Fijación biológica del nitrógeno by ele silva

la fijación biológica del nitrógeno atmosférico en condiciones tropicales

capítulo 1. la fijación biológica del nitrógeno atmosférico como uno de los pilares básicos de la agroecología

la fijación biológica del nitrógeno atmosférico en condiciones tropicales

rafael martínez viera marisol lópez bernardo dibut álvarez carmen parra zambrano janet rodríguez sánchez

HUGO CHÁVEZ FRÍAS

capítulo 1. la fijación biológica del nitrógeno atmosférico

como uno de los pilares básicos de la agroecología PRESIDENTE DE LA REPÚBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA

ELÍAS JAUA MILANO MINISTRO DEL PODER POPULAR PARA LA AGRICULTURA Y TIERRAS ÁNGELA BOLÍVAR

SERVICIO AUTÓNOMO DE SANIDAD AGOPECUARIA

la fijación biológica del nitrógeno atmosférico en condiciones tropicales

Contenido

Capítulo 1

Presentación Introducción

9 11

La fijación biológica de nitrógeno atmosférico como uno de los pilares básicos de la agroecología

La Revolución Verde y su situación actual Conceptos agroecológicos Importancia de los biofertilizantes dentro de la Agroecología Importancia de los biofertilizantes basados en bacterias fijadoras del N2 atmosférico Capítulo 2

Papel de la rizosfera en la efectividadde los biofertilizantes microbianos 25 Rizosfera y ambiente rizosférico Características de la rizosfera Influencia de las secreciones de las raíces sobre los microorganismos Quimiotaxismo Diferencias entre el efecto de las condiciones de clima templado y tropical sobre las interacciones planta-microorganismos en la zona rizosférica

Capítulo 3

13 17 20

Generalidades sobre la fijacion biológica del nitrógeno atmosférico Importancia del Nitrógeno La fijación de N2 por métodos industriales La fijación biológica del N2 Resumen histórico de los estudios sobre fijación biológica del N2 Mecanismo de la fijación biológica de N2: la nitrogenasa Distribución de los sistemas fijadores Organismos fijadores de N2 más utilizados como biofertilizantes

25 26 30 31

33 37 37 38 39 40 44 46 49

contenido

6 Influencia de los factores ambientales sobre la fijación biológica de N2 Importancia del Fósforo para la fijación de N2 Métodos para medir la fijación de nitrógeno Importancia económica de la aplicación de los biofertilizantes a base de bacterias fijadoras de N2 Capítulo 4

Estimulación del desarrollo de las plantas por las bacterias fijadoras de nitrógeno atmosférico Sustancias reguladoras del crecimiento vegetal Mecanismos de estimulación del crecimiento por parte de las bacterias fijadoras de Nitrógeno Síntesis de auxinas por las bacterias fijadoras Síntesis de giberelinas por las bacterias fijadoras Síntesis de citoquininas por las bacterias fijadoras Sustancias activas sintetizadas por Azotobacter chroococcum

Capítulo 5

La fijación simbiótica del nitrógeno Importancia de la fijación simbiótica Establecimiento de la simbiosis bacterias fijadoras-leguminosas Características de los nódulos Relaciones entre los nódulos y la capacidad de fijación de N2 Clasificación actual de las bacterias que forman nódulos en las plantas leguminosas Factores que influyen en el establecimiento de la simbiosis Cálculo de los beneficios aportados al suelo por la fijación simbiótica de N2 atmosférico Asociación de Rhizobium con cereales Fijación simbiótica en plantas no leguminosas

Capítulo 6

La fijación asociativa de nitrógeno

51 52 55 56 59 59 61 63 65 66 67 71 71 73 76 78 80 82 86 88 90 95

Mecanismos de protección de la nitrogenasa en la fijación aeróbica 95 Microorganismos capaces de fijar N2 en forma asociativa 97

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7 Factores ambientales que afectan la fijación asociativa de N2 Las bacterias del género Azotobacter Las bacterias del género Azospirillum La bacteria endófita Gluconacetobacter diazotrophicus La fijación de N2 en la filosfera

Capítulo 7

Preparación y aplicación de inoculantes a base de bacterias fijadoras de nitrógeno geno atmosf atmosférico Método de selección de cepas Características de los portadores Control de calidad de los biopreparados Biofertilizantes mixtos utilizando bacterias fijadoras de N2 Determinación del efecto antagonista entre las especies bacterianas aspirantes a ser utilizadas en un producto mixto Métodos de inoculación de los biofertilizantes a base de bacterias fijadoras de Nitrógeno atmosférico

98 100 110 113 116 119 120 121 123 126 132 133

Bibliografía

137

Índice de tablas Índice de figuras

167 171

contenido

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Presentación Estamos en momento de lucha, pero también de aprendizaje. No podemos negar que la cuestión ambiental ha sido no solo una forma más de expresión de la irracional voracidad capitalista, sino también un asunto largamente postergado por los movimientos en lucha contra el capitalismo globalizado. No se trata de asumir una culpa. Los procesos y las banderas de la resistencia son también determinados por las circunstancias históricas. Para los que entregamos nuestros más añorados años a la causa de la revolución, circunstancias como las dictaduras sureñas, los procesos emancipatorios en Centroamérica, las guerrillas insurgentes de los países andinos, la represión de nuestras democracias de fachada y las múltiples formas de la dominación y la explotación del hombre no nos permitían desviar nuestros esfuerzos de la cuestión netamente humana. Sin embargo, no por esto somos menos responsables. Con el advenimiento de la “triste noche neoliberal”, precipitada por la desaparición del bloque socialista, el movimiento mundial por la transformación, en todos sus niveles, tuvo que replegarse para rearticularse. Hay que admitirlo, a pesar de nuestras críticas y nuestros más pesimistas pronósticos, la contrarrevolución conservadora (como algunos la han llamado) nos sorprendió y por un tiempo nos abatió. Sin embargo, pronto nos dimos cuenta de la más irrevocable de las verdades, nuestra causa es una causa invencible. En Venezuela el despertar vino, inimaginablemente, de los substratos de la sociedad. Los marginados despertaron para conmover de un sacudón las bases del sistema de dominación y marcarlo con todas las gritas que causarían su posterior desplome, y con él, la apertura de un proceso de emancipación que bien podríamos asumir como continental. En el mundo, la historia nuevamente comenzó a correr, por todas partes reaparecieron las organizaciones ciudadanas en demanda de un mundo mejor y distinto. Organizaciones políticas, sindicales y movimientos sociales levantaron nuevamente las banderas con las más radicales consignas. Y así poco a poco nos hemos encontrado con un mundo que por un lado globaliza la injusticia y por el otro, en conflicto con esta, la esperanza. Pero en esta marcha por la equidad y la justicia mundial ahora nos acompañaban nuevos actores y nuevas causas. Juntos con los partidos, los sindicatos, y los movimientos

presentación

10 populares, aparecieron las demandas de otros movimientos. Entre ellos el movimiento mundial por el desarrollo sostenible y la defensa del ambiente. Al igual que con otros asuntos, hemos tenido que aprender que no podemos supeditar la responsabilidad ética que tenemos con el medio ambiente a la erradicación total del hambre y la explotación humana. De hecho, hemos tenido que darnos cuenta de que estos no son asuntos independientes, de que el hambre y la miseria están estrechamente vinculadas a los mecanismos cada vez más ecocidas de aprovechamiento de los recursos naturales. De la misma forma, nos hemos dado cuenta de que la soberanía tecnológica, parte fundamental de la soberanía nacional va unida a la reivindicación de nuestras potencialidades naturales y de nuestras técnicas ancestrales de aprovechamiento de los recursos que nos brinda la madre tierra. Estas, como materia prima del desarrollo de nuevos conocimientos generados con criterios ecológicos, constituyen un factor determinante en el proceso de descolonizaión de nuestras formas de producir y reproducir la vida. Todo este aprendizaje nos impulsa hoy a producir ciencia liberadora. Conocimientos científicamente adquiridos, como la agroecología, cuyos principios promueven la conservación y preservación de todos los componentes de los agroecosistemas, iniciándose así la promoción, producción y uso de tecnologías como la de los biofertilizantes. En este contexto se inscribe la iniciativa de publicación de este libro, “La fijación biológica del nitrógeno atmosférico en condiciones tropicales”, que constituye un orgullo para el Ministerio del Poder Popular para la Agricultura y Tierra, en tanto que representa no solo la emancipación tecnológica de nuestros pueblos, sino también la dignidad de científicos cubanos y venezolanos que pese a las dificultades han sumado esfuerzos par hacerlo posible. Dar a conocer, a través de este didáctico texto, los procesos naturales de fijación biológica del nitrógeno atmosférico, y su importantísimo rol en la activación de los sistemas agrícolas sostenibles, así como los beneficios ambientales derivados del mismo, es un acto de desprendimiento y compromiso que agradecemos infinitamente; vista la trascendencia y riqueza del tema descrito, y siguiendo los lineamientos presidenciales de tercer motor constituyente “Moral y Luces” es más que un deber, una necesidad, proporcionar al pueblo venezolano esta herramienta que los autores nos ofrecen con la humildad que les otorga su propia sabiduría y conciencia planetaria. Elías Jaua Milano

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Introducción

En las últimas décadas se han logrado grandes progresos en el vasto dominio de las Ciencias Biológicas. La investigación multidisciplinaria ha favorecido el desarrollo de la Biología y la Bioquímica y ha aumentado el campo de aplicación de estas ciencias. Al mismo tiempo, muchas búsquedas están originadas por el deseo de ver al hombre y a su entorno ocupando un primer plano, buscando la forma de mejorar la calidad de vida del primero y de sanear y preservar al segundo. Desde el punto de vista agrícola, se hace cada vez más urgente la necesidad de producir los más variados alimentos con la utilización de métodos que exijan un consumo menor de energía y que no contaminen los agroecosistemas. Ya los conceptos que rigieron la Revolución Verde se han ido sustituyendo por los que abogan por una Agricultura Ecológica, capaz de aprovechar el desarrollo tecnológico, pero que utiliza en lo fundamental elementos naturales, lo cual puede hacerse hoy con notable éxito gracias a los progresos de la Agrobiología. Entre los temas biológicos que se han estudiado con más profundidad se encuentran los relacionados con los procesos microbiológicos que influyen sobre la nutrición y el desarrollo de las plantas, cuyo conocimiento ha permitido la extensa utilización que hoy tienen en muchos países los biofertilizantes y bioestimuladores. El más estudiado y conocido de estos procesos es la fijación biológica del N2 atmosférico, que aporta a las plantas cantidades importantes de Nitrógeno, el principal elemento nutritivo para los cultivos, lo cual permite racionalizar las aplicaciones de fertilizantes inorgánicos y reducir de una forma marcada los niveles de contaminación de los agroecosistemas. La acción de los microorganismos fijadores se realiza en todos los componentes de la fitosfera, nombre con el que se conoce el ecosistema total suelo-planta-atmósfera, es decir, el ambiente que rodea más estrechamente a las plantas. Por esta razón, puede haber también fijación de Nitrógeno atmosférico en la filosfera, zona que rodea la parte aérea de la planta y que está en contacto con el follaje y la atmósfera, sometida a la acción reguladora de ambas. Pero la mayor actividad ocurre en la rizosfera, zona que rodea a la planta y que está en contacto con las raíces y el suelo.

12 De lo expuesto se deduce que existe una estrecha interrelación entre el suelo, la planta y los microorganismos, por lo que se hace necesario conocer como influyen cada uno de estos factores sobre los demás y en que forma las variaciones que ocurren en cada uno de ellos modifican el comportamiento general de la asociación. Una vez que se haya adquirido un conocimiento profundo del sistema en su conjunto, será posible sacar los mayores beneficios del uso de los biofertilizantes, representados por mayores aumentos de los rendimientos y la calidad de las cosechas, lo que se consigue con aplicaciones mínimas de fertilizantes inorgánicos y nuevos esquemas de fertilización orgánica. En el presente libro se ofrece una visión teórica de los distintos procesos fijadores, y se muestran los beneficios que pueden obtenerse en el medio tropical con el uso de los biofertilizantes y bioestimuladores a base de bacterias fijadoras de Nitrógeno atmosférico y de los mejores métodos de aplicación, lo cual permitirá un mayor aprovechamiento del enorme potencial biológico que se encierra en los suelos tropicales, al mismo tiempo que se reducen los problemas económicos y ecológicos derivados de la aplicación indiscriminada de los fertilizantes industriales. En la República Bolivariana de Venezuela, la utilización de estos bioproductos constituye una necesidad para el desarrollo agrícola del país, ya que permite los incrementos de los rendimientos agrícolas por medios más económicos y saludables, al mismo tiempo que generan la creación de empleos en una región determinada. En estos momentos se está desarrollando en Venezuela, con el aporte fundamental del Ministerio de Agricultura y Tierras (MAT), una red de laboratorios que se dedicarán a la fabricación de biofertilizantes y bioestimuladores microbianos para ser utilizados en todas las regiones del país, lo que incluye la fabricación y aplicación de grandes cantidades de bioproductos a base de bacterias fijadoras de forma simbiótica y asociativa. El objetivo principal que anima a los autores es suministrar a los profesionales y técnicos venezolanos los elementos necesarios para que puedan obtener los mayores beneficios de la utilización de las bacterias fijadoras, con lo que se contribuye de una manera destacada a que plasmen en realidad los esfuerzos que hoy se realizan en el país para garantizar las necesidades alimentarias de la población y preservar el medio ambiente, al mismo tiempo que se ofrece una herramienta para el manejo alternativo y económico de los agroecosistemas sin afectar los rendimientos.

introducción

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Capítulo 1

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La Revolución Verde y su situación actual

El éxito de la Revolución Industrial provocó la extensión del modelo triunfante a todos los sectores de la economía, generalizándose en su más alto grado en la Agricultura al finalizar la II Guerra Mundial con el nombre de Revolución Verde. Para alinear a la producción agrícola sobre el modelo industrial fue necesario lograr su estandarización; de esta manera, para facilitar la transformación de los productos agrícolas y simplificar los circuitos comerciales se redujo el número de especies y variedades utilizadas y se aplicó el modelo de separación espacial y temporal de las secuencias de producción. Así, las semillas no se obtienen en los hábitats donde las plantas son cultivadas, sino que son creadas algunas zonas especializadas para producirlas y después se comercializan en las más diversas regiones, lo que compromete las posibilidades de adaptación. Aplicando siempre el modelo industrial, se concentran las producciones agrícolas para rentabilizar el capital. Surge el monocultivo en áreas donde había policultivo y se introducen cultivos repetitivos que empobrecen la microfauna y microflora del suelo y facilitan la multiplicación de plagas y organismos patógenos, que disponen de verdaderos caldos de cultivo. La extensión de superficies uniformes conduce al empleo de máquinas cada vez más pesadas que alteran las propiedades físicas de los suelos (Levins, 1973). Independientemente de los éxitos productivos, y visualizado la Revolución Verde desde el punto de vista social, puede decirse que se marginó a gran parte de la población rural en todo el mundo, ya que los beneficios estuvieron centrados en los grupos ricos, los únicos con posibilidades de aplicar las costosas tecnologías intensivas. Fueron destruidas muchas formas de acceso a la tierra y a los recursos tales como la aparcería, la contratación de mano de obra y la utilización de las aguas de riego y de tierras de pas-

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toreo. Se redujo la diversidad de estrategias de subsistencia disponibles para las familias rurales y aumentó su dependencia del gran empresario agrícola. Por otra parte, las consecuencias de la quimización han sido nefastas para el ambiente por la elevada contaminación causada por el uso irracional de fertilizantes y plaguicidas, que causa graves daños en la salud del ser humano y de los animales. Sin tomar en consideración a los plaguicidas químicos, los más contaminantes, por no estar relacionados con el tema que nos ocupa, el impacto ambiental causado por el uso excesivo de fertilizantes puede resumirse de la siguiente manera, tomando como ejemplo el fertilizante nitrogenado: 1. La fabricación de fertilizantes produce emisiones de CO2 y de NO2 a la atmósfera, lo cual contribuye a incrementar los problemas de la capa de ozono. 2. La aplicación en el campo da lugar a lixiviación de nitratos y a emisiones de N2O y de NH3, especialmente a partir de urea, con la consiguiente contaminación de todos los componentes del agroecosistema. La abundancia de compuestos nitrogenados en los mantos acuíferos como consecuencia de la lixiviación hace que en todos los reservorios donde van a desembocar estas corrientes subterráneas se produzca el proceso llamado eutroficación, que consiste en el crecimiento anormal de microorganismos que agotan el oxígeno disuelto en el agua y producen la muerte masiva de los peces. Estos graves problemas de contaminación se han puesto ya de manifiesto en algunos de los ríos más caudalosos del mundo como el Mississipi en Estados Unidos y el Yang Tse en China, en cuyas desembocaduras se aprecia una notable carencia de flora y fauna. Según Altieri y Nicholls (2000), en las aguas afectadas por la eutrificación se estimula el desarrollo de Pfiesteria, un organismo que mata a los peces y es dañino para el ser humano. 3. Son muy numerosos los reportes que indican la presencia de altos niveles de nitratos en los productos agrícolas, lo que constituye una importante fuente de toxicidad para el ser humano y ha obligado a un establecimiento más riguroso del control de los niveles críticos de estos compuestos en las actividades de comercialización de los alimentos. Pero, además de la contaminación, el incremento del uso de los fertilizantes industriales ha estado acompañado por un aumento exponencial en el consumo de formas no

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renovables de energía, las cuales se han convertido en un factor limitante para lograr aumentos de los rendimientos agrícolas. Se necesitan aproximadamente 1.3 t de combustible para fijar 1 t de nitrógeno atmosférico con alta presión y temperatura por el proceso industrial de Haber-Bosch. Los 67 millones de toneladas anuales que se aplicaron en el mundo en 1996 como fertilizante nitrogenado requirieron de 87 millones de toneladas de combustible para su fabricación, lo que correspondió al 1.2 % de todo el combustible consumido en el planeta (Bökman, 1997; Olivares, 2006). Esta insostenibilidad se aumenta si se toma en cuenta que en el año 2020 deben aplicarse 130 millones de toneladas de fertilizante nitrogenado solo para la producción de cereales, de acuerdo con las proyecciones realizadas por Dyson (1996) y Lewis (1996), para cuya fabricación se necesitarán 169 millones de toneladas de petróleo, lo que reduciría a un ritmo alarmante las reservas conocidas en el mundo. Por otra parte, hay que tomar en cuenta la insostenibilidad económica del uso exclusivo de fertilizantes inorgánicos, cuyos elevados precios los hacen inaccesibles para las mayorías campesinas de los países subdesarrollados. Así, en el año 1997, los países desarrollados fabricaron 58.202.000 de fertilizantes nitrogenados, mientras que los subdesarrollados solo fabricaron 11.408.000 t, para una producción mundial de 69.611.000 t. En lo que se refiere a los fertilizantes de todo tipo, el promedio per cápita aplicado en el año 2.000 fue de 145 kg en los países del primer mundo y solo 23 kg en los subdesarrollados, lo que se tradujo en una producción de 927 kg de granos per cápita en el primer grupo de países y 210 kg en el segundo (FAO, 2001). Como un ejemplo ilustrativo de lo que se exige a los países subdesarrollados para incrementar la producción de alimentos con las tecnologías de la Revolución Verde, puede decirse que en el África sub-sahariana, una de las regiones con más hambre en el mundo, hay que aumentar en 400.000 t anuales el consumo de fertilizantes para lograr el modesto aumento de 3% anual en la producción de alimentos sin empobrecer los suelos (FAO, 1995), lo cual es totalmente insostenible. Por otra parte, el aumento del uso de los fertilizantes inorgánico de origen industrial se ha aproximado con gran rapidez al punto en que no se logran incrementos del rendimiento proporcionales a su aplicación; así, en Chile recibió el trigo 62% más fertilizante entre 1985-1990 en comparación con la década anterior, pero los rendimientos au-

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mentaron solo 3.1% (Altieri y Rojas, 1999). En el Estado de Georgia (USA) se reportó que el rendimiento de los cultivos se cuadruplicó entre las décadas del 70 y 80, mientras que las aplicaciones de nitrógeno crecieron 11 veces (Odum, 1989). Un análisis de los rendimientos del arroz en Filipinas, Indonesia y Tailandia mostró que declinaban, a pesar de los incrementos de fertilizante nitrogenado (Pingali y col., 1992). De lo expuesto anteriormente se deduce que la producción industrial de fertilizantes no puede satisfacer las necesidades de una población mundial en creciente aumento, sobre todo cuando el exceso conduce a contaminar el agua de consumo, a la eutrificación de los lagos y a las emisiones de óxido nitroso a la atmósfera, además del incremento considerable de la utilización de fuentes de energía no renovables (Brown, 1994). Según Hetch (1997), el análisis de la Revolución Verde, hecho desde los puntos de vista de diferentes disciplinas, incluyó críticas ecológicas, tecnológicas y sociales y constituyó la base para la profundización de los estudios posteriores sobre Agroecología y para las investigaciones sobre sistemas de labranza. Se ha llegado a reconocer que las tecnologías de la Revolución Verde solo pueden ser aplicadas en áreas limitadas y las nuevas tendencias de la investigación agrícola están dirigidas a resolver los problemas de los campesinos de bajos recursos. Hoy se considera que el camino recorrido por la Revolución Verde en Europa y Estados Unidos está llegando a sus límites. Su alta eficiencia en términos de rendimiento por hectárea ha sido lograda a expensas de la ineficiencia energética y social, y socava el reciclaje de los recursos renovables con la tala indiscriminada de bosques, la contaminación de los mantos acuíferos y la reducción de la biodiversidad. Este modelo destruye su propia base productiva con la erosión, la salinización y la compactación de los suelos, aumenta la vulnerabilidad de las plantas frente a las plagas y enfermedades, intoxica a los trabajadores agrícolas, a los consumidores y a la naturaleza entera y, por último, hasta constituye uno de los principales factores de transformación del clima terrestre. Como se aprecia, los problemas que se van detectando son tantos que surge una situación contradictoria en los países más desarrollados: al mismo tiempo se exaltan las posibilidades de desarrollo de la llamada agricultura “moderna” y, como reacción, aparece un movimiento de agricultura “biológica” o alternativa que se fortalece cada vez

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más. Surgen los nuevos conceptos agroecológicos que han dado origen a la moderna Agricultura Sostenible o Sustentable, junto con la crítica al rumbo del desarrollo agrícola mundial, adornado con los rótulos de “moderno”, “progresivo” y “avanzado”. Estos nuevos conceptos se han extendido entre los países desarrollados y subdesarrollados y, desde el punto de vista del suministro de nutrientes a las plantas, abogan por una combinación de cantidades reducidas de fertilizantes inorgánicos con biofertilizantes y abonos orgánicos. Conceptos agroecológicos

El uso contemporáneo del término Agroecología comenzó en la década de los años 70, pero el conocimiento y la práctica agroecológica son tan antiguos como los orígenes de la Agricultura. La Agroecología incorpora ideas sobre un enfoque de la agricultura más ligado al medio ambiente, es más sensible socialmente y está centrado no solo en la producción, sino también en la sustentabilidad ecológica del sistema de producción. La unidad ecológica principal en la Agroecología está representada por el agroecosistema, que no solo está determinado por los componentes estructurales, bióticos y abióticos, sino también por factores sociales tales como las variaciones de los precios en el mercado o cambios en la tenencia de la tierra, los cuales pueden influir en los sistemas agrícolas de forma tan marcada como la sequía, las plagas o los nutrientes del suelo. Como resultado de la interacción entre las características endógenas (biológicas y ambientales) y los factores exógenos (sociales y económicos) se genera la estructura particular de cada uno de los agroecosistemas. Un sistema agroecológico es muy complejo y está formado por numerosas variables y parámetros. Estos últimos, ya sean constantes, periódicos o erráticos, están determinados externamente al sistema y son de muy difícil control. Las variables están en interacción recíproca continua y pertenecen a distintos campos de las Ciencias Naturales y Sociales; forman una red de interacciones por vínculos directos e indirectos y solamente se pueden aislar provisionalmente para el estudio, pero después hay que unirlos en los modelos para no cometer errores que pueden ser trascendentales. Ejemplos de errores cometidos por no tener en cuenta las interacciones pueden citarse muchos: plaguicidas que han fomentado nuevas plagas, formas de control de las corrientes de agua que aumentan el daño por las inundaciones, o medidas de modernización agraria que han provocado más desigualdades y más hambre.

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Un sistema ecológico agrícola difiere en aspectos fundamentales de un sistema ecológico natural, tanto en su estructura como en su función. Los agroecosistemas son ecosistemas semi-domesticados a los que Odum (1984) les determinó 4 características principales: 1. Requieren fuentes auxiliares de energía, que puede ser humana, animal o combustible, para aumentar la productividad de organismos especí específicos. 2. La biodiversidad puede ser muy reducida en comparación con la de otros ecosistemas. 3. Los animales y plantas que dominan son seleccionados artificialmente y no por selección natural. 4. Los controles del sistema son, en su mayoría, externos y no internos. Este modelo marca un punto de partida interesante para comprender la agricultura desde una perspectiva de los sistemas ecológicos, pero no abarca la diversidad y complejidad de muchos agroecosistemas que se desarrollan en los países más pobres, especialmente tropicales, y no tiene en cuenta las determinantes sociales que tanto influyen en estos países. Las estrategias agrícolas no solo responden a presiones del medio ambiente, a presiones bióticas y del proceso de cultivo, sino que también reflejan estrategias humanas de subsistencia y condiciones económicas (Ellen, 1982). Para complementar las características expresadas por Odum surge la concepción de los agroecosistemas sostenibles o sustentables que, de acuerdo con la definición del Comité Internacional sobre Investigación Agrícola (1988), consiste en “el manejo exitoso de los recursos agrícolas para satisfacer las necesidades humanas, mientras se mantiene la calidad del ambiente y se conservan los recursos naturales”. En 1989, el Consejo Nacional de Investigación de la Academia de Ciencias de los Estados Unidos publicó un significativo reporte sobre “Agricultura Alternativa”, la cual fue definida como “un sistema de producción de alimentos y fibras que aplica tareas de manejo y de información encaminadas a reducir costos, mejorar la eficiencia y mantener niveles de producción mediante prácticas de rotación de cultivos, apropiada integración de cultivos y ganado, utilización de leguminosas fijadoras de Nitrógeno, manejo integrado de plagas, prácticas de conservación, reciclaje de residuos agrícolas como acondicionadores de suelos y utilización de biofertilizantes”.

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El reporte propugnaba la adopción colectiva de estas prácticas por los agricultores norteamericanos, como la mejor alternativa frente al uso intensivo y continuado de plaguicidas y fertilizantes químicos, que habían causado la pérdida de calidad de suelos y aguas y contaminado los alimentos. Los principios básicos que rigen un agroecosistema sustentable son: la conservación de los recursos renovables, la adaptación del cultivo al ambiente y el mantenimiento de un nivel alto de productividad. En este tipo de agricultura, debe ponerse énfasis en la sustentabilidad ecológica a largo plazo más que en la productividad a corto plazo, para lo cual deben cumplirse los siguientes objetivos (Altieri, 1997): –

Reducir el uso de energía y recursos.

–

Emplear métodos de producción que restablezcan los mecanismos que conducen a la estabilidad de la comunidad.

–

Optimizar el reciclaje de materia y nutrientes y asegurar un flujo eficiente de energía.

–

Utilizar al máximo la capacidad multiuso del sistema.

–

Disminuir los costos.

Para lograr estos objetivos hay que desarrollar una estrategia que destaca, en primer lugar, la conservación y el manejo de los recursos agrícolas locales, la participación de los agricultores y la adaptación de tecnologías a las condiciones de la región donde se trabaje. En esta estrategia hay que incluir la conservación y regeneración de los recursos naturales, el manejo de los recursos productivos, la regulación biótica como medida de protección de los cultivos y la reutilización de nutrientes y recursos naturales externos e internos del sistema. Para poder cumplir con efectividad esta estrategia, se hace imprescindible la utilización de los biofertilizantes microbianos. Los conceptos que se han expresado anteriormente han calado muy hondo en las poblaciones de todos los países desarrollados, que han sido los principales impulsores de la Revolución Verde y hoy están convencidos de los graves problemas que se han generado con estos métodos de producción agrícola. Por esta razón, cada año se multiplican los mercados donde se venden exclusivamente productos orgánicos y son mayores las superficies dedicadas a los cultivos agroecológicos en los distintos países. En la Tabla 1 se muestran las superficies de cultivos orgánicos en los países europeos (Hoffman, 2001).

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Importancia de los biofertilizantes dentro de la Agroecología

La sustentabilidad de los sistemas agrícolas a largo plazo debe fomentar el uso y manejo efectivo de los recursos internos de los agroecosistemas. Entre estos recursos, la biota del suelo realiza una serie de funciones que son esenciales para la integridad y productividad de los sistemas agrícolas, por lo que constituye una fracción primordial de la biodiversidad terrestre al contribuir a la descomposición de la materia orgánica, al reciclaje de los nutrientes, a la modificación de la estructura del suelo, a la regulación de la composición atmosférica, al control biológico de plagas y enfermedades y a la degradación de compuestos xenobióticos (Palm et al., 2001). La composición de esta biota puede ser manipulada, casi siempre de forma temporal, para mantener e incrementar la productividad de un suelo. En este sentido, los biofertilizantes y bioestimuladores microbianos representan un componente vital de los sistemas sustentables, ya que constituyen un medio económicamente atractivo y ecológicamente aceptable de reducir los insumos externos y mejorar la cantidad y calidad de los recursos internos mediante la utilización de microorganismos del suelo debidamente seleccionados, capaces de aportar a los cultivos Nitrógeno fijado de la atmósfera, Fósforo transformado a partir del que está fijado en el suelo y sustancias fisiológicamente activas que, al interactuar con la planta, desenca-

Tabla 1

País Alemania Austria España Francia Gran Bretaña Holanda Italia Suecia Suiza Total

Superficie 546.023 287.900 352.164 420.000 472.500 27.820 1.040.373 174.423 95.000 3.416.203

Superficie agrícola dedicada a cultivos orgánicos en distintos países europeos en el año 2001

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denan una mayor activación del metabolismo vegetal (Bauer, 2001; Burdman et al., 2000). Los biofertilizantes y bioestimuladores microbianos pueden definirse como productos a base de microorganismos que viven normalmente en el suelo, aunque en poblaciones bajas, y que, al incrementar sus poblaciones por medio de la inoculación artificial, son capaces de poner a disposición de las plantas, mediante su actividad biológica, una parte importante de los nutrientes que necesitan para su desarrollo, así como de suministrar sustancias hormonales o promotoras del crecimiento. En un sentido amplio, estos términos pueden usarse también para incluir todos los recursos orgánicos necesarios para el desarrollo de las plantas, los cuales son transformados mediante la acción de los microorganismos. La importancia de estos bioproductos radica en su capacidad para suplementar o movilizar nutrientes con un mínimo uso de recursos no renovables; además, tiene la ventaja de que los procesos microbianos son rápidos y los biopreparados pueden aplicarse en pequeñas unidades para solucionar problemas locales especí específicos. A este respecto, se está imponiendo en el mundo el redimensionamiento de las biotecnologías y, entre ellas, los biofertilizantes, con el objetivo de adaptar estas novedosas tecnologías al desarrollo sustentable de las localidades más pobres y necesitadas del planeta, de manera que se ayude a solucionar la problemática productiva del campesino pobre y a lograr que éste adquiera una mayor independencia y seguridad. Los inoculantes microbianos pueden considerarse como biotecnologías “apropiables”, término creado para las herramientas biotecnológicas que contribuyen al desarrollo sustentable por ser técnicamente factibles dentro del nivel científico- técnico de un país y que proveen beneficios tangibles a los destinatarios, son ambientalmente seguras y socioeconómicas y culturalmente aceptables (Izquierdo et al., 1995). También responden a las exigencias de la Agenda 21, firmada por los Jefes de Estado y Gobierno de todos los países del mundo como parte de la Reunión sobre medio Ambiente y Desarrollo, llamada también “Cumbre de la Tierra”, celebrada en Río de Janeiro (Brasil) en 1992, como se deduce de los siguientes acápites del Capítulo 3 de la citada Agenda 21: 3.1 Encontrar sustitutos o mejoras ecológicamente racionales de los procesos de producción que son nocivos para el medio ambiente.

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3.2 Determinar métodos encaminados a reducir a un mínimo la necesidad de insumos químicos sintéticos insostenibles y para utilizar al máximo aquellos productos ecológicamente adecuados, incluidos los naturales. 3.9 Promover la utilización adecuada de los biofertilizantes en todos los programas nacionales de aplicación de fertilizantes. 3.12 Desarrollar nuevas tecnologías que permitan la selección rápida de organismos que puedan tener propiedades biológicamente útiles. 3.16 Elaborar mecanismos para incrementar gradualmente y difundir biotecnologías ecológicamente racionales de gran importancia para el medio ambiente, especialmente a corto plazo, aún cuando estas tecnologías tengan potencial limitado. En general, el uso de los biofertilizantes microbianos en los sistemas productivos es una alternativa viable y de gran importancia para lograr un desarrollo agrícola ecológicamente sustentable, ya que permite una producción de bajo costo, no contamina el ambiente y mantiene la conservación del suelo desde el punto de vista de fertilidad y biodiversidad. A pesar de su inocuidad, el uso masivo de los inoculantes microbianos ha despertado algunas preocupaciones acerca del posible impacto ecológico de la liberación de estos microorganismos en el medio ambiente, en especial cuando ha existido una manipulación genética. La evaluación de dicho posible impacto es muy difícil, debido a limitaciones de tipo técnico que impiden hasta el momento determinar si la alteración de algún parámetro medioambiental como consecuencia del uso de inoculantes puede afectar de forma negativa al equilibrio futuro de los ecosistemas del suelo (Sanjuan et al., 2004). De todas maneras, en las condiciones tropicales de Cuba, y en diversos cultivos, se ha demostrado que las poblaciones de Azotobacter chroococcum, que después de la inoculación alcanzaron niveles de 109 células/g de suelo rizosférico, recuperan su nivel natural (104-105) en un período máximo de 4 meses, según el cultivo. Es decir, que no hay una contaminación a largo plazo, debido al empobrecimiento de las secreciones radiculares por el envejecimiento de las plantas y al antagonismo de otras poblaciones microbianas del suelo (Martínez Viera et al., 2004).

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Importancia de los biofertilizantes basados en bacterias fijadoras del N2 atmosférico

Los primeros estudios que se realizaron acerca de lo que hoy se llama biofertilización estuvieron relacionados con la fijación biológica de Nitrógeno atmosférico y se remontan a la primera mitad del siglo XIX. Esto es muy importante si se toma en consideración que el Nitrógeno es el mayor nutriente que limita el desarrollo de las especies vegetales, siendo superado solamente por la fotosíntesis en lo que respecta a su influencia sobre el desarrollo. A pesar de que este elemento constituye el 70% de la atmósfera, no puede ser utilizado por las plantas, que se ven obligadas a utilizar las formas nitrogenadas combinadas que se encuentran en el suelo, en cantidad insuficiente para soportar cultivos intensivos. La fijación biológica puede contribuir globalmente con más de la mitad del Nitrógeno necesario para el cultivo de las plantas, siempre que se maneje de forma adecuada. Debido a este importante papel, hoy se concibe el manejo efectivo del Nitrógeno que existe en el ambiente como uno de los pilares básicos de la sustentabilidad agrícola. Los resultados de los estudios que se han realizado en los últimos 25 años han revolucionado el conocimiento sobre la fijación biológica del N2 atmosférico y sobre los beneficios que puede suministrar. A pesar de eso, muy pocos de los conocimientos adquiridos están siendo aplicados por los agricultores en la mayor parte de los países subdesarrollados, a pesar de que en las condiciones tropicales existen temperaturas constantemente favorables y hay una alta fijación de Carbono, que alcanza hasta 20 t/ha/año (Debinstein, 1970), lo que garantiza la presencia de altas poblaciones de microorganismos en la zona rizosférica de las plantas. Por los motivos que se han expuesto, los únicos biofertilizantes que son utilizados extensamente en muchos países son los que contienen las bacterias fijadoras de los géneros Rhizobium y Bradyrhizobium, que establecen la fijación simbiótica de N2 en las leguminosas. Pero no se está aprovechando la actividad de los fijadores asociativos ni de los organismos solubilizadores de Fósforo o estimuladores del crecimiento y el rendimiento, que tantos beneficios pueden reportar en las regiones tropicales, donde se encuentran los países más necesitados. Hoy ya se está adquiriendo conciencia de que la aplicación en la práctica agrícola tropical de los conocimientos que hoy existen sobre la fijación biológica de N2 atmosférico

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permite lograr importantes impactos en lo que se refiere a productividad y economía de los cultivos, así como en la reducción de los niveles de contaminación ambiental. Por estas razones, deben elaborarse estrategias encaminadas a lograr la adaptación de las tecnologías existentes a las condiciones agroecológicas de las distintas regiones del país, con la participación de investigadores, docentes, técnicos y estudiantes, cuyos esfuerzos deben coordinarse para que pueda cumplirse este objetivo. Al elaborar estas estrategias, hay que considerar que la fijación de N2 no puede considerarse como una práctica aislada, puesto que la productividad de un cultivo y la productividad a largo plazo de un agroecosistema dependen de múltiples variables, que implica distintos tipos de factores, incluyendo el manejo humano. Por ejemplo, hay que considerar las rotaciones de cultivos o aprovechar las interacciones leguminosasno leguminosas en cultivos simultáneos, de manera que se optimicen los procesos de fijación y sus beneficios para todos los sistemas productivos; es necesario seleccionar cepas eficientes y competitivas frente a organismos que ya están establecidos en el suelo, así como que sean capaces de adaptarse a distintas condiciones de stress; deben utilizarse métodos de inoculación adecuados para las características de cada agroecosistema y para las especies vegetales que quieren cultivarse; las técnicas agronómicas que se apliquen deben facilitar el establecimiento de los inóculos y permitirles desarrollar su actividad fijadora. Además, hay que considerar muchos aspectos más para los que es necesario preparar al agricultor, organizando talleres, demostrando los efectos de estos microorganismos mediante su aplicación en parcelas demostrativas y con un adecuado trabajo de extensión agrícola que permitirá que los agicultores obtengan los mayores beneficios con la utilización de los biopreparados a base de bacterias fijadoras de Nitrógeno atmosférico. En los capítulos siguientes se ha expuesto la situación actual del conocimiento relacionado con la fijación biológica del N2 atmosférico y se incluyen numerosos ejemplos de los beneficios que pueden obtenerse con su utilización, poniéndose de manifiesto la importancia ecológica y económica del uso de los inoculantes a base de bacterias fijadoras. Hoy se están incrementando los niveles de aplicación en muchos países con notable éxito, y los beneficios que se están logrando con la generalización de las nuevas tecnologías se van aproximando con rapidez a las potencialidades que han sido calculadas por distintos autores.

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Capítulo 2

Papel de la rizosfera en la efectividad de los biofertilizantes microbianos

Rizosfera y ambiente rizosférico

La capacidad de los microorganismos para suministrar nutrientes y estimular el crecimiento de las plantas depende de su exitoso establecimiento sobre las raíces (Zuberer, 1990). Por estas razones, se hace obligado explicar el papel que desempeña la rizosfera y su gran importancia para lograr resultados efectivos con la aplicación de los biofertilizantes, sobre todo si se toma en cuenta que la asociación planta-microorganismo es extremadamente compleja, debido a la cantidad de factores que influyen en el establecimiento de la asociación y, por ende, en la mayor o menor efectividad, y hasta en la inefectividad, de la inoculación. La primera definición de rizosfera fue dada por Hiltner en 1904 considerándola como el volumen de suelo que recibe influencia de la raíz. Sus deducciones estaban basadas en los resultados de estudios realizados en macetas y en condiciones de campo, encaminados a conocer los efectos que la utilización de abonos verdes en cultivos de leguminosas tenían sobre la fertilidad del suelo. Sus observaciones demostraron que ocurrían una serie de procesos en la interfase suelo-raíces, entre los que se encontraban los siguientes: 1. Existe un volumen de suelo que está ocupado por raíces y microorganismos. 2. Los materiales exudados por las raíces de distintas leguminosas atraen a organismos diferentes a los que son atraídos por plantas no leguminosas. 3. Cada especie de leguminosa atrae a microorganismos que tienen un beneficio específico para esa especie. A partir del momento en que Hiltner divulgó sus conclusiones se realizaron numerosos estudios que han puesto de manifiesto la diferente influencia de las raíces de distintas especies vegetales sobre la masa del suelo, así como los cambios estacionales en el desarrollo de las raíces (Watson et al., 2000). Por ejemplo, la masa promedio de raí-

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ces oscila entre 0.2 kg/m2 en las plantas cultivadas y 5 kg/m2 en las especies forestales (Jackson et al., 1996). Pero, además, hay una constante renovación de raíces y de sus secreciones, todo lo cual influye sobre las poblaciones de microorganismos que se encuentran en su zona de influencia. En lo que se refiere a la profundidad de las raíces, se ha reportado para las hortalizas entre 0.65 y 1.6 m (Merril et al., 2002) y entre 2 y 10 m para las especies forestales (Carradell et al., 1996). Hoy, tomando como base el conocimiento adquirido en las últimas décadas, el concepto de rizosfera es mucho más amplio y abarca a la zona de interacción única y dinámica entre las raíces de las plantas en general y los microorganismos del suelo, lo que origina la formación de una región especializada que se caracteriza por el aumento de la biomasa microbiana y de la microfauna y de su actividad (Steciow, 2004). Tomando como base estos conocimientos, la rizosfera puede definirse como una zona biológicamente activa del suelo con un alto contenido de Carbono, debido a la continua exudación y rizodeposición de las raíces de las plantas. Esta zona puede extenderse entre 1 mm y más de 1 cm, en dependencia de la especie vegetal y de la humedad y textura del suelo (Pinton et al., 2001). Características de la rizosfera

La zona de la rizosfera es diferente al resto del suelo, debido a los numerosos procesos biológicos, bioquímicos, químicos y físicos que ocurren como consecuencia del crecimiento de las raíces, los movimientos de agua y de nutrientes tomados por ellas, la respiración y la rizodescomposición (Hinsinger et al., 2005). Como consecuencia de estos procesos, las características de esta región son totalmente diferentes de las del resto del suelo: ocurre disminución o aumento de 2 unidades de pH, es 100 veces mayor la actividad reductasa y entre 2 y 8 veces más alta la actividad fosfatasa; además, la concentración de azúcares aumenta 2-3 veces y la de aminoácidos 10; la acumulación de Calcio es 10 veces mayor, ocurriendo precipitación, y 6 veces más alta la de NaCl (Römheld y Neumann, 2006). Lynch (1990) propuso la división de la rizosfera en: 1) endorizosfera, que se extiende desde la superficie de las raíces hasta los primeros estratos celulares internos, y comprende a tejidos conductores como xilema y floema, a la endodermis, la epidermis y el extremo de la raíz; 2) rizoplano, que comprende la superficie externa de las raíces; 3) ectorizosfera, que consiste en el volumen de suelo en contacto inmediato con las

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raíces y contiene los pelos radicales, muscílagos exudados por la planta y los microorganismos y restos de células de la raíz. Se concibe también el término espermosfera para nombrar a la zona que rodea a la semilla en estado de germinación, donde la microflora desarrolla una intensa actividad que afecta el futuro desarrollo de la planta. En los últimos tiempos se considera que en esta fase comienza realmente la actividad rizosférica. Es importante señalar que los microorganismos que colonizan la superficie de la semilla pueden tener una notable importancia en la definición de la población microbiana que posteriormente se establecerá en la rizosfera de una planta determinada. La rizosfera constituye un microambiente complejo y dinámico, cuyo volumen y actividades dependen de las características específicas del suelo y de la especie vegetal, así como de la edad y vigor de esta última. Constituye un ejemplo de equilibrio biológico que se establece gracias a las relaciones de tipo sinérgico o de comensalismo entre la microflora y las raíces de las plantas, y entre ellas y las características inorgánicas del suelo. La causa principal de la influencia de la rizosfera sobre las comunidades que viven en esta zona consiste en la deposición de los compuestos derivados de las raíces, los cuales se clasifican en exudados (procesos pasivos), secreciones (procesos activos), mucigel (mezcla de las raíces con subproductos microbianos) y lisados (contenido de las células que se rompen) (Rovira, 1969). El estudio del sistema rizosférico es complejo, no solo por el alto número de interacciones que en él se dan, sino por la escala espacial y temporal de los elementos y procesos. El ambiente rizosférico es el resultado de las distintas interacciones entre la planta, los microorganismos y el suelo. La planta influye de distintas maneras, en dependencia de su estadio, de su estado nutricional y sanitario y de las características de sus secreciones y residuos; el suelo lo hace de acuerdo con su estructura y su contenido de nutrientes y de agua, y los microorganismos intervienen según el nivel de sus poblaciones, las relaciones entre las distintas especies y el aporte de sustancias nutritivas (Curt y Truelover 1986; Killham, 1999). En las plantas que crecen en el suelo, la rizosfera está caracterizada por gradientes que se establecen de forma radial y longitudinal a lo largo de la raí raíz individual. Estos gradientes pueden existir para los nutrientes minerales, el pH, el potencial redox y los procesos reductores, los exudados radicales y la actividad microbiana (Perret et al., 2000).

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La cantidad y los tipos de sustratos en la rizosfera son sustancialmente distintos de la masa normal del suelo en lo que respecta a las condiciones físico-químicas, como son acidez, humedad, conductividad eléctrica, potencial redox y otros (Cocking, 2003). Estas características, unidas a la liberación de numerosas sustancias orgánicas a través de las secreciones de las raíces, estimulan la llegada y el desarrollo de diferentes poblaciones de bacterias, hongos y actinomicetos y de diversos componentes de la micro y mesofauna (protozoos, nematodos, microartrópodos). Las secreciones están formadas por una gran diversidad de compuestos orgánicos volátiles y solubles de bajo y alto peso molecular, los cuales tienen entre sus funciones la de servir como atrayentes de los organismos citados anteriormente, como reservorio de los nutrimentos necesarios para estos organismos y como fuente de señales genéticas reguladoras. Como consecuencia de todo lo que se ha expresado, en el suelo que se encuentra muy cerca a las raíces aumenta notablemente la población de organismos, lo que se conoce como efecto rizosfera, el cual tiende a disminuir con la profundidad del suelo debido a que las raíces son más numerosas en las proximidades de la superficie, por lo que puede decirse que el efecto rizosfera constituye en lo esencial un fenómeno de los estratos más superficiales del suelo. A su vez, la población de microorganismos resultante de este efecto es capaz de ejercer una influencia muy positiva sobre las plantas por distintos mecanismos, ya que en esta zona desarrollan una gran variedad de actividades, como son la fijación del Nitrógeno atmosf atmosférico, la solubilización del Fósforo retenido en el suelo, la estimulación del crecimiento de las plantas, el establecimiento de simbiosis mutualísticas, el biocontrol, la antibiosis, el mejoramiento de la estructura del suelo, la liberación de enzimas y el incremento de la retención de agua. Como un ejemplo, puede citarse la síntesis de reguladores del crecimiento, tales como auxinas, giberelinas y citoquininas, que estimulan la actividad metabólica de las raíces (Burdman et al., 2000). Si se toma en cuenta, además, el beneficio recibido por la fijación de Nitrógeno, que es sinergístico con la estimulación del crecimiento, puede comprenderse por qué se incrementa el uso de los biofertilizantes y bioestimuladores en el mundo, con el objetivo de reducir las aplicaciones de fertilizantes inorgánicos (Lambrecht et al., 2000).

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Por otra parte, el concepto de colonización microbiana de la rizosfera comprende tres fases (Merckx et al., 1993): una primera etapa, donde los microorganismos migran en dirección a las raíces, atraídos por el efecto de las sustancias que componen los exudados, y comienzan a distribuirse paralelamente al crecimiento de la raíz, con disminución de la población a medida que ésta se aleja de la zona germinada. Esta migración es posible porque ocurre un intercambio de señales entre las raíces y los microorganismos En una segunda fase se produce la supervivencia y la multiplicación de las poblaciones microbianas hasta el límite del nicho ecológico; en este período ocurre una intensa competencia entre los organismos que están siendo atraídos y los que ya se encuentran establecidos, y esta competencia tiene lugar durante y después de la primera etapa. En una tercera fase ocurre la distribución de la población a lo largo de las raíces, su multiplicación y establecimiento. Pero los microorganismos no están distribuidos de manera uniforme sobre la superficie de la raíz, sino que se localizan en determinados puntos (microambientes) de la misma que poseen mayor actividad segregante de materia orgánica (exudados radicales). En general, se considera que solo entre 4 y 10 % de la superficie de la raíz está colonizada por microorganismos (Metting, 1993). El sistema radical de las plantas ejerce varios efectos sobre la micropoblación edáfica; así, hay efectos indirectos, producidos por la actividad de las raíces al modificar la estructura del suelo, el régimen hídrico, el pH, la concentración de elementos nutritivos y la composición de la atmósfera del suelo. También hay efectos directos causados por la exudación de diversas sustancias (azúcares, fenoles, vitaminas, aminoácidos, ácidos orgánicos y grasos, nucleótidos, esteroides, etc.) que, junto con la decamación de células y tejidos, estimulan la microflora al actuar como fuentes de energía, de Carbono, Nitrógeno, Fósforo, etc., o la inhiben por la liberación de sustancias tóxicas. Entre los factores abióticos, los que más influyen son el suministro de Carbono, la humedad y la aireación. Los microorganismos deben de tener acceso a abundantes fuentes de Carbono para su crecimiento y la producción de energía, sobre todo en el caso de los fijadores de Nitrógeno, ya que la fijación de una molécula de N2 requiere aproximadamente 16 moléculas de ATP, por lo que los organismos deben utilizar considerables cantidades de sustratos. La falta o exceso de humedad limita la vida microbiana en el suelo y, como es natural, también en la zona rizosférica. El exceso influye sobre todo en la capacidad de aireación y es más perjudicial que la falta de humedad, ya que algunos de los organismos rizosfé-

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ricos son capaces de formar quistes ((Azotobacter) o esporas (Bacillus, Clostridium) que les permiten sobrevivir durante largos períodos a la desecación. La aireación ejerce un efecto muy marcado, ya que las bacterias aeróbicas y microaerofílicas sufren bajo condiciones anóxicas. A pesar de esto, los fijadores de Nitrógeno funcionan mejor a concentraciones reducidas de Oxígeno, debido a la sensibilidad del complejo nitrogenasa al Oxígeno molecular, el cual inactiva de forma irreversible a la enzima (Postgate,1987). En general, en la rizosfera existen numerosos ecositos con bajo pO2 que proporcionan condiciones favorables para el establecimiento de los diazotrofos (Zuberer, 1990). Influencia de las secreciones de las raíces sobre los microorganismos

Como se ha dicho antes, una de las principales características de la rizosfera consiste en lo que se llama rizodeposición, relacionada con el flujo del Carbono fotosintético que se realiza desde las raíces al suelo en forma de exudados de bajo peso molecular (azúcares, ácidos orgánicos, aminoácidos y fenoles), exudados de alto peso molecular (macropolímeros y ectoenzimas) y mucigel (mucílagos mezclados con la población microbiana que puebla el rizoplano, con metabolitos y con células epidérmicas en senescencia). Los exudados de bajo peso molecular favorecen la toma por la planta de los cationes con valor nutritivo a partir del complejo de intercambio edáfico, para lo que deben cumplir la función de agentes acidificantes; también pueden emitir señales químicas que estimulan la migración de los microorganismos hacia las raíces o facilitar la expresión de determinados genes, como los que inducen la nodulación (Perret et al., 2000). El complejo mucopolisacárido tiene acción lubricante sobre las raíces y mejora de esta forma las interacciones con las partículas del suelo, sobre todo en el caso de suelos secos, al mismo tiempo que protege de la deshidratación al área apical de la raíz y regula la toma de nutrientes. Las enzimas que tienen más importancia en estos exudados son las fosfatasas y la polifenoloxidasa, necesarias para la síntesis de las células de las raíces (Merschner, 1999). La cantidad y tipo de exudados producidos por las plantas están muy estrechamente relacionados con los factores que afectan su propio desarrollo, tales como tempera-

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tura, intensidad y calidad de la luz y contenido de nutrientes en el suelo. Mishustin y Shilnikova (1971) expresaron que la exosmosis puede representar el 5% de la materia orgánica sintetizada por las plantas. Para una cosecha de trigo de 2 t/ha, la biomasa vegetal se calcula en 5 toneladas y, de ella, la exosmosis representa 250 kg/ha. Por su parte, Newman (1985) calculó que los exudados solubles de las raíces estaban en una concentración entre 20-50 mg/g, y contribuyen con 3-15% de la materia orgánica que éstas aportan al suelo, ya que la mayor parte del carbono translocado a las raíces termina como fracciones insolubles, especialmente polisacáridos estructurales (celulosas, hemicelulosas y otras). Pero la profundización de los métodos científicos ha permitido conocer, mediante la incubación de plantas totales con 14CO2, que 20% de los fotosintatos son liberados como materia orgánica en la rizosfera (Cocking, 2003). Como ya se expresó, entre las secreciones de las raíces de cada especie vegetal hay distintos tipos de sustancias orgánicas, algunas de las cuales pueden ayudar al establecimiento de las bacterias en la zona rizosférica, mientras que otras pueden actuar como repelentes. Así, por ejemplo, en el caso del maíz los exudados que predominan son azúcares (65%), ácidos orgánicos (33%) y aminoácidos (2%), aunque la diversidad es amplia y se han encontrado en este cultivo más de 10 tipos de ácidos orgánicos y 4 tipos de azúcares (Kraffczyk et al., 1984). Se ha demostrado que las células epidérmicas de las raíces están recubiertas de polisacáridos de doble origen, vegetal y microbiano, en los cuales se encuentran asentadas las colonias de microorganismos. De esta manera, los azúcares, aminoácidos, ácidos orgánicos etc., que han sido secretados son responsables del número de microorganismos, así como de su composición por especies y variedades. Uno de estos componentes puede ser estimulante del crecimiento de un microorganismo y puede ser neutral o inhibidor para otros. Por ejemplo, los compuestos flavonoides exudados por las raíces de las leguminosas, si se añaden al medio de cultivo, estimulan el crecimiento de Bradyrhizobium japonicum, pero disminuyen el de Pseudomonas sp. Igualmente, algunas gramíneas, así como algunas sustancias excretadas por los microorganismos, pueden ser inhibidores. Quimiotaxismo

Debido a esta diversidad, algunas cepas de una bacteria determinada se establecen mejor sobre algunas especies vegetales, e incluso sobre algunas variedades de una mis-

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ma especie, que sobre otras. Estas diferencias se atribuyen tanto a las características de las plantas hospedantes como a las de las propias cepas microbianas. En este sentido, la cantidad y calidad de las fuentes de carbono que segregan las raíces desempeñan un papel fundamental en el establecimiento de las bacterias (Boddey y Döbereiner, 1988). Lo expresado anterirmente debe ser comprendido por los investigadores y fabricantes de biofertilizantes, y la no comprensión de este principio fundamental ha sido la causa de la inconsistencia de los resultados obtenidos por distintos investigadores, y hasta del fracaso de una política racional de aplicación de biofertilizantes. Por esta razón, es necesario realizar una correcta selección de la cepa más adecuada para cada especie vegetal, para lo que debe de tomarse en cuenta que la mayor o menor influencia de las secreciones de las raíces sobre las bacterias ocurre por procesos quimiotáxicos. La quimiotaxis es el movimiento de los organismos vivos hacia o en contra de una sustancia química determinada. Este fenómeno ha sido observado en una amplia gama de animales, vegetales y microorganismos. En el caso de las bacterias, la quimiotaxis se conoce desde ffinales del siglo XIX, cuando Engelmann, Pfeffer, Beijerinck y otros descubrieron que esta reacción, positiva o negativa, ocurría cuando algunas bacterias se enfrentaban al Oxígeno, a minerales y a nutrientes orgánicos. Cuando la bacteria tiene una orientación positiva en dirección a la fuente de estimulación el movimiento se llama topotaxis, y cuando es negativa, evitando la fuente, se conoce como fobotaxis (Adler, 1972). En el caso de las bacterias fijadoras de Nitrógeno atmosférico, se ha demostrado claramente la quimiotaxis en varias especies de Rhizobium, aunque ocurre en general en todas las bacterias que actúan en la rizosfera. En la tabla 2 puede verse el resultado de una selección hecha en una cámara de quimiotaxismo, en la cual se colocaron secreciones de las raíces de cebolla y un cultivo líquido de la cepa de Azotobacter chroococcum que se quería probar (Dibut, 2000). Como se observa en la tabla, las cepas INIFAT-17 e INIFAT-3 son las más atraídas por los exudados de la cebolla. Al considerar también los resultados del ARA (prueba de reducción del acetileno), que indicaron una mayor eficiencia de fijación de nitrógeno atmosférico en la cepa INIFAT-17, fue seleccionada ésta para su uso comercial en la cebolla, con la garantía de que se establecerá una abundante población de la bacteria

la fijación biológica del nitrógeno atmosférico en condiciones tropicales

en la zona rizosférica de las plantas y éstas recibirán los beneficios de la inoculación. Mediante este procedimiento, fue seleccionada la cepa INIFAT-12 para el tomate y otras solanáceas y la INIFAT-9 para las gramíneas. Diferencias entre el efecto de las condiciones de clima templado y tropical sobre las interacciones planta-microorganismos en la zona rizosférica

Todas las interacciones que ocurren entre las plantas y los microorganismos están gobernadas por las condiciones del ambiente, por la naturaleza, estado fisiológico y vigor de las plantas en desarrollo, por las características del suelo, el régimen hídrico y el manejo agronómico; igualmente, los microorganismos interaccionan entre ellos, dando lugar a procesos de naturaleza antagónica o sinérgica, muy importantes para esta relación. La mayor parte de los conocimientos que se han adquirido sobre estas interacciones son fruto de las investigaciones realizadas en las condiciones de clima templado. Pero, en las regiones tropicales, las excreciones de las raíces y las hojas tienen mayores concentraciones de compuestos carbonados que en las regiones templadas debido a la mayor fijación de Carbono, lo cual trae como consecuencia la presencia de poblaciones más altas de microorganismos en la rizosfera y en la filosfera (zona de las hojas) de las plantas en el trópico.

Tabla 2 Efecto quimiotáxico de los exudados totales de las plantas de cebolla sobre distintas cepas de A. chroococcum (expresado en logn de X). Factor C= Factor quimiotaxis. Relación de células atraídas por los exudados/células atraídas por buffer de fosfato X= Número de células atraídas

Variantes

INIFAT -17 Logn Factor X C

INIFAT-15 Logn Factor X C

INIFAT-3 Logn Factor X C

INIFAT-10 Logn Factor X C

Exudados

7.87 3584

5.03 613

7.84 3287

5.11 660

4.25

4.30

4.24

Control (buffer) 4.32

capítulo 2. papel de la rizosfera en la efectividad de los biofertilizantes microbianos

La baja concentración de compuestos carbonados puede ocasionar que las raíces de las plantas en las regiones templadas tengan menor influencia sobre el desarrollo de algunos organismos fijadores de nitrógeno de forma asociativa, como es el caso de las especies de Azotobacter, ya que estas bacterias se encuentran ausentes, en muchos casos, de la rizosfera de especies vegetales de tanta importancia económica como avena y trigo, y ni siquiera mediante la inoculación es posible lograr que se establezcan en la zona rizosférica de estas especies (Becking, 1977; Knowles, 1981). La introducción en el suelo de un organismo foráneo que ha demostrado aportar grandes beneficios en condiciones axénicas puede tener problemas en condiciones naturales, y hasta puede no entrar a formar parte de la microflora del suelo. En una revisión de la literatura puede verse una elevada cantidad de fallos en la inoculación. Esto se debe a que existe todavía un conocimiento muy limitado de la rizosfera, lo que impide poder modificar las condiciones de forma adecuada. Por ejemplo, Rovira (1965) reportó que, en los suelos cultivados de las regiones templadas, se encuentra Azotobacter en niveles muy bajos, y con frecuencia estas bacterias son eliminadas de la rizosfera, especialmente de la superficie de las raíces. También Trolldenier (1977) encontró, mediante el uso de microscopía de fluorescencia, que la rizosfera del trigo contiene solo unas pocas células de estas bacterias. La pobre incidencia de Azotobacter se atribuye a la falta de sustratos utilizables y a la acumulación de sustancias bacteriostáticas por la presencia de numerosos microorganismos antagonistas. En cambio, los reportes de las zonas áridas calientes indican una elevada incidencia, con poblaciones que alcanzan hasta 100 millones de células/g de suelo rizosférico de trigo, algodón y leguminosas (Abd-El-Malek, 1971). Las plantas xerofíticas también pueden estimular las poblaciones de Azotobacter, desde 10 células/ g en los suelos desérticos hasta 1 millón en la rizosfera de algunas plantas cultivadas en esos mismos suelos (Wullstein et al., 1979). En contraposición a lo expresado por Rovira (1965) y Trolldenier (1977) para los suelos templados, en un país tropical como Cuba pueden aprovecharse los beneficios de la inoculación del trigo con Azotobacter, como se demuestra en la Tabla 3 (Dibut et al., 1996). Como puede verse en la tabla, la combinación de una cantidad reducida de fertilizante con el biofertilizante produjo los rendimientos más elevados, lo que indica que hubo

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una marcada influencia de la bacteria, la cual se estableció en la zona rizosférica de las plantas y aportó el nitrógeno fijado y las sustancias activas estimuladoras del crecimiento Frioni (1999) demostró que el efecto rizosférico de plantas de sorgo, maíz, mijo perla (Pennisetum americanum) y mijo común (Panicum miliaceum) influyó marcadamente sobre las distintas poblaciones de Azotobacter, Azospirillum y Clostridium, así como en la actividad nitrogenasa de cada una de ellas. El efecto más marcado ocurrió en la fase de grano al estado lechoso en todos los cultivos. En los últimos tiempos se realizan numerosos estudios sobre ecología de la rizosfera, enfocados desde una perspectiva dinámica en la que se incluyen las interacciones entre los microorganismos y entre estos y las plantas, así como los mecanismos que rigen estas interacciones, muchos de los cuales están aún por descubrir. De acuerdo con estos estudios, todo lo que se ha expuesto anteriormente, que se ha ejemplificado con el caso de las bacterias del género Azotobacter, pero que puede aplicarse a todos los microorganismos con características de biofertilizantes o bioestimuladores en general, demuestra la importancia que tienen las secreciones de las raíces para que pueda establecerse una cepa bacteriana en la zona rizosférica de un determinado cultivo y para que se aprovechen sus efectos benéficos. En la Tabla 4 (Martínez Viera, 1998) se pone de manifiesto la presencia de poblaciones naturales de Azotobacter en la rizosfera de todos los cultivos situados en diferentes tipos de suelos de la Huasteca Hidalguense (México). En esta tabla hay que destacar la presencia de estas bacterias en la rizosfera del cafeto en La Puerta, a pH 4.04, lo cual contradice los datos que existen en la bibliografía y que han sido ratificados por nuestros propios datos, ya que nunca se ha podido aislar ni una Tabla 3 Respuesta del trigo a la inoculación con A. chroococcum en las condiciones de Cuba

Variante

Superficie (ha)

Rendimiento (t/ha)

Peso de 1.000 granos (g)

45 Kg N/ha 22.5 Kg N/ha 22.5 Kg N/ha+ Azotobacter

7.2 11.8

4.39 3.58

45.00 39.00

8.3

4.71

47.00

capítulo 2. papel de la rizosfera en la efectividad de los biofertilizantes microbianos

cepa de Azotobacter en suelos de Cuba con pH inferiores a 5.0, en zonas rizosféricas de tabaco y cítricos, que son los cultivos predominantes en estos suelos. El resultado que se muestra en la tabla sugiere que las secreciones de las raíces de algunos cultivos, en este caso del cafeto, podrían ayudar al establecimiento de estas bacterias aunque las condiciones del suelo sean perjudiciales.

Tabla 4

Lugar Coacuilco 1 Coacuilco 2 Huitzilingo Jaltocan Tlaica Ixtle Tepaco La Puerta Huantla Coatzonco 1 Coatzonco 2 Coatzonco 3 Coatzonco 4 Metlatepec

Tipo de suelo

Cultivo

pH del suelo (agua)

UFC/g de suelo

Rendzina “ “ “ “ Regosol “ Levisol “ Feozen “ “ “ “

Plátano á átano Pasto natural Cítricos í ítricos Maiz Pasto natural Maiz Pasto na natural Cafeto Maní Maíz í íz Maíz Café Pasto natural Pasto natural

6.59 6.72 6.48 6.97 6.30 7.44 7.35 4.04 7.34 7.33 7.42 7.65 7.80 7.84

2 x 104 3 x 104 2 x 104 6 x 104 8 x 103 5 x 104 2 x 104 3 x 103 3 x 104 9 x 104 3 x 104 1 x 105 8 x 104 3 x 103

Poblaciones naturales de bacterias pertenecientes al género Azotobacter en las muestras de suelos rizosféricos recogidas en la Huasteca Hidalguense (México)

la fijación biológica del nitrógeno atmosférico en condiciones tropicales

Capítulo 3

Generalidades sobre la fijacion biológica del nitrógeno atmosférico

Importancia del Nitrógeno

El Nitrógeno es uno de los dos mayores factores, junto con el agua, que gobiernan la productividad de los cultivos y procede de tres fuentes principales: las reservas orgánicas e inorgánicas del suelo, los fertilizantes minerales y los abonos orgánicos que se aplican y la fijación biológica del Nitrógeno que se encuentra en la atmósfera en forma de N2. Pero las reservas del suelo son muy limitadas y los fertilizantes son económicamente costosos y fuertes contaminantes del ambiente, por lo que la fijación biológica constituye una alternativa importante para aumentar la producción de alimentos utilizando métodos económicos y no contaminantes. En forma gaseosa, este elemento constituye las cuatro quintas partes de la atmósfera terrestre, y representa una reserva prácticamente inextinguible que alcanza a 4. 1015 toneladas. Se ha calculado que en la atmósfera que rodea cada hectárea de la superficie terrestre hay unas 70.000 toneladas de Nitrógeno, el cual no puede ser utilizado por los seres vivos porque se encuentra en forma molecular. En esta forma tiene una gran inercia química y se combina muy difícilmente con O2 e H2 para dar compuestos minerales simples como nitratos o amoniaco, que son las formas que asimilan los seres vivos para sintetizar las moléculas biológicas nitrogenadas. Por estas razones, hace falta que el N2 sea transformado por un grupo reducido de microorganismos llamados fijadores de Nitrógeno atmosférico, o por métodos industriales, hasta formar compuestos amoniacales, los cuales son llevados a su vez hasta nitratos por otros microorganismos llamados nitrificantes, que efectúan el proceso de nitrificación. La forma de nitratos constituye la principal fuente nitrogenada para la nutrición de las plantas.

capítulo 3. generalidades sobre la fijación biológica del nitrógeno atmosférico

La fijación de N2 por métodos industriales

Hasta mediados del siglo XIX, el proceso de fijación del Nitrógeno atmosférico por parte de los microorganismos, que se había desarrollado durante millones de años, fue suficiente para suministrar el elemento necesario a los cultivos que debían de mantener a la población del planeta. Pero con el rápido aumento de la población y el crecimiento de las grandes ciudades, la demanda de suministros obligó a buscar nuevas formas de resolver las necesidades de fuentes nitrogenadas para los cultivos. Al principio se importó en Europa el guano de Perú y el salitre de Chile, formas de fertilización que fueron suplementadas con los subproductos amoniacales de la producción de gas a partir del carbón. La creciente demanda de Nitrógeno condujo a la invención de distintos procesos industriales que permitieran aprovechar, mediante la fijación, la inagotable fuente del elemento que constituía la atmósfera. Así, surgieron las tecnologías de Birkeland-Eyde en 1905, de Frank-Caron en 1906 y de Serpak en 1908, todas con altísimos requerimientos de energía que impidieron su desarrollo en gran escala. Poco después de la Primera Guerra Mundial, en 1919, surgió el proceso de HaberBosch, que es el utilizado actualmente, modernizado, en las fábricas de fertilizante nitrogenado y que fue ayudado por el desarrollo simultáneo de un proceso de catalización simple para la oxidación de amonio a nitratos en la industria de explosivos. El N2 y el H2 se combinan directamente en condiciones de operación apropiadas para alcanzar una mezcla en equilibrio que contiene 20% de amonio. Cuando se descubrió esta reacción, requería 1.300ºC más que la modificada actualmente, pero, a pesar de todo, para producir 1 t de fertilizante hacen falta 1,3 t de petróleo, además de que se pierden en la atmósfera 6.3x109 t de CO2, metano, NO y NO2 durante la fabricación, lo que contribuye en gran medida al efecto invernadero. En los sistemas agrícolas tradicionales, este fertilizante constituye el principal insumo externo para optimizar los rendimientos, pero su eficiencia es una de las más bajas entre todos los nutrientes de las plantas, además de su efecto sustancial sobre la contaminación ambiental mediante la lixiviación de los nitratos a los mantos acuíferos, lo que trae como consecuencia su eutrificación, así como mediante pérdidas gaseosas por la vía de amonio o de N2O, además de que el aumento de la deposición de N en los sistemas naturales influye sobre el balance de nutrientes y la diversidad biológica (Peoples y Craswell,1992).

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A pesar de esto, en los últimos años se utilizan en el mundo 83 millones de toneladas anuales de fertilizante nitrogenado (FAO, 2001b), y la causa principal del aumento desde casi 61 millones en los años 80 ha sido la creciente aplicación en los países asiáticos. Se considera que Asia, Africa y América Latina consumen 46 millones de toneladas (55% del total), según la Asociación Internacional de la Industria de Fertilizantes (2003). La fijación biológica del N2

En contraste con lo expresado anteriormente, la fijación biológica del Nitrógeno constituye un componente primordial de la sustentabilidad agrícola. En los suelos que tienen escasa disponibilidad del elemento, solamente los cultivos que pueden asociarse con sistemas de fijación biológica de Nitrógeno tienen la posibilidad de sobrevivir (Dôbereiner et al., 1995). En contraste con las grandes cantidades de energía fósil utilizadas para desarrollar el proceso de Haber- Bosch, en el proceso biológico la energía se deriva de la fotosíntesis, y se requieren entre 6 y 12 kg de C fotosintético para lograr la fijación de 1 kg de N2 en la simbiosis Rhizobium – leguminosas (Marschmer, 1999). De lo que se ha expuesto se deduce que éste constituye el método de suministrar N a los agroecosistemas más saludable para el ambiente. El flujo terrestre de Nitrógeno a partir de la fijación biológica ha sido calculado entre 125 y 200 millones de toneladas/año (Paul, 1988), de las cuales 35 millones corresponden a la fijación simbiótica por leguminosas, 15 a la fijación simbiótica por no leguminosas, 7 a los campos de arroz , 80 a otra vegetación y 36 millones de toneladas a la fijación marina. Es decir, que el Nitrógeno aportado por la fijación biológica al suelo se encuentra en el rango de los 137 millones de toneladas y puede ser mayor si se aplican los biofertilizantes en mayor escala. En términos absolutos, estas cifras son pequeñas en comparación con las reservas totales de Nitrógeno en el suelo, que ascienden a 105.000 millones de toneladas (Peoples y Craswell, 1992), pero son más elevadas que los 83 millones de toneladas de fertilizante nitrogenado que se aplican actualmente en el mundo. Si se toma en cuenta que solo a causa de la extracción por los cultivos se pierden del suelo todos los años 100 millones de toneladas del elemento, sin considerar las pérdidas por lixiviación, volatilización o por otros procesos, puede deducirse la gran importancia que tiene la fijación biológica para el mantenimiento del ciclo del Nitrógeno.

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Resumen histórico de los estudios sobre fijación biológica del N2

El hombre cultivó la tierra de una forma organizada desde hace 8.000 años a.C. Los reportes más antiguos indican que los romanos tenían ya manuales para que los agricultores incrementaran la fertilidad del suelo; así, Columella escribió 60 años a.C. un tratado que contiene descripciones de varias prácticas agrícolas, el cual fue usado en el Imperio Romano por muchas generaciones. La cultura árabe floreció en el siglo XII, cuando Ibn-al-Awan escribió un Tratado de Agricultura. Muchos pueblos conocían el papel de los componentes del suelo en cuanto a la nutrición de las plantas. En el siglo XVI, Bernard Pallisy planteó que los residuos vegetales contenían “la sal” o “el principio” que apoyaba el crecimiento de las plantas, mientras que Jan Baptista van Helmont creía que el agua era “el principio”. Mas tarde, se estableció la idea de que ciertos ingredientes del suelo disueltos en el agua intervenían en el crecimiento de las plantas, gracias a los experimentos de John Woodward en Inglaterra. Los trabajos de J.B. Boussingault en Francia, en 1834, revelaron el importante papel de los componentes químicos de las plantas y del suelo. El alemán Justus von Liebig preparó un balance de la nutrición vegetal en relación con el suelo. Uno de los hitos en los estudios sobre fertilidad de los suelos lo constituyó el descubrimiento del superfosfato, en 1840, por John Bennet Lawes y J. H. Gilbert, en la Estación Experimental de Rothamsted, en Inglaterra. Estudios posteriores en la misma estación condujeron a un mayor conocimiento de la Química del Suelo y de los requerimientos químicos de las plantas. Los primeros estudios que se realizaron acerca de lo que hoy se llama biofertilización estuvieron relacionados con la fijación biológica del Nitrógeno atmosférico, y se remontan a la primera mitad del siglo XIX. Así, Boussingault señaló en 1838 que el cultivo del trébol mejoraba la fertilidad de los suelos cuando se rotaba con cereales, aún después de recoger la masa de follaje verde para alimentar el ganado, por lo que encontró razonable pensar “que las partes verdes de las plantas son capaces de asimilar el Nitrógeno de la atmósfera”. Para probarlo, diseñó experimentos con trigo y trébol en un medio totalmente libre de Nitrógeno y demostró que, mientras el trigo tuvo solo una diferencia de 5% en el contenido del elemento, desde la semilla hasta la cosecha, el trébol mostró 36% de aumento. Estos resultados, unidos a los que había obtenido en los experimentos de rotación, le permitieron expresar que “el Nitrógeno de la atmósfera puede ser asimilado durante la vida de una planta”.

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En 1847, Liebig planteó la “hipótesis del amonio”, y Ville, en 1854, utilizando técnicas muy parecidas a las de Boussingault, reportó una gran acumulación de Nitrógeno en las plantas experimentales. En 1862, Jodin demostró que una solución que contenía azúcar y ácido tartárico, pero ningún Nitrógeno, permitía un vigoroso crecimiento de “micoderma” en forma de velo sobre la superficie del medio, lo que constituye una característica de Azotobacter, que habría de ser descubierto 40 años después. Pero la demostración de Jodin no recibió reconocimiento. Pronto fue olvidada por los científicos la fijación de N2, hasta que en 1890 Berthelot encontró que las muestras de suelos sin esterilizar aumentaban su contenido del elemento durante el almacenamiento, mientras que las esterilizadas no lo hacían, por lo que sacó la conclusión de que algunas bacterias que vivían libres en el suelo eran capaces de fijar N2 atmosférico, proceso que Berthelot consideró necesario para compensar las pérdidas que ocurren en la naturaleza. En este sentido dijo: “La reserva natural de los compuestos nitrogenados tendería a disminuir si no existieran causas compensadoras. Es preciso que existan acciones inversas capaces de fijar nitrógeno”. Ya en 1888, Hellriegel y Wilfarth habían descubierto las bacterias simbióticas del género Rhizobium, aisladas de nódulos de raíces de plantas leguminosas. En 1894, Winogradsky aisló el primer diazotrofo de vida libre, la bacteria anaeróbica Clostridium pasteurianum, utilizando un medio de cultivo libre de Nitrógeno enriquecido con manitol. En 1901, Beijerinck aisló la bacteria aerobia Azotobacter chroococcum. La primera inoculación bacteriana al suelo fue realizada por Nobbe y Hiltner en 1895, quienes prepararon en el laboratorio un inóculo a base de Rhizobium sp sobre un medio que contenía extractos de plantas leguminosas, gelatina, azúcar y asparagina. En pocos años se produjeron 17 inoculantes distintos para diferentes especies de leguminosas, todos protegidos por la marca “Nitragin” (Martínez Viera, 1986). Ya en 1920 existían 19 patentes comerciales en Estados Unidos que amparaban la fabricación de inoculantes a base de Rhizobium, y estos bioproductos se utilizan hoy con éxito en todo el mundo. En relación con las bacterias fijadoras asociativas, comenzó a utilizarse en la URRS y Polonia, en los años 30, un producto sólido llamado “Azotobacterin”, a base de Azotobacter chroococcum, y se reportaron incrementos notables en los rendimientos de cereales y hortalizas en algunas regiones y ningún efecto en otras (Mishustin y Silnikova,

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1971). Pero el mayor nivel de aplicación efectiva de estas bacterias ha ocurrido en la India (Mehrotra y Lehri, 1971; Joi y Shinde, 1976) y, más recientemente, en Cuba (Dibut et al., 2004; Martínez Viera et al., 2004); en ambos países han alcanzado estos bioproductos altos niveles de aceptación entre los campesinos, debido a que su aplicación en distintos cultivos de plantas no leguminosas promueve la germinación de las semillas y el vigor inicial de las plantas, con importantes incrementos de los rendimientos y la calidad de los cultivos. En 1976 fueron redescubiertas las bacterias del género Azospirillum, que habían sido descritas por Beijerinck en 1925 con el nombre de Spirillum lipoferum y cayeron en el olvido hasta que Döbereiner y Day (1976) pusieron de manifiesto su capacidad para fijar N2 atmosférico y para sintetizar sustancias activas estimuladoras del crecimiento vegetal. Desde un punto de vista evolucionista, se ha sugerido que estas bacterias son organismos intermedios entre los fijadores libres y los simbióticos. La localización de los puntos de fijación de Nitrógeno dentro de las células de las plantas hospedantes ha apoyado esta hipótesis, porque no se admite hoy que la fijación simbiótica tenga que estar confinada dentro de estructuras visibles como los nódulos cuando existe la posibilidad de otras formas de asociación, tales como el establecimiento dentro del tejido cortical de las raíces (Krieg y Tarrand, 1978). Estas bacterias están siendo ampliamente utilizadas como inoculantes para las gramíneas en distintos países. Más recientemente fue descubierta una bacteria fijadora de nitrógeno atmosférico que vive en el interior del tallo de la caña de azúcar y actúa en asociación con dicha planta, la cual fue bautizada originalmente como Saccharobacter nitrocaptans (Cavalcante y Dobereiner, 1988) y después como Acetobacter diazotrophicus (Gillis et al., 1989) , nombre que cambió en los últimos años por Gluconacetobacter diazotrophicus (Yanada et al., 1997). Los resultados obtenidos en el estudio de esta nueva bacteria permitieron decir a Dôbereiner (1993): “Todas estas observaciones cambian completamente el concepto de asociación planta-diazotrofo, la cual se pensaba que era una asociación puramente casual con las raíces de las plantas, y abre enteramente nuevas vías para expandir la fijación biológica del nitrógeno en sustitución de los fertilizantes nitrogenados para las gramíneas”. Con esta nueva bacteria se han preparado también inoculantes que se aplican en algunos países productores de caña de azúcar. En Cuba se están utilizando con éxito en cultivos tales como la papa, la yuca y la batata, en los cuales se logran importantes in-

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crementos del rendimiento con una escasa aplicación de fertilizante nitrogenado (Dibut et al., 2003). También existen distintos organismos de alta efectividad en la fijación de N2 pero que no son bacterianos, por lo cual no serán tratados en este espacio, ya que, por su gran importancia, deben de ser objeto de estudios separados. Entre ellos se encuentran el helecho acuático Azolla sp .y las algas verdi-azules. También existen otras bacterias que han sido efectivas en pruebas experimentales, pero que no cuentan aún con tecnologías adecuadas de fabricación y aplicación que les permita alcanzar el nivel de aplicación comercial, por lo cual tampoco se hablará de ellas en este momento. El más familiar y utilizado de los procesos de fijación es la asociación simbiótica entre las bacterias del género Rhizobium y las raíces de las plantas leguminosas. Pero en las últimas décadas se ha demostrado concluyentemente que un gran número de especies de gramíneas, incluyendo cultivos de tanta importancia económica como caña de azúcar, maíz y sorgo, pueden tener asociadas a sus raíces, y hasta viviendo dentro de sus tallos, poblaciones de bacterias fijadoras. Por último, hay bacterias de vida libre que dependen de su asociación con los exudados radicales para obtener la fuente energética que les permite cumplir su función fijadora. Este proceso puede ser la mayor fuente de Nitrógeno para la agricultura cuando se utilizan los sistemas simbióticos bacterias-leguminosas, los cuales pueden aportar hasta 360 kg de N/ha, como se pone de manifiesto en la Tabla 5, mientras que los sistemas a base de microorganismos fijadores asociativos o de vida libre aportan cantidades mucho menores, por lo que los cultivos requieren aplicaciones suplementarias de fertilizante nitrogenado, aunque siempre significativamente menores que las necesarias cuando no se realiza la inoculación. Pero muchos de los conocimientos que se han adquirido sobre el proceso de fijación no están siendo utilizados, especialmente en los países que más necesitan de su aplicación, lo que se debe a la existencia de obstáculos importantes para lograr implementar las tecnologías en la práctica agrícola, los cuales son de orden técnico, socio-económicos o de escasez de talentos humanos. En la Tabla 5 se presentan los aportes de Nitrógeno a la agricultura, calculados para diferentes sistemas fijadores en asociación con distintos cultivos (Bohlool et al., 1992).

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Hay todavía muchos aspectos desconocidos en los procesos de fijación de Nitrógeno atmosférico y, en la medida en que la investigación permita su clarificación, será posible mejorar las prácticas agrícolas que promueven estos procesos. Mecanismo de la fijación biológica de N2: la nitrogenasa

El sistema enzimático responsable de la fijación se llama nitrogenasa. El primer extracto libre de células fue preparado a partir de Clostridium pasteurianum en 1960. Desde entonces, se han obtenido nitrogenasas parcialmente purificadas a partir de unas 20 especies bacterianas, cinco de las cuales han podido ser totalmente purificadas. Esta enzima puede ser aislada de dos formas distintas: como el complejo nitrogenasa, el cual ha sido bien caracterizado solamente para Azotobacter vinelandii, tiene un peso molecular de 300.000 y contiene una proteína Fe-Mo, una proteína Fe y una ferredoxina, La segunda forma resulta de la separación de las dos proteínas componentes (Fe-Mo y Fe), que tienen pesos moleculares de 230.000 y 60.000 respectivamente. Ninguna de estas proteínas muestran actividad enzimática cuando están aisladas, pero cuando se recombinan despliegan el mismo nivel de actividad que el complejo (Haaker y Veeger, 1977). Actualmente se utilizan las designaciones Acl, Avl, Bpl, Cpl, Cal, Kpl, Rll y Rjl para las proteínas Fe-Mo de los distintos fijadores que se han estudiado: Azotobacter chroococcum, A. vinelandii, Bacillus polymyxa, Clostridium pasteurianum, Corynebacterium autotrophicum, Klebsiella pneumoniae, Rhizobium lupini y Rhizobium japonicum respectivamente. Tabla 5

Sistema fijador de nitrógeno Sistemas de vida libre Arroz-algas verde azules Arroz-asociación con bacterias Asociación caña de azúcar-bacterias Sistemas simbióticos Arroz-Azolla Leguminosas-Rhizobium No leguminosas-Frankia

N2 fijado (kg/ha) por período de cultivo 10-80 10-60 20-160 20-100 50-360 40-60 por año

Estimados de Nitrógeno aportado por diferentes sistemas fijadores en la agricultura

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Estos símbolos deben utilizarse hoy con preferencia al término nitrogenasa, según fue aprobado en la discusión sobre nomenclatura que se realizó en la IV Conferencia sobre Fijación de Nitrógeno, celebrada en Australia en 1980 (Gibson et al., 1982). Para que se tenga una idea de las variaciones que ocurren entre las distintas nitrogenasas, pueden verse las variaciones entre los pesos moleculares de las proteínas Fe-Mo de cada una de ellas (Smith, 1983): Avl 216 000, Acl 216 000, Rjl 180 000, Rll 194 000, Cal 235 000, Kpl 220 000 y Cpl 200 000. La nitrogenasa es altamente sensible a la presencia de oxígeno y requiere una fuente de potencial reductor y de adenosina trifosfato (ATP) para poder cumplir su función. Cuando existe esta fuente, la enzima cataliza la reacción de un reductante dependiente de ATP con N2 para formar NH3+ADP (adenosina difosfato) y fosfato. La ecuación que permite la expresión de la reacción nitrogenasa, determinada en el caso de Clostridium pasteurianum, es la siguiente: N2 + 8 ferredoxinas- + 8H+ + 16 MgATP2- + 18 H2 2 NH4+ + 2 OH- + 8 ferredoxinas + 16 MgADP-+ 16 H2 PO4- + H2

Esta reacción muestra una clara necesidad de potencial reductor y de energía como ATP. El notable requerimiento de ATP se debe a que actúa como un agente deshidratante para incrementar la reactividad de los lugares reducidos en el complejo enzimático. En los sistemas microaeróbicos, como son los bacteroides de los nódulos de las raíces de las leguminosas y la mayoría de las bacterias asociativas, la ferredoxina es reemplazada en la reacción anterior por la flavodoxina, un portador de electrones similar que dona electrones al sistema nitrogenasa. Puede decirse con certeza que ninguna otra reacción bioquímica simple requiere esta cantidad de ATP. Pero todavía más ATP debe utilizarse por las bacterias fijadoras vivas, ya que la utilización incrementada de sacarosa que se necesita para crecer sobre N2 indica que la actividad nitrogenasa requiere 30 moléculas de ATP (Kennedy y Cocking, 1997). El costo energético del proceso de fijación se considera que es demasiado alto, pero no se ha podido demostrar por los que están en contra de utilizar los biofertilizantes que este costo energético tenga influencia en la reducción de los rendimientos, sino más bien, como se expondrá en otros capítulos, éstos se incrementan, a pesar de que se reduce el fertilizante nitrogenado de origen industrial. En los casos de las leguminosas y el arroz no se han observado diferencias en el rendimiento cuando las plantas utilizaban nitratos o Nitrógeno fijado (Lahda y Reddy, 2003), lo que puede ser atribuido

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a que los costos energéticos para fijar N2 (687 kJ/mol) son teóricamente similares a los que se necesitan para la reducción de nitratos (605 kJ/mol) por las plantas (Pate et al., 1979). Aunque desde 1960 se obtuvieron mutantes para la fijación de Nitrógeno, no fue hasta 1971 que se realizaron detalladas investigaciones sobre los genes de fijación (nif). En este año se reportó el agrupamiento de los nif-genes del cromosoma de Klebsiella pneumoniae (Streicher et al., 1971). Hoy se conoce que el número de genes relacionados con la fijación es 17, así como su localización en el caso de Klebsiella pneumoniae, que es la bacteria utilizada como modelo para estos estudios. Trabajos similares se han realizado con especies pertenecientes a los géneros Azotobacter y Rhizobium y algas verdi-azules del género Anabaena, aunque en todos estos casos ocurren complicaciones que le dan mucha lentitud a estas investigaciones; así, por ejemplo, Rhizobium presenta la dificultad de que tiene que ser aplicado a una leguminosa antes de su estudio, pero ya hoy se conoce bastante acerca del clonaje de los genes-nif de Rhizobium y sobre su presencia en un plásmido y se piensa que estos organismos tengan por lo menos el mismo número de genes que K. pneumoniae. Distribución de los sistemas fijadores

La fijación de Nitrógeno ocurre en toda la superficie de la tierra, en la parte sólida y en la líquida. Todos los ecosistemas contienen sistemas fijadores, aunque las cantidades que se fijan del elemento varían con amplitud, en dependencia de la presencia de Nitrógeno en el medio y de la riqueza del ecosistema. La variedad de ecositos donde se ha reconocido la fijación biológica se muestra en la tabla 6 (Kennedy y Cocking, 1997). Puede causar asombro que, entre los sistemas fijadores de Nitrógeno, se encuentren las trompas de las termitas y, más específicamente, su intestino. En efecto, de 50 especies bacterianas reconocibles como diferentes tipos morfológicos en el intestino de las termitas, fijaban nitrógeno unas 40 especies, las cuales expresaron actividad nitrogenasa aún en presencia de cantidades superiores a 5 mm de amonio en el intestino, y solamente perdían esa expresión cuando se exponían a gas amonio puro (Kennedy y Cocking, 1997). Aunque se ha recorrido hasta hoy una escala diversa de sistemas fijadores de nitróge-

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Tabla 6 Distribución de sistemas fijadores de Nitrógeno

Ecosistema Natural

Naturaleza de la fijación Simbiótica

No simbiótica

Zonas agrícolas y de bosques

Simbióticas

No simbióticas

Tipo de fijación

Asociación

Nódulos en raíces y tallos por Rhizobium y Frankia

Leguminosas, plantas actinorrizales

Musgos, líquenes, Pteridofitas

Superficie del suelo, rocas y árboles.

Simbiosis GunneraNostoc

Base de las hojas y raíces de Cycadas

Insectos

Termitas

Saprofitos de vida libre

Suelo, raíces, materia orgánica, superficie de las plantas.

Fotosintética

Algas verdi-azules, bacterias de aguas dulces y del mar.

Leguminosas noduladas

Cultivos anuales y perennes, rotación, abonos verdes

Angiospermas actinorrizales

Plantaciones y áreas de formación de suelos

Misceláneas simbióticas

Azolla, caña de azúcar y otros

Igual que ocurre en el medio natural

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no, como se pone de manifiesto en dicha tabla, la fijación biológica está restringida a los procariotes y nunca se ha encontrado en organismos eucarióticos. Lo que ocurre es que algunos organismos procariotes fijan Nitrógeno por sí mismos, mientras que otros deben establecer una relación simbiótica con un sistema eucariótico para realizar la fijación. La escala de microorganismos fijadores de Nitrógeno cubre la mayoría de los diferentes sistemas de energía biotrófica, incluyendo bacterias fotosintéticas, anaeróbicas, anaeróbica microarerobias y aerobias . En cada uno de estos grupos se encuentran numerosos géneros y especies, entre los que se presentan a continuación los más conocidos. Organismos aeróbicos: Todas las especies de los géneros Azotobacter, Azomonas, Azotococcus, Beijerinckia y Derxia, algunas especies de los géneros Aquaspirillum, Methanosinus y otras bacterias oxidantes de metano y todas las algas verde-azules heteroquísticas. Organismos microaeróbicos: Todas las especies de los géneros Rhizobium, Bradyrhizobium, Azospirillum, Gluconacetobacter, Herbaspirillum y Xanthobacter, la especie Thiobacillus ferro-oxidans y muchas algas verde-azules no heteroquísticas. Organismos facultativos: Bacillus azotogensis, B. macerans, B. polymyxa, Klebsiella aerogenes, K. oxytoca, K. pneumoniae, Citrobacter freundii, y algunas especies de los géneros Enterobacter, Rhodopseudomonas y Rhodospirillum. Organismos anaeróbicos: Clostridium pasteurianum y algunas especies de los géneros Chlorobium, Chromatium, Desulfovibrio, Desulfotomaculum Ectothiospira, Propionibacterium y Thiopedia. Todos estos organismos han sido ubicados como fijadores de Nitrógeno atmosférico a partir de las pruebas de reducción del acetileno a etileno, en las que han demostrado su capacidad de fijación aunque sea en pequeñas cantidades. Pero de esta larga lista, solo unos pocos géneros se han considerado capaces de aportar beneficios a los cultivos cuando se aplican como biofertilizantes: Azotobacter, Azospirillum, Rhizobium, Bradyrhizobium, Gluconacetobacter, Herbaspirillum y algunas especies de algas verdeazules heteroquísticas.

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Organismos fijadores de N2 más utilizados como biofertilizantes

En la tabla 7 se presentan los microorganismos que pueden ser considerados como biofertilizantes principales entre los fijadores de N2 y las mayores limitaciones que existen para su uso (según Ladha, 1997, con algunas modificaciones). Como se observa en la tabla 7, los únicos biofertilizantes de amplio uso son los preparados a base de Rhizobium y Bradyrhizobium, que se utilizan en la mayor parte de los países en los cultivos de leguminosas para grano y para aceite. Los biofertilizantes que se utilizan en arroz ((Azolla y cianobacterias) son extensamente aplicados en los países asiáticos, pero no se han extendido a otros continentes porque no se ha tomado en asiá cuenta la efectividad demostrada en muchos años de uso en las condiciones de aquellos países. En relación con Azospirillum y Azotobacter, aunque se ha alcanzado un buen nivel de desarrollo tecnológico en los últimos años, es poco utilizado todavía por los agricultores, a pesar de que, además de su papel como fijadoras, estas bacterias asociativas sintetizan una amplia gama de sustancias promotoras del crecimiento, sideróforos y bacteriocinas, las que no solo incrementan el desarrollo de las plantas, sino que también aseguran el establecimiento competitivo de estas especies bacterianas en la rizosfera (Elmerich et al., 1992). En el caso de Gluconacetobacter, su conocimiento es relativamente reciente, pero su potencialidad es muy grande. La baja utilización de Azospirillum y Azotobacter se debe a las escasas investigaciones en los países tropicales para aprovechar los beneficios que pueden aportar estas bacterias, a pesar de que las condiciones ambientales son más favorables para su establecimiento. Con excepción de Brasil, Cuba y México, muy poco se trabaja con Azospirillum en el mundo tropical, y los estudios sobre Azotobacter se abandonaron prácticamente hace años, con excepción de Cuba e India, como consecuencia de los resultados irregulares que se obtenían en los países templados. Utilizando la técnica de reducción de acetileno, se han reportado ganancias de Nitrógeno en los países templados de 34 Kg N/Ha año en el trigo (Jenkinson, 1976), mientras que en el trópico se obtuvieron valores de 876 Kg N/Ha/año en raíces de maíz y de Digitaria decumbens (von Bulow y Döbereiner, 1975; Döbereiner y Day, 1976). Estos datos demuestran la importancia que tiene la aplicación de los procesos de fijación biológica del Nitrógeno atmosférico para la Agricultura Tropical.

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Tabla 7

Biofertilizante Cultivo

Limitaciones técnicas

Limitaciones Uso por los socio-económ. agricultores

Leguminosas de granos Leguminosas de aceite Leguminosas forrajeras

Baja calidad del inóculo. Bajo Fósforo en el suelo

Pobre infraestructura. Poco conocimiento por los agricultores

Azolla

Arroz

Mantenimiento del inóculo. Bajo Fósforo. Calor, plagas y enfermedades

Pobre infraestructura

Cianobacterias

Arroz

Bajo Fósforo. Malezas

Falta de tecnología

+/-

Azospirillum

Gramíneas

Pobre inóculo

Poco conocimiento por los agricultores

+/-

Azotobacter

Todos los cultivos

Pobre inóculo

Poco conocimiento por los agriculores

+/-

Glucon Acetobacter

Caña de azúcar y otros cultivos

Conocimiento muy reciente

Poco conocimiento por los agricultores

+/-

Rhizobium y Bradyrhizobium

XXX

Biofertilizantes fijadores de N2, limitaciones y uso por los agricultores

XXX X X

XXX = amplio uso X = uso intermedio +/- = más o menos

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Influencia de los factores ambientales sobre la fijación biológica de N2

Un número de factores ambientales gobiernan la magnitud de la fijación, en dependencia de las características físicas y químicas del agroecosistema. En primer lugar, los microorganismos fijadores tienen también la habilidad de utilizar amonio, nitratos y algunas otras formas combinadas de Nitrógeno. Las sales de amonio son usadas con preferencia, y muchas veces en mayor cantidad que el N2, por lo que la presencia de amonio inhibe la fijación, es decir, que los microorganismos utilizan el Nitrógeno combinado en vez del N2 de la atmósfera. Döbereiner (1987) demostró que la fijación se reduce en suelos brasileños que han sido fertilizados recientemente. En Madagascar se puso de manifiesto la reducción en 60% de la población de Azospirillum en raíces de arroz con la aplicación de fertilizante nitrogenado (Boddey et al., 2006). Pero el estudio más completo, utilizando técnicas de análisis de ADN, fue realizado por Tan et al. (2003), los que reportaron una rápida disminución en la población de diazotrofos en las raíces de arroz 15 días después de la aplicación de fertilizante nitrogenado de origen industrial. También los compuestos que se transforman en amonio, como urea o nitratos, son efectivos para inhibir la fijación, aunque no todas las aplicaciones de fertilizantes nitrogenados tienen un efecto negativo. Así, en suelos pobres en Nitrógeno, una dosis de 5-10 kg/ha de fertilizante puede estimular la germinación y el crecimiento de las plántulas y la capacidad de fijación y estimulación, lo que se traduce en incrementos del rendimiento (Ma et al.,1998), y 15 kg N/ha de F-nitrogenado en suelos ácidos de muy baja fertilidad (España et al., 2006); mientras que (España et al., 2000) en un vertisol del Estado Guárico, aplicó 20 Kg N/ha y logró FBN en soya de 47% mejorando la FBN al utilizar labranza conservacionista. Por estas razones, cuando se quieren aprovechar los beneficios de los organismos fijadores hay que aplicar cantidades reducidas de fertilizantes minerales, por lo menos hasta que se hayan establecido los organismos inoculados y estén cumpliendo con su actividad fijadora. Aunque muchas sustancias inorgánicas son necesarias para el desarrollo de los microorganismos, solamente unas pocas de ellas están directamente implicadas en el metabolismo del N2, es decir, que son indispensables para que se efectúe el proceso. Así, la falta de Molibdeno, Hierro y Calcio es crítica y puede inhibir la capacidad de fijación.

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En el caso de algunos organismos, el Vanadio puede reemplazar al Molibdeno, aunque nunca es igualmente efectivo. En los suelos ácidos de sabanas hay que aplicar dosis bajas de Mo (0,2 Kg.ha-1 para lograr la fijación de nitrógeno en leguminosas de grano y forrajeras (López et al., 2006), para poder lograr una eficiente fijación. Algunos fijadores, como los pertenecientes al género Azotobacter, son muy sensibles a las altas concentraciones de hidrogeniones. Por eso, la ausencia de estos fijadores en determinados suelos está asociada directamente con el pH. Investigaciones de carácter ecológico han puesto de manifiesto que el 100% de los suelos con pH entre 7 y 8 contienen Azotobacter mientras que se encuentran en el 80% de los suelos con pH entre 6 y 7, en el 20 % de los que tienen pH entre 5 y 6 y en menos de 10% con pH entre 4.5 y 5. Por debajo de pH 4.5 no se encuentra la bacteria (Alexander, 1977). En un estudio hecho en suelos arenosos de Cuba, con pH inferiores a 5, no fue posible aislar ninguna cepa de Azotobacter (Martínez Viera et al., 1968). La humedad, en general, limita la vida microbiana del suelo, por lo que su exceso o defecto influye directamente sobre las poblaciones de los diazotrofos. En el caso de exceso de humedad, se reduce la aireación y las poblaciones microbianas disminuyen. Sin embargo, algunas especies de bacterias fijadoras de Nitrógeno pueden resistir prolongados períodos de sequía y han sido aisladas de muestras que se han conservado secas durante tiempos largos (Moreno et al., 1986). Esta resistencia se debe a que algunos géneros como Azotobacter y Azospirillum son capaces de formar quistes que permiten una larga supervivencia. La aireación probablemente ejerce un mayor efecto sobre el desarrollo de la mayoría de los diazotrofos, en comparación con otros microorganismos no fijadores. A pesar de esto, la mayor parte de los diazotrofos aeróbicos funcionan mejor a reducidas concentraciones de O2, debido a la sensibilidad del complejo nitrogenasa (Postgate, 1990). En general, la rizosfera contiene numerosos ecositos con bajo pO2, los que constituyen habitats favorables para las bacterias fijadoras (Zuberer, 1990). Importancia del Fósforo para la fijación de N2

Después del Nitrógeno, el fósforo es el elemento más necesario para la vida y no es sustituible en los sistemas biológicos. Es uno de los principales constituyentes de los

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ácidos ribonucléico y desoxiribonucléico y del ADN; es el portador de energía de la molécula adenosina trifosfato (ATP) y de sus dos precursores mono y difosfato (AMP y ADP). Su presencia en las moléculas de ADN de los cromosomas permite los procesos de almacenamiento, replicación y, junto con el ARN, la transcripción de información genética. En el caso de las plantas, el fósforo tiene que existir en el suelo en formas asimilables en cantidades suficientes, ya que, además de los papeles citados en el párrafo anterior, actúa en los procesos de fotosíntesis, respiración, almacenamiento y transferencia de energía, permite la división celular y participa en otros procesos, tales como la fecundación de las flores (Wilcox, 1996). La cantidad total de fósforo en la biomasa vegetal se ha calculado en 1805 millones de toneladas, considerando un contenido de 0.1%; de esta cantidad, se ha estimado una transferencia al suelo como componente orgánico de 136.4 millones de toneladas por año (Bazilevich, 1974). A pesar de estas reservas, gran parte del elemento es inmovilizado en formas no accesibles para las plantas, además de que se pierde una parte importante por lixiviación de iones fosfato y por la erosión del suelo. Lo mismo ocurre cuando se aplica fertilizante fosfórico, del cual las plantas aprovechan solo una mínima porción, especialmente en los suelos tropicales. Un requerimiento fundamental para la fijación de N2 es la presencia de Fósforo asimilable, ya que las bacterias deben asimilar por lo menos 1 mg de Fósforo por cada 5 a 10 mg de N2 que se fijan (Alexander, 1977). Debido a esta necesidad, se obtienen los elevados incrementos de los rendimientos que se mostrarán más adelante, en el capítulo correspondiente, cuando se hable de los biofertilizantes mixtos a base de fijadores de nitrógeno y solubilizadores de fósforo. La acción limitadora de la falta de fósforo se debe a que este elemento tiene un efecto fundamental en el intercambio del carbono, en la multiplicación de las bacterias y en el mismo proceso de fijación. Entre los muchos trabajos que se han efectuado para conocer las cantidades de este elemento que deben existir para garantizar un proceso de fijación efectivo, se ha demostrado que las leguminosas requieren un mínimo de 30 kg/ha para que pueda efectuarse la simbiosis (Weber, 1996). Pero las especies vegetales difieren en su capacidad para asimilar fósforo, especialmente cuando el contenido del elemento asimilable en el suelo es bajo, aunque muchos de ellos contienen considerables reservas que están

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fijadas en formas inutilizables. Por eso es importante aplicar la inoculación al suelo de organismos solubilizadores de fósforo, para garantizar que el elemento esté disponible en el proceso de fijación (Sanginga, 2003). En el caso de la solubilización del fósforo inorgánico, el principal mecanismo microbiológico que permite la movilización del compuesto insoluble consiste en la síntesis de ácidos orgánicos en el medio, tales como fórmico, acético, propiónico, glucónico, láctico, glicólico, fumárico y succínico. Otros microorganismos sintetizan ácidos inorgánicos que tienen la misma acción, formando quelatos con Calcio o Hierro que traen como consecuencia la efectiva solubilización (Oswald y Bhide, 1977; Gaur y Ostwald, 1977). Por ejemplo, el Ca3 (PO4)2, insoluble, se transforma en fosfato dibásico o monobásico solubles, lo que trae como consecuencia un aumento de la disponibilidad para las plantas. La cantidad de fósforo solubilizado varía de acuerdo con el consumo de carbohidratos por los microorganismos solubilizadores, que deben tener la capacidad para convertir el sustrato carbonatado en ácidos orgánicos. Algunas bacterias pueden liberar SH2, el cual reacciona con el FePO4 y produce SFe, liberando el ión fosfato. Otra vía, que predomina en los suelos anegados como los arrozales, consiste en reducir el Fe del FePO4 y la liberación de Fe soluble, con la consiguiente liberación del ión fosfato en la solución. Este aumento de la disponibilidad de fósforo en los suelos anegados puede explicar la menor necesidad de fertilizante fosfórico en los campos de arroz bajo agua, en comparación con los secos. En suelos tropicales gran parte del fósforo se encuentra en forma orgánica (Dalal, 1977), lo cual afecta la producción optima de los cultivos y la fijación eficiente de nitrógeno, debido a que las plantas no pueden utilizar el P-orgánico directamente (Tate, 1984), en estas condiciones la actividad de enzimas fosfatas juegan un importante papel, ya que pueden hidrolizar el P-orgánico a P-inorgánico (Beck et al, 1989) y hacer disponible el fósforo a las plantas, beneficiando el proceso de fijación biológica de nitrógeno (FNB). La actividad de fosfatasa en el suelo proviene de muchas fuentes, incluyendo las plantas (Dinkelaker y Marschner, 1992), los hongos (Tarafdar et al, 1988); hongos micorrizícos (Tarafdar y Marschner, 1994) y bacterias (Tarafdar y Claassen, 1988). En el caso de la solubilización del fósforo orgánico, el proceso se desarrolla mediante la síntesis de enzimas fosfatasas por los microorganismos, las cuales separan el P de los sustratos orgánicos. Con esta actividad, se puede aportar a las plantas entre 30-60% de sus necesidades del elemento, en dependencia de la capacidad del microorganismo.

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Métodos para medir la fijación de nitrógeno

Se han desarrollado muchos métodos para estimar de forma cualitativa y cuantitativa el nitrógeno fijado en condiciones de campo (Unkovich y Pate, 2000; Hardarson y Craig, 2003). Así, en condiciones en que el rendimiento está limitado por la falta del elemento en el suelo, la materia seca producida por una especie vegetal en asociación fijadora está correlacionada estrechamente con la cantidad de nitrógeno fijado. De la misma manera, el número y la masa de los nódulos de las leguminosas pueden suministrar una idea del nivel de fijación. Una apreciación visual del contenido de leghemoglobina de los nódulos mediante el grado de pigmentación roja también da buenos elementos sobre la efectividad de la asociación. Un estimado más directo se obtiene mediante el análisis del contenido de nitrógeno del material cosechado, en comparación con el material procedente de una parcela del mismo suelo donde no ha habido fijación. Un método más sofisticado consiste en determinar la actividad nitrogenasa mediante la medición de la reducción del Acetileno a Etileno o de la evolución de Hidrógeno, utilizando la cromatografía gaseosa. Estas técnicas se utilizan sobre todo para medir la actividad de fijación en un momento dado, pero son inadecuadas para conocer la cantidad de nitrógeno fijado en un período de crecimiento del cultivo, si se considera que en este período hay diferentes variables que afectan directamente a la actividad nitrogenasa (Broughton et al., 2003). También se han desarrollado métodos que cuantifican la translocación del Nitrógeno fijado desde los nódulos a otras partes de las plantas, como son análisis colorímétricos de los ureidos (alantoína y ácido alantóico) contenido en el xilema; si se toma en cuenta que el nitrógeno del suelo es asimilado en las raíces como aminoácidos y no como ureidos, la proporción de estos últimos en el xilema representa la contribución del N2 fijado (Herridge y Rose, 2000). Pero los métodos basados en el uso de isótopos ofrecen las mediciones más exactas de la fijación durante todo el período de crecimiento de un cultivo en condiciones de campo. Se utilizan plantas fijadoras y no fijadoras en suelo que ha sido enriquecido con 15 N mediante la adición de fertilizante marcado. La medición de la extensión en la cual el cultivo fijador diluye el 15N tomado del suelo conduce al conocimiento de la cantidad del elemento que se ha fijado, por diferencia en base a los datos obtenidos del cultivo no fijador (Hardarson y Danso, 1993). Este método permite conocer las cantidades de N2 fijado en distintos períodos después de la siembra.

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Importancia económica de la aplicación de los biofertilizantes a base de bacterias fijadoras de N2

La mayor parte de las biotecnologías que se han desarrollado para los inoculantes bacterianos no están siendo utilizadas en gran escala, debido a una serie de prejuicios basados en la inconsistencia de los resultados obtenidos en las condiciones de clima templado, donde se han realizado la mayor parte de las investigaciones que generan las publicaciones más importantes y de más amplia divulgación. Pero estos prejuicios no se justifican en las condiciones tropicales, con temperaturas constantemente favorables y con una alta fijación de Carbono que alcanza hasta 20 t/ha/año (Debinstein,1970), lo que garantiza la presencia de altas poblaciones de microorganismos en la zona rizosférica de las plantas. En general, se han generado grandes contradicciones entre los resultados logrados con la aplicación de estos bioproductos en condiciones templadas y tropicales, lo que ha sido manejado de forma negativa por los grandes monopolios que fabrican y distribuyen los productos agroquímicos, con el fin de aplazar lo más posible la introducción en gran escala de los biofertilizantes. En tiempos pasados relativamente recientes, los subsidios para comprar fertilizantes industriales, tanto en países desarrollados como subdesarrollados, quitaban el estímulo para utilizar los biofertilizantes y bioestimuladores, por lo que en muchos países las investigaciones aplicadas en este campo eran escasas. Sin embargo, al desaparecer estos subsidios como resultado de las nuevas políticas económicas gubernamentales, estos bioproductos se hacen más atractivos y aceptables para los agricultores. De acuerdo con los datos que se han presentado en párrafos anteriores, el uso de los productos biológicos constituye una necesidad económica y ecológica. Puede decirse que se está viviendo el momento internacional más favorable para el desarrollo de las investigaciones básicas y aplicadas sobre microorganismos con características como biofertilizantes y bioestimuladores y para su utilización.. Desde un punto de vista económico, la importancia de la aplicación de los biofertilizantes y los bioestimuladores es muy grande. En la tabla 8, y a pesar de que los datos no son actualizados, se ponen de manifiesto las grandes posibilidades que están a nuestro alcance para sustituir por medios biológicos el nitrógeno del suelo tomado por los cultivos o perdido por lixiviación, volatilización o denitrificación (Martínez Viera, 1986).

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En esta tabla, si no se toman en consideración los datos correspondientes a Gran Bretaña, con una superficie muy inferior a la de otros países, puede verse que, en Australia, donde la fijación biológica es explotada al máximo, hasta el punto de que constituye un modelo para el mundo, hay un aporte total de nitrógeno muy similar al de Estados Unidos, con la diferencia de que, en Australia, el fertilizante químico representa solo 0.7% del total, mientras que en Estados Unidos alcanza 32%. En la India, el aporte de Nitrógeno es muy bajo, pero el 60% se realiza mediante la fijación biológica. En lo que se refiere a las superficies aplicadas con biofertilizantes, se deduce de la tabla que en Australia se aplican sobre la casi totalidad de la superficie agrícola y en Estados Unidos sobre una parte importante de esta superficie. En la India existen 69 fábricas de biofertilizantes que se aplican sobre leguminosas, oleaginosas, arroz y gramíneas en general, hortalizas y otros cultivos que incluyen viveros forestales; en 1995 se aplicaron en ese país 1.107 toneladas de inoculantes a base de Rhizobium y Bradyrhizobium (Chandra et al., 1996). En China se inoculan 6 millones de hectáreas de soya, 2.3 millones de maní y 1 millón de no leguminosas (Cheng Tin Wey, 1997). En Brasil se cultivan 13 millones de hectáreas de soya, con una producción media de 2,4 t/ha; sobre esta superficie no se aplica fertilizante nitrogenado, sino biofertilizante (Hungría et al., 2000). Entre los impactos de la Biotecnología en Cuba, se encuentra la disminución del uso de los fertilizantes de origen industrial, que se han sustituído por fertilizantes biológicos. En ese país se utilizan hoy 11 veces menos fertilizantes inorgánicos que en los años 90, lo que constituye un ejemplo de años de labor y resultados del trabajo cientí científico (Borroto, 2005). Para que se tenga una idea de los beneficios económicos que pueden lograrse con la aplicación efectiva de los biofertilizantes y bioestimuladores, puede ponerse el ejemplo Tabla 8 Aporte estimado de nitrógeno a los cultivos agrícolas en distintos países (expresado en millones de toneladas)

Fuente de Nitrógeno Gran Bretaña Fijación simbiótica 0.4 Fijación asociativa 0.05 Fertilizantes 0.6 Total 1.05

USA 8.6 1.4 4.9 14.9

Australia 12.8 1.0 0.1 13.9

India 0.9 0.7 1.2 2.8

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de la fijación de Nitrógeno atmosférico en la caña de azúcar en Brasil, donde hay unas 2.5 millones de hectáreas dedicadas a este cultivo. Si se calcula un modesto rendimiento promedio de 70 t/ha y 10% de materia seca con un contenido de 1.4% de Nitrógeno, del cual 15% procede de la fijación atmosférica por las bacterias que viven normalmente en el suelo y por las bacterias endofíticas, resultará que en la superficie cañera de Brasil se fijarán unas 43.000 toneladas de Nitrógeno, que representan un ahorro no menor de 20 millones de USD. Esta fijación es natural y gratuita, y demuestra que todos los incrementos en los aportes de Nitrógeno que puedan lograrse por la aplicación efectiva de los biofertilizantes tienen un elevado valor económico (Urquiaga et al., 2001). También en el caso de Brasil, considerando el rendimiento promedio que se obtiene en soya sobre una superficie de 13 millones de hectáreas, que asciende a 2 400 kg/ha y tiene un contenido de Nitrógeno en los granos de 6.5%, puede decirse que se exportan anualmente del sistema suelo-planta 169 kg/ha del elemento. Si se asume que en los residuos del cultivo se encuentran 60 kg/ha de Nitrógeno, puede concluirse que la soya acumula en el año 230 kg/ha del nutriente, sin aplicar fertilizante. De estos resultados se deduce que la fijación biológica del Nitrógeno, solo en el caso de la soya, le representa a Brasil una economía de fertilizante equivalente a 1 500 millones de USD (Urquiaga et al., 2001). Vose et al. (1982) calcularon que una ganancia de solo 10% de Nitrógeno por los cultivos mediante la fijación biológica debida a la aplicación de estos inoculantes representaría 3 mil millones de dólares anualmente si ocurriera en todas las áreas cultivadas del mundo. Igualmente, en la India se ha calculado que si en aquel país se aumentaran solamente 10 kg/ha de Nitrógeno mediante la fijación biológica aportada por estos bioproductos, el valor económico sería de 55 millones de USD (Subba Rao, 1982). Todo lo que se ha expuesto demuestra la importancia ecológica y económica del uso de los biofertilizantes y bioestimuladores. En un gran número de países se trabaja actualmente por incrementar los niveles de aplicación con notable éxito, y los beneficios económicos que se obtienen con la generalización de las nuevas tecnologías se van aproximando con rapidez a las potencialidades que han sido calculadas por diversos autores.

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Capítulo 4

Estimulación del desarrollo de las plantas por las bacterias fijadoras de nitrógeno atmosférico

Sustancias reguladoras del crecimiento vegetal

El desarrollo de los seres vivos se realiza mediante cambios que ocurren en el crecimiento y diferenciación de células, tejidos y órganos. En el caso de las plantas, la integración del crecimiento en distintos órganos y la coordinación del desarrollo entre ellos debe ser regulada por un grupo de hormonas, que pueden ser definidas como sustancias orgánicas naturales que influyen sobre los procesos fisiológicos en bajas concentraciones. La síntesis de estas sustancias puede ser localizada o puede ocurrir dentro de varios tipos de tejidos y células. Algunas veces pueden ser transportadas, pero en la mayor parte de los casos actúan en los tejidos o células donde son sintetizadas. A diferencia de las hormonas animales, cuyo efecto es específico, una hormona vegetal puede inducir varias respuestas diferentes, en dependencia del tipo de tejido o célula donde actúa. La magnitud de la respuesta puede depender de muchos factores, tales como la concentración activa, la especie vegetal, la sensibilidad del tejido, la estabilidad y las interacciones con los microorganismos. Por todas estas razones, el término hormona vegetal ha sido sustituído por el de sustancia del crecimiento vegetal o reguladora del crecimiento vegetal y se identifican actualmente como PGRs (Plant Growth Regulators). De acuerdo con Arshad y Frankenberger (1993), cuando estas sustancias son sintetizadas de forma endógena por las plantas deben llamarse hormonas vegetales, mientras que el término PGR incluye muchos compuestos naturales y sintéticos, ya que las plantas pueden responder a las aplicaciones exógenas durante ciertas etapas de crecimiento y bajo determinadas condiciones de cultivo. Según Nieto y Frankenberger (1990), el descubrimiento de las sustancias reguladoras del crecimiento vegetal ocurrió en los trabajos realizados por Darwin sobre el fototropismo de los coleóptilos de las gramíneas, en los cuales se determinó que una señal transportada era responsable de la curvatura inducida en la planta por un estílmulo

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luminoso. El mensajero químico relacionado con este proceso fue aislado por primera vez por F. W. Went en 1928 y se le llamó auxina, palabra procedente de la griega auxein, que significa crecer. A partir de entonces, se han descubierto e identificado otras varias sustancias reguladoras del crecimiento vegetal, entre las cuales han sido las más estudiadas las siguientes: auxinas, giberelinas, citoquininas, ácido abscísico y etileno y, más modernamente, ácido jasmónico. Estas sustancias no actúan solas, sino en conjunción u oposición unas con otras. La acción final sobre el crecimiento y diferenciación de una planta representa el efecto neto de un balance hormonal. También las acciones que pueden ocurrir dependen de la concentración; así, si ésta es baja, una sustancia puede ser estimuladora, pero si es alta puede ser inhibidora. Hay microorganismos que son capaces de sintetizar estas sustancias biológicamente activas y, como resultado de la estrecha relación que existe entre los microorganismos rizosféricos y la superficie de las raíces, la producción exógena de PGRs por parte de aquellos afecta el crecimiento de las plantas. Este suministro exógeno puede representar cantidades suplementarias a los niveles endógenos de las plantas o puede alterar la capacidad de síntesis de las plantas y el metabolismo de otros PGRs dentro del sistema. La productividad de los cultivos puede ser mejorada mediante la manipulación de los microorganismos rizosféricos que tienen la capacidad de sintetizar sustancias activas promotoras del crecimiento vegetal, además de que pueden modificar la fertilidad del suelo y facilitar el establecimiento de las plantas. En el caso de las bacterias que poseen esta capacidad, aunque muchos hongos también la poseen, se las ha incluído en un grupo que se conoce como Rizobacterias Promotoras del Crecimiento Vegetal, más comúnmente llamadas PGPR (Plant Growing Promoting Rhizobacteria), Algunas de estas bacterias han sido llamadas también Rizobacterias Promotoras de la Emergencia o EPR (Emergency Promoting Rhizobacteria), ya que este efecto es de gran valor al estimular la emergencia de las plantas en suelos con pobre estructura, como los de las zonas áridas y semi-áridas (Requena et al., 1997).

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Mecanismos de estimulación del crecimiento por parte de las bacterias fijadoras de Nitrógeno

Las bacterias fijadoras de Nitrógeno, especialmente las que lo hacen de forma asociativa, sintetizan sustancias activas reguladoras del crecimiento de las plantas, por lo cual son consideradas también como PGPR, e incluso en numerosas publicaciones se concede mayor importancia a esta actividad que a la fijadora.por parte de estas bacterias. Así, en cultivos a los que se aplicó todo el Nitrógeno que necesitaban, Kapulnik et al. (1985) y Sarig et al. (1990) incrementaron el desarrollo y el rendimiento de maíz, sorgo y trigo inoculando Azospirillum y Kloeppper et al. (1994) lograron aumentar 30% el rendimiento del trigo con la inoculación de Azotobacter chroococcum. Se conocen dos tipos de mecanismos mediante los cuales las bacterias fijadoras de Nitrógeno actúan como PGPR, uno de acción directa y otro de acción indirecta (Glick, 1995). El primero consiste en la síntesis de fitohormonas y de algunas enzimas, tales como la deaminasa ACC, las cuales modulan el nivel de las hormonas en las plantas; el segundo se manifiesta en la reducción de la acción perjudicial de los organismos fitopatógenos mediante la síntesis de sideróforos y antibióticos por parte de las bacterias (Rodríguez y Fraga, 1999), efecto que se demuestra más adelante, en los casos de A. chroococcum y Azospirillum brasilense, en la Tabla 23. El género bacteriano más importante en lo que se refiere a la síntesis de hormonas vegetales, entre los fijadores de Nitrógeno, es Azotobacter, como se pone de manifiesto en la Tabla 9, confeccionada a partir de datos de Arshad y Frankenberger (1993). Debido a que no se han reportado microorganismos fijadores capaces de sintetizar etileno ni ácido abscísico no se incluyen estos PGRs en la tabla. El conjunto de estas sustancias, que son asimiladas por las plantas a través de las raíces, permite que cada una de ellas actúe en el momento en que la planta lo requiera; así, algunas estimulan el desarrollo de las raíces o el de la planta entera; otras aumentan la floración o reducen el aborto floral; por último, algunas posibilitan que el fruto se forme y madure en un tiempo menor. Todos estos efectos permiten el desarrollo más precoz de plantas más vigorosas y el incremento del rendimiento en niveles superiores a los que se obtienen en los países de clima templado.

capítulo 4. estimulación del desarrollo de las plantas por las bacterias fijadores de nitrógeno atmosférico

Tabla 9

Auxinas Número de especies bacterianas sintetizadoras: 68 Géneros más importantes: Pseudomonas (10 especies) Bacillus (9) Arthrobacter (8) Azotobacter (6) Número mero de especies ffúngicas sintetizadoras: 56 Géneros más importantes: Penicillium (12 especies) Fusarium (7) Giberelinas Número de especies bacterianas sintetizadoras: Géneros más importantes: Número mero de especies ffúngicas sintetizadoras: Géneros más importantes:

21 Azotobacter (5 especies) Bacillus (4) Pseudomonas (3) 15 Fusarium (5 especies)

Citoquininas Número de especies bacterianas sintetizadoras: Géneros más importantes: Número mero de especies ffúngicas sintetizadoras: Género más importante:

21 Azotobacter (4 especies) Pseudomonas (3) 24 Taphrina (4)

Microorganismos productores de hormonas vegetales

la fijación biológica del nitrógeno atmosférico en condiciones tropicales

Síntesis de auxinas por las bacterias fijadoras

En el caso de las auxinas, el ácido indol-3-acético (IAA) es el compuesto más activo y el principal en la mayor parte de las especies vegetales, y es sintetizado a partir de triptófano en los tejidos meristemáticos de las hojas jóvenes, flores, semillas y frutos. Las principales funciones que se atribuyen a las auxinas incluyen el alargamiento y la división celular, la iniciación de las raíces, respuestas tropísticas y dominancia apical. Como se deduce de la Tabla 9, hay un gran número de microorganismos que son capaces de sintetizar auxinas en cultivo puro y en el suelo, y se considera que aquellos que se encuentran en la rizosfera y el rizoplano las sintetizan con más facilidad que los habitantes del suelo libre, aunque todos necesitan la presencia de un precursor como triptófano, el cual se encuentra entre los aminoácidos que son liberados por las raíces. En la Tabla 10 se muestran las especies de bacterias fijadoras de Nitrógeno que son capaces de sintetizar distintas auxinas. El hecho de que no aparezcan otras especes en la lista no significa que no sean capaces también de prducirlas, sino que no han sido estudiadas.

Tabla 10 Auxinas sintetizadas por bacterias fijadoras de Nitrógeno

Auxina

Especie bacteriana

Ácido indolacético Ácido indolcarboxílico Ácido indolpirúvico Ácido indol-láctico Indolacetamina Heteroauxina

Azospirillum brasilense Azospirillum lipoferum Azotobacter beijerinckii Azotobacter chroococcum Azotobacter paspali Azotobacter vinelandii Gluconacetobacter diazotrophicus Rhizobium leguminosarum Rhizobium meliloti Rhizobium phaseoli Rhizobium trifolii

Frankia spp Azospirillum brasilense Rhizobium leguminosarum Rhizobium trifolii Rhizobium leguminosarum Rhizobium trifolii Azospirillum brasilense Azospirillum lipoferum Azotobacter chroococcum Azotobacter agile

capítulo 4. estimulación del desarrollo de las plantas por las bacterias fijadores de nitrógeno atmosférico

Puede verse la gama de auxinas sintetizadas por las bacterias de los géneros Azospirillum, Azotobacter y Rhizobium, destacándose las especies Azospirillum brasilense, Rhizobium leguminosarum y R. trifolii, con tres auxinas cada una, y Azospirillum lipoferum y Azotobacter chroococcum con dos. En el caso de las especies de Rhizobium, las auxinas que sintetizan promueven la formación de raíces laterales en las leguminosas e inhiben su elongación, dando origen a los nódulos. Sin embargo, las auxinas solas no influyen en la diferenciación vascular, por lo que estas bacterias liberan también citoquininas en la superficie de las raíces o en los filamentos de infección que, junto con las auxinas, estimulan la división celular en la corteza. En raíces de leguminosas no inoculadas o en suspensiones de Rhizobium phaseoli sin la presencia de la leguminosa no se han detectado cantidades significativas de citoquininas (Nieto y Frankerberger, 1990). Es decir, que la asociación entre auxinas y citoquininas es una consecuencia de la simbiosis bacterias-plantas. También se ha observado que la presencia de altas poblaciones de Azospirillum brasilense en las raíces de las gramíneas afecta marcadamente el desarrollo de las plantas por la presencia de auxinas sintetizadas por las bacterias (Barbieri et al., 1988). En la Figura 1 se muestra la influencia de la inoculación con distintas cepas de Azotobacter sp.sobre el desarrollo de las raíces de plántulas de tomate. En la figura se distingue el efecto de las distintas cepas y se pone de manifiesto que algunas de ellas no ejercen influencia sobre el desarrollo de las raíces, lo que puede atribuirse a que no son capaces de sintetizar PGRs. Otras cepas, en cambio, muestran una alta efectividad. Figura 1 Efecto estimulador e inhibidor de distintas cepas de Azotobacter sp. sobre el desarrollo de raices de tomate

la fijación biológica del nitrógeno atmosférico en condiciones tropicales

Síntesis de giberelinas por las bacterias fijadoras

Las giberelinas (GAs) son las fitohormonas menos estudiadas como metabolito microbiano en el sistema suelo-planta. La falta de información se debe a que existen muchas dificultades para su detección analítica. En las plantas, estas hormonas son sintetizadas a partir del ácido mevalónico en los brotes, semillas en desarrollo y raíces. Estimulan el desarrollo del tallo, inducen la germinación de las semillas, el desarrollo de los frutos y la inducción de flores en las plantas dióicas. En el caso de los microorganismos, ha sido reportada su presencia en un número limitado de bacterias y hongos. En la Tabla 11 pueden verse las especies de bacterias fijadoras de Nítrógeno que han demostrado su capacidad para sintetizar GAs. El hecho de que la mayor parte de las bacterias fijadoras aparezcan como capaces de sintetizar solamente GA3 puede deberse a la falta de estudios para detectar otra GA. En el caso de Rhizobium phaseoli se reportan en la tabla 4 giberelinas (Atzorn et al., 1988),

Tabla 11 Giberelinas sintetizadas por bacterias fijadoras de Nitrógeno

Giberelina

Especie bacteriana

GA1

Azospirillum lipoferum Rhizobium phaseoli

GA3

Azospirillum brasiliense Azospirillum lipoferum Azotobacter sp. Azotobacter beijerinckii Azotobacter chroococcum Azotobacter paspali Azotobacter vinelandii Gluconacetobacter diazotrophicus Rhizobium phaseoli Frankia sp.

GA4

Rhizobium phaseoli

GA9

Rhizobium phaseoli

capítulo 4. estimulación del desarrollo de las plantas por las bacterias fijadores de nitrógeno atmosférico

pero quizás con esta bacteria los estudios fueron más profundos que con las demás debido a las dificultades que se señalaron antes. Síntesis de citoquininas por las bacterias fijadoras

Las citoquininas constituyen uno de los mayores grupos de hormonas del crecimiento vegetal sintetizadas por las plantas y microorganismos. Se han identificado 50 citoquininas y sus metabolitos y, de ellas, las más activas son los derivados de la adenina. El efecto principal de estas sustancias consiste en promover la formación de flores y frutos con mayor desarrollo y aumentar los rendimientos. En la Tabla 12 se presentan las bacterias fijadoras de Nitrógeno capaces de sintetizar algunas de las citoquininas más importantes. Tabla 12

Citoquinina

Especie bacteriana

Isopentenil adenosina

Azospirillum brasiliense Rhizobium japonicum Rhizobium leguminosarum

Isopentenil adenina

Azospirillum brasilense Azotobacter beijerinckii Azotobacter chroococcum Azotobacter paspali Azotobacter vinelandii Gluconacetobacter diazotrophicus Rhizobium japonicum Rhizobium leguminosarum Rhizobium phaseoli

Cis zeatina

Azospirillum brasilense Azotobacter chroococcum Rhizobium japonicum

Zeatina ribósido Trans zeatina Dihidrozeatina ribósido

Azotobacter chroococcum Azotobacter chrococcum Azotobacter chroococcum

Citoquininas sintetizadas por bacterias fijadoras de Nitrógeno

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Como se observa, la mayor parte de las especies que aparecen en esta tabla son también capaces de sintetizar auxinas y giberelinas (Tablas 10 y 11). La especie que mayor número de citoquininas sintetiza es Azotobacter chroococcum (6), por lo cual es necesario poner énfasis en esta bacteria, aunque también Azospirillum brasilense tiene un papel destacado. Sustancias activas sintetizadas por Azotobacter chroococcum

Estudios realizados con diferentes cepas de A. chroococcum que han sido aisladas en diferentes condiciones edafoclimáticas han permitido conocer que esta bacteria sintetiza una amplia gama de sustancias biológicamente activas que estimulan el desarrollo y el rendimiento de los cultivos económicos. En las Tablas 13, 14 y 15 se presentan los resultados obenidos en los estudios que se han realizado con cepas aisladas de suelos de Cuba con el fin de conocer su capacidad para sintetizar diversas sustancias activas (Dibut, 2000). Las concentraciones que aparecen en la tabla 13 pueden considerarse elevadas. También en las bacterias del género Azospirillum se han señalado altas concentraciones de vitaminas. Así, Rodelas (2001) reportó una síntesis de tiamina ascendente a 50-100 mg/g de materia celular seca y de ácido nicotínico equivalente a 200-600 mg/g de materia celular seca. Puede observarse una gama de 14 aminoácidos y una concentración muy alta de muchos de ellos.

Tabla 13 Producción de vitaminas por A. chrococcum cepa INIFAT-12

Vitamina Tiamina Riboflavina Piridoxina Ácido Fólico

Concentración (mg/100 mL) 5.7 44.0 18.0 3.5

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Los valores que se muestran en la tabla 15 son elevados. Por lo general, en el caso de síntesis de fitohormonas es superior la gama y la concentración que es capaz de producir una cepa aislada de un suelo tropical en comparación con otra cepa de la misma especie aislada de un suelo templado. Así, por ejemplo, en lo que respecta a la actividad citquinínica relativa a Kinetina fue de 4.4 mg/L en el caso de una cepa aislada de un suelo templado (González-López et al., 1986) y de 32.5 mg/L en la aislada del suelo tropical (Tabla 15). Tabla 14

Aminoácidos

Concentración en proceso de fermentación (n mol./ mL).

Acido aspártico Serina Glicina Valina Isoleucina Ácido Glutámico Ornitina Glisina Arginia Treonina Leucina Fenilalanina Prolina Tirosina

71.05 61.05 127.35 38.70 20.05 82.15 0.83 9.40 4.45 58.80 35.95 66.55 60.60 2.87

Concentración total

Producción de aminoácidos por la cepa INIFAT-12 de Azotobacter chroococcum

728.90 Tabla 15

Tipo de sustancia reguladora Actividad (mg/L) Actividad Auxínica (Eq. AIA) Actividad Giberélica (Eq. A3 G) Actividad Citoquinínica (Eq. Kinetina)

14.47 30.20 32.50

Producción de PGRs por A. chroococcum cepa INIFAT-12

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La síntesis de esta amplia variedad de sustancias activas por parte de las bacterias fijadoras de Nitrógeno hace que tengan un efecto positivo marcado desde las primeras etapas del desarrollo de la planta, independientemente del suministro de Nitrógeno que son capaces de aportar. Esto se pone de manifiesto desde el estadío de emergencia de las plántulas, como se demuestra en la Tabla 16, en la que se presenta la actividad ETP de una cepa de Azotobacter sp. aislada de un suelo de Venezuela sobre la emergencia de plantas de maíz (López et al., 2007; en prensa). Se observa en la tabla 16 el efecto estimulador de la emergencia por parte del inóculo preparado a partir de una cepa de Azotobacter, fijadora de Nitrógeno de forma asociativa. Ya a los 4 días después de la siembra había emergido en esta variante el 75% de las semillas sembradas, en comparación con 52% de la variante sin inocular. 2 dias después emergió el 96% de las plantas, mientras en la variante sin inocular había germinado a los 10 días solo el 66%. En el caso del tiempo necesario para la aparición de la primera hoja verdadera se pone también de manifiesto la estimulación de la precocidad en la variante inoculada. El efecto EPR que se pone de manifiesto en la tabla 16 puede deberse, según Noel et al. (1996), al mayor desarrollo de las raíces y del crecimiento del hipocotilo en los primeros estadíos de desarrollo de las plantas, como se puso de manifiesto en la Figura 2, lo cual le confiere una ventaja a estas plantas en una situación crí crítica del desarrollo.

Tabla 16 Porcentaje de plantas de maíz emergidas y tiempo de aparición de la primera hoja verdadera en plantas inoculadas y sin inocular con la cepa Guárico-1 de Azotobacter ssp.

Emergencia de las plántulas (%)

Aparición de la primera hoja verdadera (%) en las plantas emergidas

Variante

4 días

5-10 días

7 días

7-12 días

Sin inóculo Inoculadas

52 75

66 96

63 87

100 100

cap铆tulo 4. estimulaci贸n del desarrollo de las plantas por las bacterias fijadores de nitr贸geno atmosf茅rico

la fijación biológica del nitrógeno atmosférico en condiciones tropicales

Capítulo 5

La fijación simbiótica del nitrógeno

Importancia de la fijación simbiótica

Entre los distintos sistemas biológicos que son capaces de fijar Nitrógeno, la simbiosis Rhizobium-leguminosas contribuye con el mayor aporte del elemento al ecosistema y a la producción de alimentos. Esta simbiosis constituye la asociación más elaborada y eficiente entre las plantas y las bacterias y, por esta razón, ha sido la más estudiada hasta el momento. Ya en el siglo XVI se dibujaron raíces de plantas leguminosas noduladas, aunque el agente causal permaneció desconocido en los tres siglos siguientes. En los suelos ácidos de sabanas venezolanas, (España, et al., 2006), utilizando prácticas agrícolas con principios agroecológicos (rotación de cultivos, uso de roca fosforica, cultivares tolerantes a la acidez, mezcla de abonos orgánicos e inorgánicos en bajas dosis sin encalar), aplicando técnica isotópica 15N encontraron valores de fijación biológica de nitrógeno alrededor de 79%, generando un balance de nitrógeno positivo en el agrosistema, ya que el índice de cosecha de N fue bajo (40%); igualmente encontraron valores de fijación de N entre: 67% y 75%, utilizando leguminosas usadas como abono verde, éstos investigadores reportaron eficiencia de fijación de nitrógeno entre 62 y 72 mg N/pote y utilizando añil (I. lespediciones) la acumulación de N derivado del aire estuvo entre 29 y 40 mgN/pote cuando se uso C. Juncea. Menos del 24% de las aproximadamente 16 500 especies de leguminosas conocidas han sido estudiadas en lo que se refiere a su capacidad para formar nódulos fijadores de N. Sin embargo, se ha determinado que más del 75% de las Caesalpinioideae son incapaces de nodular, mientras que 89% de las Mimosoideae y 96% de las Papilionoideae lo pueden hacer (Pueppke y Broughton, 1999). Si se toma en cuenta que la gran mayoría de las especies de leguminosas que se utilizan en la agricultura convencional pertenecen a las Papilionoideae es posible deducir los grandes beneficios que pueden obtenerse con el manejo adecuado del proceso de fijación simbiótica de N2. Como consecuencia del gran número de estudios que se han realizado en el mundo, hoy se conoce que la contribución de la fijación simbiótica al suministro de Nitrógeno

capítulo 5. la fijación simbiótica del nitrógeno

a las plantas cultivadas depende de la eficiencia de la asociación y de la disponibilidad del elemento en el suelo cuando los factores ambientales son adecuados. La gran importancia de este proceso para los cultivos económicos y el considerable ahorro de fertilizante nitrogenado para los países pobres se pone de manifiesto con los siguientes ejemplos: En un suelo vertisol del sur de Aragua – Venezuela, (España et al., 2000), encontraron valores de FBN en soya de 54% bajo labranza convencional y de 67% aplicando siembra directa mas cincel cada 2 años. Entre las leguminosas forrajeras, Centrosema pubescens nodula profusamente; en esta especie, apropiada para pastos bajos y resistentes a la sequía, se han reportado fijaciones anuales que ascienden a 320 Kg de N/ha. Pero las más elevadas se han encontrado en Leucaena leucocephala, usada extensamente en muchos países, que crece en períodos prolongados de sequía y suministra forraje con 30% de proteínas todo el año, la cual puede fijar anualmente hasta 800 kg de N/ha aunque, cuando las condiciones ambientales o biológicas no son favorables, esta especie no puede alcanzar más del 13% de la fijación que se logra en ambientes más apropiados (Norris, 1972). En lo que respecta a las leguminosas de grano y aceite, en la Tabla 17 pueden verse las cantidades de N2 fijado por las principales especies, a partir de datos ofrecidos por Peoples et al. (1995).

Tabla 17

Especie de leguminosa Garbanzo (Cicer arietinum) Lenteja (Lens culinaris) Haba (Vicia faba) Lupino (Lupinus angustifolius) Soya (Glycine Glycine max max) Maníí ((Arachis Arachis hypogaea) Frijol común (Phaseolus vulgaris) Frijol mungo (Vigna radiata)

Cantidad de N2 fijado (KgN/ha) 3-141 10-192 53-330 32-288 0-450 37-206 0-125 9-112

Estimados experimentales de la cantidad de N2 derivado de la fijación atmosférica por las más importantes leguminosas de grano y aceite

la fijación biológica del nitrógeno atmosférico en condiciones tropicales

Puede observarse en la tabla que el rango de N2 fijado por las leguminosas es muy grande, e incluso hay especies tan importantes como la soya y el frijol que pueden fallar en demostrar su capacidad para establecer la simbiosis en condiciones de producción. Estas variaciones se atribuyen al impacto de factores limitantes que ocurren en el campo, los que disminuyen en gran medida la capacidad de fijación. Aunque en la mayor parte de los suelos del mundo existen bacterias simbióticas de los géneros Rhizobium y Bradyrhizobium, muchos no contienen las específicas para determinados hospederos. Por ejemplo, las vastas áreas naturales de suelos “cerrados” de Brasil no poseen cepas capaces de nodular soya, mientras que algunos suelos de Australia poseen estas cepas, pero son inefectivas (Gibson et al., 1982), por lo que es obligatorio aplicar siempre la inoculación con cepas seleccionadas de estas bacterias. Gracias a un trabajo eficiente en este sentido, actualmente se logran en la región de los “cerrados” rendimientos de grano de soya superiores a los 4 t/ha (Alves et al., 2003). Sin embargo, es interesante señalar que en suelos de Africa los cultivares asiáticos de soya nodularon con algunas cepas nativas pertenecientes a la miscelánea cowpea (Jara et al.,1981). En el caso del frijol, la respuesta a la inoculación en condiciones de campo es variable. Esta es la leguminosa más importante para el consumo humano en América Latina y Brasil es el principal productor, por lo que se utiliza muy extensamente la inoculación con Rhizobium, pero es frecuente encontrar respuestas negativas. Por el contrario, el maní se considera una especie con alta promiscuidad simbiótica, como lo demuestra el hecho de que suspensiones de nódulos colectados de 51 especies de leguminosas silvestres de la India fueron capaces de inducir la nodulación en esta especie ( Martínez Viera,1986). En general, el maní se encuentra siempre bien nodulado en las condiciones naturales, por lo que no hay respuesta a la inoculación. Establecimiento de la simbiosis bacterias fijadoras-leguminosas

Un aspecto fundamental para que se establezca una simbiosis efectiva consiste en la especificidad entre las bacterias y las plantas hospederas, la cual ocurre en tres niveles: la habilidad para formar nódulos, la eficiencia para fijar nitrógeno y el grado en que la fijación simbiótica provee a la planta de sus requerimientos del elemento. Durante muchas décadas, todas las bacterias capaces de inducir la formación de nódulos en las leguminosas fueron clasificadas dentro del género Rhizobium. Este género contenía

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una cantidad de especies, de acuerdo con su especificidad para una o varias especies o grupos de leguminosas. Hoy, la profundización del conocimiento adquirida por la exitosa utilización de técnicas de investigación de última generación ha permitido descubrir numerosas nuevas especies de bacterias simbióticas, las que se han agrupado en seis géneros: Allorhizobium, Azorhizobium, Bradyrhizobium, Mesorhizobium, Rhizobium y Sinorhizobium, los más importantes de los cuales desde una visión económica son Rhizobium y Bradyrhizobium, porque sus especies se asocian con las leguminosas de mayor importancia. Más adelante se hablará con más detenimiento acerca de esta moderna clasificación de las bacterias nodulares de las leguminosas. Independientemente de ella, existe consenso en el mundo para seguir llamando comúnmente a las bacterias que forman nódulos en las leguminosas con el nombre de rhizobium o bacterias del grupo rhizobium (Giller, 2001). Los nódulos radicales son estructuras muy especializadas, adaptadas a la fijación del Nitrógeno para el beneficio de la planta en su conjunto, lo que permite su desarrollo cuando hay deficiencia de este elemento en el suelo. A pesar de que ni las plantas leguminosas ni los microsimbiontes pueden ser fijadores cuando están separados, la morfogénesis de los nódulos crea las condiciones que se requieren para la inducción y el funcionamiento del sistema nitrogenasa. Estos nódulos representan un tipo de crecimiento anormal, pero tan armoniosamente organizado que constituye una nueva estructura, considerada como un órgano sui generis que difiere de forma cualitativa y específica de los que se encuentran normalmente en las plantas. La frecuencia de distribución a lo largo del sistema radicular está determinada por factores que controlan los pasos en secuencia para la formación del nódulo: a. Acumulación de las bacterias en la rizosfera de las plantas. b. Infección de los pelos de las raíces, que culmina con la formación de los filamentos de infección dentro de la corteza. c. Inducción del crecimiento meristemático local en la corteza de la raíz y formación del nódulo maduro. d. Formación de los simbiosomas o bacteroides dentro de las células de las plantas debido a la transformación de las bacterias originales y, en este estadio, comienzo del proceso de fijación de Nitrógeno.

la fijación biológica del nitrógeno atmosférico en condiciones tropicales

Los procesos señalados en los puntos anteriores ocurren del siguiente modo: las bacterias se adhieren a los pelos radicales por la acción de una proteína específica llamada ricadesina, que se encuentra en la superficie de la bacteria, y de las lectinas, proteínas que se identificaron en los extremos de los pelos de las raíces y también en la superficie de los microorganismos simbióticos (Sparvoli et al., 2001). Una vez que se establece la unión, los pelos radicales se encurvan y entrampan a las bacterias. El enroscamiento es causado por ciertas sustancias específicas secretadas por las bacterias que se conocen como factores Nod, los cuales poseen características semejantes a las hormonas y son inductores de cambios en las membranas y en la oscilación de determinados iones (Ca2+, Cl- y H-) hasta que se forman los filamentos de infección, dentro de los cuales se multiplican las bacterias; estos filamentos crecen hasta alcanzar las células adyacentes a la raíz, cuya división se estimula por los factores Nod hasta que se forman los nódulos. Dentro de ellos se transforman las bacterias en bacteroides y comienza la fijación de N2. Todos estos cambios en las raíces ocurren por la activación en la planta de fosfolipasa C y proteínas G como respuesta a los factores Nod (Cárdenas et al., 1999, 2000; Irving et al. 2000; Pacios et al., 2001; Kelly e Irving, 2001,2003). Desde que las bacterias penetran en las raíces se establece un nuevo intercambio de señales entre los simbiontes, lo que incluye la secreción de polisacáridos y proteínas por tres tipos de sistemas de excreción. De estas sustancias, solo se han identificado hasta el momento los flavonoides, los cuales regulan la expresión de genes y se están aplicando artificialmente a las semillas o al suelo para mejorar la nodulación y la fijación. En el caso de los factores Nod, este tipo de inoculación está descartado por el momento porque no se ha encontrado beneficio, sino más bien perjuicios (Hogg et al., 2002; Broughton et al., 2003). Por último, los bacteroides son formaciones hinchadas, ramificadas y deformes, en que se transforman las bacterias, y pueden llegar a ser hasta 40 veces más grandes que los bacilos de los que se originaron. Ellos dependen totalmente de la planta para obtener sus fuentes de energía y, hasta que no se forman, no comienza la fijación de Nitrógeno. Cuando ocurre la senescencia del nódulo, estas formas pasan al suelo y la mayor parte de las veces no se reproducen, pero en los nódulos hay siempre bacterias originales en estado de latencia que se multiplican en el suelo, donde pueden mantenerse en estado libre, aunque no son fijadoras.

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Características de los nódulos

El color interno de los nódulos varía desde rojo hasta blanco, con una amplia escala de colores intermedios. Cuando la simbiosis funciona con efectividad, tienen una región roja relativamente grande, porque existe la presencia del pigmento leghemoglobina; en algunos nódulos puede encontrarse el pigmento rojo antocianina, que está asociado con simbiosis poco efectivas y puede ser confundido con aquel, pero es soluble en agua y se identifica con facilidad introduciendo los nódulos en el agua durante un corto tiempo, con lo que pierden la coloración. La leghemoglobina es similar a la hemoglobina de la sangre e integra un grupo de proteínas específicas del nódulo que se llaman nodulinas. Su función consiste en regular los niveles de O2 y aportar este elemento a los bacteroides. En general, los nódulos de color claro indican poca o ninguna eficiencia en la fijación de nitrógeno y su distinto grado de longevidad refleja usualmente el hábito de crecimiento de la especie vegetal en la que se han formado. Así, los nódulos de las leguminosas herbáceas son frágiles y funcionan durante un período corto del crecimiento vegetativo de las plantas; el corte de éstas, las condiciones desfavorables de humedad, la falta de fotosíntesis y el ataque de nemátodos, insectos y hongos pueden conducir a su desintegración. Las especies perennes, en cambio, producen nódulos frescos, que pueden ser temporales o persistentes durante varios años.

Figura 2 Nódulos de frijol (Phaseolus vulgaris)

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La forma de los nódulos está determinada, en primer lugar, por la especie de planta leguminosa, aunque puede ser modificada por el grado de efectividad de la cepa bacteriana y está definida por el material meristemático. Puede ser redonda, oval, alargada, en forma de maza, ramificada, coraloide o en forma de collar. En las figuras 2, 3 y 4 pueden verse algunas de estas formas de nódulos. Las relaciones entre los nódulos radicales y el resto de la planta están gobernadas por el suministro de carbohidratos a las células bacteroides y por la transferencia de los productos de la fijación. Como se conoce, las sustancias que más comúnmente transporta la savia del floema es la sacarosa. Como productos de la fijación se forman aminoácidos, mediante la ligadura del amonio con los ácidos orgánicos que se produFigura 3 Nódulos de garbanzo (Cicer arietinum L.)

Figura 4 Nódulos de soya (Glycine max L.)

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cen en los nódulos a partir de los azúcares transportados. Hoy se conoce con certeza que la cantidad de fotosintatos utilizables constituye uno de los principales factores que controlan la magnitud de la fijación. Experimentos en los que se utilizó la reacción de reducción del acetileno no han mostrado que ocurre una rápida declinación en la actividad nitrogenasa después de colocar las plantas en la oscuridad y después de su defoliación o decapitación; la mayor actividad, en cambio, se encontró durante el día, aún en temperatura constante (Burris, 1978). Los fotosintatos transportados a los nódulos son metabolizados rápidamente, suministrando así el reductor y el ATP requerido para la reducción de N2 a NH4, y también los esqueletos de Carbono necesarios para la formación de aminoácidos. La sacarosa, transportada con rapidez en glucosa y fructuosa por la acción de la invertasa presente en las células nodulares, representa así el principal sustrato para los bacteroides (Neyra, 1978). Relaciones entre los nódulos y la capacidad de fijación de N2

La fijación de N2 total en la simbiosis bacterias fijadoras-leguminosas depende de dos parámetros: del peso de los nódulos y de su actividad específica de fijación (N2 fijado por g de nódulo). El peso de los nódulos va en aumento durante la etapa de crecimiento de la planta, ocurriendo el punto máximo durante la segunda mitad del desarrollo, seguido por una disminución. Pueden existir grandes fluctuaciones, causadas por cambios de temperatura, intensidad de la luz, humedad o por efectos a largo plazo que relacionan estas variables con el estado de crecimiento de la planta. La apariencia de la planta, el número, tamaño, peso y la intensidad del color de los nódulos, así como el contenido de Nitrógeno de distintas partes de la planta, constituyen características utilizadas para medir la respuesta a la simbiosis. De acuerdo con ellas, la nodulación puede clasificarse como efectiva o inefectiva. Sin embargo, estos dos términos no son suficientemente descriptivos como para distinguir todas las respuestas posibles de la planta a la nodulación, por lo que se elaboró un sistema más completo de clasificación que se muestra en la tabla 18 (Caldwell y Vest, 1977), adecuado para interpretar la mayor parte de las relaciones planta-inoculación que se han observado. Las descripciones se obtuvieron en un medio con Nitrógeno limitado.

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De acuerdo con esta clasificación, así se establecerá el potencial simbiótico de una leguminosa dada que se asocia con una cepa fijadora. Este potencial se define como la actividad máxima de esta leguminosa cuando nodula eficientemente con una determinada cepa de bacteria fijadora simbiótica que está sometida a las más favorables condiciones ambientales. Un importante hecho a tomar en cuenta durante la nodulación es el período que transcurre entre la inoculación y la aparición de los nódulos, lo que representa el comienzo de la fijación de N2. Este período depende de un número de factores, el más importante de los cuales es la cepa que se utiliza, ya que aquellas cepas que nodulan primero son activas competidoras contra las que lo hacen más tarde. Como se verá

Tabla 18 Clasificación y descripción de las respuestas a la nodulación

Clasificación

Descripción

I) No nodulación

No hay nódulos, ni evidencia externa sobre las raíces de que se ha iniciado su formación. La planta es pequeña y clorótica, típica de deficiencia nitrogenada

II) Nodulación

Las raíces muestran que se ha iniciado la formación de nódulos.

A) Inefectiva

En las raíces se forman proliferaciones corticales y/o pequeñas estructuras semejantes a nódulos, con el interior de color blanco, verde o rosado. La planta es pequeña y clorótica, típica de deficiencia nitrogenada.

B) Efectiva

Las raíces están noduladas.

a) Ineficiente

El interior de los nódulos es de color verde o blanco, algunas veces rosado. La planta es pequeña, con un grado de clorosis que depende de la mayor o menor eficiencia de la fijación.

b) Eficiente

Los nódulos tienen el interior rosado o rojo. La planta es de color verde oscuro, con apariencia saludable.

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más adelante, el tamaño de la población de Rhizobium, la disponibilidad de humedad, la temperatura, el nivel de Nitrógeno en el suelo son otras determinantes importantes que afectan la velocidad de nodulación. La fijación de N2 por un nódulo de leguminosa necesita tres fases: lag (durante la iniciación del nódulo y el desarrollo temprano), exponencial (rápido crecimiento del nódulo y desarrollo de la actividad nitrogenasa) y senescencia (ruptura del tejido nodular y declinación de la actividad nitrogenasa, la cual puede ser rápida o extenderse por un período considerable). La sequía y el exceso de humedad son dos factores ambientales que promueven esta senescencia. Los nódulos de tipo meristemático (Trifolium, Pisum y Phaseolus) muestran actividades nitrogenasa específicas, significativamente más altas que los nódulos de tipo esférico o de tipo determinado que se encuentran en muchas leguminosas tropicales. Una excepción la constituye el maní, el cual tiene una alta actividad específica (Gibson et al., 1982). Clasificación actual de las bacterias que forman nódulos en las plantas leguminosas

Beijerinck aisló por primera vez, en 1888, un cultivo bacteriano puro proveniente de un nódulo y llamó a esta bacteria Bacillus radicicola. Posteriormente, Frank propuso el nombre de Rhizobium para estos aislados, lo que alcanzó general aceptación. Debido a la especificidad de los aislados bacterianos frente a determinadas especies vegetales hospedantes se crearon distintas especies de este género, y ya en 1929 existían seis de ellas, cada una de las cuales constituía un grupo de nodulación para un conjunto de distintas leguminosas hospedantes: R. japonicum, R. leguminosarum , R. lupini, R. meliloti, R. trifolii y R. phaseoli. En 1982 se dividió en dos el género Rhizobium, dando origen al género Bradyrhizobium, con una sola especie, B. japonicum, que absorbió a la especie R. lupini, muy similar en muchos de los aspectos de taxonomía numérica y de hibridación ADN-ADN (Jordan, 1982). En los últimos años se desarrolló la taxonomía de las bacterias nodulantes con gran rapidez, y han aparecido muchas especies y géneros nuevos, los que se exponen a continuación, de acuerdo con Tao Wang y Martínez Romero (2003):

la fijación biológica del nitrógeno atmosférico en condiciones tropicales

Género Allorhizobium, que contiene solo la especie A. undicola, que fue aislada de nódulos de raíces de la planta acuática africana Neptunia natans y que es también capaz de nodular otras especies de plantas, entre ellas la alfalfa ((Medicago sativa). Género Azorhizobium, que también contiene solamente la especie A. caulidonans, aislada de nódulos en los tallos de Sesbania rostrata y que puede además nodular las raíces. Esta especie es la única, entre las bacterias fijadoras simbióticas, que tiene la característica de formar nódulos en los tallos (Dreyfus et al., 1988), y solamente en la especie vegetal de que fue aislada, aunque se ha querido utilizar como promotora del crecimiento del arroz con relativo éxito. Género Bradyrhizobium, que contiene las siguientes cuatro especies: B. elkani, B. japonicum y B. liaoningense, que nodulan la soya, y B. yuanmingense, que solo forma nódulos en Lespedeza cuneata (Jordan, 1982). La especie más importante del género es B. japonicum que, además de la soya, tiene un amplio rango de plantas hospedantes, tanto de regiones tropicales como de zonas templadas. Género Mesorhizobium, que contiene las siguientes ocho especies, capaces de formar nódulos en distintas especies de leguminosas de las zonas templadas, subtropicales y tropicales: M. amorphae, M. chacoense, M. ciceri, M. huakuii, M. loti, M. mediterraneum, M. plurifarium y M. tianshanense. Género Rhizobium, que contiene 13 especies, capaces de nodular diferentes especies de leguminosas en todas las regiones: R. etli, R. galegae, R. gallicum, R. giardinii, R. hainanense, R. huautlense, R. indigoferae, R. leguminosarum, R. loessense, R. mongolense, R. sullae, R. tropici y R. yanglingense. La especie más importante para América Latina es R. etli, que predomina en los nódulos del frijol (Phaseolus vulgaris L.). Género Sinorhizobium, que contiene 9 especies: S. arboris, S. fredii, S. kostiense, S. kummerowiae, S. medicae., S. meliloti, S. saheli, S. terangae y S. xinjiangense. La mayor parte de estas especies son capaces de nodular a la soya y a Leucaena leucocephala. Recientemente se describieron dos especies no simbióticas en este género: S. morelenses y S. adhaerens. La primera fue aislada de nódulos de L. leucocephala pero no forma nódulos, aunque cuando se inocula puede estimular el crecimiento de la planta. La segunda fue transferida del género Ensifer y es una bacteria predatora de bacterias Gram positivas que viven en el suelo.

capítulo 5. la fijación simbiótica del nitrógeno

82 Factores que influyen en el establecimiento de la simbiosis

Son muchos los factores limitantes para el establecimiento de la simbiosis Rhizobium o Bradyrhizobium-leguminosas, por lo cual deben ser discutidos detenidamente, ya que la presencia de algunos de ellos limita el éxito de la inoculación. En la tabla 19 se presentan los factores más importantes. La nodulación y la fijación de Nitrógeno dependen de las interacciones entre una determinada leguminosa y las cepas de una especie de Rhizobium. Estas interacciones constituyen el resultado de la variación genética en la planta hospedera y en la bacteria y las relaciones entre los dos sistemas genéticos no son constantes, sino que dependen de los factores ambientales (Martínez Viera, 1986). Tabla 19

Factor

Influencia

Relacionados con el macrosimbionte

Variedad Cantidad de Nodulina Utilización de fotosintatos Tolerancia al stress

Sobre la nodulación y fijación Sobre la función nodular Sobre la eficiencia de la fijación Sobre el establecimiento de la simbiosis

Relacionados con el microsimbionte

Infertilidad Efectividad Competitividad Competencia saprofítica

Sobre la formación de nódulos Sobre la fijación Sobre la ocupación del nódulo Sobre la persistencia en el suelo

Relacionados con el ambiente

Presencia de N combinado Luminosidad Temperatura Agua y aireación Salinidad Presencia de agentes bióticos

Sobre la nodulación y la fijación Sobre la eficiencia de la fijación Sobre el crecimiento de la planta y la fijación Sobre la actividad nitrogenasa Sobre la viabilidad e infección Sobre la viabilidad e infección

Principales factores que afectan la fijación simbiótica de Nitrógeno

la fijación biológica del nitrógeno atmosférico en condiciones tropicales

La influencia del suelo sobre la simbiosis Rhizobium-leguminosas es muy grande. Existe un balance muy delicado en las relaciones entre macro y microsimbionte, el cual es fácilmente perturbado por las características del suelo. Las bacterias de los géneros Rhizobium y Bradyrhizobium pueden sobrevivir en el suelo en ausencia de leguminosas, aunque su población es siempre más alta cuando se encuentran presentes las plantas hospedantes. Los exudados radicales estimulan la multiplicación, ya que suministran biotina y tiamina, homoserina y ácido glutámico, necesarios para el desarrollo de estas especies, pero son necesarias determinadas condiciones del suelo para que puedan sobrevivir las bacterias (Ledgard y Steele, 1992). Los aumentos más espectaculares de Nitrógeno procedente de la fijación simbiótica son obtenidos manipulando el sistema total suelo-planta-bacteria. Es muy importante el efecto de las altas temperaturas del suelo sobre la supervivencia de Rhizobium y Bradyrhizobium en condiciones de campo. El calentamiento bajo condiciones húmedas promueve la muerte de las bacterias de forma más rápida que bajo condiciones secas, por lo que un inoculante húmedo es más susceptible a las altas temperaturas que uno seco. Sin embargo, se han aislado cepas de Rhizobium y Bradyrhizobium tolerantes a temperaturas elevadas y que forman nódulos efectivos en estas condiciones (Eagleshan et al., 1981). La temperatura de la superficie del suelo puede limitar la población de las especies simbióticas más susceptibles. Este efecto se ejerce principalmente sobre la cantidad de N2 fijado, aunque cuando las temperaturas son muy altas pueden causar también pobre nodulación. En el caso del frijol, por ejemplo, la temperatura constituye uno de los principales factores limitantes de la efectividad de la simbiosis en las regiones tropicales y subtropicales; así, en dos localidades situadas a 1.000 m y 1.800 m de altitud, en la zona de mayor altura, con temperatura máxima del suelo de 29°C, la fijación, determinada por la reducción de acetileno a etileno (ARA), fue equivalente a la reducción de 20 nmol C2H4/planta/h, mientras que en el lugar más bajo, donde se sobrepasan los 35°C durante varias horas cada día, la fijación máxima conseguida fue menor de 10 nmol C2 H4/planta/h (Pate, 1977). El stress de humedad, debido a falta o exceso, es perjudicial para la simbiosis, ya que las bacterias muestran una rápida disminución de su viabilidad bajo condiciones de sequía y esto es exacerbado por las condiciones de humedad y sequía (Peña Cabriales y Alexander, 1979). La nodulación no ocurre cuando el suelo está seco porque falla la infección,

capítulo 5. la fijación simbiótica del nitrógeno

y si la sequía ocurre después de la infección disminuye notablemente la fijación, debido a la pérdida de humedad de los nódulos o a que cesa la fotosíntesis. El suelo anegado (sobresaturados), principalmente cuando está asociado a pobre estructura del suelo, retarda la nodulación y la fijación de N2, lo que se debe a bajos niveles de O2. De la misma manera, los factores nutricionales pueden afectar la fijación de N2 por un efecto directo sobre los procesos de infección y nodulación, ya que pueden influir sobre la actividad de la simbiosis y sobre el metabolismo o el crecimiento de las plantas, independientemente de cualquier efecto sobre la simbiosis. Cuando el pH del suelo es bajo no hay fijación de Nitrógeno o es muy escasa, lo cual se atribuye a la influencia sobre los siguientes aspectos de la simbiosis: a. Supervivencia de las bacterias en el suelo; b. Establecimiento en las raíces e inicio del nódulo c. Eficacia de la simbiosis d. Nutrición de las plantas Los suelos ácidos cubren superficies muy extensas en las regiones tropicales. Así, en Brasil constituyen 68% de la superficie; en Colombia 57%; en Perú 44%; en Venezuela 58%; en Panamá 63% (Lopes,1978). La mayoría de estas áreas están formadas por junglas, pero unas 300.000.000 ha son sabanas, en las que la cantidad y calidad del forraje nativo son inadecuadas, y se ha demostrado que no pueden ser utilizados en estas regiones los resultados de los avanzados programas de inoculación de leguminosas de Australia, Estados Unidos y otras regiones, por lo que se han creado nuevos programas con alta efectividad en algunos países como Brasil, Colombia, India y otros, los cuales están adaptados a las condiciones de estos suelos. En el oeste de África, Vigna unguiculata y maní son relativamente tolerantes a bajos pH (4-5), pero Leucaena leucocephala no crece ni nodula en estos suelos y responde marcadamente al encalado (Hutton y Andrews, 1978). Con soya en suelos ácidos de Nigeria, Bromfield y Ayanaba (1980) observaron que la inoculación con cepas de Bradyrhizobium japonicum seleccionadas por adaptarse a estas características producía buenos rendimientos (hasta 2 t/ha) y que el encalado no tenía influencia sobre esta respuesta. La acidez, deficiencia de Ca y toxicidad de Mn y Al tienden a ocurrir juntos y, por eso, es difícil señalar la causa exacta que influye sobre la fijación, sin embargo, (Es-

la fijación biológica del nitrógeno atmosférico en condiciones tropicales

paña et al., 2006), han encontrado altos % de fijación de N en leguminosas de grano y forrajeras en suelos ácidos encalados. El Fósforo constituye un importante factor limitante para la nodulación en los suelos tropicales. Los nódulos contienen frecuentemente 2-3 veces más Fósforo por unidad de materia seca que las raíces, por lo que la fertilización fosfórica o la presencia de microorganismos solubilizadores de Fósforo incrementa la nodulación y la fijación. Se ha demostrado que plantas con fuerte asociación micorrízica tienen requerimientos de P externo más bajos que las que tienen micorrización inefectiva (Habte y Manjunath, 1987). La inhibición de la nodulación por la presencia de Nitrógeno combinado es reconocida por todos los especialistas, pero la naturaleza de la inhibición aún no se ha establecido claramente. Hasta el momento se conoce que se afectan tres fases: la infección de los pelos radicales, el crecimiento del nódulo y la actividad nitrogenasa. Igualmente, se ha demostrado que el nitrato ejerce un efecto sobre las lectinas (glicoproteínas específicas para que las bacterias reconozcan a la planta) sobre la superficie de los pelos radicales, lo cual ocasiona un bajo nivel de infección (Dazzo et al., 1981). El menor crecimiento del nódulo y la reducción de la actividad nitrogenasa parece ser consecuencia de un suministro más bajo de fotosintatos a los nódulos, debido a que estos fotosintatos los utiliza la planta para asimilar el Nitrógeno combinado (Gibson et al., 1982). Debido a las fluctuaciones de los niveles de nitratos y de amonio en el suelo es difícil establecer con seguridad la significación del Nitrógeno combinado en condiciones naturales. Los suelos tropicales son frecuentemente bajos en este elemento, pero pueden existir altos niveles de nitratos en campos no fertilizados por cortos períodos después de la estación seca, lo que puede retardar la nodulación y la fijación, como ha sido observado en maní en Senegal (Gibson et al., 1982). De los microelementos que son esenciales para que ocurra una nodulación exitosa (Bo, Cu, Mo, Co), el Mo es el más deficiente en los suelos tropicales. En un survey de 41 suelos brasileños, 36 tuvieron deficiencia de Molibdeno (Franco et al., 1978). En Australia, la incorporación de Mo en el Superfosfato ha significado la diferencia entre fracaso y éxito en el positivo establecimiento de la nodulación en muchos suelos ácidos (Gibson et al.,1982); en Venezuela en suelos ácidos debe aplicarse Mo (molibdeno) para lograr una eficiencia en la FBN (López et al.,2006).

capítulo 5. la fijación simbiótica del nitrógeno

En lo que respecta a la influencia que puede tener la aplicación de herbicidas, puede decirse que la susceptibilidad de las bacterias simbióticas frente a estos productos químicos de amplio uso ha sido investigada por métodos variados, que van desde el recuento en placas de las células bacterianas hasta el estudio de la nodulación de las plantas. Los resultados generales han mostrado que la susceptibilidad de la planta hospedante a los herbicidas es más grande que la de las bacterias. Las reducciones en la nodulación y en la fijación de Nitrógeno que se han encontrado en algunos de los trabajos han sido atribuidas a daños sufridos por las plantas, más bien que a efectos directos del herbicida sobre los microorganismos. Cálculo de los beneficios aportados al suelo por la fijación simbiótica de N2 atmosférico

En general, la siembra de una leguminosa inoculada con una cepa eficiente de Rhizobium o Bradyrhizobium aporta importantes beneficios al suelo después de la cosecha, como consecuencia de los aportes de Nitrógeno suministrados por el cultivo y que ha recibido de forma gratuita por la fijación del N2 que se encuentra en la atmósfera. El balance de Nitrógeno que queda en un suelo después de cultivar una leguminosa inoculada puede calcularse aplicando la siguiente fórmula (Woods y Myers, 1987): Balance neto de N = Nf – NIs

Nf = nitrógeno fijado= P x NI P = proporción de N en la planta derivado de la fijación NI = Cantidad total de N en la planta NIs = N extraído en la semilla cosechada El valor P tiene que ser determinado por técnicas isotópicas, y varía de acuerdo con las condiciones edafo-climáticas de cada país e incluso entre regiones de un mismo país. En la Tabla 20 se presentan algunos valores determinados en diferentes países y en distintos cultivos (Peoples y Craswell, 1992), y en ella se pueden observar las notables oscilaciones que existen en los valores para un mismo cultivo, en dependencia de las condiciones en que se ha desarrollado. Los abonos verdes vienen siendo utilizados cada vez más en la región, especialmente donde la posibilidad de uso de los fertilizantes nitrogenados está limitada por su alto costo. Dentro de los abonos verdes que tienen mayor potencial de uso en el trópico

la fijación biológica del nitrógeno atmosférico en condiciones tropicales

se incluyen no solo las tradicionales especies de Crotalaria, Mucura, Canavalia y Pueraria, sino también algunas leguminosas de grano como caupí y la propia soya, especialmente las variedades de rápida producción de biomasa y de alta eficiencia de fijación; la I. lespediciodes leguminosa nativa con alto potencial para ser usada como abono verde, así como el C. Juncea, representaron una alternativa para promover la sustentabilidad de agrosistemas de sabanas venezolanas (López, et al., 2006). Los residuos de las leguminosas, debido a su baja relación C/N, generalmente presentan rápida descomposición, y muchas veces ésta no es una característica muy deseada, por lo cual se está utilizando en algunos lugares el cultivo mixto de leguminosas y gramíneas para abonos verdes, que presenta una relación C/N intermedia y puede reducir la velocidad de mineralización de los resíduos y favorecer su mayor aprovechamiento por el cultivo principal o subsecuente (Urquiaga et al., 2001; López et al., 2006). De acuerdo con Calegari y Peñalva (1994), dentro de los abonos verdes es posible encontrar plantas leguminosas que acumulan hasta 300 kg/ha de N y, según Urquiaga y Zapata (2000), hasta 80% de este N es derivado de la fijación. A modo de ejemplo, es conocido que el cultivo del plátano ocupa un lugar muy relevante en los países tropicales. Espíndola et al. (2000) determinaron que Pueraria phaseoloides es la especie con mayor poder de adaptación como cobertura viva en este

Tabla 20 N de la planta derivado de la fijación (P) en distintos cultivos y países

Cultivo

País

Valor de P

Maní

Australia Brasil India

0.22-0.65 0.47-0.73 0.86-0.92

Soya

Brasil Hawaii

0.70-0.80 0.80-0.97

Frijol

Brasil Kenia

0.16-0.71 0.16-0.32

capítulo 5. la fijación simbiótica del nitrógeno

cultivo, y supera hasta en 90% a las demás especies en producción de materia seca. Estos autores indicaron también que el 55% de todo el Nitrógeno acumulado por el plátano se derivó de la fijación por parte de esta leguminosa. Por otra parte, una de las prácticas más corrientes de la moderna Agricultura Sustentable consiste en la rotación de cultivos, usando siempre en primer lugar una especie de leguminosa inoculada con una cepa eficiente de Rhizobium o Bradyrhizobium. Este cultivo le suministra al que viene posteriormente una cantidad apreciable de Nitrógeno, lo cual permite una reducción importante del fertilizante nitrogenado en el cultivo subsecuente, además de que mejora la estructura del suelo y su disponibilidad de nutrientes en general. El valor del Nitrógeno aportado al suelo por la leguminosa que se utilizó en una rotación de cultivos y, por consiguiente, la cantidad de fertilizante que puede reducirse, se calcula de acuerdo con la siguiente fórmula (Myers y Wood, 1987): Contribución al cultivo subsecuente = NI x P (1-NHi) x Fm x E

Donde:

P = proporción de N en la planta derivado de la fijación NI = Cantidad total de N en la planta NHi = índice de N cosechado = NIs/NI NIs = N extraído en la semilla cosechada Fm = proporción del N que se mineraliza de la leguminosa E = Eficiencia de la utilización de este N mineral

Estos dos últimos valores deben ser el resultado de investigaciones encaminadas en esa dirección en distintas regiones. Asociación de Rhizobium con cereales

En la última década se ha demostrado que Rhizobium puede colonizar de forma endófita a los cereales cuando se practica la rotación de cultivos con leguminosas inoculadas con determinadas especies de bacterias fijadoras simbióticas. Así, se ha demostrado que Rhizobium leguminosarum bv trifolii puede encontrarse de forma endófita en el arroz rotado con trébol cuando se practica la rotación en suelos drenados, para suministrar las condiciones aerobias que no ocurren en los campos de arroz inundados (Yanni et al., 2001). Después de aislar estas cepas endófitas, se puso de manifiesto que también eran capaces de establecerse dentro de las raíces del arroz cuando eran inoculadas, sin necesidad de hacer la rotación.

la fijación biológica del nitrógeno atmosférico en condiciones tropicales

Pruebas efectuadas con rotaciones de trigo con otras leguminosas como trébol, alfalfa, soya, lenteja y caraota ratificaron que la única especie de Rhizobium capaz de establecerse dentro de las raíces del trigo fue también Rh. leguminosarum bv trifolii ( Dazzo y Yanni, 2006). Estudios recientes han puesto de manifiesto que, tanto en el caso del trigo como en el arroz, esta invasión comienza por las raíces laterales y penetra en la raíz principal a través de las células epidérmicas, a lo que sigue una migración ascendente hacia la base del tallo y las hojas, donde desarrollan altas densidades de población que permanecen activas durante períodos relativamente largos (Chi et al., 2005). Se han determinado los beneficios del establecimiento de esta simbiosis endofítica, y se ha encontrado que ocurre una germinación más rápida, alargamiento de las raíces, incremento del peso del tallo, mayor área foliar, contenido de clorofila, actividad fotosintética y biomasa total, todo lo cual demuestra una actividad estimuladora del crecimiento por parte de las bacterias. Igualmente, se han encontrado mayores contenidos de Nitrógeno en la paja y en el grano en estado de madurez, aunque la procedencia de este Nitrógeno es el suelo, ya que se ha demostrado mediante pruebas de reducción de acetileno y de 15N que no hay fijación de N2 (Biswas et al., 2000; Yanni et al., 2001). Se han realizado una cantidad de experimentos en condiciones de campo, tratando las semillas con inóculo en polvo y aplicando solo 70% de fertilizante nitrogenado. Estos experimentos mostraron incrementos del rendimiento entre 18 y 30% en el caso del arroz, y entre 16 y 30% en el trigo (Dazzo y Yanni, 2006). La capacidad de otras bacterias fijadoras de forma simbiótica para establecerse de forma endógena en cultivos cerealeros ha sido demostrada por algunos autores. Así, Gopalaswami et al. (2000) pusieron de manifiesto la colonización del xilema del arroz por Azorhizobium caulidonans , aunque no ha sido todavía bien estudiada. Como puede verse, falta mucho aún por conocer acerca de estas asociaciones, ya que también se ha reportado que no se han obtenido resultados positivos en otros experimentos. La rapidez con que se está trabajando permite pronosticar que, en un tiempo relativamente corto, será posible incorporar las asociaciones Rhizobium-cereales a la gama de biofertilizantes que tantos beneficios aportan a la Agricultura Sustentable.

capítulo 5. la fijación simbiótica del nitrógeno

Fijación simbiótica en plantas no leguminosas

Hay plantas no leguminosas que tienen también la capacidad de asociarse con determinados microorganismos para formar nódulos fijadores en las raíces. Muy pocas de las especies no leguminosas capaces de nodular lo hacen en asociación con Rhizobium y, de ellas, solo se ha demostrado que existe fijación de N2 en especies del género Parasponia, perteneciente a la Familia de las Ulmaceae, que se encuentra extensamente distribuída en Nueva Guinea. Este género agrupa a cinco especies, tres de las cuales son capaces de establecer la simbiosis. El primer reporte sobre esta asociación lo hizo Trinick en 1973 (Trinick, 1988). También se ha reportado nodulación rhizobiana en algunas especies del género Zygophyllum, que pertenece a la Familia Zygophyllaceae, distribuída en el desierto xerofítico. Mostafa y Mahmoud (1951) reportaron aislamiento de Rhizobium de nódulos de estas especies, el cual fue capaz de formar nódulos en Arachis hypogaea y Trifolium alexandrinum. Sin embargo, Becking (1982) no encontró actividad nitrogenasa en estas inoculaciones. Las plantas no leguminosas con nódulos radicales no formados por Rhizobium y que tienen una importante capacidad de fijación de Nitrógeno están presentes en un número de familias que no están relacionadas genéticamente, sobre todo en géneros de angiospermas y dicotiledóneas. Las especies noduladas se encuentran en una gran variedad de habitats y muestran una amplia gama de formas morfológicas. Algunas de ellas son herbáceas (Dryas sp.), otras son arbustos (Ceanothus sp y Colletia sp) y otras son especies maderables arbóreas ((Alnus sp y Casuarina sp). Aunque estas especies no son de importancia agrícola, todas desempeñan un importante papel en las sucesiones vegetales de los ecosistemas naturales, porque pueden cubrir suelos de áreas perturbadas. Todas estas simbiosis son producidas por actinorrizas, y son causadas por actinomicetos que pertenecen al género Frankia, de la Familia Frankiaceae. En 1978 se realizó el primer aislamiento del actinomiceto endófito en nódulos de no leguminosas. La taxonomía del género se debe a Becking (1982), quien propuso el nombre de Frankia como homenaje al microbiólogo A.B. Frank y determinó 10 especies. Actualmente se considera que dentro del género se encuentran 4 grupos, que son los siguientes (Valdés et al., 2003):

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Grupo 1:

Cepas infectivas en Myricaceae, Betulaceae y Casuarinaceae.

Grupo 2:

Cepas que no pueden ser cultivadas in vitro y que forman nódulos en las familias Rosaceae, Coriariaceae y Datiscaceae.

Grupo 3:

Cepas de Eleagnaceae.

Grupo 4:

Cepas de Rhamnaceae.

Los nódulos formados en las plantas no leguminosas son diferentes, desde los puntos de vista anatómico y morfológico, de los que se forman en las plantas leguminosas. Pueden distinguirse dos tipos principales: el tipo Alnus, que es de forma coraloide por ramificación dicótoma, se origina en las raíces laterales y los meristemos apicales son inhibidos o con crecimiento muy lento. El segundo tipo es el Myrica-Casuarina, en el que el ápice de cada uno de los lóbulos en los nódulos produce una raíz normal, pero con geotropismo negativo; de esta manera, el nódulo llega a estar encerrado por raicillas que crecen hacia arriba (Pawlowski y Bisseling, 1996). El crecimiento inicial de estos nódulos inducidos por los actinomicetos también es diferente del que ocurre en las leguminosas. Primero se forma un pre-nódulo como un ligero engrosamiento de la raíz principal. A partir de este estadio se forma el nódulo a partir de un primordio lateral en la raíz que desarrolla por proliferación meristemática del periciclo y de las células corticales de la raíz principal. El estudio de la estructura fina de la endofita ha revelado la presencia de hifas, estructuras vesiculares y partículas semejantes a esporas (Torrey y Callaham, 1979). En la Tabla 21 se muestran los géneros de plantas capaces de ser nodulados por los actinomicetos. Como se ve en la Tabla 21, las plantas no leguminosas noduladas por especies de actinomicetos del género Frankia comprenden 7 órdenes, 8 familias, 18 géneros y 175 especies de plantas dicotiledóneas. La nodulación radicular en los géneros Casuarina, Allocasuarina y Gymnostoma es bien conocida en los trópicos. Sus especies aparecen espontáneamente en el Sudeste de Asia, incluyendo el Sudeste del Pacífico y Australia. Algunas de las 50 especies de los tres géneros se han introducido en el Norte de África, en áreas de América tropical y subtropical y en otras localidades de Asia.

capítulo 5. la fijación simbiótica del nitrógeno

Tabla 21

Orden

Familia

Género

Número de especies noduladas

Casuarinales

Casuarinaceae

Casuarina Allocasuarina Gymnostoma

23 (40) 2 (5) 2 (5)

Myricales

Myricaceae

Myrica Comptonia

26 (35) 1 (1)

Fagales

Betulaceae

Alnus

33 (35)

Elaeagnaceae

Eleagnus Hippophae Shepherdia

17 (45) 1 (3) 3 (3)

Ceanothus Discaria Colletia Trevoa

31 (55) 6 (10) 3 (17) 1 (6)

Coriaria

14 (15)

Rubus Dryas Purshia Cercocarpus

1 (250) 3 (4) 2 (2) 4 (20)

Datisca

2 (2)

Clasificación de las dicotiledóneas no leguminosas fijadoras de N2 en simbiosis con actinomicetos del género Frankia

Rhamnales Rhamnaceae

Coriariales

Coriariaceae

Rosales

Rosaceae

Cucurbitales

Datiscaceae

NOTA: Los números entre paréntesis indican el total de especies que hay en cada género.

la fijación biológica del nitrógeno atmosférico en condiciones tropicales

El género Alnus, con 35 especies, se encuentra principalmente en las regiones templadas, aunque importantes representantes del género se encuentran también en los trópicos. Por ejemplo, las especies A. japonica y A. maritima se han podido introducir en las altas elevaciones de Asia tropical. El género Eleagnus tiene muchas especies que se encuentran en ecosistemas naturales en el Sudeste de Asia. Varias especies de montaña que pertenecen al género Myrica se encuentran de forma natural en las regiones altas de Indonesia y Filipinas. Algunas de las 15 especies del género Coriaria se encuentran en las altas elevaciones de Asia. La especie Rubus elipticus, la única que nodula entre las 250 especies del género Rubus, se encuentra naturalmente en Asia continental y en algunas islas como Sry Lanka y Luzón. Las especies de Colletia tienen su distribución principalmente en el trópico. La única especie que nodula de Trevoa vive en la región tropical. El resto de los géneros que tienen especies capaces de nodular con Frankia spp se encuentran distribuídas en regiones templadas. La importancia económica de las plantas no leguminosas noduladas radica en su capacidad para aumentar el contenido de Nitrógeno en el suelo, por lo que son muy útiles para el mejoramiento de suelos muy pobres en este elemento. Además, desempeñan un papel importante en la estabilización de los suelos después de que han ocurrido disturbios naturales, tales como inundaciones, erupciones volcánicas o grandes incendios. Algunas especies que crecen bien en la zona tropical son de considerable importancia para la reforestación y la producción de madera. Por ejemplo, la Casuarina equisetifolia, de litoral, es particularmente útil en el desarrollo de vegetación en las dunas y en suelos muy arenosos cerca de las costas, mientras que la especie de montaña Casuarina junghuhniana es buena colonizadora de las áreas erosionadas en las regiones montañosas de los trópicos. Estas especies tienen un crecimiento relativamente rápido, combinado con un buen potencial de fijación de N2, y muestran habilidad para crecer en climas secos y ca-

capítulo 5. la fijación simbiótica del nitrógeno

lientes. Así, en la península de Cabo Verde, al norte de Dakar, se encontró que el suelo tenía originalmente 80 kg de N/ha y, después de la reforestación con Casuarina equisetifolia, el mismo suelo tenía 309 kg de N/ha (Dommergues, 1963). Resultados similares que se han obtenido en distintas regiones han permitido sugerir la posibilidad de mezclar pinos tropicales con casuarinas. En general, la capacidad de adaptación de las plantas actinorrícicas a suelos marginales está relacionada no solo con su capacidad para autoabastecerse de Nitrógeno, sino también a su facilidad para asociarse con hongos endo y ectomicorrízicos, lo que les permite proveerse de otros nutrientes, especialmente Fósforo.

la fijación biológica del nitrógeno atmosférico en condiciones tropicales

Capítulo 6

La fijación asociativa de nitrógeno

La fijación biológica de Nitrógeno atmosférico también puede ser realizada por microorganismos que no requieren la cooperación de otras formas vivas para cumplir esta función. Sin embargo, la mayor actividad fijadora de estos microorganismos de vida libre ocurre cuando se encuentran asociados a las plantas en las zonas de rizosfera y filosfera, donde aprovechan para utilizar en su desarrollo la excreción por las raíces y las hojas de notables cantidades de compuestos carbonados y otras sustancias. La asociación entre plantas y bacterias fijadoras de Nitrógeno depende de la interacción entre ambos componentes, con el beneficio de por lo menos uno de los participantes (Dôbereiner, 1992). Estos organismos fijadores no forman simbiosis con especies vegetales y pueden vivir libremente en el suelo o estableciendo relaciones denominadas asociativas, menos especializadas que la simbiosis, con diversas especies. Hasta el momento, han sido estudiadas las asociaciones Azotobacter paspali-Paspalum notatum, Derxia y gramíneas, Beijerinckia sp y caña de azúcar, Azospirillum sp (A. brasilense, A. lipoferum, A. amazonensis) y monocotiledóneas (gramíneas, cereales y palmeras), Bacillus sp (B. polymixa y B. azotofixans) con cereales y gramíneas, Pseudomonas sp en arroz, Campylobacter sp y Spartina alterniflora, Herbaspirillum seropedicae y cereales y Gluconacetobacter diazotrophicus y caña de azúcar. Con excepción de Campylobacter, que aparece en pantanos salinos, todas estas especies se encuentran en suelos agrícolas. Además, las especies del género Azotobacter son capaces de establecer asociación con una gran cantidad de especies vegetales. Existen otras asociaciones de otros géneros de bacterias, pero son mucho menos importantes que las que se han citado. Mecanismos de protección de la nitrogenasa en la fijación aeróbica

La mayor parte de las especies microbianas involucradas en la fijación asociativa son aerobias y, por ello, tienen que disponer de sistemas de protección de la nitrogenasa frente a O2, los cuales actúan a través de los siguientes mecanismos:

capítulo 6. la fijación asociativa de nitrógeno

–

Protección respiratoria. Las células de Azotobacter son capaces de ajustar hasta un cierto nivel su coeficiente respiratorio, de manera que se mantenga la concentración de O2 en la superficie de la célula igual a cero. Esto significa, por ejemplo, que si se aumentara el potencial de O2 de un cultivo de Azotobacter que está en proceso de fijación, las células pasarían a respirar más rápidamente, procurando consumir todo el O2 a través de la respiración y gastando excesivamente las fuentes de carbono.

–

Protección conformacional de la nitrogenasa. También en Azotobacter existen formas de nitrogenasa en las que la enzima muda a su forma parcial para proteger los puntos sensibles al O2. Es decir, que cuando hay exceso de O2 la enzima se desliga y cuando el O2 cae a una concentración satisfactoria la enzima liga, volviendo entonces a su forma activa.

–

Producción de polisacáridos extracelulares. Muchas especies fijadoras producen diversos polisacáridos extracelulares, cuya composición varía entre las especies. Por ejemplo, las células de Derxia spp y de Beijerinckia spp sintetizan un tipo de goma extremadamente elástica alrededor de sus colonias en determinadas condiciones. Se ha demostrado que la producción de polisacáridos sirve para impedir el acceso de O2 al centro de las colonias.

–

Variación en el tamaño de las células. El establecimiento de una baja relación superficie celular/contenido celular representa un método de impedir el exceso de absorción de O2.

–

Movimiento de las células hacia lugares con potencial de O2 adecuados. Debido a que no poseen mecanismos de protección más eficientes, muchas especies de bacterias aerobias son microaerofílicas cuando fijan N2. Las especies de los géneros Azospirillum y Herbaspirillum, por ejemplo, tienen un movimiento ambulatorio típico y son capaces de crecer en medio semi-sólido sin Nitrógeno, porque en medios con esta consistencia ocurren distintos gradientes de O2, de modo que las células pueden moverse hacia una zona donde el potencial de O2 sea adecuado. Cuando se multiplican las células, se aglomeran y se mueven hacia la superficie del medio, para formar una película característica en el punto donde haya un potencial de O2 conveniente. Si la película fuera rota por acción mecánica, la actividad nitrogenasa cesará y solo será restablecida cuando aquélla se vuelva a formar.

la fijación biológica del nitrógeno atmosférico en condiciones tropicales

Con la utilización de alguno de estos mecanismos, el más adecuado para la especie bacteriana de que se trate, es posible lograr el aislamiento selectivo de distintos organismos aerobios fijadores de N2, mediante la utilización de medios de cultivo que no contienen Nitrógeno de forma combinada. Microorganismos capaces de fijar N2 en forma asociativa

Mediante la utilización del método de reducción del acetileno a etileno se ha confeccionado una lista de organismos que son capaces de fijar N2 en condiciones de vida libre o en forma asociativa. Todos estos organismos son procarióticos, y no se conoce ningún eucariótico que sea capaz de realizar la fijación. Los géneros a que pertenecen estos organismos se incluyen a continuación (Bohlool et al., 1992; Elmerich et al., 1992; Boddey et al., 1998). Organismos aeróbicos: Especies de los géneros Achromobacter, Aerobacter, Aquaspirillum, Azomonas, Azotobacter, Azotococcus Beijerinckia, Derxia, Methanosinus y otras bacterias oxidantes de metano, Pseudomonas. Además, se encuentran todas las algas verdi-azules heteroquísticas y algunos actinomicetos y hongos. Organismos microaeróbicos: Especies de los géneros Azospirillum, Thiobacillus, Xanthobacter. Además, se encuentran muchas algas verdi-azules no heteroquísticas. Organismos facultativos: Especies de los géneros Bacillus, Burkholderia, Citrobacter, Enterobacter, Gluconacetobacter, Herbaspirillum, Klebsiella, Rhodomicrobium, Rhodopseudomonas, Rhodospirillum. Organismos anaeróbicos: Espécies de los géneros Thiopedia, Chlorobium, Chromatium, Clostridium, Desulfotomaculum, Desulfovibrio, Ectothiospira, Propionibacterium. Esta amplia gama de organismos heterotróficos indica que la fijación de Nitrógeno ocurre en los más diversos ambientes del suelo, por la capacidad de adaptación de unas u otras especies. Por ejemplo, los campos arroceros constituyen un ambiente muy difícil para el desarrollo de los organismos del suelo. A pesar de esto, Matsuo y Takahashi (1977), en experimentos a largo plazo en Japón, calcularon el balance de Nitrógeno en los suelos arroceros sin aplicación del elemento y estimaron el suministro natural promedio en tales campos entre 49 y 91 kg/ha/año y 70 kg/ha/año como promedio para todos los distritos de Japón. En Hokkaido (Japón), un experimento de

capítulo 6. la fijación asociativa de nitrógeno

arroz realizado durante 41 años sin fertilizante nitrogenado mostró un rendimiento promedio de 2.8 t/ha de grano sin que declinara la fertilidad del suelo (Shiga, 1971). La cantidad de Nitrógeno tomado del suelo por el cultivo fue 53 kg/ha/año. El contínuo suministro al suelo, a pesar de su toma por el cultivo, es consecuencia de la fijación. En general, las algas verdi-azules han recibido más atención que las bacterias en relación con la fijación de N2 en los suelos arroceros. Sin embargo, distintas especies de bacterias fijadoras se encuentran actuando con mucha frecuencia en los campos de arroz, con predominio de los géneros Azotobacter, Azotomonas, Arthrobacter, Bacillus, Beijerinckia, Desulfomaculatum, Desulfovibrio, Flavobacterium, Pseudomonas y bacterias oxidantes de metano. Más recientemente se agregaron a estos géneros Azospirillum, Enterobacter, Derxia y Vibrio (Yoshida y Rinaudo, 1982). Factores ambientales que afectan la fijación asociativa de N2

Se conoce que algunas cepas se establecen mejor sobre unas especies vegetales que sobre otras, o que en determinados lugares son más efectivas que en otros (Boddey y Dôbereiner, 1988). Estas diferencias se atribuyen tanto a las peculiaridades de cada especie vegetal como a las de las distintas cepas de una misma especie bacteriana pero, sobre todo, se deben a las características edafoclimáticas de cada región. Entre los numerosos factores ambientales que afectan la supervivencia y el crecimiento de las bacterias fijadoras en el suelo se encuentra la disponibilidad de nutrientes orgánicos e inorgánicos, principalmente la posibilidad de acceso a fuentes de carbono abundantes para el crecimiento y la producción de energía. Estas bacterias pueden utilizar carbohidratos (monosacáridos, disacáridos y determinados polisacáridos), ácidos orgánicos, alcoholes monohídricos y polihídricos y otras sustancias. Incluso pueden utilizar algunos compuestos orgánicos volátiles aún en estado gaseoso, como por ejemplo vapores de alcohol etílico, de acetona y de algunos ácidos orgánicos volátiles. La humedad limita toda la vida microbiana del suelo, así como la producción vegetal. Roper (1983,1984) encontró que condiciones húmedas y calientes incrementaban la actividad nitrogenasa en el suelo cuando se añadía paja y reportó que la mayor actividad nitrogenasa ocurre en el suelo en o por encima de la capacidad de campo. En general, los sistemas de fijación de Nitrógeno trabajan mejor cuando el suministro de agua llega a ser apropiado (Tchan y Kennedy, 1987). Sin embargo, está claro que algunos

la fijación biológica del nitrógeno atmosférico en condiciones tropicales

diazotrofos son capaces de resistir prolongados períodos de sequedad, porque han podido ser aislados de suelos secos al aire que han sido almacenados por largos períodos (Moreno et al., 1986). Muchas de estas especies son capaces de formar quistes o células similares a quistes, lo cual ayuda a su supervivencia durante largos períodos de desecación (Lamm y Neyra, 1981). Un factor muy importante que tiene gran influencia sobre la población de diazotrofos en el suelo consiste en la acción asociativa y antagonista de los organismos que viven normalmente en el suelo. Así, se conocen muchos microorganismos que son capaces de estimular el crecimiento de los organismos fijadores de N2, como por ejemplo los microorganismos celulolíticos, que son capaces de degradar los resíduos vegetales del suelo. Pero también hay otros muchos, como los actinomicetos y hongos, que actúan como antagonistas. Zuberer y Roth (1982) reportan numerosos ejemplos de inhibición de los diazotrofos en la rizosfera de las gramíneas por la acción de los actinomicetos. En general, en dependencia de los grupos microbianos que predominan normalmente en un determinado suelo, así será la efectividad de la cepa que se inocula. Un requerimiento importante para la fijación de N2 de forma asociativa es la presencia de Fósforo asimilable, ya que las bacterias deben asimilar por lo menos 1 mg de Fósforo por cada 5 a 10 mg de N2 que se fijan (Alexander, 1977). La acción limitadora de la falta de este elemento se debe a que tiene un efecto fundamental en el intercambio del Carbono, en la multiplicación de las bacterias y en el mismo proceso de fijación. El Potasio también es necesario, pero en cantidades relativamente más pequeñas que el Fósforo, e incluso es suficientemente conocido que altas dosis del elemento impiden el desarrollo de las bacterias fijadoras. Calcio y Magnesio son muy importantes en el metabolismo de estas bacterias y su presencia es fundamental en el caso de algunos géneros como Azotobacter. La falta de estos elementos conduce a un alargamiento de la fase de crecimiento, así como a la vacualización e hinchamiento de las células, al mismo tiempo que se reduce la actividad metabólica y, en consecuencia, la capacidad de fijación de N2. Las bacterias que asimilan N2 pueden utilizar también amonio, nitratos y otras formas combinadas de Nitrógeno. En realidad, las sales de amonio son utilizadas con preferencia, por lo que la presencia de estos compuestos inhiben la fijación, bien sea por su presencia directa o como consecuencia de la transformación de urea o nitratos.

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capítulo 6. la fijación asociativa de nitrógeno

Muchos otros elementos inorgánicos son necesarios para el desarrollo de los microorganismos, pero solamente unos pocos están implicados en el metabolismo del N2, siendo los principales Molibdeno, Manganeso, Hierro y Boro, que son críticos para la reacción de fijación, especialmente el Molibdeno, que no solo es fundamental para la fijación del N2, sino también para la utilización de los nitratos, aunque en este último caso en menor grado. En algunos organismos fijadores puede sustituirse el Molibdeno por Vanadio, aunque no es tan efectivo. Las bacterias del género Azotobacter

Hasta la octava edición del Bergey´s Manual (1974) se consideraba que la Familia Azotobacteriaceae contenía cuatro géneros: Azotobacter, Beijerinckia, Derxia y Azomonas. En 1980, De Schmedt et al. sugirieron sacar el género Beijerinckia de la Familia, basándose en los análisis de rRNA, que demostraron que esté género no está relacionado con los demás. Algo semejante ocurrió con el género Derxia, ya que, además de los análisis de rRNA, las especies pertenecientes a este género tienen la capacidad de fijar N2 autotroficamente usando H2, propiedad que no tienen los otros géneros. Los análisis de taxonomía numérica y los inmunológicos, así como las diferencias morfológicas y fisiológicas ratificaron la separación de estos géneros, por lo que actualmente la Familia Azotobacteriaceae contiene solo los géneros Azotobacter, Azotococcus y Azomonas, que pueden diferenciarse por la formación de quistes y la composición del DNA (Tchan, 1984). Hoy se aceptan dentro del género Azotobacter las siguientes especies: A. chroococcum, A. vinelandii, A. beijerinckii, A. nigricans, A. armeniacus, A. paspali y A. macrocytogenes (Crum, 2004). Las bacterias que pertenecen a este género son Gram negativo, pleomórficas, es decir, de distintos tamaños y formas. Su tamaño oscila entre 2-10 x 1-2.5 µ. Las células jóvenes poseen flagelos peritricos que son usados como órganos locomotores. Las poblaciones viejas incluyen formas encapsuladas resistentes al calor, a la desecación y, en general, a las condiciones adversas. Estos quistes germinan en condiciones favorables para dar células vegetativas. En las figuras 5 y 6, pueden verse colonias caracteristicas en el medio de Ashby y la morfología de células tìpicas de Azotobacter chroococcum.

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En relación con estas bacterias, conocidas y estudiadas por primera vez por Beijerinck en 1901, se realizaron numerosas investigaciones en Rusia durante el siglo pasado, obteniéndose resultados que demostraron la efectividad de la inoculación en numerosos cultivos, como se pone de manifiesto en la Tabla 22 (Martínez Viera, 1986). Como puede verse, la respuesta de todos los cultivos fue positiva, aunque, como se verá más adelante, estas respuestas son muy inferiores a las que se obtienen con la aplicación de cepas aisladas de países tropicales. Figura 5 Colonias tipicas de Azotobacter sp. en medio de Ashby

Figura 6 Tinciòn Gram negativa de células de A. chroococum

Tabla 22 Efectividad de la Azotobacterina preparada en turba en experimentos realizados en Rusia.

Cultivos Algodón Avena Cebada Centeno Girasol Maíz Papa Remolacha Tabaco Trigo

Número de experimentos

Promedio de incremento del rendimieno (%)

21 77 60 15 12 9 86 126 3 164

13.7 8.0 12.8 6.6 12.1 15.5 9.7 8.8 10.7 7.7

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Sin embargo, existieron grandes variaciones en la efectividad del mismo biopreparado cuando se aplicó en condiciones de producción en lo que era aquel extenso país, lo que se debió a errores cometidos en la selección de cepas por no haber tomado en cuenta la influencia del quimiotaxismo de las bacterias frente a las secreciones radicales y por haberse seleccionado un grupo muy reducido de cepas que, como es lógico, no podían tener una capacidad igual de adaptación para todos los tipos de suelos existentes en aquella gran superficie. Estos errores trajeron como consecuencia la desaparición del programa de aplicaciones de biofertilizantes en la antigua URSS. En general, la capacidad de fijación de N2 por parte de Azotobacter puede variar grandemente de acuerdo con las condiciones del cultivo y con las características del suelo, con su temperatura y el grado de aireación, con la presencia de otras fuentes de Nitrógeno, con el carácter de las fuentes de Carbono y con la presencia de determinados microelementos, así como con la frecuencia de los pasajes de la cepa en el laboratorio, ya que si estos son muy frecuentes puede llegar a perderse la capacidad fijadora. Pero la cantidad de N2 fijado depende, en primer lugar, de las características de la cepa que se utiliza, ya que pueden encontrarse cepas activas y pasivas, siendo estas últimas las que han perdido la capacidad fijadora en condiciones ambientales desfavorables. Una buena cepa activa no asimila más de 10-15 mg de N2 por gramo de carbono consumido, aunque se han encontrado cepas capaces de asimilar hasta 30 mg (Madigan et al., 1997). Jensen, en 1940, desarrolló un trabajo monumental encaminado a conocer el papel que desempeñaba Azotobacter en la economía del nitrógeno en las plantaciones de trigo de Australia. Uno de los resultados más importantes consistió en encontrar que las cantidades del elemento fijadas en el suelo por estas bacterias pueden calcularse de acuerdo con el número de células presentes. Así, en el suelo con escaso contenido de Nitrógeno ocurría una fijación de 1 ppm por 5-10 millones de células presentes en 1 g de suelo; cuando se agregaba paja, la fijación era de 0.5-1 mg de nitrógeno/g de paja. La multiplicación de Azotobacter en el suelo depende en gran medida de la presencia de Fósforo y Potasio, y su ausencia reduce los niveles de biomasa y, en consecuencia, disminuye la fijación. Las fuentes de Fósforo pueden ser inorgánicas y orgánicas, puesto que se ha establecido la presencia de fosfatasa activa en los cultivos de estas bacterias (Tchan, 1989). Igualmente, Kumar y Narula (1999) y Narula et al. (2000) reportaron el aislamiento de cepas naturales de Azotobacter chroococcum de suelos de la India capaces de solubilizar Fósforo del suelo a pH altos (8-8.5).

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En términos generales, la fijación del Nitrógeno atmosférico por estas bacterias comienza cuando la concentración de Fósforo en el medio es de 0.004% y se inhibe cuando alcanza 0.8% (Mishustin y Silnikova, 1971). En el caso del Potasio, las cantidades necesarias son menores y cantidades altas impiden la fijación. También la presencia de Calcio y Magnesio es muy importante y la fuente más idónea de Calcio es el carbonato que, aún en concentraciones elevadas, no impide la asimilación de Nitrógeno. Molibdeno es fundamental para la fijación, en cantidades no mayores de 0.05 ppm, así como trazas de Boro, Manganeso, Zinc, Hierro y Cobalto. Cuando el pO2 del suelo es muy bajo puede limitarse la fosforilación. Los compuestos de Carbono y algunos reductores como NAD(P)H tienden entonces a acumularse, lo cual conduce a un paso metabólico posterior en el cual la acetil coenzima A es utilizada junto con el NAD(P)H para la síntesis del polímero de almacenamiento poli-beta-hidroxibutirato (PHB), el que puede alcanzar hasta el 70% del peso de las células y es degradado y usado cuando se restaura el suministro de O2. La presencia de PHB constituye una de las características de las colonias de Azotobacter y también se encuentra en algunas especies de Azospirillum y de las Rhizobiaceas. En lo que respecta a la salinidad, se considera que estas bacterias tienen un buen nivel de resistencia, aunque no debe pensarse que son abundantes en los suelos salinos (Mishustin y Silnikova, 1971). La escasez de materia orgánica del suelo constituye un factor limitante (Vanlawe et al., 2000), así como pH inferiores a 5. Se ha determinado también que Azotobacter produce una sustancia fungistática soluble en éter, termoestable, que inhibe el crecimiento de importantes hongos fitopatógenos como Fusarium sp, Helminthosporium sp, Alternaria sp y otros, y se ha logrado disminuir mediante la aplicación de Azotobacter la incidencia de enfermedades virales y bacterianas en papa, el crecimiento de hongos en semillas de trigo en germinación, las infecciones de Fusarium en trigo, de carbón en millo y de roya en trigo (Durkhead et al., 1998). En la Tabla 23 se muestra el efecto inhibidor in vitro que tienen estas bacterias, así como las del género Azospirillum, sobre algunos importantes hongos fitopatógenos (Lakshmi Kumari et al., 1975). Como se verá más adelante, estas bacterias también sintetizan una amplia gama de sustancias activas estimuladoras del crecimiento y el rendimiento de los cultivos, por lo

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que muchos autores le conceden mayor importancia a la capacidad para sintetizar estas sustancias (fitohormonas, vitaminas, aminoácidos) que a la actividad fijadora de nitrógeno. Filtrados libres de células no tienen efecto estimulador, por lo que se ha pensado que una proteína ligada a la célula, no identificada hasta el momento, es responsable por la estimulación (Subba Rao, 1996; Burdman et al., 2000). Como se deduce de todo lo expuesto, la importancia de las bacterias del género Azotobacter es muy grande, por la doble función de aportar nitrógeno y sustancias reguladoras del crecimiento a los cultivos, así como de inhibir el crecimiento de microorganismos fitopatógenos y hasta de solubilizar en determinadas condiciones el Fósforo del suelo. También se han citado una serie de factores que limitan las poblaciones de estas bacterias en el suelo. Sin embargo, no deben ser manejados estrictamente los datos que se han expuesto a la hora de aplicar en la práctica agrícola los microorganismos con características de biofertilizantes. Por ejemplo, en los suelos pobres en Azotobacter que fueron inoculados con estas bacterias se logró la colonización de la rizosfera de las plantas hospedantes y se produjo un efecto positivo en cereales y otros vegetales (Arshald y Frankerberger, 1993). De acuerdo a la experiencia cubana, es verdad que no se han podido aislar cepas de Azotobacter en suelos con pH 4.5, pero se han logrado

Tabla 23

Especie de hongo fitopatógeno

Sclerotium rolfsii Sclerotium sclerotiorum Fusarium moniliforme Fusarium solani Fusarium oxysporum Alternaria brasicola Colletotrichum falcatum

Efecto inhibitorio, expresado en mm de la zona de inhibición Azotobacter chroococcum

Azospirillum brasilense

22 20 18 18 18 17 23

17 18 6 2 2 20 20

Efecto antagonista de Azotobacter y Azospirillum frente a hongos fitopatógenos que atacan a las raíces de las plantas

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importantes resultados efectivos al realizar inoculaciones en suelos similares cultivados de tabaco (Martínez Viera et al., 1968). Es decir, que el ambiente rizosférico crea determinadas condiciones que facilitan la vida de estas bacterias, las cuales se comportan como si estuvieran en condiciones normales. Pero al envejecer el cultivo o una vez recogida la cosecha, la bacteria no puede permanecer en el suelo y desaparece. Mientras tanto, cumplió con su función de biofertilizante y bioestimuladora y debe ser inoculada de nuevo con el próximo cultivo, con la seguridad de que se obtendrán beneficios similares. Los países donde más se aplican estas bacterias en la práctica agrícola son India y Cuba. En la India existen 75 fábricas dedicadas a la producción de estos biofertilizantes. En Cuba se desarrolla, desde 1990, un programa de fabricación y aplicación de Azotobacter a base de cepas seleccionadas que son capaces de suministrar entre 30 y 50% de los requerimientos de Nitrógeno de las plantas, y se determinó la capacidad fijadora por parte de 15 cepas de A. chroococcum, cuyos valores oscilaron entre 12.2 y 25 nmol de C2H2/h. De todas las cepas se destacó la INIFAT-8, con 24.46 nmol C2H2 /h (Dibut et al., 2004). En la tabla 24 se presentan algunos resultados obtenidos en diferentes evaluaciones en condiciones de producción en la India, utilizando como procedimiento de inoculación la introducción de las raíces en el momento del trasplante (en el caso de las hortalizas) o de las semillas (en el caso de los cereales) en un inoculante semi-líquido. Tabla 24 Resultados obtenidos en la India con la inoculación de Azotobacter chroococcum en distintos cultivos

Cultivo

Incremento del rendimiento (%)

Autores

Cebolla Berenjena Tomate Col Arroz Trigo Trigo Maíz Maíz

Entre 18 y 22 Entre 20 y 24 Entre 15 y 29 Entre 25 y 50 Entre 15 y 22 Entre 15 y 30 Entre 10 y 20 Entre 15 y 30 Entre 20 y 35

Joi y Shinde, 1976 Mehrotra y Lehri, 1971 Lehri y Mehrotra, 1972 Lehri y Mehrotra, 1972 Mehrotra y Lehri, 1971 Sundara Rao et al.,1973 Zambre et al., 1984 Mishram y Shende,1982 Zambre et al., 1984

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Pueden observarse los importantes incrementos que se obtuvieron en todos los cultivos evaluados, muy superiores a los que aparecen en la Tabla 22 como reportados en condiciones templadas, a pesar de que estos últimos fueron logrados en condiciones experimentales, en las que se ajustan todos los factores que pueden influir en los resultados. Se pone así de manifiesto la superior respuesta a la inoculación que se logra en los países tropicales en comparación con los países templados, debido a las diferencias de condiciones agroecológicas que se ha comentado en varias oportunidades en el transcurso de este libro. En lo que se refiere a las hortalizas, el efecto de la inoculación con Azotobacter en Cuba puede resumirse con el ejemplo del tomate (Martínez Viera y Dibut,1996): 1. En los semilleros se obtiene un aumento en la población de plántulas entre 3040% más, lo que permite que se logre un mayor número de plantas viables por Kg de semillas, con la posibilidad de reducir la superficie necesaria para producir la cantidad de plántulas que deben ser trasplantadas posteriormente. 2. Las sustancias activas producidas por las bacterias aceleran el desarrollo de las plantas en el semillero: es mayor la altura en comparación con las plantas no tratadas (30% como promedio),el número de hojas (20%), el diámetro del tallo (40%) y la masa seca de las plantas completas (52%); estos resultados indican la posibilidad de acortar el período que transcurre entre la siembra del semillero y el momento en que las plantas están listas para ser transplantadas , ya que el desarrollo es más rápido y puede transplantarse entre 7 y10 días antes, con el consiguiente ahorro de agua, combustible, plaguicidas y mano de obra, al mismo tiempo que se reduce el ciclo total del cultivo. 3. El número de flores por planta es mayor en los campos tratados. 4. La fructificación de las plantas que fueron tratadas ocurre más temprano y el número de frutos por planta es 35% superior en la época normal y 60% fuera de época. 5. Se obtiene un incremento promedio de rendimiento de 25% en época normal y 40% fuera de época, lo que permite rendimientos altamente rentables en las siembras de períodos anormales.

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6. La calidad de los frutos es superior, con pesos y diámetros promedios que son significativamente más altos en las variantes tratadas. En lo que respecta al valor comercial, en la época normal son de primera calidad entre 80 y 85% de los frutos en comparación con 60-70% en las siembras no tratadas. 7. Estos resultados se obtienen eliminando el 30% del fertilizante nitrogenado. En las figuras 7 y 8 se presenta el efecto de la aplicación de esta bacteria fijadora de nitrógeno y estimuladora del crecimiento sobre las plantas de tomate y pimiento en semillero. Puede observarse la diferencia en el vigor de las plantas tratadas en comparación con las que no recibieron biofertilizante.

Figura 7 Efecto de la aplicación de A. chroococcum en semilleros de tomate Izquierda: inoculada Derecha: sin inocular

Figura 8 Efecto de la aplicación de A. chroococcum en semilleros de pimiento Izquierda: inoculada Derecha: sin inocular

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capítulo 6. la fijación asociativa de nitrógeno

En las figuras 9 y 10 se presenta el efecto de la aplicación de A. chroococcum sobre el desarrollo de los frutos de tomate y pepino en condiciones de plantación. Puede observarse la más rápida maduración y el mayor número y diámetro de los frutos de tomate en la variante tratada. En el caso del pepino, fue más alto el rendimiento por el mayor número y peso de los frutos inoculados. En la figura 11 se presenta el efecto de la aplicación de A chroococcum en semilleros de cebolla. En ambos racimos hay igual número de plantas y puede verse el mayor desarrollo y el vigor de las plantas inoculadas. Se observa que cuando las plantas inoculadas se van a trasplantar ya tienen los bulbos desarrollados, lo cual incide en el acortamiento del ciclo del cultivo.

Figura 9 Efecto de la aplicación de Azotobacter sobre el desarrollo de los frutos de tomate Izquierda: Planta inoculada Derecha: Planta sin inocular

Figura 10 Efecto de la aplicación de A. chroococcum sobre los frutos de pepino cv. Ashley Izquierda: Plantas inoculadas Derecha: Plantas sin inocular

la fijación biológica del nitrógeno atmosférico en condiciones tropicales

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En el caso de la yuca y la batata se aprovecha, además de la actividad fijadora de Nitrógeno, la capacidad que tienen las sustancias activas sintetizadas por las bacterias de estimular la fotosíntesis (acumulación de compuestos) y reducir la respiración (gasto de compuestos) de las plantas, lo que permite el almacenamiento de fotosintatos, que constituye la base de la formación de tubérculos y raíces, constituidas por material de reserva (Martínez Viera et al., 2004). En la tabla 25 se ofrecen los rendimientos obtenidos con la aplicación de biopreparados a base de A. chroococcum sobre dos clones de yuca ((Manihot sculenta) y dos de batata (Ipomoea batatas) (Martínez Viera, 1998). Como se observa, la aplicación no solo compensa el 50% del Nitrógeno necesario para estos cultivos, sino que además incrementa los rendimientos por la acción de las sustancias activas sintetizadas por las bacterias.

Figura 11 Efecto de la aplicación de A. chroococcum sobre semilleros de cebolla Izquierda: plantas sin inocular Derecha: plantas inoculadas

Tabla 25 Efecto de la aplicación de A.chroococcum sobre el rendimiento de yuca y batata(Tm/ha).

Variante

100 % N 50 % N 50 % N + Azotobacter

Clones de yuca

Clones de batata

CMC-90

Señorita

CEMSA 78354

31.5 20.0 32.6

32.9 20.6 35.4

25.0 18.7 30.6

30.0 20.6 34.3

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capítulo 6. la fijación asociativa de nitrógeno

Las bacterias del género Azospirillum

Estas bacterias fueron descritas por Beijerinck en 1925 con el nombre de Spirillum lipoferum y cayeron en el olvido hasta que fueron redescubiertas por Döbereiner y Day en 1976. Los estudios taxonómicos permitieron su reclasificación en el nuevo género Azospirillum. Inicialmente se describieron las especies A. lipoferum y A. brasiliense y actualmente se consideran también dentro del género las especies A. amazonense, A. halopraeferans, A. irakense, A. largimobile y A. doebereinerae (Caballero-Mellado, 2003). El aislamiento de estas bacterias puede hacerse a partir del suelo rizosférico, de la superficie de las raíces (rizoplano) o del interior de las raíces y tallos de numerosas plantas hospederas. Azospirillum coloniza la superficie y el interior de la raíz. En algunas gramíneas, como el millo, se han encontrado estas bacterias en la epidermis de la raíz, cubierta con una capa mucilaginosa; en otras, como trigo, sorgo, maíz y diferentes pastos proliferan en la zona de alargamiento de las raíces, principalmente en áreas de contacto longitudinal entre las células epidérmicas y la base de los pelos radicales, embebidas en capas mucilaginosas (Ramirez y Luna, 1995). Mediante técnicas inmunológicas, Levanony et al. (1998) encontraron que A. brasilense inoculado en trigo se asocia internamente con células corticales de las raíces, y localizaron a la bacteria en los espacios intercelulares de las células corticales en las zonas de alargamiento y de formación de pelos radicales, pero no en la endodermis y el sistema vascular. Desde un punto de vista evolucionista, se ha sugerido que estas bacterias son organismos intermedios entre los fijadores libres y los simbióticos; la localización de los puntos de fijación de Nitrógeno dentro de las células de las plantas hospedantes ha apoyado esta hipótesis, porque no se admite hoy que la fijación simbiótica tenga que estar confinada dentro de estructuras visibles como los nódulos cuando existe la posibilidad de otras formas de asociación, tales como el establecimiento dentro del tejido cortical de las raíces. La fijación de O2 por estas bacterias ocurre en condiciones microaerofílicas y pueden cumplir esta función en condiciones extremas, entre 0.05 y 0.1 atmósferas de O2 (Moens, 1996; Dommelen, 1998). Los requerimientos de temperatura para Azospirillum son altos y su mayor crecimiento ocurre entre 32 y 36º C. La fijación máxima de Nitrógeno se logra entre 33 y 40º C y disminuye de forma pronunciada por debajo de 33º C. La incidencia de la bacteria en el suelo está controlada en alto grado por el pH, con un punto óptimo entre 6.8 y

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7.8; por debajo de pH 5 no es posible lograr su aislamiento. Factores abióticos tales como alto contenido de arcilla y de materia orgánica y buena capacidad de retención de agua afectan positivamente la presencia de Azospirillum en el suelo, mientras que alto contenido de partículas arenosas y elevada concentración de Carbonato de Calcio afectan negativamente su supervivencia. A pesar de la influencia de estos factores, es válido para estas bacterias lo que se expresó anteriormente en el caso de Azotobacter acerca de la inoculación en suelos con dificultades, ya que el ambiente rizosférico tiene determinadas condiciones que favorecen el desarrollo de Azospirillum independientemente de las características del suelo, aunque el envejecimiento o la cosecha del cultivo causará la desaparición de estas bacterias después de que aportaron los beneficios que se esperaban. Los azúcares no constituyen sustratos apropiados y la actividad máxima de fijación se obtiene con malato, succinato, lactato y piruvato. Las bacterias del género Azospirillum producen bacteriocinas y sideróforos (agentes quelantes del hierro), los que tienen un efecto antagonista sobre agentes fitopatógenos de las raíces. En la Tabla 23 pudieron verse los resultados de esta actividad frente a un grupo de hongos fitopatógenos. En la Tabla 26 se presenta la distribución geográfica de Azospiriillum (Sarro da Silva y Döbereiner, 1977). Puede verse la abundancia de muestras positivas en las regiones tropicales en comparación con los bajos resultados obtenidos en las regiones templadas, lo que indica que los mayores beneficios de la aplicación de estas bacterias al suelo pueden ser logrados Tabla 26 Distribución geográfica de Azospirillum en raíces y suelos colectados en varias regiones del mundo.

Origen de las muestras Europa EE.UU. África Colombia Brasil Tropical Brasil Subtrop.

Raíces de pastos

Suelo

Número de muestras

% Positivas

Número de muestras

% Positivas

62 58 54 926 226

11 45 43 61 22

48 6 79 192 -

8 17 53 62 -

112

capítulo 6. la fijación asociativa de nitrógeno

en el trópico. De este estudio se pudo deducir que los factores que más limitan la presencia de Azospirillum son el pH y el tipo de vegetación; así, los suelos de bosques tropicales y de sabanas muestran las bacterias esporádicamente pero, cuando la tierra es cultivada, aumenta su presencia de manera considerable; también pueden encontrarse en suelos semi-desérticos (Bashan y Holguin, 1997). Muestras con pH bajo fueron positivas cuando el contenido de Aluminio era también bajo. Se ha demostrado que existe una gran variabilidad genotípica entre cultivares de trigo, maíz, y otros cereales en cuanto a lograr una eficiente fijación de Nitrógeno en asociación con Azospirillum y también se ha reportado la presencia de quimiotaxismo, lo que es causa de que plantas C4, como maíz, se asocien principalmente con A. lipoferum, mientras que las plantas C3 se asocian con A. brasilense (Döbereiner, 1983). Estos datos deben ser manejados cuidadosamente por los investigadores y fabricantes de inoculantes para seleccionar las cepas adecuadas con el fin de inocular diferentes especies y variedades de gramíneas. Desde los hallazgos iniciales sobre Azospirillum se creó una expectativa en torno a los resultados prácticos de la introducción de estas bacterias en la agricultura. En comparaciones de inoculación de distintas bacterias fijadoras ((Azotobacter, Beijerinckia y Azospirillum) sobre maíz, los mejores resultados se obtuvieron con Azospirillum (Jaime et al., 1999; Zanier et al., 2001). La inoculación de la caña de azúcar tratada con bajos niveles de fertilizante nitrógenado produjo un aumento en el rendimiento, igual que ocurrió con sorgo y maíz (Macalintal y Urgel, 1992). Stolfus et al. (1997) informaron que la fijación en suelos inundados aporta hasta 50 kg/ha/ciclo de cultivo. Los resultados positivos obtenidos en Israel en aplicaciones de campos de trigo han conducido a establecer el uso de Azospirillum en aquel país como una práctica agronómica (Okon et al., 1993), aunque aún debe verificarse más profundamente el éxito de las aplicaciones. La causa de que los resultados positivos sean inconsistentes en algunos lugares se atribuye a que no se conoce cual es el número necesario de bacterias ni la cantidad de sustratos carbonados que deben existir para que se logre un aporte significativamente adecuado a las necesidades de Nitrógeno de las plantas de trigo (Kennedy y Tchan, 1992). En la Tabla 27 se muestran algunos resultados obtenidos por diferentes autores con la inoculación de dos especies de Azospirillum en distintos países, inoculando las semillas

la fijación biológica del nitrógeno atmosférico en condiciones tropicales

113

mediante su mezcla con producto en polvo que contenía las bacterias (Martínez Viera, 1986). En México se llevó a cabo en 1999 la inoculación de 450 000 ha de maíz y 150 000 ha de sorgo, cebada y trigo, empleando cepas seleccionadas de Azospirillum. La evaluación del rendimiento en grano se efectuó sobre 675 ha en 170 lugares de México. El éxito de la inoculación estuvo en el rango entre 62 y 95%, de acuerdo con el cultivo, y los incrementos del rendimiento fluctuaron entre 6 y 98%, de acuerdo con la región evaluada. El incremento promedio de la producción en todos los lugares evaluados fue de 26%. Las variaciones en los resultados dependieron de la variedad y cultivo, tipo de suelo, uso y nivel de fertilizantes (Caballero-Mellado, 2003). La bacteria endófita Gluconacetobacter diazotrophicus

Los microorganismos endófitos comprenden a los hongos y bacterias que viven sin causar daño en el interior de células y tejidos de plantas superiores durante una parte considerable de su ciclo de vida, y pueden localizarse en espacios intracelulares, intercelulares o en el tejido vascular. Existe una extensa diversidad de endófitos, y los que se han aislado con más frecuencia pertenecen a los géneros Pseudomonas, Enterobacter, Bacillus, Erwinia y Xantomonas (Muñoz-Rojas y Caballero-Mellado, 2003). Tabla 27 Resultados obtenidos en distintos países con la inoculación de Azospirillum brasiliense y A. lipoferum en diferentes especies de gramíneas

Cultivo

País

Bacteria

Maíz í íz Maíz í íz Sorgo Sorgo Trigo Trigo Trigo Trigo

Brasil Israel Egipto India India India Israel Bélgica

A. lipoferum A. brasilense A. lipoferum A. brasilense A. brasilense A. lipoferum A. brasilense A. brasilense

Incremento del rendimiento (%) 25 34 Entre 60 y 100 Entre 50 y 80 Entre 15 y 26 Entre 40 y 60 Entre 10 y 25 28

Trigo

Alemania

A. lipoferum

Entre 35 y 60

114

capítulo 6. la fijación asociativa de nitrógeno

La más importante de las bacterias endófitas fijadoras de Nitrógeno atmosférico, por su gran importancia práctica, es la que hoy se conoce como Gluconacetobacter diazotrophicus, que fue descubierta por Cavalcante y Döbereiner (1988) en raíces y tallos de caña de azúcar cultivada en Brasil y bautizada como Saccharobacter nitrocaptans, nombre que cambió al poco tiempo por Acetobacter nitrocaptans y, pocos meses después, por Acetobacter diazotrophicus (Gillis et al., 1989). Yamada et al. (1997) propusieron, y así fue aceptado, el nombre actual de Gluconacetobacter diazotrophicus. El género Gluconacetobacter comprende además a las especies G.liquefaciens, G. xylinus, G. hansenii, G. europeaus, G. obodiens, G. pomorum, G. sacchari, G. johannae y G. azotocampans (Fuentes et al., 2001; Muñoz-Rojas y Caballero-Mellado, 2003). G. diazotrophicus produce sustancias estimuladoras del crecimiento vegetal y es capaz de excretar más del 50% del Nitrógeno fijado en una forma asimilable por la planta (Cojho et al., 1993). Se ha calculado que es capaz de entregar entre 11 y 270 kg de Nitrógeno/ha a la caña de azúcar (Döbereiner, 1993), y las cualidades excepcionales de esta bacteria se ponen además de manifiesto porque su pH óptimo es 5.5 y puede vivir en concentraciones de sacarosa tan altas como 30%. Se encuentra en los vasos xilemáticos del tallo de plantas maduras y en el espacio apoplástico del tallo. Las poblaciones de las bacterias diazotrofas endofíticas se ven disminuídas cuando se aplica una alta fertilización nitrogenada, lo que ha sido demostrado en México, India y Brasil (Fuentes-Ramirez et al.,1999; Muthukumarasamy et al.,1999; Reis et al., 2000). Los aislamientos de la bacteria se han realizado en su mayoría a partir de especies vegetales que se reproducen de forma asexual y se ha propuesto que su dispersión geográfica a gran distancia se lleva a cabo durante la reproducción del material vegetativo que alberga a la bacteria de forma natural; por ejemplo, se ha aislado la bacteria a partir de esquejes de caña de azúcar cultivados en Cuba, que fueron transportados a Canadá y propagados bajo condiciones de invernadero (Muñoz-Rojas y Caballero-Mellado, 2003). También ha sido aislada de insectos de la caña de azúcar, como las cochinillas, los cuales pueden actuar como agentes de transmisión de la bacteria (Franke et al., 1999). En la Figura 12 se muestra el crecimiento de G. diazothrophicus en forma de colonias amarillas sobre el medio cultivo LGI-P. Las especies vegetales de las que ha sido aislada esta bacteria endofítica han sido las siguientes: en primer lugar, la caña de azúcar, donde se descubrió su existencia; posteriormente fue aislada de batata (Ipomoea batatas) (Paula et al., 1993) y de hierba

la fijación biológica del nitrógeno atmosférico en condiciones tropicales

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elefante (Pennisetum purpureum) (Reis et al., 1994). Mas recientemente fue aislada de cafeto (Coffea arabica) (Jiménez-Salgado et al., 1997), así como de plantas adultas e hijuelos de piña ((Ananas comosus) (Tapia-Hernández et al., 2000), de la gramínea Eleusine coracana y de maíz (Zea mays), melón (Cucumis melo) y remolacha (Beta vulgaris) (González y Barraquio, 2000). En los últimos tiempos, se ha reportado el aislamiento en Cuba a partir de auyama (Cucúrbita pepo), ocumo ((Xanthosoma sp), papaya (Carica papaya), yuca (Manihot sculenta) y rosa (Rosa montezumae) (Dibut et al., 2005). Como se observa, con excepción de cafeto y rosa, la tendencia de la bacteria es habitar dentro de especies vegetales de alto contenido en azúcares. La distribución de las poblaciones en los diferentes órganos de las plantas es variable de acuerdo con la especie vegetal; así, en caña de azúcar, en Brasil, los estudios arrojaron un título entre 103 y 107 UFC/g de tejido fresco y en maíz en Estados Unidos se encontraron poblaciones de 105 UFC/g de tejido fresco (Döbereiner et al., 1993). En Cuba se reportaron poblaciones entre 103-105 en maíz, batata y ocumo, entre 102-104 en yuca y entre 104-107 en caña de azúcar, dependiendo las variaciones del órgano vegetal. En papa no se ha conseguido aislar la bacteria en condiciones naturales, pero ésta se encuentra en concentraciones elevadas (106 UFC/ g de tejido fresco) después de la inoculación y produce un marcado efecto sobre el cultivo. Las perspectivas que presentan las bacterias diazotróficas endofíticas son muy grandes, aunque es necesario todavía hacer muchas investigaciones para lograr el mayor provecho con su utilización. Estas bacterias no se han encontrado en la zona rizosférica y muy raramente sobreviven en el suelo. No infectan fácilmente plantas intactas de caña o de otros cultivos, por lo que se están buscando métodos que faciliten la penetración de la bacteria. Hoy existe la posibilidad de introducir estos organismos diazotróficos en Figura 12 Colonias de G. diazothrophicus en medio LGI-P

116

capítulo 6. la fijación asociativa de nitrógeno

las raíces de las plantas por la vía de las esporas de micorrizas vesículo-arbusculares, lo que abre un campo totalmente nuevo para la Biotecnología. En caña de azúcar, batata y sorgo dulce se han logrado infecciones exitosas con G. diazotrophicus mediante la coinoculación con el hongo micorrízico Glomus clarum (Cocking, 2003). En el caso de la caña de azúcar, sobre todo en Brasil, se ha considerado prematuro utilizar inoculantes a base de G. diazotrophicus, porque las bacterias parece que están bien establecidas en el cultivo y se considera necesario obtener mayores conocimientos que permitan lograr la mayor efectividad con las inoculaciones con otras cepas. Las especiales cualidades de G. diazotrophicus permitieron decir a la Profesora Johanna Döbereiner (1993): “Todas estas observaciones cambian completamente el concepto de asociación planta-diazotrofo, la cual se pensaba que era una asociación solamente casual de las raíces de las plantas, y abre enteramente nuevas vías para expandir la fijación biológica del nitrógeno como una sustitución a los fertilizantes nitrogenados por las gramíneas”. La fijación de N2 en la filosfera

En el medio tropical ocurre también fijación de nitrógeno en la filosfera, zona que está en contacto con la hoja y la atmósfera, sometida a la actividad reguladora de ambas. Los microorganismos que viven en las hojas, entre los cuales se encuentran las bacterias del género Azotobacter, toman el agua y los gases disueltos de la atmósfera y los nutrientes a partir de los exudados de las hojas vivas, los cuales están regulados por el estado nutricional de las plantas. El follaje funciona como soporte, trampa de agua y centro de producción de nutrientes y condiciona el medio para el crecimiento microbiano; además, procesa y distribuye compuestos nitrogenados en flujo a través de la planta hacia las partes más jóvenes. Esta propiedad, y la habilidad para concentrar materia resuspendida o disuelta en la atmósfera con gran rapidez, hace que las hojas tengan una gran importancia en los ecosistemas agrícolas (Bhat et al., 1971). La abundante población microbiana que se encuentra en las hojas es, por sí misma, prueba de un ambiente que posee considerable valor nutritivo; la humedad contribuye también al desarrollo y supervivencia de ésta población, ofreciéndole espacio y estimulando el intercambio de productos metabólicos. El importante papel que desempeña

la fijación biológica del nitrógeno atmosférico en condiciones tropicales

117

la filosfera en la economía del Nitrógeno de un ecosistema natural fue sugerido inicialmente en bosques semidecíduos de las regiones tropicales, basado en el conocimiento de que, en ellos, la biomasa alcanza valores de 500 a 1700 Kg/Ha, muy superiores a los encontrados en los bosques subtropicales y templados, en los que no excede de 400 Kg/Ha; además, la fracción verde asimiladora es 10 a 20 veces superior en el trópico a la de la zona templada y 4 veces la de los bosques subtropicales (Debinstein, 1970). Ruinen (1974) reportó desde 1954 la presencia permanente de las bacterias fijadoras de nitrógeno sobre la filosfera de distintas plantas de Java y Sumatra, donde aisló estas bacterias en 192 y 198 muestras de hojas de árboles, arbustos, enredaderas, epífitas y vegetación costera. Recuentos de bacterias pertenecientes al género Azotobacter sobre hojas maduras de cacao, en Surinam, dieron un promedio de 1.3 x107/cm2. En Egipto se estudiaron 58 muestras de árboles, cultivos de campo, vegetales, plantas ornamentales, silvestres y acuáticas y solamente 2 de las muestras no contenían Azotobacter (Abd-El-Malek,1971). En la India se encontró una fijación de 10 mg N/g de manitol oxidado sobre hojas de jacinto de agua (Eichhornia crassipes), con un abundante crecimiento de A. chroococcum, incluso en el tejido interior de las hojas (Iswaran et al., 1973). Se ha demostrado la presencia de la enzima nitrogenasa en el interior de las hojas de caña en Brasil (Olivares et al., 1997), lo cual constituye una confirmación irrebatible de que ocurre la fijación en este medio. Al determinar los métodos de aplicación de biofertilizantes a base de A. chroococcum en Cuba se aprovecharon los conocimientos existentes acerca del papel de la filosfera, y se comprobó que las aplicaciones foliares en las extensas plantaciones de cítricos del país, utilizando el avión, eran de gran efectividad, como se demuestra en la tabla 28 (Martínez Viera y Dibut, 2006). Puede verse en la tabla que, por el método de aplicación aérea, se consigue no solo la sustitución del fertilizante, sino que permite una alta expresión de las sustancias activas sintetizadas por las bacterias, que estimulan la floración y la fructificación, lo que se traduce en rendimientos más altos. En este sentido, la inoculación actúa en sustitución de productos comerciales a base de aminoácidos, hormonas vegetales y otras sustancias que se ofrecen para estos mismos fines y tienen un precio elevado. En la Tabla 29 puede verse también el efecto de las aplicaciones foliares sobre el mango en el Estado Sinaloa (México) (Martínez Viera et al., 2003).

capítulo 6. la fijación asociativa de nitrógeno

118

Como se observa, se produjo un incremento de 28% en el número total de frutos cosechados y de 20% en el peso de los frutos en la variante tratada con el biofertilizante. Desde el punto de vista económico, un importante efecto adicional de la biofertilización consistió en la aceleración de la fructificación; así, 38% de los frutos fue cosechado en la primera recogida en la variante tratada, mientras que en el control fue solo 22%. La segunda recogida fue más baja en la variante tratada, porque se habían recogido más frutos en la primera y los árboles estaban en recuperación, mientras que la tercera fue 44% más alta. La cosecha total fue 28% superior en número de frutos y 21% en peso en la variante biofertilizada.

Tabla 28

Tratamiento

Rendimiento (Tm/Ha)

Toronja

50 % N + Azotobacter 100 % N 50 % N

73.00 66.50 57.90

50 % N + Azotobacter 100 % N 50 % N

48.00 36.25 27.60

Naranja

Efecto de la aplicación foliar de A. chroococcum sobre el rendimiento de toronja y naranja en las condiciones de Cuba.

Tabla 29 Recogida

1 2 3

Total

Número de frutos

Control

Biofertilizante

1472

1886

328 796 348

716 540 630

Peso de la cosecha (kg) Control Biofertilizante

210.8 310.4 218.6

730.8

349.2 218.8 312.6

882.6

Efecto de la aplicación foliar de A. chroococcum sobre el rendimiento del mango en el Estado Sinaloa (México)

la fijación biológica del nitrógeno atmosférico en condiciones tropicales

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Capítulo 7

Preparación y aplicación de inoculantes a base de bacterias fijadoras de nitrógeno atmosférico

La práctica agrícola de inocular las plantas con bacterias beneficiosas es muy antigua. En el último tercio del siglo XIX ya era un método muy extendido en los Estados Unidos el mezclar las semillas de leguminosas con suelo inoculado naturalmente. En 1896, Nobbe y Hiltner patentaron por primera vez un producto para inocular las leguminosas con Rhizobium, al que dieron el nombre de “Nitragin”. Los inoculantes que se utilizaban en aquella lejana época para aplicar al suelo las bacterias fijadoras de Nitrógeno atmosférico fueron cultivos puros de las bacterias propagados en medios sólidos a base de agar y envasados en botellas de cristal con un volumen entre 250 y 300 mL. Después de una larga evolución encaminada a satisfacer las demandas del mercado, hoy se presentan estos biopreparados en forma líquida o como materiales sólidos absorbentes de distintos tipos, llamados portadores, que son impregnados con cultivos líquidos de la bacteria que se quiere inocular. Una vez que se demostró la efectividad de estas nuevas tecnologías, durante muchas décadas se han estado introduciendo bacterias en el suelo para mejorar el desarrollo de los cultivos de mayor importancia económica, mediante la inoculación directa del suelo o la mezcla de preparados bacterianos en polvo con semillas, raíces o tubérculos. El efecto de la inoculación con bacterias fijadoras de Nitrógeno atmosférico de forma simbiótica o asociativa, que al mismo tiempo son estimuladoras del crecimiento, puede variar en dependencia de la cepa bacteriana, de la especie vegetal, del tipo de suelo, de la densidad del inoculante y de las condiciones ambientales. En general, la población de un diazotrofo que se ha inoculado al suelo comienza a disminuir a los pocos días después de la inoculación, debido a que tiene que competir con una extensa gama de microorganismos rizosféricos bien adaptados a las condiciones de todos los factores ambientales del lugar. Por otra parte, al envejecer las plantas se empobrecen las secreciones de las raíces y se hace más difícil la adquisición del alimento, por lo cual disminuyen las poblaciones.

120

capítulo 7. preparación y aplicación de inoculantes a base de bacterias fijadoras de nitrógeno atmosférico

Por las razones expuestas, la formulación del inóculo debe suministrar a los microorganismos que se quieren inocular las condiciones necesarias para sobrevivir hasta que se adaptan a las condiciones del ambiente rizosférico y se hacen competitivas durante el tiempo necesario para que puedan aportar a las plantas los beneficios esperados. De acuerdo con todo lo expuesto, la producción de inóculos comerciales es el paso por el cual las cepas seleccionadas de una determinada especie microbiana son multiplicadas en masa y comercializadas en formulaciones que permiten su aplicación a los cultivos de importancia económica. Método de selección de cepas

El primer objetivo cuando se quiere preparar un inóculo es utilizar la cepa bacteriana más activa y efectiva. La optimización de una formulación inoculante es independiente de la cepa utilizada porque, en general, la mayoría de las cepas de una misma especie microbiana tienen características fisiológicas comunes. Esto generalmente no es aplicable cuando se trata de diferentes géneros bacterianos (Bashan, 1998). Tomando en cuenta estos conceptos, se han elaborado esquemas para seleccionar cepas de microorganismos con mayor eficiencia y efectividad como biofertilizantes y bioestimuladores para cada una de las especies vegetales, incluyéndose en ellos los aspectos siguientes: –

Estudios quimiotáxicos utilizando secreciones de las raíces de diferentes especies vegetales, con el fin de seleccionar las cepas que más pueden ser atraídas por las secreciones radicales de cada una de las especies.

–

A las cepas que han sido seleccionadas en las pruebas de quimiotaxismo se les hace la prueba de reducción del acetileno (ARA) y de solubilización del fósforo, para seleccionar las que tienen mayor capacidad de fijación de nitrógeno atmosférico o de solubilización del fósforo del suelo.

–

A las que presentan valores más altos para la fijación y la solubilización se les hacen pruebas en bandejas en las que se han sembrado semillas de la especie vegetal que se desea probar, para seleccionar las que presentan mayor actividad estimuladora del crecimiento vegetal.

la fijación biológica del nitrógeno atmosférico en condiciones tropicales

121

–

Terminada la selección, las cepas se cultivan in vitro en medios que contienen los plaguicidas que más se usan en la región, incluyendo los fungicidas para tratar las semillas, con el fin de conocer si alguno de ellos puede hacer fracasar la inoculación.

–

Las cepas seleccionadas son sometidas a los estudios taxonómicos correspondientes para su correcta identificación y se les realizan las pruebas toxicológicas para demostrar su inocuidad.

En la figura 13 se muestran algunos de los resultados que pueden obtenerse con la inoculación de semillas de tomate con distintas cepas, con el fin de seleccionar las más efectivas. Características de los portadores

Los portadores son los vehículos que sirven para transportar los microorganismos vivos desde la fábrica hasta el campo. Un buen portador debe tener la capacidad de Figura 13 Efecto de la inoculación de distintas cepas de bacterias fijadoras de N sobre el desarrollo de plantulas de tomate

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capítulo 7. preparación y aplicación de inoculantes a base de bacterias fijadoras de nitrógeno atmosférico

mantener una población elevada de células viables de la cepa bacteriana que ha sido seleccionada, en buenas condiciones fisiológicas, durante el mayor tiempo posible. Según Bashan (1998), el portador debe ser un material asequible y disponible, fácilmente esterilizable en el autoclave o mediante rayos gamma, uniforme desde los puntos de vista físico y químico, no tóxico, biodegradable, con alta capacidad de hidratación y utilizable por el mayor número posible de especies y cepas bacterianas. También tiene que ser fácilmente manufacturado y mezclado, manteniendo sus características durante un tiempo largo de almacenamiento, al mismo tiempo que debe tener propiedades adhesivas para que pueda recubrir las semillas y permitir una rápida liberación de las bacterias en el suelo. Hay muchos materiales que pueden ser utilizados como portadores, y entre ellos se encuentran turba, arcilla, suelo inorgánico, compost, abono de establo, humus de lombriz, harina de soya, aceite de soya o maní, cachaza y otros residuos agrícolas, materiales inertes como vermiculita, perlita, zeolita, geles de poliacrilamida, alginato y otros. En los últimos años se ha utilizado el método de encapsular las bacterias con portadores sintéticos con el objetivo de incrementar la supervivencia durante el almacenamiento. Al bajar el contenido de agua, las bacterias permanecen inactivas, resistentes a las condiciones ambientales e insensibles a la contaminación (Paau, 1988). Los inoculantes que han sido sometidos al proceso de deshidratación tienen un período muy largo de viabilidad, aunque se ha demostrado que una importante proporción de células bacterianas son destruidas durante el proceso (Paul et al., 1993); sin embargo, las supervivientes son suficientes para que pueda hacerse una inoculación efectiva. Para preparar el inoculante se introduce en el portador una cantidad determinada de cultivo líquido del microorganismo que se quiere aplicar al suelo, procurando que la humedad del sustrato no sea mayor de 60%. El portador se puede utilizar esterilizado previamente o sin esterilizar; el primero es más caro debido al costo del proceso de esterilización, pero presenta numerosas ventajas que se ponen de manifiesto en la Tabla 30, según Bashan (1998). Se ha demostrado en muchos países que, en el caso de los inoculantes a base de Rhizobium, las poblaciones contaminantes superan varias veces a las de bacterias benéficas cuando se utilizan portadores sin esterilizar. Los altos niveles de contaminantes hacen

la fijación biológica del nitrógeno atmosférico en condiciones tropicales

123

que las bacterias que se desea inocular pierdan su efectividad, pero a la vez representan un peligro potencial para la salud del hombre, los animales y las plantas. Control de calidad de los biopreparados

El éxito de la aplicación de los biofertilizantes depende de la calidad del inoculante utilizado, y es necesario que contenga un número adecuado de células viables efectivas, con el fin de asegurar la infección de las plantas. Este requisito es fundamental, y debe

Tabla 30 Comparación de inoculantes a base de turba estéril y no estéril

Parámetros del inoculante Estéril

No estéril

Población de bacterias benéficas

Alta

Variable

Longevidad

Alta

Relativamente baja

Adición de nutrientes para aumentar la población final

Posible sin sacrificar la calidad final del inoculante

Puede ocurrir desarrollo más rápido de contaminantes

Elección de materiales para ser usados como portadores

Muchos materiales no son esterilizables o cambian su composición con el proceso

Casi ilimitada

Requerimientos de trabajo

Muchos y caros

Pocos y baratos

Equipamiento requerido

Grandes y costosos autoclaves

No necesita

Espacio necesario estéril

Grande

No necesita

Monitoreo de contaminación

Esencial para el control de calidad

Costo total de producción

Alto

Mucho más bajo

124

capítulo 7. preparación y aplicación de inoculantes a base de bacterias fijadoras de nitrógeno atmosférico

organizarse un mecanismo adecuado para garantizar que no se engañe a los agricultores, ya que ellos no tienen medios para determinar la calidad del producto que están recibiendo. Algunos países desarrollados, entre los que no se cuenta Estados Unidos, tienen regulaciones oficiales para controlar la calidad de los inoculantes, pero en la mayor parte de los países latinoamericanos esto no ocurre. En algunos lugares como Canadá y Francia ocurrió un mejoramiento en la calidad de los inoculantes después de estas regulaciones (Brockwell et al., 1988), pero en gran parte de ellos no se regula el nivel de contaminación ni la población de organismos benéficos que debe existir en el inóculo, a pesar de que en casi todos se utilizan portadores sin esterilizar. En América del Sur solo Brasil y Uruguay y en América del Norte solo Canadá tienen autoridades regulatorias apoyadas por la legislación. En Cuba existe un Registro en el cual hay que inscribir los diversos bioproductos exponiendo las características que deben poseer y los resultados de las pruebas de campo realizadas por instituciones oficialmente autorizadas y se comienzan a implantar oficialmente las normas d e control de calidad, igual que ocurre en Venezuela. Australia, África del Sur, Nueva Zelandia e India también tienen importantes programas de control. Pero los más exigentes requisitos para el control de calidad de los inoculantes los ha puesto Francia, donde está prohibido el más mínimo nivel de contaminación y se exigen pruebas de campo antes de aceptar nuevas formulaciones (Cantroux, 1991). En Estados Unidos e Inglaterra también existen las normas, pero su cumplimiento se deja a discreción de los dueños de empresas. En general, no existen normas internacionales para el control de calidad de los biofertilizantes y bioestimuladores microbianos, por lo que la calidad de los inoculantes varía de país en país, debido a que la falta de estos mecanismos de control no incentiva a los fabricantes a establecer sus propios programas de calidad, como ha sido reconocido por NiffTAL, el organismo más importante que asesora, coordina y divulga en el mundo la producción y el uso de los inoculantes para las leguminosas. Hace pocos años, en el año 2001, el Buró de Standards de la India (BIS), país donde hay unas 75 fábricas de biofertilizantes, publicó las especificaciones para los inoculantes a base de Rhizobium, Azospirillum, Azotobacter y solubilizadores de fósforo. En la Tabla 31 se exponen estas especificaciones (Kannaiyan, 2003).

la fijación biológica del nitrógeno atmosférico en condiciones tropicales

125

En estas especificaciones se ha sido muy conservador en algunos de los parámetros, lo cual atenta contra la calidad y la efectividad que debe tener el biopreparado. Por ejemplo, el número de células/g está muy bajo, de acuerdo con las normas que ha recomendado la FAO para Rhízobium, que no debe ser inferior a 108, y de acuerdo a la experiencia con Azotobacter o Azospirillum, ya que las poblaciones señaladas en la tabla no permiten lograr la debida efectividad, no solo en la fijación de Nitrógeno sino también en la estimulación del crecimiento vegetal. Estas poblaciones no deben ser menores de 108-9 UFC/g de suelo y pueden lograrse con las tecnologías adecuadas. Como se ha explicado en uno de los capítulos anteriores, Australia es el país que mejor maneja la inoculación de las leguminosas. Según las especificaciones de la Australian Inoculant Research and Control Service (AICRS), un buen inoculante a base de Rhizobium o Bradyrhizobium debe presentar las siguientes características (Subba Rao, 1996): Tabla 31 Especificaciones de control de calidad del Buró de Standards de la India para los biofertilizantes y bioestimuladores

Parámetros

Rhizobium

Azotobacter

Azospirillum

Solubilizadores

Base

Portador

Células/g

I07

106

I07

108

Contaminación

0 a dilución 10-5

0 a dilución10-5

0 a dilución 10-7

Expiración

6 meses

6.5-7.5

Cepa

Chequeada serológicamente

No específica í ífica

Partícula del portador

150-212 micras

106 micras

Otros

Nodulación positiva. Aumento de materia seca superior a 50%

Fijación de N mayor de 5 mg/ g de sacarosa

Película blanca en medio NFB a dilución 10-7

Zona de solubilización mayor de 8 mm a dilución 10-5

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capítulo 7. preparación y aplicación de inoculantes a base de bacterias fijadoras de nitrógeno atmosférico

1. Tener un solo portador. 2. Contener un mínimo de 108 células viables dentro de los 15 días después de su fabricación y 107 dentro de los15 días antes de la fecha de expiración cuando se almacena a 6-100C. 3. El período máximo de expiración no debe ser mayor de 6 meses desde la fecha de fabricación. 4. No debe tener contaminación con otros microorganismos. 5. El pH del inoculante debe estar entre 6.0 y 7.5. 6. Tiene que ocasionar buena nodulación antes de la fecha de expiración en todas las especies vegetales que aparezcan listadas en el paquete. 7. El total de masa seca de las plantas inoculadas debe ser más alto, de una forma significativa, en comparación con los controles no inoculados. 8. El material portador debe pasar por malla 75-106 micras. Biofertilizantes mixtos utilizando bacterias fijadoras de N2

Hasta mediados de la década de los 90, en el mundo se habían realizado estudios relativamente escasos en relación con la inoculación simultánea de varios microorganismos; en su mayor parte, los resultados que se han mostrado no habían rebasado el nivel de macetas con suelos esterilizados, lo que aleja a estos estudios de la práctica agrícola. A pesar de eso, y tomando en cuenta las grandes posibilidades que mostraban las asociaciones, Subba Rao (1996) enfatizó que el efecto asociativo de otros microorganismos con fijadores de Nitrógeno, en el suelo y en las raíces debe ser estimulado mediante la fabricación de inoculantes mixtos basados en portadores. También Parr et al. (1994) y Higa (1995) plantearon que la mejor probabilidad de lograr importantes ventajas de la aplicación de microorganismos beneficiosos al suelo es la inoculación como parte de un cultivo mixto, con una densidad de inóculo suficientemente grande para permitir maximizar la posibilidad de su adaptación a las condiciones ecológicas del lugar. A partir de 1995, las investigaciones sobre inoculantes mixtos se intensificaron, lográndose su aplicación con grandes beneficios en la producción agrícola. Los primeros estudios sobre la utilización de biofertilizantes mixtos fueron realizados con la asociación

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de bacterias fijadoras de Nitrógeno y solubilizadoras del Fósforo del suelo. Así, Cantir (1962), tomando en cuenta la necesidad de Fósforo para lograr una fijación eficiente, estudió el efecto de la inoculación simultánea de Rhizobium, Azotobacter y Bacillus megatherium var. phosphaticum sobre el rendimiento de las leguminosas, reportando un incremento del rendimiento superior a los obtenidos con la inoculación independiente de cada uno de ellos. Kunda y Gaur (1980, 1982, 1984) demostraron en la India importantes incrementos del rendimiento en trigo, papa, algodón y arroz con inoculaciones mixtas de Azotobacter chroococcum y diferentes bacterias solubilizadoras del Fósforo; estos incrementos fueron superiores en comparación con los logrados con la inoculación separada de estas bacterias. Alagwadi y Baur (1988) también lograron resultados altamente positivos con la inoculación conjunta de Rhizobium y B. megatherium, en comparación con los que obtuvieron con inoculaciones separadas. En Cuba se han desarrollado productos a base de A. chroococcum y Pseudomonas. fluorescens y Rhizobium sp. y Ps. fluorescens (Bach et al., 2000), A. chroococcum y B. megatherium var. phosphaticum (Dibut et al., 2003) y A. chroococcum y el hongo Penicillium bilaii (García et al., 2004). En la Tabla 32 pueden verse los resultados obtenidos en el cultivo de la rosa con la aplicación de un inoculante mixto a base de Azotobacter chroococcum y Bacillus megatherium var. phosphaticum (Dibut et al., 2004). Los resultados expresados en la tabla anterior se reflejan en las figuras 14 y 15, donde puede observarse la diferencia de densidad en los campos de rosas inoculados con el biofertilizante mixto y las diferencias entre el tamaño de los racimos de rosas obtenidos de plantas inoculadas y sin inocular.

Tabla 32 Efecto de la aplicación de inoculante mixto a base de A. chroococcum y B. megatherium var. phosphaticum sobre rosales de seis años de edad NOTA: PC-Periodo de corte.

Variante

Numero de ramas primarias

Peso de los tallos g. (25 cm)

Numero de retoños

Numero de mazos /planta PC.

Peso fresco botón (g)

Testigo Inoculado Esx CV (%)

2.20 b 9.53 a 0.48 31.91

1.89 b 2.36 a 0.50 11.10

4.24 b 7.50 a 2.51 16.70

1.10 b 2.13 a 1.00 17.7

10.28 b 15.36 a 0.42 4.20

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capítulo 7. preparación y aplicación de inoculantes a base de bacterias fijadoras de nitrógeno atmosférico

En lo que respecta a la asociación entre las bacterias fijadoras de Nitrógeno, se han puesto de manifiesto los beneficios obtenidos con la aplicación de inoculante mixto a base de Rhizobium y Azotobacter, lográndose incrementos de la eficiencia fijadora de Rhizobium en las leguminosas y el aumento de los rendimientos agrícolas por la acción de las sustancias activas sintetizadas por Azotobacter (Elmerich, 1984; Lynch, 1990; Peoples y Craswell, 1992). Igualmente, la asociación entre Bradyrhizobium japonicum y A. chroococcum en sustrato a base de turba ha demostrado también que incrementa la nodulación y el rendimiento de la soya (Katayama y col., 1996). Rodelas et al. (1999)

Figura 14 Efecto de la aplicación de inoculante mixto, a base de A. chroococcum y B. megatherium var. phosphaticum, sobre la densidad y la velocidad de floración de un campo de rosas inoculado (derecha) en comparación con un campo vecino sin inocular (izquierda)

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encontraron un incremento del crecimiento de las plantas, de la nodulación y del contenido de Nitrógeno en haba (Vicia faba) con la inoculación mixta de Rhizobium leguminosarum bv. viceae y Azotobacter chroococcum, así como un aumento en el contenido total de Fósforo, Potasio, Calcio, Magnesio y microelementos en la parte aérea de las plantas. Resultados similares fueron obtenidos en frijol por Torres et al. (2001) con la inoculación mixta de R. leguminosarum bv phaseoli y A. chroococcum. También la asociación de Azospirillum y Bradyrhizobium japonicum en soya ha demostrado el incremento de la nodulación y el rendimiento (Singh y Subba Rao, 1979), así como la de Azospirillum y Rhizobium en alfalfa y garbanzo (Tilak et al., 1981) y en haba (Rodelas, 2001). La estimulación de la nodulación posterior a la inoculación con Azospirillum puede estar dada por un incremento en la inducción de raíces laterales, la densidad de los pelos radicales y las ramificaciones de dichos pelos; pero también por la diferenciación de un número mayor de células epidérmicas dentro del pelo radical infectado (Burdman et al., 2000). Hasta 1999, más del 15% del total de 150 000 ha de leguminosas inoculadas con Rhizobium sp. en Africa del Sur habían sido coinoculadas con Azospirillum brasilense. Debido al éxito alcanzado con esta co-inoculación, en el periodo 1999-2000 este porcentaje se ha incrementado alrededor del 50% (Burdman et al., 2000). Según estos autores, se han demostrado incrementos en los rendimientos de 15-30 % en leguminosas coinoculadas, valores superiores a los obtenidos con la inoculación de Rhizobium Figura 15 Efecto de la aplicación de inoculo mixto a base de A. chroococcum y B. megatherium var. phosphaticum sobre la producción de rosas

Izquierda: Plantas inoculadas Derecha: plantas sin inocular

capítulo 7. preparación y aplicación de inoculantes a base de bacterias fijadoras de nitrógeno atmosférico

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solo. Estos resultados coinciden con los citados por Okon y Vanderleyden (1997), los cuales, en investigaciones realizadas en relación con la inoculación conjunta de Rhizobium y Azospirillum, reportan un efecto positivo para diversos tipos de leguminosas, incluyendo una temprana nodulación, incrementos en el número de nódulos, altas cantidades de fijación de N2 y un mejoramiento en general del desarrollo del sistema radical. En Cuba se han desarrollado productos a base de Azotobacter chroococcum y Azospirillum brasiliense. En las tablas 33 y 34 se presentan algunos resultados obtenidos con la aplicación de estos inoculantes mixtos (Martínez Viera et al., 2001). Un mayor número de estudios se han ejecutado para demostrar la efectividad de la asociación entre las micorrizas y Azotobacter, Rhizobium, Azospirillum y bacterias solubilizadoras del Fósforo. Los resultados han demostrado la gran efectividad de estas asociaciones en todos los casos ( Barea et al., 1977; Ocampo et al., 1975; Bagyaraj y Menge, 1978; Brown y Carr, 1984; Young, 1990; Rivera et al., 1997). Tabla 33 Rendimiento de campos testigo (kg/ha)

Incremento por la aplicación del inó óculo (%)

5000-5900

6000-6900

7000-7900

8000-8900

13 (4)

12.5 (8)

12 (7)

6 (6)

Incremento del rendimiento de arroz producido por la aplicación de biofertilizante mixto a base de A. chroococcum y Az. brasiliense en 25 haciendas arroceras Nota: Números entre paréntesis en la Tabla indican el número de campos evaluados

Tabla 34 Variante

Control Inoculante

Granos/ espiga

Granos vanos (%)

Rendimiento (Tm/ha)

Incremento (%)

145 153

6 4

7.81 8.96

Efecto de la aplicación del biofertilizante mixto a base de A. chroococcum y Az. brasiliense sobre el rendimiento del arroz en condiciones de producción

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Como puede verse, la información existente demuestra que existe una total compatibilidad entre las más importantes bacterias fijadoras de Nitrógeno atmosférico de forma simbiótica o asociativa y entre ellas y las bacterias solubilizadoras del Fósforo del suelo. Pero cada uno de los inóculos a base de estos microorganismos se fabrican y aplican de forma individual, en una secuencia que encarece los bioproductos y que complica la agrotecnia de un determinado cultivo, por lo que muchas veces los productores agrícolas renuncian a su aplicación, a pesar de los evidentes beneficios que reciben de esta práctica. Por estas razones, se hace necesario encaminar los esfuerzos en el sentido de obtener bioproductos mixtos, con lo cual se abarata su costo y con cuya aplicación pueden aportarse a los cultivos los beneficios derivados de la actividad de cada uno de los microorganismos que integran la mezcla. Para lograr esto, es necesario determinar el grado de compatibilidad que existe en un mismo sustrato entre los distintos microorganismos que pueden utilizarse, así como la viabilidad de cada microorganismo en el sustrato que se va a emplear en distintas condiciones ambientales. Hay que tomar en cuenta que, durante los últimos 30 años, se han publicado gran número de trabajos en relación con los efectos de las sustancias antagonistas sintetizadas por algunos microorganismos del suelo sobre las bacterias fijadoras de N2 atmosférico, y se han reportado numerosos microorganismos que son fuertes antagonistas para estas bacterias y que disminuyen de manera considerable la cantidad de N2 fijado cuando crecen en cultivos mixtos. Lo mismo ocurre en relación con las bacterias solubilizadoras del fósforo del suelo. El mayor número de microorganismos productores de sustancias inhibidoras del crecimiento de estos dos grupos de bacterias son actinomicetos y hongos y, en mucha menor relación, bacterias, especialmente las que pertenecen al género Bacillus (Martínez Viera, 1986). Por su parte, las bacterias con características de biofertilizantes tienen también una apreciable actividad antagonista, como se expuso en los casos de A. chroococcum y Az. brasiliense. Debido a la existencia de estas interrelaciones negativas, que afectan tanto a la multiplicación de algunas especies como a sus funciones biológicas, se hace necesario determinar, en un primer paso, los posibles efectos antagonistas que pueden producirse entre las asociaciones microbianas que se pretende establecer artificialmente, para seleccionar solo aquellas especies y cepas que son totalmente compatibles o que tienen

capítulo 7. preparación y aplicación de inoculantes a base de bacterias fijadoras de nitrógeno atmosférico

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un grado muy ligero de incompatibilidad. Después de hacer esta selección, pueden empezar a prepararse los biofertilizantes mixtos. Determinación del efecto antagonista entre las especies bacterianas aspirantes a ser utilizadas en un producto mixto

Sobre la superficie del medio de cultivo agarizado más adecuado para el desarrollo de los microorganismos que se van a probar se abren concavidades en las cuales se coloca cultivo líquido de las especies cuyo antagonismo se quiere determinar. Sobre el césped de la placa se realiza una siembra extensa de la especie bacteriana que se va a probar. En caso de existir antagonismo, se produce un halo de no crecimiento alrededor de las concavidades, debido a la difusión de las sustancias antagónicas en el medio de cultivo. El diámetro de este halo se mide con una regla. Se ha establecido una escala para determinar la compatibilidad interespecífica (Martínez Viera, 1986): Halo de 0 – 2.5 mm se consideran especies compatibles Halo de 2.6 – 5.0 mm son especies con compatibilidad aceptable Halo superior a 5.0 mm se consideran especies incompatibles. En la tabla 35 se presentan, a modo de ejemplo, algunos resultados que se han obtenido en estas pruebas, expresados en cm.

Tabla 35 Concavidades Césped

Bacillus megatherium Pseudomonas fluorescens Bacillus subtilis Azospirillum brasilense Rhizobium etlii Rhizobium ciceri

INIFAT-9

INIFAT-12

INIFAT-17

0.16 0.15 0.15 0.10 0.16 0.14

0.11 0.14 0.14 0.13 0.20 0.16

0.13 0.10 0.18 0.08 0.16 0.14

Acción antagonista de 3 cepas comerciales de Azotobacter chroococcum frente a otras 6 especies de bacterias con características de biofertilizantes

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Métodos de inoculación de los biofertilizantes a base de bacterias fijadoras de Nitrógeno atmosférico

En lo que respecta a los métodos de inoculación, existen muchos que se aplican en distintos países, unos más seguros y efectivos que otros, aunque siempre hay que aplicar aquel que le ha dado mejores resultados a cada productor, de acuerdo con su propia experiencia. Uno de los aspectos más importantes que deben ser manejados para tener éxito en la inoculación tiene que ser la calidad del inóculo, sobre lo cual se habla extensamente en párrafos anteriores. Los métodos de inoculación más utilizados son los siguientes: 1. Polvo: seco, en base a portadores. Se aplica el polvo sobre las semillas. Es rápido, simple, pero se pierde inoculante antes de alcanzar el suelo y no es muy duradero. 2. Suspensión: igual que el anterior, pero suspendido en agua o solución adhesiva. Se aplica a las semillas y se deja secar. No requiere equipo especial. Las semillas se secan al abrigo de la luz solar. El procedimiento es algo lento y a veces hay que reinocular. No puede utilizarse cuando las semillas están tratadas con fungicidas. 3. Sólido: Mezcla de gránulos de polietileno, polvo de mármol, zeolita u otro producto. Se mezcla con inoculante con base de portador y se aplica en el surco con las semillas. Mantiene la viabilidad y puede aplicarse con semillas tratadas con funguicidas. 4. Peletización: Inoculante con base de turba u otro portador, aplicado a la semilla y mezclado por agitación con un material peletizador. La semilla se seca. Protege al inoculante contra factores ambientales perjudiciales. La preparación consume tiempo y se observa a veces alta mortalidad en las bacterias. 5. Aspersión: Inoculante basado en un portador, suspendido en agua y aplicado a los surcos. No hay problemas para la conservación ni la preparación. Es adecuado para semillas tratadas con funguicidas. 6. Pre-inoculación: Inoculación de las semillas antes de venderlas, lo que permite un período de almacenamiento de la semilla inoculada antes de la siembra. Si no está bien preparado el inóculo puede ocurrir un alto nivel de mortalidad de bacterias.

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capítulo 7. preparación y aplicación de inoculantes a base de bacterias fijadoras de nitrógeno atmosférico

7. Aplicación del inoculante líquido, sin portador, utilizando una asperjadora de espalda o una mecánica si la superficie que debe aplicarse es extensa. Se utiliza en el caso de semillas muy pequeñas, como las de tabaco, lechuga, cebolla o tomate. La aplicación se hace a la superficie del suelo, inmediatamente después de la siembra y antes del riego, para que el inoculante penetre en el suelo con el agua de riego. 8. Aplicación del inoculante líquido por aspersión aérea, cuando se trata de extensas superficies de frutales, de arrozales o de otros cultivos, aprovechando la facilidad que tienen estas bacterias para establecerse sobre las hojas, como ya se explicó en el Capítulo 3. 9. Aplicación del inoculante líquido por el sistema de riego por aspersión o por goteo. De todos estos métodos, el más simple y el más generalmente utilizado en todo el mundo consiste en la mezcla del inoculante en polvo con las semillas de leguminosas antes de la siembra. Este proceso se realiza con las semillas correspondientes a 1 ha en un lugar sombreado, para evitar el efecto perjudicial de los rayos del sol. Las semillas se colocan sobre un piso de cemento limpio o sobre una manta plástica limpia. Se vacía el contenido de una bolsa de inoculante (500 g) en un tobo plástico que contiene 1 L de agua en la que se han disuelto 100 g de azúcar. Se mezcla bien hasta que se forme una masa fluida, deshaciendo con los dedos los grumos que aparezcan. La mezcla se vierte sobre las semillas y se revuelve varias veces con una pala pequeña hasta que todas las semillas se cubran con la mezcla preparada que se aplicó. Se dejan secar durante media hora, para que el inoculante se adhiera a la superficie de las semillas y se procede a la siembra. Es esencial la selección del inoculante más apropiado para una determinada empresa agrícola, especialmente en aquellos suelos donde existen cepas autóctonas inefectivas que van a competir con las inoculadas por la formación y ocupación de los nódulos. Por ello, para comprobar la calidad del inoculante y conocer si será efectivo y aportará beneficios al cultivo que se ha programado en una región, se recomienda a los productores efectuar una pequeña prueba un mes antes del momento en que ha decidido efectuar la siembra de la leguminosa.

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La prueba consiste en preparar tres pequeñas parcelas de 12 m2 cada una, en las que se va a sembrar la leguminosa que se quiere probar. En la primera parcela se aplica el fertilizante nitrogenado y no se hace inoculación. En la segunda ni se aplica fertilizante ni se hace inoculación y en la tercera se hace la inoculación y no se aplica fertilizante. Después de un mes se arrancan las plantas y se comprueba el resultado en las tres parcelas. Se pueden presentar cualquiera de las siguientes 7 situaciones, las cuales permitirán definir si debe ser aplicado el inoculante comercial en ese campo o si la aplicación no va a tener efectividad: Situación 1: La variante no inoculada no forma nódulos y el crecimiento es pobre. Igual ocurre con las variantes inoculada y con aplicación de N. La explicación es que influye otro factor limitante distinto del N ( por ejemplo falta de Fósforo). Situación 2: Las variantes no inoculada e inoculada no forman nódulos y el crecimiento es pobre. La variante con N no forma nódulos y el crecimiento es bueno. La explicación es que la cepa utilizada no es satisfactoria o que hay condiciones adversas en el suelo para la infección. Situación 3: La variante no inoculada no forma nódulos y el crecimiento es pobre; la variante inoculada forma nódulos efectivos y el crecimiento es bueno. La variante con N puede o no formar nódulos y el crecimiento es bueno. La explicación es que la cepa es efectiva para la nodulación y la fijación. Situación 4: La variante no inoculada no forma nódulos y el crecimiento es pobre; la variante inoculada presenta nódulos inefectivos y el crecimiento es pobre; la variante con N puede o no formar nódulos y el crecimiento es bueno. La explicación es que la cepa no es apropiada. Situación 5. La variante no inoculada forma nódulos inefectivos y su desarrollo es pobre; la variante inoculada forma nódulos efectivos y su crecimiento es bueno; la variante con N puede o no formar nódulos y su crecimiento es bueno. La explicación es que la cepa es competitiva frente a las cepas nativas. Situación 6: La variante no inoculada forma nódulos inefectivos y su desarrollo es pobre; la variante inoculada forma nódulos inefectivos y su crecimiento es pobre; la variante con N puede o no formar nódulos y su crecimiento es bueno. La explicación es que la cepa no es competitiva o es inefectiva.

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capítulo 7. preparación y aplicación de inoculantes a base de bacterias fijadoras de nitrógeno atmosférico

Situación 7. Las variantes no inoculada e inoculada forman nódulos efectivos y el crecimiento es bueno; la variante con N puede o no formar nódulos y el crecimiento es bueno. La explicación es que no hace falta aplicar inóculo.

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bibliografía

la fijación biológica del nitrógeno atmosférico en condiciones tropicales

167

Índice de tablas

Tabla 1

Superficie agrícola dedicada a cultivos orgánicos en distintos países europeos en el año 2001

Tabla 2

Efecto quimiotáxico de los exudados totales de las plantas de cebolla sobre distintas cepas de A. chroococcum (expresado en logn de X).

Tabla 3

Respuesta del trigoa la inoculación con A. chroococcumen las condicionesde Cuba

Tabla 4

Poblaciones naturales de bacterias pertenecientes al género Azotobacter en las muestras de suelos rizosféricos recogidas en la Huasteca Hidalguense (México)

Tabla 5

Estimados de Nitrógeno aportado por diferentes sistemas fijadores en la agricultura

Tabla 6

Distribución de sistemas fijadores de Nitrógeno

Tabla 7

Biofertilizantes fijadores de N2, limitaciones y uso por los agricultores

Tabla 8

Aporte estimado de nitrógeno a los cultivos agrícolas en distintos países (expresado en millones de toneladas)

Tabla 9

Microorganismos productores de hormonas vegetales

Tabla 10

Auxinas sintetizadas por bacterias fijadoras de Nitrógeno

Tabla 11

Giberelinas sintetizadas por bacterias fijadoras de Nitrógeno

índice de tablas

168 Tabla 12

Citoquininas sintetizadas por bacterias fijadoras de Nitrógeno

Tabla 13

Producción de vitaminas por A. chrococcum cepa INIFAT-12

Tabla 14

Producción de aminoácidos por la cepa INIFAT-12 de Azotobacter chroococcum

Tabla 15

Producción de PGRs por A. chroococcum cepa INIFAT-12

Tabla 16

Porcentaje de plantas de maíz emergidas y tiempo de aparición de la primera hoja verdadera en plantas inoculadas y sin inocular con la cepa Guárico-1 de Azotobacter sp.

Estimados experimentales de la cantidad de N2 derivado de la fijación atmosférica por las más importantes leguminosas de grano y aceite

Tabla 18

Clasificación y descripción de las respuestas a la nodulación

Tabla 19

Principales factores que afectan la fijación simbiótica de Nitrógeno

Tabla 20

N de la planta derivado de la fijación (P) en distintos cultivos y países

Tabla 21

Clasificación de las dicotiledóneas no leguminosas fijadoras de N2 en simbiosis con actinomicetos del género Frankia

Tabla 22

Efectividad de la Azotobacterina preparada en turba en experimentos realizados en Rusia.

101

Tabla 23

Efecto antagonista de Azotobacter y Azospirillum frente a hongos fitopatógenos que atacan a las raíces de las plantas

104

Tabla 24

Resultados obtenidos en la India con la inoculación de Azotobacter chroococcum en distintos cultivos

105

Tabla 17

la fijación biológica del nitrógeno atmosférico en condiciones tropicales

169

Tabla 25

Efecto de la aplicación de A.chroococcum sobre el rendimiento de yuca y batata(Tm/ha).

109

Tabla 26

Distribución geográfica de Azospirillum en raíces y suelos colectados en varias regiones del mundo.

111

Tabla 27

Resultados obtenidos en distintos países con la inoculación de Azospirillum brasiliense y A. lipoferum en diferentes especies de gramíneas

113

Tabla 28

Efecto de la aplicación foliar de A. chroococcum sobre el rendimiento de toronja y naranja en las condiciones de Cuba.

118

Tabla 29

Efecto de la aplicación foliar de A. chroococcum sobre el rendimiento del mango en el Estado Sinaloa (México) 118

Tabla 30

Comparación de inoculantes a base de turba estéril y no estéril

123

Tabla 31

Especificaciones de control de calidaddel Buró de Standards de la India para los biofertilizantes y bioestimuladores

125

Tabla 32

Efecto de la aplicación de inoculante mixto a base de A. chroococcum y B. megatherium var. phosphaticum sobre rosales de seis años de edad

127

Incremento del rendimiento de arroz producido por la aplicación de biofertilizante mixto a base de A. chroococcum y Az. brasiliense en 25 haciendas arroceras

130

Efecto de la aplicación del biofertilizante mixto a base de A. chroococcum y Az. brasiliense sobre el rendimiento del arroz en condiciones de producción

130

Acción antagonista de 3 cepas comerciales de Azotobacter chroococcum frente a otras 6 especies de bacterias con características de biofertilizantes

132

Tabla 33

Tabla 34

Tabla 35

170

Ăndice de tablas

la fijación biológica del nitrógeno atmosférico en condiciones tropicales

171

Índice de figuras

Figura 1

Efecto estimulador e inhibidor de distintas cepas de Azotobacter sp. sobre el desarrollo de raices de tomate

Figura 2

Nódulos de frijol (Phaseolus vulgaris)

Figura 3

Nódulos de garbanzo (Cicer arietinum L.)

Figura 4

Nódulos de soya (Glycine max L.)

Figura 5

Colonias tipicas de A Azotobacter sp. en medio de Ashby

101

Figura 6

Tinciòn Gram negativa de células de A. chroococum

101

Figura 7

Efecto de la aplicación de A. chroococcum en semilleros de tomate

107

Figura 8

Efecto de la aplicación de A. chroococcum en semilleros de pimiento 107

Figura 9

Efecto de la aplicación de Azotobacter sobre el desarrollo de los frutos de tomate

Figura 10 Efecto de la aplicación de A. chroococcum sobre los frutos de pepino cv. Ashley

108

Figura 11 Efecto de la aplicación de A. chroococcum sobre semilleros de cebolla 109 Figura 12 Colonias de G. diazothrophicus en medio LGI-P

115

Figura 13 Efecto de la inoculación de distintas cepas de bacterias fijadoras de N sobre el desarrollo de plantulas de tomate

121

índice de figuras

172 Figura 14 Efecto de la aplicación de inoculante mixto, a base de A. chroococcum y B. megatherium var. phosphaticum, sobre la densidad y la velocidad de floración de un campo de rosas inoculado (derecha) en comparación con un campo vecino sin inocular (izquierda) 128 Figura 15 Efecto de la aplicación de inoculo mixto a base de A. chroococcum y B. megatherium var. phosphaticum sobre la producción de rosas

129