérico inicial (Hb) nos da la capacidad de fijación de hierro no saturado o residual. Material: • Centrífuga para muestras. • Equipamiento habitual de laboratorio • Micropipeta • Fotocolorímetro • Cubetas para fotocolorímetro • Suero o plasma heparinizado. Libre de hemólisis. Separado lo antes posible de los hematíes. REACTIVOS R5 Solución Saturante

Solución de hierro

500 ug/dL

R6 Magnesio carbonato Agente Precipitante

REACTIVOS ADICIONALES El sobrenadante obtenido se procesa como muestra para la determinación del hierro: Hierro TPTZ manual Ref: 1001240 Hierro TPTZ Ref: 1001242, 1001243 Hierro Nitro PAPS Ref: 1001244, 1001245 Hierro FerroZine Ref: 1001247, 1001248 Procedimiento: 1. Pipetear en los tubos: Muestra (mL) 0,5 R 5 Solución saturante (mL) 1,0 2. Mezclar e incubar bien 10 minutos a Tempetarura ambiente (15-25 ºC) 3. Añadir a cada tubo: R 6 Agente precipitante en polvo usando la cuchara que viene con el kit, aproximadamente 70 mg= 1 dosis. Añadir 3 dosis 4. Mezclar e incubar 10 minutos a temperatura ambiente 5. Centrifugar 15 min. a 3000 r.p.m. 6. Recoger el sobrenadante, cuidadosamente y procesar como una muestra para la determinación de hierros Resultados: Se calcula según lo indicado en las instrucciones de trabajo de la determinación de hierro. 28

CFTH = Concentración de hierro en el sobrenadante x 3 (Factor de dilución) VALORES DE REFERENCIA Suero o plasma: 200 – 400 µg/dL = 36-72 umol/L Estos valores son orientativos. Es recomendable que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia. Absorvancias medidas: Blanco 1º Medicion 0,000 2º con TPTZ 0,000 (A2- A1) Muestra (A2- A1) Patrón

Patron 0.515 0.021

Muestra 0.477 0.105

X 100 (conc. patrón) = μg/dl de Fe en muestra

(0,477- 0,105) Muestra X 100 (conc. patrón) = 83,3 μg/dl de Fe en muestra (0,515- 0,021) Patrón CTFH= 83,3 X 3 = 249,9 μg/dl El resultado está dentro de los valores considerados como normales. Interpretación de los resultados: El hierro es el constituyente de un gran número de enzimas. La mioglobina, proteína muscular, contiene hierro, así como el hígado. El hierro es necesario para la producción de hemoglobina, molécula que transporta el oxígeno en el interior de los glóbulos rojos. El hierro se controla, normalmente, junto con la capacidad de fijación total del hierro (CFTH), y nos indica la capacidad de unión sérica disponible. Encontramos niveles altos de CFTH en la anemia ferropénica. Niveles bajos en hemocromatosis, cirrosis, hepatitis aguda. El diagnostico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clínicos y de laboratorio.

15/01/08

Título de la práctica: Determinación de la Velocidad de Sedimentación Globular (VSG) Fundamento: Para la medición de la VSG, se coloca la sangre problema en el interior de un tubo dispuesto verticalmente. En estas condiciones los glóbulos rojos de la sangre tienden a ir cayendo, a favor de la fuerza de la gravedad, hacia la parte inferior del tubo. En condiciones normales este proceso es lento, pues la fuerza con la que es atraído cada hematíe hacia el fondo del tubo es casi compensada por la fuerza ascendente creada por el plasma al desplazarse hacia arriba. La VSG equivale a la longitud del recorrido que desciende la columna de eritrocitos, desde la parte superior del tubo hacia abajo, en un intervalo de tiempo. Material: • Tradicionalmente se han usado las pipetas y la gradilla de Westergreen. Recientemente se han incorporado al mercado sistemas semiautomáticos que constan de una bomba de succión que aspira la sangre hasta enrasar las pipetas a 0. Sin embargo, son más recomendables otros sistemas que permiten una aspiración sin riesgos de la sangre y además son de fácil realización y bajo costo. El sistema Eritrosed consta de los siguientes elementos: – Pipetas desechables de vidrio. Cada una de ellas tiene un diámetro externo de 2,4 mm y un diámetro interno de 2,1 mm. Están graduadas en mm, con marcas blancas, desde el O hasta el 170. En su interior albergan un émbolo de aspiración de plástico blanco. – Gradilla especial, con unas perforaciones en su base, para situar los tubos mezcladores, y con otras, en su parte superior y media, que permiten soportar verticalmente las pipetas al ser atravesadas por éstas. Además, consta de una corredera superior para atrapar las puntas de los émbolos. • Tubos mezcladores de polipropileno con tapones de goma perforable • Reloj avisador. Reactivos • Se recomienda el uso de citrato sódico al 3,8% como anticoagulante, pero también se puede utilizar el EDTA. Sin embargo, no se deben emplear otros anticoagulantes como la heparina, pues altera el potencial zeta de los hematíes, ni los oxalatos, pues encogen las células sanguíneas. Lo ideal es que el citrato sódico al 3,8% esté contenido en tubos mezcladores apropiados. Muestra

• Se recomienda el empleo de sangre venosa anticoagulada con citrato sódico al

3,8% en una proporción de 4 a 1 (al 20%). Lo ideal es recoger la sangre en tubos mezcladores, que contienen 0,4 ml de citrato sódico al 3,8%, y al que se añade sangre venosa problema, hasta el nivel de 2 ml marcado en el tubo mezclador. • Si sólo se dispone de sangre anticoagulada con EDTA, se puede utilizar una mezcla de 2 ml de esta sant con 0,5 ml de citrato sódico al 3,8% o con 0,5 ml de cloruro sódico al 0,85%. • En cualquier caso, la muestra siempre ha de estar libre de hemólisis. Procedimiento: 1. Realizar la prueba:

•

2. 3. 4.

5. 6. 7.

A temperatura ambiente (20-25 °C), pues a mayor temperatura asciende la VSG y a menor temperata disminuye la VSG (debido a que aumenta la viscosidad de la sangre). • Antes de las 3 primeras-horas transcurridas desde la extracción de la muestra, pues, tras ese tiempo, los hematíes tienden a adoptar una forma esférica y desciende la VSG. Este tiempo puede prolongarse a 12 horas si se utiliza corno anticoagulante el EDTA y si se conserva la sangre a 4 °C. Mezclar suavemente la sangre y el anticoagulante contenidos en el tubo mezclador. Situar el tubo mezclador en una de las perforaciones de la base de la gradilla para VSG. Introducir una pipeta de VSG a través de las perforaciones superior y media de la gradilla que están localizadas sobre el tubo mezclador correspondiente, y presionar con la pipeta sobre el tapón de éste hasta que su punta lo perfore y alcance el fondo del tubo. Desplazar la corredera superior de la gradilla para atrapar la punta del émbolo de la pipeta, que sobresale. Tomar la gradilla con ambas manos y agitarla suavemente para asegurar una correcta mezcla de la sangre y del anticoagulante. Tirar del émbolo hasta el final de su recorrido y romper el mismo por la zona más débil que tiene para este fin. De esta forma se aspira la sangre hasta el enrase O, de una manera fácil y sin formación de burbujas que pueden interferir en los resultados de la prueba. Además, al usar pipetas desechables también se evita la interferencia de la suciedad y humedad que pueden estar presentes en pipetas reutilizadas. 8. Ajustar el reloj avisador al tiempo de lectura previsto. Dejar reposar la sangre durante ese tiempo sin que sea afectada por vibraciones.

El diseño de la gradilla para VSG asegura que, una vez colocada en ella la pipeta de VSG, ésta se halla dispuesta con una posición perfectamente vertical, es decir, con su eje longitudinal perpendicular a la base de la gradilla. Esto es importante, ya que una inclinación de la pipeta hace que aumente el resultado de la VSG. Resultados: La lectura se efectúa a la primera hora y a la segunda hora. Con el paso del tiempo se delimita una zona de separación entre la columna de eritrocitos y el plasma. Al final del tiempo de lectura previsto, se mira en la escala graduada de la pipeta, la marca que coincide con el límite de separación entre los hematíes y el plasma. El resultado se puede expresar de dos maneras: • Longitud en mm del recorrido descendente de la columna de glóbulos rojos en una hora (VSG de la primera hora) y en dos horas (VSG de la segunda hora). Índice de Katz, que se calcula con la siguiente fórmula: VSG 2ºh. VSG 1ºh. + _________ Índice de Katz= _____________2_______ 2 • Los valores normales de VSG son los expuestos a continuación: VSG la hora 2a hora Varones Mujeres

2-7 mm 3-10 mm

8-15 mm 12-20 mm

Resultado obtenido 34 mm. Se produjo un error durante el proceso de medición. Interpretación clínica de los resultados: La VSG varía, fisiológicamente, en determinadas circunstancias. Así pues, es más alta en la mujer, y aumenta en la vejez y a partir del tercer mes del embarazo. En esta última circunstancia, sus valores vuelven a la normalidad, un mes después del parto. El aumento de las proteínas plasmáticas (sobre todo el del fibrinógeno y el de las globulinas α2 , β y γ) produce una alteración en las propiedades físico-químicas del plasma que conlleva un bloqueo de las cargas eléctricas negativas de los hematíes. Este bloqueo acarrea un apilamiento de los eritrocitos y, por tanto, una formación de agregados de glóbulos rojos. Los agregados hemáticos, al ser más pesados y al tener un área superficial más baja (en comparación con su volumen) que los hematíes aislados, descienden más fácilmente mientras el plasma asciende. Debido a lo anterior, la VSG aumenta en alto grado en enfermedades en las que hay una hiperproducción de inmunoglobulinas monoclonales (neoplasias malignas de las células plasmáticas) y, en menor grado, en enfermedades que cursan con un aumento inespecífico de las inmunoglobulinas (por ejemplo, las enfermedades autoinmunes) o con un ascenso de las proteínas involucradas en la inflamación, es decir, de los reactantes de fase aguda (fibrinógeno,

alfa-1 antitripsina, alfa-1 glucoproteína, haptoglobina y ceruloplasmina). Este último caso es el más frecuente y es propio de las enfermedades infecto-inflamatorias. Por el contrario, la VSG desciende en las hepatopatías graves que conllevan una hipoproducción de fibrinógeno. El número, el tamaño y la forma de los glóbulos rojos también alteran la VSG. Así pues: • En las anemias aumenta la VSG debido a que un número pequeño de hematíes, englobado en un gran volumen de plasma, sedimenta con mayor facilidad. Sin embargo, en las poliglobulias disminuye la VSG debido a que se incrementan las fuerzas de fricción existentes entre los eritrocitos. • En la macrocitosis asciende la VSG debido al mayor peso y a la menor área superficial relativa de los hematíes. Por razones opuestas, en la microcitosis desciende la VSG. • En las proliferaciones de formas anómalas de los glóbulos rojos, la formación de apilamientos está dificultada y, por consiguiente, disminuye la VSG. La alteración de la VSG es un indicador altamente inespecífico, ya que sólo señala la presencia de una enfermedad activa, pero no ofrece casi datos acerca del tipo de proceso patológico que la origina ni de la gravedad de éste. Sólo en algunas ocasiones su grado de ascenso es directamente proporcional a la severidad con la que cursa la enfermedad subyacente, por lo que puede ser utilizada para controlar la evolución de algunas enfermedades (artritis reumatoidea, lupus eritematoso diseminado, endocarditis bacteriana aguda, tuberculosis, etc.)

26/02/08

Título de la práctica: Determinación de Coombs directo Fundamento: Consiste en enfrentar los hematíes del paciente al suero de Coombs específico, para determinar si existen o no autoanticuerpos fijados en la membrana eritrocitaria. Su presencia se manifiesta por la aglutinación de los hematíes en el fondo del tubo. En esta técnica es importante realizar el control del suero de Coombs con hematíes previamente preparados, esto nos permitirá saber en qué condiciones se encuentra y si los resultados obtenidos son válidos. No hemos utilizado anti C3-C4

Material: • Tubos de hemólisis. • Centrífuga. • Pipetas Pasteur. • Baño de agua. • Gradilla. • Rotulador de vidrio. Reactivos • Solución salina fisiológica. • Suero de Coombs anti-IgG. • Suero anti-D incompleto (IgG). • Hematíes normales no sensibilizados. • Hematíes Rh (D) positivos. • Sangre del grupo O sin anticoagulante. Muestra Hematíes del paciente preparados de la siguiente manera: Centrifugar la sangre para separar el plasma. Tomar un volumen de hematíes y lavar cuatro veces con solución salina fisiológica. Posteriormente resuspenderlos en esta solución al N-5%. Procedimiento: 1. Preparación de los hematíes control: • Hematíes normales no sensibilizados: Lavar los

hematíes cuatro veces con solución salina fisiológica y resuspenderlos en la misma al 2-5%. • Hematíes sensibilizados con IgG: Lavar los hematíes Rh positivos cuatro veces en solución salina fisiológica y resuspenderlos en la misma al 50%. Incubamos 0,1 ml de esta suspensión con 0,1 ml de suero anti D incompleto, durante 1 hora a 37 °C. Posteriormente lavar cuatro veces con solución salina y resuspender en la misma al N-5%. 2. Técnica: • Rotulamos tres tubos de hemólisis con las letras C 1 , C2, P1.

• En el tubo C1 añadimos una gota de los hematíes normales no

sensibilizados y una gota de suero de Coombs anti-IgG. • En el tubo C2 añadimos una gota de los hematíes sensibilizados con IgG y una gota de suero de Coombs anti-IgG. • En el tubo P1 añadimos una gota de los hematíes del paciente y una gota del suero de Coombs anti-IgG. Centrifugamos todos los tubos a 3.000 r.p.m. durante 45 segundos. Observamos la presencia o la ausencia de aglutinación en los tubos Resultados: Después de centrifugar, golpeamos suavemente con el pulpejo de los dedos anular e índice para despegar el sedimento hemático en todos los tubos. Los tubos que presentan aglutinación indican un resultado positivo, es decir, la presencia de anticuerpos sobre la membrana eritrocitaria. El tubo C1 es un control negativo, y no debe aparecer aglutinación. De ser positivo, los resultados no son válidos. El tubo C2 es un controle positivo, y siempre deben presentar aglutinación. De no ser así, indica que el suero de Coombs no está en buenas condiciones para su utilización. Ha habido aglutinación en el tubo P1, por lo tanto en la membrana eritrocitaria hay anticuerpos Ig-G. Interpretación clínica de los resultados: En el caso de utilizar también anti C3-C4 si los hematíes del paciente presentan aglutinación con el suero de Coombs anti-IgG y no con el suero antiC3-C4, indica que los autoanticuerpos son del tipo IgG. Si la aglutinación se produce con el suero anti-C3-C4 y no con el anti-IgG, indica que existe complemento fijado a la membrana eritrocitaria por IgM o IgG. Estas inmunoglobulinas no se ponen de manifiesto con el suero anti-IgG debido a su poca afinidad por la membrana eritrocitaria y se eliminan con el lavado de los hematíes. Si existe positividad con ambos antisueros indica que la anemia hemolítica autoinmune es de naturaleza mixta. Hay que tener en cuenta que existen factores que pueden dar error en esta prueba, tanto falsos positivos como falsos negativos, y que se resumen a continuación: 35

• Falsos positivos: 1. Se puede producir una sensibilización "in vitro" de los hematíes al mantenerlos

durante cierto tiempo a 4 °C. 2. Lavar insuficientemente los hematíes. 3. Utilización de un suero de Coombs que posee anticuerpos capaces de unirse a

hematíes no sensibilizados. 4. Contaminación bacteriana de la sangre. 5. Reticulocitosis elevada en la muestra analizada. 6. Reacción con la sílice coloidal de los tubos de cristal • Falsos negativos: 1. Tiempo de centrifugación insuficiente. 2. Suero de Coombs en mal estado. 3. Cuando el autoanticuerpo es de tipo IgA. 4. Lavado de los hematíes incorrecto. 5. Empleo de sangre caducada. 6. Empleo de tubos sucios o con restos de jabón.

26/2/08 Título de la práctica:

Test de Coombs indirecto Fundamento: Investigar la presencia de anticuerpos irregulares o incompletos en el suero del paciente enfrentándolos, primeramente, a hematíes específicos tipados y, posteriormente, a la AGH para su detección. Material: • Material para el lavado y la dilución de los hematíes. • Portaobjetos, cubreobjetos y tubo de hemólisis. • Pipeta de Pasteur y visualizador. • Baño termostático y microscopio. REACTIVOS • AGH y SF. • Hematíes tipados del grupo 0+. MUESTRA • Suero problema. Procedimiento: PROCEDIMIENTO 1: PREPARACIÓN DE LOS HEMATÍES TIPADOS 0+ 1. Realizar una determinación de grupo celular sobre los hematíes tipados 0+ para comprobarlo. 2. Efectuar un lavado y una dilución de los hematíes tipados O+ al 5 % 3. Realizar prueba de Coombs directa sobre los hematíes tipados 0+ para comprobar que no existen anticuerpos irregulares sobre ellos. PROCEDIMIENTO 2: DETERMINACIÓN DE COOMBS INDIRECTO 1. En un tubo de hemólisis depositar 2 o 3 gotas del suero problema. 2. Añadir al tubo unas 2 o 3 gotas de la suspensión de hematíes tipados 0-, al 5 % y agitar suavemente. 3. Incubar la mezcla en baño termostático durante 15-30 min. 4. Lavar la mezcla con 1 ml de SF. 5. Repetir este lavado 2 veces más. 6. Al sedimento obtenido con el último lavado añadir 2 o 3 gotas de AGH. 7. Centrifugar a 2.500 rpm durante 1 min. 8. Resuspender el sedimento obtenido con el último lavado dando pequeños golpecitos en el fondo del tubo; si es necesario, añadir unas gotas de SF. 9. Observar la presencia o ausencia de aglutinación en el visualizador, y si es necesario, en el microscopio. Resultados:

•

Comprobación de la aglutinación a nivel microscópico: observa en el microscopio con el objetivo de 40x: Presencia de aglutinación (+): se observan los hematíes agrupados en grumos sobre fondo claro. Ausencia de aglutinación (-): se observan los hematíes separados y distribuidos por todo el campo de forma homogénea. Es positivo ya que se observa presencia de aglutinación de los hematíes. Interpretación clínica de los resultados: El examen de Coombs indirecto detecta anticuerpos circulantes contra los glóbulos rojos (GR). El propósito principal de este examen es determinar si el paciente tiene anticuerpos en el suero capaces de adherirse a los glóbulos rojos (aparte de los del sistema principal ABO o los de tipo Rh). Esta prueba se utiliza sólo raras veces para diagnosticar una condición médica, pero su uso es esencial para laboratorios como los bancos de sangre. El examen de Coombs indirecto se utiliza en los bancos de sangre para determinar si probablemente haya una reacción adversa a la sangre que va a ser utilizada para una transfusión sanguínea. Marca con ‹‹+/-» si existe o no aglutinación en el siguiente cuadro y valora el resultado: HEMATÍES MUESTRA Aglutinación en tubo Aglutinación Microscópic a tiene un resultado negativo, se agregan • Si la prueba de Coombs hematíes control sensibilizados con IgG que deberán dar resultado positivo de aglutinación. Esto confirmará que la AGH no ha reaccionado primeramente con la muestra-problema y que, realmente, en ella no existen hematíes problema que poseen anticuerpos irregulares sobre su membrana. HEMATÍES CONTROL Aglutinación en tubo Aglutinación microscópica Expresa H prueba realizada de Coombs es directo es positiva o es negativa para los hematíes problema y valora el resultado.

21/02/08 Título de la práctica: Prueba cruzada mayor Fundamento: Consiste en enfrentar el suero del receptor con los hematíes del donante,

primero en medio salino, posteriormente en medio albuminoso, y por último frente al suero antiglobulina de Coombs. Con este último paso detectáremos los anticuerpos que se hayan quedado fijados a la membrana eritrocitaria. Es importante respetar los tiempos de incubación para evitar posibles errores en la técnica. Material: • Tubos de hemólisis. • Centrífuga. • Baño de agua. • Pipetas Pasteur. • Gradilla. • Reloj. Reactivos • Solución salina fisiológica. • Albúmina bovina al 30%. • Suero antiglobulina de Coombs. Muestra Suero del receptor, obtenido de sangre coagulada y libre de hemólisis. Debe ser fresco (menos de 24 horas desde la extracción) y conservado a 4 °C. Hematíes del donante, previamente lavados tres veces en solución salina fisiológica y resuspendidos en ella al 2-5%. •

Procedimiento: 1. En un tubo de hemólisis depositamos una gota de la suspensión de hematíes del donante y 2 gotas del suero del receptor. 1. Mezclamos suavemente, y dejamos a temperatura ambiente durante 2-3 minutos. 2. Centrifugamos a 3.500 r.p.m. durante 30 segundos. 3. Leemos el resultado obtenido en medio salino. 4. Añadimos al tubo 3 gotas de albúmina bovina al 30%. 5. Mezclamos bien e incubamos a 37 °C durante 30 minutos. 6. Centrifugamos a 3.500 r.p.m. durante 30 segundos. 7. Leer el resultado obtenido en medio albuminoso. 8. Lavamos tres veces los hematíes con solución salina para eliminar los anticuerpos que no se han fijado a los eritrocitos. Retirar bien todo el sobrenadante del último lavado. 9. Añadimos al tubo una gota de suero antiglobulina humana de Coombs. Mezclar bien. 10. Centrifugamos a 1.000 r.p.m durante 2 minutos (véase figura 55.LXIV). Leemos los resultados. 39

Resultados: La lectura de los resultados se realiza resuspendiendo el botón hemático con suavidad después de cada una de las centrifugaciones. En caso de reacciones débiles positivas, conviene observar al microscopio entre porta y cubre con objetivo de 40x. No se ha producido aglutinación, por tanto son compatibles. Interpretación clínica de los resultados: La ausencia de aglutinación en todos los pasos indica que las sangres son compatibles, y por tanto, la transfusión es posible. La aglutinación en cualquiera de las fases de la prueba indica incompatibilidad. Si se observa hemólisis en cualquiera de los pasos, también es signo de incompatibilidad. En ocasiones es conveniente realizar esta prueba en medio enzimático. Dado que el empleo de enzimas como la Bromelina o la Papaína refuerza las reacciones antígenoanticuerpo, esta prueba se usa para re-examinar a los receptores que han sufrido reacciones transfusionales.