Revista Peruana de Biología v18n3

Universidad Nacional Mayor de San Marcos Facultad de Ciencias Biológicas Rev. peru. biol. ISSN 1561-0837

Revista

Peruana de Biología

Volumen 18

Diciembre , 2011 LIMA, PERÚ

Número 3

Revista Peruana de Biología

Órgano Oficial de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos Rector Dr. Pedro Atilio Cotillo Zegarra Vicerrector de Investigación Dr. Bernardino Ramírez Bautista Consejo Superior de Investigación Dr. Eugenio Cabanillas Lapa Decana de la Facultad de Ciencias Biológicas Mag. Martha Valdivia Cuya Directora Instituto de Investigación en Ciencias Biológicas Antonio Raimondi Mag. Inés Miriam Gárate Camacho

Editor jefe Leonardo Romero Comité Editor César Arana Carlos Paredes Rina Ramírez Carlos Peña Comité consultivo en los recientes números Maximilian Weigend

Freie Universität Berlin- Alemania Sebastián Barrionuevo

Fundación Miguel Lillo- Argentina Luis Aguirre

Universidad Mayor de San Simón, Bolivia Rodney Ramiro Cavichioli

Universidade Federal do Paraná- Brasil Hélio Ricardo da Silva

Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Brazil Carlos Frederico Duarte da Rocha

Universidade do Estado do Rio de Janeiro- Brasil Fabrício Rodrigues dos Santos

Universidade Federal de Minas Gerais- Brasil Suzete Rodrigues Gomes

Instituto Butantan- Brasil Davor Vrcibradic

Universidade do Estado do Rio de Janeiro- Brasil Stefan Dennenmoser

University of Calgary, Canada Roberto Meléndez

Museo Nacional de Historia Natural- Chile Pedro Alejandro Orihuela Diaz

Universidad de Santiago de Chile- Chile Berta Calonge Camargo

Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá, Colombia Sergio Solari

Universidad de Antioquia- Colombia José María Gutiérrez

Universidad de Costa Rica, Costa Rica Finn Borchsenius

Aarhus University- Denmark Julissa Roncal

Aarhus University- Denmark Juan Rigoberto Tejedo Huaman

Universidad Pablo de Olavide- España Arnaud Bertrand

IRD. Institut de recherche pour le développement- Francia Copyright © 2011 Facultad de Ciencias Biológicas, UNMSM Hecho el Depósito Legal 98-3017 Foto en carátula: Paulia horrida, cortesia Yuri Hooker © Resumida/Indizada (Abstracted/Indexed) en: Periódica (Índice de Revistas Latinoamericanas en Ciencias), LIPECS (Literatura Peruana en Ciencias de la Salud), Zoological Record (BIOSIS), Scielo (Scientific Electronic Library Online), Index to American Botanical Literature (The New York Botanical Garden), BIOSIS Previews, Biological Abstracts (BIOSIS), ProQuest (Biological Science Journals), Redalyc.

La Revista Peruana de Biología es una publicación científica arbitrada, editada por el Instituto de Ciencias Biológicas Antonio Raimondi, Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima, Perú, y auspiciada por el Consejo Superior de Investigación. La Revista aparece con una periodicidad semestral (agosto y diciembre) y esta dedicada a la publicación de artículos científicos originales e inéditos en las áreas de Biodiversidad, Biotecnología, Manejo ambiental, Ecología y Biomedicina. La Revista publica los trabajos realizados por académicos e investigadores nacionales y extranjeros, en idioma español o inglés. Los trabajos recepcionados son evaluados por árbitros según criterios internacionales de calidad, creatividad, originalidad y contribución al conocimiento. La Revista es publicada simultáneamente en la página web de la Universidad.

Francis Kahn

IRD. Institut de recherche pour le développement, - Francia Jean-Christophe Pintaud

Institut de Recherche pour le Développement- Francia Mutsunori Tokeshi

Kyushu University - Japon Francisco Alonso Solís Marín

Universidad Nacional Autónoma de México- México Ross Robertson

Smithsonian Tropical Research Institute- Panamá Mónica Romo

Asociación Peruana para la Conservación de la Naturaleza- Perú Renato Guevara-Carrasco

Instituto del Mar del Perú- Perú César Náquira

Instituto Nacional de Salud- Perú Reynaldo Linares-Palomino

Universidad Nacional Agraria La Molina- Perú Marcel Gutiérrez-Correa

Universidad Nacional Agraria La Molina - Perú Gretty K. Villena

Universidad Nacional Agraria La Molina - Perú Gerardo Lamas

Universidad Nacional Mayor de San Marcos- Perú Pablo Ramírez

Universidad Nacional Mayor de San Marcos- Perú Diana Silva

Universidad Nacional Mayor de San Marcos- Perú Juan Tarazona

Universidad Nacional Mayor de San Marcos- Perú Armando Yarlequé

Universidad Nacional Mayor de San Marcos- Perú Manuel Tantaleán

Universidad Peruana Cayetano Heredia- Perú Nigel Pitman

Duke University- USA Sergio Solari

Texas Tech University- USA Lucia Luna

University of Michigan- USA Maria del Carmen Ulloa Ulloa

University of Missouri- USA Blanca León

University of Texas at Austin - USA Kenneth Young

University of Texas at Austin – USA Paul Velazco

American Museum of Natural History, USA Revista Peruana de Biología Rev. peru. biol. - ISSN 1561-0837 Rev. peru. biol. - ISSN 1727-9933 (on line) http://www.unmsm.edu.pe/revperubiol http://www.scielo.org.pe http://redalyc.uaemex.mx/ Información adicional a: Revista Peruana de Biología Facultad de Ciencias Biológicas UNMSM Ciudad Universitaria, Av. Venezuela Cdra. 34 s/n. Lima Casilla Postal: 11-0058 Lima-11, Perú.

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Revista Peruana de Biología Rev. peru. biol. ISSN 1561-0837

Volumen 18

Diciembre, 2011

Número 3

Contenido Trabajos originales 271 Thalictrum peruvianum (Ranunculaceae), una especie nueva de Lima, Perú

Thalictrum peruvianum (Ranunculaceae), a new species from Lima, Peru

Huber Trinidad, Asunción Cano y Blanca León

275 Vochysia awasensis (Vochysiaceae), nueva especie de los Bosques Montanos del Chocó ecuatoriano

Vochysia awasensis (Vochysiaceae), new species from the Mountain Forests from the Ecuatorian Chocó

Isau Huamantupa Chuquimaco

279 Detailed assessment of the distribution of Astrocaryum sect. Huicungo (Arecaceae) in Peru

Evaluación detallada de la distribución de Astrocaryum sec. Huicungo (Arecaceae) en Perú

Francis Kahn, Betty Millán, Jean-Christophe Pintaud and Miguel Machahua

283 Riqueza, uso y origen de plantas medicinales expendidas en los mercados de la ciudad del Cusco

Richness, use and origin of expended medicinal plants in the markets of the Cusco City

Isau Huamantupa, Magaly Cuba, Rosa Urrunaga, Elías Paz, Nelson Ananya, Myrthia Callalli, Nadir Pallqui y Hozmary Coasaca

293 Desarrollo reproductivo del “amancay” Ismene amancaes (Amaryllidaceae) en su ambiente natural

Reproductive development of “amancay” Ismene amancaes (Amaryllidaceae) in its natural environment

Mery L. Suni, Edisson Pascual y Enoc Jara

299 Nueva especie de Mediorhynchus (Acanthocephala, Gigantorhynchidae) en Turdus chiguanco (Turdidae) de Junín, Perú

New species of Mediorhynchus (Acanthocephala, Gigantorhynchidae) in Turdus chiguanco (Turdidae) from Junín, Peru

Rocío Moya, Rosa Martínez y Manuel Tantaleán

303 Aspectos estructurales y cuantitativos del ovario de Fulica armillata (Aves: Rallidae)

Structural and cuantitative aspects of the ovary of the Fulica armillata (Aves: Rallidae)

Mirian Bulfon y Noemí Bee de Speroni

311 Análisis de las vocalizaciones del murciélago longirrostro peruano Platalina genovensium Thomas, 1928 (Chiroptera: Phyllostomidae)

Analysis of vocalizations of Long-snouted Bat Platalina genovensium Thomas, 1928 (Chiroptera: Phyllostomidae)

Juan A. Malo de Molina, Sandra Velazco, Víctor Pacheco y Juan Carlos Robledo

319 Tres nuevos registros de asteroideos (Echinodermata: Asteroidea) de Perú

Three new records of asteroids (Echinodermata: Asteroidea) from Peru

Yuri Hooker y Francisco A. Solís-Marín

325 Estudio de la actividad fermentativa de Hansenula anomala y producción de compuestos químicos de importancia sensorial

Study of the fermentative activity of Hansenula anomala and production of chemical compounds of sensory importance

Waldir Estela Escalante, Mojmír Rychtera, Karel Melzoch, Elena Quillama Polo y Beatriz Hatta Sakoda

335 Inmunogenicidad del veneno de Bothrops atrox (Ophidia: Viperidae) y su evaluación por métodos inmunoenzimáticos

Immunogenicity of Bothrops atrox (Ophidia: Viperidae) venom and its evaluation by immunoenzymatic methods

Gustavo A. Sandoval, Julio Mendoza, William Roldán, Yrma Espinoza, Hilda Solis y Armando Yarlequé

343 Propagación in vitro de Carica papaya var. PTM-331 a partir de meristemos apicales

In vitro propagation of Carica papaya var. PTM-331 from apical meristem

Reynaldo Solis L., Julio Olivera S. y Rafael S. La Rosa L.

349 Diagnóstico e identificación rápidos por PCR de Yersinia ruckeri aislada de Oncorhynchus mykiss procedentes de Canta, Lima, Perú

Rapid diagnosis and identification by PCR of Yersinia ruckeri isolated of Oncorhynchus mykiss from Canta, Lima, Peru

Susana Sirvas-Cornejo, Claudia Cecilia Sánchez-Robinet y César Peña-Domínguez

(Continúa...)

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355 Efecto de la adición de materia orgánica sobre la dinámica poblacional bacteriana del suelo en cultivos de papa y maíz

Effect of addition of organic matter on bacterial population dynamics of soil in potato and corn crops

David García Ventocilla, Gloria Mamani Gamarra, Nicolás Román Cabello, Luis Suárez Salas, Ana Contreras Marín y Julio Malca Jauregui

361 Optimización de los medios de propagación y enraizamiento in vitro de las variedades “criollas” de vid para elaborar pisco

Optimization of media for in vitro propagation and rooting of creole grapevine varieties utilized for pisco making

Eugenio González, Diego Pignataro, Gisella Orjeda, Wilfredo L. Gonzáles y Daniel Clark

367 Colonización intraluminar testicular y diferenciación de la masa celular interna en ratones (Mus musculus)

Intraluminar testicular colonization and differentiation of the inner cell mass in mice (Mus Musculus)

Láyonal Acosta, Víctor Núñez, Jose Pino y Betty Shiga

Notas científicas 373 Notes on the ecology of a relict population of the Lomas´s Lizard Microlophus tigris (Tropiduridae: Sauria) in Las Leyendas Zoological Park, (Lima, Peru)

Notas sobre la ecología de una población relicto de la lagartija de las Lomas Microlophus tigris (Tropiduridae: Sauria)en el Parque Zoológico Las Leyendas (Lima, Perú)

Juan Carlos Jordán Arizmendi

377 Notes on the ecology of Phyllodactylus reissi (Phyllodactylidae: Sauria) in Parque Nacional Cerros de Amotape (Tumbes, Peru)

Notas sobre la ecología de Phyllodactylus reissi (Phyllodactylidae: Sauria) en el Parque Nacional Cerros de Amotape (Tumbes, Perú)

Juan Carlos Jordán Arizmendi

381 Extensión de la distribución del rango migratorio de la “Dormilona de Frente Negra”, Muscisaxicola frontalis (Aves: Tyrannidae) en el Perú

Extension of the distribution of the migratory range of the “Black-fronted Ground Tyrant” Muscisaxicola frontalis (Aves: Tyrannidae) in Peru

Renzo Alcocer, Grace P. Servat y Wilfredo Mendoza

383 Algunos acantocéfalos de la familia Oligacanthorhynchidae del Perú

Some acanthocephalans of the family Oligacanthorhynchidae from Peru

Luis A. Gomez-Puerta

387 Primer registro de Crepidobothrium gerrardii (Cestoda: Proteocephalidae) en el Perú

First record of Crepidobothrium gerrardii (Cestoda: Proteocephalidae) in Peru

Luis A. Gomez-Puerta

Comentarios 389 Efecto de los metales sobre microcrustáceos de agua dulce. Avances metodológicos y potencialidad de cladóceros y copépodos como organismos test

Effects of metals on freshwater microcrustaceans. Metodological advances and potentiality of cladocerans and copepods as test organisms

María Florencia Gutierrez y Ana María Gagneten

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Rev. peru. biol. 18(3): 271- 274 (Diciembre 2011) © Facultad de Ciencias Biológicas UNMSM

Thalictrum peruvianum una especie nueva ISSN 1561-0837

Thalictrum peruvianum (Ranunculaceae), una especie nueva de Lima, Perú Thalictrum peruvianum (Ranunculaceae), a new species from Lima, Peru Huber Trinidad1, Asunción Cano1,2 y Blanca León1 1 Laboratorio de Florística, Departamento de Dicotiledóneas, Museo de Historia Natural –Universidad Nacional Mayor de San Marcos.

Av. Arenales 1256, Lima 11, Perú.

Email Huber Trinidad: htrinidadpatricio@gmail.com 2 Instituto de Investigación de Ciencias Biológicas Antonio Raimondi (ICBAR), Facultad de Ciencias Biológicas, UNMSM. Presentado: 09/03/2011 Aceptado: 12/12/2011 Publicado online: 08/02/2012

Resumen Se describe e ilustra una nueva especie Thalictrum peruvianum H. Trinidad & A. Cano (Ranunculaceae) del centro de Perú. Está caracterizada por presentar flores solitarias muy pequeñas que nacen opuestas a las hojas y un estigma alado. Estos caracteres diferencian este nuevo taxón del resto de especies sudamericanas.

Palabras Claves: Thalictrum peruvianum, Ranunculaceae, nueva especie, Lima, Perú.

Abstract A new species, Thalictrum peruvianum H. Trinidad & A. Cano (Ranunculaceae), is described from central Peru.

It is characterized for having very small and solitary flowers that born opposite to the leaves, and by winged stigma. These characters distinguish this new taxon from other South American species.

Key Words: Thalictrum peruvianum, Ranunculaceae, new species, Lima, Peru.

Introducción Al realizar un estudio sobre la flora vascular en bosques de Polylepis presentes en la Reserva Paisajística Nor Yauyos Cochas (RPNYC), se observó una pequeña planta que crecía comúnmente en la zona baja del bosque, después de una minuciosa revisión se llegó a la conclusión de que se trataba de una especie nueva. La muestra colectada fue estudiada en el Laboratorio de Florística del departamento de Dicotiledóneas, Museo de Historia Natural de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos.

El género Thalictrum posee alrededor de 190 especies en el mundo (Tamura 1995), distribuido principalmente en regiones templadas (Ziman & Keener 1989). Son pocas las especies que encuentran su hábitat en tierras sudamericanas; Lourteig (1953) citó cinco especies, cuatro Thalictrum decipiens Boivin, T. longistylum DC., T. podocarpum Kunth ex DC. y T. venturii Boivin, representando la sección Camptogastrum de Boivin (1944), y una, T. cincinnatum Boivin, de la sección Cincinneria; las tres primeras han sido registradas para Perú.

Las especies peruanas (Thalictrum decipiens, T. longistylum y T. podocarpum) se distribuyen a ambos lados de la Cordillera de los Andes, principalmente hacia el lado oriental, entre los 1500-3800 m de altitud. Habitan suelos húmedos dentro de matorrales y áreas boscosas, y son poco frecuentes en campos abiertos.

Tratamiento taxonómico Thalictrum peruvianum H. Trinidad & A. Cano, sp. nov.

TIPO: Perú. Depto. Lima. Prov. Yauyos. Distrito Miraflores.

Localidad: Bosque de Yauyinazo a 3 km de Piños, 12º18´58,95”S y 75º50´58,06”W. Bosque de Polylepis, 3700 – 3800 m de altitud, H. Trinidad 221 (Holotipo: USM). Figuras 1 y 2.

Haec species insignis floribus solitaris; sepalis viridis vel purpureis; ovariis 2 – 5, stigmatibus alatis. Inter species generis Thalictrio ovariis paucis, sed floris solitari, opposita (versus inflorescentia paniculatis), staminum connectivum supra thecas appendiculatum, rubeus differt.

Rev. peru. biol. 18(3): 271- 274 (December 2011)

Hierba perenne, postrada escandente, hasta 80 cm de longitud. Raíces fasciculadas, engrosadas con ramificaciones fibrosas. Tallo cilíndrico hueco de 0,2 – 1,2 mm de diámetro, verde a purpúreo, estrías poco visibles, pubescencia glandular distribuida de manera dispersa a lo largo del tallo; entrenudos de 2 – 9 cm. Hojas alternas, 3(4) – pinnadas, imparipinnadas; lámina de 0,8 – 4,2 cm de largo por 1,5 – 6 cm de ancho, de forma subtriangular, glandular pulverulento en la superficie de la lámina y con escasos pelos glandulares en las nervaduras, verde a purpúreo en los ápices de los foliolos; peciolo de 0,1 – 2,4 cm de longitud esparcidamente glandular pubescente; vaina de 1 – 2 x 0,5 – 1,2 mm, subamplexicaule 2 – auriculada, de base purpura y borde lobulado blanquecino; foliolo asimétrico de 1,5 – 5 x 1 – 5 mm, 3 – lobulado con los ápices obtusos y lóbulo inferior a veces partidos, discoloras, ligeramente pecioluladas y sin estipelas. Flores solitarias opuestas a las hojas, hermafroditas o unisexuales (polígamo monoicas). Pedúnculo de 0,1 – 1,8 cm de longitud. Sépalos 4 de 1,5 – 3,5 x 1,2 – 2 mm, 3 – 6 nervado, ovado de ápice obtuso, verde a purpureo. Estambres 7 – 17, filamentos filiformes que siguen creciendo después de la antesis de 1 – 5 mm, rojizas; anteras oblongas de 1,4 – 2 mm, conectivo prolongado por encima de la antera hasta 0,3 mm de longitud, rojizas. Pistilos en flores perfectas 2 – 5 (en las flores femeninas llega a tener hasta 16 pistilos); ovario comprimido lateralmente de 0,6 – 1,2 x 0,3 – 0,8 mm; estilo corto, 0,1 – 0,2 mm; estigma triangular alado hasta 3,2 mm, papiloso en toda la superficie. Aquenios 1 – 3 de 3,5 – 4,5 x 2 – 2,5 mm, cortamente estipitado, estilo persistente; nervaduras prominentes 3 (4) a cada lado, subparalelas.

Material adicional examinado Perú. Depto. Lima. Prov. Yauyos. Distrito Miraflores.

Localidad: Bosque de Yauyinazo a 3 kilometros de Piños, 12º18´58,95”S y 75º50´58,06”W. Bosque de Polylepis, 3700 – 3800 m de altitud, H. Trinidad 1888 (USM).

Etimología Esta nueva especie presenta flores muy pequeñas en comparación a las otras especies del continente, por su distribución conocida decidimos nombrarla Thalictrum peruvianum.

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Trinidad et al.

Figura 1. Thalictrum peruvianum H. Trinidad & A. Cano; a) Habito, b) Segmento de tallo en la que se observa la pubescencia, c) Vaina auriculada sub-amplexicaule, d) Flor perfecta que nace opuesta a la hoja, e) SĂŠpalo, f) Estambre, g) Pistilo con vista dorsal del estigma, h) Pistilo con vista frontal del estigma, e i) Fruto.

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Rev. peru. biol. 18(3): 271- 274 (Diciembre 2011)

Thalictrum peruvianum una especie nueva

Figura 2. Thalictrum peruvianum H. Trinidad & A. Cano; a) Rama con flor perfecta, b) Rama con flor femenina, c) Vaina auriculada subamplexicaule y d) Habito.

Rev. peru. biol. 18(3): 271- 274 (December 2011)

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Trinidad et al.

Discusión taxonómica El género Thalictrum en Perú se distingue fácilmente de los otros géneros de la familia Ranunculaceae por presentar flores con cuatro sépalos y por sus hojas 2 – 4 pinnadas.

En Zuloaga et al. (2008) se considera Thalictrum decipiens como el nombre aceptado para las tres especies citadas para el Perú. Pero nosotros concordamos con Lourteig (1953) al decir que Thalictrum decipiens, T. longistylum y T. podocarpum son morfológicamente distintas y que deben ser consideradas como especies diferentes.

Las especies peruanas incluyendo Thalictrum peruvianum se pueden distinguir con la siguiente clave.

1. Flores solitarias. Estilo corto de 0,1 – 0,2 mm; estigma triangular alado.

T. peruvianum 1’. Flores en inflorescencia racemosa terminal. Estilo hasta 10 mm; estigma no triangular alado.

2. Envés de los foliolos con pubescencia glandular.

T. longistylum

2’. Envés de los foliolos glabrescentes.

3. Fruto sésil o sub-sésil con nerviación sub-paralela.

3’. Fruto estipitado con nerviación reticulada.

T. decipiens T. podocarpum

Thalictrum peruvianum no se encuentra relacionada morfológicamente con ninguna de las especies de Sudamérica; los caracteres florales y foliares que presenta son bastante diferentes.

Thalictrum peruvianum es una planta pequeña y crece postrada bajo los arbustos o algunas veces apoyada sobre estos; a diferencia de las otras especies, que crecen erguidas y a veces llegan a ser bastante grandes (2,5 m de altura). El carácter nuevo para el género es que las flores solitarias nacen opuestas a las hojas, hasta ahora se consideraba que todas las especies de este género tenían inflorescencias de disposición terminal o axilar (Macbride 1936; Lourteig 1956; Tamura 1992; Park & Festerling 1997).

Ninguna especie en Sudamérica presenta flores solitarias, aunque como en el caso de T. venturii las inflorescencias pueden llevar pocas flores (Lourteig 1956), pero en esta las flores tienen carpelos estipitados (de 1,5 mm), a diferencia de la especie aquí descrita cuyo estípite es muy corto (<1 mm). Otro carácter importante y que lo diferencia de todas las especies americanas es la presencia de un estigma triangular alado lleno de papilas.

Posiblemente esta sea una adaptación para facilitar la retención de polen debido al pequeño tamaño de sus flores. Este carácter del estigma también ha sido observado en especies asiáticas (Fu & Zhu 2001), pero estas especies muestran caracteres muy diferentes a T. peruvianum.

Distribución, ecología y fenología Thalictrum peruvianum ha sido colectada únicamente en un bosque de Polylepis de la RPNYC, el cual es conocido por la población local como bosque de Yauyinazo. Este bosque se encuentra ubicado a lado occidental de la cordillera de los Andes, al sureste de Lima en la provincia de Yauyos; restringida a una quebrada rocosa muy accidentada por encima de los 3700 m de altitud.

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Esta especie endémica del Perú se encuentra distribuida en la parte baja del bosque hasta los 3800 m de altitud; es frecuente ubicarla creciendo postrada en el suelo y algunas veces apoyada sobre los arbustos presentes en la zona.

Florece y fructifica entre los meses de enero y marzo.

Estado de conservación Todos los individuos observados han sido hallados en la localidad original, en un bosque de Polylepis. No se ha observado ningún individuo fuera de este bosque, ni en áreas cercanas dentro de la reserva (incluyendo otros bosques evaluados). Se estima que el área total donde se distribuye esta especie no sobrepasa una hectárea de extensión. Se ha observado que existe actividad minera muy cercana al área en la cual se distribuye esta especie. Por lo cual, y de acuerdo a los criterios de la UICN (UICN 2001), se sugiere que sea considerada como una Especie en Peligro Crítico (CR), y se tome las medidas necesarias para poder conservarla.

Agradecimientos Agradecemos al Jefe y los guardaparuques de la Reserva Paisajística Nor Yauyos Cochas por permitirnos realizar el trabajo de investigación durante el cual fue posible descubrir esta nueva especie. También nuestra gratitud a Delsy Trujillo por realizar la ilustración que se incluye en esta publicación y a José Roque por la revisión del manuscrito.

Literatura citada Boivin, B. 1944. American Thalictra and their Old World allies. Rhodora 46: 391–445.

Fu, D. Z. & G. Zhu. 2001. Thalictrum. Flora of China, 6: 282–302.

MacBride J. F. 1937. Ranunculaceae, Flora of Peru. Field Museum of Natural History; Botanical Series. 13: 639–661.

Lourteig, A. 1956. Ranunculáceas de Sudamérica Tropical, V. Thalictrum. Mem. Soc. Cienc.Nat. La Salle 16: 186-198.

Park, M. M. & D. Festerling. 1997. Thalictrum. Flora North America 3: 258-271.

Tamura, M. N. 1993. Ranunculaceae. In: K. Kubitzki, J. G. Rowher, and V. Bittrich, eds. The families and genera of vascular plants. Pp. 563-583. Springer, Berlin.

Tamura, M. N. 1995. Thalictrum. In: P. Hiepko, ed.) Nat. Pflanzenfam. 17a(IV): 474–494. UICN. 2001. Categorías y Criterios de la Lista Roja de la UICN. Versión 3.1. Preparado por la Comisión de Supervivencia de Especies de la UICN. UICN, Gland, Suiza y Cambridge, Reino Unido.

Ziman, S. N. and C. S. Keener. 1989. A geographical analysis of the family Ranunculaceae. Ann. Missouri Bot. Gard.76: 1012-1049.

Zuloaga, F. O; O. Morrone & M. J. Belgrano. 2008. Ranunculaceae, en F. O. Zuloaga, O. Morrone & M. J. Belgrano (eds.).

Catálogo de las Plantas Vasculares del Cono Sur. Monographs in Systematic Botany from the Missouri Botanical Garden 107 (3): 2825-2839.

Rev. peru. biol. 18(3): 271- 274 (Diciembre 2011)

Rev. peru. biol. 18(3): 275 - 278 (Diciembre 2011) © Facultad de Ciencias Biológicas UNMSM

Vochysia awasensis nueva especie del Chocó ecuatoriano ISSN 1561-0837

Vochysia awasensis (Vochysiaceae), nueva especie de los Bosques Montanos del Chocó ecuatoriano Vochysia awasensis (Vochysiaceae), new species from the Mountain Forests from the Ecuatorian Chocó Isau Huamantupa Chuquimaco

Herbario (CUZ), Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Nacional San Antonio Abad del Cusco, Prolongación Av. de la Cultura s/n, Cusco, Perú.

Email: andeanwayna@gmail.com

Resumen Vochysia awasensis I. Huamantupa, es descrita e ilustrada como especie nueva de la familia Vochysiaceae, perteneciente a la sect. Ciliantha Stafleu subsect. Megalanthae Stafleu, proviene de los bosques montanos de la región biogeográfica del Chocó en el noroeste de Ecuador. Presenta mayor afinidad a V. megalantha y V. duquei, pero a su vez se distingue de estas por presentar el peciolo sésil poco conspicuo y decurrente, limbo foliar de 17-33,5 (-35) x 4,5-10 cm; pétalos florales entre 2,4-3 x 0,6-0,9 cm.

Palabras clave: Vochysia, Reserva étnica, Awá-Camumbí, Chocó, Ecuador

Abstract

Presentado: 21/07/2011 Aceptado: 23/12/2011 Publicado online: 08/02/2012

Vochysia awasensis I. Huamantupa, is described and illustrated as new species of the family Vochysiaceae, belonging to the sect. Stafleu Ciliantha subsect. Megalanthae Stafleu, which comes from the montane forests of the Choco biogeographical region in the northwestern of Ecuador. The new species differs from its relatives V. megalantha and V. duquei, by its inconspicuous and recurrent petiole, blade 17-33,5 (-35) x 4,5-10 cm, and petals 2,4-3 x 0,6 to 0,9 cm.

Keywords: Vochysia, Reserva étnica, Awá-Camumbí, Chocó, Ecuador

Introducción Gran parte del noroeste de Ecuador está comprendido en la región biogeográfica del Chocó, área que se extiende a lo largo de la costa pacífica de Suramérica, desde el sur de Panamá hasta el noroccidente ecuatoriano. Esta región contiene los bosques más húmedos de América y es reconocida como una de las áreas de mayor diversidad biológica en el planeta (Myers et al. 2000), y una de las más amenazadas por el potencial de recursos que representa para los intereses económicos (Plan de salvaguarda étnica del pueblo indígena Awá 2010). En el lado ecuatoriano el territorio Awá comprende aproximadamente 116640 ha.

Según Sierra (1999), la reserva étnica del Awá-Camumbi se ubica dentro del bosque siempre verde piemontano, sector de las estribaciones de la cordillera occidental en la subregión norte; caracterizada por presentar alta humedad con precipitaciones anuales de 4000 a 5000 mm (Guzman 2011). Entre los pocos estudios florísticos destaca el de árboles silvestres manejados en áreas de potreros por Guzmán (2011) quién registra 122 especies en 26 ha, siendo las Lauraceae, Melastomataceae, Moraceae, Urticaceae y Fabaceae las familias más ricas; en cuanto a especies sobresalen el Cedro (Cedrela odorata), Copal (cf. Dacryodes - cf.

Protium), Pepa Mono (cf. Hippocrateaceae - cf. Sapotaceae), Chanul (cf. Humiriastrum), Corocillo (cf. Sloanea), Corozo (Pouteria sp.), Caimitillo (Pouteria sp.) y Puegunde (Pseudolemdia cf. laevis). Más para la familia Vochysiaceae se menciona a (cf.

Vochysiaceae), con poca importancia.

El género neotropical Vochysia abarca alrededor de 135 especies (Stafleui 1958, Litt 2004, Marcano-Berti 2005), con 12 especies registradas para Ecuador (Jørgensen & León-Yánez 1999, Neill & Ulloa 2011). La especie nueva descrita a continuación es la segunda especie de Vochysia a ser descrita sobre la base de colecciones provenientes de Ecuador.

Rev. peru. biol. 18(3): 275 - 278 (December 2011)

Taxonomía Vochysia awasensis I. Huamantupa, sp. nov.

(Figs. 1 y 2) TIPO: ECUADOR. Provincia, Carchi. Cantón. TulcanChical. Parroquia. Tobar Donoso, reserva étnica Awá-Camumbí.

Bosque montano bajo pluvial, suelo pantanoso. 20-29 Julio 1991; “María Teuig”, entre 1700 – 1900 m, 78°16'S, 00°53'N; C. Quelal, C. Aulestia y F. Nastacuáz 224 (Holotipo: MO; Isotipo: QCNE).

Vochysiae duquei affinis, sed stipulis majoribus, foliis in quoque verticillo quatuor, plus 15 cm longioribus, decurrentibus et inflorescentiis quam 15 cm majoribus recedit; a V. megalantha stipulis majoribus, foliis subtus glabris (nec ferrugineo-pubescentibus) differt. Árbol de 8 – 20 m. Ramas jóvenes glabras a tenuemente ciliado-hispídulas en los ápices, tetrágonas o subtetragonas hasta levemente anguladas, ramas viejas se muestra en subteretes con la corteza persistente banquecino-marrón. Estípula 3 – 5 mm de largo, 2,5 – 4 mm de largo en la base, blanquecino, glabro, triangular-sagitado levemente acuminada. Hojas 4 – 6 verticiladas, mayormente 4; peciolo inconspicuo, acanalado, decurrente con el limbo foliar; limbo espatulado, elíptico u obovado, 17 – 33,5 (-35) x 4,5 – 10 cm; ápice redondeado, levemente acuminado a veces retuso; base aguda decurrente con el pecíolo; haz glabro, hasta con cilios escasamente esparcidos; envés glabro; vena media impresa por la haz con cilios cortos ralamente esparcidos, sobresaliente en el envés, cilios rojizos dispuestos ralamente, hasta 3,5 mm de ancho en la base de la hoja; venas laterales 19 – 28 en cada semilimbo, con 0,8 – 1,9 cm de separación

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Huamantupa

Figura 1. Vochysia awasensis I. Huamantupa. sp nov. A. Rama florífera, B. Flor, C. Fruto, D. Estípula, E. Pétalos y F. Estilo, Estambre y Estaminodios. Ilustración de M. Pacorina y G. Calatayud, basado en el tipo, Quelal et al. 224.

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Rev. peru. biol. 18(3): 275 - 278 (Diciembre 2011)

Vochysia awasensis nueva especie del Chocó ecuatoriano

Figura 2. Vochysia awasensis I. Huamantupa sp. nov. Rama florífera.

Foto, I. Huamantupa.

entre ambas en la zona media del limbo, 3 – 7 mm en la base y ápice del limbo, forman ángulo de 60 – 90° con la vena media, subimpresas por la haz, notorias por el envés, casi inconspicuas en los bordes del envés, cilios cortos ralamente dispuestos, venas laterales secundarias entre las primarias de 1 – 2, con frecuencia 1; vénulas abundantes; vena marginal poco conspicua en haz y envés, de 1 – 3 mm del borde. Inflorescencia terminal solitaria, cilíndrica mayor a 15 cm, poco densa a pauciflora, eje floral ralamente villloso a ciliado-tomentuloso; cincinos con 1 flor, pedúnculo y pedicelo 1,5 – 4 cm de longitud, glabrescentes a muy escasamente ciliadas. Yema floral 0,8 – 1,5 cm, subcurvado, ápice acuminado obtuso, ralamente ciliado. Flores amarillas en conjunto con el sépalo espolonado 2,8 – 5,2 x 0,6 – 1,2 cm, curvado abarquillado incluyendo al sépalo dorsal; espolón cilíndrico curvado, ápice redondeado, 1,4 – 2,2 cm de longitud, forman un ángulo de 40 – 80° con el pedicelo, muy ralamente ciliado; sépalo dorsal 2 – 2,8 cm, escasamente ciliado mayormente en los bordes, sépalos menores 2 – 2 x 1,9 – 4 mm, borde ciliado; pétalos 3, desiguales; oblongo lanceolados, glabros en general, Rev. peru. biol. 18(3): 275 - 278 (December 2011)

ralamente ciliado-piloso en la cara abaxial de la vénula media y los bordes, pétalo central mayor 2,4 – 3 x 0,6 – 0,9 cm, en la antesis raramente excede al sépalo dorsal, pétalos menores ± 2,4 cm de longitud, glabros en general, cilios en la base, son menores en tamaño al sépalo dorsal. Estambre 2,4 – 2,8 cm de longitud, levemente curvado; filamento corto 3 – 4 mm de longitud, ralamente ciliado especialmente en la base; anteras 2 – 2,4 cm, conduplicadas, levemente incurvadas más anchas en ápice, cada lado de la antera al exponerse ± 2,5 mm, glabras en general con cilios esparcidos especialmente en los bordes.

Estaminodios 2, lanceolado elípticos 3 – 4,1 mm, en la base con agrupación de cilios. Ovario triloculado 2 – 3,5 mm, glabro.

Estilo 2,3 – 2,65 cm; estigma terminal capitado. Fruto capsula verruculosa, glabra, oblongo obovada 3,9 – 7 x 1,2 – 2,4 cm.

Material adicional analizado ECUADOR. Provincia, Carchi. Cantón, Tulcan. Parroquia, Tobar Donoso, Sector Sabalera. Reserva étnica Awá-Camumbí.

Bosque muy húmedo pre montano. “María Teuig”. 19 – 28 junio 1992. G. Tipaz, J. Zuleta & N. Guanga 1330 (MO, QCNE);

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Huamantupa

Sector Sabalera. Reserva étnica Awá-Camumbí. Bosque muy húmedo pre montano. Orilla del río botella. “María teuig”, 19–28 junio 1992. G. Tipaz, J. Zuleta & N. Guanga 1353 (MO, QCNE).

indígenas, los negros y mestizos (Guzman 2011). De acuerdo a los datos conocidos de V. awasensis, y los criterios dispuestos por la Lista Roja de la UICN (2001), consideramos que esta especie debe ser listada en la categoría “Casi Amenazada” (NT).

Se compara con las especies afines a V. duquei Pil. y V. megalantha Stafl, diferenciándose de V. awasensis por lo siguiente: V. duquei, árboles generalmente de gran tamaño, estipulas 0,5 – 1,8 mm. Hojas en verticilos tetrámeros; limbo foliar no excede los 15 cm de longitud; pecíolo 0,5 – 1,5 cm; venas primaria y secundarias bastante marcadas en la haz y el envés, en cada semilimbo el número de venas principales no excede 20 nervios.

Inflorescencias cortas menos de 15 cm, pénduloides. Flores en conjunto con el espolón 1,5 – 3 cm; espolón máximo 1,6 cm; pétalos pilosos pubescentes el mayor máximo 2 cm. Ovario piloso ferrugíneo. Fruto hasta 3,8 cm.

Etimología El epíteto está dedicado en honor al grupo étnico Awá, autodenominado “Gente de la montaña o la selva”, que ha habitado milenariamente gran parte de la región biogeográfica del Chocó en Ecuador y Colombia.

V. megalantha, ramas con estipulas y peciolos ferruginopubérulos; estipulas hasta 2 mm. Hojas elípticas obovadas; peciolo hasta 1,5 cm; limbo foliar máximo hasta 15 cm; base cuneada; envés ferrugíneo hirsuto, más abundante en las nervaduras primaria y laterales; en conjunto las ramitas al secar se tornan oscuras con las hojas rojizas. Flores, incluido el espolón 2,5 – 3,5 cm, pedúnculo y pedicelo floral máximo 2,5 cm; filamento hasta 1 mm de longitud, antera 0,3 – 0,4 cm.

De acuerdo con el esquema taxonómico de Vochysia de Stafleu (1948) Vochysia awasensis se ubica en Vochysia sect. Ciliantha, subsect. Megalanthae (Stafleu 1948) y la subsect. Megalanthae, se caracteriza por presentar la corteza (epidermis vieja) no exfoliante, hojas en verticilos tetrámeros a más, glabras; inflorescencia terminal pilosa; flores espolonadas de 1,5 – 3,5 cm de longitud, espolón nunca más largo que el estandarte (4to sépalo); pétalos 3; filamento muy corto de 0,1 – 0,3 cm, estaminodios largos y desarrollados.

Ecología y distribución Hasta la fecha Vochysia awasensis está registrada solamente para los bosques montanos del Chocó en el noroeste de Ecuador, en la reserva Étnica y Forestal Awá, ubicada entre las provincias de Esmeraldas y Carchi, y colinda con su similar en Colombia que posee el mismo nombre. Por tanto V. awasensis, muy posiblemente también se encuentre en el lado del Chocó colombiano, entre 1500 – 2500 m de altitud. Se observó floración entre los meses de junio a julio y la fructificación entre julio y agosto.

Conservación Afortunadamente Vochysia awasensis habita en los bosques del Chocó ecuatoriano, dentro de la reserva forestal y étnica Awá, la cual forma parte de la iniciativa de conservación del corredor Chocó-Manabí, conllevada por Conservación Internacional.

Cabe resaltar que aproximadamente el 65% de los bosques de la reserva étnica Awá son primarios, por lo cual el hábitat de V. awasensis se encuentra con buen estado de conservación. Sin embargo estos bosques no son ajenos a amenazas propiciadas por el hombre, siendo las principales la extracción ilegal de madera, la ampliación de zonas agrícolas y conflictos sociales entre los

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Agradecimientos Al herbario nacional de Ecuador QCNE, que a través de la Blga. Elsa Toapanta nos brindó las facilidades de acceso a las colecciones. A Robin Foster por su apoyo en la obtención de una pasantía en el Field Museum de Chicago y el MO, igualmente a Tyana Watcher y Juliana Phillips, con su apoyo logístico durante mi estadía en USA. A Olga Martha Montiel y al Dr. Ronald Liesner, por su apoyo logístico y en la revisión de las Vochysiaceae en el MO. A Janeth Santiana y Jesús Muñoz por la bibliografía facilitada; Al Dr. Henk Van der Werf, por su apoyo en la diagnosis del latín.

Literatura Citada Guzman N. L. 2011. Los árboles aislados en el territorio del pueblo indígena Inkal Awá: Un estudio de caso en la frontera entre Colombia y Ecuador. Tesis para optar el grado de Máster en Conservación y Gestión del Medio Natural. Universidad Internacional de Andalucía UNIA. Huelva, España. pp 57.

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Rev. peru. biol. 18(3): 275 - 278 (Diciembre 2011)

Rev. peru. biol. 18(3): 279- 282 (Diciembre 2011) © Facultad de Ciencias Biológicas UNMSM

Distribution of Astrocaryum sect. HISSN uicungo in Peru 1561-0837

Detailed assessment of the distribution of Astrocaryum sect. Huicungo (Arecaceae) in Peru Evaluación detallada de la distribución de Astrocaryum sec. Huicungo (Arecaceae) en Perú Francis Kahn1, Betty Millán2, Jean-Christophe Pintaud1, Miguel Machahua2

1 IRD, UMR DIADE, DYNADIV, Casilla 18-1209, Lima 18, Perú Email Francis Kahn: francis.kahn@ird.fr 2 Museo de Historia Natural, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Av. Arenales 1256, Jesús María, Lima 11, Perú

Abstract Detailed distribution of Astrocaryum sect. Huicungo (Arecaceae) in Peru is presented and discussed. Twelve out of the 15 species that compose this section are found in the Peruvian territory from North to South in the eastern Andean foothills and western Amazonian lowlands. All these species have a parapatric distribution, except for Astrocaryum macrocalyx and A. urostachys, which share a very limited area. Limits of distribution areas may be related to geographical, geomorphological and ecological barriers (river, geological rising, soil drainage). In some cases, however, the contact between species is almost contiguous; no natural barrier could be detected in the field.

Keywords: biogeography, palms, Astrocaryum, western Amazonia, Peru

Resumen

Presentado: 03/07/2011 Aceptado: 21/11/2011 Publicado online: 08/02/2012

Se presenta y se discute la distribución detallada de las especies de Astrocaryum sect. Huicungo (Arecaceae) en Perú. Doce de las 15 especies que componen esta sección se encuentran en el territorio peruano, del Norte al Sur en el piedemonte de los Andes orientales y en la llanura amazónica. Todas las especies presentan una distribución parapátrica, salvo Astrocaryum macrocalyx y A. urostachys que se superponen en una franja muy reducida. Las áreas de distribución son separadas por pasillos estrechos, que se pueden relacionar a barreras geográficas, geomorfológicas y ecológicas (ríos, levantamientos geológicos, drenaje del suelo). En algunos casos, las especies se suceden en el espacio sin que se haya podido identificar barreras naturales separándolas.

Palabras claves: biogeografía, palmeras, Astrocaryum, Amazonía occidental, Perú

Introduction High diversity of the palms in the western Amazon has been reported in several works (Kahn & Granville 1992, Montufar & Pintaud 2006, Pintaud et al. 2008a, Galeano & Bernal 2010, Balslev et al. 2011). The section Huicungo of the genus Astrocaryum illustrates this fact, with 14 out of 15 species present in the western Amazon, most of them endemic to this area, with only one species growing in the eastern Amazon and in the Guianas (Kahn 2008). Previous studies of the genus Astrocaryum have demonstrated that most species (12 of 15) of the sect.

Huicungo are found in Peru (Kahn & Millán 1992, Kahn 2008, Vargas & Pintaud 2008, Kahn & Millán 2009), with four species being endemic to Peru (Millán 2006). In bordering regions the number of species is notably lower (5 in western Brasil – States of Amazonas, Acre, and Rondonia, 5 in Colombia, 3 in Bolivia, and 1 in Ecuador).

In order to obtain a detailed distribution of species as a support to phylogenetic and biogeographical studies in the section Huicungo, Peruvian species have been collected throughout their distribution areas since 2008. It is now possible to draw the geographical limits between species and analyze in more detail their distribution patterns. Data and maps are presented and discussed here.

Material and methods Material studied.– The Neotropical genus Astrocaryum includes 40 species (excluded Astrocaryum mexicanum and A. alatum, treated as Hexopetion by Pintaud et al. 2008b); 39 species are found in South America, 2 in Central America.

The genus is divided into three subgenera: Astrocaryum with 16 species, Munbaca with four species, and Monogynanthus with Rev. peru. biol. 18(3): 279- 282 (December 2011)

20 species. The section Huicungo in the subgenus Monogynanthus groups 15 species distributed in three subsections: (i) Huicungo with 7 species, 6 of them are found in Peru; Sachacungo with 5 species, 4 of them in Peru; and Murumuru with 3 species, 2 of them in Peru.

The species of the section Huicungo grow in tropical rain forests. They are distributed in the low fluvial terraces on swampy soils or on periodically flooded alluvial soils, as well as in the upper terraces and hills on terra firme forests on well-drained and poorly-drained soils. These species tolerate deforestation rather well and are frequently found in open areas. Ecology of the genus was reviewed in Kahn (2008).

Study area.– The vast Peruvian region commonly known as Amazonia was visited using road networks and waterways for four years. It includes the Amazonian lowlands, the eastern Andean foothills and the central Andean valleys whose rivers run towards the Amazon basin (Fig. 1).

Data sample.– Palms were generally sampled at a distance of 1 to 20 km between each other, according to the frequency of the species and the accessibility of the plants. The shortest distance between two individuals was 200 m. For each specimen, elevation and coordinates of latitude and longitude were reported with a Garmin GPS, and dry leaf material was collected for further DNA analysis. Herbarium vouchers were collected from flowering and/or fruiting individuals. At least one herbarium voucher with fertile material was collected per locality.

When no fertile material was available, the locality was visited again until flowers and fruits for appropriate identification of the species were obtained. Herbarium vouchers were deposited at USM, Lima.

279

Kahn et al.

The total number of points used for mapping includes (i) all the palms sampled during the study, (ii) the data from vouchers collected by other members of the FP7-Palm project team (H. Balslev), and (iii) the data in schedula at USM, where most vouchers of Astrocaryum formerly collected in Peru are conserved.

The number of points varies among species. These depend on (i) the total area covered by the species (e.g. Astrocaryum carnosum distribution is clearly smaller than that of A. faranae), (ii) the accessibility of the region, and (iii) the number of previous collections available at the herbarium.

Astrocaryum carnosum — 39 points Herbarium specimen — Kahn 1839-40, 1933-34, 2031, 4476, Millán & Kahn 629, 636-37, 1483-84, 1679, 1681A, 1683, 1683A, Millán et al. 1377.

Astrocaryum chonta — 39 points Herbarium specimen — Balslev et al. 7658-59, 7852, 7870, 7873, Gentry 26925, Kahn 2081, Kahn & Mejia 1782, 1823, Mejia 106, Millán 141, Millán & Albán 149, 164, Millán & Mejía 60, 61, Millán & Canayo 63, 97, 99, 107, 109-10, 112, Millán & Kahn 1704, Millán & Vargas 1461, Millán et al.

706-11, 718.

Astrocaryum ciliatum — 1 point The species is only known from one place in Peru; it was identified by FK from a photograph sent by Robin Foster.

Astrocaryum faranae — 90 points Herbarium specimen — Balslev et al. 7885, 7897, 7929, 7971, 7998, 8005, 8012, 8056, 8092, Kahn 4442-44, 445155, 4475, 4477, 4489, 4490, 4492, Millán 173, 174, Millán & Clavo 1525, 1527, 1529, Millán & Kahn 627, 638, 642, 645, 647-48, 1692, 1694, Millán & Machahua 1697-98, Millán et al. 1385, 1387, 1399.

Astrocaryum gratum — 70 points Herbarium specimen — Alexiades & Pesha 357, Kahn 445658, 4467, 4473-74, Kahn & Llosa 2128, 2143, 2144, 2147, Kahn et al. 4479, Millán & Couturier 118-20, Millán & Kahn 1703, Millán & Pintaud 558, Nuñez et al. 21798, Vargas 18574, 18718.

Astrocaryum huicungo — 35 points Herbarium specimen — Kahn 4493, 4497-99, Kahn & Borchsenius 2654-55, Kahn & Moussa 3203-04, 3206-08, 3211-12, Killip & Smith 28840, 28698, Millán & Kahn 655-56, 1709, Millán & Pintaud 447, 449, Weberbauer s.n.

Astrocaryum javarense — 51 points Herbarium specimen — Fleck SWF 371, Gentry & Revilla 20873, Gentry et al. 56347, 76490, Kahn 2340, Kahn & Mejia 1776-77, 1780, 1786, 1858, 1971, 2055, 2057, 2069, Kahn & Moussa 3201-02, Kahn et al. 2408, Mejía 96, Millán 89, 90, Millán & Canayo 114, Millan et al. 32, 746, 888, 894, 1078-81, 1082-83, 1087-89, 1096, 1108.

Astrocaryum macrocalyx — 40 points Herbarium specimen — Gentry et al. 54253, 55618, 65743, Kahn 2296, Kahn & Couturier 3334, Millán 664, 674 Millán & Mejía 49, 50, Millán & Pereyra 64, Millán et al. 523, 906,

280

912-13, 916, 919-21, 922, 933-34, 1005-07, Moore et al. 8420, 8482, Pintaud 593, 595, Pipoly et al. 13685, 13839, Ruokolainen et al. 5461, Tessmann 5117, Vásquez & Jaramillo 544, Vásquez et al. 2360.

Astrocaryum perangustatum — 69 points Herbarium specimen — Kahn 3230-32, 4436-39, 4445, 4450, 4501-02, Millán 830, 839, 846, Millán & Kahn 1592, 1597, 1600, 1696, 1706-07, Smith 4045.

Astrocaryum scopatum — 56 points Herbarium specimen — Berlin 831, Kahn 4484-88, Kahn & Borchsenius 2563, Kahn & Machahua 4480-83, Millán & Kahn 526-29, 543-544, 556, 571, 577-79, 610.

Astrocaryum ulei — 32 points Herbarium specimen —Kahn 4459-63, 4465, 4466, 446972, Millán 386.

Astrocaryum urostachys — 29 points Herbarium specimen — Albán 14039, Kahn 4139, 4140, Millán 925, 934, 982, Millán & Vargas 762, Millán et al. 100103, Pintaud 587-92.

Map design — Maps were designed using ArcMap 9.3, Environmental Systems Resource Institut (2008), Redlands, California.

Results and discussion Distribution of Astrocaryum sect. Huicungo species in the Peruvian Amazonia forms a mosaic of rather contiguous areas from North to South and East to West (Fig. 1).

Two species are strictly limited to the subandean region: (i) Astrocaryum carnosum grows in the upper Huallaga valley between Tocache and Tingo María. (ii) Astrocaryum perangustatum grows in the Pozuzo, Palcazu and Pichis valleys, reaches the Amazonian lowlands to the Pachitea valley northeastwards, but does not extend into it, and follows the Perene and Ene River (Apurimac) valleys in Junín and Cusco-La Convención southwards.

Five species extend from subandean foothills to Amazonian lowlands: (i) Astrocaryum scopatum grows in the upper Marañon river valleys, from Cenepa valley northwest to San Lorenzo southeast. It is found along Nieva, lower Morona and Santiago river valleys. (ii) Astrocaryum huicungo is found in the RiojaMoyobamba region and extends to the Huallaga valleys in the Amazonian lowlands southeastwards. (iii) Astrocaryum faranae grows from the river Huallaga to Acre in Brazil, from South of Tarapoto to southern Huanuco department. The northeastern limit in the Ucayali river valley is not well defined yet. (iv) Astrocaryum gratum extends from the Urubamba valley (Cusco) northwestwards to the upper Tambopata valley southwestwards, it does not cross the Madre de Dios river eastwards. (v) Astrocaryum urostachys covers the northern region of the Amazonian lowlands, limited to the Morona river valley westwards and to the western border of Iquitos Arch southeastwards.

Five species are strictly found in the Amazonian lowlands: (i) Astrocaryum javarense grows in the region between the southern margin of Ucayali and Amazonas rivers northwards and the Jauari river basin southwards. (ii) Astrocaryum macrocalyx covers Rev. peru. biol. 18(3): 279- 282 (Diciembre 2011)

Distribution of Astrocaryum sect. Huicungo in Peru

Figure 1. Distribution of Astrocaryum sect. Huicungo (Arecaceae) in Peru.

the eastern part of the Amazonas northern margin, along Iquitos Arch eastern border. (iii) Astrocaryum ciliatum is known from the Maijuna area, north of Sucusari, halfway between the Napo and Algodon rivers, near the Colombian border. The species is rather frequent in the neighboring Colombia (Galeano & Bernal 2010). (iv) Astrocaryum chonta follows the terraces along the Amazonas-Ucayali-lower Urubamba and lower Tambo rivers; it is punctually found in the lower Marañon and the Manu river valley. (v) Astrocaryum ulei extends from the eastern margin of Madre de Dios river to Brazil and Bolivia eastwards.

Rev. peru. biol. 18(3): 279- 282 (December 2011)

All species are usually found below 1000 m elevation, except for Astrocaryum faranae collected in Peru from 167 to 1650 m.

The species of the subsection Huicungo (represented by rounds in Fig. 1 – A. carnosum, A. ciliatum, A. faranae, A. huicungo, A. javarense, A. scopatum) are grouped together in the northeastern half of the country. Those of the subsection Sachacungo (triangles) form two groups, two species (Astrocaryum macrocalyx and A. urostachys) in the northern part and two species (Astrocaryum gratum and A. perangustatum) in the southern part.

The two species of the subsection Murumuru (stars – A. chonta

281

Kahn et al.

and A. ulei) are located in the southeastern half of the country in Amazonian lowlands.

All the Peruvian species of the section Huicungo have a parapatric distribution, except for Astrocaryum macrocalyx and A. urostachys which share a very limited area (Vargas & Pintaud 2008). Such contact was not observed with the other species.

Several limits of the distribution areas may be related to geographical, geomorphological and ecological barriers. These are (i) rivers — Ucayali and Amazonas rivers in the case of Astrocaryum javarense/A. macrocalyx or Madre de Dios river in the case of Astrocaryum gratum/A. ulei, (ii) geological rising — in the case of the Iquitos Arch for Astrocaryum macrocalyx/A. urostachys (Vargas & Pintaud 2008), and of the Cordillera Vilcabamba (northern part) for Astrocaryum perangustatum/A. gratum, (iii) geomorphological location with differences in soil drainage and vegetation — the case of Astrocaryum javarense/A. chonta (A. javarense grows in terra firme forest on high terraces, while A. chonta grows in restinga forest, which covers low terraces on periodically flooded alluvial soils), or of Astrocaryum carnosum/A. faranae (A. carnosum being strictly restricted to the bottom of the Huallaga river valley, A. faranae is found on the slopes of Cordillera Azul). In other cases no barrier could be detected in the field — e.g. between Astrocaryum scopatum and A. urostachys along Santiago and Morona rivers, between Astrocaryum huicungo and A. faranae in Tarapoto region, or between Astrocaryum faranae and A. perangustatum in the Pachitea river valley. These last cases need further study to reach more detailed conclusions regarding their distribution.

Acknowledgments This work was done under the agreement between UNMSM/ San Marcos National University, Peru and IRD/Research Institute for Development (UMR DIADE/DYNADIV), France, and supported by the PALMS project funded by the European Community, 7th Framework Programme, Grant Agreement N°212631. We are indebted to Catherine Sahley for her valuable comments on the manuscript.

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Rev. peru. biol. 18(3): 279- 282 (Diciembre 2011)

Rev. peru. biol. 18(3): 283 - 291 (Diciembre 2011) © Facultad de Ciencias Biológicas UNMSM

Plantas medicinales en los mercados de la ciudad del Cusco ISSN 1561-0837

Riqueza, uso y origen de plantas medicinales expendidas en los mercados de la ciudad del Cusco Richness, use and origin of expended medicinal plants in the markets of the Cusco City Isau Huamantupa¹, Magaly Cuba², Rosa Urrunaga³, Elías Paz¹, Nelson Ananya¹, Myrthia Callalli¹, Nadir Pallqui¹ y Hozmary Coasaca¹ 1 Herbario Vargas “CUZ”, Universidad Nacional San Antonio Abad del Cusco. Cusco – Perú 2 Universidad Nacional de San Luis Gonzaga, Ica – Perú 3 Grupo Técnico de Biodiversidad de la Comisión Ambiental Regional CAR-Cusco. Perú.

Email Isau Huamantupa: achuntaquiro@yahoo.es

Resumen Se estudiaron las plantas medicinales expendidas en cinco mercados principales de la ciudad del Cusco: San Pedro, San Jerónimo, TTio, Wanchaq y Rosaspata y cuatro zonales de San Sebastián, Molino II, Huancaro y Santa Rosa. Se realizaron encuestas y colectas para identificar las especies de plantas medicinales, modo de utilización, afecciones tratadas, lugar de procedencia y origen. Registramos 152 especies, con 45 familias, las más ricas en especies fueron: Asteraceae con 36 y Lamiaceae (12); las especies con la mayor frecuencia de venta y compra fueron: Muehlenbeckia volcanica (Benth.) Endl. “mullaca”, Perezia virens (D. Don) Hook. & Arn. “valeriana”, Matricaria recutita L. “manzanilla” e Hypochaeris taraxacoides (Walp.) B. & H. “pilli pilli”; el hábito herbáceo represento el 75% del total; de las partes utilizadas 81% corresponden a toda la planta; las infusiones o “mates calientes” abarcaron el 69% del modo de preparación y las afecciones tratadas con mayor frecuencia fueron las inflamaciones renales y hepáticas, dolencias gastrointestinales y afecciones broncopulmonares. Las especies nativas representaron el 83% del total, de estas 78%, son procedentes de la región andina principalmente de localidades aledañas al departamento Cusco. Consideramos que esta alta riqueza de plantas medicinales expendidas en los mercados de la ciudad del Cusco es similar a otros registros en mercados andinos importantes de Sudamérica como en Bolivia y Ecuador, las que a su vez están arraigadas a conocimientos ancestrales, principalmente de la cultura Quechua.

Palabras clave. Riqueza, Andes, Plantas medicinales, Uso y Cultura Quechua.

Abstract Presentado: 09/02/2011 Aceptado: 17/08/2011 Publicado online: 08/02/2012

We studied medicinal plants expended in five major markets, San Pedro, San Jerónimo, Ttio, Wanchaq and four small zonal, Rosaspata, San Sebastian, Molino II, Huancaro and Santa Rosa, in the city of Cusco. It was aimed to know the richness, how to use treated conditions, place of origin, distributions and source. We recorded 152 species into 45 families, the families more riches were Asteraceae with 36 species and Lamiaceae (12), species most frequently bought and sold in all markets were Muehlenbeckia volcanica (Benth.) Endl. "Mullaca" Perezia virens (D. Don) Hook. & Arn. "Valeriana", Matricaria recutita L. "Manzanilla" and Hypochaeris taraxacoides (Walp.) B. & H. "Pilli pilli", the herbaceous habit represent 75%,the total of the parts used, 81% correspond to the entire plant, the infusions or "mates calientes" with 69% of the mode of preparation and conditions treated most frequently were the bronchopulmonary, kidney and inflammations, liver and gastrointestinal ailments. Native species accounted for 83% of the total, these 78% are from the Andean region surrounding towns mainly Cusco department. We believe that this great wealth of medicinal plants expended in the markets of the city of Cusco is similar to other important records in Andean South American markets such as Bolivia and Ecuador, which in turn are rooted in ancient knowledge, mainly Quechua culture.

Keywords. Richness, Andes, Medicinal Plants, Use and Quechua Culture.

Introducción Los andes del Perú son grandes centros de diversidad donde desde la existencia de las culturas pre colombinas, el hombre andino ha convivido en estrecha relación con su medio y recursos, aprendiendo a manejarla para obtener sus alimentos, vestimenta, vivienda y salud.

En los últimos años un 80% de la población mundial ha recurrido a las plantas medicinales para tratar diversas enfermedades o afecciones, porque son accesibles y más baratos que los productos farmaceuticos (UICN et al. 1993). En el Perú la riqueza de las plantas medicinales es muy amplia y está enmarcada dentro de más de 4400 especies de usos conocidos por las poblaciones locales, de las cuales un gran porcentaje se presenta en la región andina (Brack 1999).

En la ciudad del Cusco considerada como la capital de la cultura americana (título otorgado por la organización capital americana de la cultura en el 2007), se continúa con la práctica del uso y manejo de especies de plantas medicinales que en su mayoría son provenientes del conocimiento ancestral, a pesar de Rev. peru. biol. 18(3): 283 - 291 (December 2011)

las etapas de cambios marcados, vividos durante la colonización y republicana. Una de estas prácticas que aún se mantienen es lo que durante las culturas pre-incas e inca se realizaban como el intercambio o trueque de recursos provenientes de las zonas andinas, amazónicas y de la costa, las cuales también eran llevadas a importantes mercados de ciudades grandes como el Cusco y Cajamarca (Garcilaso 1971).

En el Perú se tuvieron diversos estudios etnobotánicos empezándose con los naturalistas españoles Ruiz y Pavón, continuando con los de Alexander Von Humboldt, y Antonio Raimondi quién quizá para este tiempo fue el que más especies referencio para el departamento del Cusco. El “Inca” Garcilaso de la Vega en su obra de “Los Comentarios Reales de los Incas” menciona algunas especies de uso frecuente durante el incanato, pero indudablemente los trabajos del botánico cusqueño Fortunato L. Herrera, dieron a conocer muchas especies medicinales (Herrera 1923), y de otros usos de la región andina principalmente del sur peruano, a estos se suman también varios trabajos del botánico cusqueño Cesar Vargas quién incluye además documentos de la etnobotánica de varias etnias poco o nada conocidas hasta

283

Huamantupa et al.

70 60 50 40 30 20 10 Mercado zonales

Ttio

Rosaspata

San Jeronimo

Wanchaq

0 San Pedro

Los mercados en todo pueblo o ciudad son lugares donde se expenden y/o intercambian productos, como es el caso de las plantas medicinales; en la ciudad del Cusco diariamente se expenden no solo especies medicinales sino también junto a estas aromáticas y para hacer pagos a la tierra. Entre las especies de uso medicinal ampliamente expendidas están: Stachys herrerae “cáncer qora”, Hypochaeris taraxacoides “pilli – pilli” y Matricaria recutita L. “manzanilla” (Mantilla & Olazábal 2004). Por otro lado, varias especies que se expenden son provenientes de Europa y Asia, los que no solo son encontradas en mercados sino también son cultivadas en chacras y huertas de las casas; por ejemplo: la “sábila”, “manzanilla”, “cedroncillo”, “retama” y la “hierba buena”.

80

N°especies

entonces. Reportes recientes indican que se han realizado con bastante auge estudios etnobotánicos en el departamento del Cusco, siendo el ámbito donde más investigaciones etnobotánicas se realizaron en el Perú, con 40 publicaciones (La Torre et al. 2006).

Figura 1. Distribución de especies en los mercados de la ciudad de Cusco.

El área de nuestro estudio está enmarcada dentro de la ciudad del Cusco, en diferentes mercados donde a diario se comercializan numerosas especies medicinales, así como también en las llamadas ferias dominicales y sabatinas.

San Sebastián, Molino II, Huancaro y Santa Rosa, no se tuvo diferencia en cuanto al número de especies expendidas en ambas temporadas, pero si en términos de abundancia (Fig. 1).

Los objetivos planteados fueron los siguientes: a) conocer las especies de plantas medicinales expendidas en los mercados de Cusco, b) conocer el modo de uso y empleo en las afecciones tratadas y c) conocer el origen, distribución y procedencia.

Se registraron 152 especies, pertenecientes a 45 familias, las de mayor riqueza fueron: Asteraceae con 36 especies, Lamiaceae (12), Plantaginaceae (6), Poaceae (5), Apiaceae, Malvaceae, Fabaceae y Polypodiaceae con 4 especies (Fig. 2), estas suman 71 especies (49,3% del total).

Los hábitos de crecimiento (Fig. 3), fueron representados en su mayoría por las hierbas con el 75% y arbustos 8% y los menos diversos fueron los de liana y arbóreo.

En cuanto a la riqueza mostrada para cada mercado (Fig. 1), en San Pedro se registró 68 especies, seguida de San Jerónimo (62), estos dos mercados principales muestran casi la mitad de las especies muestreadas para todos los mercados, cabe señalar que San Pedro (68 spp.), es el más antiguo y más grande de esta ciudad, aquí ya existen proveedores establecidos, por ende existe

En los cinco mercados principales de San Pedro, San Jerónimo, TTio, Wanchaq y Rosaspata y mercados zonales de

284

Polypodiaceae

Fabaceae

Apiaceae

Poaceae

Malvaceae

Resultados Riqueza de plantas medicinales

40 35 30 25 20 15 10 5 0 Asteraceae

Para las identificaciones botánicas en muchos de los casos se procedieron a la compra de plantas con órganos reproductivos completos, además de un registro fotográfico de cada una de ellas; las identificaciones taxonómicas se hicieron en el Herbario CUZ de la Universidad Nacional de San Antonio Abad del Cusco y además se consultó de bibliografía especializada. La clasificación taxonómica se basó en el sistema de clasificación propuesta por el APG-III (2009).

N°especies

También se consideró encuestas a los compradores y las preferencias de estos frente a las afecciones tratadas.

Plantaginaceae

Las visitas a los mercados ya mencionados se realizaron en la temporada de lluvias (diciembre-abril) y secas (mayosetiembre) del 2006. Se realizaron encuestas a 32 expendedores y 74 compradores, mediante fichas etnobotánicas elaboradas, considerando los siguientes datos, las afecciones tratadas, partes de las plantas utilizadas, modos de preparación y aplicación, procedencia, nombre vernacular y otros. Para determinar el origen de las especies ya sea como nativas o introducidas (exóticas), se consultó el Catálogo de las Angiospermas y Gimnospermas del Perú de Brako & Zarucchi (1993).

Las especies que se expenden con mayor frecuencia en los nueve mercados (Figs. 6 y 7), fueron: Muehlenbeckia volcanica “mullaca”, Perezia virens “valeriana”, M. recutita “manzanilla”, H. taraxacoides “pilli – pilli”, Taraxacum officinale “diente de león” y Persicaria hydropiperoides “duraznillo”.

Lamiaceae

Material y métodos Se seleccionaron cinco mercados principales, donde se presenta la mayor afluencia de pobladores, estas fueron: San Pedro, San Jerónimo, TTio, Wanchaq y Rosaspata; y los mercados zonales pequeños fueron: Santa Rosa, San Sebastián, Molino II y Huancaro.

Figura 2. Distribución de las ocho familias botánicas más importantes para los nueve mercados de la ciudad de Cusco.

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Plantas medicinales en los mercados de la ciudad del Cusco Hierba

Las afecciones que son tratadas con mayor incidencia, son las inflamaciones hepáticas y renales, consumiéndose para esto más del 40% del total de especies medicinales, luego las referidas a problemas gástrico-estomacales (30%) y para las afecciones broncopulmonares y respiratorias (20%).

77

Arbusto

11 8

Árbol Liana

2

Hemiparásita

2 0

20

40

60

80

%

Figura 3. Proporción de las formas de crecimiento, según las especies muestreadas en los mercados de la ciudad de Cusco.

mayor afluencia de compradores que obtienen mejor garantía y seguridad; lo mismo acontece en el mercado de San Jerónimo que abarca un alto número de especies (62), y está relacionada principalmente a que un importante porcentaje de la población urbana del extremo sur de la ciudad recurre a este mercado por ser mayorista, prioritariamente los días domingos o días de ferias; el mercado de Wanchaq con 45 especies es otro importante en la zona central del valle de Cusco.

Los mercados zonales no muestran amplia diversidad de plantas medicinales pero si expenden algunas especies importantes y poco conocidas, al igual que en las ferias dominicales y sabáticas, siendo dichas especies: Bowlesia tropaeolifolia “upuysuru”, Calycera sp “estrella kiska” y Barnadesia horrida “llaulli”.

Modos de uso Según las encuestas realizadas a expendedores y compradores, el uso y manejo de las especies medicinales nativas, están relacionados y arraigados al conocimiento ancestral transmitido de padres a hijos, este conocimiento es mayormente expresado en las zonas rurales.

De las partes utilizadas de la planta, el 75% corresponde al empleo de toda la planta, es decir incluyendo las raíces, tallos, hojas y flores, 10% solamente hojas, 4% raíces y el 11% mixtura de flores, frutos y tallos.

La forma de preparación (Fig. 4), se da en gran proporción en las infusiones o los llamados comúnmente “mates calientes” con 69%, en forma de baños realizando la decocción de las partes 15%, emplastos 5% y consumidas directamente 4%, siendo para esta las más requeridas: “diente de león” T. officinale; “pilli”, pilli pilli” H. taraxacoides; H. echegaraii, Paranaphelius sp; en forma de sahumerios, frotaciones e inhalaciones 7%, empleando varias especies de “chillcas” Baccharis spp.

De acuerdo a la encuesta realizada a pobladores, compradores y expendedores de los mercados, las plantas más requeridas fueron: S. herrerae “cancer cora”, P. virens “valeriana”, H. taraxacoides, H. echegaraii “pillis” y M. volcánica “mullaka” Otras pocas especies pero importantes las constituyen aquellas que producen resinas, látex y aceites, que son frecuentes de hallar como en el mercado San Pedro, estas son: Croton lechleri “sangre de grado”, Ficus insípida “ojé”, Ficus trigona cf. “matapalo”.

Otro de los rubros importantes son las usadas en el tratamiento de torceduras, desgarres e inflamaciones musculares y problemas del sistema óseo, destacando entre ellas Phoradendron spp “suelda que suelda”, Grindelia boliviana “chiri chiri” y Piper elongatum “matico”, que son aplicados de forma directa en la zona afectada en los llamados emplastos.

Vale destacar la mención de algunos usos poco conocidos en la farmacopea regular como por ejemplo a Otholobium pubescens “hualhua” especie requerida frecuentemente, como regulador del ciclo menstrual, corroborado por personas encuestadas del grado de efectividad, en preparados de los “mates” y “agua de tiempo”. También se halló especies consideradas “prohibidas” para la venta, porque son utilizadas en las prácticas de aborto, donde destaca Xanthium spinosum “alco kiska”.

Origen, distribución y procedencia El 83% del total (126 spp.), de las plantas medicinales expendidas en los mercados de la ciudad de Cusco son de origen nativo, la mayoría de ellos pertenecen a las familias Asteraceae y Lamiaceae, las cuales están ampliamente distribuidas en la zonas altoandinas y los bosques de montaña o ceja de selva, sin embargo una buena proporción también son procedentes de zonas aledañas a zonas marginales de la ciudad de Cusco.

De acuerdo a las encuestas a los compradores, gran parte de estas especies nativas actualmente se vienen cultivando en los bordes de chacras, huertos, jardines de los hogares, acequias y pequeñas quebradas.

Tomando en cuenta la procedencia de las tres regiones naturales, la andina, amazónica y costera (Fig. 5), se muestra que el 78% (119 spp.) son de procedencia andina, el 9% costero y especies amazónicas (8%), de esta última las especies con mayor demanda son: Uncaria tomentosa “uña de gato”, Phyllanthus niruri “chanca piedra”, C. lechlerii “sangre de grado”, F. insipida Andino

Mates calientes

Andino, Costero

Baños calientes

Amazónico

Sahumerios y otros

Andino, Amazónico, Costero

Emplastos

Costero

Consumo directo 0

10 20 30 40 50 60 70 %

Figura 4. Distribución de las formas de uso de las especies de plantas medicinales

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0

20

40

60

80

%

Figura 5. Distribución de las especies medicinales expendidas en los mercados de Cusco, según la región de su proveniencia, An = Andino, Am = Amazónico y Co = Costero.

285

Huamantupa et al.

(A)

(B)

(C)

(D)

(E)

(F)

Figura 6. (A) Puesto de venta, (B) Vendedora de “mates”, (C) Forma de empaques y combinaciones entre especies. (D) Rodaja de tallo de Cyathea caracasana “sano sano”, (E) Campiloneurum bogotense “cala huala”, (F) Perezia sp. “cáncer ccora”.

286

Rev. peru. biol. 18(3): 283 - 291 (Diciembre 2011)

Plantas medicinales en los mercados de la ciudad del Cusco

(J)

(G)

(K)

(H)

(I)

(L)

Figura 6. , (G) Calceolaria scapiflora “zapatito”, H). Eryngium weberbauerii “yanahuma”, (I) Hypochaeris echegarai “pilli-pilli”, (J) Muehlembeckia volcanica “mullaka”, (K) Hypochaeris sp. “pilli”, (L) Leucheria sp. “escorzonera”,

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287

Huamantupa et al.

“matapalo” Stachytarpheta cayennensis “yanahuacta”. En general se comparten pocas especies entre la región andina y costera, también entre la amazonia y la región andina.

El 17% (26 spp.), son de origen exótico principalmente del continente europeo y asiático, entre ellas destacan M. recutita “manzanilla”, Mentha viridis “hierba buena”, Aloe vera “sabila” y Rosmarinus officinalis el “romero”.

Discusiones De la Riqueza Las 152 especies de plantas medicinales expendidas en los mercados de Cusco representan una alta cifra, comparada con otros mercados grandes, pero debemos resaltar, que fuera de los mercados muestreados en este estudio existen otros lugares de venta como las “hierberías”, “pachamama hampis” (lugares donde se comercian especies utilizadas en los rituales de pagos a la tierra y de chamaneria), además de otros mercados zonales, los cuales por razones de tiempo no se consideraron, y que a nuestro concepto también son lugares importantes donde se expenden otras especies poco conocidas.

Para el Perú se calcula aproximadamente 1400 especies de plantas medicinales conocidas (Brack 1999), nuestro estudio representa el 11% de estas. Comparando las cifras de especies medicinales expendidas en otros mercados peruanos, podemos citar una realizada en el norte del Perú, en dos mercados mayoristas, el de Hermelindas en Chiclayo y Moshoqueque en Chiclayo, donde se reportan cerca de 400 especies (Bussmann et al. 2007), donde a diferencia de nuestro estudio, se consideró a tiendas o puestos donde se expenden especies de uso mágico religioso y otros. Consideramos que el número de especies medicinales comercializadas en estas ciudades es similar o mayor a los del Cusco, debido en gran parte a que provienen de otras unidades fisiográficas vegetacionales diferentes como la Jalca y Páramos (Sanchez & Dillon 2006), diferentes de la puna seca y húmeda características de la zona sur del Perú y norte de Bolivia.

No se cuenta con datos publicados sobre la comercialización de plantas medicinales en otros mercados de ciudades peruanas andinas, pero si podemos mencionar algunos como los expuestos en congresos de botánica y biología, por ejemplo en un estudio realizado en la ciudad de Puno en cuatro mercados, se registraron 102 especies, donde las Lamiaceae y Asteraceae fueron las más representativas, los que también en nuestro estudio fueron los más diversos.

Para el Cusco, Mantilla (2004) recopiló información en comunidades campesinas aledañas de Viacha y Ampay (distrito Pisac), y cataloga 20 especies “andinisadas” refiriéndose a especies introducidas, también registra 97 especies nativas andinas utilizadas comúnmente en estas comunidades, cabe resaltar que la totalidad de estas especies catalogadas son expendidas en los mercados de Cusco y la mayoría de ellas en los mercados de San Pedro y San Jerónimo.

Otras fuentes de información importante las constituyen las proporcionadas por Moscoso (2001) y Urrunaga (2002, 2003), quienes describen los usos de especies medicinales nativas e introducidas compilando más de 250 especies, de estas para nuestro estudio se halló que el 50% son expendidas, de las que 90% son nativas.

288

La riqueza de especies obtenida en el presente estudio es similar a mercados andinos estudiados en otros países como en Ecuador (Quito, Riobamba e Ibarra), que varían entre 69 y 175 especies (Cerón 2006), quién también hace mención a mercados de México donde la riqueza oscila entre las 135 especies, principalmente en las llamadas hierberías relacionadas a mercados mayoristas. Por otro lado en mercados de Bolivia, Vidaurre (2006), basándose en datos de Macía et al. (2005) y Vandebroek et al, (2003); cataloga la venta diaria entre 129 - 171 especies, correspondientes a 54-56 familias botánicas., específicamente en el mercado del alto La Paz, considerando todos los puestos donde se venden plantas medicinales se catalogó 129 especies correspondientes a 55 familias, de estas las más diversas fueron Asteraceae, Fabaceae y Solanaceae (Macía et al. 2004), que a diferencia de nuestro estudio las dos últimas presentan menos especies.

El número de especies comercializadas en los mercados andinos e inclusive del norte peruano son similares, porque en cada zona los conocimientos sobre las plantas medicinales estuvieron directamente relacionadas al conocimiento ancestral, esto por ejemplo se puede notar en la nomenclatura vernacular de algunas especies del norte peruano, donde algunas de ellas son aparentemente de origen moche, otras ya combinadas entre moche y quechua y varias otras solamente quechua. Esta característica similar se aprecia en el sur de Perú y norte de Bolivia con la nomenclatura quechua entremezclada con la aymara, al mismo tiempo esto se corrobora que entre los andes de Bolivia, Ecuador y Perú se comparten varias especies (Tabla 1), pero algunas varían en la nomenclatura vernacular, más las formas de uso y las afecciones tratadas son las mismas.

Las Asteraceae, Lamiaceae y Plantaginaceae en nuestro estudio presentaron la mayor riqueza, esto se corrobora con otros mercados andinos como La Paz y Cochabamba en Bolivia (Vidaurre 2006) y Quito, Cuenca en Ecuador (Cerón 2006).

La venta de especies medicinales en mercados de estos tres países andinos es compartida en alto número variando de 40 a 70 (Tabla 1), donde Asteraceae comprende varias especies, del mismo modo casi el total de especies introducidas son también compartidas entre estos mercados andinos importantes.

El grupo de las Lamiaceae comparte muchas especies especialmente con mercados de Bolivia, más en mercados de Ecuador difieren con más especies pero significativamente se tienen equivalentes en cuanto a especies diferentes pero del mismo género.

De los modos de uso En nuestro estudio en cuanto a las formas de utilización 75% corresponden al uso toda la planta considerándose las raíces, tallos, hojas, y flores, debido a que en su mayoría (72%), lo constituyen las hierbas los que son colectados normalmente desde la raíz. Este empleo mayoritario difiere con otras zonas como en los mercados de Bolivia donde las partes utilizadas son mayormente las hojas (Vidaurre 2006, Macía et al. 2004), seguidas por las flores, frutos, semillas y cortezas.

Así mismo el modo de preparación es parecido a mercados de Bolivia y Ecuador en los llamados “mates” o infusiones que en la ciudad de Cusco frecuentemente son expendido en las calles de la ciudad por los llamados “emolienteros y materos” (Fig. 6). Para los mercados de Cusco otras formas de aplicación importante son Rev. peru. biol. 18(3): 283 - 291 (Diciembre 2011)

Plantas medicinales en los mercados de la ciudad del Cusco Tabla 1. Especies de pantas medicinales frecuentemente expendidas y compartidas entre mercados andinos importantes de Sudamérica, Bolivia, Ecuador y Perú. Especie introducida (*).

Especie

Nombre vernacular

Afecciones tratadas

Sauco, Tilo

Nervios, resfríos

Chenopodium ambrosiodes L.

Paico

Vermífuga

Amarillydaceae

Aloe vera L.*

Sabila

Males del cuero cabelludo

Molle

Baños contra inflamaciones internas

Apium graveolens L.*

Apio

Inflamaciones estomacales y resfríos

Foeniculum vulgare Mill.*

Hinojo, Eneldo

Inflamaciones gastrointestinales

Ambrosia arborescens Mill.

Altamisa, Marku, Marco

Limpiados de inflamaciones internas, insecticida

Baccharis genistelloides (Lam.) Pers.

Kinsakucho, Tres filos

Inflamaciones gastrointestinales e hígado

Chuquiraga spinosa Less.

Chuquiraga

Inflamaciones del hígado

Cynara scolymus L.*

Alkachofa

Estimulaciones al funcionamiento normal de la vesícula

Gnaphalium americanum Mill.

Queto-queto, lechuguilla

Digestiva, desinfecciones oculares

Grindelia boliviana Rusby

Chiri-chiri

Para fracturas y lucsaciones

Adoxaceae Sambucus peruviana Kunth Amaranthaceae

Anacardiaceae Schinus molle L. Apiaceae

Asteraceae

Hypochaeris taraxacoides (Walp.) Benth. & Hook. f. Pilli-pilli, achicoria

Problemas hepáticos y biliares

Matricaria recutita L.*

Manzanilla

Antiespasmódicos y limpiezas gastrointestinales

Mutisia acuminata Ruiz & Pav.

Chinchirkuma

Baños contra problemas nerviosos

Sonchus oleraceus L.

Ccahua, Cashacerraja

Inflamaciones vesiculares

Taraxacum officinale L*

Diente de león, Taraxaco

Inflamaciones vesiculares y diuréticos

Aleli, Alelí morado

Problemas cardiacos

Pinco-pinco

Limpieza renal y de próstata

Cola de caballo, Caballochupa

Inflamaciones internas estomacales y renales

Coca

Chacchado, limpieza estomacal, reumatismo y problemas de altura

Sangre de grado

Cicatrizante de heridas y quemaduras, hemorroides internos

Otholobium pubescens (Poir.) J.W.

Huallhua, trinitaria

Correcciones de atrasos menstruales

Spartium junceum L.*

Retama, retamo

Purgantes, limpieza de cálculos renales

Lepechinia meyenii (Walpers) Epling

Salvereal, Puna salvia

Dolores estomacales

Melissa officinalis L.*

Torongil

Digestivo y problemas del tejido cardiaco

Mentha X piperita L. (pro sp.) *

Menta

Digestiva

Minthosthachys spicata (Benth.) Epling

Muña

Digestiva e insecticida

Rosmarinus officinalis L *

Romero

Baños antiinflamatorios

Salvia officinalis L. *

Salvia

Baños antiinflamatorios

Higo

Digestiva

Eucalypto

Problemas bronco pulmonares

Brassicaceae Matthiola incana (L.) R. Br. Ephedraceae Ephedra rupestris Benth.

Equisetaceae Equisetum bogotense Kunth Erythroxylaceae Erythroxylum coca Lam. Euphorbiaceae Croton lechleri Müll. Arg. Fabaceae

Lamiaceae

Moraceae Ficus carica L.* Myrtaceae Eucalyptus globulus Labill.*

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289

Huamantupa et al.

Tabla 1. Continuación.

Passifloraceae Passiflora ligularis Cav.

Granadilla

Digestivo

Matico

Antiinflamatorio y cicatrizante

Llanten

Inflamaciones intestinales, hemorragias internas

Cymbopogon citratus (DC) Stapf *

Hierba luisa

Digestivo y saborizante

Zea mays L.

Maíz

Inflamaciones intestinales

Cantu, cantuta

Febrífugo

Mullaca, Angoyuyo

Inflamaciones hepáticas

Rosa

Irritaciones del ojo, inflamaciones internas

Citrus medica L.*

Sidra

Inflamaciones estomacales y hepáticas

Ruta graveolens L.*

Ruda

Vermífuga y anti nerviosa

Zarza parrila

Alteraciones sanguíneas, hemorragias internas

Uña de gato

Desinflamante artrítico, febrífugo anti cancerígeno

Violeta

Problemas broncopulmonares

Piperaceae Piper aduncum L. Plantaginaceae Plantago major L. Poaceae

Polemoniaceae Cantua buxifolia Juss. ex Lam. Polygonaceae Muehlenbeckia volcanica (Benth.) Endl.

Rosaceae Rosa canina L.* Rutaceae

Smilacaceae Smilax poeppigii Kunth Rubiaceae Uncaria guianensis (Aubl.) J.F. Gmel.

Violaceae Viola odorata L. *

los emplastos, frotaciones y baños con decocciones de diferentes partes de las plantas; además muchas de estas aplicaciones o formas de suministro van combinadas entre varias especies, estas formas de aplicación son compartidas con mercados de Bolivia y en menor proporción con mercados de Ecuador.

En el presente estudio las principales afecciones tratadas fueron las inflamaciones hepáticas y renales; esto tambien se observó en los mercados de ciudades andinas de Ecuador (Cerón 2006).

Considerando el estudio de Bussmann & Sharon (2006), para todo el norte peruano con un inventario general de especies medicinales catalogaron un total de 510 especies, de estas 207 son empleadas en prácticas de curaciones mágico-religiosas, 95 son empleadas en afecciones relacionadas al sistema respiratorio, 85 a desordenes de las vías urinarias, comparados a nuestro estudio difiere notablemente dado que las afecciones respiratorias y las de vías urinarias no fueron consideradas con mayor relevancia. En Cusco, otras afecciones tratadas son las digestivas y broncopulmonares, esta última relacionada principalmente a los cambios entre la estación seca y lluviosa.

Por otra parte según los encuestados del público y expendedores, mencionan que es frecuente el consumo de especies contra problemas digestivos como: Minthosthachys spicata “muña”, Menta viridis “hierba buena” y Matricaria recutita “manzanilla”, especialmente después de consumir los alimentos Hallamos algunas especies que consideramos necesitan de mayor investigación por parte de la industria farmacológica, estas constituyen Perezia virens y P. coerulescens, las llamadas “valeriana”

290

y “valeriana macho”, que según los encuestados presenta una efectividad en afecciones de este tipo. Otra especie interesante que viene siendo estudiada recientemente es Valeriana spp. la “qata”, la cual es bastante utilizada también en las zonas rurales contra afecciones del sistema nervioso y cardiaco.

Del origen, distribución y precedencia El 83% (126 spp.), son de origen nativo, de estas el 78% son procedentes de la región andina, donde especies de las familias Asteraceae, Lamiaceae, Plantaginaceae, Fabaceae y Poaceae, son las mejor adaptadas a estos ecosistemas, por tanto las más diversas, estas especies proceden principalmente de las localidades altoandinas aledañas al valle del Cusco como son Pisac, Urubamba, Calca, Limatambo, San Jerónimo, Pachatusan, Qorao y Saylla-Huasao. También en menor cantidad son traídas de los departamentos de Puno, Apurimac y Ayacucho.

Las especies provenientes de la región costa son en menor número y la casi la totalidad de ellas son compartidas con la región andina y las otras corresponden a especies exóticas provenientes del continente europeo y asiático.

Cabe resaltar que algunos expendedores mencionan que el cultivo de especies medicinales exóticas es de gran rentabilidad y de buen rendimiento por su fácil adaptación a diferentes hábitats, por ello es común su cultivo en jardines y huertos de casas tanto en urbes y zonas rurales.

Las especies provenientes de la Amazonía son principalmente las más conocidas y utilizadas en varios departamentos principalRev. peru. biol. 18(3): 283 - 291 (Diciembre 2011)

Plantas medicinales en los mercados de la ciudad del Cusco

mente en Iquitos, Madre de Dios y Pucallpa (Ducke & Vasquez 1994), para el ámbito de Cusco, las especies provienen en gran número de los valles amazónicos de la Convención, Quincemil, Yanatile y Kosñipata.

Conclusiones El presente estudio de las especies medicinales, expendidas en los mercados de Cusco, constituye un aporte importante para el conocimiento local y regional considerando que en la región andina, la población local usa directamente este recurso. La riqueza de taxas, modos de uso, afecciones o dolencias tratadas y el origen de las plantas medicinales expendidas en los mercados de Cusco muestra patrones similares a otros mercados andinos como Puno en Perú, algunos importantes de la costa como Lambayeque y la Libertad; Cochabamba y La Paz en Bolivia y Quito, Riobamba e Ibarra en Ecuador, lugares con los que a su vez se comparte conocimientos ancestrales proveniente de las culturas Quechua y Aymara principalmente, y que estos a su vez están directamente relacionados a que también se comparten varios ecosistemas y hábitats naturales similares o parecidos. También las especies exóticas o introducidas en su totalidad son compartidas y utilizadas ampliamente en todos los mercados andinos.

Agradecimientos Los autores hacen el agradecimiento especial a los pobladores, expendedores de los diferentes mercados de la ciudad de Cusco, ya que desinteresadamente nos facilitaron el acceso a información del conocimiento que poseen que en la mayoría de casos no están documentas en fuente alguna. Igualmente a los profesionales encargados en el herbario Vargas “CUZ”, de la facultad de ciencias biológicas de la UNSAAC, por brindarnos las facilidades de acceso a dicha institución.

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Rev. peru. biol. 18(3): 293 - 297 (Diciembre 2011) © Facultad de Ciencias Biológicas UNMSM

Desarrollo reproductivo del “amancay”ISSN Ismene amancaes 1561-0837

Desarrollo reproductivo del “amancay” Ismene amancaes (Amaryllidaceae) en su ambiente natural Reproductive development of “amancay” Ismene amancaes (Amaryllidaceae) in its natural environment Mery L. Suni, Edisson Pascual, Enoc Jara

Laboratorio de Fisiología Vegetal, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Apartado 11058. Lima 11, Perú.

Email Mery Suni: msunin@gmail.com Email Enoc Jara: ejarap@gmail.com Email Edisson Pacual: e.di.sson22@hotmail.com

Resumen Ismene amancaes “amancay” es una especie bulbosa característica de las formaciones vegetales denominadas “Lomas” de la costa central del Perú. Emerge al iniciar el periodo de neblina que ocurre en junio, durante el invierno. Presenta flores grandes amarillas y con agradable aroma, muy apreciadas y de valor ornamental. A fin de conocer el desarrollo reproductivo de Ismene amancaes en su ambiente natural se hicieron muestreos mensuales de sus bulbos durante todo un año. Se realizaron observaciones del interior del bulbo para determinar el inicio de la formación y desarrollo de las yemas florales y se relacionó con la formación de sus hojas y la humedad edáfica. Se puede indicar que las primeras yemas florales se hacen evidentes el año anterior a su emergencia, en el mes de diciembre, alcanzando el máximo número de yemas florales en febrero (periodo de verano). La diferenciación de las yemas florales se inicia luego de haberse formado las hojas que saldrán el siguiente año y en el periodo de máximo descenso de la humedad edáfica y de incremento de la temperatura (noviembre). La inflorescencia es la única ramificación que se forma mientras que la yema apical continua formando hojitas. En junio, la pequeña inflorescencia alcanza el cuello del bulbo y avanza seguido por las hojas formadas antes de la inflorescencia siendo envolventes a la inflorescencia misma y a la yema foliar apical. La yema foliar continuará su desarrollo y en julio dos de sus hojas salen del bulbo, las siguientes aun pequeñas quedan dentro y brotarán en el periodo de Lomas del siguiente año. Se puede señalar que el éxito reproductivo de Ismene amancaes en su etapa inicial es dependiente de los fotoasimilados acumulados como biomasa del bulbo en el periodo de Lomas anterior.

Palabras clave: Santuario de Amancay, Lima, Desierto costero peruano, bulbo, Lomas

Abstract Presentado: 21/05/2011 Aceptado: 20/11/2011 Publicado online: 08/02/2012

Ismene amancaes “amancay” is a bulbose species typical of the central coast vegetation of Peru called “lomas”.

This species sprouts in June during the beginning of the winter-fog period. It has large yellow, aromatic flowers valued for their ornamental value. Our goal was to examine the reproductive development of Ismene amancaes in its natural environment, and we recorded monthly observations during a yearlong study. Observations of the interior of the bulbs allowed recording of the beginning of floral bud formation and development, relating them to leaf formation and edaphic humidity. We found that the first floral buds develop the year before their emergence in December, reaching a maximum number of floral buds in February, during the Summer. Floral bud differentiation starts after leaves that will emerge the following year have developed. This occurs during a period of maximum decrease in edaphic humidity and an increase in air temperature (November). The inflorescence is the only branching that develops while the apical bud continues developing leaves. In June, the small inflorescence reaches the neck of the bulb and surpasses it followed by those leaves developed before the inflorescence that surround both the inflorescence and the apical foliar bud. The foliar bud will continue its development, and in July two of the leaves expand, while the smaller ones remain inside the bulb until the following year’s Lomas season. It can be noted that the reproductive success of Ismene amancaes in its initial development depends on the photoreserves accumulated in the bulb the previous growth period.

Keywords: Amancay Sanctuary, Lima, Peruvian Coastal Desert, bulb, Lomas.

Introducción Ismene amancaes (Ruiz & Pav) Herb. “amancay” es una planta bulbosa que se desarrolla en la costa central de Perú y es un componente característico del ecosistema de Lomas. Su desarrollo es dependiente de la humedad ambiental que se presenta en los meses de invierno. Es una especie cuya inflorescencia emerge con el inicio del periodo de Lomas seguido del desarrollo foliar, floración, fructificación, producción de semillas y germinación hasta el desarrollo del bulbillo que ocurre al final del periodo de humedad.

La flor de I. amancaes, es apreciada por su color, buen tamaño, forma y fragancia. Su único medio de propagación natural es por semilla, produciendo hasta 13 semillas por flor y 7 flores por planta (dependiendo del tamaño del bulbo) (Agüero & Suni 1999). Cambios climáticos como los ocasionados por el evento El Niño afectan negativamente los procesos de floración y fructificación, disminuyendo su tasa de propagación. Se estima Rev. peru. biol. 18(3): 293 - 297 (December 2011)

que sólo el 30% de las plantas florecen bajo estas condiciones (Agüero & Suni 1999). También la actividad extractiva del poblador de las zonas aledañas a las Lomas o los visitantes que las recolectan, así como el pastoreo y la expansión de las zonas urbanas y agrícolas, han ocasionado en los últimos años la disminución de su área de distribución y número de individuos en su medio ambiente natural, lo cual ha llevado a considerarla como una especie vulnerable (León et al. 2006).

Pese a su importancia y situación de amenaza son escasos los estudios realizados en esta especie. Es por ello que en el presente trabajo examinamos el desarrollo reproductivo de I. amancaes “amancay” en las Lomas del Santuario de Amancay, Pachacámac (Lima) y evaluamos cómo la temperatura y disponibilidad de agua en el suelo afectan su ciclo de vida. El conocimiento de las condiciones de temperatura y humedad de almacenamiento de los bulbos permitiran el uso y manejo I. amancaes como planta ornamental.

293

Suni et al.

observando la presencia o ausencia de las estructuras reproductivas así como observaciones sobre la formación de hojas y flores.

Para la medición de la humedad edáfica, mensualmente se colectó una muestra de suelo de cada una de las tres parcelas a los 20 cm de profundidad, las que se introdujeron inmediatamente a tubos plásticos herméticos y rotulados para su transporte al laboratorio donde fueron pesadas y secadas a 110 ºC hasta peso constante. El porcentaje de humedad (porcentaje de humedad equivalente) fue determinado por diferencia entre el peso húmedo y peso seco dividido entre el peso seco de la muestra del suelo, multiplicado por 100.

Resultados Caracterización del desarrollo de las estructuras reproductivas

En cada fecha se retiraron de cada parcela 2 bulbos marcados, material que fue transportado al laboratorio para su posterior análisis. Se registró el peso y características internas del bulbo

7 6

4

5 4

3

3

2

2

1

1

porcentaje de humedad

5

0 Jan

Nov

Sep

Jul

0 May

Material y métodos De enero del 2004 a enero del 2005 se realizaron muestreos mensuales de bulbos y suelo por un total de 13 muestreos.

8

yema Humedad

Mar

Área de estudio A fines de octubre del 2003, en la etapa de senescencia foliar de Ismene amancaes, se delimitaron tres parcelas de estudio de 4x5 m2 dentro del Santuario de Amancay, Pachacámac, Lima.

Se marcó con estacas la ubicación de 20 bulbos por parcela que presentaban de 5 a 9 hojas (el número de hojas tiene relación con el desarrollo del bulbo y su madurez reproductiva, Suni, M., pers. obs.). Este marcado permitió ubicar los bulbos y realizar los muestreos en el periodo sin desarrollo de la parte aérea (9 meses) (Fig. 1).

6

yema

Figura 1. Área de estudio. Vista de una de las parcelas de estudio (30 de enero del 2004). Nótese la ausencia aparente de amancaes y en detalle las características del bulbo extraído y del suelo donde fue ubicado.

En enero de 2004 se observó en el interior hacia la base del bulbo la presencia de 1 a 2 yemas florales muy pequeñas (3mm). Este número de yemas en la pequeña inflorescencia se incrementa en el mes de febrero, después de lo cual se mantiene constante (4 yemas en promedio para el material evaluado) hasta el periodo de Lomas en que emergen y se inicia la floración. La pequeña inflorescencia va incrementando su longitud gradualmente (Figs. 2, 3) hasta marzo para posteriormente elongarse

Figura 2. Variación del número de yemas florales en el curso del año y su correlación negativa significativa con el contenido de humedad del suelo.

Figura 3. Vistas del desarrollo de la pequeña inflorescencia con algunas yemas florales, en el interior de bulbos colectados en diciembre del 2004 (izquierda) y enero del 2005 (derecha).

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Desarrollo reproductivo del “amancay” Ismene amancaes 600 Altura de bulbo (mm) 500

Long inf (mm)

400 300 200 100 0 ene

feb

mar

abr

may

jun

jul

ago

sep

nov

dic

ene

Figura 4. Variación de la longitud de la pequeña inflorescencia en el interior del bulbo de Ismene amancaes en relación a la altura del bulbo.

Nótese que para mayo, cuando la tasa de crecimiento se incrementa, alcanza la altura del cuello del bulbo, para continuar en los meses de julio y agosto con un crecimiento exponencial. Vista corresponde a la inflorescencia presente en el interior del bulbo en mayo del 2004.

Figura 5. Características del desarrollo de los órganos foliares y florales en el interior del bulbo de Ismene amancaes en junio del 2004, en la parte central sobre el disco basal se observa la inflorescencia y la yema foliar. Nótese la apariencia del bulbo antes de su disección (foto de la izquierda). Asimismo se muestra las pequeñas hojas desplegadas a ambos lados según su posición en el bulbo.

Figura 6. Comparación del tamaño del escapo en corte transversal a nivel medio del bulbo en julio (izquierda) y septiembre (derecha) del 2004. Nótese la reducción de sus dimensiones (véase las líneas).

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Suni et al.

Figura 7. Características del interior del bulbo (foto izquierda), observado en noviembre 2004, nótese la presencia de una hojita (vaina y lámina). Se señala con el puntero el meristemo apical de la yema foliar (visto al microscopio estereoscópico 80X), no fue evidente la presencia de estructuras reproductivas.

2

4 3

200

1 0

0

2 1 0 Mar

Jan

Nov

Sep

Jul

May

Mar

0

5

300

100

porcentaje de humedad

3

50

400

Jan

4

6

Nov

5

7

500

Sep

6

100

8

areaFol Humedad

Jul

7

600

May

8

totalPf Humedad

área floliar (cm2)

total peso fresco

150

Figura 8. Relación directa entre el contenido de humedad del suelo y el peso fresco de la planta (izquierda) y con el área foliar (derecha) de Ismene amancaes.

1 0 Jan

Nov

Sep

Jul

May

0

2

10

porcentaje de humedad

3

1 0

0 Jan

2

10

4 20

Nov

3

5

30

Sep

4 20

6

Jul

5

30

7

40

May

6

8

totRelpspf Humedad

Mar

7

40

Mar

50

8

bultotRelpspf Humedad

Porcentaje ps bulbo/pf total

Porcentaje ps/pf total

50

Figura 9. Relación inversa entre el contenido de humedad del suelo con el porcentaje de materia seca (ps) del bulbo y de la planta en relación a la biomasa total (pf) de Ismene amancaes.

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Desarrollo reproductivo del “amancay” Ismene amancaes

muy rápidamente alcanzando en el mes de mayo la altura del cuello del bulbo (Fig. 4) y en junio su emergencia (Fig. 5). El cuello del bulbo se constituye externamente por las vainas de las últimas hojas que emergieron el periodo anterior de Lomas y que formaban parte de la yema foliar que estuvo presente contigua a la inflorescencia en el periodo de mayo-junio. Seguido hacia el interior por las hojas (vainas y láminas) que se formaron luego, cuyas vainas tienen un arreglo concéntrico. Y más hacia el interior se presenta la hoja (sin vaina) adyacente a la inflorescencia, la inflorescencia y nueva yema foliar apical. La diferenciación de las yemas florales se inicia luego que se han formado las hojas que saldrán el siguiente año y en un periodo de máximo descenso de la humedad edáfica (noviembre). Llegan a constituir una pequeña inflorescencia que resulta ser la única ramificación que formará la yema apical que luego continuará formando hojitas. La yema foliar continuará su crecimiento pero en menor grado que la inflorescencia, la misma que en el periodo de Lomas emergerá primero. En julio sólo las primeras dos hojas de la yema foliar emergen y se pudo notar el gran grosor del escapo floral (Fig. 6) en este mes y que va disminuyendo hacia el periodo de fructificación para finalmente formar parte de los catafilos del bulbo.

Luego de la senescencia foliar (septiembre a noviembre), en el interior del bulbo sólo se observó la presencia de pequeñas hojas y hacia la parte central del disco basal, una yema foliar apical (Fig. 7). En diciembre se hace evidente la presencia de las pequeñas yemas florales rodeadas de pequeñas brácteas. Se observa también la yema foliar.

Evaluación de las características del bulbo El contenido de humedad de la planta y del bulbo en peso fresco (pf ) y peso seco (ps) y el área foliar tienen una relación directa con el contenido de humedad del suelo (Fig. 8), por lo que se puede señalar que el contenido de humedad del suelo influye positivamente en el desarrollo del área foliar y el contenido de humedad de toda la planta. Mientras que tiene una relación inversa con el porcentaje de materia seca del bulbo y de la planta (Fig. 9) lo cual refleja una alta absorción de agua que coincide con el máximo desarrollo de sus hojas (en agosto). Se observó asimismo que el grosor de los catafilos (que originalmente fueron las vainas de las hojas) variaba de 0,5 a 1,9 mm. Siendo el grosor de los catáfilos externos menor que los internos.

Contenido de humedad del suelo A 20 cm de profundidad, nivel aproximado de ubicación del bulbo, los valores más bajos de contenido de humedad del suelo se presentaron de febrero a abril del 2004. En los meses siguientes se observó un incremento de la humedad hasta que en los meses de agosto y septiembre de obtuvieron los mayores valores para declinar precipitadamente en noviembre, periodo en que se considera se inicia la diferenciación de las yemas florales.

Paralelamente se realizó a partir del mes de junio la evaluación del contenido de humedad del suelo a 5 cm de profundidad. A este nivel, el contenido de humedad del suelo está más sujeto a los cambios medio ambientales, este llega a tener en los meses húmedos mayores valores y en verano valores menores que a 20 cm de profundidad.

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Discusión Ismene amancaes presenta actividad a lo largo de todo el año.

Al inicio del periodo no Lomas, cuando declina precipitadamente el contenido de humedad en el suelo (Agüero 2002) y se incrementa la temperatura (noviembre), ocurre el inicio de la diferenciación de las yemas florales. El desarrollo de la pequeña inflorescencia dentro del bulbo, continua en los meses de verano, como se ha observado en algunos bulbos (Noy-Porat et al.

2009). Se encontró una relación inversa entre el contenido de humedad del suelo y la presencia de yemas florales. Esta es una etapa que depende de los recursos almacenados en el mismo bulbo (Boeken 1989). En años con incremento de temperatura en verano (evento El Niño) no se espera que se afecte el inicio de la diferenciación de las yemas florales, más bien por el retraso del periodo de humedad se prolonga este periodo de desarrollo dentro del bulbo, consumiendo reservas nutricias y disminuyendo la posibilidad de éxito reproductivo (Agüero & Suni 1999). El desarrollo foliar en el periodo de Lomas presentó una relación directa con el contenido de humedad edáfica. Agüero y Suni (1999) reportaron un resultado semejante para plantas juveniles.

El periodo de diferenciación y desarrollo de las estructuras reproductivas hasta la floración abarca ocho meses (noviembre a julio); mientras que la acumulación de fotoasimilados, los cuales son traslocados a la vaina de las hojas retornando e incrementando biomasa al bulbo, solamente dos meses (agosto, setiembre). Sin embargo este periodo es determinante para el éxito reproductivo del siguiente periodo.

Agradecimientos Los autores expresan su profundo agradecimiento especialmente a PRODENA-AREQUIPA, CEMENTOS LIMA por el apoyo recibido, al Ingeniero M.Sc. Felipe Mendiburu por los análisis estadísticos de los datos con el programa estadístico R. Literatura citada Agüero S. & M. Suni. 1999. Influencia del evento “El Niño 19971998” en el desarrollo de Ismene amancaes (Amaryllidaceae, Liliopsidae). En: El Niño 1997-98 y su Impacto sobre los Ecosistemas Marino y Terrestre. J. Tarazona y E. Castillo. (Eds.) Rev. peru. biol. Vol Extraordinario: 118-124.

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Rev. peru. biol. 18(3): 299 - 302 (Diciembre 2011) © Facultad de Ciencias Biológicas UNMSM

Nueva especie de Mediorhynchus (Acanthocephala, Gigantorhynchidae) ISSN 1561-0837

Nueva especie de Mediorhynchus (Acanthocephala, Gigantorhynchidae) en Turdus chiguanco (Turdidae) de Junín, Perú New species of Mediorhynchus (Acanthocephala, Gigantorhynchidae) in Turdus chiguanco (Turdidae) from Junín, Peru Rocío Moya1, Rosa Martínez1, Manuel Tantaleán2 1 Laboratorio de Parasitología de Fauna Silvestre y Zoonosis, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Apartado 110058, Lima 11, Perú.

2 Laboratorio de Parasitología, Facultad de Veterinaria y Zootecnia, Universidad Peruana Cayetano Heredia. Lima, Perú.

E-mail Rocío Moya: rocio.moya@gmail.com E-mail Rosa Martínez: rmartinezr@unmsm.edu.pe E-mail Manuel Tantaleán: mtantaleanv@hotmail.com Presentado: 01/07/2011 Aceptado: 13/10/2011 Publicado online: 08/02/2012

Resumen Se describe una nueva especie de Mediorhynchus (Acanthocephala, Gigantorhynchidae) basada en 36 especímenes colectados de 4 individuos de Turdus chiguanco (Lafresnaye & D’Orbigny, 1837). Las aves fueron capturadas en el distrito de Muqui, provincia de Jauja, Junín, Perú. La nueva especie, Mediorhynchus peruensis se caracteriza por la armadura de la probóscide y la longitud de los lemniscos que se extienden hasta la parte media o posterior del testículo anterior en el macho y hasta la parte media anterior del cuerpo en la hembra.

Palabras clave: Mediorhynchus, Acanthocephala, Turdus, Turdidae, Perú.

Abstract A new species of Mediorhynchus (Acanthocephala, Gigantorhynchidae) is described based on 36 specimens collected from 4 individuals of Turdus chiguanco (Lafresnaye & D’Orbigny, 1837). The birds were captured in the district of Muqui, Jauja Province, Junín, Peru. The new species, Mediorhynchus peruensis is characterized by the armature of the proboscis and lemnisci length extending to the middle or back of the anterior testis in the male and to the middle front of the body in the female.

Keywords: Mediorhynchus, Acanthocephala, Turdus, Turdidae, Peru.

Introducción Turdus chiguanco (Lafresnaye & D´Orbigny, 1837) es un ave no migratoria residente en el Perú que se encuentra ampliamente distribuida en Sudamérica donde se le puede encontrar en zonas semiáridas, entre los 2000 y 4300 m de altura, pero también en la orilla de los ríos; se distribuye a lo largo de los Andes desde Ecuador hasta la sierra del Perú, norte de Chile, Bolivia y Argentina (Blancas 1959, Fjeldsa & Krabbe 1990).

Poco se conoce de los parásitos de T. chiguanco en el Perú.

Salinas et al. (1999) mencionan la presencia de céstodos, nemátodos y acantocéfalos sin indicar género o especie en T. chiguanco procedentes de Lima; Tantaleán y Chávez (2004) aislaron de los ojos de T. chiguanco del Cusco dos nemátodos del género Aprocta sp.

En el presente trabajo se describe a Mediorhynchus peruensis n. sp. obtenido del intestino de Turdus chiguanco capturados en el distrito de Muqui, provincia de Jauja (Junín).

Material y métodos En enero del 2007, se capturaron cuatro especímenes de T. chiguanco utilizando redes de niebla colocadas en corrales de las aves domésticas y jardines de las viviendas del distrito de Muqui (3322 m de altitud, margen derecha del valle del Mantaro), provincia de Jauja, departamento de Junín. En total fueron colectados 36 acantocéfalos del intestino delgado de las aves. Los acantocéfalos fueron lavados en solución salina, se prensaron entre 2 láminas portaobjetos y fijaron en alcohol etílico de 70º. Para el estudio morfológico y anatómico se colorearon con carmín clorhídrico alcohólico, de acuerdo a la metodología convencional.

Para observar la distribución de los ganchos, previamente se seccionaron las probóscides de 5 machos y 5 hembras y se transparentaron en una mezcla de alcohol-fenol, en algunas se hicieron cortes transversales. Las medidas corporales se expresan en milímetros y la de los ganchos en micras (promedio y rango en Rev. peru. biol. 18(3): 299 - 302 (December 2011)

paréntesis). Los dibujos se prepararon con ayuda de una cámara lúcida Carl Zeiss. Los especímenes tipo fueron depositados en la Colección Helmintológica del Laboratorio de Fauna Silvestre y Zoonosis de la Facultad de Ciencias Biológicas UNMSM. Resultados Mediorhynchus peruensis nov. sp.

(Figuras 1 – 4) Descripción: basada en 7 machos y 7 hembras.

De color blanco cremoso recién obtenidos del intestino, probóscide cónica, truncada y de pared gruesa y dividida en 2 partes, la anterior con ganchos y la posterior con espinas; con marcado dimorfismo sexual pues la hembra, de mayor tamaño que el macho, tiene diferente número de ganchos en la probóscide; lemniscos largos y delgados.

Macho.- Mide 11,15 (8,72 – 14,0) de largo por 1,49 (1,25–1,78) de ancho. El tamaño total de la probóscide es de 0,57 (0,53 – 0,64), la longitud de la probóscide anterior es de 0,34 (0,30 – 0,43) por 0,40 (0,36 – 0,45) de ancho y de la posterior es de 0,23 (0,20 – 0,27) por 0,54 (0,41 – 0,73) de ancho. La probóscide anterior se encuentra armada de 77 (62 – 84) ganchos distribuidos en 13 – 14 filas cada una con 4-6 elementos, la probóscide posterior tiene 116 (104 – 120) espinas. Los lemniscos miden 4,61 (3,1 – 6,31) de longitud por 0,79 (0,7 – 1,0) de ancho, extendiéndose hasta la parte media y/o posterior del testículo anterior. Los testículos se ubican ligeramente en la mitad posterior del cuerpo uno detrás del otro, sin unirse entre ellos ni con las glándulas de cemento, son ovalados, ligeramente angulosos y de bordes irregulares, miden 1,43 (1,07 – 1,80) de diámetro mayor con 0,47 (0,4 – 0,75) el menor. Con 8 glándulas de cemento, separadas en 2 grupos de cuatro. Poro genital terminal.

299

Moya et al.

2

3 1 4 Figuras. (1) Mediorhynchus peruensis nov. sp. Ejemplar adulto. (2) Proboscide armada de ganchos y espinas. (3) Parte posterior de un macho. (4) Huevos.

Hembra.- Generalmente de mayor tamaño que el macho, mide 17,04 (14,0 – 21,0) de largo por 1,77 (1,52 – 2,10) de ancho. La longitud total de la probóscide es de 0,69 (0,57 – 0,78); la longitud de la probóscide anterior es de 0,40 (0,35 – 0,45) por 0,50 (0,43 – 0,55) de ancho y el largo de la probóscide posterior es de 0,24 (0,22 – 0,35) por 0,71 (0,57 – 0,80) de ancho. La parte anterior de la probóscide se encuentra armada con 94 (74 – 96) ganchos, distribuidos en 15-16 filas conteniendo cada una 5 – 6 ganchos; la parte posterior de la probóscide lleva 128

300

(110 – 134) espinas. Los lemniscos miden 6,80 (5,52 – 8,21) de largo por 0,84 (0,65 – 1,0). En la parte posterior del cuerpo se observa la campana uterina muscular seguida por células del aparato selector, con esfínter y el poro genital terminal (Fig. 3).

El huevo es ovalado y mide 0,056 (0,052 – 0,060) de diámetro mayor por 0,031 (0,027 – 0,035) de diámetro menor (Fig. 4).

Localización: Intestino delgado.

Holotipo macho: Col. PAS-FCB N° 257 Rev. peru. biol. 18(3): 299 - 302 (Diciembre 2011)

Nueva especie de Mediorhynchus (Acanthocephala, Gigantorhynchidae) Tabla 1. Comparación morfométrica de las hembras de diferentes especies de Mediorhynchus

M. peruensis n.sp

M. pintoi

M. oswaldocruzi Turdidae

** M. pauciuncinatus

Icteridae

Perú

M. pintoi

Hospedero

Brasil M. oswaldocruzi

M. emberizae

Brasil y Puerto Rico

Tinamidae

Cardinalidae

Turdidae

11,5

14,0 — 21,0

Estructuras (mm) Cuerpo

largo

20 — 55

35

35

70

20

ancho

1 — 1,5

0,87

0,77

1,5

1,5

0,5

1,52 — 2,1

4—5

6,5

6,5

4,4

4,4

———

5,52 — 8,21

Lemnisco Probóscide total

largo

———

0,43

0,43

0,34

0,34

———

0,57 — 0,78

—————

0,26

0,26

0,34

0,34

———

0,57 — 0,80

0,4

———

———

———

———

———

0,61 — 0,85

mayor

0,06 – 0,068

0,048

0,076

0,076

———

0,052 — 0,06

menor

0, 04 — 0,05

0,021

0,044

0,044

———

0,027 — 0,035

ancho*

Receptáculo Probóscide Huevo (diametro)

Número de ganchos

132

120

120

72

72

56

74 — 96

Números de espinas

—————

———

———

———

———

———

110 — 134

53

78

37

122

78

25; 19,5 y 11

109 — 135

Tamaño de los ganchos (µm) ** Único individuo hembra inmaduro * Probóscide posterior

Alotipo hembra: Col. PAS-FCB N° 258 Paratipos: Col. PAS-FCB N° 259 a-d Discusión El género Mediorhynchus Van Cleave, 1916 (Gigantorhynchidae) agrupa a especies que son parásitas de aves de diferentes regiones del mundo; según Schmidt & Kuntz (1977) y Petrotchenko (1958) se caracteriza por tener la probóscide truncada, armada de ganchos y espinas, lemniscos largos y delgados, testículos en la mitad posterior del cuerpo, ocho glándulas de cemento y huevos ovalados.

En cuanto al tamaño de la probóscide (Fig. 2), Mediorhynchus peruensis n. sp. tiene mayor longitud (0,57 — 0,78) que la de M. pintoi (0,34) y la de M. oswaldocruzi (0,43); además, presenta 74 — 96 ganchos diferenciándose de M. emberizae y de M. oswaldocruzi que tienen 132 y 120 respectivamente. La nueva especie también difiere de M. pauciuncinatus en el número (74 — 96) y tamaño (109 — 135) de los ganchos frente a los 56 que miden 25; 19,5 y 11. También encontramos diferencias en los huevos que son de menor tamaño (0,052 — 0,06) que los de M. pintoi (0,076) pero de mayores dimensiones que los de M. oswaldocruzi (0,048).

En la actualidad se conocen alrededor de 41 especies de Mediorhynchus a nivel mundial (Golvan 1994, Smales 2002).

Travassos (1924) ha revisado las especies brasileras, M. oswaldocruzi Travassos, 1923 parásita de Turdus sp., M. pintoi Travassos, 1923 del intestino de Nothura sp. y M. emberizae (Rudolphi 1819) de varias especies de aves; esta última también ha sido registrada en Puerto Rico (Golvan 1994). La única especie de Mediorhynchus conocida para el Perú es M. pauciucinatus descrita por Dollfus (1959) del intestino de Saltator albicollis peruvianus de Cajamarca.

Por lo antes mencionado consideramos a nuestro espécimen como una especie nueva.

La nueva especie que aquí se describe fue comparada con las que más se asemejan morfológicamente y que son M. pintoi, M. emberizae y M. oswaldocruzi (ver Tabla 1).

Blancas F. 1959. Comunidades y Campos de vida de Acolla y sus alrededores, (Prov. Jauja, Dpto. Junín) con estudio especial de vertebrados. Mem. Mus. Hist. Nat. Javier Prado N° 7, 160 pp.

Dollfus R. 1959. Cestodes et Acanthocéphale D’oiseaux Récoltés Au Pérou Par le Docteur Jean Dorst. Bull. Soc. Zool.

France, 5-6: 384-395.

Fjeldsa J. & Krabbe N. 1990. Birds of the high Andes. Published

by Zoological Museum, University of Copenhagen and Apollo Books, Svendborg, Denmark., 558-559 p.

La hembra de Mediorhynchus peruensis n. sp. se diferencia de las especies anteriores del mismo sexo por el tamaño de los lemniscos pues son de mayor longitud (5,52 — 8,21) que los de M. pintoi (4,4) y M. emberizae (4,0 — 5,0); entre los machos no encontramos diferencias notables en el tamaño de los lemniscos.

Rev. peru. biol. 18(3): 299 - 302 (December 2011)

Agradecimientos Al Dr. José Luis Venero Gonzales de la Universidad San Antonio Abad del Cusco, por la identificación de las aves y por habernos proporcionado referencias bibliográficas, y al Ing. César Peña (Univ. Federico Villarreal) por permitirnos consultar en su biblioteca personal.

Literatura citada

301

Moya et al.

Golvan Y. 1994. Nomenclature of the Acanthocephala. Res. rev. parasitol. 54: 135-205.

Petrochenko V. 1958. Acanthocephala of domestic and wild animals.

Academy of Sciences of the USSR. All-Union Society of Helminthologists. Edit. Skrjabin. Vol.II, 478 pp.

Salinas L., Samamé M. & Franke I. (1999). Parasitismo de la avifauna del bosque de Zárate: Implicancias en su Conservación.

Biota, 99: 59-66.

Schmidt G. & Kuntz R. 1977. Revision of Mediorhynchus Van Cleave 1916 (Acanthocephala) with a key to species. J. Parasitol., 63:500-507.

302

Smales L. R. 2002. Species of Mediorhynchus (Acanthocephala: Gigantorhynchidae) in Australia birds with the description of Mediorhynchus colluricinclae n. sp. J. Parasitol., 88: 375-381.

Tantaleán M. & Chávez, J. 2004. Endoparásitos (Nemathelminthes y Platyhelminthes) de animales de vida silvestre de la Reserva de Biósfera del Manu, Perú. Rev. peru. biol. 11: 219-222.

Travassos L. 1924. Contribuções para o conhecimento da fauna helminthologica brasileira. XVII. Revisão dos acanthocephalos brazileiros. 1. Famil. Gigantorhynchidae Hamann, 1892 – Suplemento. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, 17: 365-387.

Rev. peru. biol. 18(3): 299 - 302 (Diciembre 2011)

Rev. peru. biol. 18(3): 303 - 309 (Diciembre 2011) © Facultad de Ciencias Biológicas UNMSM

Aspectos estructurales y cuantitativos del ovario deISSN Fulica armillata 1561-0837

Aspectos estructurales y cuantitativos del ovario de Fulica armillata (Aves: Rallidae) Structural and cuantitative aspects of the ovary of the Fulica armillata (Aves: Rallidae) Mirian Bulfon y Noemí Bee de Speroni Cátedra de Anatomía Comparada.

Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales. Universidad Nacional de Córdoba. Avda. Vélez Sársfield 299.Córdoba, CP. 5000.

República Argentina.

Email Mirian Bulfon: mbulfon@com.uncor.edu.

Resumen Se estudiaron los aspectos morfohistológicos y cuantitativos del ovario de Fulica armillata durante la fase de recrudescencia gonadal. Se utilizaron 5 hembras adultas. El análisis morfohistológico reveló la presencia de numerosos folículos en diferentes estadios de desarrollo y regresión. El epitelio simple de células granulosas caracterizó a los ovocitos primordiales y el pseudoestratificado a los folículos previtelogénicos, ambos tipos foliculares exhibieron un notorio cuerpo de Balbiani. En los folículos vitelogénicos blancos y amarillos (> de 1 mm) se evidenció una compleja pared folicular formada por la zona radiada, el epitelio folicular estratificado y las envolturas tecales bien delimitadas, mientras que, en los vitelogénicos amarillos (> de 3 mm) fue observado un epitelio simple con células cúbicas muy basófilas. Se identificaron dos tipos de atresia folicular: 1) pared folicular intacta o no bursting, la involución se realiza en el interior del folículo, comprende a la atresia lipoidal (Ovocitos primordiales) y lipoglandular (folículos previtelogénicos y vitelogénicos pequeños) y 2) atresia por ruptura de la pared o bursting con extrusión del contenido ovoplásmico (folículos vitelogénicos > 1 mm). El análisis cuantitativo reveló una diferencia significativa (p <0,05), entre los folículos en desarrollo (< de 2 mm) y los folículos mayores e idéntica diferencia entre lo folículos atrésicos pequeños (lipoidales y lipoglandulares) y los folículos bursting. Los procesos de crecimiento y diferenciación (foliculogénesis y vitelogénesis) y el de atresia folicular se desarrollan normalmente durante la fase de recrudescencia gonadal, contribuyendo a la homeostasis del ovario de esta ave.

Palabras clave: Ovario; estructura; morfometría; foliculogénesis; vitelogénesis; atresia folicular.

Abstract Presentado: 22/07/2011 Aceptado: 13/12/2011 Publicado online: 08/02/2012

Morfohistologic and quantitative aspects were studied of the ovary of the Fulica armillata during gonadal recrudescence phase. Were used 5 adult females. Morfohistologic analysis revealed the presence of numerous follicles at different stages of development and regression. The simple epithelium of granulosa cells characterized the primary oocytes and the pseudostratified granulosa cells the previtellogenic follicle, both types showed a marked Balbiani body. In the white and yellow vitellogenic follicles > 1 mm evidenced a complex follicular wall formed by the radiated area, stratified follicular epithelium and well-defined thecal enveloped, while the vitellogenic yellow > 3 mm, was observed a simple epithelium with basophilic cuboidal cells. We identified two types of follicular atresia:1)intact follicle wall or non-bursting, the involution takes place inside the follicle,comprising the lipoidal atresia (primary oocytes) and lipoglandular (previtellogenic and vitellogenic follicles small), 2) atresia by wall rupture or bursting (vitellogenic follicles> 1 mm), extrusion of the yolk. Quantitative analysis revealed a statistically significant difference (p <0,05) among the developing follicles <2 mm and larger follicles and the same difference between the small atretic follicles (lipoidal and lipoglandulares) and bursting follicles. The processes of growth and differentiation (folliculogenesis and vitellogenesis) and follicular atresia develop normally during the gonadal recrudescence, contributing to the homeostasis of the ovary of this bird.

Keywords: Ovary; structure; morphometry; folliculogenesis; Vitellogenesis; follicular atresia.

Introducción Los factores desencadenantes de la reproducción en las aves silvestres son varios, algunos internos, los cuales están regidos por la hipófisis, y otros externos, relacionados con el medio ambiente; entre otros, el fotoperíodo, las precipitaciones, la temperatura y la cantidad de alimento disponible. La interacción de estos factores confiere la regularidad característica de cada especie y determina que la época de reproducción coincida con el óptimo ecológico para cada especie (Dorst 1976).

El ovario de las aves es una estructura muy compleja, profusamente irrigada y constituida por una zona cortical y una interna o médula. En la periferia se localizan numerosos tipos foliculares en distintos estadios de maduración, entre los cuales, los folículos en desarrollo son los más abundantes durante todo el ciclo reproductivo. Están formados por el ovocito y la pared folicular, estructuras ovocitarias que exhiben las notorias modificaciones producidas durante la maduración de los mismos. Los Rev. peru. biol. 18(3): 303 - 309 (December 2011)

procesos de foliculogénesis y vitelogénesis han sido estudiados en el ovario de diferentes especies silvestres (Chalana & Guraya 1979, Guraya 1989a, Madekuroswa & Kimaro 2006).

Bulfon y Bee de Speroni (2003, 2009) y Bulfon (2008) analizaron las variaciones estructurales y cuantitativas durante el período reproductivo anual de aves estacionales como Spheniscus magellanicus, Myiopsitta monachus, e Himantopus melanurus.

Además se estudiaron similares aspectos en aves con ciclos de postura prolongada que caracterizan a algunos colúmbidos como Columba maculosa maculosa (Maron 2007), Zenaida auriculata (Bulfon 2008) y Columbina picui (Altamirano et al. 2009).

En el ovario de aves domésticas y silvestres, se encuentra otro tipo de folículos los cuales están afectados por un mecanismo degenerativo muy complejo denominado atresia folicular. Esta última es un proceso normal que remueve del ovario a numerosos folículos en cualquier etapa de su desarrollo. Su naturaleza y evolución ha sido estudiado por numerosos autores (Gilbert et

303

Bulfon & Bee de Speroni

al. 1981, 1983, Halse 1985, Gupta y Maití 1986, Forgó et al.

1988, Guraya 1989b, Bulfon & Bee de Speroni 2001, 2003, Bulfon 2008, Maderuskowa 2006, Claver et al. 2008, Bulfon & Bee de Speroni 2009).

En consideración que, la información morfológica básica del ovario proporciona datos valiosos al estudio de la biología reproductiva en especies silvestres, la gallareta de ligas rojas Fulica armillata constituye un interesante grupo entre las aves acuáticas. Esta especie forma parte del paisaje de las lagunas o ríos con vegetación densa. Vive en grupos y su nombre proviene de las franjas o ligas rojas en la tibia, sobre patas de coloración amarillentas. Nidifica desde mayo a noviembre y ovipone de 4 a 7 huevos de color crema oliváceo con pintas pardo oscuras (Nores & Izurieta 1980).

En este trabajo se realiza un análisis estructural y cuantitativo, a fin de aportar conocimientos básicos acerca de los procesos de crecimiento, diferenciación y regresión folicular que se desarrollan en el ovario recrudescente de esta ave.

Materiales y metodos Ejemplares.- Cinco hembras adultas de Fulica armillata (Viellot) se capturaron en el Arroyo Chucul (33º07’52”S, 63º35’05”W), Córdoba, República Argentina, entre agosto y noviembre de los años 2009 y 2010. En el laboratorio, las aves se anestesiaron y perfundieron intracardíacamente con formalina Neutra (pH 7, 4%) luego se disecaron y removieron las gónadas.

La ausencia de la Bursa de Fabricius, indicó del estado adulto de las mismas (Wight 1959).

Histología.- Las muestras de ovario se postfijaron en formol tamponado pH 7,0 y procesaron de acuerdo a la técnica de inclusión en parafina. Los cortes seriados de 6 µm de espesor se colorearon con hematoxilina – eosina y tricrómico de Mallory (Romeis 1928). Los folículos atrésicos se distinguieron de los folículos normales y postovulatorios de acuerdo a Bulfon y Bee de Speroni (2003).

Figura 1. Norma ventral del ovario en fase de recrudescencia. Se destacan los folículos ováricos en diferentes estadios de desarrollo y diferenciación. Barra: 1 cm.

304

Histomorfometría.- De cada gónada se extrajeron 10 secciones histológicas mediales y se midieron y contaron todos los folículos ováricos en desarrollo (FD) y atrésicos (FA), para lo cual se empleó el software ImageJ 1.4 (http://rsbweb.nih.gov/ ij/index.html). En las lecturas se consideró un intervalo de 80 secciones histológicas Las imágenes fueron captadas a través de una Cámara Nikon Digital Sight DS -Fi1 acoplada a un microscopio Nikon Eclipse 50i.

Análisis estadístico.- Se estimaron los porcentajes de los folículos en desarrollo y folículos atrésicos en base al promedio de lecturas realizadas en cada ovario durante la recrudescencia gonadal. Los datos se analizaron y compararon estadísticamente a través del análisis de la varianza (ANAVA). Para estudiar las diferencias entre grupos se utilizó el test de Tukey. Un valor de p <0,05, fue considerado significativo (Programa Infostat 2011).

Resultados Aspectos morfológicos El aparato genital femenino de F. armillata es asimétrico y lo constituye el ovario izquierdo que representa la gónada funcional y el oviducto del mismo lado con forma de largo tubo.

Durante la recrudescencia gonadal el ovario adquiere un aspecto arracimado por la presencia de cuatro o cinco folículos de color amarillo, folículos postovulatorios y folículos atrésicos (Fig. 1).

Características histológicas del ovario El análisis del ovario durante la fase de recrudescencia permite reconocer en la zona cortical de la gónada, a los Ovocitos primordiales, folículos en desarrollo, que comprenden a los folículos previtelogénicos, vitelogénicos,preovulatorios y postovulatorios y a los folículos atrésicos (Fig. 2).

Los ovocitos primordiales dispuestos en forma de cordones (60 a 100 µm de diámetro), están constituidos por el ovocito o célula germinal y rodeados por una capa simple y aplanada de células foliculares. Las envolturas tecales aún están ausentes.

Figura 2. Vista general del ovario. En la corteza se observan cordones de O.P, F.P.V y F.V.B y en el estroma medular numerosos vasos sanguíneos (V.S).Tinción: Hematoxilina Eosina. Barra: 250 µm.

Rev. peru. biol. 18(3): 303 - 309 (Diciembre 2011)

Aspectos estructurales y cuantitativos del ovario de Fulica armillata

Figura 3. Ovocito Primordial. Las células foliculares (C.F) se disponen en una capa simple y en el ovoplasma (O) se localiza el cuerpo vitelino de Balbiani (c.B); N: núcleo. Tinción Hematoxilina-Eosina.

Barra: 25 µm.

Figura 4. Pared folicular de un FVB < 2 mm. Epitelio folicular estratificado; (C.F) células foliculares; teca interna (T.I); teca externa (T.E); (O) ovoplasma. Tinción Hematoxilina-Eosina. Barra: 16 µm.

El núcleo ovocitario presenta un prominente (nucleolo y los cromosomas en configuración diplotene o lampbrush.(Fig. 3).

afecta desde los ovocitos primordiales hasta los folículos previtelogénicos y las características más notorias corresponden a la desintegración del epitelio folicular, la destrucción del núcleo o cariolisis y la fragmentación citoplasmática. Los cambios estructurales exhibidos permiten identificar dos tipos involutivos:

Folículos en desarrollo.- Entre los folículos en desarrollo, los folículos previtelogénicos (100 a 1000 µm de diámetro) presentan células foliculares o granulosas que forman un epitelio columnar alto, pseudoestratificado e incipientes envolturas tecales. En estos folículos se destaca el cuerpo de Balbiani y las granulaciones citoplasmáticas dispuestas en la zona cortical del ovoplasma.

Los folículos vitelogénicos blancos (1000 y 2000 µm de diámetro), exhiben una capa pluriestratificada de células foliculares y envolturas tecales bien diferenciadas. Se visualiza la zona radiada y en el interior del ovoplasma notorias estriaciones y gránulos de aspecto lipídico de variadas formas y tamaños (Fig. 4).

A medida que se incrementa el diámetro de los folículos vitelogénicos amarillos (> de 2 mm), las células foliculares se comprimen y constituyen una capa de células cuboidales con núcleos muy basófilos, mientras que las tecas se observan engrosadas y fibrosas. En el ovoplasma se incorporan gran cantidad de gránulos de vitelo pigmentados proveyéndole la coloración amarilla característica. Se destacan 4 ó 5 folículos (> de 5 mm) de los cuales los más grandes (entre 13 y 17 mm de diámetro).

1) Atresia no bursting: las paredes foliculares se mantienen intactas y el contenido ovoplásmico se absorbe in situ por las células foliculares, comprende: 1a) Atresia lipoidal: afecta a los ovocitos primordiales. Los ovocitos atrésicos se contraen, en el ovoplasma se observan gran cantidad de gotas lipídicas que comprimen al núcleo y las células granulosas comienzan a desprenderse de la membrana basal. Por la apariencia de “burbuja” que ofrece el ovocito en esta etapa de regresión recibe el nombre de atresia lipoidal.(Fig. 6).

Se convierten en folículos preovulatorios. Estos últimos se destacan por el tamaño la presencia del estigma o zona de ruptura durante la ovulación. A posteriori de la misma, las paredes colapsan, visualizándose la abertura que queda en la superficie folicular. En el interior del recientemente formado folículo postovulatorio quedan restos de epitelio folicular y abundantes células de aspecto luteal. Las envolturas tecales están muy engrosadas y notablemente irrigadas. (Fig. 5).

Estroma medular.- En esta fase de desarrollo la zona interna del ovario está compuesta por tejido conectivo que exhibe espacios o lagunas y una notoria vascularización. (Fig. 2) Folículos atrésicos.- Durante la recrudescencia gonadal se observa, además, en la corteza ovárica de F. armillata a numerosos folículos atrésicos. El mecanismo involutivo o atresia folicular Rev. peru. biol. 18(3): 303 - 309 (December 2011)

Figura 5. Folículo postovulatorio (FPO) con aspecto de un saco aplanado. Se observan las envolturas tecales (E.T), muy engrosadas, escasas células luteales (C.L) y abundante irrigación en el interior del folículo. (V.S) vasos sanguíneos. Tinción Hematoxilina - Eosina.

Barra: 0,25 mm.

305

Bulfon & Bee de Speroni

Figura 6. Ovocito Primordial Atrésico (OPA). Gran cantidad de vacuolas (v) distribuídas en el ovoplasma (O) rodean al núcleo (N).

Las flechas indican el desprendimiento de las células foliculares de la membrana basal. Vaso sanguíneo (V.S). Tinción Hematoxilina Eosina. Barra: 25 µm.

Figura 7. Folículo previtelogénico atrésico. Se observa el desprendimiento de las celulas foliculares (C.F) de la membrana basal (flechas) y la vacuolización del ovoplasma. N (núcleo); cB (cuerpo vitelino de Balbiani; E.T (eenvolturas tecales). Tinción Hematoxilina - Eosina.

Barra: 60 µm.

1b) Atresia lipoglandular: Este proceso involutivo comprende a los folículos previtelogénicos y vitelogénicos blancos entre 1500 y 2000 μm. El folículo se observa deformado y de contorno irregular. En las envolturas foliculares se evidencia el incremento de la irrigación sanguínea como así también la desorganización citoplasmática del epitelio folicular. La hiperestratificación y la intensa vacuolización del ovoplasma le proveen al folículo una apariencia glandular, que caracteriza la denominación de esta regresión folicular (Figs. 7 y 8).

constituyen una fibrosa red azulada que paulatinamente se extiende por toda la superficie folicular. A medida que se incrementa la migración de las fibras conectivas el folículo lipoglandular disminuye de tamaño hasta convertirse en una pequeña cicatriz.

En un estadio más avanzado de involución, notorios cordones colagenizados revelados con Tricrómico de Mallory,

Figura 8. Atresia lipoglandular. En el folículo vitelogénico se visualiza una marcada hiperplasia de las células foliculares (C.F). Envolturas tecales (E.T) engrosadas y abundante irrigación, (V.S) vasos sanguíneos. Ovocito primordial (O.P). Hematoxilina - Eosina. Barra: 0,4 mm.

306

2) Atresia por ruptura o bursting: Este tipo de atresia afecta a los folículos vitelogénicos amarillos, algunos pequeños (2 mm) y a otros de mayores dimensiones. La característica de este proceso involutivo es la ruptura de las paredes foliculares y la posterior extrusión del contenido ovoplásmico al exterior del folículo.

Al inicio del proceso regresivo los folículos bursting o por ruptura se colapsan y contraen y el polimórfico e hipertrofiado

Figura 9. Atresia bursting. En el folículo vitelogénico amarillo, se destaca la zona de ruptura (flechas) por donde se libera el vitelo. V (vitelo); C.F (Células foliculares); E.T (envolturas tecales); Hematoxilina - Eosina. Barra: 0,4 mm.

Rev. peru. biol. 18(3): 303 - 309 (Diciembre 2011)

Aspectos estructurales y cuantitativos del ovario de Fulica armillata

55,00

a

Porcentajes

44,00

33,00 ab 22,00

ab b

11,00

0,00

Figura 10. Folículo atrésico bursting. Espacios lacunares (E.L) en las proximidades del folículo (F.A), conteniendo abundante vitelo (V).

Hematoxilina - Eosina. Barra: 0,45 mm.

epitelio folicular ocupa paulatinamente el área de la cavidad folicular de un modo similar al que ocurre con los folículos lipoglandulares. Posteriormente la pared folicular se escinde formando en la proximidad del tallo folicular una abertura simple y pequeña, a través de la cual el contenido del ovoplasma se libera al exterior del folículo. La masa ectópica, constituída por vitelo y células de diferente naturaleza cae sobre el estroma del ovario ocupando los espacios lacunares o en la cavidad peritoneal. Luego de la extrusión, se observan pequeñas hemorragias en el centro del folículo como consecuencia de la ruptura de la pared folicular. Las tecas se colagenizan formando un cordón trabeculado azulado, revelado con Tricrómico de Mallory, mientras que, el interior del folículo es ocupado por células muy vacuoladas, similares a las luteales. Finalmente fibras conectivas ocupan paulatinamente toda la superficie folicular, al igual que en los folículos lipoglandulares (Fig. 9 y 10).

Los porcentajes de atresia lipoidal durante esta fase es de (37,60% ± 15,90), la lipoglandular (49% ± 3,20) y la bursting (13,40% ± 1,80). Las variaciones estimadas entre los folículos atrésicos lipoidal y lipoglandular no revelan diferencias, mientras que, entre estos últimos y los atrésicos bursting o por ruptura, las variaciones estadísticas son significativas (Fig. 12).

Discusión El análisis morfohistológico del ovario de F. armillata realizado durante la fase de recrudescencia revela que, durante el Rev. peru. biol. 18(3): 303 - 309 (December 2011)

OP

FPV

FVB

FVA FVA //

Figura 11. Variaciones porcentuales de los folículos ováricos en desarrollo de F.armillata durante la recrudescencia gonadal. N = 20.

Las barras representan (x ± DS).Letras distintas indican diferencias significativas (p<=0,05).

desarrollo y diferenciación folicular, la gónada exhibe importantes variaciones en la forma y tamaño que la convierten en una estructura cambiante y polimórfica.

En esta fase del ciclo, la maduración de un elevado porcentaje de folículos ováricos se asocia estrechamente a la formación del epitelio folicular. La foliculogénesis se inicia en etapas tempranas de desarrollo desde los ovocitos primordiales y culmina con la formación del folículo preovulatorio. Este proceso evidenciado por modificaciones en la morfología y distribución de las células de la granulosa, el incremento en la irrigación de la pared folicular y los componentes ovocitarios entre otros, refleja los cambios a

55,00 a 44,00

Porcentajes

Análisis cuantitativo y estadístico Los ovocitos primordiales (48% ± 4,30), folículos previtelogénicos (23% ± 3,80) y vitelogénicos blancos (16% ± 3,30) son los más abundantes en la gónada recrudescente, los folículos vitelogénicos amarillos entre 2 y 4 mm (8,5% ± 2,60) y los mayores a 4mm (5,5% ± 1,90) presentan valores porcentuales menores que los folículos anteriores. Las variaciones estimadas entre folículos son estadísticamente significativas entre los primeros folículos y los amarillos (Fig. 11).

b

33,00

22,00

b

11,00

0,00

Lipoidal lipoglandular bursting Tipos de atresia

Figura 12. Variaciones porcentuales de los folículos atrésicos de F.armillata durante la recrudescencia gonadal. N = 20. Las barras representan (x ± DS). Letras distintas indican diferencias significativas (p<=0,05).

307

Bulfon & Bee de Speroni

estructurales inherentes a la diferenciación folicular. Asimismo, la proximidad de las células foliculares con la membrana plasmática del ovocito y la formación de la zona radiada, permite que las diversas macromoléculas y precursores del vitelo sean transportados a través de los vasos sanguíneos para constituir el vitelo. Este proceso denominado vitelogénesis es bien conocido en el ovario de Gallus domesticus y ha sido descrito por numerosos autores (Wallace 1985, Guraya 1989a, Etches 1990). La misma se desarrolla en varias etapas, la última deposición vitelogénica o fase de rápido crecimiento se realiza durante la recrudescencia gonadal incrementando notoriamente de tamaño a algunos folículos amarillos en pocos días. En F. armillata este grupo o cohorte comprende de 4 a 5 folículos los cuales exhiben una jerarquía morfológica de acuerdo al tamaño y de la cual surgirán los folículos dominantes para ovular a posteriori.

Las características morfohistológicas de la gónada femenina de esta ave, son similares a las analizadas en G. domesticus por (Gilbert et al. 1981, 1983, Etches 1990), en Anser anser (Forgó et al. 1988, Kovacks et al. 1992) y también en especies silvestres como Passer domesticus (Guraya & Chalana 1976), Columba livia (Guraya 1989a), Spheniscus magellanicus (Bulfon & Bee de Speroni 2003), Struthio camelus (Madekuroswa & Kimaro 2006), Columbina picui (Altamirano et al. 2009).

En F. armillata los ovocitos primordiales, los folículos previtelogénicos y vitelogénicos blancos son los más abundantes durante la fase analizada, el significado de estas ponderaciones se asocia a la formación de un importante reservorio folicular.

Asimismo el bajo porcentaje de folículos vitelogénicos amarillos indica que sólo lo más aptos son reclutados y seleccionados en cada ciclo reproductivo para la posterior maduración y ovipostura; en ovarios de aves silvestres estos eventos aún no están claramente dilucidados.

Contrariamente a los mecanismos de desarrollo y diferenciación, la atresia folicular produce en el ovario de F. armillata, la degeneración y ulterior eliminación de una gran cantidad de folículos ováricos en diferentes estadios de diferenciación y desarrollo.

Las características morfohistológicas de los folículos lipoidales y lipoglandulares y las secuencias en la involución de los mismos concuerdan con las descripciones realizadas en los folículos ováricos de aves silvestres como Passer domesticus (Guraya & Chalana 1976), Zonotrichia leucophrys gambelii (Kern 1972), Columba livia (Guraya 1989a), Struthio camelus (Madekuroswa & Kimaro 2006), Nothura maculosa (Claver et al. 2008), Vanellus chilensis e Himantopus melanurus (Bulfon & Bee de Speroni 2009).

El otro proceso regresivo visualizado en los folículos ováricos amarillos mayores de 2 mm de F. armillata corresponde a la formación de la ruptura de la pared folicular o bursting. Así, mediante un eficiente mecanismo estas aves remueven de los folículos vitelogénicos grandes una cantidad importante de vitelo. La involución se facilita porque esta masa ectópica es digerida posteriormente fuera del folículo, ya sea en los espacios lacunares ubicados en la proximidad de los folículos atrésicos como también en la cavidad peritoneal.

Nili y Kely (1996) han demostrado que, el sistema lacunar del ovario de G. domesticus provee a los folículos bursting de un espacio voluminoso para que el vitelo allí depositado sea luego metabolizado por las células fagocíticas.

308

La atresia folicular de F. armillata muestra similitudes morfológicas con las descriptas en el ovario de diferentes especies de aves silvestres por diferentes autores (Halse 1985, Gupta & Maití 1986, Gupta et al. 1988, Guraya 1989b, Bulfon & Bee de Speroni 2003, 2009, Madekuroswa & Kimaro 2006, Claver et al. 2008).

El papel que desempeña la atresia no bursting (lipoidal y lipoglandular) en el ovario de F. armillata, se relaciona con un mecanismo temprano de selección folicular debido a que involucra a los folículos ováricos pequeños y presenta un alto porcentaje durante la recrudescencia, mientras que debido a la atresia bursting o por ruptura se eliminan los folículos vitelogénicos amarillos no aptos para ovular.

De este estudio se concluye que, durante la fase de recrudescencia gonadal de F. armillata, el desarrollo y diferenciación y la atresia folicular son procesos normales y dinámicos que contribuyen a la homeostasis del ovario de esta ave de hábitat acuático.

Agradecimientos Los autores agradecen a la Dra. María Helena Samar por las sugerencias y lectura crítica del manuscrito, al Prof. Jorge Dongiovani por la colaboración en los trabajos de campo y a la SECYT- UNC. Resol-214/10 por la financiación de este trabajo.

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Vocalizaciones de Platalina enovensium ISSNG1561-0837

Análisis de las vocalizaciones del murciélago longirrostro peruano Platalina genovensium Thomas, 1928 (Chiroptera: Phyllostomidae) Analysis of vocalizations of Long-snouted Bat Platalina genovensium Thomas, 1928 (Chiroptera: Phyllostomidae) Juan A. Malo de Molina1, Sandra Velazco2, Víctor Pacheco2,3 y Juan Carlos Robledo4 1 ECONIMA, Consultoría Ambiental. Batalla de Bailén, 24, 28400 Madrid, España. jmalomolina@econima.com 2 Departamento de Mastozoología, Museo de Historia Natural – UNMSM. Aptdo. 14-0434, Lima 14, Perú.

3 Instituto de Ciencias Biológicas “Antonio Raimondi”, Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Lima 1, Perú.

4 DBBASICO. Avda. Toledo 31, 3º P, L22. 45600 Talavera de la Reina (Toledo, España).

Resumen Se presentan los primeros datos sobre las emisiones acústicas del murciélago longirrostro peruano Platalina genovensium, siendo este el primer estudio que se publica sobre análisis de los ultrasonidos emitidos por murciélagos en el Perú. Las emisiones acústicas analizadas fueron grabadas de individuos volando en condiciones de confinamiento dentro de sus propios refugios, en dos localidades relativamente próximas a la ciudad de Lima. La señal acústica de P. genovensium está compuesta por pulsos de 1,30 ms de duración media, en frecuencia modulada, de niveles sonoros extremadamente bajos (aprox. -10 a -35 dB a 1 m de distancia), en secuencias de 12,90 pulsos/segundo, con ancho de banda promedio de 28,58 kHz, discontinuo, con interpulso promedio de 67,56 ms y con máxima energía en 89,21 kHz. Presentan además un armónico en frecuencias superiores a190 kHz. El uso de la Transformada de Fourier para Señales Discretas y el posterior Análisis de la Distribución de Energía en bandas de frecuencia han permitido establecer una ecuación predictiva sobre el tiempo de duración del pulso en función de las bandas 70-80 kHz, 90-100 kHz y 110-120 kHz. Aumentos de un 4% de la Energía en la banda de 110-120 kHz implican una disminución de hasta 0,2 ms en la duración del pulso, mientras que el mismo aumento en las bandas de 70-80 y 90-100 kHz incrementan 0,1 ms dicha duración. Esta ecuación de predicción podría ser de utilidad para la identificación de la especie, su monitoreo, y servir de base para conocer cómo P. genovensium adapta la emisión energética en sus bandas de frecuencia evitando que pulso y eco se solapen y enmascaren la señal emitida.

Palabras clave: Platalina genovensium, Phyllostomidae, Lonchophyllinae, Emisiones acústicas, Vertiente occidental del Perú, Transformada de Fourier.

Abstract Presentado: 28/07/2011 Aceptado: 23/09/2011 Publicado online: 08/02/2012

This paper presents the first data on vocalizations of the Long-snouted Bat Platalina genovensium. It is also the first published study on ultrasound analysis of any bat from Peru. The recordings of vocalizations were obtained from flying bats while in their roosts. These roosts were found in two locations near the city of Lima. Each echolocation call was composed of FM fast pulses of 1.30 ms of extremely low intensity (-10 to -35 dB one m away from the recording device), in sequences of 12.90 pulses per second, with 28.58 kHz bandwidth in average, discontinuous, average interpulse of 67.56 ms, and an energy peak in 89.21 kHz. The pulses present a harmonic above 190 kHz. Both, Discrete Fourier Transform and Analysis of the Energy Distribution in frequency bands were used to obtain a predictive equation. This equation is able to predict duration call for 70-80 kHz, 90-100 kHz, and 110-120 kHz energy frequency bands. So, if 110-120 kHz frequency band increases 4%, then duration call decreases 0.2 ms, whereas if 70-80 y 90-100 kHz frequency band increases, then duration call also does it in 0.1 ms. This equation can be used to identify and monitor this species. It also allows us to determine how P. genovensium adapts its energy frequency bands in order to avoid overlap between pulse and echoes.

Keywords: Platalina genovensium, Phyllostomidae, Lonchophyllinae, Acoustic signals, Western slope of Peru, Fourier transform.

Introducción El murciélago longirrostro peruano Platalina genovensium es una especie nectarívora de la subfamilia Lonchophyllinae (Griffith 1982) catalogada en peligro crítico por la legislación peruana (Ministerio de Agricultura 2004) y como casi amenazada por UICN desde el año 2008 (Pacheco et al. 2008) porque su población global se encuentra declinando significativamente, aunque se estima que a una tasa inferior al 30% en 10 años.

UICN reconoce que está próxima a calificar como vulnerable debido a la extensa y rápida pérdida de su hábitat en gran parte de su área de distribución. En su proceso de enrarecimiento se señalan también otros factores como la captura de ejemplares para su uso en la medicina tradicional (Zeballos-Patrón et al.

2001). En cuanto a su tamaño poblacional, se considera una especie rara; en un hábitat favorable del SW del Perú se ha estimado una densidad poblacional de 0,0684 individuos/km2 (Sahley 1995, Sahley & Baraybar 1996). La falta ocasional de alimento por prolongadas sequías u otras razones puede ocaRev. peru. biol. 18(3): 311 - 318 (December 2011)

sionar mortandades o movimientos dispersivos (Graham 1987, Eisenberg & Redford 1999, Sahley 1995).

Se refugia principalmente en cuevas de dimensión variable.

Se han registrado casos en los que descansa durante el día bajo cornisas naturales de grandes rocas (M. Aguirre, com. pers.).

Excepcionalmente lo hace también en refugios artificiales como se demuestra en este trabajo. Presentan un sistema complejo de organización dentro de las colonias, donde machos y hembras preñadas se encuentran formando grupos separados (S. Velazco, com. pers.) con un promedio de 10 individuos por refugio, aunque se ha reportado un refugio que albergaba alrededor de 50 ejemplares (Sahley & Baraybar 1996).

Esta especie se encuentra a lo largo de la costa comprendida entre Piura (Perú) (Aragón & Aguirre 2007) y Tarapacá (Chile) (Galaz et al. 1999). Su distribución está vinculada a la presencia de cactáceas como Neoraimondia arequipensis, Corryocactus brevistylus (Aragón & Aguirre 2007), Weberbauerocereus weberbaueri (Sahley 1995 & 1996) y Stenocereus thurberi (Sahley 2001), de

311

Malo de Molina et al.

se viene aplicando desde hace décadas en otras regiones aunque presenta algunas limitaciones (Ahlén & BaagØe 1999, Russo & Jones 2002). Este estudio se centra en las emisiones durante el vuelo en condiciones de confinamiento en sus propios refugios. Área de estudio El trabajo de campo se realizó durante marzo y octubre de 2010 en las cuencas de los ríos Chillón y Chancay, departamento de Lima, Perú (Fig. 1). Ambas se encuentran dentro de la zona de vida del matorral desértico subtropical (md-ST) el cual se ubica entre los 800 y 2100 m. El clima en ambas zonas es árido y semicálido hasta los 2000 m, con un gradiente de precipitación que aumenta con la altitud (Cabrera et al. 2001, Novoa et al.

2005). La temperatura media en la cuenca del río Chillón es de 18 °C con una precipitación media anual de más de 125 mm, cerca de cuatro veces más de lo que recibe la cuenca del río Chancay a similar altitud (36 mm/año) (Novoa et al. 2005). Al igual que en las demás cuencas de la costa del Pacífico, el relieve se caracteriza por ser una hoya hidrográfica alargada, profunda y de fuertes pendientes, que se ensancha hacia los valles (Cabrera et al. 2001). A continuación se detallan las características de los dos refugios evaluados de P. genovensium.

Refugio de Acos

Figura 1. Ubicación de las localidades del estudio de vocalización de Platalina genovensium en el departamento de Lima: 1 = Refugio de Acos, 2 = Refugio de Santa Rosa de Quives.

las que obtiene su alimento. Para ello, P. genovensium probablemente combina sus capacidades olfativa, visual y ecoacústica para explotar los recursos florales quiropterófilos, al igual que otros murciélagos nectarívoros (von Helversen & von Helversen 1999, von Helversen et al. 2003, Simon et al. 2006).

La subfamilia Lonchophyllinae, a la que pertenece Platalina, fue separada de Glossophaginae por Griffiths (1982) sobre la base de diferencias linguales que inducen a pensar que ambas subfamilias han alcanzado el nectarivorismo por rutas evolutivas diferentes; sin embargo, las afinidades evolutivas y adaptativas con Glossophaginae son notables, aunque se desconoce si ambas subfamilias presentan similares señales de ecolocación (Helversen et al. 2003).

Se localiza en la cuenca del río Chancay, en el segundo piso de una vivienda de dos plantas a medio construir con ladrillos y temporalmente abandonada de la localidad de Acos, distrito de San Miguel de Acos, provincia de Huaral, departamento de Lima, Perú. El refugio se ubica a 1571 m de altitud, en las coordenadas 11˚16’25.62”S; 76˚49’16.13”W. En las laderas desérticas de los cerros circundantes crecen las cactáceas columnares Neoraimondia arequipensis de las que probablemente se alimenta P. genovensium (Fig. 2). Durante el muestreo del 20 de marzo de 2010 (estación húmeda) se encontraron 3 ejemplares: un macho muy joven, posiblemente recién independizado, y un macho adulto (Fig. 3). El tercero, también adulto, no se capturó y no se pudo verificar su sexo.

Refugio de Santa Rosa de Quives El segundo refugio se ubica a 1320 m de altitud, con coordenadas 11˚40’07.99”S y 76˚46’45.39”W, en la localidad de Santa Rosa de Quives, distrito de Santa Rosa de Quives, provincia de

Las vocalizaciones de la familia Phyllostomidae, entre los que se encuentra el género Platalina, se emiten desde las narinas, a diferencia de la mayoría de quirópteros que lo hacen por la boca; rasgo que es compartido con Megadermatidae, de su mismo suborden Yangochiroptera, y con Rhinolophidae, Nycteridae e Hipposideridae del suborden Yinpterochiroptera (Teeling et al.

2002, Vaughan et al. 2010). P. genovensium, al igual que otros quirópteros, tienen estructuras dérmicas en el área naso-bucal, como pliegues y proyecciones, que les permiten modular el ultrasonido (Mergell et al. 1999).

El objetivo de este trabajo es dar a conocer por primera vez las características de las vocalizaciones de P. genovensium. Este estudio es también el primero que presenta un análisis de las emisiones acústicas de una especie de murciélago en Perú. Se pretende contribuir a facilitar la identificación de la especie emisora a partir de la grabación y posterior análisis de sus emisiones de ultrasonidos. Esta técnica, novedosa aún en el Perú,

312

Figura 2. Hábitat de Platalina genovensium en una comunidad de cactáceas de Neoraimondia arequipensis en la localidad de Acos, departamento de Lima.

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Vocalizaciones de Platalina Genovensium

Grabación de las señales de ultrafrecuencia Una vez localizados los refugios, estos fueron inspeccionados para verificar que no residan otras especies cuyas emisiones pudiesen confundirse con las de P. genovensium. Se tomaron grabaciones en el interior del refugio durante un período de 20 minutos, evitando prolongar el tiempo para no estresar a los individuos. En el refugio de Acos se obtuvieron unas 30 grabaciones pero en general resultaron deficientes por la baja presión sonora de emisión de las vocalizaciones, de modo que solo se aprovecharon 12 pulsos a efectos de este estudio. En Santa Rosa de Quives se obtuvieron 200 pulsos de suficiente calidad como para ser estudiados.

Las grabaciones se realizaron en horario diurno y crepuscular.

En el curso del estudio se comprobó que en horas diurnas P. genovensium es muy reacio a abandonar el refugio incluso aunque se sienta seriamente amenazado en su interior. No obstante, para realizar algunas de las grabaciones se cerraron todas las posibles salidas con redes de neblina asegurando que no se produjeran escapes que habrían sido tan perjudiciales para la obtención de registros sonoros como para la propia supervivencia de los murciélagos.

Figura 3. Dos ejemplares de murciélago longirrostro peruano, Platalina genovensium en el refugio de Acos. A la izquierda macho subadulto, con coloración gris plomo, y a la derecha ejemplar adulto, probablemente macho, de color pardo.

Canta, departamento de Lima, Perú. El refugio es una pequeña gruta de unos 5 m de profundidad por 2,5 m de ancho y 4 m de alto, cuya entrada se encuentra reducida por un portón construido de barro y piedra. La entrada está orientada al oeste junto a una pequeña quebrada seca que desemboca sobre el río Chillón.

En la evaluación del 9 de octubre de 2010 se encontraron dos ejemplares, ambos machos adultos.

Material y métodos En este trabajo se describen los anchos de banda, duración de pulso, picos de frecuencia e interpulsos de las señales acústicas. Se demuestra que las bandas de frecuencia consideradas están relacionadas con la duración del pulso. La distribución en frecuencias de la energía puede resultar útil como herramienta a la hora de identificar la especie debido a la relación de estas con las adaptaciones discriminatorias de la señal (Signal Overlap Zone (SOZ) y Distance Of Focus (DOF)) y por lo tanto con la adaptación evolutiva de cada especie a su hábitat.

Para la detección de las emisiones se utilizó un detector Pettersson D240x, el cual permite su uso en función heterodina y de expansión de frecuencia. Para este estudio se utilizó en primer lugar la función heterodina para asegurarse de que no existieran otros quirópteros ocultos en grietas del refugio, cuyas emisiones pudiesen interferir con las de P. genovensium; mientras que se aplicó la expansión de frecuencia para la grabación y el análisis de vocalizaciones. Cada secuencia de ultrasonido registrada en expansión de frecuencia se grabó con una TASCAM DR-08 configurada en PCM wav 44,1 kHz/16 bits/mono, cumpliendo las especificaciones del fabricante del detector. El procedimiento es muy similar al empleado en muchos estudios con equipos de similares condiciones (e.g. Russo & Jones 2002). Para ello, se grabaron 41 secuencias de sonido de 1,7 y de 3,4 segundos, y se expandieron a 17 y 34 segundos respectivamente para examinar y medir con precisión sus características tras reflejarlas gráficamente en un sonograma.

Análisis Las grabaciones fueron analizadas con los programas BatSound y Audacity. Se seleccionaron las de mejor calidad y se analizaron los siguientes parámetros: Descripción del pulso, descripción de la secuencia de pulsos, frecuencia de máxima energía, duración del pulso e interpulso (tiempo entre pulsos) (Tablas 1 y 2).

Tabla 1. Análisis descriptivo de las frecuencias que componen la señal acústica de Platalina genovensium: Promedio, Intervalos de Confianza con un nivel de significancia de 0,05, Mediana, Mínimo y Máximo y Rango entre Cuartil 25 y Cuartil 75.

Promedio

Intervalo de Confianza (95 % )

Mediana

Mínimo

Máximo

Rango InterCuartil

89,21

88,66 - 89,75

89,42

86,90

91,20

1,91

Frecuencia de máxima energía (kHz) Duración (ms)

1,30

1,25 - 1,34

1,30

1,10

1,50

0,10

Ancho de banda (kHz)

28,58

27,86- 29,29

28,41

26,12

32,18

2,11

Interpulso (ms)

67,56

52,93-99,08

55,97

32,46

138,61

31,73

Pulsos por segundo (N/s)

12,90

5,65-20,15

13,54

6,41

28,49

8,29

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313

Malo de Molina et al.

Tabla 2. Análisis descriptivo de la Distribución de Energía por Bandas de Frecuencia en porcentajes (%) para la señal acústica de Platalina genovensium. Test de Shapiro-Wilk para la comprobación de la asunción de Normalidad, Media, Mediana, Intervalos de Confianza con un nivel de significancia de 0,05, Mediana, Mínimo y Máximo, Desviación estándar y Rango entre Cuartil 25 y Cuartil 75.

Intervalos de Frecuencia (kHz)

Nº señales

Test Shapiro-Wilk

Media (%)

Mediana Intervalo de Desviación Mín. (%) Máx. (%) (%) Confianza (95%) Estándar

<50

W=0,90678, p<0,0554

20

1,86

1,63

(1,39- 2,33)

0,65

4,41

1,01

2,28

50 a 60

W=0,95431, p<0,4373

20

3,23

3,11

(2,73- 3,74)

1,47

6,13

1,08

4,00

60 a 70

W=0,93297, p<0,1761

20

3,67

3,35

(3,15- 4,19)

2,06

6,32

1,11

4,36

70 a 80

W=0,82480, p<0,061

20

5,56

4,66

(4,38- 6,74)

3,04

12,26

2,52

6,22

80 a 90

W=0,93252, p<0,1726

20

42,42

44,46

(39,53- 45,32)

28,26

52,11

6,19

46,30

90 a 100

W=0,96615, p<0,6724

20

27,11

27,61

(22,79- 31,43)

10,41

44,51

9,23

32,14

100 a 110

W=0,95888, p<0,5218

20

9,89

9,07

(8,67- 11,10)

5,89

15,43

2,60

11,86

110 a 120

W=0,95687, p<0,4833

20

4,24

4,09

(3,90- 4,57)

3,09

5,61

0,72

4,87

120 a 130

W=0,96387, p<0,6238

20

0,25

0,26

(0,21- 0,29)

0,12

0,41

0,08

0,32

>130

W=0,95519, p<0,4527

20

1,77

1,74

(1,68 1,87)

1,48

2,16

0,20

1,92

Muchos de los pulsos grabados se utilizaron para verificar ritmos (duración del pulso e interpulso); mientras que se realizó una selección de los de mejor calidad con el fin de medir en cada uno de ellos los parámetros indicados. En la selección se tuvo en cuenta la posibilidad de que modifiquen levemente sus frecuencias cuando coexisten dos o más individuos en un espacio en el que sus emisiones pueden interferir (Airas 2003). De hecho, en este estudio se comprobó que las emisiones simultáneas de dos ejemplares de P. genovensium se pueden diferenciar entre sí levemente tanto en estructura como en frecuencia.

Se analizó la señal de P. genovensium con la aplicación Matlab 7.7., calculándose la Transformada de Fourier mediante el algoritmo:

X (F ) =

∫

∞

−∞

− 2π Ft x (t )e ∫ dt

Las Energías por bandas de Frecuencia de la señal se calcularon mediante la Ecuación de Paserval (Oppenheim & Schafer 1999) para las bandas de frecuencias < 50Khz, entre 50-60 kHz, entre 50-60 kHz, entre 60-70 kHz, entre 70-80 kHz, entre 80-90 kHz, entre 90-100 kHz, entre 100-110 kHz, entre 110-120 kHz, entre 120-130 kHz y > 130 kHz. El Teorema de Paserval relaciona la energía de la señal en el dominio temporal y frecuencial de la forma: ∞

2

∞

2

E x  ∫ x(t ) dt  ∫ X ( F ) dF −∞

−∞

Los intervalos entre pulsos y la duración del pulso fueron determinados usando el oscilograma. Máximos y mínimos de frecuencias en la señal fueron determinados para el cálculo del ancho de banda utilizando el pico de frecuencia de la serie como máximo y el mínimo el valor por debajo de 15 dB con el fin de eliminar el efecto del ruido de fondo y la distancia a P. genovensium (Surlykke & Moss 2000).

Los datos en porcentajes por bandas de frecuencias se analizaron previamente para identificar el ruido de fondo descartándose aquellos valores definidos como atípicos:

314

Cuartil Superior

UBV + 1,5*(UBV-LBV) Siendo UBV el valor de la media más el cuartil 75%, LBV la media menos el cuartil 25% y 1,5 el coeficiente outlier o valor atípico (Tukey 1977).

El análisis estadístico siguió dos objetivos; el primero, la caracterización de una señal típica y representativa de P. genovensium a través de la distribución frecuencial de su energía, anchos de banda, picos de frecuencia, duración del pulso y tiempo de interpulsos. El segundo objetivo fue analizar la distribución en frecuencias de la energía como herramienta causal en el tiempo de duración del pulso. Los murciélagos acortan la duración del pulso cuando se aproximan al objetivo como consecuencia de optimizar la Signal Overlap Zone (SOZ) (Jones & Holderied 2007) por lo que la distribución en frecuencias de la energía podría ser un indicador de dicha adaptación. Las variables asociadas al análisis descriptivo de la señal de murciélagos no cumplen, según diversos autores, el supuesto de normalidad (Ratcliffe & Dawson 2003). Con el objeto de cumplir con dicho supuesto se transformaron los datos de porcentajes con la raíz cuadrada y la duración del pulso mediante la transformación logarítmica (Zar 1999). Posteriormente se valoró la normalidad mediante el Test de Shapiro-Wilk (Shapiro et al. 1968). Finalmente, se utilizó un análisis de regresión por pasos para determinar qué bandas de frecuencia estaban relacionadas con la duración del pulso.

Resultados La señal emitida por P. genovensium es de tipo modulado, variando las amplitudes de la misma en intervalos de tiempo muy breves con interpulsos de duración variable (Fig. 4). Estas vocalizaciones registradas tienen en común la presencia de armónicos emitidos a partir de 190 kHz hacia frecuencias más elevadas. Cada uno de los pulsos pueden descomponerse en una serie de armónicos distribuidos en el rango de frecuencias comprendidas entre 50 y 120 kHz, teniendo como consecuencia un sonograma característico (Fig. 5).

El rango de frecuencias de los pulsos de P. genovensium es una variable de escaso interés porque depende de las condiciones de grabación. En condiciones óptimas puede extenderse en un rango de 25-225 kHz pero con el aumento de la distancia se pierden rápidamente las altas frecuencias y también aquellas frecuencias asociadas a los niveles de presión sonora más bajas.

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Vocalizaciones de Platalina Genovensium

Figura 4. Sonograma que muestra la Secuencia de pulsos característica de Platalina genovensium. Se aprecian interpulsos de duración variable.

Figura 5. Sonograma que muestra las bandas de frecuencia en un pulso característico de Platalina genovensium.

La señal de Platalina genovensium tiene una duración media de 1,3 segundos (Fig. 6) . Las frecuencias en las cuales los coeficientes de Fourier presentan amplitudes máximas son 60, 90 y 110 kHz como puede observarse en la Figura 7, lo que demuestra la modulación de la señal por parte de Platalina genovensium frente a otras especies que emiten en frecuencias constantes.

Las Figuras 6 y 7 presentan distintos aspectos de un pulso característico de P. genovensium. Para la caracterización de la señal se ha utilizado la muestra que más se correlaciona con los valores de la mediana (Muestra 1, r=0,999) con el fin de definir la señal más característica. Por otro lado, las Tablas 1 y 2, y la Figura 8 sintetizan los resultados obtenidos en el análisis de los pulsos.

Figura 6. Oscilograma correspondiente a un pulso característico de la señal de Platalina genovensium. La duración de la señal es 1,30±0,05 ms.

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Se han obtenido valores medios de duración de la señal de 1,3 ms, con interpulsos en intervalos de 67,56 ms y valores máximos de energía a 89,21 Hz (Tabla 1). La comprobación de los Test de Normalidad (Shapiro-Wilk) para la distribución de energías en la señal permite utilizar indiscriminadamente la media o la mediana para la interpretación de la distribución de la energía con el fin de poder comparar su señal con la de otras especies en trabajos posteriores (Tabla 2).

315

Malo de Molina et al.

Figura 7. Espectrograma de la señal discreta de Platalina genovensium mediante la Transformada de Fourier en tiempo discreto (DTFT) de –F/2 a F/2. Se puede observar cómo aparecen armónicos en frecuencias próximas a los 220 kHz con un aumento en la amplitud de la señal.

La mayor contribución a las variaciones en la duración del pulso se debe a la banda de frecuencia 110 – 120 kHz. Un incremento energético en esta banda de frecuencia implicará una disminución en la duración del pulso en P. genovensium.

Relación energía en bandas de frecuencia con el tiempo de duración de la señal Al analizar mediante el Análisis de Regresión Forward se comprobó que la dependencia entre los residuos no tenían colinealidad mediante el Test de Durban-Watson (d= 2,44) entre las variables consideradas.

A medida que aumenta la concentración de energía en la banda de frecuencia 110 – 120 kHz, P. genovensium estaría reduciendo el tiempo de duración del pulso y a su vez la Signal Overlap Zone (SOZ) corrigiendo los posibles errores introducidos por el eco de la señal conforme con la Teoría Distance Of Focus (DOF) (Holderied et al. 2006).

Los resultados del Modelo de Regresión indican que existe una relación significativa entre la concentración de energía en las bandas de frecuencia 80 – 90, 90 – 100 y 110 – 120 kHz (F= 5,451; p<0,00893; R= 0,71; R²= 0,51) y la duración del pulso, resultando la ecuación predictiva observada en la Figura 9.

t = 1,143 + 0,0196 * (E 70-80 kHz) + 0,0106 * (E 90-100 kHz) – 0,0559 * (E 110-120 kHz) (0,16) (0,011) (0,0031) (0,021) Figura 9. Ecuación predictiva del tiempo de duración del pulso a través de los porcentajes de energía en las bandas de frecuencia significativas del modelo (70-80, 90-100 y 110-120), error standard de intercepto y de los coeficientes predictivos de la regresión.

50

40

30

20

10

0

<50

50-60

60-70

70-80

80-90

90-100

100-110

110-120

120-130

>130

kHz Figura 8. Representación de la Media ± Desviación Estándar y Media ± Error Estándar. Como puede observarse en la figura la Concentración de la Energía se centra entre 80 kHz y 100 kHz, representando prácticamente el 70% de la Energía de la señal de Platalina genovensium.

316

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Vocalizaciones de Platalina Genovensium

Discusión Al igual que sucede en otras especies simpátricas de la familia Phyllostomidae grabadas en Lima, como Glossophaga soricina o Artibeus fraterculus (J. A. Malo de Molina, com. pers.), las emisiones sonoras de P. genovensium son de presión sonora extremadamente débil, concordando con lo publicado para otros miembros de la familia Phyllostomidae (Fenton et al. 1992), como los glossofaginos que presentan emisiones sonoras muy breves (0,5-3 ms) y débiles, así como multiarmónicas, de banda ancha y frecuencia modulada (von Helversen et al. 2003). En consecuencia, P. genovensium no es detectable con el equipo utilizado en este trabajo a más de 3 m de distancia, mientras que en el mismo entorno y condiciones, especies insectívoras como Tadarida brasiliensis, por ejemplo, son nítidamente registrables a distancias de 40 m o incluso superiores (J. A. Malo de Molina, com. pers.). No obstante, la posibilidad de discriminar la señal acústica de Platalina genovensium de la de otras especies será especialmente útil en prospecciones con grabaciones no presenciales y en otras situaciones en que no se pueda identificar la especie de visu. Para que esto sea factible serán necesarios ulteriores estudios para caracterizar las vocalizaciones de especies simpátricas estableciendo criterios de discriminación acústica.

Es de esperar que la subfamilia Lonchophyllinae muestre una menor dependencia de la ecolocación que las especies insectívoras, como Bogdanowicz el al. (1997) sugirió para los Glossophaginae, constituida también por especies básicamente nectarívoras. Afirmación basada en el hecho que muchas especies de la familia Phyllostomidae localizan sus recursos alimenticios principalmente con el olfato y la visión en horario crepuscular, reservando la ecolocación para la aproximación final a la flor (Korine & Kalko 2005, von Helversen & von Helversen 2003). Esto, además de la escasa presión sonora de emisión en etapas preliminares de este estudio, podría justificar los escasos y deficientes registros que se obtuvieron para P. genovensium en condiciones de no confinamiento. Estas dificultades se muestran en muchas especies de filostómidos y fueron ya descritas por Griffin (1958), lo que induce a estudiar sus vocalizaciones en laboratorio (Macías et al. 2006). Howell (1974) describe cómo muchos filostómidos, a los que denominaban murciélagos susurrantes, whispering bats, emiten señales con intensidades 50 veces menores que las especies insectívoras.

En contraste con los murciélagos de la familia Molossidae, el conocimiento acústico de los murciélagos de la familia Phyllostomidae aún es limitado, por la dificultad de registrar las bajas intensidades y las altas frecuencias de sus señales de ecolocación emitidas en frecuencia modulada (Kalko 2004). No obstante, se tiene información de algunas especies, por ejemplo Desmodus rotundus (Schmidt et al. 1991), Carollia perspicillata (Koay et al. 2003, Sterbing 2002), los géneros Lophostoma, Micronycteris, Chiroderma, Artibeus (Kalko 2004, Jennings et al. 2004) y Glossophaga, Anoura y Leptonycteris (Howell 1974, von Helversen et al. 2003). A ellos se añade Platalina en el presente estudio.

Agradecimientos Nuestro agradecimiento a Catherine Sahley por la mejora en la preparación del abstract. Un especial reconocimiento a Kathrin Barboza por sus comentarios y sugerencias, y a un réferi anónimo por revisar el manuscrito del presente trabajo.

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Rev. peru. biol. 18(3): 311 - 318 (Diciembre 2011)

Rev. peru. biol. 18(3): 319 - 324 (Diciembre 2011) © Facultad de Ciencias Biológicas UNMSM

Nuevos registros de asteroideos (Echinodermata: Asteroidea) de Perú ISSN 1561-0837

Tres nuevos registros de asteroideos (Echinodermata: Asteroidea) de Perú Three new records of asteroids (Echinodermata: Asteroidea) from Peru Yuri Hooker1,2 y Francisco A. Solís-Marín3 (1) Laboratorio de Biología Marina, Facultad de Ciencias y Fisiología, Universidad Peruana Cayetano Heredia. Av. Honorio Delgado 430, Urb. Ingeniería, S.M.P. Lima - Perú.

Email: hookery@yahoo.com (2) Unidad Marino Costera, Servicio Nacional de Áreas Naturales Protegidas por el Estado (SERNANP), Ministerio del Ambiente, Perú.

(3) Colección Nacional de Equinodermos, Instituto de Ciencias del Mar y Limnología, Universidad Nacional Autónoma de México.

Resumen En el presente trabajo se registran 3 nuevos asteroideos (Echinodermata: Asteroidea) de aguas someras (4 - >50 m) para el Perú: Astropecten regalis Gray, 1840, Paulia horrida Gray 1840 y Meyenaster gelatinosus (Meyen, 1834). Astropecten regalis se conocía desde el Golfo de California hasta Panamá, en el presente trabajo, se amplía su distribución hasta Máncora, Perú. La distribución geográfica de Paulia horrida era conocida desde Baja California, hasta Isla Cocos, Costa Rica, en este estudio se amplía su distribución geográfica hasta Punta Sal, Perú. A Meyenaster gelatinosus se le conocía solo de Chile, en el presente trabajo se registra y confirma su presencia en el Perú, ampliando su distribución norte hasta San Juan de Marcona. Se proporciona información morfológica de las especies, características del hábitat y fotografías in situ y de los especímenes recién recolectados.

Palabras clave: nuevos registros, estrellas de mar, Perú.

Abstract

Presentado: 01/08/2011 Aceptado: 16/09/2011 Publicado online: 08/02/2012

The aim of this work is to present three new shallow water (4 - >50 m) records of asteroids (Echinodermata: Asteroidea) for the Peruvian fauna: Astropecten regalis Gray, 1840, Paulia horrida Gray 1840 and Meyenaster gelatinosus (Meyen, 1834). Astropecten regalis geographical distribution is known that ranges from Gulf of California to Panama, this discovery extends its distribution to Mancora, Peru. Paulia horrida is known from Baja California to Isla Cocos, Costa Rica, and this record extends its southern distribution limit to Punta Sal, Peru. Meyenaster gelatinosus was considered endemic to Chilean waters, however, this record confirm its presence in Peru extending its northern distribution limit to San Juan de Marcona, Peru. Morphological and habitat information on this four species is provided, together with live pictures.

Keywords: new records, sea star, Peru.

Introducción Los equinodermos, a pesar de su gran importancia ecológica, son un grupo poco estudiado en el Perú. Los trabajos de Clark (1910), Madsen (1956), Hooker et al. (2005), Paredes y Gamarra (2006) y Prieto (2010) son publicaciones donde se tratan a los equinodermos del Perú desde el punto de vista taxonómico y ecológico. Otros autores han registrado algunas especies recolectadas en aguas peruanas durante cruceros o investigaciones en áreas geográficas amplias (Aggassiz 1881, Deichmann 1941, 1958, Bluhm & Gebruk 1999).

El conocimiento de la diversidad de estrella de mar en un ecosistema o área geográfica es de relevancia pues son especies clave en las comunidades tanto de sustratos duros como blandos y en toda la gradiente batimétrica de los océanos. Howell et al.

(2003) los clasifica en 3 grupos tróficos: suspensívoros, depredadores/carroñeros y sedimentívoros. La mayoría de estrellas de mar son carnívoras y pueden ser los mayores depredadores en algunos hábitats (Gil & Zaixso 2008, Himmelman et al. 2005).

Los nuevos registros de asteroideos para el Perú se constituyen como un importante aporte al conocimiento de la biodiversidad de equinodermos del mar peruano y componentes importantes de la estructura comunitaria a las que pertenecen, contribuyendo además a la mejor comprensión biogeográfica del Pacífico Oriental tropical y del Pacífico Sur Oriental templado.

Material y métodos Se realizaron colectas directas por medio de buceo SCUBA y utilizando artes de pesca. Los especímenes fueron fotografiados in situ, tomando el dato batimétrico por medio de un computador de buceo. La recolecta fue directa, transportándose los Rev. peru. biol. 18(3): 319 - 324 (December 2011)

especímenes vivos hasta el laboratorio de campo. Un espécimen de Astropecten regalis fue colectado con red de arrastre de playa (chinchorro) y otro fue encontrado varado en la playa. Todos los especímenes, excepto Paulia horrida, fueron fijados en formalina neutralizada por 24 horas, enjuagados y desecados al medio ambiente y posteriormente en estufa. P. horrida fue directamente fijada en alcohol al 96% y conservada de manera permanente en alcohol al 70%. Los especímenes se encuentran depositados en la Colección de Zoología Acuática (CZA) de la Universidad Peruana Cayetano Heredia y en IMARPE. La medida R o “radio mayor” proporcionada fue tomada desde el centro del disco del espécimen hasta la punta del brazo más largo.

Todos los especímenes fueron recolectados por el autor, excepto un ejemplar de Meyenaster gelatinosus que fue recolectado por el Blgo. Marco Rios.

Resultados Se registra por primera vez para el Perú a Meyenaster gelatinosus (Meyen, 1834), Paulia horrida Gray 1840, Astropecten regalis Gray, 1840 y Luidia superba Clark, 1917.

Clase Asteroidea Orden Paxillosida Perrier, 1884 Familia Astropectinidae Gray, 1840 Astropecten regalis Gray, 1840 Figura 1 Material examinado: 2 especímenes: 1 espécimen (CZM58), R= 51 mm, recolectado en Isla del Amor, manglares de tumbes (3°29’20,67”S – 80°23’14,85”W) y 1 espécimen (CZM-

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Figura 1. Astropecten regalis: A. Espécimen vivo en regeneración (CZM-58); B. Espécimen desecado (CZM-59); C. Placas súperomarginales; D. Superficie abactinal del brazo; E. Placas ínferomarginales y surco ambulacral; F. Madreporito rodeado de espinas paxilares; G. Boca, espinas orales y ambulacros.

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59), R= 53 mm, encontrado varado en Máncora (4°6’36,95”S – 81°3’55,60”W).

Caracteres diagnósticos: Cuerpo plano, brazos cortos y anchos, ligeramente constrictos hacia la base, ensanchándose ligeramente y luego adelgazándose homogéneamente hasta el extremo. Discos y brazos cubiertos completamente por espinas paxilares romas, con 1 a 8 gránulos en la parte central y rodeada por más de 12 espinillas marginales. Placas súperomarginales cubiertas por gránulos redondos, varios de ellos más grandes, formando una fila. Placas ínferomarginales planas, cubiertas por gránulos planos, y a uno de sus lados y en el margen externo, una fila de espinas aplanadas. Borde de las placas marginales con grandes espinas planas con puntas aguzadas. Madreporita esférica, con tabiques longitudinales.

Color: Anaranjado intenso en vida, especímenes secos amarillentos.

Hábitat: En fondo arenoso, cerca del intermareal. Se le menciona como fauna acompañante de la pesca de arrastre de langostino en Perú (hasta unos 50 m de profundidad).

Distribución: Conocida del Golfo de California hasta Panamá (Caso 1979). Se amplía su distribución hasta Máncora, Perú.

Orden Valvatida Perrier, 1884 Familia Asterodiscididae Rowe, 1977 Paulia horrida Gray 1840 Figura 2 Material examinado: 1 espécimen (CZM-62) R= 84 mm, recolectado en Punta Sal (03º56’32’’S – 80º56’46,3’’O) a 33 m de profundidad.

Caracteres diagnósticos: Disco bien desarrollado y poco elevado, región ventral aplanada; con 5 brazos anchos, triangulares. Fuertes espinas cónicas cubren la superficie abactinal (aboral), las placas abactinales con numerosos poros a través de los cuales salen las pápulas. Superficie actinal con placas actinales teseladas, cada una con una protuberancia rodeada por pequeños gránulos. Placas súperomarginales con grandes espinas esféricas distintivas de la especie (Figura 3B). Surco ambulacral estrecho, las placas interambulacrales tienen una hilera de espinas internas pequeñas, digitiformes, varias en cada placa, y una serie externa de espinas más grandes, dos en cada placa.

Color: en vida es rojo bermellón intenso.

Hábitat: se le ha encontrado sobre un arrecife rocoso a 33 m de profundidad, con abundantes pólipos de corales ahermatípicos y depósitos de sedimento orgánico.

Distribución: Se le conocía de Punta Santa Elena, Ecuador y en las Islas Galápagos (Clark 1910), también en Todos Santos (Baja California), Isla Cocos e Isla Clarión (A. M. Clark 1993), se amplía su distribución hasta Punta Sal, Perú.

Orden Forcipulatida Perrier, 1884 Familia Asteriidae Gray, 1840 Meyenaster gelatinosus (Meyen, 1834) Figura 3 Rev. peru. biol. 18(3): 319 - 324 (December 2011)

Material examinado: 2 especímenes: 1 espécimen (UPCH CZM-56) R= 141 mm, recolectado el 5 de diciembre del 2008 en el islote El Avión, San Juan de Marcona (15°23’26,02”S 75°10’45,02”W) a 19 m de profundidad; 1 espécimen, R= 185 mm, recolectado en Punta Picata, Tacna, en el 2006 (Recolector: Marco Ríos).

Caracteres diagnósticos: 5 o 6 brazos (comúnmente 6).

Esqueleto abactinal (aboral) reticulado, poco calcificaco. Brazos con una fila de espinas carinales a lo largo del radio y dos filas de espinas marginales, todas bien desarrolladas. Espinas rodeadas de grandes cojines de pedicelarios, abundantes y minúsculos.

Poros papulares grandes, reunidos en grupos; pápulas bien desarrolladas.

Color: blanco amarillento en vida, también desecadas. Un juvenil observado presentó color marrón-ocre.

Hábitat: sobre fondos rocosos y aguas bien oxigenadas. Se le ha observado entre 4 y 19 m de profundidad.

Distribución: Anteriormente solo conocida en Chile, sin embargo H. L. Clark (1910) suponía su presencia en el sur del Perú. En el presente trabajo se registra y confirma su presencia en el Perú, ampliando su distribución norte hasta San Juan de Marcona.

Observaciones Mutschke y Mah (2009) indican que Meyenaster gelatinosus se encuentra en Perú basándose en la publicación de Madsen (1956). Al revisar la citada publicación, Perú no se menciona dentro del rango de distribución de la especie, sin embargo en un gráfico de grupos faunísticos de la misma publicación, se incluye erróneamente a M. gelatinosus en Perú lo que puede haber generado la confusión. Este registro no se considera válido.

En la publicación de H. L. Clark (1910) “The Echinoderms of Peru”, a pesar del título, hay algunas especies que no las registra para Perú y solo supone su presencia en este país. Ese el es caso de Paulia horrrida Rowe (1977) menciona a Perú dentro de las localidades de registro de la especie, muy probablemente basándose en la publicación de H. L. Clark (1910), ya que no menciona haber revisado algún espécimen recolectado en aguas peruanas.

Además, actualmente no se conoce ningún espécimen de P. horrida recolectado en Perú y depositado en alguna colección científica, por lo que suponemos que este es el primer ejemplar realmente registrado para Perú. El registro tiene además el valor de haber obtenido, hasta donde sabemos, la primera fotografía de esta especie en su hábitat natural.

Los hallazgos mencionados en el presente trabajo son parte de los esfuerzos que se vienen realizando por inventariar la diversidad acuática de las áreas marinas protegidas del Perú así como para identificar y priorizar localidades con alta biodiversidad que deben ser protegidas dentro del Sistema Nacional de Áreas Naturales Protegidas, siendo Punta Sal, localidad de colecta de Paulia horrida, uno de los lugares que ya se encuentra propuesto para su protección.

Literatura citada Agassiz A. 1881. Report of the Echinoidea dredged by the H.M.S. Challenger during the year 1873-1876. Zool. 3(9): 1-321.

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Hooker & Solís-Marín

Figura 2. Paulia horrida: A. Espécimen in situ; B. Espinas superomarginales esféricas; C. Madreporito, espinas abactinales y pápulas; D. Espécimen desecado; E. Boca, ambulacros y espinas interambulacrales ; F. Superficie actinal.

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Nuevos registros de asteroideos (Echinodermata: Asteroidea) de PerĂş

Figura 3. Meyenaster gelatinosus: A. Adulto in situ; B. Juvenil in situ; C. EspĂŠcimen desecado; D. Boca, espinas orales y surcos ambulacrales; E. Espinas carinales y marginales rodeadas de cogines de pedicelarios, se observa poros y pĂĄpulas; F. Madreporito.

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Rev. peru. biol. 18(3): 325 - 334 (Diciembre 2011) sensorial © Facultad de Ciencias Biológicas UNMSMActividad fermentativa de Hansenula anomala y compuestos químicos de importancia ISSN 1561-0837

Estudio de la actividad fermentativa de Hansenula anomala y producción de compuestos químicos de importancia sensorial Study of the fermentative activity of Hansenula anomala and production of chemical compounds of sensory importance Waldir Estela Escalante1,4, Mojmír Rychtera1, Karel Melzoch1, Elena Quillama Polo2y Beatriz Hatta Sakoda3 1Department of Fermentation Chemistry and Bioengineering, Faculty of Food and Biochemical Engineering. Institute of Chemical Technology Prague. Technická 5, 166 28. Praha 6, Dejvice. Czech Republic.

Email:Waldir.Desiderio.Estela.

Escalante@vscht.cz 2Laboratorio de Microbiología Industrial, Facultad de Ciencias Biologicas, Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Apartado postal 110058, Lima 11, Perú.

Email: equillamap@unmsm.edu.pe 3Facultad de Ingeniería de Industrias Alimentarias, Universidad Nacional Agraria La Molina. Av. La Molina s/n, La Molina, Lima, Perú.

Email: bhs@lamolina.edu.pe 4Laboratorio de Biotecnología Agroindustrial, Escuela de Ingeniería Agroindustrial, Universidad Nacional Micaela Bastidas de Apurímac. Av. Arenas 121, Abancay–Apurimac, Perú.

Presentado: 17/05/2011 Aceptado: 20/12/2011 Publicado online: 08/02/2012

Resumen Se ha estudiado la actividad fermentativa de Hansenula anomala RIVE 7-1-5 con el objetivo de evaluar la producción de compuestos químicos de importancia sensorial. Los resultados mostraron que fermenta bien monosacáridos y también sucrosa y maltosa. Su actividad fermentativa es inhibida a concentraciones de 100,0mg/L de metabisulfito de sodio en el medio. Además, es capaz de producir 5,81±0,1 % v/v de etanol. La agitación del medio de cultivo incrementa la producción de alcoholes superiores (679,2 mg/L) y etil acetato (206,0±8,0 mg/L), por el contrario disminuye la producción de ácido acético (196,0±7,0 mg/L). La producción de glicerol fue similiar tanto en cultivo estático (sin agitación) como agitado. Durante el cultivo batch en biorreactor a condiciones aireadas la tasa de crecimiento (µ) alcanzó el valor de 0,13 h-1 y se observó la producción de ácido acético hasta 4,2±0,3 g/L. La concentración de oxígeno en el medio afecta su metabolismo, así cantidades insuficientes de oxígeno provocaría un metabolismo respirofermentativo con la producción de etanol, alcoholes superiores, ésteres y ácido acético. El control de la aireación al medio de fermentación es una herramienta útil para controlar el balance entre la actividad respiratoria y fermentativa y así la síntesis de compuestos de importancia sensorial en la producción de bebidas fermentadas no tradicionales.

Palabras clave: Hansenula anomala, fermentación alcohólica, alcoholes superiores, etil acetato, cultivo por lote.

Abstract The fermentative behaviour of Hansenula anomala RIVE 7-1-5 was studied in order to evaluate the production of chemical compounds of sensory importance. The results demonstrated that the strain ferments very well monosaccharides and also sucrose and maltose. Its fermentative activity was inhibited at concentrations of 100 mg/L of sodium metabisulphite in the medium. Furthermore, it was able to produce 5,81±0,1% (v/v) of ethanol.

Agitation of the culture medium increases the production of higher alcohols (679,2 mg/L) and ethyl acetate (206,0±8,0 mg/L), but on the contrary affects the production of acetic acid (196,0±7,0mg/L). Glycerol production was similar in static (without agitation) and shaken cultivation. During batch cultivation carried out in biorreactor under aerated conditions the growth rate (µ) reached value of 0,13 h-1 and, it was also observed production of acetic acid at levels of 4,2±0,3 g/L. The oxygen concentration in the medium affects its metabolism, thus insufficient amounts of oxygen would provoke a respirofermentative metabolism with production of ethanol, higher alcohols, esters and acetic acid. The control of aeration during fermentation is a useful tool to control the balance between the respiratory and fermentative activity and thus; synthesis of compounds of sensory importance in the production of non-traditional fermented beverages.

Keywords: Hansenula anomala, alcoholic fermentation, higher alcohols, ethyl acetate, batch cultivation.

Introducción Hansenula anomala ó Pichia es una levadura no-Saccharomyces que frecuentemente es referida como contaminante en la producción de bebidas fermentadas ya que produce compuestos químicos en cantidades que afectan la calidad organoléptica (Thomas 1993). Sin embargo, en ciertas bebidas no tradicionales su presencia es beneficioso ya que los metabolitos que produce contribuye al aroma y sabor del producto final (Fleet 1992).

Por ejemplo, Hansenula anomala forma parte de la microflora en la fermentación espontánea de un tipo de “vino de arroz” consumido en Vietnam (Dung et al. 2006). Además es también responsable del aroma y sabor característico del “takju”, bebida alcohólica consumida en Corea del sur, hecha a base de arroz (Shin & Cho 1970).

Hansenula anomala es una levadura osmotolerante, ha sido aislada de productos con baja actividad de agua como por ejemplo en mermeladas de fruta (Tokuoka et al. 1992) y además de lugares con bajo contenido de oxígeno (Naito 1984). H. anomala frecuentemente forma parte aúnque no es predominante de la microflora de uvas y mostos y, participa en la etapa temprana de la fermentación alcohólica espontánea hasta que el oxígeno se agote y el etanol alcance niveles de 5–6% (a los 3 – 4 días) y Rev. peru. biol. 18(3): 325 - 334 (December 2011)

consecuentemente mueren (Fleet & Heard 1993; Torija et al.

2001). Subsecuentemente, las cepas resistentes al etanol como Saccharomyces cerevisiae predominan y completan la fermentación (Ribereau-Gayon 1985).

Metabolismo de azúcares en Hansenula anomala.- Los azúcares fermentables son la fuente de energía más importante en el metabolismo de levaduras. Hansenula anomala al igual que las demás levaduras utiliza vías metabólicas comúnes para la degradación de azúcares, llámese glucólisis, ciclo de krebs y vía de la pentosa fosfato. Estos para ser utilizados deben ser transportados hacia el interior de la célula mediante mecanismos de transporte específicos (Kruckeberg 1996, Flores et al. 2000).

La velocidad de utilización de azúcares esta influenciada por la concentración y el tipo de azúcar, la concentración de oxígeno disuelto en el medio así como de la temperatura, el pH entre otros factores (van Dijken et al. 1993, Bisson 1993, Goffrini et al. 2002). Hansenula anomala puede crecer a valores bajos de pH, baja actividad de agua, y alta presión osmótica (Fredlund et al. 2002). Además, no requiere adición externa de vitaminas para su crecimiento. Es una levadura Crabtree negativa, oxidativa, debido a que altas concentraciones de glucosa no reprime su respiración a condiciones aerobias (De Deken 1966a,b).

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Escalante et al.

Durante su crecimiento totalmente aerobio produce cantidades pequeñas de etanol y glicerol, es decir tiene preferencialmente un metabolismo respiratorio (De Deken 1966b, Fredlund et al. 2004a). A condiciones anaerobias su crecimiento se inhibe (Fredlund et al. 2004b).

A condiciones aerobias la glucosa-6-fosfato se metaboliza mayormente (50%) vía glucólisis y otra parte (30%) vía pentosa fosfato. Así mismo, a estas condiciones la mayor parte del piruvato entra a la mitocondria para su oxidación en el ciclo de Krebs, el cual funciona como un ciclo completo (Fredlund et al. 2004a). La limitación de oxígeno activa las enzimas de la vía fermentativa, como resultado se producen considerables cantidades de etanol y glicerol y, la tasa específica de toma de glucosa incrementa sustancialmente comparado con la tasa de toma de glucosa a condiciones aerobias. A estas condiciones, la oxidación de la glucosa-6-fosfato por la vía pentosa fosfato se reduce a solo 10% y el ciclo de Krebs funciona como una vía ramificada (Fredlund et al. 2004a). El flujo metabólico de Hansenula anomala en estas condiciones es similar al metabolismo fermentativo de Saccharomycescerevisiae (Gombert et al. 2001, Fiaux et al. 2003). Condiciones de limitación de oxígeno causa una mayor producción de etanol y también la acumulación de glicerol dentro de la célula y en el medio externo comparado a condiciones aerobias (Fredlund et al. 2004a y b). La producción de glicerol a condiciones de limitación de oxígeno esta relacionado a la necesidad de reoxidar los equivalentes redox producidos durante la síntesis de aminoácidos (Gancedo & Serrano 1989). Ácido acético también es producido durante su crecimiento respiratorio y respirofermentativo, pero no a condiciones severas de limitación de oxígeno (Fredlund et al. 2004a yb).

necesidad de reoxidar el NADH generado durante la glucólisis (Prior y Hohmann 1997).

En la Figura 1 se presenta en forma general el metabolismo respiratorio y respirofermentativo de Hansenula anomala en la degradación de glucosa.

Las levaduras no-Saccharomyces no son muy tolerantes a bajas concentraciones de oxígeno, especialmente comparado con S. cerevisiae (Hansen et al. 2001). A condiciones de limitación de oxígeno se estimularía la fermentación (van Dijken 1993), así entonces el piruvato es convertido a acetaldehído por la piruvato descarboxilasa, y luego es reducido bien a etanol por la alcohol deshidrogenasa (Bisson 1993), u oxidado a ácido acético por la acetaldehído deshidrogenasa NADP-dependiente (Jacobson & Bernofsky 1974). El acetaldehído funciona como receptor terminal de electrones cuya reducción por el NADH genera etanol (Bisson 1993, Boulton et al. 1996). En levaduras Crabtree negativas en presencia de oxígeno, el acetaldehído es preferentemente oxidado a acetato por la aldehído deshidrogenasa y luego convertido en acetil CoA por la acetil-CoA sintetasa (van Urk et al. 1990, Remize et al. 2000). Sin embargo, la acumulación de ácido acético bajo condiciones de limitación de oxígeno resultaría de la insuficiente actividad de la acetil-CoA sintetasa requerida para la oxidación completa del acetato (van Urk et al. 1990).

En levaduras Crabtree negativas cultivadas a condiciones aerobias, el piruvato se metaboliza preferentemente vía piruvato deshidrogenasa hasta acetil-CoA y luego éste entra al ciclo de Krebs para su oxidación completa (van Dijken et al. 1993, Gancedo & Serrano 1989); esto se debe a que presentan bajos niveles de piruvato descarboxilasa y una alta actividad de enzimas respiratorias como la piruvato deshidrogenasa, acetaldehído deshidrogenasa y acetil-CoA sintetasa (Postma et al. 1989).

La ausencia de oxígeno en el medio es crucial y conduce a la cesación del crecimiento (Bulder 1964, van Dijken et al. 1993).

La producción de acetato, glicerol y etanol se debería a una baja actividad de las enzimas respiratorias especialmente la piruvato deshidrogenasa, acetaldehído deshidrogenasa y la acetil-CoA sintetasa como resultado de la limitación de oxígeno en el medio (van Dijken et al. 1993), lo que a la vez conduce a una disminución de la tasa de respiración y a la estimulación del metabolismo fermentativo.

La producción de glicerol en medios con alta concentración de azúcar también estaría conectado al mecanismo de adaptación que utiliza la levadura frente al estrés osmótico y así prevenir su deshidratación (Andre et al. 1988). Sin embargo, también ha sido sugerido que la producción de glicerol no siempre es un factor relacionado a la osmorregulación (Tokuoka et al. 1992).

Así mismo, la formación de glicerol esta acoplado a la oxidación de NADH a NAD+, lo que causa un desbalance redox en el citosol (NADH:NAD+) el cual es corregido con la producción de ácido acético cuya síntesis reconvierte nuevamente NAD+ a NADH (Blomberg & Alder 1992; Remize et al. 1999).

Finalmente, la producción de glicerol también esta ligado a la

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Figura 1. Metabolismo típico de levaduras Crabtree negativas como Hansenula anomala: Respiratorio (––) y respirofermentativo (----).

1: Transporte de piruvato a la mitocondria, 2: Complejo piruvato deshidrogenasa, 3: Piruvato descarboxilasa, 4: Alcohol deshidrogenasa, 5: Acetaldehído deshidrogenasa, 6: Acetil CoA sintetasa (citoplasmático), 7: Acetil CoA sintetasa (mitocondrial), 8: Transporte de acetil CoA mediado por la vía carnitina. Formación de ésteres, 9: Acetiltransferasa, 10: éster sintasa, (adaptado de Fredlund et al.

2004a,b y van Dijken et al. 1993).

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Actividad fermentativa de Hansenula anomala y compuestos químicos de importancia sensorial

Efecto del etanol y sulfito en Hansenula anomala.- Hansenula anomala no es una levadura tolerante a altas concentraciones de etanol y ácido acético (Kalathenos et al. 1995, Fredlund et al. 2002). El etanol inhibe la viabilidad de las células, la tasa de crecimiento específico, y la tasa específica de fermentación (SaCorreia & Van Uden 1983, Pina et al. 2004, Ricci et al. 2004).

Se considera que el etanol provoca la disminución del contenido de esteroles en la membrana celular y esto afecta el transporte de azúcares. Así mismo, se cree que el etanol tendría un efecto inhibidor sobre la actividad del sistema hexoquinasa, enzimas responsables de transferir grupos fosfato de una molécula a otra en la glucólisis (Nagodawithana et al. 1977, D’Amore et al.

1990, Ricci et al. 2004).

En general, la tolerancia al etanol depende de la habilidad de la célula de levadura para exportar el etanol producido hacia el exterior, un proceso que depende de la composición y fluidez de la membrana citoplasmática (Nagodawithana & Steinkraus 1976). El dioxido de azufre se ha utilizado desde hace mucho tiempo como agente antimicorbiano durante la elaboración de vinos y otras bebidas fermentadas. Este compuesto inhibe el crecimiento de bacterias y ciertas levaduras, entre ellas las no-Saccharomyces (Beech 1979). La capacidad inhibitoria del SO2 esta influenciada por el pH del medio. El pH determina el equilibrio entre tres compuestos, el SO2, HSO-3, y SO=3. El SO2 es el responsable del efecto tóxico y su concentración en medio acuoso es favorecido a valores bajos de pH ya que provoca el desbalance del equilibrio hacia este compuesto (Jarvis & Lea 2000).

Los sulfitos tienen actividad a nivel del metabolismo energético, afectan la glucólisis, así bajas concentraciones conducen a una rápida reducción del contenido de ATP en la célula a bajos valores de pH. Las enzimas más afectadas serían la gliceraldehído3-fosfato deshidrogenasa y la alcohol deshidrogenasa (Maier et al.

1985). Así mismo, el sulfito sería responsable de la inhibición de la alcohol deshidrogenasa, enzima responsable de la reducción de acetaldehído a etanol durante la fermentación (Maier et al. 1985).

Producción de compuestos sensoriales por Hansenula anomala.- Hansenula anomala durante su crecimiento aerobio produce una variedad de compuestos volátiles. Esta especie es conocida por producir altas concentraciones de etil acetato y ácido acético (Romano et al. 1992, Grbin 1999, Plata et al.

2003). Los ésteres representan el mayor grupo de componentes aromáticos en bebidas alcohólicas fermentadas (Suomalainen 1981), y son producidos mediante reacción enzimática dentro de la célula. La principal enzima que cataliza la reacción es una acetiltransferasa (Malcorps et al. 1991, Yoshioka & Hashimoto 1984, Mason & Dufour 2000). En S.cerevisiae la síntesis de ésteres de acetato ha sido atribuído a la actividad de al menos tres acetiltransferasas: alcohol acetiltransferasa (AATasa), etanol acetiltransferasa e isomail alcohol acetiltransferasa (Lilly et al.

2000). La alcohol acetiltransferasa cataliza la reacción: acetil CoA + alcohol → CoA + acetil éster. Actúa sobre un rango de alcoholes alifáticos de cadena corta incluyendo metanol y etanol. La AATasa reacciona con la acetil-CoA y dependiendo del grado de afinidad con una variedad de alcoholes (Fujii et al.

1994). Por ejemplo, etil acetato es principalmente producido a partir de acetil CoA y etanol (Yoshioka & Hashimoto 1981).

La AATasa de S. cerevisiae es fuertemente reprimida bajo condiciones aerobias y por la adición de ácidos grasos insaturados en el medio (Malcorps et al. 1991, Fujii et al. 1997). Por otra Rev. peru. biol. 18(3): 325 - 334 (December 2011)

parte, se ha reportado que la actividad de la éster sintasa (esterasa reversa) en la síntesis de ésteres en S. cerevisiae es limitada. Etil caprilato y etil acetato serían producidos a partir de etanol y los respectivos ácidos grasos (Hilary & Peddie 1990, Plata et al.

1998, Rojas et al. 2002).

La vía de síntesis de ésteres en Hansenula anomala difiere de la vía usada por S. cerevisiae. Así, etil acetato se sintetiza preferentemente a partir de ácido acético y etanol mediante una reacción reversa de esterasa (Yoshioka & Hashimoto 1981, Rojas et al.

2002). Etil acetato se produce durante el crecimiento en glucosa y a diferentes niveles de aireación. El incremento de la oxigenación del medio reduce la producción de etil acetato (Tabachnick & Joslyn 1953, Fredlund et al. 2004a). Sin embargo, Rojas et al.

(2001) han reportado menor producción de etil e isoamil acetato a condiciones de limitación de oxígeno comparado a condiciones aerobias. Mucho antes ya se había reportado que la producción de etil acetato requiere la presencia de pequeñas cantidades de oxígeno, y que su sintesís se inhibe a condiciones totalmente anóxicas (Davies et al. 1951, Tabachnick & Joslyn 1953). Los ésteres de acetato se forman en altas concentraciones durante la fermentación temprana (Henschke & Jiranek 1993). Hansenula anomala también produce otros ésteres como etil propanoato y 2-feniletil acetato (Westall 1999). Debido a la solubilidad de los ésteres en lípidos, estos pueden atravezar de manera relativamente fácil la membrana celular. Sin embargo, la tasa de difusión depende de la longitud de la cadena, así por ejemplo el etil acetato se excreta rápida y completamente, mientras que la excreción de los demás ésteres etílicos disminuye dramáticamente a medida que incrementa la longitud de la cadena, desde 100% para etil hexanoato hasta 54 – 68% para etil octanoato y 8 – 17% para etil decanoato (Nykanen & Nykanen 1977). Finalmente, la tasa de formación de ésteres depende de la concentración de sus precursores y de la actividad de las enzimas incolucradas en la síntesis e hidrólisis (Swiegers & Pretorius 2005). De ahí que todos los parámetros que afectan la concentración de los precursores o la actividad de las enzimas involucradas pueden afectar la producción de ésteres.

Sin embargo, la producción de ésteres varía también entre cepas de una misma especie de levadura.

Las levaduras no-Sacccharomyces también producen diferentes niveles de alcoholes superiores. Altas concentraciones de estos afectan negativamente la calidad organoléptica por ejemplo en vinos, pero bajas concentraciones más bien confieren complejidad (Romano & Suzzi 1993). Estas levaduras frecuentemente producen bajas concentraciones de alcoholes superiores comparado a S. cerevisiae, pero hay una gran variabilidad entre cepas (Romano et al. 1992, Zironi et al. 1993).

Los alcoholes superiores son formados a partir de α-cetoácidos, los cuales derivan de la desaminación de los correspondientes aminoácidos (valina, leucina, isoleucina, fenilalanina, etc.) a travez de la vía de Ehrlich ó a partir del metabolismo de la glucosa como precursores en la síntesis de aminoácidos (Ouchi et al. 1980, Mauricio et al. 1997). Concentraciones de alcoholes superiores a 400 mg/L contribuirían negativamente a la calidad organoléptica especialmente en vinos (Rapp & Mandery 1987). A excepción de 2-feniletanol el cual presenta aroma floral (Ribereau-Gayon et al. 2006a), cuyo valor umbral de percepción es 10 mg/L (Rous et al. 1983), los demás alcoholes superiores imparten características sensoriales desagradables (Rapp & Mandery 1987, Ribereau-Gayon et al. 2006a).

327

Escalante et al.

El presente estudio descriptivo se realizó con la finalidad de contribuir al entendimiento del comportamiento fermentativo de Hansenula anomala RIVE 7-1-5 y la producción de compuestos químicos de interés organoléptico como potencial para su aprovechamiento en la producción de bebidas fermentadas.

Así mismo, se discute la influencia del oxígeno en la actividad metabólica y fermentativa y su repercusión en la síntesis de compuestos químicos de importancia sensorial.

Material y métodos Microorganismo.- Se utilizó Hansenula anomala RIVE 7-1-5 adquirido de la colección de levaduras del Instituto de Investigación de Viticultura y Enología, Bratislava-República Eslovaca, y fue mantenido en agar extracto de malta a 7 oC con renovación periódica cada 3 meses.

Fermentación de azúcares y tolerancia al metabisulfito de sodio.- En los ensayos de fermentación de azúcares se utilizó caldo tipo Saboraud 2% como medio de cultivo base en el cual se sustituyó sólo la fuente de carbono. La actividad fermentativa se determinó visualmente mediante la producción de gas, para ello se usó la técnica de tubos Durham. Los ensayos se realizaron por triplicado a 28 oC durante 96 horas. En los ensayos de tolerancia al metabisulfito de sodio se utilizó medio sintético de la siguiente composición: glucosa 50,0 g/L; KH2PO4 5,0 g/L; MgSO4.7H2O 0,4 g/L; (NH4)2SO4 2,0 g/L y extracto de levadura 1,0 g/L. La tolerancia al metabisulfito de sodio (Na2S2O5) se determinó mediante la capacidad de fermentar glucosa a diferentes concentraciones de Na2S2O5 en el medio. El Na2S2O5 se adicionó de acuerdo al pH del medio: 100 mg/L al medio de pH 3,3; 150 mg/L al medio de pH 3,65 y 200 mg/L al medio de pH 4,24. En la evaluación de la fermentación se utilizaron tubos Durham y se observó visualmente la producción de CO2 hasta las 72 horas. Todos los ensayos se realizaron a 28 oC y por triplicado.

Producción de etanol.- Para los ensayos de producción de etanol se adquirió jugo de manzana concentrado, esterilizado por ultrafiltración y aroma removido de Severofrukt a.s., Terezin, República Checa. La remoción del aroma se realizó durante el proceso de concentrado en un evaporador provisto de una columna de separación de volátiles. El jugo concentrado así como el aroma obtenido fue entregado por separado al grupo de investigación. El jugo concentrado se reconstituyó con agua desionizada estéril hasta una concentración de azúcares totales de 12,8% w/v y pH 3,8 para utilizarlo como medio de fermentación. Los ensayos se realizaron en frascos Erlenmeyer de 1 L conteniendo 0,5 L de medio de cultivo. Las fermentaciones se llevaron a cabo en cultivo estático y agitado a 16 oC y 28 oC respectivamente. Las fermentaciones en cultivo agitado se realizaron en frascos agitados a 200 min-1 en un agitador orbital. Las fermentaciones en cultivo estático se consideraron terminadas cuando no se observó producción de CO2 y aquellas en cultivo agitado, el tiempo de cultivo fue el equivalente al tiempo utilizado durante la fermentación en cultivo estático.

El inóculo se propagó utilizando medio de cultivo de la misma composición. Los frascos Erlenmeyer se agitaron a 200 min-1, durante 48 horas, la temperatura de cultivo fue 28 oC. Así, el medio de fermentación se inoculó con 14,0 % v/v de inóculo. Finalmente, el contenido de etanol producido se determinó mediante picnometría. Todos los ensayos se realizaron por triplicado.

328

Síntesis de compuestos de importancia sensorial Preparación de inóculo y condiciones de fermentación.Jugo de manzana reconstituido y aroma removido (explicado anteriormente) se ha utilizado como medio de fermentación.

Las fermentaciones se realizaron en cultivo agitado y estático en frascos Erlenmeyer de 0,5 L conteniendo 250 mL de medio.

En las fermentaciones en cultivo agitado los frascos se agitaron a 200 min-1 durante 8 días y, aquellos en cultivo estático el tiempo de fermentación fue de 15 días. Los experimentos se realizaron a 28 oC. La propagación del inóculo se llevo a cabo en 100 mL de jugo de manzana estéril a 28 oC durante 24 horas, los frascos se agitaron a 200 min-1 en un agitador orbital. Las células se separaron por centrifugación (3000 min-1 durante 10 minutos) y se lavaron tres veces con solución fisiológica estéril. Los medios de fermentación se inocularon con 1,0±0,1 g de células en peso húmedo.

Cultivo batch en biorreactor.- Como medio de cultivo se utilizó jugo de manzana variedad Rubin con un contenido de azúcares totales de 13% en peso y pH 3,8. Las manzanas fueron adquiridas de la distribuidora de frutas y hortalizas Fruit-CZ, Praga, República Checa. Luego de la extracción, el jugo se vertió en envases estériles de 10 L y se pasteurizó en un termostato a 65 – 70 oC durante 12 horas (incluyendo el tiempo de enfriado) con la finalidad de eliminar la flora microbiana y además todos los compuestos volátiles varietales (El-Nemra et al. 1988, Su & Wiley 1998). Al jugo de manzana se suplementó con KH2PO4 1,2 g/L y (NH4)2SO4 1,2 g/L como fuente de fósforo y amonio para promover el crecimiento de la levadura.

Los cultivos se realizaron en un biorreactor (BIOSTAT–B. Braun International, Alemania) de 2 L conteniendo 1,5 L de medio de cultivo. El biorreactor estuvo conectado a una unidad de regulación y medición micro-DCU-300 y además estuvo equipado con un agitador, medidor de pH, termómetro y un electrodo de medición de oxígeno disuelto. Los parámetros considerados en el cultivo los cuales fueron mantenidos constante a lo largo del proceso fueron: temperatura 18 oC, frecuencia de agitación 300 min-1 y flujo de aire 25 L/h (0,2 moles O2/h). El tiempo de cultivo se dejó hasta el incremento de la concentración de oxígeno disuelto en el medio a su valor inicial.

El inóculo se propagó en 80 mL de medio sintético de la siguiente composición: glucosa 8,0 g/L; peptona 10,0 g/L; KHPO4 1,2 g/L; (NH4)2SO4 1,2 g/L y extracto de levadura 10,0 g/L, 2 el pH se ajustó a 3,6. La propagación de células se llevo a cabo en un agitador orbital a 150 min-1 durante 48 horas a 28 oC. Las células se separaron por centrifugaron (3000 min-1 durante 10 minutos), se lavaron tres veces con solución fisiológica estéril y, finalmente las células obtenidas se inocularon en el biorreactor.

Métodos analíticos y presentación de resultados Los compuestos volátiles producidos durante la fermentación (alcoholes superiores y ésteres) se analizaron en un cromatógrafo de gas (Hewlett-Packard 5890II), equipado con una columna HP5 (30m x 0,32mm) y un detector FID. Las muestras fermentadas por triplicado se centrifugaron y filtraron en una membrana de microfiltración de 0,45 µm de porosidad, luego se extrajeron los compuestos volátiles mediante el método de microextracción con diclorometano (Ortega et Rev. peru. biol. 18(3): 325 - 334 (Diciembre 2011)

Actividad fermentativa de Hansenula anomala y compuestos químicos de importancia sensorial Tabla 2. Producción de etanol por Hansenula anomala RIVE 7-1-5 en cultivo estático y agitado en jugo de manzana a 16 oC y 28 oC.

al. 2001). Finalmente, 1 μL de cada extracto se inyectó en el cromatógrafo.

El ácido acético, succínico, málico, etanol, glicerol, fructosa y glucosa se analizaron en un HPLC (Pump LCP 4000), equipado con una columna Watrex 250 x 8mm (Ostion LGKS 0800 H+) y un detector RID. En el análisis se utilizó 0,005M de H2SO4 como fase móbil a una tasa de flujo de 1 mL/min.

Las muestras fermentadas por triplicado luego de ser filtradas y centrifugadas se diluyeron con agua desmineralizada (1:3) y se inyectaron al equipo.

Tipo de cultivo

Temperatura de fermentacion (oC)

Etanol producido (%v/v)

Agitado Agitado Estático Estático

16 28 16 28

4,69 ± 0,1 2,35 ± 0,1 3,05 ± 0,1 5,81 ± 0,1

para dar formación a compuestos típicos de la fermentación alcohólica. En la Tabla 2 se muestra las concentraciones de etanol producido por Hansenula anomala RIVE 7-1-5. Se ha observado una mayor producción de etanol en cultivo estático (5.81±0,1% v/v) a 28 oC. La agitación del medio disminuyó la producción de etanol dramáticamente en cultivos a 28 oC y un efecto contrario se observó a 16 oC. Así mismo, la diminución de la temperatura afectó sustancialmente la producción de etanol en cultivo estático, sin embargo esto no sucedió en cultivo agitado donde la producción de etanol incrementó de 2,35±0,1 a 4,69±0,1% v/v. Esta cepa es capaz de producir hasta 5,8±0,1% v/v de etanol que es una cantidad suficiente para producir bebidas con contenido medio de etanol (por ejemplo cidras).

Nuestros resultados demuestran que algunas cepas de Hansenula anomala pueden producir concentraciones de etanol por encima de 5% v/v contrariamente a lo encontrado por Kalathenos et al.

(1995) y Fredlund et al. (2002). La disminución de producción de etanol en cultivo agitado (al menos a 28 oC) se debería al efecto del oxígeno incorporado al medio durante la agitación.

Esto explica que Hansenula anomala RIVE 7-1-5 prefiere oxidar la glucosa en presencia de oxígeno antes que fermentarla. Para casos prácticos la producción de etanol podría ser controlado mediante la tasa de aireación.

La biomasa celular se determinó mediante gravimetría. Las células se separaron por centrifugación a 3000 min-1 durante 10 minutos, se lavaron 3 veces con agua destilada luego se secaron a 110 °C durante 2 horas y finalmente se pesaron. Además, se determinaron el coeficiente global de rendimiento de biomasa YX/S y la tasa de crecimiento (µ) respectivamente (van Hoek et al. 1998). Los ensayos y análisis se realizaron por triplicado, los resultados se presentan como los promedios y su desviación estandard.

Resultados y discusión Fermentabilidad de azúcares y tolerancia al etanol y metabisulfito de sodio.- Las levaduras difieren en su capacidad de fermentar azúcares, esta característica es fundamental para definir su utilidad en procesos fermentativos. Como se muestra en la Tabla 1, Hansenula anomala RIVE 7-1-5 es capaz de fermentar glucosa, fructosa y manosa. Estos azúcares generalmente estan presentes en los jugos de fruta. La fermentación de sucrosa y maltosa es una característica interesante ya que puede fermentar también medios que contengan estos azúcares, por ejemplo mostos a base de cereales.

La capacidad inhibitoria del SO2 esta influenciada por el pH del medio (Jarvis & Lea 2000). Como se observa en la Tabla 1, la actividad fermentativa de Hansenula anomala RIVE 7-1-5 ha sido inhibida totalmente a concentraciones de metabisulfito de sodio (precursor de SO2) incluso hasta 100 mg/L. La utilización de dioxido de azufre (SO2) en el caso de la producción de vinos esta regulado debido a los posibles efectos tóxicos que produce.

La OIV (Organización Internacional de la Viña y el Vino) recomienda dosis entre 150–400 mg/L de sulfito, dependiendo del tipo de vino (Ribereau-Gayon et al. 2006b).

La temperatura juega un rol importante en la producción de compuestos secundarios durante la fermentación. En la producción de vinos blancos y cervezas por ejemplo se prefiere temperaturas bajas de fermentación ya que influye positivamente en la síntesis de compuestos químicos de importancia sensorial (Torija et al. 2003). Para casos prácticos la producción de etanol por Hansenula anomala RIVE 7-1-5 podría ser controlado ajustando la temperarura y la aireación del medio de fermentación.

Síntesis de compuestos de importancia sensorial.- La variación de parámetros que dan paso a la fermentación conducen a la producción de etanol y otros compuestos químicos de importancia sensorial. En la Tabla 3 se muestra las concentraciones de los compuestos producidos por Hansenula anomala RIVE 7-1-5 durante cultivo estático y agitado, así mismo se muestra con fines de comparación los principales compuestos encontrados en cidras y jugo de manzana. Un ligero incremento de glicerol

Producción de etanol.- Las levaduras oxidativas cultivadas bajo limitación de oxígeno producen etanol debido a la interrupción de su actividad respiratoria. La respiración y la fermentación suceden simultaneamente, la concentración de oxígeno determina el balance entre ambos metabolismos. Sin embargo, en un metabolismo mixto la generación de energía disminuye y como resultado también la tasa de crecimiento,

Tabla 1. Fermentación de azúcares, y tolerancia al metabisulfito de sodio por Hansenula anomala RIVE 7-1-5 cultivado en medio sintético a 28 oC. Producción de CO2: intenso: +++, moderado: ++, débil: + Concentración de azúcar, etanol y metabisulfito de sodio Tipo de azúcar (2%) glucosa

galactosa

fructosa

maltosa

sucrosa

rafinosa

almidón

xilosa

manosa

+++

+

+++

++

++

–

–

–

+++

Fermentación en Na2S2O5 (mg/L) Control (sin Na2S2O5)

100 mg/L (pH: 3,3 )

150 mg/L (pH: 3,65 )

200 mg/L (pH: 4,24)

+++

–

–

–

Rev. peru. biol. 18(3): 325 - 334 (December 2011)

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Escalante et al.

Tabla 3. Compuestos de importancia sensorial producidos por Hansenula anomala RIVE 7-1-5 cultivado en jugo de manzana a 28oC en cultivo estático y agitado, además compuestos típicos encontrados en cidras y jugos de manzana.

Compuestos(mg/L) Glicerol * 1-Propanol 1-Butanol 2-Butanol 2-Metil-propanol 3-Metil-butanol 2-Metil-butanol 2-feniletanol Etil acetato Butil acetato Isoamilacetato Etil decanoato Acido acetico Acido succinico*

Tipo de cultivo de Hansenula anomala RIVE 7-1-5a Agitado Estático 1,4 ± 0,15 1,5 ± 0,4 19,0 ± 3,0 41,0 ± 4,0 23,2 ± 1,2 9,7 ± 1,2 3,0 ± 1,0 1,0 ± 0,3 218,0 ± 8,0 83,0 ± 6,0 228,0 ± 9,0 54,0 ± 6,0 162,0 ± 5,0 28,0 ± 3,0 26,0 ± 4,0 31,0 ± 3,0 206,0 ± 8,0 102,0 ± 6,0 n.d tr 1,7 ± 0,4 n.d 2,3 ± 0,5 4,6 ± 0,8 196,0 ± 7,0 366,0 ± 10,0 0,74 ± 0,10 0,7 ± 0,12

Compuestos analizados en cidras fermentadas con Saccharomyces cerevisiae 4,05 ± 0,131; 2,59 ± 1,72 20,01 ± 0,351; 27,3 ± 13,02 6,99 ± 0,041; 6,1 ± 0,72 – 22,17 ± 0,081; 34,8 ± 8,92 232,00 ± 13,803 94,8 ± 0,2+; 173,0 ± 41,1+ 7,8 ± 0,391; 131,5 ± 55,32 231,06 ± 33,091; 114,6 ± 35,52 0,27 ± 0,024 16,66 ± 1,04 1,50 ± 0,094 900,0 ± 140,01; 282,93 ± 16,94 200,0 ± 30,01; 0,5 ± 0,062

Compuestos analizados en jugos de manzana 0,05 7,06 4,50 ± 0,234 – 0,75 ± 0,044 2,11 ± 0,114 9,06 0,46 ± 0,024 0,57 ± 0,034 0,58 ± 0,034 2,48 ± 0,124 0,01 ± 0,0024 0,05 0,05

*g/L., tr.: trazas., n.d: no detectado., aResultados obtenidos en este estudio. 1Valores de cidras fermentadas con S.cerevisiae (Suarez et al. 2005). 2Valores de cidras analizados en el año 1998 (Picinelli et al. 2000). 3Valores de cidras fermentadas con S.cerevisiae (Jarvis et al. 1995). 4Valores promedios (Wang et al. 2004). 5Valores promedios (Cabranes et al. 1998). 6Valores promedios (Souci et al. 2000). +Contenido de alcoholes amílicos: 3-Metil-butanol+2-Metil-butanol (Suarez et al. 2005; Picinelli et al. 2000). Compuestos no reportados (–).

se observó en cultivo estático (1,5±0,4 g/L), comparado con el cultivo agitado (1,4±0,15 g/L). La disminución se debería en parte a que el metabolismo aerobio promueve la respiración celular disminuyendo así la producción de glicerol. Sin embargo, su producción también sería una respuesta al estrés osmótico del medio de fermentación debido a la alta concentración de azúcar. Una mayor producción de glicerol sería favorable para el perfil sensorial de la bebida fermentada ya que impartiría un ligero sabor dulce (Nieuwoudt et al. 2002).

Con respecto a la producción total de alcoholes superiores se observa que en cultivo agitado se produjo mayor cantidad (679,2 mg/L) comparado al cultivo estático (247,7 mg/L); la mayor producción se debería al efecto del oxígeno incorporado al medio durante la agitación. El oxígeno promueve el metabolismo respiratorio y como consecuencia un mayor flujo de glucosa y aminoácidos, cuya degradación produce compuestos intermediarios (cetoácidos) de la síntesis de alcoholes superiores (Ribereau-Gayon et al. 1975; Valero et al. 2002). Otros factores que incrementan la producción de alcoholes superiores incluyen la clarificación del mosto, la madurez de la fruta, la temperatura entre otros (Ough et al. 1966; Blanco et al. 1992; Mangas et al. 1994).

Los ésteres imparten el aroma frutal en las bebidas fermentadas, por esta razon su presencia determina en parte la calidad sensorial. El etil acetado es el éster de mayor importancia por su concentración. Como se muestra en la Tabla 3, la mayor producción de etil acetado por Hansenula anomala RIVE 7-1-5 se observó en cultivo agitado (206,0±8,0 mg/L). La tasa de formación de etil acetato estaría relacionado con la disponibilidad de ácido acético, etanol y, además de la actividad de la ester sintasa necesarios para su formación (Yoshioka & Hashimoto 1981, Rojas et al. 2002). Por otro lado, la concentración de ácido acético en cultivo agitado (196,0±10,0mg/L) resultó ser menor comparado al cultivo estático (366,0±10,0mg/L), lo que indicaría que la tasa de formación de etil acetato en cultivo agitado ha sido suficientemente alta para convertir el ácido acético en etil acetato. El incremento de la síntesis de ácido acético también esta unido a la producción de glicerol (Prior et al. 2000).

330

Nuestros resultados concuerdan con lo reportado por Rojas et al. (2001) quienes reportaron que la aireación promueve una mayor síntesis de etil acetato e isoamil acetato. Sin embargo Fredlund et al. (2004a) reportaron un efecto contrario de la aireación en Hansenula anomala. La mayor formación de etil acetado en cultivo agitado con Hansenula anomala RIVE 7-15 involucraría otros factores propios de la cepa. Por otra parte, también se ha observado la producción de isoamil acetato y etil decanoato en concentraciones menores. La producción de estos ésteres es ventajosa si se desea producir bebidas no tradicionales con aromas especiales. En el caso de la fermentación de vinos la presencia de etil acetato en concentraciones menores a 80 mg/L contribuye positivamente al aroma y sabor (Ribereau-Gayon 1978). Altas concentraciones de etil acetato sobre 200 mg/L imparte un sabor a vinagre (Dequin et al. 2003).

Así mismo, se ha observado la formación de ácido succínico tanto en cultivo agitado (0,74±0,10 mg/L) como estático (0,7±0,12 mg/L). Este ácido contribuye a la acidez total de la bebida. En presencia de oxígeno el ácido succínico se produce normalmente como un intermediario del ciclo de Krebs ó bien por la actividad de las enzimas relacionadas al ciclo de Krebs cuya síntesis no sería inducida por el oxígeno (Arikawa et al. 1999).

Los cultivos agitados en frascos Erlenmeyer presentan limitaciones en la transferencia de oxígeno (Gupta & Rao 2003, Tolosa et al. 2002), esto provocaría un metabolismo respirofermentativo mixto en Hansenula anomala RIVE 7-1-5 con la consecuente variabilidad en la producción de productos de la fermentación.

Los factores que influyen en la transferencia de oxígeno incluyen la relación volumen del frasco Erlenmeyer/volumen del medio de cultivo, diametro del cuello del frasco e inclusive el tipo y las características del tapón (Nikakhtari & Hill 2006).

Cultivo batch en biorreactor.- La Figura 2 muestra el transcurso del consumo de oxígeno, el crecimiento celular y la variación del pH durante 11 días de cultivo de Hansenula anomala RIVE 7-1-5. El oxígeno es el factor más importante que determina el balance entre la actividad respiratoria y fermentativa en esta levadura. A concentraciones inferiores a la concentración Rev. peru. biol. 18(3): 325 - 334 (Diciembre 2011)

Actividad fermentativa de Hansenula anomala y compuestos químicos de importancia sensorial Tabla 4. Compuestos utilizados y producidos por Hansenula anomala RIVE 7-1-5 durante el cultivo batch en biorreactor a 18 oC. Concentración inicial de componentes (g/L) fructosa

glucosa

sucrosa

70,95

22,6

35,5

ác. málico 5,02 Compuestos finales (g/L)

fructosa

glucosa

etanol

glicerol

ác. acético

ác. sucínico

ác. málico

0,24±0,04

1,9±0,2

0,0

0,91±0,05

4,2±0,3

0,26±0,05

4,6±0,5

Alcoholes superiores y etil acetato producidos (mg/L) 1-propanol

propil acetato

2-metil propanol

3-metil butanol

2-metil butanol

Etil acetato

1,0±0,2

0,0

0,0

0,0

0,0

9,7±0,5

Azúcar utilizado (S), biomasa final (X), rendimiento (YX/S, YE/S), tasa de crecimiento (µ) S

X

YX/S

YE/S

µ

127,0

11,5

0,11

0,0

0,13

YX/S: g. de biomasa/gr. azúcar; YE/S: g. de etanol/gr. azúcar; µ: tasa de crecimiento (h-1); X: biomasa seca final (g/l); S: azúcar total consumido (g/L).

El agotamiento rápido del oxígeno indica que esta cepa manifiesta un metabolismo aerobio pero que probablemente experimenta limitación de oxígeno, en este caso se recomienda trabajar a concentraciones de saturación o exceso de oxígeno si se desea suprimir al máximo la actividad fermentativa. En este caso la producción de etanol se acercaría a cero.

Además, se observa un incremento gradual de biomasa celular alcanzando un valor de 11,5 g/L al final del cultivo (Tabla 4). Estequiométricamente este valor es inferior a lo esperado, esto sugiere que la fuente de carbono no solamente habría sido utilizado para el crecimiento, sino en algún otro proceso como en “maintenance” (Beeftink et al. 1990), o en la formación de productos de la fermentación. Sin embargo en los compuestos residuales al final del cultivo no reporta etanol, además bajos niveles de glicerol (0,91±0,05 g/L) y alta concentración de ácido acético (4,2±0,3 g/L). La producción de ácido acético a condiciones aerobias ha sido reportado por Fredlund et al.

(2004 a,b), sin embargo concentraciones tan elevadas sería una característica aún no reportada.

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La ausencia de muchos compuestos de la fermentación como por ejemplo alcoholes superiores y además la baja cantidad de algunos de ellos indicarían que el metabolismo ha sido predominantemente respiratorio (Tabla 4). En todo caso, el etanol probablemente producido durante el cultivo podría haber servido como fuente de carbono al agotarse los azúcares fermentables. Al final del cultivo, el incremento del porcentaje de oxígeno disuelto estaría conectado al agotamiento de la fuente de carbono que limitaría el crecimiento y así el consumo de oxígeno.

Reportes anteriores mostraron la utilización de Hansenula anomala junto a otras levaduras no-Saccharomyces en la producción de vinos de bajo contenido alcohólico (3% v/v) en envases 16

120

14

100

12 80

10 8

60

6

40

pH, biomasa seca (g/L)

Como se observa en la Figura 2 luego de las 10 horas la concentración de oxígeno disuelto en el medio cayó a cero y así permaneció hasta las 250 horas. Esto significa que el oxígeno transferido al medio ha sido consumido en su totalidad, sin embargo este valor no da información de la tasa de consumo de oxígeno. El oxígeno es poco soluble en agua pura (9,1 mg/L, 20 oC) y a medida que la temperatura y la viscocidad del medio incrementa la solubilidad disminuye. La tranferencia de oxígeno al medio es crucial y depende de muchos factores, entre ellos, el flujo de aire, la velocidad de agitación, la composición química del medio, la geometría del biorreactor, entre otros. El oxígeno consumido es utilizado mayormente en la respiración es decir en la oxidación de la glucosa, pero también en vías no respiratorias como en la síntesis de esteroles y ácidos grasos insaturados que son componentes esenciales de la membrana celular (Rosenfeld & Beauvoit 2003).

Así mismo, no se ha observado una variación significante del pH (de 3,64 a 3,09) al final del proceso. La variación del pH esta asociado con el proceso de crecimiento celular y la actividad metabólica como la principal causa del intercambio de protones en el medio. También no se ha observado una disminución significante del contenido de ácido málico, lo que significaría que esta cepa utiliza limitadamente este ácido en presencia de oxígeno. Sin embargo, Corte-Real et al. (1990) y Corte-Real y Leao (1990) reportaron la utilización de ácido málico por Hansenula anomala. Desde el punto de vista práctico concentraciones de oxígeno que conducen principalmente al metabolismo respiratorio debe ser evitado.

%pO2

crítica la velocidad de respiración es dependiente de la concentración de oxígeno, por el contrario a concentraciones superiores es independiente (Johnson 1976). En presencia de oxígeno como subtrato, la relación entre la tasa de crecimiento y concentración de oxígeno en el medio sigue la cinética de Michaelis Menten (Johnson 1976). La concentración crítica de oxígeno para levaduras es muy baja, en el orden de 0,12mg/L a 20oC.

4 20 0

2 0

50 %pO2

100

150 tiempo (h) pH

200

250

0

biomass g/L

Figura 2. Cultivo batch de Hansenula anomala RIVE 7-1-5 en biorreactor a 18 °C y con flujo de aire 25 L/h.

331

Escalante et al.

aireados. Sin embargo, la agitación resultó en el incremento de biomasa celular y la disminución de la producción de etanol (Erten & Campbell 2001).

Conclusiones Hansenula anomala RIVE 7-1-5 tiene una gran capacidad de fermentar azúcares comunmente encontrados en frutas y en mostos preparados a base de cereales, característica que la hace interesante para su aprovechamiento y utilización en fermentación de bebidas. Su sensibilidad al SO2 es importante ya que concentraciones de 100 mg/L sería suficiente para inhibibir su actividad fermentativa en caso que sea necesario. Así mismo, su capacidad de producir etanol hasta 5,81±0,1 % v/v la hace adecuada para producir bebidas con bajo contenido alcohólico.

Sin embargo, la producción de etanol puede ser controlada mediante la tasa de agitación y la temperatura. Temperaturas de 16 oC con agitación de 200 min-1 o menos se recomienda.

Por otro parte, la aireación promueve una mayor producción de alcoholes superiores y etil acetato, lo que no sucede con ácido acético. Así mismo, la tasa de agitación puede utilizarse para controlar la tasa de aireación y así balancear la producción de compuestos de importancia sensorial. Con la finalidad de producir bebidas fermentadas no tradicionales se recomienda airear intermitentemente el medio de fermentación para conseguir la mayor producción de compuestos volátiles de interés sensorial.

La demanda por bebidas fermentadas con características sensoriales particulares hace a las levaduras no-Saccharomyces oxidativas aprovechables. El suministro constante y controlado de oxígeno (0,2 moles/h) desvía el metabolismo fermentativo hacia el oxidativo, sin embargo el oxígeno disuelto bajo estas condiciones no provoca un metabolismo enteramente oxidativo.

La concentración de oxígeno es el factor clave que determina la formación de compuestos de la fermentación alcohólica al menos en esta cepa de levadura.

Finalmente, bebidas fermentadas no tradicionales con altas concentraciones de compuestos aparentemente indeseables pueden parecer placenteros para algunos y lo opuesto para otros.

Agradecimientos Los autores agradecen a la colección de levaduras del Instituto de Investigación de Viticultura y Enología, Bratislava, República Eslovaca por proporcionarnos la cepa de levadura estudiada.

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Rev. peru. biol. 18(3): 335 - 341 (Diciembre 2011) © Facultad de Ciencias Biológicas UNMSM

Inmunogenicidad del veneno de Bothrops atrox ISSN 1561-0837

Inmunogenicidad del veneno de Bothrops atrox (Ophidia: Viperidae) y su evaluación por métodos inmunoenzimáticos Immunogenicity of Bothrops atrox (Ophidia: Viperidae) venom and its evaluation by immunoenzymatic methods

1Laboratorio de Biología Molecular.

Facultad de Ciencias Biológicas.

Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Lima – Perú.

2Instituto de Medicina Tropical “Daniel Alcides Carrión”. Facultad de Medicina Humana. Universidad Nacional Mayor de San Marcos.

Lima - Perú. *Correspondencia: Dr. Armando Yarlequé, Laboratorio de Biología Molecular, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, apartado postal 110058, Lima 11, Perú.

E-mail: ayarleque48@gmail.com

Gustavo A. Sandoval1, Julio Mendoza1, William Roldán2, Yrma Espinoza2, Hilda Solis2, Armando Yarlequé*1 Resumen Se estudió la inmunogenicidad del veneno de la serpiente Bothrops atrox, “jergón”, utilizando los métodos inmunoenzimáticos de ELISA y Western Blot, así como los patrones de reactividad cruzada empleando los venenos de las serpientes Bothrops brazili, Lachesis muta y Crotalus durissus. Para este fin se inmunizaron conejos albinos Nueva Zelanda (2 kg aprox) con cuatro dosis de 500 μg del veneno de B. atrox en un periodo de 90 días. La producción de anticuerpos fue monitoreada mediante la técnica de ELISA, determinándose el título del suero hiperinmune obtenido al final del protocolo de inmunización. Adicionalmente se analizaron los patrones electroforéticos de los venenos en estudio mediante PAGE-SDS y su reactividad frente al suero obtenido mediante ELISA y Western Blot. El esquema de inmunización utilizado permitió una producción sostenida de anticuerpos a partir del día 20 del protocolo. Finalizado este proceso, el título del suero fue calculado en 256000, lo cual mostró la eficacia y practicidad del procedimiento desarrollado. Por otro lado, los venenos estudiados mostraron una heterogeneidad en su composición proteica a partir del análisis de sus patrones electroforéticos, mientras que a partir de los estudios inmunoenzimáticos, se pudo obtener valores de reactividad cruzada entre el veneno de B. atrox y los venenos de B. brazili, L. muta y C. durissus, de 23,7%, 4,0% y 1,8%, respectivamente. Los resultados obtenidos constituyen el paso inicial para posteriores ensayos dirigidos a la optimización en la producción de inmunosueros para el tratamiento del envenenamiento, así como para el desarrollo de kits de diagnóstico e identificación de especies de serpiente.

Palabras claves: inmunogenicidad, veneno, Bothrops atrox, ELISA, Western Blot, reactividad cruzada.

Abstract Presentado: 12/02/2011 Aceptado: 23/07/2011 Publicado online: 08/02/2012

The immunogenicity of Bothrops atrox, “jergón”, venom was studied using ELISA and Western Blot methods, as well as cross-reactivity patterns against venoms of Bothrops brazili, Lachesis muta and Crotalus durissus.

For this purpose, New Zealand white rabbits (2 kg aprox) were immunized with four 500 µg doses of B. atrox venom in a period of 90 days. Antibody production was followed using ELISA technique, and title of hiper-immune serum was determined at the end of immunization protocol. Additionally, electrophoretic patterns of venoms were analyzed by SDS-PAGE and venom reactivity against obtained serum by ELISA and Western Blot. Immunization schedule allowed a pronounced antibody production since day 20 of protocol. At the end of process, serum title was 256000, which demonstrated both efficacy and usefulness of the developed procedure. On the other hand, studied venoms showed a heterogenic protein composition according to their electrophoretic patterns, whereas cross-reactivity values of 23,7%, 4,0% and 1,8% were obtained between B. atrox venom and B. brazili, L. muta and C. durissus venoms, respectively, using immunoenzymatic methods. According to our results, this procedure constitutes an initial step for further assays directed to optimization in immunoserum production for envenoming treatment and development of kits for diagnosis and species identification of snakes.

Keywords: immunogenicity, venom, Bothrops atrox, ELISA, Western Blot, cross-reactivity.

Introducción Los venenos de serpientes son mezclas complejas de sustancias, principalmente proteínas, producidas por una glándula sero – mucosa, e inoculados mediante un aparato especializado compuesto por colmillos acanalados los cuales ingresan por presión en los tejidos. Debido a su acción tóxica, estas proteínas han sido clasificadas como miotoxinas, hemorraginas, nefrotoxinas, neurotoxinas y toxinas coagulantes; sin embargo, debido a su variada acción farmacológica y a sus propiedades farmacocinéticas, Chippaux y Goyffon (1998) agruparon estas sustancias en dos categorías: a) toxinas, que son polipéptidos con un peso molecular menor a 30 kDa, abundantes en los venenos de serpientes de la familia Elapidae; y b) enzimas, las cuales poseen un peso molecular mayor a 30 kDa y constituyen el componente principal del veneno de serpientes de la familia Viperidae.

Las ponzoñas procedentes de la familia Viperidae causan principalmente hemorragia, edema, mionecrosis y disturbios en la coagulación, siendo la incidencia mundial anual de morRev. peru. biol. 18(3): 335 - 341 (December 2011)

dedura por serpientes de 5 millones de habitantes (Chippaux y Goyffon, 1991) con cálculos de muertes estimados entre 60 a 80 mil (Warrell, 1996). Por ello, el ofidismo constituye un problema de salud pública para los países que cuentan con una fauna ponzoñosa muy variada, tal como ocurre en el Perú (Yarlequé 2000).

En nuestro país, las mordeduras por serpientes se producen en su mayoría en las zonas silvestres de selva alta y baja y en numerosos reportes se consigna a los especímenes de la familia Viperidae como las principales agresoras (Lévano & Fernández 2004). Dentro de éstas, se considera a la especie Bothrops atrox “jergón” como la más común para la zonas selváticas, B. brazili “jergón shushupe” localizada principalmente en la selva norte, Lachesis muta “shushupe”, que habita diversas regiones de la selva amazónica y Crotalus durissus “cascabel” restringida al valle de Sandia, provincia de Puno. De estas serpientes, es de especial interés la especie B. atrox por ser la serpiente de mayor peligro y la causante entre el 88 y 92% de accidentes ofídicos registrados en el país (Loja, 2000).

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Sandoval et al.

Frente al envenenamiento ofídico, la seroterapia es la única alternativa específica para contrarrestar su acción, por ello se producen antivenenos mediante hiperinmunización de animales seroproductores (por ejemplo, caballos, ovejas, cabras, etc.), usando venenos de especies de serpientes taxonómicamente cercanas (Theakston et al. 2003). A pesar de la efectividad en el tratamiento, se pueden presentar reacciones alérgicas tardías producto de la inoculación del antiveneno. En el caso de los antivenenos producidos en el Perú, el Instituto Nacional de Salud elabora un antiveneno botrópico polivalente mediante la inoculación de caballos con una mezcla de venenos de las serpientes B. atrox, B. brazili, B. pictus, B. barnetti y B. hyoprora, el cual resulta efectivo en la neutralización de los daños locales producidos durante el envenenamiento, pero presenta propiedades limitadas para reducir el edema y la necrosis (Rojas et al. 2005). Así, se requiere de un mejor conocimiento de las propiedades inmunogénicas de los componentes proteicos de los venenos de serpientes, la cual puede lograrse con la aplicación de técnicas inmunoenzimáticas como el análisis por Western Blot y el ELISA (EnzymeLinked Immunosorbent Assay), en las cuales la reactividad de un antígeno es valorada cualitativa y cuantitativamente.

Por este motivo, en el presente trabajo se ha realizado un estudio de la inmunogenicidad del veneno de la serpiente Bothrops atrox (Linnaeus, 1758), y luego se evaluó la reactividad cruzada del suero hiperinmune producido contra los venenos de otras serpientes peruanas de la familia Viperidae, mediante técnicas inmunoenzimáticas. Estos resultados contribuirán al mejoramiento de la calidad de los antivenenos polivalentes comerciales producidos en el Perú.

Materiales y métodos Material biológico.- Se empleó el veneno de la serpiente Bothrops atrox obtenido a partir de ejemplares procedentes de Pucallpa – Ucayali y mantenidos en el Serpentario “Oswaldo Meneses” – Museo de Historia Natural – UNMSM. El veneno fue extraído por presión manual, después liofilizado y mantenido a 4 °C hasta su uso. Para evaluar la reactividad cruzada se emplearon venenos de las especies: B. brazili, L. muta y C. durissus, procedentes de ejemplares mantenidos en el mismo serpentario.

Para la obtención del suero hiperinmune se emplearon conejos albinos machos Nueva Zelanda (2,5 kg de peso aprox.), los cuales fueron mantenidos en el Instituto de Medicina Tropical Daniel Alcides Carrión de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos.

zar el protocolo de inmunización, la sangre se obtuvo mediante punción cardiaca, a fin de evaluar la presencia de anticuerpos reactivos en el suero contra el veneno en estudio.

Detección de anticuerpos contra el veneno de B. atrox y cálculo del título de anticuerpos.- Se realizó mediante la técnica de ELISA (Engvall & Perlmann 1971), siguiendo el método de titulación a punto final (Alzamora et al. 2002). Para ello se emplearon placas de 96 pocillos (Nunc – ImmunoTM, Dinamarca) cubiertas con 100 μL/pocillo de veneno de B. atrox (0,25 μg/mL) disuelto en buffer de cubierta (carbonato de sodio 0,015 M; bicarbonato de sodio 0,035 M; pH 7,6), durante una noche a 4 °C. Después de tres lavados sucesivos empleando buffer de lavado (NaCl 0,15 M, Tween-20 0,05%), se aplicó en los pocillos buffer de bloqueo (leche descremada al 3%, Tween-20 0,05% en PBS pH 7,4) por 1 h a 37 °C. Luego de tres lavados, se aplicaron 100 μL/pocillo de suero de conejo obtenido a los días 0, 10, 40, 70, así como al final del protocolo de inmunización (día 90), diluido seriadamente con factor 2 a partir de 1/1000 en el buffer de bloqueo, e incubados durante 1 h a 37 °C. Las placas fueron lavadas nuevamente y los anticuerpos unidos fueron detectados empleando anti-IgG de conejo conjugado con fosfatasa alcalina (1/4000 en buffer de bloqueo) seguido de la adición del sustrato respectivo (100 μL/pocillo de p-nitrofenil fosfato disuelto en buffer Tris). Después de 30 min a 20 – 22 °C, la reacción se detuvo mediante la adición de 50 μL/pocillo de NaOH 3 M registrándose la absorbancia a 405 nm en un lector de placas Titertek Multiskan PLUS MKII. El título del suero correspondió a la inversa de la dilución del mismo que produjo un 50% de la máxima absorbancia registrada.

Evaluación de la reactividad cruzada entre el suero anti-B. atrox y otros venenos de serpientes peruanas.- La reactividad cruzada del suero anti-B. atrox contra los venenos de B. brazili, L. muta y C. durissus fue evaluada mediante la técnica de ELISA para lo cual se emplearon placas de 96 pocillos cubiertas con 100 μL/pocillo de los respectivos venenos (0,25 μg/mL). Luego se siguieron los pasos establecidos en el procedimiento anterior, empleando el mismo suero de conejo diluido a partir de 1/1000.

La reactividad cruzada fue expresada como porcentaje de las densidades ópticas resultantes de la reacción entre los mencionados venenos y el suero anti-B. atrox considerando como 100% el valor de absorbancia obtenido entre el veneno de B. atrox y su respectivo suero a una dilución equivalente al título obtenido.

Protocolo de inmunización.- El veneno crudo de B. atrox (1 mg/mL) preparado en PBS, fue emulsificado con un volumen equivalente de Adyuvante Completo de Freund (CFA) e inyectado por vía intradérmica, en cada uno de los conejos albinos en volúmenes de 0,25 mL seleccionando cuatro lugares del dorso.

Análisis electroforético de los venenos en estudio.- Los venenos en estudio (20 – 25 μg) fueron tratados con buffer de muestra bajo condiciones no reductoras (Tris – HCl 0,05 M, pH 6,8; SDS 2%, azul de bromofenol 0,1%, glicerol 10%) durante 5 min a 100 °C para luego ser sometidos a PAGE – SDS al 12% durante 1 h a 100 voltios constantes (Laemmli 1970).

Se utilizaron como proteínas patrones de peso molecular: fosforilasa b (97 kDa), albúmina (66 kDa), ovoalbúmina (45 kDa), anhidrasa carbónica (29 kDa), inhibidor de tripsina (20,1 kDa) y lisozima (14,3 kDa). Después de la corrida, los geles fueron teñidos con azul de Coomassie R-250 0,1% durante 2 h y lavados con solución decolorante conteniendo metanol, ácido acético y agua (4:3:4) hasta evidenciar las bandas proteicas.

Luego de 10 días se aplicaron tres dosis de refuerzo preparadas en Adyuvante Incompleto de Freund (IFA) a intervalos de 30 días. Diez días después de aplicada cada dosis de refuerzo, se extrajo sangre a partir de la vena marginal de la oreja y al finali-

Análisis por Western Blot.- Los venenos en estudio (10 – 15 μg) separados previamente mediante PAGE – SDS, fueron transferidos a membranas de polifluoruro de vinilideno (PVDF) en buffer de transferencia (Tris 0,02 M, pH 8,3; glicina 0,192

Cuantificación de proteínas.- La cantidad de proteína fue calculada midiendo la absorbancia de luz UV a 280 nm (Warburg & Christian 1944) y por el método de Lowry et al.

(1951) modificado en nuestro laboratorio (Loayza et al. 1985) empleando albúmina sérica bovina como proteína estándar.

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Inmunogenicidad del veneno de Bothrops atrox

Figura 1. Detección de IgG anti-B. atrox en el suero de conejos inmunizados mediante la técnica de ELISA.

Figura 2. Determinación del título de anticuerpos contra el veneno de B. atrox.

M, SDS 0,1%, metanol 20%) durante 50 min a 100 voltios (Towbin et al. 1979). Las membranas fueron bloqueadas usando el buffer respectivo (leche descremada al 5% en Tris-HCl 0,02 M, NaCl 0,15 M, pH 7,5, Tween-20 1%) durante una noche a 4 °C. Después se procedió al lavado con buffer de lavado (NaCl 0,15 M, Tween-20 0,05%) y luego las membranas fueron enfrentadas con el suero hiperinmune de conejo (1/1000) diluido en buffer de bloqueo. Luego de 1 h de exposición a 20 – 22 °C, las membranas fueron lavadas nuevamente y esta vez expuestas a anti-IgG de conejo ligada a fosfatasa alcalina (1/4000) durante 1 h a 20 – 22 °C, para luego de lavados sucesivos incubarlas con una solución de revelado (NBT [nitro-azul tetrazolio] y BCIP [bromo-cloro indolil sulfato] en buffer Tris-HCl 0,1 M; NaCl 0,1 M; MgCl2 0,005 M; pH 9,5). Posteriormente, las membranas fueron sumergidas en agua destilada para detener el desarrollo de color y finalmente se procedió al análisis visual de los patrones de reactividad del suero hiperinmune, obtenido experimentalmente contra los diferentes venenos.

Comparación de los perfiles de veneno de serpiente mediante PAGE-SDS.- La Figura 4a muestra los patrones proteicos obtenidos para los venenos de B. atrox, B. brazili, L. muta y C. durissus mediante PAGE – SDS en condiciones no reductoras.

En todos los casos, se detectó un mínimo de 10 bandas proteicas, observándose que cada veneno presenta un patrón característico. Además se pudieron detectar varios componentes de pesos moleculares similares en todos los venenos dentro del rango de 14,3 y 66 kDa. Sin embargo también se visualizaron bandas específicas entre los 25 y 60 kDa especialmente en el veneno de B. atrox. En el caso del veneno de B. brazili se distinguieron proteínas en el rango de 30 a 45 kDa y componentes de bajo peso molecular alrededor de los 14,3 kDa. Para el veneno de L. muta se pudieron apreciar bandas proteicas en un rango mucho mayor (14,3 – 97 kDa) donde las más abundantes se concentraron en el rango de los 30 kDa. En cambio, para el caso del veneno de C. durissus se observaron bandas mayormente agrupadas en el rango de los 14,3 a 30 kDa.

Resultados Detección y título de anticuerpos contra el veneno de B. atrox.- Se realizó el seguimiento de la respuesta inmune de los conejos albinos mediante la técnica de ELISA desde el día 0 hasta el día 90 del protocolo de inmunización (Fig. 1). Los resultaron muestran los niveles de producción de anticuerpos IgG específicos contra el veneno de B. atrox, los cuales alcanzan su máximo valor después de la tercera dosis de refuerzo (día 70), y se mantuvieron hasta el final del protocolo de inmunización.

Asimismo, el título de anticuerpos anti-B. atrox en el suero obtenido al final del protocolo de inmunización correspondió al valor de 256000 (Fig. 2).

Reactividad cruzada determinada por Western Blot.- La Figura 4b muestra que el suero anti – B. atrox reaccionó con los

Reactividad cruzada determinada por ELISA.- Al evaluarse la reactividad de los cuatro venenos en estudio contra el suero hiperinmune anti-B. atrox mediante la técnica de ELISA; se alcanzaron diversos valores de densidad óptica a 405 nm, donde el máximo valor correspondió a la reacción entre el veneno de B. atrox y su correspondiente suero (Fig. 3). Además, se observó que el suero reaccionó de forma cruzada con los otros venenos de serpientes, pero con diferente intensidad, siendo los valores de reactividad cruzada para los venenos de B. brazili, L. muta y C. durissus, de 23,7, 4,0 y 1,8%, respectivamente.

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Figura 3. Evaluación de la reacción inmunológica cruzada del suero anti-B. atrox con otros venenos de serpientes peruanas mediante la técnica de ELISA.

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Figura 4. Análisis electroforético de los venenos en estudio y su reactividad cruzada con el suero anti-B. atrox determinada mediante Western Blot. (A) Venenos de las serpientes B. atrox (1), B. brazili (2), L. muta (3) y C. durissus (4) (20‒25 μg) fraccionados mediante PAGE‒SDS y teñidos con azul brillante de Coomassie. (B) Venenos de las serpientes B. atrox (1), B. brazili (2), L. muta (3) y C. durissus (4) (10‒15 μg) transferidos a membranas de PVDF e incubadas con suero anti‒B. atrox (1/1000). Se visualizan los inmunocomplejos formados utilizando anti‒IgG de conejo conjugado con fosfatasa alcalina (1/4000).

componentes proteicos de los venenos de B. atrox, B. brazili, L. muta y C. durissus lo cual se evidencia por la formación de bandas coloreadas. Para el caso del veneno de B. atrox se obtuvo una intensa reactividad comprendiendo bandas en el rango de 14,3 a 97 kDa, lo cual indica que la mayoría de sus componentes son inmunogénicos. Por otro lado el suero reaccionó de forma cruzada con los componentes del veneno de B. brazili abarcando un rango de pesos moleculares similar al anterior, pero con menor intensidad y a su vez mostrando un número menor de bandas coloreadas. Los venenos de L. muta y C. durissus reaccionaron con menor intensidad frente al suero anti-B. atrox, donde la reactividad de este último se limitó a componentes alrededor de los 66 kDa y a otros comprendidos en el rango de 14,4 a 20,1 kDa. Discusión Los venenos de serpientes peruanas han sido durante muchos años, objeto de estudio mediante el empleo de herramientas bioquímicas dirigidas principalmente al análisis de su actividad enzimática, tanto en sistemas in vitro como su actividad biológica mediante el empleo de animales de experimentación, cuyos efectos semejan a los mostrados por las personas envenenadas (Yarlequé 2000). Como resultado de estos estudios, se ha podido clasificar a estos venenos como proteolíticos, coagulantes, hemorrágicos, nefrotóxicos, neurotóxicos y miotóxicos, lo cual se puede correlacionar con la sintomatología manifestada por las personas accidentadas producto de la mordedura de estos animales (Lévano & Fernández 2004).

La principal herramienta terapéutica contra estos accidentes es el empleo de antivenenos producidos en caballos, ovejas, cabras y conejos, elaborados con sueros obtenidos a partir de la inoculación de estos animales con el veneno de las serpientes de mayor importancia en salud pública de un país, tomando como punto de partida la incidencia de su mordedura en una

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determinada población (Theakston et al. 2003). En Perú, el Instituto Nacional de Salud, mediante el Centro Nacional de Productos Biológicos, es el encargado de elaborar diferentes tipos de antivenenos como el botrópico polivalente (el cual utiliza los venenos de B. atrox “jergón de la selva”, B. brazili “jergón shushupe”, B. pictus “jergón de la costa”, B. barnetti “macanche” y B. hyoprora “jergón”), el laquésico monovalente (empleando el veneno de L. muta “shushupe”) y el crotálido monovalente (obtenido a partir del veneno de C. durissus “cascabel sudamericana”). A pesar de la efectividad mostrada por estas preparaciones biológicas en el tratamiento de mordeduras ofídicas, existe escasa información sobre las características inmunoquímicas de los venenos utilizados para su producción, por lo que resulta crucial estudiar la potencial reactividad inmunológica cruzada presente entre estos venenos a fin de optimizar la producción de tales inmunobiológicos, así como para el desarrollo de sistemas de detección de venenos para la identificación de la especie de serpiente responsable de un envenenamiento a fin de seguir el tratamiento apropiado (Van Dong et al. 2003).

Para la producción de anticuerpos se siguen diversos esquemas o protocolos de inmunización, los cuales consideran diferentes parámetros para su desarrollo (Christensen 1979); entre ellos se considera el tiempo necesario para obtener un título aceptable de anticuerpos, la edad del animal inmunizado y el empleo de adyuvantes. Además se debe tener en cuenta la naturaleza del antígeno y su toxicidad, así como la del antiveneno que se pretende producir (Heneine & Heneine 1998). En el presente estudio se utilizaron conejos albinos de raza Nueva Zelanda como animales de experimentación, los cuales fueron inmunizados con una cantidad de veneno de B. atrox que se encuentra por debajo del valor de toxicidad (DL50) reportado (Laing et al. 2004, Rojas et al. 2005) por lo que no se observaron reacciones secundarias en los animales que pudieran interferir con la producción de anticuerpos. A fin de garantizar la producción de altos títulos de Rev. peru. biol. 18(3): 335 - 341 (Diciembre 2011)

Inmunogenicidad del veneno de Bothrops atrox

anticuerpos en el suero, el veneno fue emulsificado previamente con adyuvante completo de Freund (CFA) para la inmunización primaria y adyuvante incompleto de Freund (IFA) para las dosis de refuerzo, co-adyuvantes ampliamente utilizados por su capacidad de localizar a los antígenos en la zona de inoculación durante un periodo de tiempo prolongado. La eficacia de este método puede ser monitoreada por diversos métodos inmunoquímicos tales como inmunodifusión, inmunoelectroforesis, inmunofluorescencia, hemaglutinación, radioinmunoensayo (RIA), etc. (Theakston 1983). Sin embargo, se ha encontrado que la técnica de ELISA es el método más usado para la detección específica de venenos de serpientes y sus respectivos anticuerpos (Selvanayagam & Gopalakrishnakone 1999). La respuesta inmune de los conejos inoculados fue monitoreada mediante la técnica de ELISA (Fig. 1) donde el aumento de la absorbancia a 405 nm, indica el aumento en la cantidad de inmunocomplejos formados producto del reconocimiento entre el antígeno y los anticuerpos IgG específicos presentes en el suero de los conejos inmunizados. A partir de estos resultados se considera que el procedimiento empleado resulta práctico, eficiente y de corta duración, convirtiéndolo en un método útil para la obtención de anticuerpos contra el veneno de B. atrox.

Para la obtención del título de los antivenenos estudiados existen diversos métodos, siendo el más útil el de la titulación a punto final (Alzamora et al. 2002). Este método consiste en analizar los sueros problema en diluciones seriadas con factor 2 partiendo de una dilución inicial fija. En nuestro esquema experimental se eligió como título la dilución de suero que produce un 50% de la absorbancia máxima, siendo el título anti-B. atrox correspondiente al valor de 256000 (Fig. 2), el cual muestra que el veneno analizado es altamente inmunogénico. En el caso de los venenos de serpientes y los protocolos de inmunización para la obtención de anticuerpos específicos, se considera que el título de anticuerpos para un antiveneno es alto cuando su valor es mayor a 32000 (Van Dong et al. 2003). Sin embargo también se han observado títulos que alcanzan valores de 2048000 para los venenos de B. atrox y L. muta provenientes de Brazil (Colombini et al. 2001). Si bien estos valores están muy por encima de los hallados en la presente investigación, hay que tener en cuenta el tipo de conjugado empleado en ambos tipos de ensayos, el cual basa la sensibilidad de su detección en la enzima acoplada que realiza la hidrólisis del sustrato respectivo. En el presente trabajo se utilizó un conjugado acoplado a la enzima fosfatasa alcalina el cual reaccionó sobre el sustrato p-nitrofenil fosfato para dar una coloración amarilla cuya absorbancia es registrada a 405 nm.

A fin de realizar un análisis comparativo de los venenos de serpientes en estudio: B. atrox, B. brazili, L. muta y C. durissus, se analizó el patrón electroforético de sus proteínas mediante PAGE – SDS en condiciones no reductoras (Fig. 4a). En el caso del veneno de B. atrox se pueden observar bandas específicas entre los 25 y 60 kDa, las cuales corresponderían a proteínas tales como la miotoxina (27 kDa; Huatuco et al. 2004) y la L-aminoácido oxidasa (60 kDa; Lazo et al. 2007). Así mismo podría notarse la presencia de la atroxina, una metaloproteinasa dependiente de Ca2+, principal responsable del efecto proteolítico y hemorrágico de este veneno (19,9 kDa, Pantigoso et al.

1996). En el perfil electroforético del veneno de B. brazili, se distinguen bandas proteicas dentro del rango de 30 a 45 kDa que corresponderían a la miotoxina (30 kDa, Pantigoso et al.

2001), incluyendo una L-aminoácido oxidasa (59,9 kDa, Solis Rev. peru. biol. 18(3): 335 - 341 (December 2011)

et al. 1999). Además de las proteínas mencionadas, se pueden distinguir componentes de bajo peso molecular como es el caso para una fibrinogenasa (22 kDa, Azañero et al. 2000) y una fosfolipasa A2 (21,2 kDa, Zeballos et al. 1999) previamente reportadas. Ambos venenos tuvieron un número similar de componentes, si bien la distribución de bandas de sus perfiles electroforéticos es claramente diferente. Con respecto al patrón de bandas para el veneno de L. muta, éste presenta un rango mucho mayor abarcando proteínas desde los 14,4 kDa hasta los 97 kDa como se ha reportado para el caso de la fosfolipasa A2 (19,2 kDa, Mejia et al. 2006), la proteinasa I (25,1 kDa, Rodriguez & Yarlequé 1991), la enzima similar a trombina (40,0 kDa, Yarlequé et al. 1989) y la L-aminoácido oxidasa (60,6 kDa, Cisneros et al. 2006). En el caso del veneno de C. durissus, se observa un menor número de bandas, donde las proteínas se encuentran agrupadas en el rango de 14,4 a 30 kDa, sin embargo sólo se ha reportado la presencia de ciertas actividades enzimáticas como la proteolítica, amidolítica, coagulante, fosfolipasa A2 y L-aminoácido oxidasa (Remuzgo et al. 2000). A partir de este análisis, los componentes de los venenos en estudio pueden dividirse en dos grupos basados en sus pesos moleculares; por un lado los de alto y mediano peso molecular (mayor a 15 kDa) y por otro los de bajo peso molecular (menor a 15 kDa). Esta heterogeneidad en los perfiles obtenidos ha sido reportada para venenos de otras especies sudamericanas, como B. alternatus, B. atrox, B. cotiara, B. erythromelas, B. jararaca, B. jararacussus, B. moojeni, B. neuwiedi y B. pradoi de Brazil (da Silva et al. 1990); centroamericanas, incluyendo a L. muta stenophrys y C. durissus durissus de Costa Rica (Anderson et al.1993); norteamericanas como C. atrox, C. viridis viridis, C. adamanteus y C. horridus horridus (Ownby & Colberg 1990) y asiáticas como Naja naja siamensis, Ophiophagus hannah, Bungarus fasciatus, Vipera russelli, Calloselasma rhodostoma y Trimeresurus albolabris (Chinonavanig et al. 1988).

Para el análisis de la reactividad inmunológica de los venenos de serpientes estudiados contra el suero anti-B. atrox, se empleó en primer lugar el método de ELISA. Mediante esta técnica se pudo determinar que los anticuerpos presentes en el suero hiperinmune reaccionaron con los venenos de serpientes, donde la densidad óptica más fuerte fue la obtenida entre el veneno de B. atrox y su antiveneno homólogo (Fig. 3). En estos experimentos de titulación, se pudo observar también reactividad cruzada con los otros venenos de serpientes, donde el mayor valor correspondió a la reacción del suero hiperinmune con el veneno de B. brazili, seguido por títulos bajos contra los venenos de L. muta y C. durissus. Estos resultados indican que los venenos en estudio contienen proteínas estructuralmente relacionadas con los componentes del veneno de B. atrox, los cuales varían tanto en intensidad como en abundancia. Estos resultados deben ser correlacionados con los de otros métodos inmunoenzimáticos, siendo el más idóneo el de Western Blot (Li & Ownby 1994), ya que si sólo se utiliza un método para este tipo de análisis, se podría llegar a conclusiones e interpretaciones erróneas sobre la reactividad entre los venenos y antivenenos (Siigur et al. 2000). Por esta razón se evaluó de forma adicional la inmunogenicidad de los componentes de los venenos en estudio utilizando el ensayo de Western Blot, el cual consiste en primer lugar en la separación de los componentes proteicos del veneno mediante PAGE – SDS, para luego ser transferidos a membranas de nitrocelulosa y puedan así ser detectadas por

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Sandoval et al.

los anticuerpos presentes en el suero hiperinmune obtenido. De este modo, la formación de inmunocomplejos es detectada de forma similar que en un ELISA indirecto. La Fig. 4b muestra el patrón característico de coloración de bandas correspondiente a los componentes inmunorreactivos de los venenos en estudio analizados previamente por PAGE – SDS (Fig. 4a). Esta metodología permite la visualización directa y la comparación de la reacción de un mismo suero con los componentes del veneno homólogo y los venenos heterólogos bajo las mismas condiciones. De esta manera se pudo observar que las proteínas de los venenos reaccionaron con el suero hiperinmune producido contra el veneno de B. atrox lo cual indica que la mayor parte de los componentes proteicos son potencialmente inmunogénicos.

Estos resultados pueden correlacionarse con los de Chinonavanig et al. (1988), quien trabajando con el veneno de serpientes de Tailandia, encontró que los componentes de alto peso molecular fueron inmunogénicos, donde además otros componentes de menor peso molecular también lo fueron. En los demás carriles se pudo observar una reactividad inmunológica cruzada entre los anticuerpos del suero hiperinmune con las proteínas de los venenos de B. brazili (carril 2), L. muta (carril 3) y C. durissus (carril 4). La mayoría de estas bandas de reacción corresponden a proteínas de alto y mediano peso molecular y con una elevada inmunorreactividad. Tales reacciones cruzadas entre los venenos de vipéridos han sido descritas antes para el caso de un antiveneno anti-C. atrox y los venenos de C. adamenteus, C. h. horridus y C. v. viridis de norteamerica (Minton 1979).

En nuestro estudio, se obtuvieron resultados mediante ELISA, pero con esta técnica no se pudieron determinar los componentes específicos que contribuyen a la reactividad cruzada. En el caso del veneno de B. brazili (Fig. 6b, carril 2), las reacciones cruzadas ocurren con una intensidad casi similar a la del veneno homólogo, lo que indicaría un alto grado de conservación en la estructura de sus proteínas con las del veneno de B. atrox lo cual se correlaciona con los datos obtenidos por ELISA. Para el veneno de L. muta (Fig. 6b, carril 3), la mayor reactividad se concentró en componentes de alto y mediano peso molecular (20 – 60 kDa), donde se encuentran agrupados componentes como proteasas y otras toxinas hemorrágicas. Finalmente, el veneno de C. durissus (Fig. 6b, carril 4), reaccionó pobremente con el antiveneno, donde la mayor reactividad se concentró en un componente de alto peso molecular (>66 kDa) que podría corresponder a su L-aminoácido oxidasa.

En el desarrollo de pruebas de inmunodiagnóstico para identificación rápida de la especie responsable de un envenenamiento, los componentes del veneno que reaccionan cruzadamente podrían dar lugar a ambigüedad o inclusive error en el diagnóstico (Marshall & Herrmann 1984, McCarthy 1984, Ho et al. 1986). Los anticuerpos producidos contra el veneno de B. atrox mostraron una reactividad cruzada con los tres venenos heterólogos, por lo que sería necesaria la preparación de anticuerpos específicos de especie como paso preliminar en el desarrollo del kit de diagnóstico. Una aproximación para la obtención de tales anticuerpos ha sido reportada en el trabajo de Sandoval et al. (2006), donde utilizando columnas de afinidad con el veneno inmovilizado de B. atrox se pudieron capturar los anticuerpos IgG específicos a partir del suero hiperinmune.

Queda por analizar si estos anticuerpos reaccionan de forma cruzada o no contra otros venenos de serpientes empleando las técnicas descritas en este trabajo.

340

Agradecimientos El presente trabajo fue desarrollado gracias al apoyo recibido en marco del Convenio firmado entre la Universidad Nacional Mayor de San Marcos (Perú) y las Universidad de Liverpool y Oxford (Inglaterra).

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Sandoval et al.

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Rev. peru. biol. 18(3): 335 - 341 (Diciembre 2011)

Rev. peru. biol. 18(3): 343 - 347 (Diciembre 2011) © Facultad de Ciencias Biológicas UNMSM

Propagación in vitro de Carica papaya variedad PTM-331 ISSN 1561-0837

Propagación in vitro de Carica papaya var. PTM-331 a partir de meristemos apicales In vitro propagation of Carica papaya var. PTM-331 from apical meristem

Reynaldo Solis L.1*, Julio Olivera S.2 y Rafael S. La Rosa L.1 1 Universidad Nacional Federico Villarreal - Facultad de Ciencias Naturales y Matemática. Jr. Rio Chepen N° 110, 114 y 290 – El Agustino. *Email Reynaldo Solis Leyva: rsolisleyva@yahoo.com.pe 2 Estación Experimental Agraria DONOSO -Instituto Nacional de Innovación Agraria. Altura Km. 5,4 de la Carretera Chancay – Huaral.

Resumen El trabajo consistió en desarrollar un protocolo de propagación in vitro de la variedad de papaya PTM-331 a partir de meristemos apicales, con la finalidad de obtener plántulas vigorosas y libres de enfermedades, empleando la técnica del cultivo de tejidos. Las yemas apicales empleadas fueron obtenidas de plantas cultivadas en invernadero, los cuales fueron usados como explantes para la extracción de meristemos. La mejor diferenciación de meristemos se logró en el medio basal MS suplementado con 0,5 mg.L-1 de BAP, 0,5 mg.L-1 de AIA y 10 mg.L-1 de adenina. La mejor multiplicación se logró con el medio MS suplementado con 0,5 mg.L-1 de BAP, 0,5 mg.L-1 de AIA y 0,3 mg.L-1 de AG3, con un coeficiente de multiplicación de 3,42; mientras que el mejor medio para el enraizamiento fue la combinación del medio MS, 3 mg.L-1 de AIB y 5 mg.L-1 de adenina, donde se obtuvo 83,33% de plantas enraizadas.

Palabras claves: Carica papaya, Propagación in vitro, meristemos apicales, invernadero, explantes.

Abstract

Presentado: 02/07/2011 Aceptado: 15/12/2011 Publicado online: 08/02/2012

An in vitro protocol was develop to propagate variety of papaya PTM-331 from apical meristems, with the objective of obtaining vigorous and disease-free seedlings, using tissue culture techniques. Apical buds were obtained from seedlings cultivated in greenhouse and used as explants for meristem dissection. Meristems were cultured on MS basal medium supplemented with 0,5 mg.L-1 of BAP, 0,5 mg.L-1 of AIA and 10 mg.L-1 of adenine for their differentiation. The best multiplication of explants was achieved with the combination of MS medium supplemented with 0,5 mg.L-1 of BAP, 0,5 mg.L-1 of AIA and 0,3 mg.L-1 of AG3, where largest seedlings, with more shoots were obtained. The best medium for rooting was the combination of MS, 3 mg.L-1 of AIB and 5 mg.L-1 of adenine, where 83,33% of rooted plants were obtained.

Keywords: Carica papaya, in vitro propagation, apical meristem, greenhouse, explants.

Introducción En el Perú, la papaya (Carica papaya L.) es una especie importante en la economía del poblador amazónico debido a su fruta de alto rendimiento y valor nutritivo. Su cultivo presenta una serie de ventajas como calidad de su fruto, desarrollo vegetativo corto y la cosecha semanal luego de haber iniciado la producción, permitiendo el rápido retorno del capital invertido.

Según Carbajal y Remuzgo (2007), en los últimos diez años la Amazonía Peruana se ha constituido en el principal productor y abastecedor de papaya al mercado de Lima e involucra a más del 35% de los agricultores en las distintas etapas de la cadena productiva.

El Instituto de Investigación de la Amazonía Peruana (IIAP) viene trabajando en el programa de mejoramiento genético de la papaya, teniendo como objetivos principales mejorar la calidad del fruto, incrementar el rendimiento y desarrollar variedades tolerantes a enfermedades limitativas al cultivo (Carbajal & Remuzgo 2007); así se ha logrado obtener la variedad PTM-331.

Existen diversas formas de propagar la papaya, sin embargo, desde el punto de vista comercial, el uso de semilla sexual es el más generalizado (Franciosi 1992) a pesar de las dificultades que se presentan al obtenerse plantas de diferente sexo y que a veces las plantas resultantes no reproducen exactamente las características de la planta originaria (Ibar 1979). La propagación vegetativa por medio de estacas o injertos no brindan los efectos deseados, Rev. peru. biol. 18(3): 343 - 347 (December 2011)

las primeras son de lento desarrollo y las segundas degeneran y no mantienen las características (Posada 2005).

Una forma de obtener plantas libres de patógenos es a través del cultivo in vitro de meristemos que se fundamenta en el hecho de que la distribución de los microorganismos (virus, bacterias y micoplasmas) en los tejidos de la planta no es uniforme y su concentración tiende a disminuir progresivamente hacia el ápice del tallo (Jiménez 1998). Con el estudio de los procesos que ocurren en el cultivo de tejidos de la papaya se han desarrollado técnicas de micropropagación por organogénesis (Alvarado 1992, Baca 2002, Gallardo et al. 2002) y embriogénesis somática (Jimenez 1999, Ascencio et al. 2008) pero en ninguno de estos casos se trabajó con la variedad PTM-331.

El desarrollo de una metodología de micropropagación a partir de meristemos apicales es importante para conocer el comportamiento in vitro de esta variedad y apoyar la multiplicación de plantas élite de sexo femenino seleccionadas en campo por sus características fenotípicas especiales; además se puede realizar una cuidadosa selección del material genético, manejar grandes volúmenes de plántulas en espacios reducidos y mantener un stock de plantas libres de enfermedades. Este trabajo tuvo como objetivo determinar los requerimientos nutricionales y hormonales de Carica papaya var. PTM-331 en los medios de cultivo durante las fases de establecimiento de meristemos apicales, multiplicación y enraizamiento de las plántulas.

343

Solis et al.

Materiales y métodos El presente trabajo se desarrolló en el Laboratorio de Biotecnología de la Estación Experimental DONOSO del Instituto Nacional de Innovación Agraria del Perú. Los meristemos fueron extraídos de yemas apicales obtenidas de plantas de 45 días provenientes de invernadero. Para la desinfección, los explantes fueron lavados con abundante agua y jabón y luego fueron transportados a la cámara de flujo laminar en donde fueron sumergidos en alcohol 70% durante 30 segundos y enjuagados tres veces con agua destilada estéril, luego fueron sumergidos en hipoclorito de sodio 1% durante 10 minutos y enjuagados tres veces con agua destilada estéril.

Fase de establecimiento de meristemos.- Luego de desinfectar las yemas apicales, con la ayuda de un microscopio estereoscopio se realizó la disección de meristemos. Los explantes vegetales se colocaron sobre una placa Petri (148 x 120 mm.), se sujetaron con pinzas y con ayuda del bisturí se eliminaron los primordios foliares hasta dejar el meristemo descubierto. Después se realizó un corte en la base del meristemo y se introdujo al tubo de ensayo que contenía el medio de cultivo.

Con la finalidad de obtener el medio de cultivo adecuado que nos permita la diferenciación de los meristemos se formularon diversos tratamientos considerando los resultados obtenidos por Alvarado (1992) y Baca (2002), empleando el medio de cultivo basal Murashige y Skoog (MS-1962) con diferentes concentraciones de BAP, ANA, AIA, AG3 y adenina (Tabla 1).

El pH del medio de cultivo fue ajustado a 5,6. Se realizaron evaluaciones cada 7 días y la evaluación final se realizó 49 días después de la siembra.

Fase de multiplicación.- Para determinar el medio de cultivo más adecuado para la multiplicación de las plántulas, los tratamientos planteados consistieron en medio de cultivo base MS con diferentes concentraciones de BAP, KIN, ANA, AIA, AG3 y adenina (Tabla 2). Se realizaron evaluaciones cada 7 días y la evaluación final se realizó 35 días después de la siembra.

Fase de enraizamiento.- Para determinar el medio de cultivo adecuado para el enraizamiento de las plántulas se formularon diversos tratamientos empleando el medio base MS con diferentes concentraciones de IBA, BAP, ANA y adenina (Tabla 3).

La evaluación se realizó 21 días después de la siembra.

Tabla 1. Medios de cultivo para la fase de establecimiento de meristemos.

Tratamiento

Medio + Hormonas

TR0

MS

TR1

MS + BAP 0,5 mg.L-1 + ANA 0,3 mg.L-1

TR2

MS + BAP 0,5 mg.L-1 + ANA 0,3 mg.L-1 + AG3 0,3 mg.L-1

TR3

MS + BAP 0,5 mg.L-1 + ANA 0,3 mg.L-1 + Adenina 10 mg.L-1

TR4

MS + BAP 0,5 mg.L-1 + AIA 0,5 mg.L-1

TR5

MS + BAP 0,5 mg.L-1 + AIA 0,5 mg.L-1 + AG3 0,3 mg.L-1

TR6

MS + BAP 0,5 mg.L-1 + AIA 0,5 mg.L-1 + Adenina 10 mg.L-1

Tabla 2. Medios de cultivo para la fase de multiplicación.

Tratamiento

Medio + Hormonas

TA 0

MS

TA 1

MS + BAP 0,5 mg.L + AIA 0,3 mg.L-1 + AG3 0,3 mg.L-1 + Adenina 5 mg.L-1

TA 2

MS + BAP 0,5 mg.L-1 + AIA 0,5 mg.L-1 + AG3 0,3 mg.L-1

TA 3

MS + BAP 0,5 mg.L-1 + ANA 0,3 mg.L-1 + AG3 0,3 mg.L-1+ Adenina 5 mg.L-1

TA 4

MS + BAP 0,5 mg.L-1 + ANA 0,5 mg.L-1 + AG3 0,3 mg.L-1

TA 5

MS + KIN 1 mg.L-1 + AIA 0,3 mg.L-1 + AG3 0,3 mg.L-1 + Adenina 5 mg.L-1

TA 6

MS + KIN 1 mg.L-1 + AIA 0,5 mg.L-1 + AG3 0,3 mg.L-1

TA 7

MS + KIN 1 mg.L-1 + ANA 0,3 mg.L-1 + AG3 0,3 mg.L-1 + Adenina 5 mg.L-1

TA 8

MS + KIN 1 mg.L-1 + ANA 0,5 mg.L-1 + AG3 0,3 mg.L-1

-1

Tabla 3. Medios de cultivo para la fase de enraizamiento.

344

Tratamiento

Medio + Hormonas

TM0

MS

TM1

MS + IBA 3 mg.L-1 + ANA 0,5 mg.L-1

TM2

MS + ANA 1 mg.L-1

TM3

MS + IBA 3 mg.L-1

TM4

MS + IBA 3 mg.L-1 + Adenina 5 mg.L-1

TM5

MS + IBA 2 mg.L-1 + BAP 0,5 mg.L-1 + AIA 0,5 mg.L-1

TM6

MS + IBA 2 mg.L-1 + BAP 0,5 mg.L-1 + ANA 0,5 mg.L-1 Rev. peru. biol. 18(3): 343 - 347 (Diciembre 2011)

Propagación in vitro de Carica papaya variedad PTM-331 Tabla 4. Influencia de los diferentes medios de cultivo en la diferenciación de meristemos apicales.

Tratamientos

49 días Meristemos diferenciados (%)

Altura de plántulas (mm)

Número de brotes

87,5

2,3929 d

1,0000 d

TR 1

87,5

7,6667 b

1,1667 bcd

TR 2

93,75

5,3000 c

1,0667 cd

TR 3

93,75

5,8000 c

1,1333 bcd

TR 4

100

8,5313 ab

1,4375 b

TR 5

100

7,8750 ab

1,3750 bc

TR 6

100

9,1875 a

2,1875 a

TR 0

* Medias con diferentes letras en la misma columna difieren para p<0,05 (Notación Duncan)

Resultados y discusión Fase de establecimiento.- En el 2002, Baca determinó que el explante más adecuado para el establecimiento in vitro de papaya eran los meristemos.

No se observó contaminación en la introducción in vitro de meristemos apicales de papaya. El uso de alcohol (70%) durante 30 segundos y NaOCl (1%) durante 10 minutos resultó ser muy efectivo en la desinfección de explantes, pero es muy importante considerar que la introducción de meristemos se hizo a partir de plántulas provenientes de invernadero.

En la Tabla 4 se observa el porcentaje de meristemos diferenciados a los 49 días, las variaciones encontradas entre los distintos tratamientos se debieron básicamente a la manipulación de las yemas apicales durante la disección de los meristemos.

El análisis de los resultados a los 49 días después de la siembra nos indica que el tratamiento TR6 presenta mayor altura de plántula y mayor número de brotes (Tabla 4), estos datos nos indican que la combinación de los reguladores de crecimiento empleados en TR6 son óptimos para el establecimiento in vitro de meristemos apicales de papaya var. PTM-331.

Un balance apropiado entre auxinas y citoquininas en el medio de cultivo es necesario para la formación de plantas a partir de meristemos, ápices o yemas. Usualmente en los meristemos y ápices la citoquininas endógena es baja debido a que el principal sitio de síntesis son las raíces, por lo que la adición exógena de citoquininas en los medios de establecimiento es generalizada

(Jiménez 1998). El tratamiento TR6, el cual resultó ser el más óptimo para el establecimiento in vitro de meristemos apicales de la variedad de papaya PTM-331, contiene en su formulación 0,5 mg.L-1 de BAP, resultados congruentes a los obtenidos por Baca (2002) quien reporta una mayor proliferación de brotes de papaya empleando BAP como fuente de citoquininas.

Jiménez (1998) indica que los ápices y meristemos que son empleados como material inicial para el cultivo in vitro, son áreas de síntesis de auxinas por lo que la concentración endógena es alta y que normalmente cuando se emplean ápices no se adicionan auxinas al medio de cultivo aunque estos pueden estimular el crecimiento, pero cuando se emplean meristemos es frecuente que no exista suficiente auxina endógena siendo necesaria la adición exógena. Se puede observar que para el establecimiento in vitro de meristemos apicales de la variedad de papaya PTM-331, nuestra mejor fuente de auxinas fue el AIA a diferencia de los resultados obtenidos por Baca (2002) donde el ANA como fuente de auxinas resultó ser más efectivo para la diferenciación de meristemos de papaya criolla. En la tabla 4 se observa que los tratamientos que contienen ANA como fuente de auxinas (TR1, TR2 y TR3), presentaron porcentajes altos de diferenciación pero los explantes obtenidos presentaron menor altura de plántula y menor número de brotes que los explantes obtenidos con el tratamiento TR6. Alvarado (1992) indica que la utilización del AIA como fuente de auxina resulta más favorable que el ANA para el establecimiento in vitro de explantes de papaya.

Tabla 5. Altura de las plántulas (mm) y número de brotes en la fase de multiplicación.

35 días

Tratamientos Altura de la plántula (mm)

Número de brotes

TA0

5,5833 g

1,0000 e

TA1

13,6667 b

2,1667 b

TA2

15,4167 a

3,4167 a

TA3

11,8333 cd

2,0833 b

TA4

11,3333 d

2,0000 bc

TA5

13,7500 b

2,0833 b

TA6

12,1667 c

1,8333 bc

TA7

8,8333 e

1,5833 cd

TA8

7,1667 f

1,1667 de

* Medias con diferentes letras en la misma columna difieren para p<0,05 (Notación Duncan)

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Solis et al.

Figura 1. Plántulas provenientes de TA2, después de 35 días de siembra.

Fase de multiplicación.- El análisis de los resultados obtenidos al comparar el efecto de diferentes combinaciones de reguladores de crecimiento demostró que TA2 nos permitió obtener plántulas de mayor tamaño y con mayor número de brotes, con diferencias significativas frente al resto de los tratamientos (Tabla 5). La Figura 1 muestra las plántulas obtenidas en TA2. TA1 y TA5 también mostraron buenos resultados, sin diferencias significativas entre ellas, pero son significativamente diferentes al resto de tratamientos.

Al analizar la composición de los reguladores de crecimiento en TA1, TA2 y TA5 se observa que los tres tratamientos presentan AIA como fuente de auxina y estos son superiores a los tratamientos que presentan ANA como fuente de auxina.

En los tratamientos TA1 y TA2 la fuente de citoquininas es BAP y en el tratamiento TA5 la fuente de citoquininas es KIN, estos resultados nos indican que tanto BAP y KIN nos pueden proporcionar buenos resultados en la fase de multiplicación.

Todos los tratamientos contienen AG3 en su composición debido a que esta hormona induce el alargamiento de los brotes. Baca (2002) obtuvo un mayor alargamiento de tallos empleando un medio basal MS al que se le adicionó 0,5 mg.L-1 de AG3 y 10 mg.L-1 de adenina.

El número de brotes es una variable importante en la fase de multiplicación ya que a mayor número de brotes se tendrá una mayor tasa de multiplicación. Orellana (1998) indica que la proliferación de brotes axilares se logra con la adición de citoquininas en el medio de cultivo para romper la dominancia apical y estimular la brotación de las yemas que se encuentran en las axilas de las hojas. El BAP resultó ser la citoquinina más efectiva para la multiplicación de brotes. Alvarado (1992) concluyó que la interacción de 0,05 mg.L-1 de AIA, 1,5 mg.L-1 de KIN y 100 mg.L-1 de ácido nicotínico permite la mayor proli-

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feración de nudos y desarrollo de abundante de follaje, mientras que Baca (2002) obtuvo mayor proliferación de brotes, mayor número de nudos y menor presencia de callos en un medio MS suplementado con 0,5 mg.L-1 de BAP, 0,1 mg.L-1 de AG3, 0,01 mg.L-1 de AIA y 10 mg.L-1 de adenina; en ambos casos el AIA fue la mejor fuente de auxinas.

Gallardo et al. (2002) reportaron que el medio de cultivo MS suplementado con 0,14 mg.L-1 de ANA y 0,45 mg.L-1 de BAP permite obtener mayores coeficientes de multiplicación.

La diferencia en la fuente de auxina más efectiva en la multiplicación in vitro se debe principalmente a la variedad de papaya empleada en cada caso, en el presente trabajo se empleó la variedad PTM-331; Alvarado (1992) empleó la variedad Pauna, Baca (2002) empleó la variedad Criollo y Gallardo et al. (2002) emplearon el híbrido IBP-4299.

Fase de enraizamiento.- El enraizamiento se caracteriza por ser la fase más voluminosa de todo el proceso, pues en ella cada brote, esqueje o yema de forma individual que se ha formado durante la fase de multiplicación, debe ser cultivada y manipulada in vitro para que, además de crecer y desarrollar un seudotallo o tallo con las primeras hojas, forme y desarrolle varias raíces que le permitan comenzar la absorción de nutrientes al transplantarse sobre un sustrato enriquecido y convertirse en vitroplanta aclimatizada lista para llevarse al campo (Orellana 1998).

Previamente al análisis estadístico de las variables número y longitud de raíces se determinó el porcentaje de enraizamiento en cada tratamiento. Se observó que TM0, TM2 y TM6 no presentaron enraizamiento por lo que estos tratamientos no fueron tomados en cuenta para el análisis estadístico. Se alcanzaron mejores resultados en TM4 con 83,33% de plantas enraizadas (Tabla 6).

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Propagación in vitro de Carica papaya variedad PTM-331 Tabla 6. Número y longitud de raíces (21 días después de siembra).

Tratamientos

21 días Porcentaje de enraizamiento

Número de raíces

Longitud de raíces (mm)

TM1

50 %

6,3333 b

5,1667 b

TM3

66,67 %

8,5000 a

6,9375 a

TM4

83,33 %

8,6000 a

7,4000 a

TM5

33,33 %

4,2500 c

4,1250 c

* Medias con diferentes letras en la misma columna difieren para p<0,05 (Notación Duncan)

Al realizarse el análisis para las variables número y longitud de raíces, los tratamientos TM3 y TM4 presentan los mayores promedios, estos tratamientos no presentan diferencias significativas entre si de acuerdo a la prueba de Duncan realizada con un nivel de significancia de p<0,05 (Tabla 6). Estas variables son de mucha importancia en la fase de aclimatación, debido a que es necesaria que una planta tenga el soporte de las raíces para un mejor desarrollo en el sustrato estéril. Si bien las raíces no son del todo funcionales debido a la escasez de pelos absorbentes que no se desarrollan in vitro, un mayor tamaño y un mayor número de raíces inducen la formación ex vitro de nuevas raíces y pelos absorbentes, que extraerán del suelo los nutrientes necesarios para el desarrollo de la plántula.

Al comparar los diferentes tratamientos, se observa que TM4 presenta el mayor porcentaje de enraizamiento, mayor número de raíces y mayor longitud de raíces; este tratamiento contiene el medio basal MS al que se le adicionó 3 mg.L-1 de IBA y 5 mg.L-1 de adenina. Estos resultados se asemejan a los obtenidos por Baca (2002) que obtuvo mayor proliferación de raíces en un medio que contenía 2 mg.L-1 de IBA y 10 mg.L-1 de adenina.

En el tratamiento TM3 que contiene 3 mg l-1 IBA se observa un menor porcentaje de enraizamiento, pero las respuestas en el número de raíces y longitud de raíces no presentan diferencias significativas con las respuestas obtenidas en el tratamiento TM4. Reuveni et al. (1990) lograron enraizar plantas in vitro en un medio MS que contenía 1 mg.L-1 de IBA, mientras que Alvarado (1992) señala que el enraizamiento de plántulas de papaya se obtiene en un medio que contenga 5 mg.L-1 de IBA. Jiménez (1999), señala que el método de Drew (1993) induce el enraizamiento de los brotes en proliferación, es decir una concentración de 0,2 mg.L-1 de IBA y 11,3 mg.L-1 de Riboflavina.

Posada (2005) indica que para el enraizamiento de plántulas de papaya, los explantes se subcultivan en un medio de cultivo compuesto por el 50% de las sales MS y concentraciones entre 3 y 5 mg.L-1 de IBA durante 10 días, luego se transfieren a un medio de cultivo compuesto por sales MS sin reguladores de crecimiento por espacio de 20 días proporcionando un 80 % de plantas enraizadas.

A manera de sumario puede señalarse que: En la fase de establecimiento, el tratamiento donde se obtuvo una mayor diferenciación de meristemos a los 49 días fue TR6 (MS + 0,5 mg.L-1 de BAP + 0,5 mg.L-1 de AIA + 10 mg.L-1 de Adenina) y por lo tanto proporcionó plántulas más vigorosas para iniciar la fase de multiplicación.

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El medio TA2 que contiene MS + 0,5 mg.L-1 de BAP + 0,5 mg.L-1 de AIA + 0,3 mg.L-1 de AG3, permitió obtener a los 35 días plántulas más grandes y con mayor número de brotes.

El uso de AIA como fuente de auxina nos permitió obtener mejores resultados que el uso del ANA en el establecimiento in vitro de meristemos y la multiplicación de explantes.

El tratamiento TM4 que posee MS + 3 mg.L-1 de IBA + 5 mg.L-1 de adenina permitió obtener un mayor porcentaje de enraizamiento (83,33%).

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Solis et al.

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Diagnóstico e identificación de Yersinia ISSN ruckeri por PCR 1561-0837

Diagnóstico e identificación rápidos por PCR de Yersinia ruckeri aislada de Oncorhynchus mykiss procedentes de Canta, Lima, Perú Rapid diagnosis and identification by PCR of Yersinia ruckeri isolated of Oncorhynchus mykiss from Canta, Lima, Peru Susana Sirvas-Cornejo*, Claudia Cecilia Sánchez-Robinet y César Peña-Domínguez Laboratorio de Biología Molecular; Departamento Académico de Acuicultura, Facultad de Oceanografía, Pesquería y Ciencias Alimentarias; Universidad Nacional Federico Villarreal. Calle Roma 350, Miraflores, Lima 18, Perú.

Email Susana Sirvas Cornejo: sirvascornejo@yahoo.com Email Claudia Sánchez Robinet: sanchezrobinet@hotmail.com *Autor para correspondencia

Resumen Se muestrearon 20 ejemplares (alevines y juveniles) de trucha arco iris cultivados en la piscifactoría Acochinchán (Canta, Lima, Perú), y se les aplico la técnica de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) con la finalidad de obtener una identificación rápida del agente patógeno Yersinia ruckeri que produce la enfermedad entérica de la boca roja (ERM) y genera elevadas tasas de mortalidad. Nueve ejemplares fueron asintomáticos mientras que 11 presentaron signos de ERM. Se aislaron 22 cepas bacterianas del hígado, bazo y riñón. Se empleó la técnica de la PCR para la amplificación y cebadores específicos (ARNr 16S), que permitieron amplificar un fragmento de ADN de 575 pb de Yersinia ruckeri. Diecinueve cepas fueron identificadas como Yersinia ruckeri mediante la PCR, tanto en peces sintomáticos como asintomáticos. Se estableció un tiempo de diagnóstico de 26 horas, en comparación con los 2 ó 3 días que duraría el diagnóstico empleando las pruebas bioquímicas.

Palabras Clave: Yersinia ruckeri, Oncorhynchus mykiss, PCR, diagnóstico, Enfermedad Entérica de la Boca Roja.

Abstract

Presentado: 08/07/2011 Aceptado: 10/10/2011 Publicado online: 08/02/2012

Twenty individuals of rainbow trout were sampled (fry and juveniles) from Acochinchan Fishfarm (Canta, Lima - Peru), and analyzed with the Polimerase Chain Reaction test (PCR ) in order to achieve a rapid identification of Yersinia ruckeri, which is the pathogen agent that causes the enteric red mouth disease (ERM) and produces high rates of mortality. Nine fish samples were asymptomatic, while 11 of them showed signs of ERM. In addition, 22 bacterial strains were isolated from the liver, spleen and kidney. PCR and specific primers (16S rRNA), were used to amplified a specific 575 bp DNA fragment of Yersinia ruckeri. Nineteen strains were identified as Yersinia ruckeri by PCR in symptomatic and asymptomatic fishes. It was established a diagnosis time of 26 hours, compared with the 2 or 3 days that would take the diagnosis using biochemical tests.

Keywords: Yersinia ruckeri, Oncorhynchus mykiss, PCR, diagnosis, Enteric Red Mouth Disease.

Introducción La Enfermedad Entérica de la Boca Roja, ERM (Enteric Redmouth Disease), es una infección sistémica de curso crónico y agudo y que afecta principalmente a la trucha arco iris, Oncorhynchus mykiss (Rodgers 1991), y genera elevadas tasas de mortalidad ocasionando importantes pérdidas económicas(Austin 1993). Esta infección es producida por Yersinia ruckeri aislada por primera vez, en el Valle Hagerman (USA) a principios del 1950 (Rucker 1966, Ross et al. 1966). Además ha sido reportada en Australia (Bullock et al. 1977), Iran (Soltani et al. 1999), Turquía (Timur & Timur 1991), Portugal (Sousa et al. 1996), Sudáfrica (Bragg & Henton 1986, Bragg 1991), China (Raidal et al. 2004), Francia (Lesel et al. 1983), Reino Unido (Austin et al. 2003) entre otros países. En Perú, Y. ruckeri fue aislada de 34 piscifactorías del departamento de Junín en el año 2004 utilizando procedimientos bioquímicos estándares (Bravo & Kojagura 2004). En ese trabajo, inicialmente se realizaron identificaciones presuntivas a través de tinción Gram, actividad de la oxidasa, motilidad, y reacción a la prueba O/F; posteriormente la confirmación de Y. ruckeri se realizó en Chile mediante una reacción de aglutinación con el antisuero Tipo I. El cultivo de trucha arco iris es una actividad económica importante en el Perú, según reporte del Ministerio de la Producción (2010). De las 17,320 TM procedentes de la acuicultura continental, 14,250 TM corresponden al cultivo de trucha (PRODUCE 2010).

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Yersinia ruckeri se transmite de manera horizontal es decir a través del agua, por las deyecciones de los peces infectados o portadores al pez susceptible (Rodger 1991). La ERM se caracteriza por hemorragias en la boca y alrededores, presencia de zonas hemorrágicas en la superficie del cuerpo e inflamación en la base de las aletas, opérculos, paladar (Bullock & Cipriano 1990). La ERM también ha sido referida como Yersiniosis ya que no siempre los peces afectados presentan las características áreas enrojecidas de la boca (Frerichs et al. 1985, Inglis et al. 1993).

Asimismo, este término es usado para distinguir una infección crónica en comparación con la ERM que se muestra de forma aguda (Carson & Wilson 2009).

También se puede presentar exoftalmia con hemorragias en el orbital (Rucker 1966, Horne & Barnes 1999, Avci & Birincioğlu 2005). Además, presentan un oscurecimiento de la piel y distensión abdominal, se pueden observar cambios en el comportamiento de los peces, como nado cerca de la superficie y movimientos lentos. Con frecuencia, los peces afectados se encuentran en estado de letargo y en áreas con bajo flujo de agua, además a menudo pierden el apetito. Esta enfermedad puede afectar a los peces de todas las etapas de cultivo, pero es más aguda en alevinos. En peces de mayor tamaño, la enfermedad aparece de manera crónica (Avci & Birincioğlu 2005).

El cultivo de peces en condiciones intensivas genera factores de estrés, ligados a las propias condiciones de producción, a las altas densidades del cultivo y a la calidad del agua, favoreciendo

349

Sirvas-Cornejo et al.

así la aparición de enfermedades infecciosas y toxicológicas (Reno 1998).

Estas cepas fueron incubadas en placas con Agar Tripticasa de Soya (TSA). Los parámetros óptimos de temperatura y tiempo de incubación en placa fueron de 20 a 22 ºC durante 18 horas.

La sintomatología y lesiones de las enfermedades infecciosas de los peces carecen de la especificidad suficiente como para establecer un diagnóstico definitivo del posible agente patógeno (Gibello et al. 2001).

Yersinia ruckeri.- El Área de Investigación Experimental de Patobiología Acuática, de la Universidad Nacional Federico Villarreal (UNFV) perteneciente a la Facultad de Oceanografía, Pesquería y Ciencias Alimentarias (FOPCA), cedió una cepa de Yersinia ruckeri, la cual había sido aislada de truchas arco iris de la laguna de Paucarcocha, Lima, Distrito de Tanta - Provincia de Yauyos, a una altitud de 4284 m. La identificación de esta cepa fue confirmada por pruebas bioquímicas y empleada como control positivo.

La identificación definitiva de Y. ruckeri por los métodos microbiológicos tradicionales (como siembra en placa e incubación para obtener un cultivo joven, luego siembra en medios de cultivo conteniendo sustratos específicos como aminoácidos, carbohidratos, entre otros, para observar las reacciones bioquímicas de la cepa) duran de 2 a 3 días. Además la identificación con el sistema API 20E debe ser interpretada con precaución porque en ocasiones se ha confundido con el perfil de Hafnia alvei (Furones et al. 1993). Por otro lado, la técnica de PCR es un sistema de diagnóstico clínico que permite la identificación fiable y específica del agente etiológico Y. ruckeri en menor tiempo (Gibello et al. 2001).

Extracción de ADN.- Las extracciones de ADN se efectuaron en el Laboratorio de Biología Molecular de la Facultad de Oceanografía, Pesquería y Ciencias Alimentarias, UNFV, empleando el Kit AxyPrep ™ Bacterial Genomic DNA. El ADN de cada cepa aislada se obtuvo incubando previamente la cepa en Caldo Tripticasa de Soya (TSB). Además, en cada lote de reacción se empleó un blanco de extracción del Kit. Por otro lado, se escogió al azar una cepa identificada como Yersinia ruckeri por la técnica de PCR y se cultivó a diferentes tiempos de incubación (6, 8, 10, 12, 14, 16 y 18 h). Luego se realizaron extracciones de ADN y PCR a cada uno de los cultivos con el objeto de determinar el menor tiempo de diagnóstico.

El presente trabajo reporta la presencia de Y. ruckeri en Oncorhynchus mykiss en piscigranjas de Canta, Lima, utilizando la técnica de la PCR. Materiales y métodos Muestreo.- Se recolectaron 20 ejemplares (8 alevines y 12 juveniles) de trucha arco iris provenientes de los estanques de cultivo de la Piscigranja Acochinchan, Lima (Distrito de Huaros, Canta, 3333 m de altitud), de los cuales 11 ejemplares presentaron signos de enfermedad (Yersiniosis o ERM) mientras que 9 ejemplares asintomáticos fueron muestreados como control.

Asimismo, se determinó la temperatura y pH del agua.

Amplificación de ADN (PCR).- Se utilizaron los cebadores YER8 (5’-GCGAGGAGGAAGGGTTAAGTG- 3’) y YER10 (5’-GAAGGCACCAAGGCATCTCTG- 3’) correspondientes al ADN del gen que codifica la subunidad 16S del ARN ribosomal bacteriano (ARN 16S) (Gibello et al. 1999). Las amplificaciones fueron realizadas en un volumen de 25 µL de reacción conteniendo: 1 µL de ADN (diluido 1/100) extraído de la cepa bacteriana, 10 µm de cada primer (Eurofins MWG Operon), 2 mM de cada desoxinucleótido trifosfato (Fermentas), 5 µL del

Aislamiento de cepas.- Con el fin de aislar al patógeno se realizaron disecciones asépticas de los peces. Se empleó el método de estrías para aislar cepas bacterianas del hígado, bazo y riñón.

(a)

(d)

(b)

(c)

(e)

Figura 1. Signos externos. Oscurecimiento de la piel (a); boca roja (b); distención abdominal (c); secreciones (d); exoftalmia (e).

350

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Diagnóstico e identificación de Yersinia ruckeri por PCR

(a)

Aeromonas salmonicida (proveída por el Área de Investigación de Patobiología Acuática FOPCA, UNFV), Flavobacterium sp. (proveída por el Laboratorio de Biología Molecular – FOPCA, UNFV) y Escherichia coli (proveída por el Laboratorio de Microbiología – FOPCA, UNFV).

Resultados Signos patológicos.- Los especímenes enfermos (alevines y juveniles) de trucha arco iris analizados en este estudio mostraron signos evidentes y frecuentes como exoftalmia y oscurecimiento de la piel (Fig. 1a y e), distención abdominal (Fig. 1c) y secreciones (Fig. 1d) así como inflamación en la base de las aletas y paladar. Sin embargo, la característica más distintiva de la ERM, fue la clásica “boca roja” (Fig. 1b).

(b)

Otras características adicionales fueron inapetencia, letargia, nado cerca de la superficie con movimientos lentos o permanencia cerca de la salida del agua. La Figura 2 muestra los signos clínicos más relevantes que afectan a los órganos internos como: esplenomegalia del bazo, palidez y hemorragias en el hígado.

Características del cultivo bacteriano.- A partir de las muestras patológicas se lograron aislar en el medio de cultivo TSA un total de 22 cepas, las cuales mostraron características de colonia algo similares. Dichas colonias presentaron un tamaño comprendido entre 0,5 a 2 mm de diámetro, circulares, lisas, ligeramente convexas, y translúcidas ante la luz natural con un color blanco cremoso.

Amplificación de ADN.- Las muestras que mostraron la amplificación de un fragmento de ADN de 575 pb, de acuerdo con el tamaño esperado, fueron consideradas positivas.

(c)

Se confirmó la presencia de Y. ruckeri en 19 truchas arco iris de un total de 20 ejemplares colectados, de los cuales 11 ejemplares presentaron signos patológicos siendo los demás asintomáticos.

La especificidad de esta prueba fue corroborada con la PCR de Aeromonas salmonicida, Flavobacterium sp. y Escherichia coli, ninguna de las cuales mostró ADN amplificado con los cebadores descritos YER8 y YER10 (Fig. 3) confirmándose su especificidad para amplificar Y. ruckeri.

La figura 4 muestra ADN amplificado de Y. ruckeri, donde se puede apreciar que una de las muestras resultó negativa producto de una trucha asintomática.

La técnica de PCR es tan sensible que aún habiendo disminuido el tiempo de incubación de la cepa de 18 a 6 horas, se pudo detectar el patógeno en las muestras estudiadas (Fig. 5).

M 1500 pb

Figura 2. Hígado pálido y hemorrágico (a); bazo normal (b); bazo esplénico (c).

buffer Taq polimerasa (Fermentas) y 5 U/µL de Taq polimerasa (Fermentas). La reacción de amplificación se llevó acabo en el termociclador Applied Biosystems (Modelo M-201) por 35 ciclos de desnaturalización a 94 ºC por 1 min, anillamiento a 61,8 ºC por 1 min, elongación a 72 ºC por 1 min. Previamente una desnaturalización inicial a 92 ºC por 5 min y posteriormente una elongación final a 72 ºC por 8 min. En cada lote de reacción de PCR se empleó como control negativo a las cepas de Rev. peru. biol. 18(3): 349 - 353 (December 2011)

Y23

AS

BeAS

F

BeF

EC

BeEC

Y23

BL

1000 pb 700 pb

575 pb

500 pb 300 pb

Figura 3. M: Ladder, Y23: Yersinia ruckeri (control positivo), AS: Aeromonas salmonicida, BeAS: Blanco de extracción (Kit) para A. salmonicida, F: Flavobacterium sp., BeF: Blanco de extracción (Kit) para Flavobacterium sp., EC: Escherichia coli, BeEC: Blanco de extracción (kit) para E. coli, BL: Blanco de PCR.

351

Sirvas-Cornejo et al.

M

Y23

AS BeAS Be Y13 Y14

Y15

Y16

Y17

BL

1500 pb 1000 pb 700 pb 500 pb 300 pb

Figura 4. M: Ladder, Y23: Yersinia ruckeri (control positivo), AS: Aeromonas salmonicida, BeAS: Blanco de extracción (kit) para A. salmonicida, Be: Blanco de extracción para muestras (kit), Y13 al Y15: Muestras (+): Yersinia ruckeri, Y16: Muestra (-): No identificada, Y17: Muestra (+): Yersinia ruckeri, BL: Blanco de PCR.

M

18h(Y23) 16h

14h

12h

10h

8h

6h

BL

1500 pb 1000 pb 700 pb 500 pb 300 pb

Figura 5. M: Ladder, 18h(Y23): control positivo (18h de incubación), 16h: Y. ruckeri (16 h de incubación), 14h: Y. ruckeri (14 h de incubación), 12h: Y. ruckeri (12 h de incubación), 10h: Y. ruckeri (10 h de incubación) 8h: Y. ruckeri (8h de incubación), 6h: Y. ruckeri (6h de incubación), BL: Blanco de PCR.

Discusión A pesar que han sido descritos métodos de PCR de alta sensibilidad capaces de detectar menos de 20 UFC por gramo de órgano (Gustafson et al. 1992, Wiklund et al. 2000) esta sensibilidad es bastante menor a la obtenida a partir de ADN purificado o de microorganismos aislados. Esta reducción en la sensibilidad de la técnica se atribuye a la existencia de sustancias inhibidoras en los tejidos y órganos de los animales como la hemoglobina y proteínas séricas de la sangre, grasas y glicógeno, así como también determinados reactivos añadidos durante el procesado de la muestra (Wilson 1997). No obstante, las sustancias que inhiben la reacción de PCR actúan interfiriendo la lisis del microorganismo necesaria para la liberación del ácido nucleico a amplificar, degradando o capturándolo e inhibiendo la actividad de la polimerasa. En el presente estudio se amplificó el ADN total a partir de cepas bacterianas aisladas, mientras que otros autores como Gibello et al. (1999) y Kirkan et al. (2006), amplificaron el ADN a partir de tejidos homogenizados.

Los ensayos de PCR no diferencian entre ADN procedente de células vivas o muertas (Hiney & Smith 1998), como la amplificación del ADN de bacterias muertas tras un tratamiento efectivo con un antibiótico o en animales vacunados con microorganismos inactivados. El método de diagnóstico del presente estudio se puede realizar en peces previamente vacunados o en tratamiento con cualquier tipo de antibiótico ya que la detección es a partir de cepas aisladas en vez de tejidos y se confirma la presencia de la bacteria patógena en su forma viable.

352

La detección de portadores asintomáticos es muy importante para prevenir la transmisión y propagación de la ERM (Leclercq et al. 1989). Diferentes investigadores (Bush & Lingg 1975, Hunter et al. 1980) han demostrado exitosamente la detección de patógenos en peces infectados asintomáticos. En los estudios realizados por Gibello et al. (1999), Altinok et al. (2001), Kirkan et al. (2006), se utilizó la PCR para detectar la presencia de Y. ruckeri en peces infectados natural y artificialmente, y en nuestro estudio se empleó además de la PCR, métodos microbiológicos para aislamiento de cepas logrando detectar Y. ruckeri tanto en peces con signos de la Enfermedad Entérica de la Boca Roja, como en peces asintomáticos.

Agradecimientos Los autores agradecen al IRD (Institut de Recherche pour le Développement) por el apoyo brindado dentro del marco del convenio UNFV-IRD. Además un especial agradecimiento a la Piscigranja Acochinchan, al Dr. Fernando Carvajal V. por su valioso aporte, a Edmundo Guzmán y a todos los colaboradores que hicieron posible la ejecución del presente estudio.

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353

Sirvas-Cornejo et al.

354

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Rev. peru. biol. 18(3): 355 - 360 (Diciembre 2011) © Facultad de Ciencias Biológicas UNMSM

Materia orgánica y dinámica bacteriana de suelos de cultivos de papa y maíz ISSN 1561-0837

Efecto de la adición de materia orgánica sobre la dinámica poblacional bacteriana del suelo en cultivos de papa y maíz Effect of addition of organic matter on bacterial population dynamics of soil in potato and corn crops David García Ventocilla1, Gloria Mamani Gamarra1, Nicolás Román Cabello1, Luis Suárez Salas2, Ana Contreras Marín2, Julio Malca Jauregui2 1 Instituto de Biotecnología e Ingeniería Genética - Universidad Nacional del Centro del Perú.

Ciudad Universitaria, Av. Mariscal Castilla Nº 3909 - 4089, El Tambo, Huancayo, Perú. Email David Garcia Ventocilla: d2_gv@hotmail.com 2 Instituto de Investigaciones para el Desarrollo Tecnológico (ININDETEC)

Resumen Se determinó el efecto de la fertilización orgánica sobre las poblaciones bacterianas del suelo en cultivos de papa y maíz durante la campaña agrícola 2008-2009 en terrenos de cuatro localidades del Valle del Mantaro: INIA Santa Ana (Huancayo), en la EEA El Mantaro (Jauja), Vista Alegre y Huayao (ambos en Chupaca). En estos lugares se instalaron parcelas experimentales de papa (Solanum tuberosum L. Var. Canchan) y maíz (Zea maíz L. Var. Cusco mejorado) bajo abonamiento orgánico (vacuno, ovino, cuy), fertilización química y sin fertilización alguna (testigo). Para dicho efecto se empleó las técnicas de la Electroforesis en Gel de Gradiente Desnaturalizante (DGGE) con amplificación de la región 968 – 1401 del rDNA 16S. Los resultados obtenidos muestran que la variabilidad de las poblaciones bacterianas en los suelos está afectado directamente por el tipo de cultivo mas no por el tipo de fertilización ya que el efecto de este último resulta variable para cada zona experimental y cultivo encontrándose solo en la zona experimental de Chupaca - Maíz una segregación de los tratamientos con fertilización orgánica de los tratamientos químicos. También se ha encontrado que la variación de las comunidades microbianas no sufre variaciones significativas en los suelos con cultivos de maíz obteniéndose coeficientes de similaridad para todos los tratamientos por encima del 80% mientras que para los tratamientos en los cultivos de papa dicho coeficiente fue de tan solo del 60%.

Palabras clave: Materia orgánica, papa, maíz, DGGE.

Abstract

Presentado: 18/02/2011 Aceptado: 10/11/2011 Publicado online: 08/02/2012

The effect of organic fertilization on soil bacterial populations in potato and corn crops during the crop season 2008-2009 at four sites in the Mantaro Valley locations: INIA Santa Ana (Huancayo), the EEA El Mantaro (Jauja), Vista Alegre and Huayao (both in Chupaca). In these places were set up experimental plots of potato (Solanum tuberosum L. var. Canchan) and corn (Zea maize L. Var. Cusco enhanced) under organic manure (cattle, sheep, guinea pig), chemical fertilizer and no fertilizer at all (control) . To do this we used the techniques of electrophoresis Denaturing Gradient Gel (DGGE) with amplification of the region from 968 to 1401 of 16S rDNA. The results show that the variability of bacterial populations in soil is directly affected by crop type but not by the type of fertilization and the effect of the latter is variable for each experimental area and culture found only in the experimental area of Chupaca - Corn segregation of treatments with organic fertilization of chemical treatments. We have also found that the variation of the microbial communities did not suffer significant variations in soils with maize similarity coefficients obtained for all treatments above 80% while for the treatments in potato crops that rate was only 60%.

Keywords: Organic matter, potato, corn, DGGE.

Introducción Se considera que entre el 80 y 90% de los procesos que ocurren en los suelos, son reacciones mediadas por los microorganismos (Nannipieri et al. 2003). Los microorganismos han sido descritos como el motor de los ecosistemas terrestres (Killham 1994), dado su papel en la mineralización y transformación de la materia orgánica, además de influir directamente en el metabolismo de las plantas, ya que también fijan nitrógeno, producen metabolitos, actúan como controladores biológicos e inclusive pueden descomponer productos tóxicos (Azevedo 1998), también ayudan a mantener la estructura del suelo, ya que actúan como agentes cementantes que estabilizan los agregados del mismo (Elliott et al. 1996). Es por ello que la biomasa microbiana toma un papel crítico en todos los ecosistemas naturales y manipulados por el hombre. Algunas prácticas agrícolas pueden producir alteraciones críticas en la comunidad microbiana del suelo. Una de estas prácticas es el uso de excesivos fertilizantes inorgánicos y pesticidas que causan cambios en las densidades de hongos y bacterias, la supresión o la promoción del crecimiento, y la actividad microbiana. Estos cambios pueden contribuir a la Rev. peru. biol. 18(3): 355 - 360 (December 2011)

pérdida de la diversidad y o función de la comunidad microbiana (Heilmann et al. 1995, Girvan et al. 2004). En cuanto a las prácticas agrícolas que influyen positivamente en el mantenimiento de la calidad de los suelos, tenemos el uso de la materia orgánica como fertilizante, la cual mejora las diversas propiedades del suelo como la capacidad de intercambio cationico, retención del agua y estructura del suelo, pero el aporte probablemente mayor de este tipo de fertilización es el desarrollo y promoción de una gran actividad biológica (Felipe-Morales 2002).

Dado a estos antecedentes el objetivo de este estudio fue determinar el efecto del tipo de fertilización orgánica sobre la distribución bacteriana en los suelos al finalizar los cultivos de papa y maíz. Para ello se empleó las técnicas de la Electroforesis en Gel de Gradiente Desnaturalizante (DGGE), técnica ampliamente utilizada en ecología microbiana para determinar la composición y estructura de comunidades microbianas dominantes permitiendo estudiar las comunidades microbianas en términos ecológico moleculares definidos por el número y/o forma de la distribución del material genético extraído de las poblaciones bacterianas directamente del suelo (Garbeva et al. 2004).

355

García Ventocilla et al.

Optimización de las condiciones de desarrollo de la electroforesis en geles de gradiente desnaturalizante.

Material y métodos Áreas de estudio y recolección de muestras La investigación se realizó durante la campaña agrícola 20082009 en terrenos de cuatro localidades del Valle del Mantaro: INIA Santa Ana (Huancayo), en la EEA El Mantaro (Jauja), Vista Alegre y Huayao (ambos en Chupaca). Los análisis fisicoquímicos se realizaron en el Laboratorio de Análisis de Suelos, Aguas y Plantas (LASAP) y el análisis molecular para evaluar el efecto de fertilización orgánica sobre las poblaciones bacterianas en el suelo se realizaron en los laboratorios del Instituto de Biotecnología e Ingeniería Genética (IBIG), ambos pertenecientes a la Universidad Nacional del Centro del Perú.

Se instalaron parcelas experimentales de papa (Solanum tuberosum L. Var. Canchan) y maíz (Zea maíz L. Var. Cusco mejorado) en las cuatro zonas anteriormente mencionadas bajo abonamiento orgánico (ovino (T1), cuy (T2), vacuno (T3)), fertilización química (T4) y sin fertilización alguna (testigo, T5). La cantidad de estiércol fue de 15 t.ha-1 para cultivo de papa y de 10 t.ha-1 para cultivo de maíz. Las dosis de fertilizante químico fueron de 0,180 – 0,120 – 0,080 tm.ha-1 de N-P-K, respectivamente (Ver tabla 1).

Tabla 1. Dosis de abono orgánico y fertilizante químico aplicadas a cada cultivo. Tratamientos: T1: ovino, T2: cuy, T3: vacuno, T4: fertilización química N-P-K: (T4), Testigo: T5. tm ha-1; n=3 Zona

Maíz T1

T2

T3

T4

T5

Huayao

10

10

10

0,18-0,12-0,08

0

Mantaro

10

10

10

0,18-0,12-0,08

0

Santa Ana

10

10

10

0,18-0,12-0,08

0

Chupaca

10

10

10

0,18-0,12-0,08

0

Papa T1

T2

T3

T4

T5

Huayao

15

15

15

0,18-0,12-0,08

0

Mantaro

15

15

15

0,18-0,12-0,08

0

Santa Ana

15

15

15

0,18-0,12-0,08

0

Chupaca

15

15

15

0,18-0,12-0,08

0

Los análisis se realizaron antes del experimento y al final de los cultivos. La instalación de las parcelas experimentales siguió un diseño de bloques completamente randomizado con tres repeticiones por tratamiento. Se cogieron 100 g de suelo entre plantas de cada repetición y cada tratamiento, para ello se empleó una pequeña lampa, la cual sirvió para remover la parte superficial del suelo tomando de esta manera la alícuota a una profundidad aproximada entre 5 y 10 cm.

Las muestras recolectadas fueron trasladadas en refrigeración al laboratorio para el procesamiento de las mismas que consistió en la eliminación del exceso de humedad, tamizado en mallas de 2 mm de tamaño de luz y mezcla de las tres muestras de un mismo tratamiento para obtener una sola muestra representativa, la cual sirvió para los análisis respectivos. Las muestras para los análisis moleculares se almacenaron a -40 ºC.

356

Extracción y purificación de DNA microbiano de suelo Se evaluaron tres métodos de extracción de DNA microbiano a partir muestras de suelo. Estos métodos corresponden a las metodologías empleadas por Seishi et al. (2004), Quirino et al. (2006) y Griffiths et al. (2000), las cuales fueron adaptadas a las condiciones del laboratorio en cuanto a equipamiento e insumos en algunos casos. Para la purificación del DNA se hizo uso de los kits “Wizard DNA Clean – Up System” de la empresa comercial Promega USA y “AxyPrep Multisource DNA Mini” de la empresa comercial Axigen USA. Tanto la concentración y pureza de DNA fueron determinados mediante visualización en geles de agarosa.

Amplificación de la región 968 – 1401 del rDNA 16S Para la amplificación de la región 968 – 1401 del rDNA 16S se empleó los iniciadores 968F – 1401R y el kit GoTaq DNA Polymerase (catalogo#: M3005). Se probaron 12 programas en las que se variaron temperaturas y tiempos de alineamiento, además se experimentaron con 12 concentraciones diferentes de insumos de PCR tales como MgCl2, dNTPs, Taq, y primers.

Electroforesis en geles de gradiente desnaturalizante (DGGE) Se preparó geles de polacrilamida al 6% (w/v) con gradiente de desnaturalización de 40-70% (urea – formamida). Para la formación del gradiente y corrida de los geles se hizo uso del sistema de electroforesis vertical Denaturing Gradiente Gel Electophoresis System 2001 de la empresa C.B.S. Scientific Compay, Inc. En este equipo se evaluó el tiempo y el voltaje a aplicar en la corrida para la obtención de bandas con la resolución deseada. La temperatura y buffer de corrida empleado en todos los casos fue de 60 ºC y TAE 0.5X respectivamente.

Para la tinción de los geles se empleó el protocolo para tinción de geles de poliacrilamida con nitrato de plata propuesta por Embrapa solos (2004).

Efecto de la adición de la materia orgánica en la diversidad poblacional bacteriana del suelo Los perfiles de bandas que se obtuvieron a partir de las corridas electroforéticas (DGGE) fueron convertidos en una matriz binaria de acuerdo a la presencia o ausencia de bandas. Esta matriz fue procesada en el software NTSYSpc 2.1 con coeficiente de similaridad DICE y agrupado con el algoritmo UPGMA. Resultados y discusión Optimización de las condiciones de desarrollo de la electroforesis en geles de gradiente desnaturalizante De los resultados de la evaluación de los métodos para la extracción de DNA del suelo, se optó por la metodología propuesta por Quirino et al. (2006), debido a que se obtiene DNA de buena calidad y sin presencia de RNA con peso de aproximadamente 12000 bp visualizados en gel de agarosa al 1%, cuyo valor coincide al que reporta Silva (2004) y Bresolin (2006).

Del proceso de estandarización de la PCR para la amplificación de la región de 968 – 1401 del rDNA 16S se logró obtener amplificados satisfactorios con el siguiente programa y formulación: desnaturalización inicial de 3 min a 94 ºC; 35 Rev. peru. biol. 18(3): 355 - 360 (Diciembre 2011)

Materia orgánica y dinámica bacteriana de suelos de cultivos de papa y maíz

ciclos (desnaturalización 94 °C x 1 min; alineamiento: 58 °C x 1 min; polimerización: 72 °C x 1 min); extensión final de 10 min a 72 ºC. La concentración de los insumos de la PCR fueron: dNTPs: 0,2 mM; MgCl2: 0 mM; Green GoTaq Buffer: 1X; 968 (forward): 0,5 µM; 1401 (reverse): 0,5 µM; GoTaq DNA polymerasa: 0,025 U/µL. Para las corridas de los geles DGGE se determinó que a las 20 horas, a 70 V y 60 ºC se obtienen bandas con la separación y resolución adecuada para la interpretación de los geles.

En el proceso de extracción y purificación de DNA microbiano de las muestras de suelo de los tratamientos para cada lugar y cultivo se pudo apreciar bandas con intensidades diferentes, esto debido probablemente a la cantidad de material extraído y origen de estas según lo reporta Silva (2004). De este último se resalta la pobre extracción de DNA de las muestras provenientes de zona experimental de Santa Ana, logrando extraer DNA a partir de los suelos con tratamientos T1, T3 y T4 con cultivos de papa y T5 con cultivos de maíz. Esto presumiblemente a la disminución de la concentración de las poblaciones bacterianas debido a la acidificación y salinización de los suelos en cultivos de maíz (Tabla 2 y 3).

En cuanto a la amplificación de la región 968 – 1401 de las muestras de DNA extraído se obtuvo bandas con peso aproximado de 450 bp presentando intensidades adecuadas para el empleo de la técnica del DGGE. Estos resultados coinciden con lo reportado por Bresolin (2006).

Efecto de la adición de la materia orgánica en la diversidad poblacional bacteriana del suelo Poblaciones bacterianas antes de la instalación de los cultivos Los suelos de las zonas experimentales de Huayao y Chupaca presentaron poblaciones bacterianas muy similares cuyo

Tabla 2. Propiedades, químicas del suelo en las cuatro localidades experimentales antes de aplicar los tratamientos. (Noviembre de 2008). Fosforo (P), Conductividad Eléctrica (CE), Carbonato de calcio (CaCO3).

Localidad Suelo Chupaca

Santa Ana

Mantaro

Huayao

Trat.

pH

T1 T2 T3 T4 T5 T1 T2 T3 T4 T5 T1 T2 T3 T4 T5 T1 T2 T3 T4 T5

8,03 8,07 8,02 8,00 8,04 6,02 5,94 6,00 6,03 6,18 7,37 7,42 7,29 7,55 7,87 7,52 8,06 7,55 7,84 7,87

P

CE

(ppm)

dS/m

%

21,62

0,324 0,424 0,394 0,325 0,356 0,157 0,132 0,103 0,106 0,106 0,176 0,186 0,275 0,163 0,195 0,420 0,459 0,465 0,435 0,643

2,34 2,34 2,56 2,45 2,46 0,37 0,35 0,23 0,45 0,46 0,74 1,34 1,34 2,30 2,46

23,97

46,35

43,41

CaCO3

coeficiente de similaridad (CS) alcanzó un máximo del 65%.

Además estos suelos albergaron a una gran cantidad de especies bacterianas representados por el número de bandas presentes en los geles DGGE (Muyzer & Smalla 1998), encontrándose 64 y 50 bandas para los suelos de Huayao y Chupaca respectivamente.

En los suelos del El Mantaro y Santa Ana el número de bandas presentes fue mucho menor (21 para Mantaro y 20 para Santa

Tabla 3. Variación real de los valores correspondientes a las propiedades físico-químicas del suelo en las cuatro localidades experimentales al final de los cultivos de papa y maíz tratados con cinco tipos de abonamiento. Fosforo (P), Conductividad Eléctrica (CE).

Localidad/suelo

Cultivo de papa

Trat. pH

Chupaca

Santa Ana

Mantaro

Huayao

T1 T2 T3 T4 T5 T1 T2 T3 T4 T5 T1 T2 T3 T4 T5 T1 T2 T3 T4 T5

Rev. peru. biol. 18(3): 355 - 360 (December 2011)

-0,03 0,03 0,08 -0,10 0,16 0,08 0,36 0,00 -0,63 -0,48 -0,07 -0,12 0,01 -0,25 -0,57 0,38 -0,06 0,35 0,06 0,03

Cultivo de maíz

P

CE

(ppm)

dS/m

84,28 71,08 69,48 75,08 72,88 24,93 17,53 26,63 16,53 16,33 31,25 29,35 27,95 -0,35 19,55 45,09 24,59 13,99 25,39 5,29

0,560 0,530 0,393 0,471 0,440 0,213 0,149 0,252 0,237 0,122 0,144 0,117 0,067 0,265 0,097 -0,010 -0,087 -0,065 0,081 -0,242

pH 0,37 0,43 0,48 0,50 0,46 -0,42 -0,34 -0,30 -0,43 -0,68 0,73 0,78 0,81 0,25 0,23 0,68 0,24 0,75 0,46 0,33

P

CE

(ppm)

dS/m

106,50 59,22 65,05 90,91 65,05 22,86 34,27 50,82 27,28 14,24 -13,61 17,63 19,75 25,03 -19,32 8,08 16,40 36,13 24,65 -7,34

-0,106 -0,222 -0,195 0,046 -0,159 0,214 0,393 0,304 0,224 0,317 0,090 0,066 -0,009 0,056 0,062 -0,156 -0,204 -0,218 -0,176 -0,382

357

García Ventocilla et al.

M H SA

CH SA

0,36

0,43

0,50

0,58

0,65

Coefficient

Figura 1. A: Fotografia de Gel 16S rDNA-DGGE de muestras recolectadas antes de la instalación de los cultivos. Mantaro (M), Huayao (H), Chupaca (CH), Santa Ana (SA). B: Dendograma respectivo de la figura 1.a generado por el algoritmo UPGMA y coeficiente de similaridad DICE.

Ana) resaltando poblaciones bacterianas diferentes de la zona experimental de Santa Ana en comparación de las demás zonas experimentales. Esto se observa en la Figura 1B donde la similaridad de las poblaciones bacterianas de las muestras de suelo de Santa Ana se separan del resto formando un grupo con una similaridad del 36%. De estos resultados se evidencia la pobre fertilización biológica encontrada en los suelos experimentales del El Mantaro y Santa Ana. Poblaciones bacterianas después de la siembra Chupaca.- En los suelos donde se desarrollaron los cultivos de papa se encontró un coeficiente de similaridad máximo del 89% para los tratamientos T2 y T4. Esto nos indica que ambos tratamientos favorecen el desarrollo de poblaciones bacterianas similares. También se puede observar que los grupos T5–T3 y T1-T2-T3 proporcionan poblaciones bacterianas con una similaridad del 79% cuyo valor es un indicativo de la no variación dramática en cuanto al manejo de los suelos con diferentes opciones de fertilización. En cuanto a la riqueza de especies bacterianas representadas por el número de bandas presentes en los geles DGGE se encontró que los tratamientos T1, T3 y T5 generaron la mayor cantidad de bandas (55, 53 y 50 bandas respectivamente), mientras que los tratamientos T2 y T4 fueron los que produjeron el menor número de bandas (43 y 42 bandas respectivamente). También se pudieron apreciar bandas únicas en los tratamientos T1, T3 y T5 (5, 5 y 3 bandas respectivamente).

En los suelos en donde se desarrollaron los cultivos de maíz se encontró un CS máximo del 93% para los tratamientos T1 y T3 y un CS mínimo del 83% entre los grupos T1-T3-T2 y T4-T5. Estos valores difieren dramáticamente a los obtenidos en los suelos con cultivo papa, mostrando una relación directa entre la distribución de las poblaciones bacterianas versus la fertilización orgánica, la no fertilización y la fertilización química. En cuanto a la riqueza de especies bacterianas se encontró que el tratamiento T5 genera una cantidad un poco mayor de

358

bandas (47 bandas) comparado a los demás tratamientos que produjeron 44, 44, 42 y 43 en los tratamientos T1, T2, T3 y T4 respectivamente. En cuanto a la producción de bandas únicas el T5 produjo 4 bandas únicas, mientras que el T1, T2 y T4 produjeron 2, 2 y 1 banda respectivamente. El T3 es el único que no presenta bandas únicas.

Mantaro.- En los suelos en donde se desarrollaron los cultivos de papa se encontró un CS máximo del 96% para los tratamientos T4 y T5. Los grupos T3 y T1-T2-T4-T5 proporcionan poblaciones bacterianas con una similaridad del 78%. En cuanto a la riqueza de especies bacterianas, los tratamientos T1, T2, T4 y T5 generaron la mayor cantidad de bandas (30, 31, 33 y 34 bandas respectivamente), mientras que el tratamiento T3 un número de bandas menor (22 bandas). Solo el tratamiento T4 produjo una banda inédita.

En los suelos en donde se desarrollaron los cultivos de maíz se encontró un CS máximo del 98% para los tratamientos T3 y T4 y un CS mínimo del 88% entre los grupos T5 y T1-T2T3-T4 mostrando una relación directa entre la distribución de poblaciones bacterianas versus la fertilización y la no fertilización.

En cuanto a la riqueza de especies bacterianas se encontró que los tratamientos T3 y T4 presentaron un número mayor de bandas (32 y 31 bandas respectivamente) comparado a los tratamientos T1, T2 y T5 que produjeron 27, 27 y 23 bandas respectivamente.

El T3 fue el único que produjo una banda única.

Huayao.- En los suelos donde se desarrollaron los cultivos de papa se encontró un CS máximo del 74% para los tratamientos T1 y T3. Los grupos T2 y T1-T3 proporcionan poblaciones bacterianas con una similaridad del 78%. En cuanto a la riqueza de especies bacterianas, los tratamientos T1, T2, T3 generaron 19, 23 y 19 bandas con 2, 7 y 3 bandas únicas respectivamente.

En los suelos en donde se desarrollaron los cultivos de maíz se encontró un CS máximo del 94% para los tratamientos T1 y T4 y un CS mínimo del 80% entre los grupos T2 y T1-T4-T5 mostrando una relación directa entre la distribución de poblaciones bacterianas versus la fertilización y la no fertilización. En cuanto a la riqueza de especies bacterianas, los tratamientos T1, T2, T4 y T5 generaron 25, 19, 25 y 23 bandas con 0, 1, 1, 0 bandas únicas respectivamente.

Santa Ana.- En los suelos en donde se desarrollaron los cultivos de papa se encontró un CS máximo del 70% para los tratamientos T1 y T4. Los grupos T3 y T1-T4 proporcionan poblaciones bacterianas con una similaridad del 60%. En cuanto a la riqueza de especies bacterianas, los tratamientos T1, T3, T4 generaron 33, 32, 36 con 6, 4, 3 bandas únicas respectivamente.

A partir de estos resultados para ambos cultivos se destaca que las poblaciones bacterianas en los suelos está afectado directamente por el tipo de cultivo albergado. Esto concuerda con los reportado por (Garbeva et al. 2004) quien menciona que el tipo de planta es el factor determinante en la estructura de comunidades microbianas del suelo debido a que estos son los mayores contenedores de formas específicas de carbono y energía.

Los resultados también muestran la poca variación de las poblaciones bacterianas en los suelos instalados con maíz aún en los diferentes manejos que fueron aplicados. Esto se deduce a partir de los CS por encima del 80%. Estos resultados concuerdan con lo reportado por Ridder–Duine et al. (2005) demostrando que los cultivos de maíz no ejercen un efecto consistente en las coRev. peru. biol. 18(3): 355 - 360 (Diciembre 2011)

Materia orgánica y dinámica bacteriana de suelos de cultivos de papa y maíz

Chupaca Papa

Huayao Papa

Maíz

Maíz

Santa Ana Papa

Maíz

Figura 2. Geles 16S rDNA-DGGE. Muestras recolectadas al término del cultivo (semana antes de cosecha). Zonas experimentales: Huayao (H), Chupaca (CH), Santa Ana (SA), Cultivos: papa (P) y maíz (M), Tratamientos: T1: ovino, T2: cuy, T3: vacuno, T4: químico, T5: testigo.

Chupaca Papa

Mantaro

Huayao Papa

CHPT1

Papa

HPT1

MPT5

CHPT2

HPT3

MPT4

CHPT4

HPT2

MPT2

CHPT3

MPT1

CHPT5 0.79

0.82

0.84 0.87 Coefficient

0.64

0.89

Maíz

0.67

0.69 0.71 Coefficient

MPT3

0.74

0.78

Maíz

0.82

0.87 0.91 Coefficient

0.96

Maíz

CHMT1

HMT4

MMT5

CHMT3

HMT2

MMT4

HMT3

MMT3

CHMT2

HMT4

MMT2

CHMT4 CHMT5 0.84

0.86 0.88 0.91 Coefficient

0.93

MMT1 0.45

0.51

0.58 0.65 Coefficient

0.71

0.88

0.91

0.93 0.96 Coefficient

0.98

Figura 3. Análisis de poblaciones bacterianas a través de 16S rDNA-DGGE empleando iniciadores 16S (968 – 1401). Dendograma generado por el algoritmo UPGMA y coeficiente de similaridad DICE. Muestras recolectadas al término del cultivo (semana antes de cosecha). Zonas experimentales: Mantaro (M), Huayao (H), Chupaca (CH), Cultivos: papa (P) y maíz (M), Tratamientos: T1: ovino, T2: cuy, T3: vacuno, T4: químico, T5: testigo.

Rev. peru. biol. 18(3): 355 - 360 (December 2011)

359

García Ventocilla et al.

munidades microbianas de su rizósfera cuando se le compara a lo largo de un amplio grupo de suelos. Este efecto no ocurre en los suelos instalados con papa en las cuales los CS están por encima del 60%. Otro punto a considerar es la relación ente el tipo de fertilización con la variabilidad y abundancia de poblaciones bacterianas se ha encontrado en todos los casos un solo clusters (Chupaca) que segregan los tratamientos con fertilización orgánica de los tratamientos químicos. Con respecto a las demás zonas experimentales este efecto no resultó igual. Adeboye et al.

(2006) demostraron que la fertilización química no presenta un efecto significativo sobre la biomasa microbiana del suelo, pero si la rotación del cultivo. También demostraron que el flujo de la biomasa microbiana del suelo está determinado por el pH y el carbono orgánico presente en el suelo. Suzuki et al. (2005) señalan además que la fertilización orgánica tiene poco impacto en las comunidades microbianas mientras que la inorgánica con amonio ejerce un fuerte efecto sobre la abundancia relativa de los diferentes grupos microbianos. Esto queda demostrado en el trabajo ya que en todos los casos se encontró que la riqueza de especies microbianas (número de bandas) en el tratamiento químico resultó estar a la par o por encima de los tratamientos con materia orgánica.

Conclusiones.- El efecto del tipo de fertilización en la dinámica poblacional de las bacterias en el suelo resultó variable para cada zona experimental y cultivo. No se ha encontrado una relación directa concluyente entre el tipo de fertilización con la distribución de las comunidades bacterianas. En lugar de ello se pudo determinar que la variabilidad de las poblaciones bacterianas en los suelos está afectado directamente por el tipo de cultivo mas no por el tipo de fertilización.

Agradecimientos Al Programa de Ciencia y Tecnología-FINCyT por el financiamiento del presente estudio. Así mismo nuestro sincero agradecimiento a la bióloga Milagros Zavaleta Apéstegui.

Literatura citada Adeboye, M.K.A., E.N.O. Iwuafor y J.O. Agbenin. 2006. The effects of crop rotation and nitrogen fertilization on soil chemical and microbial properties in a Guinea Savanna Alfisol of Nigeria. Plant Soil 281: 97–107.

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Rev. peru. biol. 18(3): 355 - 360 (Diciembre 2011)

Rev. peru. biol. 18(3): 361 - 366 (Diciembre 2011) © Facultad de Ciencias Biológicas UNMSM

Medios de propagación y enraizamiento in vitro de vid paraISSN elaborar pisco 1561-0837

Optimización de los medios de propagación y enraizamiento in vitro de las variedades “criollas” de vid para elaborar pisco Optimization of media for in vitro propagation and rooting of creole grapevine varieties utilized for pisco making Eugenio González1, Diego Pignataro1, Gisella Orjeda1, Wilfredo L. Gonzáles2 y Daniel Clark*1 1 Unidad de Genómica, Facultad de Ciencias y Filosofía, Universidad Peruana Cayetano Heredia Avenida Honorio Delgado 430, San Martín de Porres, (Apartado Postal 4314, Lima 100), Perú 2 Laboratorio de Ecología Evolutiva, Facultad de Ciencias y Filosofía, Universidad Peruana Cayetano Heredia Email Eugenio González:

egoncla@gmail.com Email Diego Pignataro:

jose.pignataro.l@upch.pe Email Gisella Orjeda:

gisella.orjeda@upch.pe Email Wilfredo Gonzáles:

wilfredo.gonzales@upch.pe *Autor para correspondencia Email Daniel Clark:

daniel.clark@upch.pe

Resumen Los protocolos y medios disponibles para la propagación y enraizamiento in vitro de la vid no han sido ajustados todavía a las variedades “criollas” con las que se elabora el pisco. En este trabajo se exploró el uso de medios para la propagación de las variedades Quebranta, Negra Criolla, Albilla, Italia y Torontel, así como para el enraizamiento de las variedades Quebranta, Albilla y Torontel, a partir de los medios estándares reportados en la literatura científica. Para ello, se pusieron a prueba 11 variantes del medio estándar de propagación de vid (medio Murashige y Skoog 1X, 3% de sucrosa, 1 mg/L de benzilaminopurina y 0,8% de agar) en las que se combinaron reducciones en la fuerza del medio con reducciones en la concentración de hormona. Para el enraizamiento posterior, se probaron el ácido naftalen acético y el ácido indol acético a 5 concentraciones distintas por cada hormona. Los resultados mostraron que el mejor medio para la propagación de las variedades Quebranta, Albilla e Italia es el estándar; las variedades Negra Criolla y Torontel tuvieron mejor desempeño con una reducción de la concentración de benzilaminopurina a 0,25 y 0,5 mg/L, respectivamente. El mejor enraizamiento en la variedad Quebranta ocurrió con 80 µg/L de ácido naftalen acético y 2 mg/L de ácido indol acético; las variedades Albilla y Torontel tuvieron una mejor respuesta al ácido indol acético a concentraciones de 2 y 1 mg/L, respectivamente.

Palabras clave: Cultivo in vitro, propagación, enraizamiento, vides criollas, pisco.

Abstract

Presentado: 25/02/2011 Aceptado: 23/12/2011 Publicado online: 08/02/2012

The protocols and culture media available for in vitro propagation and rooting of grapevine have not yet been adjusted to the creole varieties used for pisco making. In this paper we explored the use of culture media for the propagation of varieties Quebranta, Negra Criolla, Albilla, Italia and Torontel and for rooting varieties of Quebranta, Albilla and Torontel based on known standard culture media.To address this issue, 11 media derived from the standard propagation medium for grapevine (1X Murashige & Skoog medium, 3% sucrose, 1 mg/L benzilaminopurine, and 0,8% agar) with diminished medium strength and/or hormone concentration were tested.

In addition, 5 concentrations of naphtalen acetic acid or indol acetic acid were tested for rooting. We found that Quebranta, Albilla, and Italia varieties show a better growth in the standard propagation medium; by contrast, Negra Criolla and Torontel grew better in media with diminished benzilaminopurine concentrations (0,25 and 0,5 mg/L, respectively). Quebranta rooted better with 80 µg/L naphtalen acetic acid or 2 mg/L indol acetic acid, while Albilla and Torontel showed better rooting results with 2 and 1 mg/L indol acetic acid, respectively.

Keywords: Tissue culture, propagation, rooting, creole grapevines, pisco

Introducción La vid (Vitis vinifera) es una dicotiledónea leñosa cuyos frutos se utilizan tanto para consumo directo como para la elaboración de bebidas alcohólicas. El cultivo de la vid fue introducido en el Perú por los españoles durante el siglo XVI (Lacaste 2004) para la elaboración de vinos. A partir del siglo XVII se empezó a producir un destilado que se denominó pisco, nombre de la localidad en la que se producía el destilado de mayor calidad. En la actualidad el pisco es uno de los productos bandera del Perú y su producción ha venido creciendo de forma sostenida hasta llegar a los 6,67 millones de litros en el año 2009 (CONAPISCO 2010). El pisco se produce a partir de un grupo de variedades “criollas” de vid que se dividen en aromáticas (Albilla, Italia, Moscatel y Torontel) y no aromáticas (Mollar, Negra Criolla, Quebranta y Uvina). De todas ellas, la única variedad que se distingue genéticamente de aquellas cultivadas en otros países es la Quebranta (Pignataro y Orjeda, resultados no publicados).

Un paso importante para mejorar el rendimiento cualitativo y cuantitativo del viñedo es la selección clonal de los mejores Rev. peru. biol. 18(3): 361 - 366 (December 2011)

especímenes. Ello implica una evaluación de las plantas en un territorio determinado, la selección de los mejores individuos de acuerdo a criterios sanitarios y productivos, la evaluación de clones de estos individuos en parcelas experimentales y del producto obtenido a partir de ellos, y la propagación vegetativa a escala masiva para reemplazar las plantas de menor rendimiento en el campo (Muñoz-Organero et al. 2001). Una estrategia utilizada para la multiplicación a gran escala de clones de vid en condiciones asépticas es la propagación in vitro (Chee et al.

1984). Ella consiste en introducir yemas apicales o axilares esterilizadas de forma superficial en un medio sólido suplementado con hormonas vegetales que inducen la formación de nuevos brotes, cada uno de los cuales puede, a su vez, originar una nueva planta. La metodología permite entonces una multiplicación geométrica cuyo límite es impuesto por la eventual pérdida de vigor de los nuevos brotes. El procedimiento se completa con el enraizamiento de los brotes en medio sólido, la transferencia de las plántulas a un substrato nutritivo y su posterior adaptación a las condiciones de vivero (Chee et al. 1984).

361

González et al.

Las investigaciones realizadas en los últimos 30 años con variedades de vid para consumo de mesa o para la elaboración de vinos han permitido definir medios y condiciones de cultivo estándares para la propagación in vitro (Chee et al. 1984; Sim 2006). Si bien la mayoría de variedades estudiadas muestran una buena respuesta con los medios estándares, algunas crecen de manera anormal o son incapaces de desarrollar los nuevos brotes indispensables para la propagación. En estos casos es necesario cambiar la composición del medio para optimizar el procedimiento (Sim 2006).

Los esfuerzos por introducir y propagar in vitro las variedades “criollas” utilizadas para la elaboración del pisco en el Perú han sido aislados y poco sistemáticos, por lo que en la actualidad no se dispone de protocolos para llevar a cabo este trabajo. Ello debe subsanarse si es que se pretende mejorar el viñedo destinado a la producción de pisco a través de un proceso de selección clonal.

En este trabajo hemos llevado a cabo la optimización del medio para la propagación de las variedades Quebranta, Negra Criolla, Albilla, Italia y Torontel, así como para el enraizamiento de las variedades Quebranta, Albilla y Torontel, a partir de los medios estándares reportados en la literatura científica.

Material y métodos Material vegetal Se trabajó con una planta adulta de cada una de las variedades Quebranta, Negra Criolla, Albilla, Italia y Torontel, donadas por el Centro de Innovación Tecnológica Vitivinícola (CITEvid). La identidad varietal fue confirmada por tipificación con 9 marcadores de microsatélites (This et al. 2004; Pignataro y Orjeda, resultados no publicados) y las plantas se mantuvieron en condiciones de vivero con aplicación mensual de insecticidas, fungicidas y estimulantes foliares.

Preparación de las yemas y obtención de brotes por propagación in vitro Con un escalpelo se cortaron fragmentos de 1,5 – 2 cm que contenían una yema apical o una yema axilar a partir de brotes vigorosos. Estos fragmentos fueron colocados en agua, llevados inmediatamente al laboratorio y lavados en agua corriente con detergente líquido para vajilla (1 gota por litro) y 1,5 g/L de FARMATE (fungicida) en un frasco bajo agitación por 10 min. Luego de enjuagarlos en agua corriente fueron tratados por 10 min con hipoclorito de sodio (lejía comercial) al 2% en un frasco bajo agitación. Los fragmentos se lavaron 3 veces con agua desionizada estéril por 10 min bajo agitación y fueron colocados en placas petri (2 cm de altura x 9 cm de diámetro) con medio estándar sólido (macronutrientes, micronutrientes y vitaminas de Murashige y Skoog [MS], suplementados con 3% de sucrosa, 1 mg/L de benzilaminopurina [BA] y 0,8% de agar). Las placas se colocaron en un cuarto de cultivo bajo 4000 lux (tubos fluorescentes de 36 watt Eco Lumilux Osram), con un fotoperiodo de 16 horas de luz por 8 de obscuridad y a una temperatura de 24 °C. Los fragmentos fueron transferidos a medio fresco cada 2 semanas. Los brotes generados a partir de cada fragmento fueron utilizados para llevar a cabo los experimentos de optimización de medios.

Optimización de los medios de propagación Para aproximarse al medio óptimo para la propagación de cada variedad, se probaron 12 medios de propagación en los que

362

se varió la composición del medio estándar tal como se describe a continuación: Medio

MSX

1*

1

BA (mg/L) 1

2

1

0,5

3

1

0,25

4

1

0

5

0,5

1

6

0,5

0,5

7

0,5

0,25

8

0,5

0

9

0,25

1

10

0,25

0,5

11

0,25

0,25

12

0,25

0

*Medio estándar

Todos los medios contuvieron 3% de sucrosa y 0,8% de agar. Cinco brotes de entre 0,5 y 1,6 cm de longitud obtenidos a partir de cultivos in vitro (ver sección anterior) se colocaron en placas con cada uno de los medios a ser probados. Las placas fueron colocadas en un cuarto de cultivo bajo 4000 lux, con un fotoperiodo de 16 horas de luz por 8 de obscuridad y a una temperatura de 24 °C. Además de evaluarse la evolución en el tiempo de su apariencia general, se midieron 3 parámetros asociados al éxito de la propagación: (1) crecimiento del explante (diferencia entre la longitud final y la longitud inicial); (2) número de hojas; y (3) el producto del número de brotes por la longitud de los mismos. Se excluyeron del análisis los brotes contaminados durante el experimento. Los tiempos de evaluación se establecieron en función a la velocidad de crecimiento de cada variedad.

Optimización de los medios de enraizamiento Para el enraizamiento se pusieron a prueba 10 medios que consistieron de las concentraciones estándar de medio MS suplementadas con 3% de sucrosa y 0,8% de agar a las que se añadieron las concentraciones de ácido naftalen acético (NAA) o ácido indol acético (IAA) de acuerdo al esquema siguiente: NAA Medio 1: 40 μg/L Medio 2: 60 μg/L Medio 3: 80 μg/L Medio 4: 100 μg/L Medio 5: 120 μg/L

IAA Medio 6: 0,5 mg/L Medio 7: 0,75 mg/L Medio 8: 1 mg/L Medio 9: 1,5 mg/L Medio10: 2 mg/L

Las concentraciones de NAA de 80 μg/L y de IAA de 1 mg/L son las que se utilizan con mayor frecuencia para el enraizamiento in vitro de la vid. En cada medio se probaron 5 brotes obtenidos en medio estándar de propagación (ver sección anterior), los cuales fueron colocados individualmente en tubos que contuvieron 10 mL del medio de enraizamiento. El parámetro que se midió en el tiempo fue el producto del número de raíces por la longitud de las mismas; además, se registró el porcentaje de plantas enraizadas. Como en el caso de los medios de propagación, se excluyeron del análisis los brotes contaminados durante el experimento y los tiempos de evaluación se establecieron en función a la velocidad de crecimiento de cada variedad.

Análisis estadístico Se realizaron los análisis para cada tipo de cada variedad por separado. En el caso de los medios de propagación, se realizó un Rev. peru. biol. 18(3): 361 - 366 (Diciembre 2011)

Medios de propagación y enraizamiento in vitro de vid para elaborar pisco

en las que se observó un efecto mayor de la fuerza del medio MS, y un efecto variable y más modesto de la concentración de BA (Fig. 1B y E). En la variedad Negra Criolla la influencia de la fuerza del medio MS sobre el crecimiento del explante fue clara en las 4 concentraciones de BA, en tanto lo fue sobre el número de hojas y el producto del número de brotes por la longitud de los mismos con las concentraciones de 1, 0,5 y 0,25 mg/L de BA (Fig. 1B); en la variedad Torontel la influencia de la fuerza del medio MS sobre el crecimiento del explante y el número de hojas fue evidente con 1, 0,5 y 0,25 mg/L de BA, y sobre el producto del número de brotes por la longitud de los mismos con 1 y 0,5 mg/L de BA (Fig. 1E). Por otro lado, los efectos de la concentración de BA muestran que, con una fuerza de medio 1X MS, una concentración de 0,25 mg/L de BA permite obtener los mejores resultados para el conjunto de los 3 parámetros en la variedad Negra Criolla (Fig. 1B), mientras que en la variedad Torontel la mejor concentración fue de 0,5 mg/mL (Fig. 1E).

análisis de varianza de 2 factores con el propósito de evaluar el efecto de los cambios en las concentraciones de MS y BA sobre la propagación de los brotes (crecimiento del explante, número de hojas y el producto del número de brotes por la longitud de los mismos). Para los medios de enraizamiento, se utilizó un análisis de varianza anidado considerando como factores las hormonas (NAA e IAA) y las diferentes concentraciones de hormona en el medio (anidadas dentro de cada tipo de hormona).

De esta manera se calculó el efecto del tipo de hormona y su concentración sobre el crecimiento radicular (número de raíces por longitud de las mismas).

Resultados y discusión Optimización de medios de propagación Los experimentos de optimización de medios de propagación tuvieron duraciones distintas según la velocidad de crecimiento in vitro de cada variedad: 30 días para Quebranta, 17 días para Albilla, 19 días para Italia, 16 días para Negra Criolla y 23 días para Torontel. Los resultados se muestran en la Figura 1 y en la Tabla 1. El comportamiento de los parámetros cuantificados en relación a las variaciones de fuerza del medio MS y de concentración de BA permiten distinguir 2 grupos de variedades: (1) las variedades Quebranta, Albilla e Italia, en las cuales el medio estándar favoreció con claridad un mejor desempeño y en las que las variaciones de fuerza de MS o concentración de BA hechas en el resto de medios dieron resultados similares y de menor eficacia (Fig. 1 A, C y D); y (2) las variedades Negra Criolla y Torontel,

Se ha reportado que la disminución de la fuerza del medio MS puede aumentar el número de brotes en algunas especies y por ello suele probarse su efecto en los experimentos de optimización de medios (Frett 1987). Si bien en el caso de las variedades Negra Criolla y Torontel la disminución de la fuerza del medio MS tuvo un efecto en el número de brotes (datos no mostrados y producto del número de brotes por la longitud de los mismos), el efecto fue opuesto al reportado, es decir, se observó un mayor número de brotes conforme mayor era la fuerza del medio.

En cuanto al uso de citoquininas como la BA, su efecto en la

Tabla 1. Análisis de varianza de dos factores del efecto de la fuerza del medio MS y la concentración de benzilaminopurina (BA) sobre el crecimiento del explante, el número de hojas y el producto del número de brotes por su longitud en las variedades “criollas” de vid estudiadas.

Crecimiento del explante

N° de hojas

MS

F

P

0,0125 0,4929 0.4287

9,03 32,33 21,81 1,23

7,36 26,38 17,80

130,14 4,29 1,67

<0,0001 0,0092 0,1493

39,22 13,39 1,86 1,27

1,83 0,33 0,39 0,04

48,92 8,93 10,56

<0,0001 0,0001 <0,0001

2 3 6 48

0,28 0,08 0,05 0,02

14,23 4,28 2,78

2 3 6 47

2,25 1,28 0,40 0,19

12,14 6,91 2,14

MS

F

P

0,0096 <0,0001 <0,0001

0,51 1,92 2,42 0,16

3,27 12,37 15,58

0,0779 0,0001 <0,0001

30,96 10,57 1,47

<0,0001 <0,0001 0,2088

8,95 3,00 0,95 0,21

42,96 14,39 4,58

<0,0001 <0,0001 0,0009

24,12 19,79 41,96 1,85

13,04 10,70 22,68

<0,0001 <0,0001 <0,0001

1,85 4,14 5,21 0,10

18,33 41,06 51,64

<0,0001 <0,0001 <0,0001

<0,0001 0,0093 0,0210

12,95 5,53 17,55 1,35

9,59 4,10 13,00

0,0003 0,0114 <0,0001

1,19 0,03 0,39 0,11

10,98 0,29 3,63

0,0001 0,8356 0,0047

<0,0001 0,0006 0,0657

3,29 0,39 0,13 0,03

115,91 13,84 4,55

<0,0001 <0,0001 0,0010

54,05 19,33 5,45 2,13

25,42 9,09 2,56

<0,0001 0,0001 0,0314

GL

MS

F

P

Quebranta MS BA MS X BA Error

1 2 5 42

0,36 0,04 0,05 0,05

6,81 0,72 1,00

Negra criolla MS BA MS X BA Error

2 3 6 48

2,22 0,07 0,03 0,02

Albilla MS BA MS X BA Error

2 3 6 48

Italia MS BA MS X BA Error Torontel MS BA MS X BA Error

Rev. peru. biol. 18(3): 361 - 366 (December 2011)

N° de brotes x longitud.

363

González et al.

Crecimiento (cm)

A. Quebranta

B. Negra criolla

C. Albilla

D. Italia

E. Torontel

1,5 1,0 0,5 0,0 10

N° de hojas

8 6 4 2 0

N° de brotes x longitud (cm)

4 3 2 1 0 0

0,25 0,5

1

0

0,25 0,5

1

0

0,25 0,5

1

0

0,25 0,5

1

0

0,25 0,5

1

Concentración de BA (mg/L) Figura 1. Efecto de la fuerza del medio MS (macronutrientes, micronutrientes y vitaminas de Murashige y Skoog) y la concentración de benzilaminopurina (BA, mg/L) sobre el crecimiento del explante, el número de hojas y el producto del número de brotes por la longitud de 5 variedades “criollas” de vid: (A) Quebranta, (B) Negra criolla, (C) Albilla, (D) Italia y (E) Torontel. Las fuerzas de MS fueron 1X (cuadrado), 0,5X (círculo) y 0,25X (triangulo). Se muestra el promedio ± 1EE.

proliferación de brotes axilares ha sido demostrado en múltiples trabajos de propagación in vitro (van Staden et al. 2008). En general, las variedades “criollas” con las que hemos trabajado mostraron un mayor número de brotes con la concentración más alta de BA (1 mg/L), con excepción de los casos ya señalados de las variedades Negra Criolla y Torontel. No obstante, debemos señalar que cuando la fuerza del medio MS fue menor a 1X, el efecto de dicha concentración de BA en el número de brotes no fue evidente, lo que sugiere una fuerte dependencia de la respuesta a BA en relación a la fuerza del medio en estas variedades de vid. En su conjunto, estos hallazgos confirman la complejidad de la respuesta de las distintas especies o variedades a las variaciones en la composición del medio y la dificultad para establecer patrones generales.

Nuestros resultados permiten concluir que para las variedades Quebranta, Albilla e Italia, el medio óptimo de propagación fue el estándar (medio 1), en tanto el medio 3 lo fue para la variedad Negra Criolla y el medio 2 para la variedad Torontel. Si bien la contaminación de los fragmentos nos impidió tener resultados para el medio 7 en la variedad Quebranta, mediciones hechas antes de que ocurriera la contaminación (20 días luego de iniciado el experimento) revelaban ya una menor eficacia en relación al medio estándar (datos no mostrados). Se debe enfatizar también que no se han considerado medios de propagación con fuerza de medio MS o concentraciones de BA superiores a las del medio estándar por 2 razones: (1) está reportado que medios de cultivo con alto contenido de sales suelen estar asociados a la formación de tejidos rígidos y de formas distorsionadas (vitrificación) y que las concentraciones altas de BA promueven una formación no

364

deseada de callos (Sim 2006); y (2) en experimentos preliminares hechos en nuestro laboratorio con la variedad Quebranta se encontró que el crecimiento en medios con 2X MS, 2 mg/L de BA o ambos a la vez , era muy pobre en relación al medio estándar (datos no mostrados).

Optimización de los medios de enraizamiento El tiempo para los experimentos de optimización de los medios de enraizamiento se empezó a contar a partir de la aparición de las primeras raíces en cada experimento, lo cual ocurrió entre los 10 y 18 días de colocados los brotes en los medios con las 3 variedades evaluadas. La duración de los experimentos fue de 18 días para Quebranta, 14 días para Albilla y 22 días para Torontel.

Los resultados se muestran en la Figura 2 y la Tabla 2. Un primer examen revela que el efecto de las hormonas y los tratamientos utilizados fue distinto en las 3 variedades. El ANOVA anidado no indicó diferencias significativas entre el tratamiento con ambas hormonas ni permitió identificar un mejor tratamiento entre todos los administrados en la variedad Quebranta. No obstante, los mejores promedios para el parámetro medido se obtuvieron con 80 μg/L de NAA y con 2 mg/L de IAA (Fig. 2A). En la variedad Albilla el análisis no establece una diferencia significativa entre el grupo de tratamientos con NAA y el grupo con IAA, pero sí identifica al tratamiento con 2 mg/L de IAA como el mejor (Fig. 2B). En la variedad Torontel hay una diferencia significativa entre los tratamientos con NAA y aquellos con IAA, estos últimos con mejores resultados. No obstante no identificarse un tratamiento significativamente superior en el análisis, fue el medio con 1 mg/L de IAA el que permitió obtener los mejores Rev. peru. biol. 18(3): 361 - 366 (Diciembre 2011)

Medios de propagación y enraizamiento in vitro de vid para elaborar pisco

25

A. Quebranta

20 15 10 5

N° de reaíces x longitud (cm)

0 20

B. Albilla

15 10 5 0

10

C. Torontel

8 6 4 2 0 20

40

60

80

100

120

Acido naftalen acético (NAA, µg/L)

0,5

0,75

1,0

1,5

2,0

Ácido indol acético (IAA, mg/L)

Figura 2. Comparación del efecto de diferentes concentraciones de ácido naftalen acético (NAA) o ácido indol acético (IAA) sobre el crecimiento radicular de 3 variedades “criollas” de vid: (A) Quebranta, (B) Albilla y (C) Torontel. Se muestra el promedio ± 1EE.

promedios para el parámetro medido (Fig. 2C). El porcentaje de plantas enraizadas observado con los mejores medios para cada variedad fue de 100%, excepto para la variedad Torontel en la que se llegó a un 75%.

quiere concentraciones de auxina mayores que las que requiere el posterior crecimiento de las mismas (Machakova et al. 2008).

Nuestros resultados sugieren que un fenómeno similar podría ocurrir con las variedades “criollas” de vid evaluadas.

En términos generales, se obtuvieron mejores resultados con IAA en 2 de las 3 variedades estudiadas (Albilla y Torontel); en la variedad Quebranta, el desempeño con las 2 hormonas fue comparable (Fig. 2 y Tabla 2). Cabe señalar que los mejores resultados con IAA en las variedades Quebranta y Torontel se obtuvieron con una concentración que fue el doble de la que se suele utilizar (1 mg/mL). A diferencia del NAA, que es una auxina sintética muy estable en el medio de cultivo, el IAA es una auxina natural cuya concentración tiende a caer al oxidarse bajo condiciones de cultivo. Esta propiedad ha sido aprovechada en casos como el enraizamiento de micro-cortes de manzana, en el que se ha determinado que la formación de las raíces re-

La concentración de sucrosa utilizada en el medio de enraizamiento en este trabajo fue de 3%. Dado que algunos medios utilizados para el enraizamiento de otro tipo de vides tienen concentraciones algo menores (1 – 1,5%) (Chee et al. 1984; Sim 2006), será importante determinar en un futuro si este factor ejerce una influencia significativa en el enraizamiento de las variedades “criollas” de vid y en su respuesta a los 2 tipos de auxina.

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Consideraciones finales El trabajo que se presenta debe considerarse como un estudio preliminar por el número limitado de plantas de las que se obtuvo el material de partida y por no abarcar la totalidad de

365

González et al.

Tabla 2. Análisis de varianza anidado del efecto de las auxinas ácido naftalen acético (NAA) y ácido indol acético (IAA) sobre el crecimiento radicular de 3 variedades “criollas” de vid.

GL

MS

F

P

Quebranta Hormona Medio(Hormona) Error

1 8 37

10,6 95,6 55,5

0,19 1,72

0,6653 0,1257

Albilla Hormona Medio(Hormona) Error

1 8 38

0,2 77,8 8,3

0,03 9,39

0,8704 <0,0001

Torontel Hormona Medio(Hormona) Error

1 8 35

63,5 10,6 7,5

8,44 1,41

0,0063 0,2260

las variedades “criollas” de vid utilizadas en la elaboración del pisco. No obstante, consideramos que la información incluida es una importante contribución para el manejo in vitro de estas variedades y deberá complementarse con estudios posteriores en los que se tenga acceso a una mayor cantidad de especímenes.

Agradecimientos Agradecemos al Centro de Innovación Tecnológica Vitivinícola (CITEvid) por las facilidades brindadas para el desarrollo de este trabajo, en particular a los ingenieros Manuel Morón y Manuel Gómez, y a la bióloga Hanna Cáceres. La realización de este trabajo fue posible gracias a los fondos otorgados por el Programa de Ciencia y Tecnología (Contrato Nº 004-FINCyTPIBAP-2007) y por el Consejo Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación Tecnológica (Contrato 266-2007-CONCYTECOAJ).

366

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Rev. peru. biol. 18(3): 361 - 366 (Diciembre 2011)

Rev. peru. biol. 18(3): 367 - 372 (Diciembre 2011) © Facultad de Ciencias Biológicas UNMSM

Colonización intraluminar testicular y diferenciación de la masa ISSN celular interna 1561-0837

Colonización intraluminar testicular y diferenciación de la masa celular interna en ratones (Mus musculus) Intraluminar testicular colonization and differentiation of the inner cell mass in mice (Mus Musculus)

Láyonal Acosta*, Víctor Núñez, Jose Pino, Betty Shiga Laboratorio de Reproducción y Biología del Desarrollo, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Nacional Mayor de San Marcos.

Lima, Perú. Casilla 11-0058, Lima 11, Perú. Tel.: +51 6 197000 – 1529; fax: +51 6 197000 – 1509. *Autor para las correspondencias, email Láyonal Acosta: acostaclg@gmail.com

Resumen Cuando las células germinales primordiales (CGPs) son trasplantadas al testículo de otro individuo de la misma especie; colonizan el lumen de los túbulos seminíferos, buscando su nicho para diferenciarse en espermatozoides. Nuestro objetivo fue evaluar la colonización intraluminal de una suspensión de células de la masa celular interna (MCI) obtenidas de blastocistos de ratones. Una suspensión de MCI obtenidos mediante una inmunocirugía en la red testicular de animales tratados previamente con ciclofosfamida para disminuir su propia espermatogénesis fueron trasladados a animales receptores. Se comprobó la presencia de minitúbulos intraluminales en 2 de 100 túbulos seminíferos, lo que demuestra que el trasplante de una suspensión de células de la masa celular interna pueden colonizar los túbulos seminíferos y además mantener una espermatogénesis xenogénica de manera sincrónica con el receptor.

Palabras Clave: Células madre pluripotentes, células madre germinales, testículo, minitúbulos, espermatogénesis.

Abstract

Presentado: 12/02/2011 Aceptado: 23/07/2011 Publicado online: 08/02/2012

Primordial germ cells (PGC`s) are transplanted to testicle of other individual of the same species, they colonize the lumen of the seminiferous tubules, seeking a niche to differentiate into sperm. Our objective was to evaluate the intraluminal colonization of a suspension of cells in the inner cell mass (IMC`s) of blastocysts obtained from mice, using a novel technique. It was transplanted a suspension of ICM by mean of inmunosurgery into the rete testis of recipient animals which were previously treated with cyclophosphamide to reduce their own spermatogenesis. We confirmed the presence of intraluminal minitubules in 2 of 100 seminiferous tubules, demonstrating that transplantation of a suspension of cells from the inner cell mass can colonize the seminiferous tubules and also maintain a synchronously xenogenic spermatogenesis with the receiver.

Keywords: Pluripotent stem cells, germ stem cells, testes, minitubules, spermatogenesis.

Introducción Durante el desarrollo temprano normal del embrión, sus blastómeros son totipotentes y por lo tanto capaces de generar un nuevo individuo por sí solas. Posteriormente, el desarrollo embrionario continúa y las células embrionarias empiezan a diferenciarse estableciendo su destino celular. En ratones, al séptimo día posterior a la copula, aproximadamente 100 células de la región del epiblasto se constituyen en las células germinales primordiales (PGCs), identificadas por su actividad fosfatasa alcalina (Chiquoine 1954). Las PGC`s migran hacia las crestas gonadales, formando los gonocitos a los 11,5 días posterior a la copula (Loeffer & Pottern 1997, McLaren 1998). Esta capacidad de las células germinales para participar en el proceso de desarrollo embrionario una y otra vez, indican que las CGPs son potencialmente inmortales (Donovan et al. 1997, Donovan 1998, Tsang et al. 2001).

Las células madre pluripotentes o embrionarias son las que derivan de la masa celular interna (MCI) de un embrión de mamífero en el estado de blastocisto, esto es dependiendo de la especie, 4 ‒ 7 días después de la fecundación y pueden ser expandidas sin límite in vitro (Evans & Kaufman 1981, Martin 1981, Thomson et al. 1998).

La Terapia celular es una nueva herramienta para la medicina regenerativa, que hoy en día tiene su base en el uso de células madre. Una célula madre o stem cell se define como una célula progenitora, autorrenovable, capaz de regenerar uno o más tipos celulares diferenciados. Las células madres tienen la capacidad de llegar a convertirse en cualquiera de los más de 200 tipos de células diferentes del cuerpo y juegan un importante rol en reparar órganos y tejidos (Johnson & Williams 2006).

El transplante exitoso de células germinales, desde un individuo adulto a otro individuo adulto, fue descrito por primera vez en 1994 entre ratones inmunocompatibles (Brinster & Abarbock 1994, Brinster & Zimmermann 1994). El transplante consistió en recolectar células germinales desde un animal donador e inyectarlas en los túbulos seminíferos del animal receptor, con el objetivo de que la espermatogénesis del animal donador se realice en los testículos del animal receptor. De esta manera al transplantar intraespecíficamente las células germinales, éstas

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Los gonocitos en los vertebrados pueden diferenciarse in vitro (Geijsen et al. 2004, Lacham-Kaplan et al. 2006, Nayernia et al. 2006); Asimismo, también se ha demostrado en el ratón que las células madres embrionarias (CME) pueden diferenciarse in vitro a células madres espermatogoniales (CME) con ayuda de un promotor y éstas son capaces de generar gametos haploides masculinos funcionales (Nayernia et al. 2007). Se ha podido demostrar que las células madres somáticas adultas pueden llegar a generar CMG, pero no tienen la capacidad de entrar a meiosis (Nayernia et al. 2007).

367

Acosta et al.

colonizan la membrana basal de los túbulos seminíferos del animal receptor en busca del nicho donde se desarrollan las células madre. Se ha reportado que en transplantes de PGCs en ratas muestran una colonización atípica la cual se ha denominado como espermatogénesis intraluminal. Guzmán (2002) evaluó la colonización intraluminal de una suspensión cruda de PGC`s de fetos de ratón de la cepa Balb C en los túbulos seminíferos de ratones adultos, obteniendo una colonización intraluminal en 1 de cada 100 túbulos seminíferos evaluados El objetivo del presente estudio fue evaluar la colonización intraluminal de una suspensión de células de la masa celular interna (MCI) obtenidas de blastocistos de ratones.

Material y métodos Animales.- Se utilizaron ratones de la cepa albina Swiss Rockefeller; machos (N= 8) de 10 a 12 semanas de edad y de fertilidad comprobada y hembras vírgenes (N= 8) de 6 a 8 semanas de edad. Los ratones machos receptores (N= 8) fueron de la cepa C57BL (8 a 10 semanas). Ambas cepas se mantuvieron en condiciones de laboratorio (temperatura ambiental 22 – 24 ºC, 14 h luz: 10 h oscuridad), con acceso libre a una dieta con pellets (Purina, Perú) y agua ad libitum. Los protocolos siguieron los lineamientos del Consejo Nacional de Investigación para el cuidado y uso de animales de laboratorio (NRC 1996). Para la obtención de suero anti ratón se utilizó un conejo macho de la raza Nueva Zelanda y para la obtención del complemento, un cobayo macho de la raza criolla.

Químicos.- Ciclofosfamida (NEOPHOS), medio HTF suplementado con HEPES (LifeGlobal), solución Tyrode’s ácido, solución salina fosfatada (PBS) (pH 7,4), solución Tripsina-EDTA, Azul de Trypán, Ketamina, suero fisiológico, fijador Bouin.

Obtención de embriones preimplantacionales en el estadio de blastocisto.- Ratonas Swiss en etapa de estro o proestro, fueron cruzadas con un macho semental toda la noche y la presencia del tapón vaginal al día siguiente fue señal de que ocurrió la cópula y fue tomado como día 1 de la preñez. Las ratonas fueron posteriormente (96 h posterior a la copula) eutanizadas por dislocación cervical, se procedió a extraer los cuernos uterinos para la obtención de los embriones mediante un lavado con una solución de PBS (pH 7,4).

Obtención de anticuerpos de conejo anti-bazo de ratón y complemento de cobayo.- Para la obtención de anticuerpos anti-ratón, se utilizó un conejo macho de la raza Nueva Zelanda al cual se le inyectó una concentración de 4x108 células/mL del bazo de ratón, vía vena marginal de la oreja. Se recuperó 15 mL de sangre por sangría parcial, se colocó 3mL en cada tubo Vacutainer de 15mL con gel de sílica y se llevó a centrifugación a 2500 rpm. El suero obtenido fue colocado en tubos Eppendorf a volumen de 15µL y mantenido a -20 °C hasta su posterior uso.

Antes de utilizar el suero, fue calentado en baño maría a 56 °C por 30 min. para su descomplementación y diluido 1:10. Para la obtención de complemento se utilizó un cobayo macho, al cual se le realizó una sangría total. La sangre obtenida fue colocada en tubos Vacutainer con gel de sílica y centrifugada a 2500 rpm.

El suero obtenido fue colocado en tubos Eppendorf a volumen de 15µL y mantenidos a -20 °C. Inmunocirugía.- La inmunocirugía de blastocistos de ratón fue realizada con algunas modificaciones al procedimiento de-

368

sarrollado por Solter y Knowles (1975). La zona pelúcida fue removida utilizando la solución ácida de Tyrode’s por 5 min. luego los embriones fueron lavados por 3 min., tres veces con PBS. Antes de la exposición del antisuero, los blastocistos fueron incubados a 37 ºC en medio HTF suplementado con HEPES (LifeGlobal) por 30 min. Los blastocistos libres de zona pelúcida fueron expuestos a los anticuerpos de conejo anti-bazo de ratón diluido 1:10 por 30 min. y luego lavados tres veces con PBS, 5 min. cada uno. A continuación, los blastocistos fueron transferidos al complemento de cobayo (diluido a 1:10) con medio HTF suplementado con HEPES e incubado por 20 minutos a 37 ºC. Seguidamente la MCI fue colocada en gotas de solución TripsinaEDTA e incubada por 5 minutos para permitir la disgregación de las células de la MCI. Las células de la MCI fueron lavadas tres veces con PBS y luego colocadas en medio HTF con HEPES y coloreadas con Azul de Trypán, con el objetivo de visualizar el ingreso de las células en el interior de los túbulos seminíferos.

La suspensión de células a una concentración de 3 x 103 células por mL fue cargada en la pipeta de inyección.

Tratamiento con Ciclofosfamida (CP) y transplante de células madre pluripotentes.- La Ciclofosfamida (NEOPHOS), fue disuelta en solución salina 0,9% obteniendo una concentración final de 220 mg/kg [dosis equivalente a la dosis terapéutica en humanos (750 mg/kg)]. Se utilizaron 8 ratones machos de la cepa C57BL como receptores, a cada uno se les inyecto intraperitonealmente una dosis única de CP 4 días antes del transplante de las células madre. Para la realización de la microinyección, los ratones fueron anestesiados con 0,15 mL de Ketamina más 0,15mL de suero fisiológico (0,9%), una vez anestesiado el ratón se prosiguió a remover los testículos de la cavidad corporal para localizar la zona craneal del pedículo vascular donde llega el conducto eferente a la superficie del testículo. Cargada la pipeta de inyección con las células de la MCI y coloreadas con Azul de Trypán se inyectó directamente a la rete testis del testículo izquierdo del ratón, el testículo derecho fue usado como control al cual se le inyecto sólo medio HTF con HEPES más Azul de Trypán. Para la inyección en la rete testis, se utilizó una micropipeta de 50 a 80 µm de diámetro la cual se insertó en un ángulo de 30º y una profundidad no mayor a 2 mm. El llenado de los túbulos seminíferos siguió un camino al azar. La presión en la pipeta fue aplicada suavemente para evitar una ruptura interna de los límites de la rete testis. El volumen a inyectar en cada testículo fue de 50µL. Al final del procedimiento, se cerró la abertura con hilos de sutura convencionales.

Análisis histológico.- Después de 35 días, los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical, extrayéndoles los testículos y fijados con solución de Bouin por aproximadamente 16 h, luego siguió la deshidratación y el parafinado de las muestras.

Se procedió a obtener los cortes histológicos de 5 µm de espesor con ayuda de un micrótomo rotativo Minot, los cuales fueron coloreados con hematoxilina y eosina Y. Resultados Inmunocirugía.- Con la solución ácida de Tyrode´s se destruyó exitosamente la zona pelúcida (Fig. 1), para luego enfrentar a la masa celular interna a los anticuerpos anti-ratón y complemento de cobayo (Fig. 2A) y finalmente mediante pipeteo suave obtener las células de la MCI disgregadas (Fig. 2B).

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Colonización intraluminar testicular y diferenciación de la masa celular interna

Figura 1. Blastocisto. A) Con zona pelúcida (Flecha) (250X). B) Sin zona pelúcida (100X).

Figura 3. Testículos de ratón seleccionados para el transplante. A) Antes de la inoculación, mostrando el conducto eferente (Flecha) (15X); B) inoculación exitosa de la suspensión celular de la MCI mezclada con el colorante (20X).

Inyección a la rete testis.- Se inyecto exitosamente la suspensión de células disgregadas de la MCI a nivel de la rete testis (Fig. 3A), esto se evidencio por el patrón de coloración de los túbulos seminíferos con azul de Trypan (Fig. 3B).

Figura 2. Masa celular interna sin zona pelúcida A) antes de exponerse a los anticuerpos anti-ratón; B. Después de exponerse a los anticuerpos anti-ratón. (250X).

Análisis del transplante de la MCI.- No se evidencio presencia de tumoración en los cortes histológicos evaluados. Se encontró que el 62,5% de los receptores evaluados presentaban colonización intraluminal, siendo esta colonización aleatoria en los túbulos seminíferos; en promedio se observó que sólo el 2% de los túbulos seminíferos muestran minitúbulos (Figs. 4

Figura 4. Colonización intraluminal y diferenciación de las células de la MCI y sincronización de los minitúbulos con respecto al epitelio seminífero con el receptor. Las flechas indican la formación de los minitúbulos en el lumen de los túbulos seminíferos del animal receptor A (100X); B (400X); C (630X); D (630X).

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Acosta et al.

vados en los testículos que recibieron el transplante de células donadoras, más no en los testículos controles en los que sólo se les inyecto medio HTF con HEPES más el colorante vital, por tanto este nuevo epitelio seminífero hallado no sería un efecto ocasionado por el tratamiento previo con CP ni un artefacto producido por el procedimiento de la inyección, esto fue observado también por Jiang y Short (1995) y Guzmán (2005), quienes obtuvieron resultados congruentes a los nuestros utilizando el fármaco Busulfán en lugar de CP. La no presencia de tumoraciones (teratomas) discrepa con los resultados de Brinster y Avanbock (1994) quienes al inyectar células madre embrionarias de ratones a túbulos seminíferos de receptores estériles tuvieron como resultado la presencia de tumores.

Figura 5. Colonización intraluminal y diferenciación de las células de la MCI (MB: estructura similar a membrana basal, S: célula de Sertoli, E: Espermatocito primario, ES: espermátide (630X).

A - D). Los minitúbulos formados en el lumen de los túbulos seminíferos muestran una sincronización de la espermatogénesis con respecto al epitelio seminífero del animal receptor (Fig. 4B, C y D; Fig. 5), Los testículos que solo fueron inyectados con medio HTF con HEPES más Azul de Trypán, no presentaron minitúbulos (Fig. 6).

Discusión En el presente trabajo los resultados sugieren que las células de la MCI tienen la capacidad de diferenciarse in vivo a células de la línea germinal, presentándose en forma de minitúbulos.

Según Ogawa et al. (1997), de los diferentes procedimientos de inyección de células donadoras dentro de los túbulos seminíferos de un receptor, la técnica de inyección a nivel de rete testis ha demostrado ser un método sencillo, eficiente y reproducible.

Utilizando esta técnica y células de la MCI, nosotros obtuvimos resultados en los que se observó la presencia de una colonización intraluminal en forma de minitúbulos con presencia de células espermatogénicas siendo estos resultados similares a los hallados por Jiang y Short (1995) en ratas y los de Guzmán (2005) en ratones, utilizando CGPs. Los minitúbulos sólo fueron obser-

La diferenciación obtenida in vivo de las células de la MCI, se debe a que éstas presentan un “estado de memoria” para su diferenciación, que se puede observar desde las etapas de divisiones tempranas cuando el primer blastómero dividido se encuentra destinado a formar predominantemente la estructura embrionaria, tal como lo demostró Piotrowska et al. (2001), además algunas de estas CMP están destinadas a ser parte de los túbulos seminíferos como células de Sertoli, es por ello que podemos encontrar a estas células dentro de los minitúbulos (Fig. 6).

Otra explicación seria que la ciclofosfamida eliminó todos los estadios espermatogenicos, con excepción de algunas células madre altamente resistentes como reportó Bucci y Meistrich (1987) utilizando Busulfan. Por otro lado, las CMP y las CGP comparten un gran número de marcadores moleculares similares y si se aplican estímulos apropiados puede diferenciarse de CMP a CGP in vitro, tal como explican Geijsen et al. (2004), Hubner et al. (2003) y Toyooka et al. (2003), e inclusive las CMP pueden llegar a formar gametos masculinos capaces de fecundar y desarrollar un individuo tal como lo demostró Nayernia et al. (2006) en ratones. Las células de Sertoli pueden sintetizar estímulos adecuados como el ácido retinoico (AR), tal como lo determino Cavazzini et al. (1996) en ratas, haciendo posible la activación del gen Stra8 para que pueda iniciarse la diferenciación de las CMP (Oulad-Abdelghani et al. 2006), bajo este mecanismo nuestras células transplantadas pueden diferenciarse en CGPs y estas a su vez en CMG in vivo.

Figura 6. Testículo control. A) (250X) y B) (400X).

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Colonización intraluminar testicular y diferenciación de la masa celular interna

Otro de los factores importantes y necesarios para que pueda desarrollarse la espermatogénesis es la existencia de una interacción entre las células de Sertoli y las CMG, la cual hace posible la activación de estas últimas para iniciar la espermatogénesis tal como lo comprobó Rossi et al. (1993) y Kanatsu-Shinohara et al.

(2005) en ratones. En el presente trabajo, la presencia de minitúbulos nos sugiere que ha existido una diferenciación de la MCI, algunas de estas, a células de Sertoli y otras a CMG lo cual ha hecho posible un nicho con interacción, activación y desarrollo de una espermatogénesis intraluminal. Según Guzmán (2005), la colonización xenogénica del lumen de los túbulos seminíferos se debería a que la suspensión cruda de PGCs tienen además de las células ya mencionadas, células precursoras somáticas testiculares que al co-transplantarse formarían los minitúbulos en los túbulos seminíferos de los ratones receptores capaces de soportar proceso completo de espermatogénesis.

Los resultados muestran que el ciclo espermatogénico desarrollado en los minitúbulos a partir de la diferenciación de células de la MCI, se encuentra en sincronización con los túbulos hospederos, siendo este resultado concordante con lo obtenido por Jiang y Short (1995) y Guzmán (2005) que utilizaron en sus transplantes a las CGPs, es así que se puede sugerir que el microambiente tubular microambiente tubular se encuentra regulando tanto al epitelio seminífero tubular e intraluminal. Por otro lado no se ha observado la presencia de células de Leydig en asociación con el epitelio donador (minitúbulos), debido a que estas células no pueden sobrevivir en este microambiente Jiang y Short (1995).

Bajo las condiciones de la investigación, se encontró una frecuencia de 2% de desarrollo minitúbulos, por ratón receptor ya que las células donadoras presentan poca probabilidad de colonizar e interactuar, esto debido a que se ha utilizado una baja concentración de células, estos resultados son discordantes a los de Jiang y Short (1995) y Guzmán (2005) que encontraron 5 y 1% de minitúbulos, respectivamente en sus trabajos utilizando una concentración de células 106 veces mayor.

Podemos señalar que la inyección de las células pluripotentes de la MCI ha demostrado ser una técnica adecuada para el estudio de la espermatogénesis en todos sus niveles demostrando que puede ser utilizada en las técnicas de reproducción asistida en humanos, para la recuperación del epitelio seminífero en varones que presentan una patología testicular y como un gran potencial en las terapias del futuro (McLaren 1998).

Agradecimiento Al Consejo Superior de Investigación de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos por el apoyo financiero (Estudio Fondo de Promoción de trabajo de Tesis de Pregrado, código 081001077).

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Rev. peru. biol. 18(3): 373 - 376 (Diciembre 2011) © Facultad de Ciencias Biológicas UNMSM

Microlophus tigris in Las Leyendas Zoological Park ISSN 1561-0837

NOTA CIENTÍFICA

Notes on the ecology of a relict population of the Lomas´s Lizard Microlophus tigris (Tropiduridae: Sauria) in Las Leyendas Zoological Park, (Lima, Peru) Notas sobre la ecología de una población relicto de la lagartija de las Lomas Microlophus tigris (Tropiduridae: Sauria)en el Parque Zoológico Las Leyendas (Lima, Perú) Juan Carlos Jordán Arizmendi 1,2 1Departamento de Herpetología, Museo de Historia Natural, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Museo de Historia Natural, Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Av. Arenales 1256, Jesús María Apdo. 14-0434, Lima 14, Perú.

2 Laboratorio de Estudios en Biodiversidad (LEB). Departamento de Ciencias Biológicas y Fisiológicas.

Facultad de Ciencias y Filosofía.

Universidad Peruana Cayetano Heredia (UPCH).

E-mail: juan.jordan@gmail.com

Abstract I studied activity patterns, microhabitat use and thermal ecology of a small-wild population of the Loma’s lizard, Microlophus tigris in Parque Las Leyendas Zoo, from April to October of 2006. Microlophus tigris individuals were active in a variety of microhabitats, from bushes and vegetation debris to prehispanic bricks (adobes) and litter, during the hottest hour of the day. Mean body temperature (29,4 ºC) was similar to body temperature observed in a natural population from Lomas de Lachay, although in Parque de Las Leyendas, substrate temperature was higher than air temperature, probably related to thermal properties of materials used as microhabitats and to seasonal differences. We encouraged the Zoo to takes conservation measures to protect this endangered wild population of lizard in Lima city.

Keywords: Loma’s lizard, Microlophus tigris, Parque de Las Leyendas, ecology, conservation

Resumen

Presentado: 07/03/2011 Aceptado: 06/11/2011 Publicado online: 08/02/2012

Evalué algunos aspectos de la ecología de una pequeña población silvestre de Microlophus tigris en el Zoológico Parque de Las Leyendas, desde abril a octubre del 2006. Microlophus tigris fue observado en una variedad de microhábitats, desde arbustos y restos vegetales hasta ladrillos prehispánicos (adobes) y desperdicios, durante las horas más calientes del día. La temperatura corporal promedio (29,4 ºC) fue similar a la reportada para una población natural de esta especie en Lomas de Lachay, aunque en el Parque de Las Leyendas, la temperatura del sustrato fue más alta que la temperatura del aire, probablemente relacionado a las propiedades termales de los materiales usados como microhábitats y diferencias estacionales. Recomendamos al zoológico tomar medidas de conservación para proteger a esta población de lagartijas amenazada dentro de la ciudad de Lima.

Palabras clave: Lagartija de las Lomas, Microlophus tigris, Parque de Las Leyendas, ecología, conservación.

Zoological parks have become the last refuge of several wild species that are endangered due to high levels of exploitation (hunting for subsistence or illegal traffic, etc.), fragmentation and destruction of their natural habitats (deforestation for croplands, highways development, urban expansion, among others; Rabb 1994). The Parque de Las Leyendas Zoo, located in the San Miguel district of Lima, is the main zoo in Peru with permanent exhibition of representative species from all over the country (as well as several species from other countries), promoting wildlife conservation and educating people about its importance for the next generations. This area (ca. 64 ha) is occupated by fifty-three archaeological sites belonging to Lima culture (0 – 600 A.C.) and Curacazgo de Maranga (1100 – 1532 A.C.). Since 1964, is devoted to conservation of Peruvian biological heritage (http:// www.leyendas.gob.pe/nosotros.html).

A small population of the Peruvian endemic Lomas’s Lizard, Microlophus tigris Tschudi 1845, lives in the archaeological and abandoned croplands areas located within the zoological park area (Fig. 1). This lizard species occurs from Trujillo to Arequipa, inhabiting the foothills of the Pacific slopes of the Andes and lomas formations (Carrillo & Icochea 1995, Dixon & Wright 1975, Pérez 2005). Dixon and Wright (1975) examined individuals registered in Lima and Callao city so; it is highly probably this population could be a relict one rather than an introduced population. Actually, this species shared its habitat with another Rev. peru. biol. 18(3): 373 - 376 (December 2011)

endangered local wild lizard, Phyllodactylus sentosus, recorded in the zoo area (Pérez 2010).

Microlophus tigris has been categorized as Endangered by peruvian law (D.S. Nº 034-2004-AG/INRENA). Although this lizard species is abundant in some locations (Jordán pers. obs.), its metapopulation pattern of distribution associated to loss of habitat, particularly in lomas around Lima (due to urban expansion, Mena et al. 2007), place M. tigris in serious risks for its conservation in the long term. To date, there is only one study on the ecology of Microlophus tigris from Lomas de Lachay National Reserve (Pérez 2005). In this study, I present data for the first time on microhabitat use, activity patterns and thermal ecology from an isolated population of Microlophus tigris in an artificial habitat inside Parque de las Leyendas Zoo. The study site (12º04’04.74, 77º05’14.40”, 53 m) encompasses a large archaeological area, abandoned cropland (around 40 years) and open deposits of construction and organic material (vegetation debris from parks and gardens) (Fig. 2). Natural vegetation is scarce, with some bouganvilla (Bougainvillea spp.), huarango (Prosopis spp.), pines (Pinus spp.) disseminated throughout the area. Field work was conducted from April to October of 2006. All data on microhabitat use, activity patterns and thermal ecology was combined regardless of seasonality because of low sample size. Microhabitats were

373

Jordán Arizmendi

Figure 1. Microlophus tigris (female) basking on a plastic cylinder on Las Leyendas Zoological Park.

classified as follows: 1) bushes/vegetation debris, 2) pre-hispanic ruins (also named “huacas”: pre-hispanic constructions made from hand-made mud bricks), 3) construction debris, 4) stones and 5) other (metal material, garbage). Visual encounter surveys (Crump & Scott 1994) with no time limits where employed to collect data on activity time and microhabitat use of individual lizards, from 09:00 to 17:00 during 25 days (200 hours/man).

Individuals were captured by hand or with a custom-made noose to record their body temperature with a cloacal thermometer Miller and Weber® within 30 seconds after captured. Individuals were caught by legs to avoid heat transfer from the investigator.

Substrate temperature was recorded at the exact place where the lizard had been captured by pressing the bulb against the substrate. Air temperature was recorded one centimeter above the substrate at the same place.

Spatial and temporal niche breadths were calculated from the inverse formula of Simpson (Pianka 1973, Vitt & Zani 1996): B = 1/Σ ρi 2 where ρi is the proportional use of resource i and n is the number of categories (resources) employed by the species.

ANOVA analysis was used to test differences among thermal variables. Data were tested for normality and variances homogeneity with Kolmogorov-Smirnov and Barlet test (Zar 1999), respectively. All statistical analysis was performed with Statistica software with a α-level of 0, 05.

Individuals of Microlophus tigris (n=83) was mostly recorded on vegetal debris (39% and 43% respectively), others (metal,

40 35 30 25 20 15 10 5 0 vegetal debris

pre -hispanic construction ruins debris

stones

other

Microhabitats

Figure 2. Microhabitat use by Microlophus tigris in Parque de Las Leyendas.

374

Percentage of individuals (%)

Percentage of individuals (%)

45

40 30 20 10 0 10

11

12

13

14

15

16

Hours Figure 3. Activity patterns of Microlophus tigris in Parque de Las Leyendas.

Rev. peru. biol. 18(3): 373 - 376 (Diciembre 2011)

Microlophus tigris in Las Leyendas Zoological Park Table 1. Multiple regression values among temperature variables from Microlophus tigris (n=17).

Variables

Tb

Ta

Ts

Ta vs. Ts

X ± SD

29,4 ± 4,6

25,4 ± 3,03

30,6 ± 6,7

-

Range

19,6-36,4

19,6-36,4

18,4-43

-

0,47

0,30

0, 47

F

13,57

6,61

6,35

P

<0,002

<0,02

<0,01

R

2

garbage among others; 23,9%) and in less proportion in other categories (Fig. 2).

Spatial niche breadth was 3,92. Active individuals (n=99) were observed between 10:00 and 16:00 h, with an activity peak around midday (Fig. 3). Activity niche breadth was of 4.94.

Mean lizard body temperature (Tb) was 29,4 ± 4,6ºC, mean air temperature (Ta) was 25,4 ± 3,03 ºC and mean substrate temperature (Ts) was 30,6 ± 6,7 ºC. Ranges are presented in Table 1.

Ta and Ts were related to Tb and both variables interact to affect lizard body temperature (Table 1, Fig. 2). Tb was not different from Ts and Ta, but Ts was higher than Ta (F1,32 = 8,43; p=0,006).

Microlophus tigris used a broad range of substrates in our study site in contrast with findings by Pérez (2005) in the Lomas de Lachay population. In Lomas de Lachay, M. tigris uses rocks as perches (73%) even when rocks are sparse (Pérez 2005). Despite such high substrate selectivity in the lomas, individuals of M. tigris at our study site seemed to use a wide range of substrates, from prehispanic bricks to plastic and metal materials. These substrates could provide shelter and appropriate thermal microhabitats, although this hypothesis has not been tested directly in this study. Overall, these lizards in Parque de las Leyendas were mostly observed near vegetation debris which act as food sources since vegetation (i.e. primary production) is practically absent in the entire study site.

Similarly to what observed at Lomas de Lachay (Pérez 2005), lizards in the zoo starts their activity late in the morning (~10:00 h.) and stay active throughout the early afternoon (~16:00 h).

These two populations exhibit similar activity niche breadths.

This could be related to variation in environmental temperatures along the day, with lizards delaying activity to times of the day when temperatures are near their thermal optimum (Huey 1974, Castilla et al. 1999). Body temperatures of Microlophus tigris were similar in Lomas de Lachay (natural site) and Parque de Las Leyendas (artificial site). However, there were differences in microhabitat temperature: while in the lomas Ts and Ta were similar, in Parque de Las Leyendas, Ts was higher than Ta. This difference may be related to the thermal properties of materials used as microhabitats by M. tigris in the zoo, like metals, clothes, prehispanic bricks (hand-made with mud) and to seasonal differences in data recording: summer (from December 2003 to May 2004) in Pérez (2005) and a whole year (2005) in this study.

However, our data support the hypothesis that M. tigris its a thermoconformist (Pérez 2005). Additional studies are needed to test this hypothesis.

There are not healthy microhabitats available for lizards as had been observed by the author: plastics, metals and garbage constitute the habitat of these lizards. Also, the presence of rats and feral cats could enhance conservation risks for this lizard Rev. peru. biol. 18(3): 373 - 376 (December 2011)

(and also for the critical endangered gekkonid Phyllodactylus sentosus) inside Parque de Las Leyendas Zoo, acting as potential predators of both lizards species. Additionally, two observations might be examples of the actual state of lizards in the Zoo: a very low weight male M. tigris (observed in August, 28th, 2006) and other very low weigth juvenile individual observed in August, 6th, 2010. Low food availability and/or habitat quality related to unhealthy habitat could account for this observation.

Conservation measures are needed to ensure the protection of this endangered and endemic lizard living isolated in an urban environment inside Parque de las Leyendas. A recommended strategy is habitat restoration including construction of healthy artificial microhabitats along with the recovery of archaeological heritage and increasing availability of vegetation patches over the actual distribution range of lizards inside Parque de Las Leyendas Zoo as healthy food sources for them.

Acknoledgements JCJ thanks to the Parque de Las Leyendas Zoo staff for logistic support and granted research permit. Dra. Imma Oliveras (Oxford University), Dr. Alessandro Catenazzi (Florida International University) and an anonymus referees reviewed the manuscript critically improving it with valuable comments.

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Rev. peru. biol. 18(3): 373 - 376 (Diciembre 2011)

Rev. peru. biol. 18(3): 377 - 380 (Diciembre 2011) © Facultad de Ciencias Biológicas UNMSM

Phyllodactylus reissi in Parque Nacional Cerros Amotape ISSNde 1561-0837

NOTA CIENTÍFICA

Notes on the ecology of Phyllodactylus reissi (Phyllodactylidae: Sauria) in Parque Nacional Cerros de Amotape (Tumbes, Peru)

Notas sobre la ecología de Phyllodactylus reissi (Phyllodactylidae: Sauria) en el Parque Nacional Cerros de Amotape (Tumbes, Perú) Juan Carlos Jordán Arizmendi 1,2 1Departamento de Herpetología, Museo de Historia Natural, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Museo de Historia Natural, Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Av. Arenales 1256, Jesús María Apdo. 14-0434, Lima 14, Perú.

2 Laboratorio de Estudios en Biodiversidad (LEB). Departamento de Ciencias Biológicas y Fisiológicas.

Facultad de Ciencias y Filosofía.

Universidad Peruana Cayetano Heredia (UPCH).

E-mail: juan.jordan@gmail.com

Presentado: 07/03/2011 Aceptado: 08/09/2011 Publicado online: 08/02/2012

Abstract Some basics aspects on the ecology of the nocturnal gecko Phyllodactylus reissi from Parque Nacional Cerros de Amotape (Tumbes, Peru) are described. This species used rock boulders (57,4%) and trees (31,9%) as microhabitats primarily, exhibiting a nocturnal activity pattern, with a peak between 2100-2200 hours, remaining active until midnight. Body temperature (mean 24,4 ºC) was correlated with both air and substrate temperature, with the last variable affecting in higher degree (47%) the body temperature of this species. The slightly high body temperature of Phyllodactylus reissi, compared to other Phyllodactylus geckos, could be related to nocturnal microhabitat use and diurnal retreat site selection. More studies on lizard ecology from this endangered ecosystem are needed.

Keywords: Phyllodactylus reissi, northewestern dry forest, lizard ecology, Parque Nacional Cerros de Amotape.

Resumen Se describen algunos aspectos básicos de la ecología de Phyllodactylus reisii en el Parque Nacional Cerros de Amotape (Tumbes, Peru). Esta especie emplea paredes rocosas (57,4%) y árboles (31,9%) como microhábitats principalmente, exhibiendo un patrón de actividad nocturno, con un pico entre las 2100-2200 horas, permaneciendo activos hasta la medianoche. La temperatura corporal (promedio 24,4ºC) se correlacionó con la temperatura del aire y la del substrato, donde esta última variable afecta en un mayor grado (47%) la temperatura corporal de esta especie. La ligeramente alta temperatura corporal de Phyllodactylus reissi, comparado con otros Phyllodactylus, podría estar relacionada con la selección de microhábitats nocturnos y refugios diurnos. Estudios sobre la ecología de los saurios en este ecosistema amenazado son necesarios.

Palabras clave: Phyllodactylus reissi, bosques secos del noroeste, ecología de lagartijas, Parque Nacional Cerros de Amotape.

Phyllodactylus Gray 1828, is a widespread genus of nocturnal lizards in Peru, with 13 species currently recognized (Dixon & Huey 1970, Venegas et al. 2008). These geckos occur in deserts, foothills, dry forests, and inter-Andean valleys ecosystems (Dixon & Huey 1970, Pérez 2005, Jordán 2006, Venegas et al. 2008).

Phyllodactylus reissi Peters 1862 is a common gecko in desert, dry and tropical forests in northwestern Peru (Dixon & Huey 1970, Huey 1979, Jordán 2006, Catenazzi & Donnelly 2007, Venegas et al. 2008) and also occurs in northeastern interAndean valleys (Venegas et al. 2008). Locally named “jañape” or “saltojo”, this species occurs in sympatry with other species of Phyllodactylus along its geographic range (Dixon & Huey 1970). For example, in Piura region (northwestern Peru) P. reissi is sympatric with P. kofordi, P. clinatus, P. microphyllus (Dixon & Huey 1970, Huey 1979, Catenazzi & Donnelly 2007) and in Amazonas region with P. thompsoni and P. delsolari (Venegas et al. 2008).

To date, there are few data on P. reissi ecology (Jordán 2006, Werner et al. 1996). In this study, I present information about microhabitat use, activity patterns, and thermal ecology of Phyllodactylus reissi living in the dry forest at Cerros de Amotape National Park.

Rev. peru. biol. 18(3): 377 - 380 (December 2011)

I carried out this study in the area surrounding Quebrada Faical Biological Station (03º48´ 23.3”S, 080º16´00.4”W, elevation 651 m), located inside Cerros de Amotape National Park.

A team of two herpetologists conducted field observations on P. reissi during 05 days at the dry season (October - December 2006), yielding an effective sampling effort of 18 hours/man.

The area has dense deciduous forest, with great portions of secondary forest in lower areas and transitional vegetation between dry forest and Tropical Pacific forest (Wust 1998, Pacheco et al. 2007). I used trails already established in the forest to register data about activity pattern, microhabitat use and thermal ecology of active Phyllodactylus reissi individuals. All trails were visited between 19:00 and 24:00 hours each night recording the hour when lizard was first observed and the substrate and perch height and width.

Body, substrate and air temperatures (1 cm above substrate) were registered with Miller and Weber® quick-reading cloacal thermometer. Histograms of microhabitat use and activity patterns were constructed for further analysis. Thermal data were tested with a one-way ANOVA and with a simple and multiple regressions. Data normality was assessed with Levene‘s test. All statistical analysis were performed with the software Statistica v. 5.0 for Windows with a α-level of 0,05.

377

Jordán Arizmendi

Body temperature ( °C)

27 26 25 24 23 22 21 20

21

22

23

24

25

26

27

Air temperature ( °C)

Figure 1. Microhabitat use by Phyllodactylus reissi in Cerros de Amotape National Park.

Figure 2. Relationship between air temperature and body temperature at the study site for Phyllodactylus reissi (y = 0,640x + 9,382, n=38, p = 0,036).

Fourty-eight individuals of Phyllodactylus reissi were observed during field work. They were found primarily on rock walls (57,4%) and trees (31,9%; Fig. 1). Some individuals were seen in leaf litter (6,4%) and walking on the ground (4,3%), apparently moving between perches. Mean perch height (rocks) was 84.36 cm (10-260) while mean perch height and diameter (trees) were 101.7 cm (12-186) and 96.71 cm (7 – 259), respectively.

Use of rocks as microhabitats is common in Phyllodactylus geckos in Peru (Dixon & Huey 1970). For example, two recently described species of Phyllodactylus use boulders in canyons and stones as microhabitats (Venegas et al. 2008). P. lepydopigus use mainly “tara” trees (Caesalpinia sp.) and, in a lesser percentage, “pircas” (pre-hispanic or contemporary stone walls for cattle raise) in Lomas de Lachay National Reserve (Pérez 2005). Phyllodactylus reissi is a scansorial gecko, using primarily vertical rock boulders and, to a lesser extent, trees as perches in the study area.

However, Huey (1979) reported P. reissi as an arboreal species, using primarily mesquite trees (Prosopis spp.) as perches in Cerro Illescas (Piura). Indeed, Catenazzi and Donnelly (2007) confirmed this trend with a substantial increase in geckos and mesquite trees abundance in the same study area at Cerro Illescas, where rock boulders are not abundant (Jordán, pers. comm.).

Other study recorded P. reissi as common in human constructions inside Cerros de Amotape National Park (Jordan 2006).

Phyllodactylus reissi presents morphological characteristics typically of scansorial lizards, as flat heads and bodies, similar-sized extremities and large toe pads (Miles 1994, Vanhooydonck et al. 1999, Zaaf & van Damme 2001), that allow them to occupy vertical surfaces (J. Jordán, unpublished data). No other species of nocturnal gecko were registered in the study area, except the

Mean body temperatures of Phyllodactylus reissi was 24 Cº ± 1,04 (n= 38). Mean air and substrate temperature were 23, 2 Cº and 23,7 Cº, respectively (Table 1). Body temperatures of P. reissi differed significantly from air temperature (F1,74 =10,58, p=0,001) but not from substrate temperature (F1,74 =1,89, p=0,17).

Air temperature was not different from substrate temperature in the study site (F1,74 =2,70, p=0,10). Body temperature was significantly correlated with air temperature and substrate temperature (Table 1). Both, substrate and air temperature interacted with body temperature of P. reissi (Fig. 2 and 3) with substrate temperature accounting for 47% of the variation in lizard body temperature.

Individuals were registered active from 19:30 to 00:00 hours.

Peak activity was observed between 21:00 and 22:00 (Fig. 4).

12 10 8

26 Number of lizards

Body temperature ( °C )

27

25 24 23

4 2

22 21

0

21

22

23

24

25

26

27

28

Substrate temperature ( °C)

Figure 3. Relationship among body temperature and substrate temperature for Phyllodactylus reissi in Parque Nacional Cerros de Amotape (y = 0,514x + 11,89, n=38, p < 0,001).

378

6

19:30 20:00 20:30 21:00 21:30 22:00 22:30 23:00 23:30 Time of activity

Figure 4. Activity pattern of Phyllodactylus reissi in Cerros de Amotape National Park.

Rev. peru. biol. 18(3): 377 - 380 (Diciembre 2011)

Phyllodactylus reissi in Parque Nacional Cerros de Amotape Table 1. Multiple regression values among temperature variables from Phyllodactylus reissi (n=38).

Variables

Tb

Ta

Ts

X ± SD

24 Cº ± 1,04

23,2 Cº ± 1,2

23,7 Cº ± 1,26

-

Range

21,8-26,6

21,1-28

21,6-27

-

0,12

0,47

0, 47

R2

Ta vs. Ts

F

4,93

32,50

15,91

p

<0,03

<0,001

<0,01

diurnal Gonatodes caudiscutatus (Sphaerodactylinae), which apparently, occupies similar microhabitats (J. Jordán, pers. observ.).

Phyllodactylus reissi presents nocturnal activity similar to other species of the same genus (Dixon & Huey 1970, Huey 1979, Pérez 2005, Catenazzi & Donnelly 2007, Venegas et al. 2008).

The activity period of P. reissi may extend beyond 00:00 h, as other nocturnal geckoes which present an extended activity pattern, even crepuscular (Cooper et al. 1985, Kingsbury 1989, Vitt & Zani 1997). However, more sampling between 00:00 h and sunrise is needed to determine the extent of nocturnal activity in P. reissi.

Low body temperatures are common among nocturnal species compared to diurnal lizards (Huey et al. 1989, Autumn et al.

1997, Kearney & Predavec 2000). Phyllodactylus geckos present a range of temperatures between 21.9 ºC and 22.3 ºC, usually higher than environmental temperatures (Werner et al. 1996, Pérez 2005). In Parque Nacional Cerros de Amotape, P. reissi present high body temperatures similar to those reported for the genus and this species in Peru by Werner et al. (1996). Thermal data collected by Pérez (2005) from Phyllodactylus lepidopygus, a scansorial species from central Peru, which used trees and rocks as microhabitats, showed a similar body temperature with P. reissi.

However, differences in environmental temperatures related to geographic patterns, probably affects body temperature of these two gecko species. In this case, both Phyllodactylus species maintain high body temperatures, may be via selection for warmer nocturnal microhabitats and retreat diurnal sites as have been reported for other nocturnal geckos (Schlesinger & Shine 1994) rather than local physiological adaptations.

More studies concerning the ecology of lizard community in Cerros de Amotape National Park are needed as there are very few contributions in lizard ecology from this endangered ecosystem (Jordán 2010).

Acknowledgements JCJ thanks to Parque Nacional Cerros de Amotape staff for granted collection permits, to Alejandro Mendoza for field assistance and to Danny Castro for data transcription. Also, to Dr. Rudolf von May (Florida International University, Dr. Inmaculada Oliveras (Oxford University) and an anonymus referee for critical revision of the manuscript. Jesus H. Cordova, curator of Department of Herpetology (MUSM), kindly permit access to the Department for individuals and prey analysis.

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Rev. peru. biol. 18(3): 381 - 382 (Diciembre 2011) © Facultad de Ciencias Biológicas UNMSM

Distribución del rango migratorio de Muscisaxicola frontalis en el Perú ISSN 1561-0837

NOTA CIENTÍFICA

Extensión de la distribución del rango migratorio de la “Dormilona de Frente Negra”, Muscisaxicola frontalis (Aves: Tyrannidae) en el Perú Extension of the distribution of the migratory range of the “Black-fronted Ground Tyrant” Muscisaxicola frontalis (Aves: Tyrannidae) in Peru Renzo Alcocer1, Grace P. Servat2 y Wilfredo Mendoza3 1 Área de Ornitología, Colección Científica, Museo de Historia Natural, Universidad Nacional San Agustín de Arequipa. Arequipa, Perú. Email: renzopaul@hotmail. com 2 Smithsonian Conservation Biology Institute, CCES-NZP; 1100 Jefferson Drive, Suite 3139, Washington, DC 20013-7012. E-mail: grace.servat@gmail.com 3 Laboratorio de Florística, Museo de Historia Natural-UNMSM. Av. Arenales 1256, Jesús María, Lima. Perú. Email: wilfredomen@ gmail.com Presentado: 27/07/2011 Aceptado: 03/11/2011 Publicado online: 08/02/2012

Resumen Extendemos el rango migratorio, altitudinal y de distribución norte de Muscisaxicola frontalis (“Dormilona de Frente Negra”), migrante Austral previamente reportado para el sur del país. La especie fue observada en laderas pedregosas cerca a remanentes de bosque de Queñoa (Polylepis flavipilla, Rosaceae) a 4450 m de altitud, en el Departamento de Huancavelica.

Palabras clave: Muscisaxicola frontalis, distribución, Huancavelica, ladera rocosa, bosque de Queñoa, migratoria Austral.

Abstract We extent the migratory range of distribution and elevation of Muscisaxicola frontalis (Black-fronted Groundtyrant), Austral migrant reported previously only in the Southern region of the country. The species was observed in rocky slopes near Polylepis flavipilla (Rosaceae) woodlands at 4450 m of altitude, in the Huancavelica Department.

Keywords: Muscisaxicola frontalis, distribution, Huancavelica, rocky slopes, Polylepis woodlands, Austral migrant.

La Dormilona de Frente Negra (Muscisaxicola frontalis (Burmeister, 1860), Tyrannidae), esta distribuida en regiones alto andinas (> 2900 m de altitud) desde Santiago de Chile hasta Antofagasta (Chile) y de Mendoza hasta Río Negro (oeste de Argentina). En invierno migra hasta Jujuy (noroeste de Argentina) llegando hasta el Altiplano de Bolivia (> 3600 m) (Fjeldså et al. 1990) (Fig. 1a). En el Perú, M. frontalis ha sido registrada en periodo no reproductivo (Plenge 2010), desde abril a septiembre, en los Departamentos de Arequipa, Moquegua y Puno (Fig. 1b, 1c), de 3750 a 4300 m de altitud, donde se le encuentra asociada con pastizales, humedales, laderas pedregosas y rocosas (Fjeldså y Krabbe 1990, Jaramillo et al. 2003, Schulenberg et al. 2007).

Un individuo de M. frontalis fue observado el 17 de mayo del 2010, durante una visita al remanente de bosque de Queñoa (Polylepis flavipila (Bitter) M. Kessler & Schmidt-Leb., Rosaceae), en el área cercana a la localidad de Huaytará, en el kilómetro 153 de la carretera Los Libertadores-Wari (Departamento de Huancavelica, Provincia de Huaytará, 13°30'08.01"S; 75°09'22.60"W, 4450 m) (Fig. 1c). El individuo fue observado posado sobre el suelo de una ladera pedregosa, con vegetación dispersa constituida principalmente por Jarava ichu (Poaceae), arbustos de Senecio spp., Chuquiraga spinosa (Asteraceae) y pequeños arbolillos de P. flavipila. El individuo presentaba coloración negra en la región frontal que se prolongaba hasta la corona o región pileal central que contrastaba con la coloración gris pálida de la región pileal lateral y la región loral de color blanco (Fig. 2).

El 18 de mayo, capturamos un individuo mediante el uso de redes de neblina, el cual fue preparado como ejemplar de estudio para su posterior identificación. El estado del plumaje, la coloración definida del pileo y lorum; Además, de la ausencia de color ante (canela claro) en los bordes de las plumas cobertoras alares (Jaramillo et al. 2003), revelan de que se trata de un individuo macho adulto (testes 1x1 mm), aunque presenta Rev. peru. biol. 18(3): 381 - 382 (December 2011)

Huancavelica

Cusco

Puno

N Arequipa

Moquegua

220 km

Figura 1. Distribución de Muscisaxicola frontalis en Sudamérica (a) (Ridgely, et al. 2007) y en el Perú (b y c). En c) Los círculos negros corresponden a registros confirmados, los círculos blancos son registros por confirmar (Schulenberg et al. 2006). El círculo gris representa el nuevo reporte para la localidad de Huaytará (Huancavelica).

381

Alcocer et al.

Figura 2. Muscisaxicola frontalis, nótese la coloración negra en la región frontal que se prolonga hasta la región pileal central (corona) y la región loral de color blanco (Foto: R. Alcocer).

un porcentaje de osificación del cráneo del 25%. Una posterior revisión de la literatura y comparación con especímenes de las colecciones ornitológicas de los Museos de Historia Natural de la Universidad Nacional de San Agustín de Arequipa (MUSA) y de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos (MUSM) nos permitieron confirmar que se trata de la especie M. frontalis. El espécimen (junto con el contenido estomacal y tejidos preservados) se encuentra depositado en la colección del MUSM (GSV 2010-85). Con este reporte extendemos el rango migratorio de distribución norte de la especie hasta Huancavelica y su rango altitudinal hasta los 4450 m para el Perú.

Agradecimientos Agradecemos a E. López Tejada, Director del Museo de Historia Natural de la Universidad de San Agustín de Arequipa (MUSA) y a L. Salinas, Curadora de la Colección Ornitológica del Museo de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos (MUSM) por facilitarnos el acceso a las colecciones a su cargo.

Así mismo agradecemos a las autoridades respectivas de la Dirección General de Gestión Forestal y de Fauna Silvestre por el permiso otorgado para el presente estudio (RD No. 0130-2010-AG-DGFFS-DGEFFS del 26/3/2010).

Literatura citada Fjeldså J. & N. Krabbe. 1990. Birds of the High Andes. Copenhagen. Zoology Museum, University of Copenhagen and Svendborg, Apollo Books.

382

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Rev. peru. biol. 18(3): 381 - 382 (Diciembre 2011)

Rev. peru. biol. 18(3): 383 - 385 (Diciembre 2011) © Facultad de Ciencias Biológicas UNMSM

Acantocéfalos Oligacanthorhynchidae del Perú ISSN 1561-0837

NOTA CIENTÍFICA

Algunos acantocéfalos de la familia Oligacanthorhynchidae del Perú Some acanthocephalans of the family Oligacanthorhynchidae from Peru Luis A. Gomez-Puerta Laboratorio de Medicina Veterinaria Preventiva. Facultad de Medicina Veterinaria. Universidad Nacional Mayor de San Marcos.

Av. Circunvalación 2800, San Borja.

Lima, Perú.

E-mail: lucho92@yahoo.com

Resumen Cuatro especies de acantocéfalos pertenecientes a la familia Oligacanthorhynchidae son estudiados. Dos de ellas corresponden a nuevos hallazgos geográficos. Adicionalmente se registra por primera vez en el Perú a Oligacanthorhynchus carinii y Oligacanthorhynchus major.

Palabras clave: Acantocefalos, Oligacanthorhynchidae, Perú.

Abstract Presentado: 28/05/2011 Aceptado: 17/10/2011 Publicado online: 08/02/2012

Four species of acanthocephalan (Oligacanthorhynchidae) were studied. Two species are new geographical records. Additionally, Oligacanthorhynchus carinii and Oligacanthorhynchus major are registered for the first time in Peru.

Keywords: Acanthocephala, Oligacanthorhynchidae, Perú.

Introducción Los acantocéfalos son un grupo de parásitos intestinales que infectan una variedad de vertebrados. Presentan un ciclo de vida indirecto, necesitando de un invertebrado como hospedador intermediario, en ellos se desarrollara la forma larvaria denominada cystacantho (Petrochenko 1956).

Los estudios sobre acantocéfalos en el Perú son limitados.

La gran mayoría de especies conocidas hasta ahora han sido registradas en peces y aves silvestres (Tantaleán et al. 2005). En el presente trabajo se dan a conocer nuevos acantocéfalos para el Perú, así como nuevos hallazgos geográficos para algunas especies ya registradas en estudios anteriores.

Material y métodos Los acantocéfalos se colectaron directamente de los hospederos y fueron relajados en agua destilada hasta que la proboscis estuvo completamente evertida. Luego, los parásitos se fijaron y preservaron en etanol al 70%. Para el estudio morfológico, los acantocéfalos fueron aclarados en una solución de alcoholfenol (1:2 V/V) y coloreados con carmín de Semichon. Algunos

parásitos fueron disectados para el estudio anatómico de sus órganos genitales. Las medidas y fotografías se realizaron usando un microscopio Carl Zeiss Axioskiop-40.

Para la identificación de los especímenes se utilizaron las claves propuestas por Travassos (1917), Petrochenko (1956) y Richardson y Barger (2006). La nomenclatura taxonómica sigue a Amin (1985). Parte de las muestras examinadas se encuentran depositadas en la Colección Helmintológica y de Invertebrados Relacionados del Museo de Historia Natural de la UNMSM (MUSM) Lima, Perú.

Resultados Familia Oligacanthorhynchidae outhwell & MacFie, 1925 1. Oligacanthorhynchus carinii (Travassos, 1917) Schmidt, 1972 (Fig. 1) Hospedero: Dasypus novemcinctus (Dasypopidae).

Localización: Intestino delgado.

Localidad: Iquitos (3°45’00”S, 73°15’00”W), Loreto Deposito Nº: MUSM 3016 Comentario: Oligacanthorhynchus carinii mide de 140 a 220 mm de longitud por 2 a 2,5 mm de ancho. Fue descrito por vez primera en el Brasil por Travassos (1917) como Hamanniella carinii; posteriormente, Meyer (1932 o 1933? revisar en bibliografia) consideró la especie dentro del género Travassosia.

Schmidt (1972) realizó una revisión de la familia Oligacanthorhynchidae y consideró a los géneros Hamaniella y Travassosia como sinónimos del genero Oligacanthorhynchus.

Figura 1. Oligacanthorhynchus carinii. Probóscide de un espécimen adulto. Escala 0,2 mm Rev. peru. biol. 18(3): 383 - 385 (December 2011)

Esta especie ha sido descrita en mamíferos dasipódidos (Dasypodidae): Dasypus novemcinctus de Brasil (Travassos, 1917; Lent y Freitas, 1938); en Tolypeutus tricinctus conurus de Bolivia (Meyer, 1933); en Chaetophractus vellerosus y Tolypeutus mataco procedentes de Argentina (Martínez, 1984) y en Tolypeutes mata-

383

Gomez-Puerta

peligrosas, pero las infestaciones intensas pueden provocar retraso en el crecimiento y emaciación, así como cuadros de peritonitis ocasionada por la perforación de la pared intestinal por parte del parasito. En lo que respecta a Salud Publica, se han reportado casos humanos de acantocefalosis por M. hirudinaceus en diversas partes del mundo (Radomyos et al. 1989, Barnish y Misch 1987, Hemsrichart et al. 1983, Leng et al. 1983).

4. Prosthenorchis elegans (Diesing, 1851) Hospedero: Saimiri sciureus (Cebidae) Localización: Intestino delgado.

Figura 2. Oligacanthorhynchus major. (A) Macho adulto. (B) Macho inmaduro. Escala 1,0 cm.

cus de Paraguay. Con nuestro registro, ampliamos la distribución geográfica de esta especie de acantocéfalo.

2. Oligacanthorhynchus major (Machado-Filho, 1963) Schmidt, 1972 (Fig. 2) Hospedero: Tayassu pecari (Tayassuidae) Localización: Intestino delgado.

Localidad: Tambopata (12°35’36”S, 69°10’35”W), Madre de Dios.

Deposito Nº: MUSM 3017 Comentario: Acantocéfalos relativamente grandes, los machos pueden llegar a medir hasta 498 mm y las hembras hasta 697 mm. Machado-Filho (1963) describe a Macracanthorhynchus major parasitando el intestino delgado del pecarí de collar (Tayassu tajacu) proveniente de Brasil. Posteriormente, Schmidt (1972) transfiere esta especie de acantocéfalo dentro del género Oligacanthorhynchus. La especie O. major ha sido descrita parasitando el intestino delgado de pecaríes (Tayassu pecari y T. tajacu) provenientes de Brasil y Bolivia. Este hallazgo representa el primero registro de O. major para el Perú.

3. Macracanthorhynchus hirudinaceus (Pallas, 1781) Hospedero: Sus scrofa f. domestica (Suidae) Localización: Intestino delgado.

Localidad: Capitán Hoyle (04°05’00”S, 80°53’00”W), Tumbes.

Deposito Nº: MUSM 3018 Comentario: M. hirudinaceus es un parasito del intestino delgado del cerdo que presenta una distribución cosmopolita. Actualmente en el Perú, se conoce su distribución en las localidades de: Cajamarca, Cajabamba, Celendín, Hualgayoc, San Marcos, San Pablo (Cajamarca); Huanuco, Leoncio Prado (Huánuco); Chiclayo, Ferreñafe (Lambayeque); Pucallpa (Ucayali); con este hallazgo ampliamos su distribución en el Perú.

Localidad: Lima.

Deposito Nº: MUSM 3019 Comentario: P. elegans es un parasito común de primates del nuevo mundo. Fue reportado por primera vez en el Perú en el primate Saimiri sciureus (Dunn, 1963). Posteriores estudios ampliaron la lista de hospederos definitivos, registrándose hasta ahora en Saguinus labiatus, S. mystax, Saimiri boliviensis y S. sciureus provenientes de Loreto (Michaud et al., 2003); y en S. sciureus de la reserva Tambopata en Madre de Dios (Phillips et al. 2004). En el presente estudio el acantocéfalo fue colectado de un ejemplar de S. sciureus criado como mascota en la ciudad de Lima.

Este acantocéfalo se propaga fácilmente en colonias de monos en cautiverio, utilizando a las cucarachas o a algunos escarabajos como hospederos intermediarios (Stunkard 1965). La acantocefalosis ocasionada por P. elegans presenta dos síndromes: un síndrome crónico y uno agudo. El curso crónico se caracteriza por una diarrea acuosa por varios meses, con cuadros de anorexia y caquexia. El curso agudo dura menos de un día produciendo la muerte del animal a causa de una peritonitis bacteriana por perforación de la pared intestinal por la proboscis del parasito.

Los registros sobre acantocéfalos en el Perú son principalmente por hallazgos accidentales en las necropsias de animales, tales como en el presente trabajo. El registro por primera vez en el Perú de los acantocéfalos O. carinii y O. major puede deberse a la escasez de estudios parasitológicos en mamíferos dasipódidos y tayasuidos peruanos.

Con los nuevos registros de los acantocéfalos O. carinii y O. major, el estatus de las familia Oligacanthorhynchidae en el Perú pasaría a conformarse por seis especies incluyendo a M. hirudinaceus, P. elegans, Oncicola spirula y Oncicola canis.

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Primer registro del cestodo Crepidobothrium gerrardii en el Perú ISSN 1561-0837

NOTA CIENTÍFICA

Primer registro de Crepidobothrium gerrardii (Cestoda: Proteocephalidae) en el Perú First record of Crepidobothrium gerrardii (Cestoda: Proteocephalidae) in Peru Luis A. Gomez-Puerta Laboratorio de Medicina Veterinaria Preventiva. Facultad de Medicina Veterinaria. Universidad Nacional Mayor de San Marcos.

Av. Circunvalación 2800, San Borja.

Lima, Perú.

E-mail: lucho92@yahoo.com

Resumen Se registra por primera vez la presencia en el Perú del cestodo Crepidobothrium gerrardii parasitando el intestino de una boa constrictora (Boa constrictor) procedente del departamento de Loreto. Cuatro especímenes fueron estudiados e identificados como C. gerrardii.

Palabras clave: Crepidobothrium gerrardii, cestodo, Boa constrictor, Perú.

Abstract Presentado: 04/05/2011 Aceptado: 17/10/2011 Publicado online: 08/02/2012

It is the first record of cestode Crepidobothrium gerrardii in Peru, parasitizing the intestine of a boa constrictor (Boa constrictor) from Loreto. Four tapeworms were studied and identified as C. gerrardii.

Keywords: Crepidobothrium gerrardii, cestode, Boa constrictor, Peru.

Introducción El grupo de cestodos más destacable en serpientes es la familia Proteocephalidae La Rue, 1911, encontrada en una lista amplia de hospederos del viejo y nuevo mundo (Freze 1965, Rego 1994, Ernst y Ernst 2006). Dentro de esta familia, el género Crepidobothrium Monticelli, 1900; parasita únicamente a serpientes sudamericanas (Rego 1994).

Actualmente, los registros sobre cestodos de serpientes peruanas son escasos, únicamente es conocida Ophiotaenia sp. parasitando a las serpientes Bothrops atrox Linnaeus, 1758, Boa constrictor Linnaeus, 1758, Epicrates cenchria Linnaeus, 1758 y Corallus caninus Linnaeus, 1758(Tantaléan y Gozalo 1985, Sánchez et al. 2004). En el presente trabajo se reporta a Crepidobothrium gerrardii Baird, 1860 como nuevo cestodo para la fauna parasitaria de Perú.

Material y métodos En Mayo del 2004, se examinó el sistema digestivo de una boa constrictora (B. constrictor) procedente de la localidad de Nauta (4°29’09.00”S – 73°35’40.96”W), provincia de Iquitos, Loreto, en la amazonía del Perú. Se colectaron 4 cestodos, los cuales fueron fijados y preservados en etanol al 70%. Para el estudio taxonómico, los cestodos fueron teñidos con acetocarmin ferrico, clarificados en eugenol y montados en Bálsamo de Canadá (Georgiev et al. 1986). Las medidas y fotografías se realizaron en un microscopio Carl Zeiss Axioskop 40, equipado con un ocular micrométrico. Las medidas se expresan como rango en milímetros.

Para la identificación se utilizaron las claves morfológicas propuestas por Rego (1994) y de Chambrier (1989a). La nomenclatura taxonómica se realizo de acuerdo a Rego (2003).

Parte de las muestras examinadas se encuentran depositadas en la Colección Helmintológica y de Invertebrados Relacionados del Museo de Historia Natural de la UNMSM (MUSM 2978) Lima, Perú.

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Resultados Clase: Cestoda Orden: Proteocephalidea Mola, 1928 Familia: Proteocephalidae La Rue, 1911 Género: Crepidobothrium Monticelli, 1900 Crepidobothrium gerrardii Baird, 1860 Cestode de 320 – 540 mm de largo con un ancho máximo de 4 mm. El escolex presenta cuatro ventosas prominentes que miden de 0,60 – 0,72 mm de diámetro. Los proglotidos maduros (Figura 1) miden de 2500 – 4800 mm de largo por 2450 – 3000 mm de ancho. Los proglotidos grávidos miden de 4020 – 4750 mm de largo por 1420 – 1680 mm de ancho. El poro genital es irregularmente alternado. Los testículos son numerosos (312 – 360), se encuentran agrupados en dos filas laterales. La vagina se encuentra posterior al saco del cirro. El ovario es bilobulado con un ancho que oscila de 0,99 – 1,30 mm de largo y se encuentra

Figura 1. Proglotis maduro de Crepidobothrium gerrardii. Escala 0,5mm.

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localizado en el margen posterior de los proglotis. Los proglotis grávidos presentan el útero medial con ramas laterales.

Coincidiendo con las descripciones de Chambrier (1989a) concluimos que la especie corresponde a C. gerrardii.

Discusión Durante muchos años las especies correspondientes al género Crepidobothrium han tenido controversias en lo que respecta a su nomenclatura. Meggitt (1927) considera que el género Crepidobothrium se encuentra conformado por más de 7 especies. Freze (1965) considera cuatro especies para este género.

Schmidt (1986) menciona que el género está conformado por solo 5 especies. Finalmente, de Chambrier en 1989 (a y b), realizó una revisión del género Crepidobothrium concluyendo que está representado por 5 especies validas: C. gerrardii para la boa constrictora; C. dollusi y C. lachesidis parásitos de la anaconda (Eunectes murinus Linnaeus, 1758); C. viperis y C. garzonii para Bothrops alternatus Duméril, Bibron & Duméril, 1854 (de Chambrier 1988, de Chambrier 1989a, de Chambrier 1989b).

Crepidobothrium gerrardii fue descrita por vez primera por Baird (1860) parasitando una boa constrictora procedente de Sudamérica. Posteriormente fueron descritas otras especies de cestodos Proteocephalideos para la boa constrictora. MacCallum (1921) describe a Tetrabothrius boiae parasitando a una B. constrictor proveniente de Brasil y a Tetrabothrius brevis para una B. constrictor de México. De Chambrier (1988 a y b) realizó una revisión del material tipo de estos especímenes y concluye que T. boiae y T. brevis son sinónimos de C. gerrardii.

La distribución de C. gerrardii es únicamente para países tropicales (Rego 1967). Los registros en otros países se deben exclusivamente a hallazgos en zoológicos (de Chambrier 1989a).

El hallazgo de C. gerrardii en Perú permite ampliar el área de distribución del parásito.

Literatura citada Baird W. 1860. Description of some new species of intestinal worms (entozoa) in the collection of the British Museum. Proc.

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Efecto de los metales sobre microcrustáceos de agua dulce ISSN 1561-0837

COMENTARIO

Efecto de los metales sobre microcrustáceos de agua dulce.

Avances metodológicos y potencialidad de cladóceros y copépodos como organismos test Effects of metals on freshwater microcrustaceans. Metodological advances and potentiality of cladocerans and copepods as test organisms María Florencia Gutierrez1 y Ana María Gagneten2 1 Instituto Nacional de Limnología (CONICET- UNL). Ciudad Universitaria. Santa Fe, Argentina. Email: fgutierrez@inali.unl.edu.ar 2 Facultad de Humanidades y Ciencias, Universidad Nacional del Litoral, Ciudad Universitaria. Santa Fe, Argentina. Email: amgagnet@ fhuc.unl.edu.ar

Resumen El incremento de los metales en los cuerpos de agua dulce a causa de las actividades antropogénicas genera importantes alteraciones sobre la biota. Esta revisión analiza los efectos adversos de varios metales de relevancia ecotoxicológica sobre los microcrustáceos zooplanctónicos (cladóceros y copépodos), los avances experimentales en esta línea y las ventajas de cada grupo como organismos test. En general, la necesidad de obtener indicadores más sensibles y representativos que los tradicionales, promovió lineamientos hacia estudios subcrónicos, interspecíficos y multigeneracionales. Por otra parte, la tendencia actual hacia el estudio de mezclas de sustancias y los efectos indirectos permite adquirir una visión más integral del problema. El impacto sobre las poblaciones es muy variable, dependiendo de la naturaleza del metal, las características del medio, el tiempo de exposición, las condiciones de cultivo y aspectos genéticos. Sin embargo, la mayoría de los trabajos se centran en pocas especies, dejando vacancias en el conocimiento de las representantes de cada región particular. Si bien algunos atributos de los cladóceros y copépodos como el tamaño, la morfología y el rol ecológico los tornan buenos indicadores, las diferencias en el desarrollo, reproducción y estrategias de perpetuación confieren ventajas a un grupo sobre otro.

Palabras clave: ecotoxicología; metales; microcrustáceos zooplanctónicos; diseños experimentales.

Abstract

Presentado: 11/05/2011 Aceptado: 16/08/2011 Publicado online: 08/02/2012

The increase of metals in fresh water systems due to anthropogenic activities cause important alterations on the biota. The present review analyze the adverse effects of various metals of ecotoxicological relevance on microcrustaceans zooplankton species (cladocerans and copepods), the experimental advances and the advantages of each group as test organisms. In general, the need to obtain more sensitive and representative indicators than the tradicional ones leads to subchronic, interespecific and multigenerational studies. Additionally, the analysis of mixtures as well as their indirect effects allows to acquire more integral knowledges of the impact of contaminants. The toxic effects are different, depending on the nature of metals, the physicochemical characteristics of the water, exposutre time and genetic traits. However, most works are focused on few species, leading vacant areas on the knowledge of the representatives of every particular region. Despite some cladocerans and copepods atributes make them good bioindicators (size, morphology and ecological role), differences of development, reproduction and perpetuation strategies bring advantages to one group on another.

Keyword: ecotoxicology metals zooplanktonic microcrustaceans; experimental designs.

Introducción Los metales constituyen componentes comunes de la litosfera y forman parte de numerosos ciclos biológicos y geológicos naturales. No obstante, se ha demostrado que la creciente industrialización y actividades agrícolas suelen generar importantes modificaciones en estos ciclos, causando el incremento de las concentraciones normales en los cuerpos de agua continentales (Chen & Folt 2000). Estos ecosistemas constituyen los ambientes más sensibles a dichos cambios y sus alteraciones tienden a repercutir directamente sobre las poblaciones humanas que los utilizan como fuente de recursos. Una de las principales medidas para su conservación implica evaluar los efectos de estas sustancias sobre la biota que los habita y desarrollar normas de gestión adecuadas en base a los niveles guía determinados en campo y laboratorio (Baudouin & Scoppa 1974).

Entre los integrantes de los mencionados ecosistemas, el zooplancton constituye una comunidad clave. Sus componentes poseen un rol central en las tramas tróficas, y su elevada sensibilidad a los cambios físicos y químicos del medio los tornan adecuados para su utilización como bioindicadores de contaminación por metales. Si bien pertenecen a diversos grupos funcionales, en Rev. peru. biol. 18(3): 389 - 396 (December 2011)

conjunto contribuyen al transporte de materia y energía desde los niveles tróficos inferiores hacia los superiores. Intervienen activamente en el reciclado de materia orgánica disuelta, se alimentan de algas, detritos u otros microorganismos y son el principal recurso de numerosos peces e invertebrados acuáticos (Ortaz et al. 2006).

Los cladóceros y copépodos pertenecen al grupo de los microcrustáceos del zooplancton y dada su gran sensibilidad, son los más utilizados en estudios ecotoxicológicos si se los compara con otros miembros de dicha comunidad. Además, su pequeño tamaño, cortos períodos generacionales y facilidad para los cultivos les otorgan relevancia y practicidad para estudios experimentales y de impacto ambiental (Gaete & Paredes 1996). En este sentido, permiten evaluar no sólo los efectos directos, sino también el impacto indirecto de los contaminantes o estresores ambientales, otorgando mayor representatividad a los resultados obtenidos y estimaciones a largo plazo (Boyd 2010). Esto se debe a que dicho análisis requiere frecuentemente observaciones a mayor escala, o bien sobre las interacciones con los niveles tróficos adyacentes, lo cual resultaría dificultoso con organismos de mayor talla o tiempo generacional.

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Gutierrez & Gagneten

El objetivo de esta revisión es analizar los trabajos más relevantes sobre los efectos negativos de los metales de importancia ecotoxicológica en cladóceros y copépodos de agua dulce. Esta breve revisión no intenta cubrir toda la literatura existente, sino proveer información útil a partir de las investigaciones experimentales importantes para el ámbito académico, y sugerir posibles vías para futuros estudios. Adicionalmente, dado que al presente la mayoría de las revisiones en esta temática refieren a estudios de campo (Ferdous 2009, Boyd 2010), este trabajo pretende además aportar información para una base de datos de trabajos experimentales de referencia.

En primera instancia, se detallarán los avances metodológicos en estudios de laboratorio resaltando los cambios ocurridos.

Luego, se identificarán los efectos adversos de varios metales sobre cladóceros y copépodos y, finalmente se mencionarán las ventajas y desventajas de cada grupo como organismos test.

Diseños experimentales y avances metodológicos en estudios de laboratorio.

Los primeros conocimientos sobre los efectos de los metales en los organismos acuáticos se inician a principios del siglo XX (Norwood et al. 2003). Éstos provienen de estudios experimentales basados en ensayos de toxicidad aguda y crónica, mediante los cuales se obtienen las concentraciones letales o efectivas para el 50% de la población analizada (LC 50; EC50) y las concentraciones de efecto mínimo y de efecto no observables (CEM; CENO). A partir de estos valores las agencias internacionales suelen establecer los niveles guía para la protección de la biota (OECD 1981, EPA 1984, APHA 1989). Sin embargo, numerosas investigaciones han cuestionado la representatividad de tales métodos (Heugens 2001, Cairns 1986). Esto se debe, en primera instancia, a que las concentraciones determinadas por ellos son frecuentemente mayores a las presentes en los ambientes naturales.

En segundo lugar, no contemplan los efectos más sutiles de los contaminantes sobre los organismos. Es decir, aquellos efectos inducidos por concentraciones aún más bajas, capaces de generar estrés y alterar la eficacia biológica de las especies o la estabilidad de las poblaciones a largo plazo (Sibly & Calow 1989, Cohen & Forward 2005). Finalmente, no suelen analizar la existencia de los efectos indirectos de los contaminantes, subestimando de este modo su toxicidad real.

La necesidad de obtener indicadores más sensibles y representativos promovió entonces los primeros lineamientos hacia estudios subcrónicos, interespecíficos y en ocasiones, multigeneracionales utilizando generalmente concentraciones menores a las empleadas en los ensayos tradicionales. En esta línea, los cladóceros y copépodos son uno de los principales representantes, lo cual se refleja en la extensa literatura existente hasta el momento (De Cohen & Janssen 1997, Reichwaldt & Stibor 2005, Sánchez-Ortíz et al. 2010).

Numerosos ejemplos de estos avances se observan en diferentes niveles de organización biológica. Desde el punto de vista fisiológico, Barata et al. (2004) propusieron diseños que permiten reconocer disrupciones endocrinas en copépodos mediante el análisis de los ciclos de vida y posibles desvíos del patrón de desarrollo normal. Esta metodología fue utilizada por Gutierrez et al. (2010) quienes analizaron los efectos del cobre y cromo sobre el copépodo Notodiaptomus conifer

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y detectaron importantes alteraciones con concentraciones aún mas bajas que las que produjeron daños reproductivos.

Por otra parte, el estudio del comportamiento se ha propuesto como otro indicador subcrónico altamente sensible y representativo para cladóceros y copépodos. En este sentido, los comportamientos de escape (Sullivan et al., 1983; West et al., 1998), alimentación (Sharp y Stearns, 1997), fototaxismo (Stearns y Sharp, 1994) y natación (Sullivan et al., 1983) entre otros, han demostrado gran sensibilidad y eficiencia en la detección temprana de contaminantes. Además, su facilidad de medición los constituyen herramientas complementarias de gran potencial para futuros estudios ecotoxicológicos.

Finalmente, los análisis a nivel poblacional han ponderado el empleo del indicador r (tasa intrínseca de crecimiento natural) por la capacidad integradora de diversos parámetros biológicos en estudios de ciclo de vida (Coniglio & Baudo 1989, Koivisto & Ketola 1995, Forbes & Calow, 1999). Pese a haber sido cuestionado por algunos autores (Allan 1976, Janssen et al. 1994), este indicador es altamente confiable y es utilizado en estudio para evaluar los efectos directos de los metales y otros contaminantes.

Otra de las principales líneas de investigación en ecotoxicología de microcrustáceos acuáticos es el estudio del efecto de las mezclas de metales, empleando particularmente el género Daphnia como modelo experimental (Jak et al. 1996, Gaete & Paredes 1996, Wong & Pak 2004). La relevancia de esta línea radica en que los distintos contaminantes, no se encuentran aislados en la naturaleza, sino combinados e interactuando con diferentes componentes del medio. Existen varios métodos gráficos y estadísticos que proporcionan curvas de dosis-respuesta para cada metal en modelos de mezclas. Esta información es utilizada para generar las concentraciones críticas y predecir el impacto de la interacción de los metales (Norwood et al. 2003).

Dado que estos trabajos sólo son aplicables a la toxicidad aguda, aún quedan por diseñar nuevos modelos para valores crónicos.

Pese a la gran importancia de los avances mencionados, hasta el momento ningún organismo internacional ha creado protocolos que involucren estos modelos para el monitoreo orientado al mantenimiento de la calidad del ambiente acuático.

Finalmente, considerando la incidencia indirecta de los tóxicos sobre los microcrustáceos, recientes líneas de investigación se han abocado al estudio de posibles mecanismos de interferencias en las interacciones intra o interespecíficas (Boyd 2010), o los efectos de la bioacumulación de compuestos a lo largo de la trama trófica (Zyadah 2000). Es sabido que las interacciones biológicas cumplen un rol clave en la estructuración y mantenimiento de los ecosistemas, y si tales interacciones son alteradas por factores antropogénicos, la principal consecuencia sería una desestabilización de los mismos.

A partir de lo desarrollado, se podría afirmar que las nuevas tendencias metodológicas aportan una visión más integral y representativa de la contaminación química real del ambiente.

Esto reside por un lado, en que la incorporación de parámetros más sensibles y de relevancia ecológica permite analizar los balances energéticos de los organismos y estimar las consecuencias poblacionales a mayor plazo. Por otra parte, el análisis de mezclas y de los efectos indirectos favorece una mejor comprensión de los efectos de los contaminantes que interactúan en el medio e interfieren en los procesos biológicos.

Rev. peru. biol. 18(3): 389 - 396 (Diciembre 2011)

Efecto de los metales sobre microcrustáceos de agua dulce

Efectos adversos de los principales metales de importancia ecotoxicológica.

Entre los metales “no esenciales”, es decir aquellos cuya presencia en el organismo no es necesaria para el desarrollo normal de las funciones metabólicas se consideraron el mercurio, el cadmio, el plomo y el arsénico. Entre los más representativos del grupo de los “esenciales” se analizó el níquel, el zinc, el cromo y el cobre. Estos poseen funciones metabólicas importantes a concentraciones traza, pero se tornan altamente tóxicos cuando superan el umbral de tolerancia.

Mercurio. La mayoría de los estudios sobre los efectos biológicos del mercurio se centran en el cladócero D. magna. En esta especie, De Cohen y Janssen (1997) observaron que dicho metal y otros compuestos asociados pueden inhibir enzimas digestivas específicas. Sin embargo, tales efectos estarían estrechamente ligados a la temperatura del medio, que puede determinar su ingreso y eliminación (Tsui & Wang 2004): temperaturas bajas reducirían los efectos tóxicos, aunque se ha demostrado que el potencial de transferencia trófica desde las algas hacia los dáfnidos no se ve completamente afectado. Tal observación favorece la evidencia que el grado de toxicidad del mercurio puede ser diferente según el nivel biológico considerado y promueve la necesidad de continuar las investigaciones acerca de la importancia relativa de los factores externos, como determinantes de la toxicidad.

Khangarot y Das (2009) evaluaron el desarrollo de huevos partenogenéticos de D. carinata exponiéndolos a concentraciones entre 0,1 y 32 g L-1 de mercurio. Los resultados obtenidos indicaron que la inhibición de los mismos constituye un indicador eficaz de la toxicidad de este metal. Dada la sensibilidad del método empleado, futuras investigaciones en esta línea contribuirían a detectar indicadores tempranos y muy apropiados para biomonitoreo.

Cadmio. Hasta el momento los cladóceros más estudiados en relación a la toxicidad del cadmio son Ceriodaphnia dubia, D. magna (Suedel et al. 1997) y Moina macrocopa (Wong & Wong 1990) y entre los copépodos, Eurytemora affinis (Hall et al.

1995). Sin embargo, se ha reconocido que varias especies de la biota acuática poseen gran tolerancia a este metal. Esta propiedad podría estar asociada, entre otros factores, a la presencia de ciertos componentes del medio capaces de inhibir o disminuir su ingreso al organismo. Por ejemplo, se ha demostrado en otros invertebrados acuáticos que la exposición a bajas concentraciones de sulfato de zinc disminuye la susceptibilidad a la toxicidad del cadmio (Howell 1985). La presencia de enzimas o complejos de detoxificación tales como las metalotioneínas también podrían ejercer un rol clave, aunque la relación entre éstos y la elevada tolerancia aun está poco resuelta (Wright & Welbourn 1994).

Por otra parte, se ha demostrado el potencial bioacumulativo de este elemento a lo largo de las cadenas tróficas (Munger et al.

1998, Croteau et al. 2005), indicando que tal proceso es notoriamente mayor en la comunidad planctónica que en la de peces.

Entre los trabajos experimentales más significativos se encuentra el de Barata et al. (2002). Estos investigadores analizaron cómo el aporte de alimento y la densidad poblacional pueden afectar las respuestas del cladócero tropical Moinodaphnia macleayi a la toxicidad del cadmio. Estos autores reconocieron un efecto denso-dependiente sobre la toxicidad del metal, sin Rev. peru. biol. 18(3): 389 - 396 (December 2011)

embargo dicho efecto es variable según la cantidad de alimento provisto. La relevancia de dicha investigación reside en reconocer la posibilidad de subestimar la toxicidad real del metal según las condiciones ambientales.

Plomo. En los ambientes naturales los efectos adversos del plomo incluyen alteraciones en el crecimiento, reproducción, comportamiento, metabolismo y sobrevivencia. En cuanto a la incorporación del metal disuelto en los organismos, no existen muchas investigaciones, pero se comprobó que D. magna, absorbe casi el 90% a través de su exoesqueleto (Berglind et al.

1985). Por otra parte, de modo similar que para otros metales, existen diferencias específicas en la sensibilidad y numerosos autores concuerdan que los calanoideos resultan generalmente más sensibles (Sharma & Selvaraj 1994), seguidos por los cladóceros, particularmente D. magna, y los copépodos ciclopoideos (Offem & Ayotunde 2008). De todos modos, pese al aporte de información, estos estudios sólo consideran parámetros irreversibles, obtenidos a partir de ensayos agudos. Sería necesario realizar nuevas investigaciones a nivel crónico o subcrónico para conocer en detalle los efectos más concretos y mecanismos de acción del plomo sobre el ciclo de vida de los organismos. Otros autores analizaron la influencia del sedimento (García-García 2006) o de la disponibilidad de alimento (Enserink 1995) en la toxicidad del plomo durante el ciclo de vida de varias especies, enfatizando nuevamente la importancia de los factores externos como determinantes de la toxicidad de éste y otros elementos.

Arsénico. En contraposición con otros metales, los compuestos inorgánicos de arsénico son más tóxicos que los orgánicos, aún para cladóceros y copépodos de agua dulce. Los principales estudios sobre sus efectos tóxicos se realizaron en Bosmina longirostris, D. magna, D. pulex y Simocephalus serrulatus (Eisler 2004). Los trabajos más recientes han considerado no sólo las características del metal sino las posibles alteraciones en la naturaleza o el modo de exposición. Por ejemplo, Hoang (2007) evaluó las respuestas de D. magna a exposiciones fluctuantes de arsénico observando que el parámetro más afectado fue la mortalidad, mientras que el crecimiento corporal no fue significativamente alterado. Otro aporte interesante lo proveen Chen et al. (1999), quienes detectaron la capacidad del arsénico de incrementar la expresión del ARNm en células constitutivas de D. pulex. Este análisis permitió desarrollar biomarcadores eficientes utilizando técnicas moleculares y demográficas combinadas. Sin embargo, cabe mencionar que pese a su sensibilidad, las investigaciones a escala molecular no contemplan los efectos individuales más sutiles, de relevancia ecológica. Estos efectos son esenciales para comprender procesos tóxicos a mayor plazo, tales como cambios en las dinámicas poblacionales, lo cual adquiere gran relevancia desde el punto de vista ecológico y ambiental.

Níquel. Se ha detectado que la presencia y distribución de níquel en los fluidos corporales, caparazón, apéndices filtradores y huevos se deben principalmente a procesos de acumulación a partir del medio (Hall 1982). A nivel celular, el efecto tóxico más claro se refleja en la homeostasis del Mg2+. Entre las principales alteraciones fisiológicas en cladóceros de agua dulce, se conoce el efecto inhibitorio sobre el crecimiento (Khangarot & Ray 1987), el consumo de oxígeno y la concentración de hemoglobina (Panne 2003). Tal como fue demostrado para otros metales, la toxicidad del níquel varía según las condiciones del medio. En esta línea Keithly et al. (2004) y, posteriormente, Deleebeeck

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Gutierrez & Gagneten

et al. (2008) observaron que el incremento de la dureza del agua aumenta la concentración efectiva (LC50s) del níquel en C. dubia y otros cladóceros de agua dulce. Actualmente existen varios modelos que permiten predecir la biodisponibilidad de este metal para los crustáceos, sin embargo están diseñados casi únicamente para experiencias con D. magna y C. dubia. Aún quedan por desarrollar modelos que involucren otros organismos planctónicos de relevancia ecológica.

Zinc. Las investigaciones más recientes sobre los efectos del zinc confieren particular énfasis a la calidad del alimento y a la aclimatación como factores determinantes de la toxicidad y tolerancia. En líneas generales, los estudios a nivel celular indican que el zinc es capaz de alterar el balance de Ca2+, y si tal cosa ocurre, los daños embrionarios, en el desarrollo o el crecimiento podrían ser irreversibles, con graves consecuencias poblacionales (Jeziorski & Yan 2006). A nivel reproductivo, la toxicidad actuaría más en forma directa inhibiendo la eclosión de los huevos en la cámara incubatriz, que indirectamente por la disminución de la fecundidad de las hembras (Brown et al. 2005).

Entre los cladóceros de agua dulce más estudiados se encuentran los géneros Daphnia y Ceriodaphnia. Varios trabajos registran la elevada tolerancia de D. magna al zinc que podrían deberse a características genéticas específicas (Shaw et al. 2006) o al efecto de aclimatación a las condiciones de laboratorio (Muyssen et al. 2005). Por otra parte, se investigó el efecto individual de diferentes cationes mayores (Ca2+, Mg2+, Na+, K+, y H+) sobre la toxicidad aguda del zinc para D. magna (Heijerick, 2002) así como el efecto de la transferencia trófica sobre la misma especie alimentada con algas contaminadas. En este trabajo, no se observaron efectos en el crecimiento, pero sí en la reproducción total (De Schamphelaere et al., 2004). Para el caso de los copépodos se desarrolló un protocolo que permite evaluar el efecto de la toxicidad y el modo de acción de este metal sobre Bryocamptus zschokkei. En ausencia de alimento, los estadios larvarios fueron más sensibles y los principales efectos tóxicos fueron la reducción en el número de huevos por camada, aumento del tiempo de desarrollo y elevada mortalidad durante la eclosión (Brown 2005).

Cromo. Los efectos tóxicos que generan elevadas concentraciones de cromo inciden sobre numerosos parámetros de la historia de vida de microcrustáceos. Sin embargo, se han registrado diferentes resultados que dependen en gran medida de las condiciones de cultivo así como aspectos genéticos de las diferentes especies (Martínez-Jerónimo et al. 2006). En este sentido, entre los trabajos más completos en cladóceros, se encuentran los de Spehar y Fiandt (1986); Coniglio y Baudo (1989); Gagneten (2006), quienes estudiaron alteraciones en la longevidad, alimentación y reproducción. Asimismo, en condiciones similares, se evaluaron los efectos adversos del cromo en forma individual y en mezclas en el copépodo Mesocyclops pehpeiensis (Wong & Pak 2004) y otros copépodos dulceacuícolas (Gutierrez et al.

2010, Soto et al. 2003).

A nivel comunitario, el impacto del cromo fue evaluado intensamente en estudios de mesocosmos, donde se observaron importantes modificaciones en la diversidad, riqueza y densidad del zooplancton (Gagneten, 2002). Dicho trabajo denota la necesidad de realizar estudios multiespecíficos, dada su mayor capacidad predictiva al compararla con ensayos que involucran sólo una especie.

392

Cobre. En los compartimientos biológicos, este elemento forma parte de numerosas enzimas que actúan como catalizadoras redox o “carriers” (Flemming & Trevors 1989). En el caso de los cladóceros, la sensibilidad es muy variada, y depende principalmente de las condiciones del medio. Entre la literatura analizada en este trabajo, D. magna registra un rango de toxicidad aguda entre 1,4 y 70 μgL-1 (Winner & Farrel 1976, Bossuyt et al. 2004). C. dubia, otra de las especies más estudiadas en ensayos de laboratorio, registró valores entre 35 to 79 μgL-1 a diferentes grados de dureza del agua (Belanger et al. 1989), sin embargo, Gagneten y Vila (2001) encontraron límites menores de sensibilidad (entre 5 y 20 μgL-1) en el mismo cladócero sometido a diferentes niveles de pH. En estudios crónicos con tres generaciones sucesivas, Cowgill y Milazzo (1991) compararon el efecto del cobre metálico individual y como nitrato de cobre en la misma especie, observando diferentes respuestas tóxicas, lo que demuestra la importancia de tener en cuenta la especiación de los metales en los ambientes naturales. En el caso de los copépodos, las variaciones en la sensibilidad dependen del estadio de desarrollo. Por ejemplo, la LC50 -48 h registrada para nauplios de Mesocyclops pehpeiensis fue 75 μg L-1 (Wong & Pak 2004), mientras que los adultos de Cyclops abyssorum y Eudiaptomus padanus registraron valores de 2500 μgL-1 y 500 μgL-1 respectivamente (Baudouin & Scoppa 1974).

Los mecanismos de toxicidad conocidos para cobre consideran interacciones con proteínas, enzimas, ácidos nucleicos y metabolitos (Flemming & Trevors 1989). Sin embargo, los estudios con cobre a nivel celular en invertebrados acuáticos son muy escasos o incompletos. Pese a esta falta de información, los ensayos crónicos suelen ser útiles para detectar indicios de los mecanismos de toxicidad (Winner & Farrel 1976). A nivel comunitario, Havens (1994) realizó estudios de mesocosmos observando una importante reducción en la biomasa total así como en el transporte del carbono orgánico a lo largo de la cadena trófica. Por otro lado, a pesar de la gran relevancia del comportamiento en la dinámica de las comunidades, los estudios etológicos actuales sobre los efectos del cobre son muy escasos y los antecedentes registrados hasta el momento se centran principalmente en D. magna (Untersteiner et al. 2003, Ferrando & Andreu 1993).

En líneas generales se puede afirmar que numerosos factores tales como la calidad del alimento, la predeterminación genética, el grado de desarrollo, el tamaño o el sexo determinan importantes diferencias en la sensibilidad individual (Vasela & Vijverberg 2007, Brown et al. 2005) y entre las especies. Por esta razón, los trabajos comparativos y multiespecíficos son necesarios e importantes para reconocer las condiciones óptimas de análisis y evitar subestimar la toxicidad de los metales.

Por otra parte, está ampliamente documentado que la incidencia de los elementos externos sobre la toxicidad de los metales es muy variable según el nivel de organización biológica considerado. En este sentido, los efectos de la temperatura o las condiciones fisicoquímicas del medio, tales como el pH, entre otros, tienden a influir de modo diferente en la toxicidad de los metales sobre los individuos, las poblaciones o sus interacciones.

Finalmente, destaca la falta de estudios con especies regionales o representativas de cada sitio contaminado en particular.

La mayor parte de los estudios en relación a la toxicidad de los metales se centran en los géneros Daphnia o Ceriodaphnia, que Rev. peru. biol. 18(3): 389 - 396 (Diciembre 2011)

Efecto de los metales sobre microcrustáceos de agua dulce

si bien presentan una amplia distribución y facilidad para el desarrollo de cultivos experimentales, su relevancia y utilidad como organismos test para estudios ambientales ha sido muy cuestionada (Koivisto 1995).

Las características de la historia de vida de los cladóceros y copépodos de agua dulce son adaptaciones adquiridas que permitieron su éxito evolutivo (Paggi 1995). Estas características los tornan muy apropiados para estudios ecotoxicológicos, sin embargo, ciertas diferencias confieren ventajas a un grupo sobre el otro, según los objetivos propuestos.

La reproducción es un parámetro de particular relevancia en los ensayos de laboratorio. En este caso, dado que los cladóceros poseen reproducción partenogénica, son más favorables que los copépodos, razón por la cual han sido estandarizados y considerados más apropiados para establecer comparaciones y determinar los niveles guía de toxicidad (De Bernardis & Peters 1987). En condiciones ambientales estables, estos organismos producen individuos genéticamente idénticos, promoviendo mayor certeza en las evaluaciones a escala de microcosmos, donde se requiere el mayor control posible de las variables externas al tóxico que se intenta analizar. Los copépodos en cambio poseen reproducción sexual, más compleja y prolongada y carecen consecuentemente de la homogeneidad que caracteriza a los cladóceros.

En primer lugar, la morfología constituye una característica favorable para los estudios toxicológicos de campo y laboratorio en ambos grupos (De Bernardis & Peters, 1987). Su longitud media varía entre uno y dos milímetros, y sus diversos apéndices permiten reconocer malformaciones o alteraciones en el desarrollo sea por causas naturales, tales como parasitismo o regeneración post daño, o antropogénicas como las consecuencias de eventos de contaminación ambiental (Fleminger 1985, Sillett & Stemberger 1998, Otha et al. 1998, Sinev 2000).

Finalmente, considerando el esquema r-K de estrategias de perpetuación, los copépodos estarían ubicados entre los K estrategas por su extenso período de desarrollo, su comparativamente modesta tasa intrínseca de crecimiento natural y su sexualidad.

Contrariamente, por el gran oportunismo y capacidad partenogenética, los cladóceros serían estrategas r, vinculándose a los rotíferos (Allan 1976). Estas particularidades son importantes si se pretende realizar estudios de campo, o extrapolar resultados de laboratorio a escalas mayores.

Otro aspecto ventajoso compartido son los parámetros fisiológicos relacionados con las funciones de respiración. Los intercambios de gases se dan principalmente en la superficie del cuerpo, pero ciertos cladóceros poseen además “órganos nucales” que cumplen funciones excretoras (Aladin & Potts 1995). En este sentido, el consumo de oxígeno así como la proporción de hemoglobina en el cuerpo se encuentran entre los indicadores fisiológicos más sensibles (Pane et al. 2003).

Conclusión Los primeros criterios ecotoxicológicos para evaluar la toxicidad de los contaminantes sobre las especies acuáticas fueron la mortalidad y daños reproductivos en ensayos cortos. La ventaja de dichos tests radica en su claridad, ya que los resultados obtenidos son cuantales, generando respuestas de tipo “todo o nada”. Sin embargo, la necesidad de obtener información subletal a bajas dosis de contaminantes, que permita detectar el estrés previo a la muerte y tomar medidas oportunas para mitigar los riesgos, promovió nuevos enfoques metodológicos.

Potencialidades de cladóceros y copépodos como organismos test

Una primera diferenciación entre ambos grupos reside en la alimentación, ya que los cladóceros se caracterizan principalmente por ser herbívoros-detritívoros, aunque algunos pocos son depredadores. Los copépodos, en cambio, poseen modos de alimentación más variados, siendo algunos grupos filtradores, otros ramoneadores o carnívoros. El conocimiento de estos hábitos es particularmente importante cuando se llevan a cabo estudios de laboratorio por la necesidad de realizar cultivos paralelos para alimentar a los organismos.

Otro de los aspectos de particular importancia en estudios experimentales ecotoxicológicos es el desarrollo postembrionario (Gutierrez et al. 2010). En este sentido, los copépodos, a diferencia de los cladóceros, presentan un ciclo de vida altamente complejo, pero a la vez muy favorable para la obtención de información sobre los efectos tóxicos en cada etapa (Kovatch et al, 1999). Esta característica permite además obtener una mayor aproximación sobre las respuestas poblacionales (Hutchinson 2002). El desarrollo de los copépodos incluye el paso por doce estadios larvarios y una metamorfosis de la morfología naupliar (N6) a la de copepodito (C1). Cada uno de dichos estadios es fácilmente identificable, y el pasaje de N6 a C1 constituye un excelente parámetro para evaluar una posible disrupción endocrina ya que implica un momento de gran estrés y susceptibilidad ante alteraciones ambientales (Barata et al., 2004).

Contrariamente, los cladóceros poseen un desarrollo directo, y sus estadios larvarios son más variables y difíciles de identificar, con lo cual la detección de alteraciones en este proceso podría resultar imprecisa.

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Los análisis sobre los efectos más sutiles o subcrónicos, el efecto de las mezclas de metales y el impacto indirecto de los mismos sobre los individuos y las poblaciones, son los principales puntos de interés actual en la comunidad científica. Estos permiten además obtener resultados más representativos de la potencialidad tóxica de los contaminantes, aunque aún es necesario un mayor esfuerzo interdisciplinario para integrar los resultados alcanzados.

Pese a la existencia de un gran número de trabajos ecotoxicológicos respecto a la toxicidad de los metales, la gran mayoría se han focalizado en pocas especies de microcrustáceos, dejando áreas vacantes en el conocimiento de la sensibilidad de especies representativas de cada región en particular. Considerando la importancia biológica y ecológica de las mismas, el desarrollo de estudios en esta línea proveería información complementaria y de gran utilidad para evaluaciones de impacto ambiental y estudios integrales de los ecosistemas.

Finalmente, se podría concluir que ciertas particularidades comunes de los cladóceros y copépodos tales como el tamaño, la morfología y el rol ecológico, los tornan buenos indicadores de toxicidad y permiten evaluar eficientemente los efectos y mecanismos de acción de los metales. No obstante, ciertas diferencias en el desarrollo, la reproducción y las estrategias de perpetuación confieren ventajas a un grupo sobre otro según el análisis requerido, que necesariamente deben ser consideradas en cada diseño metodológico particular.

393

Gutierrez & Gagneten

Agradecimientos A la Universidad Nacional del Litoral, por el financiamiento del trabajo (Proyecto CAI+D 2009).

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Rev. peru. biol. 18(3): 389 - 396 (Diciembre 2011)

Colof贸n

Rev. peru. biol. 17(2): 000- 000 (August 2010)

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Suscripciones y Canje Subscriptions and Exchange programs La Revista Peruana de Biología es publicada en abril. agosto y diciembre y esta dedicada a la publicación de los resultados de investigaciones originales e inéditas en las áreas de Biodiversidad, Biotecnología, Manejo ambiental, Ecología y Biomédicas. Los trabajos recibidos son evaluados por árbitros según criterios internacionales de calidad, creatividad, originalidad y contribución al conocimiento.

The Revista Peruana de Biología is published in April, August and December, the aims is to disseminate the results of original research in Biodiversity, Biotechnology, Environmental management, Ecology and Biomedical areas. Papers in Spanish or English are peer-reviewed using international criteria of quality, creativity, originality and the knowledge contribution.

Revista Peruana de Biología Suscripción anual, costo incluye envío.

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PAUTAS PARA LA PRESENTACIÓN DE LOS ARTÍCULOS EN LA REVISTA PERUANA DE BIOLOGÍA Enero 2009

1. La Revista Peruana de Biología es una publicación científica arbitrada y es editada por el Instituto de Investigaciones de Ciencias Biológicas Antonio Raimondi, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima, Perú. Tiene una periodicidad semestral y los números aparecen en agosto y diciembre, tanto en su versión impresa como Online.

2. La Revista Peruana de Biología recibe artículos completos, originales e inéditos en los temas de biodiversidad, biotecnología, ecología, manejo ambiental y biomedicina, elaborados según las normas indicadas en las presentes pautas.

3. Los artículos pueden ser presentados en idioma inglés o castellano.

4. Los artículos serán evaluados por árbitros según criterios internacionales de calidad, creatividad, originalidad y contribución al conocimiento. El artículo es aceptado luego del proceso de revisión por árbitros y las modificaciones indicadas. El artículo aceptado será editado y una prueba enviada al autor para la aceptación y consentimiento de publicación.

5. El artículo deberá ser presentado acompañado de una carta dirigida al Editor Jefe, firmada por el responsable del trabajo con quien se tendrá comunicación, indicando además el carácter inédito, original y completo del artículo presentado y su disposición para que sea revisado y editado.

6. El artículo puede ser enviado por correo común; en este caso por triplicado y además los archivos digitales apropiados. El artículo comprende el texto, con las páginas numeradas correlativamente. Las ilustraciones, en hojas aparte, comprenden las tablas y figuras.

7. El artículo también puede ser enviado por email al Editor Jefe. Los archivos deben ser enviados de acuerdo a las pautas indicadas en el presente documento.

8. El texto del artículo debe ser escrito en tipo Courier 12 puntos, doble espacio, en A4. En general todos los artículos deben de tener: Título (en inglés y castellano), nombre y apellido de los autores, institución de los autores, dirección postal y correo electrónico de los autores, Resumen no mayor de 250 palabras (en inglés y castellano), 5 palabras clave (en inglés y castellano).

9. El título no debe de exceder de 20 palabras y debe expresar el contenido real del trabajo, si incluye un nombre genérico o específico se indicarán los taxa de referencia.

10. Los Agradecimientos deben dedicarse solamente a las personas e instituciones que colaboraron directamente en la realización del trabajo.

11. La Revista cuenta con las siguientes secciones: a. Trabajos originales. Son artículos primarios, inéditos que exponen los resultados de trabajos de investigación y constituyen aportes al conocimiento. Deben contener las siguientes partes: Título, autores, Resumen (en inglés y castellano), palabras clave (en inglés y castellano), Introducción, Material y métodos, Resultados, Discusión, Agradecimientos y Literatura citada. Todo el artículo debe tener un texto promedio de 20 páginas, las ilustraciones deben ser sólo las necesarias para una mejor exposición de los resultados. b. Notas científicas. Son artículos primarios, reportes de resultados cuya información es de interés para la comunidad científica.

La extensión del texto no será mayor de 8 páginas. Esta sección debe tener las siguientes partes: Título, autores, Resumen (en inglés y castellano), palabras clave (en inglés y castellano), cuerpo de la Nota, Agradecimientos y Literatura citada. c. Artículos de Revisión. Son artículos primarios, en esta sección se incluyen trabajos que constituyen una exhaustiva revisión del tema de investigación del autor, se incluyen aquí tesis, revisiones taxonómicas y recapitulaciones. Deben contar las siguientes partes: Título, autores, Resumen (en inglés y castellano), palabras clave (en inglés y castellano), Introducción, cuerpo de la revisión, Agradecimientos y Literatura citada. Todo el artículo debe tener un texto promedio de 35 páginas. Las ilustraciones deben ser sólo las necesarias para una mejor exposición de los resultados. d. Comentarios. Son artículos donde se discute y exponen temas o conceptos de interés para la comunidad científica. Se incluyen aquí ensayos de opinión y monografías. Deben contar con las siguientes partes: Título, autores, cuerpo del comentario, y Literatura Citada. Todo el artículo debe tener un texto promedio de 10 páginas. e. Comentarios de Libros. Son artículos que comentan recientes publicaciones de interés para la comunidad científica.

Puede solicitarse al Comité Editor la elaboración de un comentario enviando dos copias del libro a la dirección postal de la Revista Peruana de Biología.

12. Cuando el artículo exponga sobre experimentos con humanos y animales, los procedimientos deben de ceñirse a la Declaración de Helsinki de 1975 y a las leyes peruanas vigentes (Ley 27265). Deben ser presentadas las declaraciones pertinentes y mencionadas en el texto.

13. Cuando el artículo exponga sobre nuevas especies, nuevos registros, ampliaciones biogeográficas o inventarios taxonómicos debe indicarse el depósito de los ejemplares en un centro de referencia taxonómico.

14. Cuando los especímenes hallan sido colectados en áreas protegidas, debe de indicarse los respectivos permisos.

15. Los nombres científicos del género y especie irán en cursivas. La primera vez que se cita un organismo deberá hacerse con su nombre científico completo (género, especie y autor); posteriormente podrá citarse solamente la inicial del nombre genérico y el nombre específico completo.

16. Deben usarse los símbolos de las unidades del Sistema Internacional de Medidas. Si fuera necesario agregar medidas en otros sistemas, las abreviaturas correspondientes deben ser definidas en el texto. Decimales con coma, no punto (ejemplo correcto: 0,5; incorrecto: 0.5).

17. Las citas en el texto deben incluir el apellido del autor y año (ejemplo: (Carrillo 1988) o « ... de acuerdo a Sánchez (1976) …» o (Chávez y Castro 1998, Rios 1999, Piedra 2001)). Si hay varios trabajos de un autor en un mismo año, se citará con una letra en secuencia adosada al año (ejemplo: Castro 1952a). Cuando hay más de dos autores se citará al primer autor y se colocará et al.

(Ejemplo: (Smith et al. 1981) o «según Smith et al. (1981)»).

Rev. peru. biol. 17(2): 000- 000 (August 2010)

(Continúa....)

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18. La Literatura citada incluirá todas las referencias citadas en el texto dispuestas solamente en orden alfabético y sin numeración.

La cita se inicia con el apellido del primer autor a continuación, sin coma, las iniciales del nombre con puntos y sin espacio. El segundo y tercer autor deben de tener las iniciales de los nombre y a continuación el apellido. El último autor se diferenciara por que le antecede el símbolo &. Si hubiesen más de tres autores pueden ser indicados con la abreviatura et al. En la literatura citada solamente se usa letra tipo normal, no itálica, no versalita. Ejemplos: a. Montgomery G.G., R.C. Best & M. Yamakoshi. 1981. A radio-tracking study of the American manatee Trichechus inunguis (Mammalia: Sirenia). Biotropica 13: 81 -85. b. Buhrnheim C.M. & L.R. Malabarba. 2006. Redescription of the type species of Odontostilbe Cope, 1870 (Teleostei: Characidae: Cheirodontinae), and description of three new species from the Amazon basin. Neotrop. ichthyol. 4 (2): 167-196. c. Nogueira R.M.R., M.P. Miagostovich, H. G. Schatzmayr, et al. 1995. Dengue type 2 outbreak in the south of the State of Bahia, Brazil: laboratorial and epidemiological studies. Rev. Inst. Med. trop. S. Paulo 37 (6): 507-510. d. McLachlan A. & A.C Brown. 2006. The Ecology of Sandy Shores. Elsevier Science & Technology Books. 373pp. e. Crawford D.J. 1983. Phylogenetic and systematic inferences from electrophoretic studies. In: S.D. Tanksley and T.J. Orton, eds.

Isozymes in plant genetics and breeding, Part A. Elsevier, Amsterdam. Pp. 257-287. f. Pianka E.R. 1978. Evolutionary ecology. 2nd edn. New York: Harper & Row. g. Carroll S.B. 2005. Evolution at Two Levels: On Genes and Form. PLoS Biol 3(7): e245. <http://biology. plosjournals.org/ archive/1545-7885/3/7/pdf /10.1371_journal.pbio.0030245-S.pdf >. Acceso 31/07/2005. h. Food and Drug Administrations (FDA). 2001. Fish and Fishery Products Hazards and Controls Guidance. Third Edition June 2001. <http://www.cfsan.fda.gov/~comm/haccp4.html> (acceso 24/12/07). i. CONAM. 2005. (en línea). Informe nacional del estado del ambiente 2001. <http://www.conam.gob.pe /sinia/INEA2001. shtml>. Acceso 31/07/2005. j. IMARPE. 2002. (en línea). Segundo informe del BIC José Olaya Balandra. Paita – Salaverry. 24 febrero- 05 Marzo 2002. <http:// www.imarpe.gob.pe /imarpe/informeolaya02-032002.php>. Acceso 01/07/2005. k. Solari S.A. 2002. Sistemática de Thylamys (mammalia: didelphimorphia: marmosidae). Un estudio de las poblaciones asignadas a Thylamys elegans en Perú. Tesis, Magíster en Zoología, mención Sistemática y Evolución. Facultad de Ciencias Biológicas Universidad Nacional Mayor de San Marcos. <http://www.cybertesis.edu.pe/sisbib/2002/solari_ts /html/indexframes.html>.

Acceso 31/07/2005 19. Las citas de artículos en prensa deben incluir el volumen, el año y el nombre de la revista donde saldrán publicados; de lo contrario deberán ser omitidos.

20. Deben evitarse las citas a resúmenes de eventos académicos (congresos y otros) y las comunicaciones personales.

21. Las Figuras (mapas, esquemas, diagramas, dibujos, gráficos, fotos, etc.) serán numeradas correlativamente con números arábigos; de igual manera las Tablas. Las leyendas de las figuras deben presentarse en hoja separada del texto y deben ser suficientemente explicativas. Cada tabla debe llevar un título descriptivo en la parte superior.

22. Cuando el trabajo es enviado por correo postal, las figuras serán presentadas en papel Canson y con tinta china, en un tamaño A4, montados sobre cartulina blanca. Los dibujos y fotos de estructuras y organismos deben llevar una escala gráfica para facilitar la determinación del aumento. Los mapas deben llevar las respectivas coordenadas. Las fotografías deben tener 15x10 cm de tamaño como mínimo, en papel liso, con amplio espectro de tonos y buen contraste, montados sobre una cartulina blanca A4. Costos por fotografías a color deberán ser asumidos por el autor.

23. Si las figuras fuesen escaneadas, deben guardarse en un archivo TIFF, tamaño natural, 600 dpi. Las gráficas de origen electrónico deben de enviarse en formato nativo editable (achivo.xls, archivo.wmf, archivo.svg, archivo.eps). Los mapas en formatos SHP. Fotos de cámaras digitales en formato JPGE mayor a 3Mpixel. Otros archivos independientes en formato TIFF, BMP, Ai, PSD. Costos por ilustraciones a color serán asumidos por el autor.

24. Los archivos deben presentarse por separado, esto es, un archivo con el texto y leyendas en formato MS-Word. Otro archivo para las tablas en MS-Excel o como tablas en MS-Word. Otros archivos en formatos nativos, no como imágenes insertadas en otros archivos (por ejemplo no enviar imágenes pegadas en una hoja de MS-Word o Excel).

25. Sólo se aceptan fotos e imágenes digitales de alta calidad.

26. El material enviado no será devuelto, por lo que los autores deben tomar sus precauciones.

27. Una prueba del trabajo revisado, editado y diagramado además del costo por impresión será enviado al autor para su aprobación.

28. El autor principal podrá solicitar cuatro ejemplares de la revista. Un número de separatas adicional podrá ser solicitado antes de la impresión teniendo en cuenta los costos respectivos.

Comité Editor Email: editor.revperubiol@gmail.com Correo postal: Leonardo Romero (Editor) Revista Peruana de Biología UNMSM-FCB Apartado 11-0058 Lima 11 Perú

400

(continúación...)

Notas científicas 373 Notes on the ecology of a relict population of the Lomas´s Lizard Microlophus tigris (Tropiduridae: Sauria) in Las Leyendas Zoological Park,

(Lima, Peru)

Notas sobre la ecología de una población relicto de la lagartija de las Lomas Microlophus tigris (Tropiduridae: Sauria)en el Parque Zoológico

Las Leyendas (Lima, Perú)

Juan Carlos Jordán Arizmendi 377 Notes on the ecology of Phyllodactylus reissi (Phyllodactylidae: Sauria) in Parque Nacional Cerros de Amotape (Tumbes, Peru)

Notas sobre la ecología de Phyllodactylus reissi (Phyllodactylidae: Sauria) en el Parque Nacional Cerros de Amotape (Tumbes, Perú)

Juan Carlos Jordán Arizmendi 381 Extensión de la distribución del rango migratorio de la “Dormilona de Frente Negra”, Muscisaxicola frontalis (Aves: Tyrannidae) en el Perú

Extension of the distribution of the migratory range of the “Black-fronted Ground Tyrant” Muscisaxicola frontalis (Aves: Tyrannidae) in Peru

Renzo Alcocer, Grace P. Servat y Wilfredo Mendoza 383 Algunos acantocéfalos de la familia Oligacanthorhynchidae del Perú

Some acanthocephalans of the family Oligacanthorhynchidae from Peru

Luis A. Gomez-Puerta 387 Primer registro de Crepidobothrium gerrardii (Cestoda: Proteocephalidae) en el Perú

First record of Crepidobothrium gerrardii (Cestoda: Proteocephalidae) in Peru

Luis A. Gomez-Puerta

Comentarios

389 Efecto de los metales sobre microcrustáceos de agua dulce. Avances metodológicos y potencialidad de cladóceros y copépodos como organismos test

Effects of metals on freshwater microcrustaceans. Metodological advances and potentiality of cladocerans and copepods as test organisms

María Florencia Gutierrez y Ana María Gagneten

Revista Peruana de Biología Rev. peru. biol. ISSN 1561-0837

Volumen 18

Diciembre, 2011

Número 3

Contenido Trabajos originales 271 Thalictrum peruvianum (Ranunculaceae), una especie nueva de Lima, Perú

Thalictrum peruvianum (Ranunculaceae), a new species from Lima, Peru

Huber Trinidad, Asunción Cano y Blanca León 275 Vochysia awasensis (Vochysiaceae), nueva especie de los Bosques Montanos del Chocó ecuatoriano

Vochysia awasensis (Vochysiaceae), new species from the Mountain Forests from the Ecuatorian Chocó

Isau Huamantupa Chuquimaco 279 Detailed assessment of the distribution of Astrocaryum sect. Huicungo (Arecaceae) in Peru

Evaluación detallada de la distribución de Astrocaryum sec. Huicungo (Arecaceae) en Perú

Francis Kahn, Betty Millán, Jean-Christophe Pintaud and Miguel Machahua 283 Riqueza, uso y origen de plantas medicinales expendidas en los mercados de la ciudad del Cusco

Richness, use and origin of expended medicinal plants in the markets of the Cusco City

Isau Huamantupa, Magaly Cuba, Rosa Urrunaga, Elías Paz, Nelson Ananya, Myrthia Callalli, Nadir Pallqui y Hozmary Coasaca 293 Desarrollo reproductivo del “amancay” Ismene amancaes (Amaryllidaceae) en su ambiente natural

Reproductive development of “amancay” Ismene amancaes (Amaryllidaceae) in its natural environment

Mery L. Suni, Edisson Pascual y Enoc Jara 299 Nueva especie de Mediorhynchus (Acanthocephala, Gigantorhynchidae) en Turdus chiguanco (Turdidae) de Junín, Perú

New species of Mediorhynchus (Acanthocephala, Gigantorhynchidae) in Turdus chiguanco (Turdidae) from Junín, Peru

Rocío Moya, Rosa Martínez y Manuel Tantaleán 303 Aspectos estructurales y cuantitativos del ovario de Fulica armillata (Aves: Rallidae)

Structural and cuantitative aspects of the ovary of the Fulica armillata (Aves: Rallidae)

Mirian Bulfon y Noemí Bee de Speroni 311 Análisis de las vocalizaciones del murciélago longirrostro peruano Platalina genovensium Thomas, 1928 (Chiroptera: Phyllostomidae)

Analysis of vocalizations of Long-snouted Bat Platalina genovensium Thomas, 1928 (Chiroptera: Phyllostomidae)

Juan A. Malo de Molina, Sandra Velazco, Víctor Pacheco y Juan Carlos Robledo 319 Tres nuevos registros de asteroideos (Echinodermata: Asteroidea) de Perú

Three new records of asteroids (Echinodermata: Asteroidea) from Peru

Yuri Hooker y Francisco A. Solís-Marín 325 Estudio de la actividad fermentativa de Hansenula anomala y producción de compuestos químicos de importancia sensorial

Study of the fermentative activity of Hansenula anomala and production of chemical compounds of sensory importance

Waldir Estela Escalante, Mojmír Rychtera, Karel Melzoch, Elena Quillama Polo y Beatriz Hatta Sakoda 335 Inmunogenicidad del veneno de Bothrops atrox (Ophidia: Viperidae) y su evaluación por métodos inmunoenzimáticos

Immunogenicity of Bothrops atrox (Ophidia: Viperidae) venom and its evaluation by immunoenzymatic methods

Gustavo A. Sandoval, Julio Mendoza, William Roldán, Yrma Espinoza, Hilda Solis y Armando Yarlequé 343 Propagación in vitro de Carica papaya var. PTM-331 a partir de meristemos apicales

In vitro propagation of Carica papaya var. PTM-331 from apical meristem

Reynaldo Solis L., Julio Olivera S. y Rafael S. La Rosa L. 349 Diagnóstico e identificación rápidos por PCR de Yersinia ruckeri aislada de Oncorhynchus mykiss procedentes de Canta, Lima, Perú

Rapid diagnosis and identification by PCR of Yersinia ruckeri isolated of Oncorhynchus mykiss from Canta, Lima, Peru

Susana Sirvas-Cornejo, Claudia Cecilia Sánchez-Robinet y César Peña-Domínguez 355 Efecto de la adición de materia orgánica sobre la dinámica poblacional bacteriana del suelo en cultivos de papa y maíz

Effect of addition of organic matter on bacterial population dynamics of soil in potato and corn crops

David García Ventocilla, Gloria Mamani Gamarra, Nicolás Román Cabello, Luis Suárez Salas, Ana Contreras Marín y Julio Malca Jauregui 361 Optimización de los medios de propagación y enraizamiento in vitro de las variedades “criollas” de vid para elaborar pisco

Optimization of media for in vitro propagation and rooting of creole grapevine varieties utilized for pisco making

Eugenio González, Diego Pignataro, Gisella Orjeda, Wilfredo L. Gonzáles y Daniel Clark 367 Colonización intraluminar testicular y diferenciación de la masa celular interna en ratones (Mus musculus)

Intraluminar testicular colonization and differentiation of the inner cell mass in mice (Mus Musculus)

Láyonal Acosta, Víctor Núñez, Jose Pino y Betty Shiga

(Continúa...)