EVALUACIÓN DEL COMPORTAMIENTO FISICOQUÍMICO Y FUNCIONAL DE UN NÈCTAR DE ZANAHORIA (Daucus carota L. var. Chantenay) HIDROLIZADO ENZIMÁTICAMENTE.
ANGELICA PAOLA AYALA RAMIREZ JESIKA MILENA PINILLA ESTUPIÑAN
FUNDACIÓN UNIVERSITARIA AGRARIA DE COLOMBIA FACULTAD DE INGENIERÍA PROGRAMA DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS BOGOTÁ 2014
EVALUACIÓN DEL COMPORTAMIENTO FISICOQUÍMICO Y FUNCIONAL DE UN NÈCTAR DE ZANAHORIA (Daucus carota L. var. Chantenay) HIDROLIZADO ENZIMÁTICAMENTE.
ANGELICA PAOLA AYALA RAMIREZ JESIKA MILENA PINILLA ESTUPIÑAN
Trabajo de grado para optar el título de Ingeniero de Alimentos
Ing. GLORIA HELENA GONZÀLEZ BLAIR.
FUNDACIÓN UNIVERSITARIA AGRARIA DE COLOMBIA FACULTAD DE INGENIERÍA PROGRAMA DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS BOGOTÁ 2014
Nota de Aceptaci贸n:
____________________________________ ____________________________________ ____________________________________ ____________________________________ ____________________________________ ____________________________________
___________________________________ Firma del presidente del jurado
___________________________________ Firma del jurado
___________________________________ Firma del jurado
Bogotá, 04 de Marzo de 2014
DEDICATORIA Principalmente dedico este triunfo a mi mamá, por ser la persona que hizo posible mi profesión como ingeniera de alimentos, por trasnochar, llorar y sonreír conmigo siempre, a mi papá por apoyarme incondicionalmente y a los dos que con su amor y enseñanza hicieron de mí una mujer de bien y con grandes valores y lo más importante por hacer realidad este sueño, pues sin ellos no hubiera sido posible. A mi abuelito por ser el mejor abue, lo amo con todo mi ser, a mi Estrellita por acompañarme y ser mi angelito desde el cielo noche y día, a mis hermanitos por creer en mí, brindarme alientos y consentirme siempre, a Luna por darme todos los días fuerza así esté ausente, le hace falta a mi vida, a Koko que la extraño y a Thomas mi amado.
A Jaime Bedoya mi primer amor, por amarme de la forma que lo hace, por ser mi apoyo, mi media vida, mi bien, mi confianza y por tenerme tanta paciencia, por darme tanta fuerza para hacer posible este logro, por creer en mí y recordarme que yo puedo con todo y contra todo, por hacerme sentir tan importante y hacerme feliz, LO AMO. Milena Pinilla Estupiñan
DEDICATORIA Los pasos que damos en la vida y en los cuales dejamos marca, siempre están rodeados de las personas realmente más importante y valiosas que tenemos a nuestro lado; por eso doy gracias a mi papá Juan Francisco Ayala por ser mi mayor y más grande orgullo y ejemplo a seguir, por apoyarme en este proceso de crecimiento, te amo muchísimo y no podría tener un mejor papa y amigo como tú. A mi mami Jaqueline Gómez le doy infinitas gracias por apoyarme en cada paso que doy, por llenarme de tanto amor y comprensión con cada una de sus palabras, por cuidarme en este proyecto de vida profesional, eres la mujer que refleja la hermosura más sincera que pueda tener una madre. A mi hermanita Nathalia Ayala que junto a su angelito Juanita me han llenado de tanto amor, enseñanza, cuidados, y lo más importante, de no rendirme y seguir luchando como lo hace ella cada día, con su alma llena de fuerza diaria me ha enseñado a ser una guerrera de la vida. A mi esposo David Sebastián Roa mi motor de amor y lucha diaria, le agradezco por todo ese amor y fuerza que me brinda sin esperar nada a cambio, por ser mi ángel de la guarda y llenarme de fuerza cada vez que me sentía sin ella con este proyecto. TE AMARE TODOS LOS DIAS MI AMOR.
Paola Ayala Ramírez
AGRADECIMIENTOS
Doy gracias a Dios por hacerme una mujer tan fuerte y tan guerrera, por darme fuerzas cada mañana para hacer posibles mis sueños, por bendecirme con una familia tan linda, llena de valores y con un hombre que realmente me ama. Todo este esfuerzo se los agradezco a toda mi familia por regalarme una vida increíble, pues me han enseñado a no rendirme cada vez que tenga un obstáculo. Y POR ULTIMO DEDICO Y AGRADEZCO A LA PERSONITA MÁS HERMOSA QUE HABITA EN EL CIELO. LAURA MARÍA AYALA GODOY.
CONTENIDO Pág. INTRODUCCIÓN Objetivo general Objetivos específicos 1 MARCO TEÓRICO 1.1 HIDROLISIS ENZIMÁTICA 1.2 FIBRA DIETARIA 1.3 NÉCTAR 1.3.1 Definición 1.3.2 Materia, prima y aditivos 1.3.3 Proceso de elaboración industrial. 1.3.4 Características fisicoquímicas, microbiológicas y organolépticas 1.3.5 Técnicas de conservación de néctares 1.3.6 Defectos de elaboración 2 METODOLOGÍA 2.1 MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS 2.2 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL 2.2.1 Preparación de néctar 2.2.2 Formulación del Néctar 2.2.3 Aditivos 2.3 Hidrólisis enzimática 2.3.1 Caracterización de los néctares 2.4 TÉCNICAS ANALÍTICAS 2.4.1 Análisis fisicoquímicos 2.4.2 Análisis funcional 2.4.3 Cálculos para determinación de Fibra Dietaria (FDI), (FDS), (FDT). 2.5 DISEÑO DE EXPERIMENTOS 2.6 ANALISIS ESTADISTICO 3 RESULTADOS Y ANÁLISIS 3.1 CARACTERIZACIÓN DEL NÉCTAR 3.2 NÉCTAR HIDROLIZADO 3.2.1 Comportamiento del pH 3.2.2 Comportamiento del contenido de sólidos solubles (°Brix) 3.2.3 Comportamiento de la densidad 3.2.4 Viscosidad intrínseca en función del peso molecular 3.2.5 Viscosidad en función de la hidrólisis enzimática.
16 18 18 19 19 22 32 34 34 35 38 39 40 42 42 43 43 44 44 51 52 53 53 55 58 59 60 61 61 62 62 65 67 70 71
3.2.6 3.2.7 3.2.8 4 5 6
Peso molecular en función de la hidrólisis enzimática Fibras dietarías en función de la hidrólisis enzimática Percepción sensorial CONCLUSIONES RECOMENDACIONES BIBLIOGRAFÍA
74 77 85 86 88 89
LISTA DE TABLAS Pág.
Tabla 1 Tabla 2. Tabla 3. Tabla 4. Tabla 5. Tabla 6. Tabla 7. Tabla 8. Tabla 9. Tabla 10. Tabla 11. Tabla 12. Tabla 13. Tabla 14. Tabla 15. Tabla 16. Tabla 17. Tabla 18. Tabla 19. Tabla 20. Tabla 21. Tabla 22. Tabla 23. Tabla 24. Tabla 25. Tabla 26. Tabla 27. Tabla 28.
Clasificación de las enzimas pécticas Composición nutricional de la zanahoria Características de un néctar de frutas higienizado Técnicas de conservación de néctares Formulación Néctar Estructura experimental Caracterización fisicoquímica y funcional de la de zanahoria (Daucus carota L. var. Chantenay) Diseño experimental Características fisicoquímicas del néctar de zanahoria (Daucus carota L. var. Chantenay) Análisis ANOVA del factor pH vs tiempo Análisis ANOVA del factor pH vs concentración Análisis HSD Tukey- pH Análisis ANOVA del factor °Brix vs Tiempo Análisis ANOVA del factor °Brix vs Concentración Análisis ANOVA del factor tiempo vs densidad Análisis ANOVA de un factor concentración vs densidad Análisis ANOVA de un factor tiempo vs viscosidad Análisis ANOVA de un factor concentración vs viscosidad Análisis HSD Tukey- viscosidad Análisis ANOVA de un factor tiempo vs peso molecular Análisis ANOVA de un factor concentración vs peso molecular Análisis HSD Tukey- peso molecular Análisis ANOVA de un factor tiempo vs FDI Análisis ANOVA de un factor concentración vs FDI Análisis ANOVA de un factor tiempo vs FDS Análisis ANOVA de un factor concentración vs FDS Análisis ANOVA de un factor tiempo vs FDT Análisis ANOVA de un factor concentración vs FDT
22 34 39 39 44 51 52 59 61 64 64 65 66 67 68 68 72 72 73 75 75 76 78 78 80 80 82 82
LISTA DE FIGURAS Pág.
Figura 1. Figura 2. Figura 3. Figura 4. Figura 5. Figura 6. Figura 7. Figura 8. Figura 9. Figura 10. Figura 11. Figura 12. Figura 13. Figura 14. Figura 15. Figura 16. Figura 17. Figura 18. Figura 19.
Principales enzimas que actúan sobre el homogalacturonano. Clasificación de fibra dietaría Clasificacion de la fibra según su grado de fermentabilidad Diagrama de flujo para la elaboración del néctar de zanahoria Selección. Limpieza. Desinfección. Corte Escaldado Pulpa Refinado Envasado Pasteurización pH-metro Refractómetro (Marca Fischer) Picnómetro Viscosímetro de Ostwald Residuo de FDI y FDS Diagrama de flujo de proceso de obtención de fibras (FDS y FDI)
21 25 26 46 47 47 48 48 49 49 50 50 51 53 54 54 55 56 57
LISTA DE GRÁFICAS Pág. Gráfica 1. Gráfica 2. Gráfica 3. Gráfica 4. Gráfica 5. Gráfica 6. Gráfica 7. Gráfica 8. Gráfica 9. Gráfica 10. Gráfica 11.
Comportamiento promedio de pH del néctar de zanahoria frente al tiempo de hidrólisis enzimática Comportamiento promedio de °Brix del néctar de zanahoria frente al tiempo de hidrólisis enzimática. Comportamiento promedio de la densidad del néctar de zanahoria frente al tiempo de hidrólisis enzimática. Comportamiento de línea de tendencia del Peso molecular en función de viscosidad intrínseca [η]. Comportamiento promedio de viscosidad del néctar de zanahoria frente al tiempo de hidrólisis enzimática Comportamiento promedio del peso molecular del néctar de zanahoria frente al tiempo de hidrólisis enzimática Comportamiento promedio de FDI del néctar de zanahoria frente al tiempo de hidrólisis enzimática Comportamiento promedio de FDS del néctar de zanahoria frente al tiempo de hidrólisis enzimática Comportamiento promedio de FDT del néctar de zanahoria frente al tiempo de hidrólisis enzimática Comportamiento promedio de las FD del néctar de zanahoria frente al tiempo de hidrólisis enzimática y concentración de 0,5%. Comportamiento promedio de las FD del néctar de zanahoria frente al tiempo de hidrólisis enzimática y concentración de 2%.
63 65 67 69 70 73 77 79 81 83 83
LISTA DE ANEXOS Pág. Anexo A. Ficha técnica de enzima Pectinex Ultra SP-L según proveedor Anexo B. Cálculos para formulación del néctar de zanahoria Anexo C. Algunos estudios que evalúan el comportamiento de la enzima (Pectinex® Ultra SPL), en el momento de hidrólisis Determinación del peso molecular en función de la viscosidad Anexo D. intrínseca
101 103 105 107
RESUMEN
La presente investigación evalúa los cambios fisicoquímicos y funcionales de un néctar de zanahoria hidrolizado enzimáticamente con Pectinex Ultra SPL con el fin de determinar si los efectos de esta reacción producen un néctar apto para el consumo y enriquecido con fibra dietaría. La zanahoria (Daucus carota L. var. Chantenay) fue seleccionada teniendo en cuenta su madurez aparente regida por la NTC 1226, 1994; se adecuó para elaborar néctar y posteriormente se sometió a hidrólisis
enzimática,
bajo
el
siguiente
diseño
de
experimentos:
dos
concentraciones de enzima (0,5% y 2% (v/v)) a tres tiempos de hidrólisis (cero, dos y tres horas), para determinar los cambios fisicoquímicos y funcionales que estas variables generan sobre el néctar. Para los seis tratamientos, a las dos horas de reacción, se alcanzó la hidrólisis completa en los cambios fisicoquímicos y funcionales. Fisicoquímicamente el pH, la viscosidad del néctar y el peso molecular tuvieron cambios significativos: el pH actuó de forma descendente permitiendo la preservación del néctar durante el almacenamiento, la viscosidad y el peso molecular actuaron de forma similar otorgando un producto con mayor rendimiento y clarificación. Funcionalmente a las dos horas de reacción, la fibra alcanzó su mayor cantidad proporcionándole al producto un contenido de prebióticos más alto en comparación con el néctar sin hidrolizar (0 horas); mientras que durante tres horas de reacción se evidenciaron cambios que indican una regresión de la hidrólisis (repolimerización) Levin y Forchiassin (2006); Aristizábal y Sánchez (2007); Badui (2006). (2006), sin causar cambios significativos en el néctar; razón por la cual, se estableció el tiempo de reacción en dos horas. Sin embargo, los néctares que fueron evaluados con 0,5% (v/v) de Pectinex® Ultra SPL funcionalmente mostraron mayor contenido de fibra dietaría en comparación con la concentración de 2% de enzima, aun así, el uso de la diferencia en la cantidad de enzima adicionada no produce cambios
fisicoquímicos significativos. A pesar de esto, la hidrolisis enzimática no fue la suficiente para generar compuestos prebióticos galactooligosacaridos (GOS). Palabras Claves: néctar de zanahoria, prebióticos, hidrólisis enzimática, alimentos funcionales, galactooligosacáridos (GOS).
ABSTRACT The present study evaluates the physicochemical and functional changes of an enzymatically hydrolyzed nectar Pectinex Ultra SPL carrot order to determine whether the effects of this reaction produces a nectar suitable for consumption enriched with dietary fiber . The carrot (Daucus carota L. var Chantenay ) was selected taking into account their maturity apparent governed by the NTC 1226, 1994, was adapted to produce nectar and subsequently subjected to enzymatic hydrolysis , under the following experimental design : two concentrations of enzyme ( 0.5% and 2 % ( v / v ) ) three times hydrolysis ( zero , two and three hours ) to determine the physicochemical and functional changes that generate these variables on nectar.
For the six treatments , after two hours of reaction , the complete hydrolysis was achieved in the physicochemical and functional changes . Physicochemically pH, viscosity and molecular weight nectar had significant changes : the pH downward acted nectar allowing preservation during storage , viscosity and molecular weight performed similarly providing a product with higher yield and clarification . Functionally the two hours of reaction , the fiber reached its highest amount giving the product a higher content compared prebiotics unhydrolyzed nectar (0 hours) , while the reaction for three hours showed changes indicating a regression hydrolysis ( repolymerization ) without causing significant changes in the nectar ; reason , the reaction time was set to two hours. However, nectars which were
evaluated with 0.5 % ( v / v ) of Pectinex Ultra SPL functionally 速 showed increased dietary fiber content compared to the concentration of 2 % of enzyme , yet the use of the difference in the amount of added enzyme produces significant physicochemical changes . Despite this, the enzymatic hydrolysis was not sufficient to generate prebiotic compounds galactooligosaccharides ( GOS).
Keywords: Nectar carrot, prebiotics, enzymatic hydrolysis, functional foods, galactooligosaccharides (GOS)
INTRODUCCIÓN Los consumidores son cada vez más exigentes al momento de adquirir y consumir un producto, pues demandan productos saludables y de calidad debido a que los alimentos son esenciales para satisfacer sus necesidades de salud y bienestar. A lo largo de la historia, se han desarrollado diversos productos y es habitual encontrar en el mercado, algunos que sobresalen por tener propiedades benéficas para la salud como lo es la zanahoria y sus derivados; esta hortaliza es importante en la dieta humana gracias a su contenido nutricional (tres vitaminas antioxidantes –provitamina A o β-caroteno; vitamina B1, vitamina C, calcio y fósforo y tiene propiedades de: descender el colesterol por su riqueza en pectinas, ser energética, buena para ciertos casos de anemia por su contenido en ácido fólico, combatir dolencias y enfermedades, como el estreñimiento o la arteriosclerosis (Herrera y Moreno, 1995). Este tipo de alimentos presentan un mercado amplio y en crecimiento, el cual tiene un desarrollo que depende de los avances en nutrición, ciencia y tecnología alimentaria que adquiere una comprensión cada vez mayor por parte del consumidor entendiendo la relación que hay entre dieta y enfermedad (Juárez, 2005).
Dentro de los alimentos asociados a salud se encuentran los naturalmente saludables, un ejemplo de estos son los productos elaborados a partir de frutas y hortalizas como los jugos, néctares y refrescos, productos que tienen un alto potencial de crecimiento en el mercado nacional debido a la tendencia a preferir el consumo de bebidas a base de ingredientes naturales (Maxime, 2012) y los enriquecidos como los funcionales adicionados con prebióticos, los cuales son consumidos especialmente por personas que tienen problemas intestinales, otorgando una alternativa comercial, que corresponde al uso de oligosacáricos (galactooligosacaridos –GOS) los cuales actúan como fibra soluble y tienen efecto
16
bifidogénico1, reduciendo el estreñimiento leve, aumentado la frecuencia de defecación, suavizando las heces y facilitando su deposición (Lopez R, 2013).
Actualmente en el néctar se están utilizando enzimas pectinasas obtenidas y añadidas de fuentes externas o presentes en el mismo producto, que aportan mayor calidad al producto final al degradar la pectina presente en éste, por medio de la hidrólisis enzimática, optimizando los procesos de su producción y dando solución a los problemas más frecuentes que se generan en la industria: turbidez, bajo rendimiento, alta viscosidad, alta cantidad de glucosa, baja solubilidad, oscurecimiento y sabores desagradables (PorquéBiotecnología, 2004. Cortés, 2005). Además, según estudios esta reacción enzimática utilizando la pectinasa Pectinex Ultra SPL también produce un rompimiento en la estructura de la pectina (ver anexo A) formando compuestos relacionados con la fibra dietaria como los GOS (Barreteau, 2006).
El presente estudio busca evaluar los efectos que tiene la hidrólisis enzimática con Pectinex Ultra SPL de una néctar de zanahoria (Daucus carota L. var. Chantenay) en sus características fisicoquímicas y funcionales, con el fin de determinar si esta reacción hidrolítica genera un producto que cumpla con: la calidad y los parámetros fisicoquímicos establecidos según norma y las condiciones para ser un producto funcional enriquecido con fibra dietaría. Lo cual permite plantear la siguiente
pregunta
de
investigación:
¿Cómo
cambian
las
propiedades
fisicoquímicas y funcionales de un néctar de zanahoria (Daucus carota L. var. Chantenay) hidrolizado enzimáticamente?
1
Efecto bifidogénico: es considerado como proliferación de bacterias benéficas (lactobacilos y bifidobacterias) para el fomento de la selectividad metabólica, la aceleración del tránsito intestinal y el refuerzo de las defensas del sistema inmune de tal forma que se mejora la absorción de nutrientes.
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Misma que conlleva a los siguientes objetivos:
Objetivo general.
Evaluar
experimentalmente el comportamiento fisicoquímico y funcional
que tiene el néctar de zanahoria (Daucus carota L. var. Chantenay) hidrolizado enzimáticamente para establecer la calidad fisicoquímica y funcional de los néctares.
Objetivos específicos.
Identificar el efecto de la concentración enzimática con respecto al tiempo para indicar la influencia que ésta relación tiene sobre las propiedades fisicoquímicas y funcionales del néctar. Determinar el peso molecular de los polímeros hidrolizados, utilizando el modelo matemático de Mark Houwink para establecer su grado de polimerización. Definir el efecto de la hidrolisis enzimática sobre la composición de la fibra dietaría en los néctares para identificar posibles beneficios al consumidor.
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1. MARCO TEÓRICO. 1.1 HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA
La hidrólisis es producida mediante un grupo de enzimas llamadas hidrolasas, según la siguiente reacción (Pagan, 2001):
Este tipo de enzimas actúan sobre moléculas como: polisacáridos, lípidos y proteínas. La acción química se expresa en la escisión de los enlaces entre átomos de carbono y nitrógeno (C-N) o carbono y oxígeno (C-O) (Romero, 2007. Cucaita, 2010). Las propiedades de las enzimas derivan del hecho de ser proteínas y de actuar como catalizadores. Como proteínas, poseen una conformación estable y grupos químicos ionizables (carboxilo –COOH; amino –NH2; tiol – SH; imidazol, etc.) en las cadenas laterales de sus aminoácidos.
Los cambios en su conformación,
suelen implicar cambios en la actividad catalítica, siendo el pH, la temperatura y los cofactores, las variables que influyen de manera más directa. La mayoría de las enzimas son muy sensibles a los cambios de pH y una desviación de pocas décimas por encima o por debajo del pH óptimo puede afectar drásticamente su actividad; por cada 10 °C de incremento en la temperatura, la velocidad de reacción se duplica y cuando ésta está por encima de la temperatura óptima, se origina una desnaturalización térmica de las enzimas que conlleva a anular la actividad enzimática; los cofactores pueden ser organicos o inorgánicos, los organicos son coenzimas sintetizadas a partir de vitaminas y los inorgánicos incluyen iones tales como el Fe2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+, los cuales colaboran en la
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catálisis de las enzimas, facilitando la unión enzima- sustrato (Romero, 2007; Cucaita, 2010) En el presente estudio las pectinasas son las hidrolasas empleadas para romper las moléculas de pectina y obtener polímeros de menor peso molecular como los galactooligosacáridos. Industrialmente, las pectinasas se utilizan también en la extracción, clarificación, aumento de rendimientos en la producción y reducción de viscosidad en jugos y néctares de frutas, en la extracción de aceites vegetales y cítricos, en la fermentación de café y té, entre otras aplicaciones (Kashyap et al., 2003; Kiss, 2008). Por otra parte, la hidrólisis de la pectina puede llevarse a cabo por pectinasas o enzimas pecto líticas que se clasifican en tres grupos principales para producir acido D-galacturónico (monómero de péctina), compuesto importante, utilizado como materia prima en la industria alimentaria, farmacéutica y cosmética (Vries, 2001; Belafi, 2007; Kiss, 2008). Poligalacturonasas (PG) se consideran como los biocatalizadores más importantes, son capaces de hidrolizar la pectina y / o el ácido péctico y juegan un papel clave en la hidrólisis (Kiss, 2008). Son un grupo de enzimas que catalizan la hidrólisis de las uniones α-1,4, rompen la pectina de bajo grado de metilación y se distinguen, según su zona de ataque sobre la cadena pectídica (Figura 1), como endo – PG y exo – PG (Palacios, et al., 2003); los dos tipos de enzimas requieren residuos desesterificados (Pagan, 2001). Las exopoligalacturonasas eliminan residuos de ácido galacturónico y su acción puede estar limitada por la presencia de residuos como ramnosa en la cadena; las endopoligalacturonasas rompen los enlaces α - 1,4 glicosídicos tanto en el interior del polímero como en los extremos del mismo, como es el caso de las enzimas pectinex Ultra Clear y Pectinex Ultra SPL. (Vries, 2001; Rosli, 2007; Kiss, 2008).
20
Pectinesterases (PE) - Catalizan la hidrólisis de metil ésteres del C6 en los residuos de ácido galacturónico, lo cual genera la demetilación de las pectinas (Figura 1). Esta demetilación facilita la formación de puentes de Ca+2 entre polímeros pécticos, permitiendo un refuerzo de la estructura de la pared. Por otro lado las PE vuelven más susceptibles los polímeros pécticos a la degradación por PG, (Vries, 2001; Rosli, 2007; Kiss, 2008).
Liasas - Intervienen en la degradación de pectinas en los mismos sitios que las PG pero mediante un mecanismo de reacción distinto (Figura 1). La ruptura de la cadena de homogalacturonanos no ocurre a través de un proceso hidrolítico, sino que la catálisis se produce por una reacción de βeliminación, la cual introduce una insaturación C4-C5 en el extremo no reductor del producto de reacción, originando la depolimerización de las pectinas y la consecuente maceración de los tejidos vegetales (Vries, 2001; Rosli, 2007; Kiss, 2008). Figura 1. Principales enzimas que actúan sobre el homogalacturonano. Algunos residuos de ácido galacturónico (AG) se encuentran metil esterificados.
Fuente: Rosli, 2007.
21
Las sustancias pécticas son naturalmente degradadas por las enzimas pécticas, la tabla 1 muestra la clasificación de las enzimas pécticas que actúan sobre pectinas o ácidos pécticos. Tabla 1. Clasificación de las enzimas pécticas que actúan sobre pectinas o ácidos pécticos. Nombre recomendado por la EC
2
Nombre habitual
Nº EC
Sustrato
Pectina esterasa
3.1.1.11
Pectina
Endopoligalacturonasa (Endo-PG)
Poligalacturonasa 3.2.1.15
Pectato
al azar
Exopoligalacturonasa 1 (Exo-PG1)
Poligalacturonasa 3.2.1.67
Pectato
último cadena
Exopoligalacturonasa 2 (Exo-PG2)
Pofigalacturonasa 3.2.1.82
Pectato
penúltimo cadena
Endopolimetilgalacturonasa (Endo-PMG)
Pectina hidrolasa
Pectina
al azar
Exopolimetilgalacturonasa (Exo-PMG) Liasas
Pectina hidrolasa
Pectina
último cadena
Enzimas desesterificantes Polimetilgalacturonato esterasa (PMGE) Enzimas despolimerizantes
Enlace Afectado al azar
Hidrolasas
Endopoligalacturonato liasa (Endo-pGL)
Pectato liasa
4.2.2.2
Pectato
al azar
Exopoligalacturonato liasa (Exo-PGL)
Pectato liasa
4.2.2.9
Pectato
penúltimo cadena
Endopolimetilgalacturonato liasa
Pectato liasa
4.2.2.10
Pectato
al azar
(Endo-PMGL) Exopolimetilgalacturonato liasa (ExoPMGL) Fuente: Pagan (2001).
Pectato liasa
Pectina
último cadena
1.2 FIBRA DIETARIA La fibra dietética es la parte comestible de las plantas o hidratos de carbono análogos que son resistentes a la digestión y absorción en el intestino delgado, con fermentación completa o parcial en el intestino grueso (Escudero, 2006). Incluye polisacáridos, oligosacaridos, lignina y otras sustancias.
Los polisacáridos son los polímeros de carbohidratos que contienen al menos veinte residuos de monosacáridos. Se clasifican en celulosa, ẞ-
2
Los números EC (Enzyme Commission numbers) son un esquema de clasificación numérica para las enzimas, basado en las reacciones químicas que catalizan.
22
glucanos, hemicelulosas, pectinas y análogos, gomas y mucílagos (Escudero, 2006. Rosli, 2007). Los oligosacaridos son hidratos de carbono con un nivel de polimerización menor, tienen de tres a diez moléculas de monosacáridos. Se dividen en fructooligosacaridos (FOS), Xilooligosacaridos (XOS), galactooligosacaridos (GOS), isomaltooligosacaridos (IMOS) (Escudero, 2006. Rosli, 2007). Las ligninas son polímeros que resultan de la unión de varios alcoholes fenilpropílicos; contribuyen a dar rigidez a la pared celular haciéndola resistente a impactos y flexiones (Escudero, 2006. Rosli, 2007). De otro lado, con las nuevas definiciones, el número de sustancias que se incluyen en el concepto de fibra ha aumentado y es probable que la investigación que se está llevando a cabo en este campo permita que nuevos productos puedan ser incluidos en el concepto de fibra dietética (Escudero, 2006). La figura 2 resume la clasificación de la fibra según la naturaleza química.
23
Figura 2. Clasificación de fibra dietaría
(Escudero, 2006).
El grado de solubilidad en agua es muy variable para las distintas fibras. Las solubles, y en general fermentables, en contacto con el agua forman un retículo donde queda atrapada, originándose soluciones de gran viscosidad y aumentando la biomasa bacteriana. Las fibras insolubles, poco fermentables son capaces de retener el agua en su matriz estructural formando mezclas de baja viscosidad; esto produce un aumento de la masa fecal que acelera el tránsito intestinal, debido a los restos de fibra no digeridos. Todos los tipos de fibra, a excepción de la celulosa y la lignina, pueden ser fermentadas por las bacterias intestinales, aunque en general las solubles lo son en mayor cantidad que las insolubles (Escudero, 2006). La figura 3 presenta su clasificación según el grado de fermetabilidad.
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Figura 3. Clasificación de la fibra según su grado de fermentabilidad
(Escudero, 2006).
Dentro de las fibras dietarias (soluble e insoluble), es la fibra dietaria soluble la que brinda mejores resultados funcionales ya que es fácilmente fermentada por la flora bacteriana. Este metabolismo produce gas y ácidos grasos de cadena corta que el organismo puede absorber en pequeñas cantidades. Investigaciones demuestran que la fibra soluble consumida en cantidades adecuadas ayuda a reducir el colesterol (importante en la prevención de enfermedades cardiacas) y a retardar la absorción de glucosa, lo cual reduce las fluctuaciones en la glicemia (importante para el control de la glucosa en el caso de diabéticos) (Pincheira, 2010). Además, la fibra dietaria soluble retiene agua y aumenta la masa bacteriana, suponiendo un aumento de masa fecal y por tanto un aumento del peristaltismo3 y de la velocidad de tránsito intestinal (Cummings, 2004; Roure, 2007).
Los alimentos adicionados con fibra dietaría se consideran enriquecidos debido a que son productos que por adición de nutrientes por encima de los contenidos en
3
Peristalismo: Movimiento involuntario de contracción del estómago, intestinos, uréteres y trompas uterinas que hace progresar el contenido del órgano en cuestión (orina, contenido intestinal, óvulo).
25
el alimento original o por la adición de otros que no contienen, buscan satisfacer las exigencias nutricionales de las personas sanas (Resolución N° 11488, 1984)
Teniendo en cuenta la naturaleza del presente estudio, a continuación se describen los grupos que sufren cambios estructurales con la reacción enzimática propuesta.
Sustancias pécticas (como sustrato)
Las sustancias pécticas son macromoléculas coloidales capaces de absorber gran cantidad de agua, engloban un grupo de sustancias asociadas a la hemicelulosa, incluyen protopectina y ácido pectínico, son un constituyente importante de los tejidos vegetales y se encuentran principalmente en la pared celular primaria donde actúan como cemento intercelular. Aunque su naturaleza exacta no está clara, se pueden considerar como polímeros lineales de ácido D-galacturonico unidos por enlaces glicosídicos α- 1,4. Algunos de los grupos ácidos o carboxilo (COOH) a lo largo de la cadena se esterifican con etanol (CH 3OH) (Olagnero, et al., 2007; Vaclavik, 2002; Belen, 2008).
Estas sustancias se pueden agrupar en una de las tres categorías dependiendo del número de grupos metil ester unidos al polímero. La protopectina se encuentra en la fruta inmadura. Es un polímero de ácido galacturonico no metilado. Es insoluble en agua pero se puede convertir en pectina dispersable en agua por calentamiento en agua hirviendo. No puede formar geles. El ácido pectínico es una forma metilada de ácido galacturonico que se forman a partir de la protopectina cuando la fruta madura. Los ácidos pectínicos de elevado peso molecular se conocen como pectinas, se dispersan en agua y pueden formar geles. El ácido péctico es un derivado de la cadena corta del ácido pectínico que se forma a medida que las frutas maduran en exceso. Enzimas como la pectinesterasa y poligalacturonsa causan depolimerización y desmetilación del
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ácido pectínico. La demetilación completa, da lugar a ácido péctico que es incapaz de formar geles (Vaclavik, 2002). La industria alimentaria utiliza el ácido pectínico de alto peso molecular (pectina) como espesante, ya que incorpora agua en su estructura otorgando a la preparación una consistencia homogénea que posibilita la sustitución de grasas en lácteos, crema de leche, yogures, etc (Olagnero, et al.;2007; Belen, 2008).
Las pectinas son polisacáridos de origen vegetal, heterogéneas, higroscópicas y solubles en ácidos y agua, con propiedades de gelificación, estabilización de emulsiones y aporte de fibra nutricional (Zapata et al., 2008). Se encuentran en la pared celular primaria en las regiones intercelulares de frutas y vegetales (Sothornvit y Pitak, 2007). Estructuralmente, están constituidas por un esqueleto de residuos de ácido galacturónico (AGA) unidos entre sí por enlaces α-(1,4) (Fishman y Cooke, 2009). Algunos de los grupos carboxílicos de las moléculas de AGA en las cadenas de pectina están metil esterificados y el porcentaje de grupos esterificados se expresa como GE (grado de esterificación). Las pectinas se dividen en dos grandes grupos, dependiendo de su GE: pectinas de alto metoxilo (PAM) con un GE mayor a 50% y pectinas de bajo metoxilo (PBM) con un GE menor a 50% (Mollea et al., 2008).
La pectina junto con las hemicelulosas, la celulosa y las glicoproteínas se unen para construir la pared celular de los vegetales. Las hemicelulosas son polisacáridos llamados así por tener un comportamiento similar a la celulosa y se encuentran intercaladas
entre las microfibrillas de esta, confiriendo de esta
manera elasticidad al tejido formado (Sousa, et al., 2010).
El peso molecular de la pectina varía entre 20.000 y 200.000, y siendo en general alrededor de 80.000 el valor de las pectinas comerciales (Pagan, 2001). La molécula de pectina se divide estructuralmente en dos partes: la cadena principal y las cadenas laterales. La cadena principal está formada por unidades lineales de
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ácido D- galacturónico unidas mediante enlaces α- (1,4) interrumpidas por enlaces α- (1,2) de unidades de L-ramnosa. De esta manera la cadena principal está formada por dos regiones: a) la región “lisa” u homogalacturonano (HG) integrada por unidades lineales de ácido D- galacturónico y b) la región “pilosa” o ramnogalacturonano está formada por dímeros de D-galacturónico y L-ramnosa. Las cadenas laterales están formadas por restos de azúcares neutros que se encuentran unidos covalentemente al átomo de carbono 4 de las unidades de ramonsa dentro de la región del ramnogalacturonano. Dentro de la cadena principal se encuentran algunos sustituyentes no glucídicos sobre los restos de ácido galacturónico, tales como metanol, ácido acético y ácidos fenólicos (Belen, 2008).
Se estima que el consumo anual de pectina en el mundo, es de aproximadamente 45.000 ton y actualmente, se extrae pectina de una gran cantidad de fuentes como tejocote4, uvas, remolacha, pomasa5 de manzana y cáscaras de cítricos (Woo et al., 2010). La función comercial más importante de las pectinas en los alimentos es que actúa como gelificante, como agente de textura y espesante en alimentos procesados, así como emulsionante y estabilizante en productos lácteos y helados (Rezzoug et al., 2008). El uso de pectina en mermeladas de alto contenido de azúcar es una de las aplicaciones más conocidas. Se ha descrito que las pectinas contienen cualidades terapéuticas (reductor de colesterol e inductor de apoptosis de células cancerígenas del colon), razón por la cual se emplean en el área de alimentos (Sánchez et al., 2011).
Sustancias celulósicas (como sutrato) 4
Tejocote: Semejante a una pequeña manzana, fruta de sabor agridulce, muy aromática, de color amarillo o anaranjado 5 Pomasa: residuo generado en el proceso de extracción de jugo de manzana y representa entre el 15 y el 20% de la fruta procesada.
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Los componentes de la materia celulósica se clasifican en tres grupos principales: sustancias extrañas, polisacáridos y lignina; se denomina no componentes extraños
a los materiales que no constituyen las paredes celulares, los
polisacáridos constan de carbohidratos de alto peso molecular, principalmente celulosa y hemicelulosa, que conforman del 60 al 80 % de la materia total, la lignina es un polímero tridimensional del fenilpropano, tienen alto peso molecular, se encuentra en las capas exteriores de la fibra y proporciona rigidez estructural por endurecimiento y por mantener juntas las fibras de polisacáridos (Belanche, 1994; Charles, 2004).
La celulosa es un polímero lineal de D- glucosa, con alto peso molecular (500.000 al), insoluble en agua, está constituida por muchas moléculas de glucosas no ramificadas, como la amilosa. Las moléculas individuales de celulosa están unidas por enlaces ẞ- 1,4 glucosidicos, formando agregados llamados microfibrillas, que contienen zonas de celulosa amorfa fácilmente atacables por enzimas y otras zonas de mayor orden, la fracción cristalina más resistente a la acción enzimática (Belanche, 1994). Solo se encuentran en materiales vegetales: frutas y pulpas de los vegetales, cascaras, tallos, hojas y en el recubrimiento externo de granos, nueces, semillas y leguminosas. La hemicelulosa difiere estructuralmente de la celulosa porque tienen menos unidades de glucosa. Pueden consistir en hexosas, pentosas y las formas acidas de estos compuestos (Lopez, 2003). Está compuesta por cadenas cortas de polisacáridos, proporciona la unión entre la celulosa y la lignina (Belanche, 1994).
La hidrólisis de la celulosa puede ser catalizada tanto por acidos como por enzimas celuloliticas. La hidrólisis enzimática puede dar lugar a un producto puro con rendimiento cuantitativo, consumiendo menos energía. Pero la enzima es una macromolecula, por lo que su acceso a la celulosa, en un sustrato celulósico heterogéneo e insoluble, puede estar restringido por muchos factores que no
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intervienen en la catálisis acida. Por ejemplo cuando se utiliza la enzima celubiasa, la unión de enzima- sustrato (celulosa) genera un producto llamado celobiosa (Belanche, 1994; Charles, 2004)
La acción hidrolitica de las celulasas puede describirse en dos etapas: El primer paso es la conversión de celulosa a celobiosa, por la acción sinergistica de endo- y exo-celulasas, que son frecuentemente adsorbidas en la superficie celulosa solida (Belanche, 1994). La segunda etapa, es la conversión de celobiosa a glucosa por acción de la α- glucosidasa, en la fase acuosa (Belanche, 1994).
Prebióticos (como producto)
Los prebióticos son ingredientes o aditivos alimenticios no digeribles que tienen efectos favorables por estimular selectivamente el crecimiento y/o actividad de bacterias benéficas en el colon, cuando estas fibras favorecen directamente a las bacterias del genero Bifidobacterium (consideradas de gran beneficio en el intestino) aumentando su población, se hace referencia al ya publicitado “efecto Bífido” que aparece cada vez con más frecuencia en el etiquetado de algunos productos (Sarmiento, 2006; Olagnero et al., 2007).
Estos compuestos se caracterizan por ser moléculas de gran tamaño que no pueden ser digeridas por las enzimas digestivas del tracto gastrointestinal alto, alcanzando el intestino grueso donde son degradados por la microflora bacteriana, principalmente por las bifidobacterias y lactobacilos, generando de esta forma una biomasa bacteriana saludable y un pH óptimo (Olagnero et al., 2007). Así mismo, Sarmiento, 2006; Gaynor, 2007) y Olagnero et al. (2007), incluyen los siguientes grupos de moléculas: GOS, FOS, XOS e IMOS, oligosacaridos definidos como polímeros de monosacáridos, no son cariogénicos, ni digeribles, son resistentes a la acidez gástrica, a la hidrólisis por las enzimas estomacales, a la absorción
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gastrointestinal y estimulan el crecimiento y el desarrollo de la microflora gastrointestinal o bacterias probióticas como bifidobacterias y lactobacilos. Tienen dos orígenes: pueden ser sintetizadas por glicosilación química o derivar de la degradación física o biológica de los polisacáridos (Barreteau , 2006.). Las fibras prebióticas tipo oligofructosas favorecen la producción colónica de butirato, el cual es utilizado como fuente de energía por los enterocitos del colon, fomentando la maduración y regeneración del epitelio intestinal con importante efecto anticancerígeno.
El
consumo
de
oligofructosa,
glucooligosacáridos
y
galactooligosacáridos incrementa la absorción de calcio y su respectiva fijación en huesos, estimulando además la absorción y retención de otros minerales particularmente magnesio y hierro. Los prebióticos son capaces de regular la lipidemia y trigliceridemia en humanos y animales por procesos aún desconocidos, pero se cree que un aumento en la producción de propionato, inhibe la síntesis hepática de lípidos (Sarmiento, 2006). La ingesta de oligosacaridos con la dieta es difícil de estimar, aunque se considera que la contribución de los alimentos usuales es baja. Incluye oligofructosas de frutas, vegetales y cereales y oligosacáridos, obtenidos por procesos de biosíntesis a partir de azúcares o de hidrólisis de polisacáridos, que se añaden a los alimentos para modificar sus propiedades nutritivas o sus características organolépticas (Lopez, 2007).
La fermentación de la fibra por las bacterias anaerobias en el colon, puede producir: flatulencia, distensión abdominal, meteorismo y dolor abdominal. Estos efectos son especialmente acusados con los FOS y GOS. Se recomienda que el consumo de fibra se realice de forma gradual para que el tracto gastrointestinal se vaya adaptando. Para los adultos se sugiere un aporte entre 20- 35g/día o bien aproximadamente de 10-14 g de fibra dietética por cada 1.000 kcal. En los niños mayores de dos años y hasta los dieciocho, se recomienda el consumo de la cantidad que resulte de sumar 5 g/día a su edad (ejemplo: un niño de cuatro años debería ingerir aproximadamente 9 g de fibra al día). De esta manera, a partir de
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los 18 años alcanzaría el consumo adecuado de un adulto. De forma general, la fibra consumida debe tener una proporción de 3/1 entre insoluble y soluble. (Escudero, 2006). Los pesos moleculares de los oligosacáridos individuales oscilan entre 342 (disacárido) y 1.315 (octasacárido) dal-tons. El peso molecular medio de la fracción GOS es de 522,28 daltons (Lopez, 2007). Para que un ingrediente alimenticio sea considerado prebiótico debe cumplir con los siguientes criterios (Olagnero et al., 2007):
No debe ser hidrolizado o absorbido en la parte alta del tracto digestivo.
Debe ser fermentado selectivamente por una o un número limitado de bacterias potencialmente benéficas del colon, por ejemplo bifidobacterias y lactobacilos.
Debe ser capaz de alterar la microflora colónica tornándola saludable, por ejemplo reduciendo el número de organismos putrefactivos e incrementado las especies sacarolíticas.
1.3 NÉCTAR DE ZANAHORIA El mercado nacional de jugos, néctares y refrescos de fruta y hortalizas tiene un alto potencial de crecimiento (17,2 % en Latinoamérica entre el 2008 y el 2011 (Fundación Chile y Programa Elige Vivir Sano, 2012.) debido al dinamismo de la demanda interna que es impulsada por la mejora del poder adquisitivo de las familias, consecuencia de la mayor actividad económica. A la par de estas consideraciones, se suma la tendencia a preferir el consumo de bebidas con base en ingredientes naturales debido a la mayor preocupación por el cuidado de la salud (Maxime, 2012). De acuerdo con el actual ritmo de vida, el consumidor pareciera inclinarse por néctares o jugos enriquecidos con vitaminas, calcio, fibra o probióticos, con pulpa
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de fruta, sin preservantes ni colorantes; haciendo a un lado bebidas artificiales como gaseosas, refrescos en polvo o citrus; iniciando la tendencia, de las bebidas refrescantes como alimento funcional, ofreciendo mayores beneficios saludables dándole así valor agregado al producto (Quintero, 2011).
Un néctar de zanahoria es un alimento con alto contenido nutricional, debido a que esta hortaliza posee beneficios tales como su aporte en vitaminas y minerales, la estimulación de eliminación de desechos, ayuda a disolver los cálculos biliares, gracias a su aporte en ẞ-caroteno que además está relacionado con su color naranja. Es ideal para los problemas de la piel, favorece la visión nocturna, por su gran riqueza en vitamina A, equilibra al organismo en problemas digestivos y metabólicos (EROSKI, 2005), es fuente de vitamina E y de vitaminas del grupo B (folatos y vitamina B3 o niacina). En cuanto a los minerales, es alto en potasio, y contiene cantidades discretas de fósforo, magnesio, yodo y calcio. Aporta ácido fólico, elemento básico para la buena estructura de los glóbulos rojos, importante para las mujeres embarazadas. Esta hortaliza tiene altas cantidades de fibra (2,6%), mayoritariamente en forma soluble como pectina, sin embargo, en el néctar esta cantidad disminuye debido a los procesos a los que se somete; fibra útil para normalizar el tránsito intestinal y cicatrizar heridas intestinales suavizando la mucosa intestinal. Los oligoelementos la convierten en un buen remineralizante del organismo, también es diurética. Otra de las propiedades que se le atribuyen a la zanahoria es su capacidad antiparasitaria intestinal (oxiuros), debido a la presencia de un aceite esencial, además es uno de los vegetales de valor agregado con mayor crecimiento en el mercado mundial (Iza, 2011). La tabla 2 muestra la composición nutricional de esta hortaliza.
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Tabla 2. Composición nutricional de la zanahoria
APORTE POR REACCION
MINERALES
Energia (Kcal)
39,4 CALCIO (mg)
Proteina (g)
1,25 HIERRO (mg)
Hidratos Carbino (g)
6,9 YODO (mg)
Fibra (g)
2,6 MAGNESIO (mg)
Grasa total (g)
0,2 ZINC ((mg)
AGS (g)
0,04 SELENIO (µg)
AGM (g)
0 SODIO (mg)
AGP (g)
0,12 POTASIO (mg)
AGP/AGS
3,02 FOSFORO (mg)
AGP-AGM/AGS
27,24 VIT B1 TIAMINA (mg)
0
ALCOHOL (g)
0
0,06
0,47 VIT B2 RIBOFLAVINA (mg)
0,05
6,53 EQ. NIACINA (mg)
0,77
11,24 VIT B6 PIROXINA (mg) 0,28 AC. FOLICO (µg) 1,3 VIT B12 CLANOCOBALAMINA (µg) 61 VIT C AC.ASCORBICO (mg) 321 RETINOL (µg) 19 CAROTENOIDES (µg) VIT A EQ. RETINCI (µg)
3,1
COLESTEROL (mg)
AGUA (g)
VITAMINAS
VIT D (µg)
0,14 13,93 0 6,48 0 87,31 14,55,17 0
89,1
1.3.1 Definición Es un producto sin fermentar pero fermentable, elaborado con jugo, concentrado o pulpa de frutas u hortalizas (en este caso zanahoria), adicionado con agua, azúcar, edulcorantes y aditivos o ingredientes que estén permitidos (Lasso y Beltran, 2013).
1.3.2 Materia, prima y aditivos Según Coronado e Hilario (2001) y Lasso y Beltrán (2013) las materias primas necesarias para la elaboración de un néctar son:
Agua: es el componente principal del néctar, debe ser potable, libre de sustancias extrañas e impurezas y de bajo contenido de sales. La cantidad que se agrega al néctar se calcula en función del peso de la pulpa o jugo y de las características de la fruta u hortaliza.
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Pulpa: El contenido mínimo es del 25% (v/v) (Codex alimentarius, 2005). Debe estar en estado óptimo de madurez, fresca, sana y libre de cualquier sustancia tóxica.
Azúcar: entre los azucares autorizados están sacarosa, glucosa, dextrosa y fructosa (codex alimentarius, 2005). Se utiliza en concentraciones medidas en grados °Brix para otorgarle sabor dulce al néctar.
1.3.3 Proceso de elaboración industrial. Las etapas de elaboración y los puntos críticos de control del néctar se describe a continuación:
a) Pesado Se pesa la materia prima en una báscula, para determinar perdidas en cascara y semillas de la fruta u hortaliza y así establecer rendimientos (lopez, 2010; ojaslid 2009; Ministerio de salud, 1991).
b) Selección y clasificación En la selección se descartan aquellas frutas de baja calidad por estar magulladas o deterioradas, que las transforman en material de segunda. La clasificación agrupa a las frutas por su tamaño, color o estado de maduración (lopez, 2010; ojaslid 2009; Ministerio de Salud, 1991).
c) Lavado y desinfección Se utiliza agua potable para retirar cualquier partícula extraña adherida a la fruta. Se realiza por: inmersión, agitación o por aspersión. Posteriormente, la fruta se
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desinfecta usando una solución de hipoclorito de sodio de 0,05 a 0,2% de cloro residual (Lopez, 2010; Ojaslid 2009; Ministerio de salud, 1991).
d) Precocción Se utiliza agua a ebullición o con vapor directo durante 5 a 10 minutos. Este tratamiento térmico debe ser detenido en forma rápida mediante un enfriamiento brusco. En esta etapa se ablanda la fruta para facilitar la etapa de pulpeado. Además, es de vital importancia para inactivar las enzimas responsables del pardeamiento y la aparición de malos olores y sabores (Lopez, 2010; Ojaslid 2009; ministerio de salud, 1991). Se considera como PCC debido a que la fruta u hortaliza se someten a los parámetros de tiempo y temperaturas adecuados y controlados para su cocción parcial.
e) Pelado Se utilizan cuchillos, agua caliente, vapor. Es posible emplear sustancias químicas como el hidróxido de sodio o soda (Lopez, 2010; Ojaslid 2009; Ministerio de salud, 1991). Esta etapa se considera como PCC por el riesgo de usar utensilios de pelado contaminados.
f) Pulpeado y refinado (molienda) En esta operación se emplean pulpeadoras para obtener la pulpa o jugo, libre de cáscara, semillas y fibra. Se aconseja primero pulpear y luego refinar, con la finalidad de reducir el tamaño de la pulpa obtenida. En esta etapa es posible regular la velocidad de la pulpeadora y variar el diámetro de los orificios del cilindro que lleva incorporado por donde sale la pulpa y se retiene la parte no deseable (cáscara y pepas) (Lopez, 2010; Ojaslid 2009; ministerio de salud, 1991).
g) Estandarizado Consiste en: diluir la pulpa obtenida con agua en función al sabor y calidad del producto, regular la acidez, regular los sólidos solubles (grados Brix), adicionar
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preservante y estabilizante para que la pulpa no precipite. Los preservantes más comunes son el sorbato de potasio y el benzoato de sodio. En la regulación de °Brix se emplea azúcar blanca refinada o edulcorantes como aspartame o sucralosa. El ácido cítrico es el insumo más utilizado para regular la acidez del néctar.
Como
estabilizantes
se
puede
utilizar:
pectina,
CMC
(carboxilmetilcelulosa), goma arábiga, goma xantán, goma de tara, entre otras (Lopez, 2010; Ojaslid 2009; ministerio de salud, 1991).
h) Molienda coloidal u homogenización Se uniformiza la mezcla haciéndola pasar por un molino coloidal o un homogenizador que combina todos los componentes del néctar para obtener un producto uniforme (Lopez, 2010; Ojaslid 2009; ministerio de salud, 1991).
i) Pasteurización o eliminación de aire. Consiste en someter la pulpa o néctar a una temperatura y tiempo determinados. Generalmente los néctares y jugos son pasteurizados a 97 ºC por 30 segundos en un intercambiador de placas, donde el néctar pasa por medio de tuberías entre placas que calientan el producto a la temperatura deseada. Esta proceso térmico tiene el objetivo de eliminar los microorganismos patógenos para alargar la vida útil del producto y además es un método eficaz para la eliminación de aire (oxigeno) ya que este realiza algunas reacciones en el néctar (oxidación y colores desagradables) (Suarez, 2003, Lopez, 2010; Ojaslid 2009; ministerio de salud, 1991). Se considera como PCC y los límites críticos serán temperatura y tiempo a los cuales no sobrevivan o multipliquen los microorganismos que pueden afectar la salud de los consumidores o provocar el deterioro del alimento.
j) Llenado y cerrado del envase. Esta operación se debe realizar en caliente a temperatura mayor a 93 ºC. Una vez envasado el néctar, se procede inmediatamente a cerrar el envase o recipiente.
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Se utilizan envases de vidrio o plástico (Lopez, 2010; Ojaslid 2009; ministerio de salud, 1991).
k) Enfriado El néctar es enfriado rápidamente después del envasado para generar un cambio brusco de temperatura y así obtener un cerrado hermético. Manualmente se puede hacer mediante chorros de agua fría o por el paso dentro de un túnel de duchas de agua (Lopez, 2010; Ojaslid 2009; ministerio de salud, 1991).
1.3.4 Características fisicoquímicas, microbiológicas y organolépticas.
Organolépticas: liquido, libre de materias y sabores extraños, color uniforme y olor semejante al de la fruta u hortaliza con la que se elaboró (Coronado e Hilario, 2001; Lasso y Beltrán, 2013).
Fisicoquímicas: lo sólidos solubles no deben ser inferiores a 12 % y máximo 18%, el pH no debe ser menor a 3,3 y ni mayor a 4,2, la acidez titulable expresada como ácido cítrico anhidro en porcentaje no debe ser inferior a 0,4 (todo esto a condiciones de temperatura a 20° C y dependiendo de la materia prima) (Coronado e Hilario, 2001;Lasso y Beltrán, 2013).
Microbiológicas: Las características de un néctar de frutas u hortaliza higienizado con duración de 30 días se pueden observar en la tabla 3 (Coronado e Hilario, 2001; Lasso; Beltrán, 2013; Ministerio de salud, 1991).
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Tabla 3. Características de un néctar de frutas higienizado. N
M
M
C
Recuento de microorganismos mesófilos
3
1000
3000
1
NMP coliformes totales / cc
3
9
29
1
NMP coliformes fecales / cc
3
<3
-
0
Recuento de esporas clostridium sulfito reductor / cc
3
<10
-
0
Recuento de hongos y levaduras / cc
3
100
200
1
Fuente: Coronado e Hilario, 2001; Lasso y Beltrán, 2013; Ministerio de salud, 1991.
1.3.5 Técnicas de conservación de néctares Tabla. 4 Técnicas de conservación de néctares Técnica Pasterización
Descripción - Dos opciones: empacar y pasterizar o pasterizar y empacar. - Primer caso: Se realiza a una temperatura de 85-88 °C, el tiempo depende de los factores (pH, tamaño, forma de los recipientes). - Segundo caso: calentar el néctar de manera rápida a 90°C, llenar los envases, cerrarlos y refrigerar durante 1 a 3 minutos. Esterilización térmica Calentamiento rápido del fluido, retención durante poco tiempo, enfriamiento y envasado bajo y envasado aséptico. condiciones asépticas en recipientes esterilizados. Empleo de aditivos
Se utilizan los benzoatos, sorbatos y compuestos de azufre como metabisulfito con el fin de inhibir el desarrollo de microorganismos. Métodos combinados Otra técnica de conservar los néctares consiste en combinar las anteriores formas de conservación pero de manera menos intensa. Fuente (Camacho y Ortegon, 2002).
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1.3.6 Defectos de elaboración. Los defectos que se pueden presentar en los néctares de frutas son la fermentación, separación de fases, cambios de color y falta de densidad. La fermentación de los néctares se debe a frutas en mal estado, pH inadecuado, mal envasado, un proceso de pasteurización deficiente o a la falta de higiene y sanidad (Suarez, 2003; Coronado e Hilario, 2001). La separación de fases se debe principalmente a la precipitación de sólidos al fondo del envase debido a una adecuada homogenización, deficiente pulpeado o refinado, excesiva cantidad de agua o a la falta o poca cantidad de estabilizante (Suarez, 2003; Coronado e Hilario, 2001). El cambio de color se produce por la falta o inadecuada precocción de la fruta, excesiva cantidad de agua o por utilizar azúcar morena como endulzante, Exceso en el tiempo y/o temperatura de pasteurización o por fermentación del néctar. Mientras que el cambio de sabor se debe al exceso de ácido, la falta o exceso de azúcar, el exceso de agua o por la fermentación del néctar (Suarez, 2003; Coronado e Hilario, 2001). La falta de densidad o de consistencia se debe a la falta de estabilizante, el exceso de agua o por la fermentación del néctar (Suarez, 2003; Coronado e Hilario, 2001). Para la identificación y control de los defectos finales que puedan presentarse del néctar es necesario, realizar un control de calidad a los productos finales mediante la elaboración de pruebas físicas, químicas, microbiológicas y sensoriales que aseguren que el producto se encuentra dentro de los rangos de las variables establecidas para el mismo (Suarez, 2003; Coronado e Hilario, 2001). Según Suarez, D (2003) y Coronado e Hilario (2001) los valores que se deben garantizar en un néctar se establecen en los siguientes rangos: el pH puede tomar valores entre 3.3 y 4.2.
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Los sólidos solubles expresados en grados °Brix y leídos a 20°C pueden oscilar entre 12 y 18. La acidez titulable expresada como ácido cítrico anhidro g/100 cm 3 se encuentra en un rango de 0,4 y 0,6. La relación entre los sólidos solubles y la acidez titulable debe ser 30-70 El contenido de alcohol etílico medido en %(v/v), a 15C/15C deber ser de máximo 0.5. El contenido de sólidos en suspensión expresados en % (v/v) debe ser de 18. El sabor color y olor de los néctares debe ser semejante al de la fruta con que fueron elaborados.
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2. METODOLOGÍA Para la elaboración y desarrollo de este trabajo se empleó zanahoria (Daucus carota L. var. Chantenay) adquirida en un supermercado de la ciudad de Bogotá teniendo en cuenta la calidad del producto, madurez por selección visual y precio. La parte práctica se realizó en los laboratorios de la Fundación Universitaria Agraria de Colombia (Uniagraria).
2.1 MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS Se utilizaron los materiales y equipos relacionados a continuación: Vasos precipitados (50 ml, 200ml y 600ml). Frascos Erlenmeyer de 250 ml y 600ml. Agua destilada. pH metro. Refractómetro Mettler Toledo. Picnometro (25 ml). Viscosímetro de Ostwald (10ml). Balanza analítica. Termómetro. Mufla a 550°C. Cronometro. Baño termostatado. Cama de hielo. Refrigerador a 4°C Congelador a -12°C. Estufa de incubación a 60°C y 90-100 °C. Desecador. Pipeta de 10 y 25ml. Pipetas Eppendorf de 0-100 µl. 42
Pipeteadores. Agitador de vidrio. Crisoles de cerámica. Papel filtro cualitativo. Recipientes de aluminio (medidas 145x115mm y altura de 50mm). Pinzas de acero inoxidable. Mechero Bunsen.
Se utilizaron los siguientes reactivos: Regulador de pH ( pH=6) NaOH 0,275 N. HCl a 0,325 N. Alcohol etílico al 95% y 78% Enzimas: α-amilasa termoestable, proteasa y amiloglucosidasa.
2.2 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL.
2.2.1 Preparación de néctar.
La materia prima (zanahoria) fue clasificada de acuerdo con la norma NTC 1226, seleccionando las sanas, enteras, firmes, libres de humedad, frescas, maduras y libres de daños mecánicos. Para su elaboración se siguieron los criterios técnicos propuestos por Coronado (2001) quien sigue las normas vigentes del Codex alimentarius (2005), la resolución 7992/91 ministerio de salud y la Norma Técnica Colombiana NTC 5468 (Figura 2), así como la formulación propuesta por Suarez (2003) la cual se relaciona a continuación, ver Anexo B (cálculos de formulación).
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2.2.2 Formulación del néctar
Las cantidades de agua y azúcar se determinaron a partir de la cantidad inicial de pulpa permitida en un néctar según la norma NTC 5468, por medio de un balance de materia. Ver anexo B. Tabla 5. Formulación néctar
Materia prima
%
Pulpa
25
Azúcar
10,23
Agua
64,7
Total néctar
100
2.2.3 Aditivos:
Ácido cítrico Al igual que el azúcar es un componente de las frutas, sin embargo esta también disminuye al realizarse la dilución. En tal sentido es necesario que el producto tenga un pH adecuado que contribuya a la duración del producto. Para calcular la cantidad de ácido cítrico a adicionar se procede de la siguiente manera:
Tomamos una muestra del néctar que estamos preparando, que puede ser por ejemplo 100 ml. Empleamos el pH-metro para ajustar pH. El siguiente paso fue agregar el ácido cítrico previamente pesado hasta que el nivel de acidez se estabilizó en un pH de 3.6, que es el pH adecuado para néctares en general. Se anotó la cantidad de ácido cítrico agregada y se realizaron cálculos para su adición al néctar total donde: en 100 ml de néctar se agregó 0,25 g de
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ácido cítrico para obtener un pH = 3.6 entonces para 1 litro de néctar se necesitarán: 100 ml ————— 0,25 gr. de ácido cítrico 1 litros ————— X gr. de ácido cítrico
X = 2,5 g de ácido cítrico Por lo tanto se agregó 2,5 g de ácido cítrico al néctar.
Pectina comercial de alto metoxilo: 3 g/1 litro. Ácido cítrico: 1,5% sobre el peso del néctar. Benzoato de sodio: 1 % sobre el peso del néctar.
Benzoato La cantidad de agente conservante a adicionar no debe ser mayor al 0.05% del peso del néctar Para 1 litro de néctar de zanahoria se agregó:
Por lo tanto se adiciono 0,5 g de benzoato al néctar. Se mezcla para facilitar su dilución.
Pectina Según norma general del Codex para zumos (jugos) y néctares de frutas la dosis máxima permitida es menor a 3 g por litro de néctar (Comision del codex alimentarius, 2000). Basado en este parámetro se adicionó 2,5 g de pectina.
45
Auxiliar tecnológico: Pectinex Ultra SPL: 0,5% y 2% v/v en función del diseño experimental. A continuación, se describe el diagrama de flujo del proceso realizado.
Figura 4. Diagrama de flujo para la elaboración del néctar de zanahoria (Daucus carota L. var. Chantenay).
46
1. Selección de materia prima: se realizó una selección visual para mantener el control de calidad verificando condiciones sanitarias, forma gruesa y alargada, macizas, sin bifurcaciones, sin raíces, tamaños de dos a tres cm de diámetro superior y mínimo 10 cm de largo, color naranja rojizo (NTC 1226, 1994). Figura 5. Selección
2. Limpieza: remover impurezas, materiales extraños y disminuir carga microbiana por medio del uso del cuchillo de acero inoxidable y la posterior inmersión durante 5 minutos en recipiente plástico lleno de agua potable. Figura 6. Limpieza
47
3. Desinfección: sumergir en recipiente plástico que contiene solución de hipoclorito de sodio (1,2 ml de NaClO/ litro de agua). Se pone en contacto con la solución durante 5 – 10 minutos. Figura 7. Desinfección
4. Corte: realizar por medio físico con cortes en forma de cubos no mayores a tres cm, utilizando cuchillo de acero inoxidable y finalizando con un lavado. El proceso de corte es importante para facilitar el pulpeado y hacer un escaldado uniforme. No se remueve piel de las zanahorias para mayor aprovechamiento de vitaminas y pectina presentes en esta. Figura 8. Corte
48
5. Escaldado: se puso en contacto la hortaliza en agua de 90 - 95°C durante 5 minutos, posteriormente se retiraron los cubos de zanahoria y se realizó choque térmico en cama de hielo. Esta operación se hizo con el fin de reducir la carga microbiana, fijar color, acentuar sabor, ablandar la hortaliza para facilitar el pulpeado e inactivar enzimas que generan pardeamiento. Figura 9. Escaldado
6. Pulpeado: obtener la pulpa o jugo empleando como mecanismo una licuadora. Figura 10. Pulpa
7. Refinado: consistió en reducir el tamaño de las partículas de la pulpa utilizando un filtro para otorgarle una apariencia más homogénea.
49
Figura 11. Refinado
8. Estandarización: operación determinada para mezclar los ingredientes que componen el néctar, involucrando los siguientes pasos:
Dilución de la pulpa en agua. Adición de componentes sólidos (azúcar, pectina como estabilizante, ácido cítrico como regulador de acidez y benzoato de sodio como conservante).
9. Envase: poner 50 ml de néctar dentro de envases de vidrio evitando la formación de espuma, bajo condiciones de temperatura mínima de 85°C. Posteriormente se sella con tapa de rosca y debe ser enfriado rápidamente para conservar su calidad. Figura 12. Envasado
10. Pasteurización: calentar el néctar de 90 a 95°C durante tres minutos e inmediatamente se realizó choque térmico.
50
Figura 13. Pasteurización
1.2
HIDROLISIS ENZIMATICA.
El néctar fue envasado en recipientes de vidrio rotulados, basado en el diseño experimental como se muestra en la tabla 6. Tabla 6. Estructura experimental. N de muestra T1 R1 T2 R1 T3 R1 T4 R1 T5 R1 T6 R1
Tiempo (h) 0 2 3 0 2 3
Concentración de enzima (%) 0,5 0,5 0,5 2 2 2
T1 R2 T2 R2 T3 R2 T4 R2 T5 R2 T6 R2
0 2 3 0 2 3
0,5 0,5 0,5 2 2 2
Posteriormente se realizó la adición de la enzima en cada recipiente, con las siguientes condiciones:
51
1.
Adición de Pectinex® Ultra SPL: bajo condiciones de temperatura de 20°C y pH de 3,60 se agrega enzima en dos concentraciones: 0,5 y 2% (v/v) por cada 50 ml de néctar que contenía cada envase.
2. Reacción de Pectinex® Ultra SPL: el proceso de activación y reacción de la enzima se controló bajo condiciones de pH a 3,6 y temperatura de 34°C (utilizando un baño termostatado) las cuales son señaladas en la ficha técnica de la enzima Anexo A como las mejores condiciones de actividad y tiempos de 0, 2 y 3 horas de reacción establecidos tomando como criterio resultados de estudios bibliográficos (Anexo C). 3. Inactivación de Pectinex® Ultra SPL: los tratamientos se exponen a temperatura de ebullición (95 -100°C) durante 5 minutos, con el fin de evitar que la enzima continúe reaccionando.
1.2.1 Caracterización de los néctares. Las muestras del néctar de zanahoria (Daucus carota L. var. Chantenay) hidrolizadas a 0, 2 y 3 horas fueron caracterizadas fisicoquímica y funcionalmente: pH, °Brix, densidad, viscosidad, fibra dietaria soluble (FDS), fibra dietaria insoluble (FDI) y fibra dietaria total (FDT), propiedades evaluadas según los métodos referidos en la tabla 7. Tabla 7. Caracterización fisicoquímica y funcional de la de zanahoria (Daucus carota L. var. Chantenay). Parámetro
Unidad
pH
Método pH-métrico
Protocolo AOAC 981.12
Sólidos Solubles
°Brix
Refractometría
Viscosidad
cP
Viscosímetro de OSWALD
AOAC 932.12, 932.14C y 936.19 ; ISO 2173 ISO 3105 – 1994
Densidad
g/mL
Gravimétrico
AOAC 962.37
FDS
%
Método Enzimático, Gravimétrico
AOAC 985.29.
FDI
%
Método Enzimático, Gravimétrico
AOAC 985.29.
FDT
%
Método Enzimático, Gravimétrico
AOAC 985.29.
52
2.4 TÉCNICAS ANALÍTICAS
La metodología usada cumple con el siguiente orden: 2.4.1 Análisis fisicoquímicos 1. pH 2. °Brix 3. Densidad 4. Viscosidad
Para determinar las propiedades fisicoquímicas de los néctares antes y después de la hidrólisis enzimática, se tuvieron en cuenta los métodos y procedimientos utilizados basados en los protocolos AOAC e ISO ya mencionados (Tabla 7). pH:
Se tomaron aproximadamente 25ml de néctar de zanahoria en un vaso de precipitado, posteriormente, se sumerge el electrodo del pH-metro CG818 Schott Gerate y se hace la lectura, tener en cuenta la previa calibración del equipo y temperatura de 20°C.
Figura 14. pH-metro.
53
Solidos solubles totales °Brix:
Se determinó por refractómetria y se reportó en unidades de °Brix. Las lecturas se realizaron haciendo uso de un refractómetro (Marca Fischer) de 0 – 32 % ubicando una gota de néctar de zanahoria en el centro de la celda. Se realiza por duplicado para cada tratamiento. Figura 15. Refractómetro (Marca Fischer).
Densidad:
Fue determinado con picnómetro de 25 ml, pesando en primer lugar el picnómetro limpio y seco, luego se llena con agua destilada a 30°C, llevando a nivel de aforo y colocar el tapón cuidadosamente sin dejar liquido en las paredes exteriores del picnómetro. Posteriormente se vacía el picnómetro, se seca e introducir la muestra de néctar efectuando la misma operación que en el paso anterior. Se obtuvo el peso del néctar contenido en ese volumen y dividirlo por el peso del agua a 30°C. Figura 16. Picnómetro de 25 ml
54
Viscosidad
La medición de este parámetro se efectuó por medio del viscosímetro de Ostwald, llenando el viscosímetro limpio y seco con 8 ml de néctar, a través del tubo de mayor diámetro, introduciendo el viscosímetro en el baño termostático y esperar unos 5 minutos para que el néctar alcance la temperatura de 30°C. Posteriormente se succiona el néctar por encima de la marca superior del viscosímetro (tubo de menor diámetro) y se realiza la medición de descenso del néctar con cronometro. Se realizó la medición por triplicado. Figura 17. Viscosímetro de Ostwald.
2.4.2 Análisis funcional
1. Fibra dietaría soluble (FDS) 2. Fibra dietaría insoluble (FDI) 3. Fibra dietaría Total (FDT)
En la figura 18 se describe el diagrama de flujo del protocolo para determinación del residuo de la muestra, el cual se aplica en las ecuaciones para hallar FDS, FDI
55
y FDT (AOAC 985.29), para así establecer la evaluación funcional de los néctares antes y después de la hidrólisis enzimática.
Figura 18. Residuo de FDI y FDS
56
Figura 19. Diagrama de flujo de proceso de obtenci贸n del residuo para hallar fibras (FDS y FDI)
Fuente: AOAC 985.29.
57
2.4.3 Cálculos para determinación de Fibra Dietaria Insoluble (FDI), Fibra Dietaria Soluble (FDS) y Fibra Dietaria Total (FDT). Posteriormente a la determinación del residuo de la muestra se aplican las ecuaciones relacionadas con el método de determinación de fibras (insoluble, soluble y total): Ecuación 1:
Donde: FDT: fibra dietaria total R muestra: peso del residuo P muestra: peso proteína C muestra: peso ceniza B: blanco Ecuación 2:
-
Peso de proteína: se establece teóricamente de acuerdo al porcentaje de proteína existente en la zanahoria.
-
Peso de ceniza: se determina de acuerdo al método A.O.A.C., 923.03 de 1990.
-
Determinación de B: se realizó de manera similar a FDT, omitiendo la adición de la muestra.
-
Determinación de FDI: la misma técnica de FDT a diferencia que se elimina la adición de alcohol al 95%.
-
Determinación de FDS: se utiliza la ecuación 2
58
2.5 DISEÑO DE EXPERIMENTOS Para evaluar el efecto de hidrólisis enzimática sobre el néctar de zanahoria (Daucus carota L. var. Chantenay) se planteó un arreglo factorial 2x3 completamente al azar. Los factores analizados fueron establecidos tomando como criterio
resultados de estudios bibliográficos Anexo C para sistemas de
hidrólisis similar, los cuales relacionan como condiciones óptimas de hidrólisis: concentraciones de enzima (0,5% y 2 % v/v) y tiempos de hidrólisis (cero, dos y tres horas). Para un total de doce (12) observaciones; seis (6) tratamientos por dos (2) repeticiones. Este diseño experimental se construyó como se muestra en la tabla 8.
Tabla 8. Diseño experimental. Estudio del comportamiento fisicoquímico y funcional del néctar de zanahoria hidrolizado enzimáticamente. Diseño experimental Factorial completamente al azar Estructura 2x3 (2 concentraciones de Pectinex Ultra SPL por tres tiempo de hidrólisis enzimática) Tratamientos Tratamiento 1 = T1 Tratamiento 2 = T2 Tratamiento 3 = T3 Tratamiento 4 = T4 Tratamiento 5 = T5 Tratamiento 6 = T6 Variables independientes Tiempos de hidrólisis enzimática (horas) 0 2 3 0 2 3
Parámetros de reacción enzimática
Concentración Tratamientos de enzima % v ( /v) T1 0,5 T2 0,5 T3 0,5 T4 2 T5 2 T6 2 pH: 3,77 y T: 34 °C.
Unidad experimental
Envase de vidrio de 100 ml con producto.
Unidad de muestreo
25 ml para cada análisis.
Número de repeticiones
Dos (2).
59
2.6 ANALISIS ESTADISTICO.
Los datos obtenidos se analizaron teniendo en cuenta la naturaleza cuantitativa de las variables, razón por la cual se emplearon medidas de tendencia central y de dispersión. Además, se aplicó el análisis de varianza (ANOVA) para establecer diferencias significativas. En los casos donde se encontró diferencia significativa entre los tratamientos, se aplicó la prueba de Tukey con el objetivo de comparar entre sí los resultados. En ambos casos se utilizó un nivel de significancia de α=0,05.
3. RESULTADOS Y ANÁLISIS 3.1 CARACTERIZACIÓN DEL NÉCTAR
La tabla 6 muestra las propiedades fisicoquímicas del néctar de zanahoria (Daucus carota L. var. Chantenay) elaborado y los rangos reportados por el CODEX STAN (247- 2005), la NTC 5468, Res. 7992/91 cap IV, la Ficha técnica de productos tropicales y Zaga (2013). Las muestras de néctar sin hidrolizar cumplen con los requerimientos fisicoquímicos marcadas por las normas
60
Tabla 9. Características fisicoquímicas del néctar de zanahoria (Daucus carota L. var. Chantenay). Medición Parámetro R1
R2
Rango establecido
Ph
3,60
3,60
3,33 – 4,2
°Brix
12,7
12,5
12 – 18
1,07381
1,0465 (ficha técnica). 1.051 g/ml en néctar de cocona. 1,13284 en néctar de uvilla hidrolizado.
Densidad (g/ml)
Viscosidad (cP)
1,07853
31,4488
29,7950
25,67 en néctar de durazno.
Referencias bibliográficas
CODEX STAN 247-2005; Suarez (2003); Coronado e Hilario (2001); Lasso y Beltrán, 2013 NTC 5468. Res. 7992/91 cap IV Ficha técnica del producto; fabricante jugos tropicales S.A, 2006.
Observaciones Depende de materia prima
la
Depende de materia prima En función rendimiento
la del
. Zaga, 2013.
León y Rosero, 2009.
Alvarado, 1993; 2001
Salazar,
En función de la cantidad de estabilizante agregado, del porcentaje de pulpa y del rendimiento
La tabla 9 muestra que las propiedades fisicoquímicas del néctar de zanahoria (Daucus carota L. var. Chantenay) se encuentran dentro de los rangos pH y °brix establecidos según Codex Stan 247-2005 y NTC 5468, y para el caso de densidad y viscosidad los resultados se asemejan a los encontrados en la literatura asociados con néctares de otras frutas u hortalizas, esto sugiere que este producto cumple con las características de una néctar apto para el consumo (Ficha técnica del producto; fabricante jugos tropicales S.A, 2006; Zaga, 2013; Alvarado, 1993; Salazar, 2001).
3.2 NÉCTAR HIDROLIZADO
61
A continuación se evaluó la intervención de los factores tiempo de hidrólisis (cero, dos y tres horas) y concentración de Pectinex® Ultra SPL (0,5 y 2 % (v/v)) en muestras tomadas al azar, determinando los cambios fisicoquímicos (pH, °Brix, Viscosidad, Densidad) y funcionales (FDS, FDI y FDT) que presentaron los néctares hidrolizados enzimáticamente.
3.2.1 Comportamiento del pH Durante la hidrólisis, la enzima rompe la estructura de la pectina liberando grupos con carácter ácido (carboxilo e hidroxilo) principalmente ácido hidroxicinámico y ácido ferúlico que están vinculados a las cadenas de polisacáridos (Bibbins et al. , 2010), aumentando a su vez la concentración de iones hidronio haciendo que el pH tenga un comportamiento descendente; comportamiento que coincide con lo encontrado experimentalmente, en las primeras dos horas (gráfica 1), para las dos concentraciones de enzima Pectinex® Ultra SPL; curva en la cual se aprecia la dispersión presentada por los datos experimentales y cuyos valores están entre 0,01 y 0,07 unidades de pH.
El valor de pH disminuye al aumentar el tiempo de hidrólisis enzimática, mientras que la concentración de enzima no produce cambios en los valores de pH. Sin embargo, la reducción de esta variable desde 3.61 hasta valores de 3.56 sigue manteniéndose dentro del rango establecido según Norma CODEX STAN 247-2005 para néctar, además, este comportamiento refleja una forma de control para la proliferación de microorganismos que afectan la calidad del néctar estudiado.
62
Gráfica 1. Comportamiento promedio de pH del néctar de zanahoria frente al tiempo de hidrólisis enzimática.
pH Vs Tiempo hidrólisis 3,62 3,61 3,60
pH Concentración 0,5%
pH
3,59 3,58
pH Concentración 2%
3,57 3,56 3,55 0
1
2
3
4
Tiempo (h)
Como se observa en la gráfica 1, en las primeras dos horas, el pH desciende un 4,5% para ambas concentraciones de enzima, acorde con los resultados reportados por Chiu Sen (2011) para dos pectinasas comerciales sobre puré; mientras que entre la segunda y la tercera hora, se presenta un cambio de dirección en la hidrólisis, siendo ligeramente menor el cambio en la concentración 0,5% (v/v), sugiriendo una repolimerización de la fibra dietaria no fermentable como la pectina. Levin y Forchiassin (2006); Aristizábal y Sánchez (2007); Badui, (2006).
Asimismo, el análisis de varianza (ANOVA) del pH frente al tiempo, muestra que al utilizar concentraciones de enzima y tiempos diferentes de hidrólisis existe diferencia significativa entre los tratamientos cuando α = 0,05 (Tabla 10). Mientras que en el ANOVA del pH frente a la concentración de Pectinex Ultra SPL no se observan cambios significativos entre las muestras estudiadas (Tabla 11).
63
Tabla 10. Análisis ANOVA del factor pH vs tiempo.
Suma de cuadrados pH
Media cuadrática
Gl
Inter-grupos
,068
2
,034
Inter-grupos
,012
9
,001
Total
,080
11
F 24,463
Sig. ,000
Tabla 11. Análisis ANOVA del factor pH vs concentración. Suma de cuadrados pH
Media cuadrática
Gl
Inter-grupos
,001
1
,001
Inter-grupos
,080
10
,008
Total
,080
11
Fd ,085
Sig. ,777
Teniendo en cuenta que existe diferencia significativa del pH en función del tiempo, se realizó la prueba de Tukey para los tratamientos cuando α = 0,05 (Tabla 12), encontrándose que los productos hidrolizados a las dos y tres horas presentan valores de pH diferentes a los del tiempo cero pero similares entre sí. En todos los casos, es de anotar que el pH permaneció dentro de los rangos establecidos por Codex alimentarius, indicando que los néctares hidrolizados cumplen con este parámetro.
64
Tabla 12. Análisis HSD Tukey- pH. a
HSD de Tukey
Subconjunto para alfa = 0,05 Tiempo
1
N
2
2
4
3,5675
3
4
3,585
0
4
3,735
Sig.
0,789
1,000
Se muestran las medidas para los grupos en los subconjuntos homogéneos. a. Usa el tamaño muestral de la media
3.2.2 Comportamiento del contenido de sólidos solubles (°Brix) La gráfica 2 muestra el comportamiento de los sólidos solubles (°Brix), para los néctares de zanahoria con sus respectivas concentraciones de enzima y tiempo de hidrólisis.
65
Gráfica 2. Comportamiento promedio de °Brix del néctar de zanahoria frente al tiempo de hidrólisis enzimática.
°Brix Vs Tiempo hidrólisis 13,20 13,10 °Brix Concentración 0,5% °Brix Concentración 2%
°Brix
13,00 12,90 12,80 12,70 12,60 12,50 0
1
2
3
4
Tiempo (h)
Nótese que en las tres horas de hidrólisis hay un ligero incremento en el contenido de sólidos solubles (1,25% para la concentración de 0,5% de enzima y 5% para la del 2%), indicando poca liberación de monosacáridos durante la reacción enzimática, lo cual implica que la solución de Pectinex Ultra SPL cataliza los polímeros (pectina y hemicelulosa) mediante rupturas endo-; comportamiento que confirma los resultados relacionados por Flores (2012), quien reporta mayores cantidades de sólidos solubles debido a que la enzima rompe la pectina y la deja en suspensión.
Los °Brix están relacionados con la concentración de zumo, el nivel de azúcar disuelta, entre otras sustancias como algunas vitaminas y algunas proteínas. Esta variable, puede ayudar a verificar la calidad del néctar, sin embargo, no se ve afectada por la reacción enzimática propuesta en el presente estudio, reportando valores dentro del rango establecido según norma para néctares.
66
En el análisis de varianza (ANOVA) cuando α = 0,05 (Tabla 13 y 14) se observa que no hay diferencia significativa entre los tratamientos, con respecto del comportamiento de la concentración de sólidos frente al tiempo de reacción y la concentración enzimática. Tabla 13. Análisis ANOVA del factor °Brix vs Tiempo. Suma de cuadrados °Brix
Media cuadrática
Gl
Inter-grupos
,515
2
,258
Inter-grupos
141,888
9
15,765
Total
142,403
11
F ,016
Sig. ,984
Tabla 14. Análisis ANOVA del factor °Brix vs Concentración. Suma de cuadrados °Bri x
Media cuadrática
Gl
Inter-grupos
, 441
1
,441
Inter-grupos
141,962
10
14,196
Total
142,403
11
F ,031
Sig. ,864
3.2.3 Comportamiento de la densidad La gráfica 3 muestra el comportamiento de la densidad del néctar de zanahoria con sus respectivas concentraciones de enzima pectinex Ulta SPL y tiempo de acción de esta.
67
Gráfica 3. Comportamiento promedio de la densidad del néctar de zanahoria frente al tiempo de hidrólisis enzimática.
Densidad Vs Tiempo hidrólisis 1,09 Densidad (g/ml)
1,08
Densidad Concentración 0,5% Densidad Concentración 2%
1,08 1,08 1,08 1,08 1,07 1,07
-1
0
1
2
3
4
Tiempo (h)
El comportamiento que tuvieron los tratamientos con diferentes concentraciones de enzima sobre la densidad mostró: para 0,5% (v/v) un aumento progresivo y para 2%(v/v) una ligera disminución a medida que transcurrió el tiempo de cero a dos horas de hidrólisis, debido a la ruptura de la cadena de pectina generada por la reacción causando la reducción de su peso molecular, momento a partir del cual, los dos tratamientos incrementaron su densidad, por el aumento de peso molecular causado por la unión de monómeros, de forma contraria a lo reportado por León y Rosero (2009), ya que reportaron que en un jugo de uvilla la densidad influye significativamente en la densidad de este, lo cual se dio la diferencia en las condiciones de su estudio en comparación con las del presente. En el análisis de varianza (ANOVA) cuando α = 0,05 (Tablas 15 y 16) se observa que no hubo diferencia significativa para los tratamientos, es decir que la hidrólisis enzimática actuó sobre la densidad de forma similar para las dos concentraciones de enzima adicionadas, en el mismo rango de tiempo de actividad hidrólitica.
68
Tabla 15. Análisis ANOVA del factor tiempo vs densidad. ANOVA de un factor Suma de cuadrados ρ
Media cuadrática
gl
Inter-grupos
,001
2
,000
Inter-grupos
,003
9
,000
Total
,003
11
F 1,272
Sig. ,326
Tabla 16. Análisis ANOVA de un factor concentración vs densidad. ANOVA de un factor Suma de cuadrados ρ
Media cuadrática
gl
Inter-grupos
,000
1
,000
Inter-grupos
,003
10
,000
Total
,003
11
F ,043
Sig. ,839
La densidad es una propiedad que describe el grado de compactibilidad del néctar, mientras más unidas estén las partículas individuales del néctar, más denso es este. Está relacionada con los °Brix de manera proporcional, la concentración de solidos solubles en el néctar refleja la densidad de éste (Contreras, 2008), por lo tanto, como fue reportado en el estudio presente, los °brix no se vieron afectados por la hidrolisis enzimática propuesta en el estudio, conllevando a que los cambios producidos en la densidad tampoco fueran significativos. Existe un efecto de la densidad sobre el asentamiento de las partículas del néctar, entre las partículas tengan mayor peso, mayor será la densidad de este y tenderán a sedimentarse (Juárez, 2007), esto explica que como la reacción no tuvo influencia en esta variable, el néctar hidrolizado enzimáticamente no presentó sedimentación, y por lo tanto es aceptado visualmente por el consumidor.
69
3.2.4 Viscosidad intrínseca en función del peso molecular La gráfica 4 muestra el comportamiento del peso molecular, el cual está directamente relacionado con la viscosidad intrínseca [η] del néctar, definiendo su (PM = ƒ [η]). Ver determinación de PM = ƒ [η] Anexo D. En cuanto a
interacción
la experimentación realizada los datos obtenidos son comparables con esta información. Gráfica 4. Comportamiento de línea de tendencia del Peso molecular en función de viscosidad intrínseca [η].
Correlación entre el peso molecular en función del viscosidad intrínseca 4.000,00
y = 119,91x - 924,09 R² = 0,9988
Peso molecular (g/mol)
3.500,00 3.000,00 2.500,00 2.000,00
PM([η])
1.500,00
Lineal (PM([η]))
1.000,00 500,00 0,00 0
10
20
30
40
50
Viscosidad intrinseca
La grafica 4 muestra que existe alta correlación (R2 = 0,9988) entre las dos variables, en otras palabras, el aumento del peso molecular (PM), genera la misma conducta en la viscosidad intrínseca [η]. Evidenciando que cuando las características de estructura de la pectina son cambiadas por acción enzimática logran generar que su tamaño y longitud se vean afectados, estas medidas están relacionadas con las dos variables, tal como lo afirma López (2004) definiendo que [η] determina la medida del tamaño y extensión en el espacio de las moléculas de pectina, y se relaciona empíricamente con la longitud de cadena la cual define el PM de este polímero lineal (Pagan, 2001).
70
3.2.5 Viscosidad en función de la hidrólisis enzimática. La gráfica 5 muestra el comportamiento promedio de los porcentajes de viscosidad, para el néctar de zanahoria con sus respectivas concentraciones de enzima pectinex Ultra SPL y Tiempo de acción de esta. Gráfica 5. Comportamiento promedio de viscosidad del néctar de zanahoria frente al tiempo de hidrólisis enzimática.
Viscosidad Vs Tiempo hidrólisis 40,0000 35,0000 Viscosidad
30,0000
Viscosidad Concentración 0,5%
25,0000 20,0000 15,0000
Viscosidad Concentración 2%
10,0000 5,0000 0,0000 0
1
2
3
4
Tiempo (h)
En el rango de tiempo de cero a dos horas de incubación de Pectinex® Ultra SPL, la viscosidad del néctar se redujo para todos los tratamientos a razón de que ésta rompió los enlaces entre los polisacáridos que componen la pectina reduciendo esta variable (Grafica 5). Carvajal (2007) observó que una mezcla de 200 ppm de Pectinex 3XL con 400 ppm Pectinex® Ultra SPL disminuye la viscosidad inicial en un 95,2%; ya que éstas, degradaron pectinas, celulosas y hemicelulosas que conforman las paredes celulares. Este mismo efecto fue reportado por Chiu Sen (2011) y Flores (2012).
71
El comportamiento que tuvo la enzima en el tiempo de hidrólisis durante dos horas se relaciona con la reducción de tamaño molecular de los oligómeros, que fue suficiente para hacer un cambio descendente en la viscosidad. Sin embargo, de dos a tres horas de acción enzimática, el tamaño molecular de éstos no contribuye a generar cambios notorios. La viscosidad de los néctares es una característica física importante, ya que influye en el desarrollo del proceso de elaboración, en la aceptación del producto por el consumidor y se emplea como medida de control (Alvarado, J. 1993), en el presente estudio, su disminución generó un néctar con textura ligera, clarificado y con mayores rendimientos (Cortés, 2004;Mejia, 2007), haciéndolo un producto más aceptado por el consumidor, ya que los néctares menos viscosos permiten una mejor clarificación, favoreciendo la homogeneidad de la mezcla del jugo con la disminución de la velocidad de sedimentación (Cardona, 2009).
El efecto del contenido de solidos solubles (°Brix) sobre la viscosidad del néctar, se debe al contenido de pectinas y de pulpa después de la hidrolisis enzimatica lo cual afecta el comportamiento reologico de este (Alvarado, J. 1992), reduciendo estas dos variables proporcionalmente. En el análisis de varianza (ANOVA) de viscosidad vs tiempo para α = 0,05, se presentan diferencias significativas, es decir, la acción enzimática reacciona directamente sobre la viscosidad, disminuyéndola al aumentar el tiempo de hidrólisis (Tabla 17). Para el caso del análisis de varianza (ANOVA), viscosidad vs concentración,
se
observó
que
no
hay
diferencia
significativa
en
el
comportamiento de los tratamientos frente a la concentración de enzima aplicada, indicando que las concentraciones 0,5 y 2% v/v generaron una conducta de acción enzimática similar para el contenido de viscosidad (Tabla 18).
72
Tabla 17. Análisis ANOVA de un factor tiempo vs viscosidad. ANOVA de un factor Suma de cuadrados η
Media cuadrática
gl
F
Inter-grupos
793,935
2
396,968
Inter-grupos
21,698
9
2,411
Total
815,634
11
Sig.
164,653
,000
Tabla 18. Análisis ANOVA de un factor concentración vs viscosidad. ANOVA de un factor Suma de cuadrados η
Media cuadrática
gl
F
Inter-grupos
,456
1
,456
Inter-grupos
815,177
10
81,518
Total
815,634
11
Sig.
0,006
0,942
Al existir diferencia significativa entre la viscosidad y el tiempo, se realizó la prueba de Tukey cuando α = 0,05 (Tabla 19) para los tratamientos, observándose que en los tiempos de cero a dos horas de trabajo, la enzima ha completado la hidrólisis enzimática en su totalidad y confirma que Pectinex® Ultra SPL actúa sin generar grandes cambios de esta variable en el rango de tiempo de dos a tres horas.
Tabla 19. Análisis HSD Tukey- viscosidad. a
HSD de Tukey
Subconjunto para alfa = 0.05 Tiempo
1
N
2
2
4
12,005125
3
4
12,753575
0
4
29,621900
Sig.
,780
Se muestran las medidas para los grupos en los subconjuntos homogéneos. a. Usa el tamaño muestral de la media
73
1,000
3.2.6 Peso molecular en función de la hidrólisis enzimática
La gráfica 6, muestra el comportamiento promedio del peso molecular (PM), para el néctar de zanahoria con sus respectivas concentraciones de enzima pectinex Ultra SPL y Tiempo de acción de esta. Gráfica 6. Comportamiento promedio del peso molecular del néctar de zanahoria frente al tiempo de hidrólisis enzimática.
PM (g/mol)
PM Vs Tiempo hidrólisis 180.000 160.000 140.000 120.000 100.000 80.000 60.000 40.000 20.000 0
PM Concentraci ón 0,5% PM Concentraci ón 2%
0
1
2
3
4
Tiempo (h)
En la gráfica 6 se ve que el comportamiento del peso molecular (PM) es similar cuando se usan las dos concentraciones de Pectinex® Ultra SPL. Alfonso, 2010 explica esta conducta afirmando que el PM de la pectina está relacionado con su longitud de cadena, donde la enzima aplicada actúa sobre las moléculas de esta cadena haciéndolas más pequeñas y de menor PM, por esta razón durante las dos primeras horas de hidrólisis, la enzima actúa hasta llegar al punto de equilibrio de reacción. Cuando la hidrólisis avanza de dos a tres horas se encuentra un proceso de repolimerización visible en el cambio de dirección del punto de equilibrio de la hidrólisis haciendo que el peso molecular se eleve.
74
Lo anterior indica que la enzima Pectinex Ultra SPL degradó la pectina, generando polímeros de menor peso molecular para así lograr una mejora en las características del néctar de zanahoria tales como: reducción su viscosidad, mejora de rendimientos y agilidad los procesos industriales (Cortes, 2004).
Los pesos moleculares de la pectina presente en el néctar, calculados mediante la ecuación de Mark-Houwink, descienden desde 156.460,36 g/mol hasta 138.002,13 g/mol después de 2 horas de acción enzimática. Teniendo en cuenta que los pesos moleculares de las pectinas varían entre 20.000 y 200.000, y siendo en general los valores de las pectinas comerciales de alrededor de 80.000 (Pagan, 2001),
el peso molecular de la pectina del néctar hidrolizado tiene un valor
aceptable para el uso de esta reacción en la industria.
Una de las formas de identificar la existencia de un prebiótico galactooligosacarido (GOS) es por medio de la comparación con su peso molecular (522,28 g/mol); sin embargo, en el estudio realizado el peso molecular más bajo de los polímeros que resultaron de la hidrólisis es 138.002,13 g/mol lo que sugiere que no se consideren estructuralmente GOS. El análisis de varianza (ANOVA) de peso molecular vs tiempo cuando α = 0,05 (Tabla 20) muestra que el tiempo de hidrólisis enzimática es un factor clave y genera una variación significativa en el peso molecular de la pectina. Sin embargo, el análisis de varianza (ANOVA) de peso molecular vs concentración cuando α = 0,05 (Tabla 21) muestra lo contrario.
75
Tabla 20. Análisis ANOVA de un factor tiempo vs peso molecular. ANOVA de un factor Suma de cuadrados PM
Media cuadrática
Gl
Inter-grupos
5,170E+14
2
2,585E+14
Inter-grupos
1,465E+13
9
1,628E+12
Total
5,317E+14
11
F 158,787
Sig. ,000
Tabla 21. Análisis ANOVA de un factor concentración vs peso molecular. ANOVA de un factor Suma de cuadrados PM
Media cuadrática
Gl
Inter-grupos
2,195E+11
1
2,195E+11
Inter-grupos
5,315E+14
10
5,315E+13
Total
5,317E+14
11
F ,004
Sig. ,950
Existe diferencia significativa con relación en peso molecular vs tiempo (tabla 22), se realizó Tukey con un nivel de significancia de 95 % para los tratamientos, muestra que durante las dos primeras horas desciende el peso molecular significativamente. Mientras que en el rango de tiempo de dos a tres horas no hay un cambio significativo de peso molecular es decir que la reacción de la enzima se reduce y ocurre la unión de monómeros (re-polimerización) haciendo que cambie la dirección del punto de equilibrio de la hidrólisis de la pectina, aumentando su peso molecular.
76
Tabla 22. Análisis HSD Tukey- peso molecular. a
HSD de Tukey
Subconjunto para alfa = 0.05 Tiempo
N
1
2
2
4
6644593,750
3
4
7165972,500
0
4
20822230,00
Sig.
,835
1,000
Se muestran las medidas para los grupos en los subconjuntos homogéneos. a. Usa el tamaño muestral de la media
3.2.7 Fibras dietarías en función de la hidrólisis enzimática
La aplicación de enzimas en condiciones específicas de tiempo, temperatura y pH, en función de la naturaleza de la fibra y enzima, produce la degradación y remoción de compuestos digeribles como: proteínas, almidones y azúcares simples, cambiando así el contenido, composición y propiedades funcionales de la fibra dietaría soluble, insoluble y total (Bibbins et al., 2010), a continuación se describe el comportamiento que tuvieron éstas. Fibra Dietaría Insoluble (FDI) La gráfica 7 muestra el comportamiento promedio de los porcentajes FDI, para el néctar de zanahoria con sus respectivas concentraciones de enzima pectinex Ulta SPL y tiempo de acción.
77
Gráfica 7. Comportamiento promedio de FDI del néctar de zanahoria frente al tiempo de hidrólisis enzimática.
% FDI Vs Tiempo hidrólisis 0,06 0,05
% FDI
0,04 0,03
%FDI Concentración 0,5%
0,02
%FDI Concentración 2%
0,01 0,00 0
1
2
3
4
Tiempo (h)
La fibra dietaría insoluble contenida en el néctar hidrolizado se comportó de forma ascendente para todos los tratamientos en el rango de tiempo de incubación cero a dos horas. Evidenciando que las acciones de la enzima provocaron cambios en la cadena estructural de los polisacáridos y polímeros que componen la FDI (celulosa, hemicelulosa y lignina), logrando aumentar el contenido de esta fibra (Baena y García (2012); Comisión del Codex alimentarius (2009)). La gráfica 7 muestra que el comportamiento de menor concentración (0,5%) de la enzima, conlleva a un mayor pero no significativo aumento de FDI comparado con la concentración de enzima del 2% (v/v), debido a que una menor concentración de Pectinex® Ultra SPL hace que el rompimiento de la estructura de cadena de pectina sea menor. También, se observó que el trabajo de hidrólisis enzimática es completada para los dos casos en el tiempo de acción durante dos horas, atribuyendo la obtención de un mayor porcentaje de FDI que brindara un producto funcional para prevenir el estreñimiento, reducir la aceleración del paso de los alimentos a través del estómago e intestinos (lo cual es importante, por ejemplo,
78
en la prevención de la constipación) y también puede reducir el riesgo de cáncer colorrectal. Nutripro (2004). En el análisis de varianza (ANOVA) FDI vs tiempo cuando α = 0,05 (Tabla 23) se presentaron diferencias no significativas, es decir que la hidrólisis enzimática tiene una reacción similar sobre la FDI en el rango de tiempo de acción de cero a tres horas. De igual manera en el análisis de varianza (ANOVA) FDI vs concentración (Tabla 24) se observa que no hay diferencia significativa en el comportamiento de los tratamientos frente a la concentración de enzima agregada, en donde la reacción de enzima 0,5 y 2% (v/v) produjeron cambios similares para el contenido de FDI del néctar en el momento de la hidrólisis. Tabla 23. Análisis ANOVA de un factor tiempo vs fibra dietaria insoluble. ANOVA de un factor Suma de cuadrados FDI
Media cuadrática
gl
Inter-grupos
,000
2
,000
Inter-grupos
,000
8
,000
Total
,000
10
F 1,588
Sig. ,263
Tabla 24. Análisis ANOVA de un factor concentración vs fibra dietaria insoluble. ANOVA de un factor Suma de cuadrados FDI
Media cuadrática
gl
Inter-grupos
,000
1
,000
Inter-grupos
,000
9
,000
Total
,000
10
79
F ,112
Sig. ,745
Fibra Dietaría soluble (FDS) La gráfica 8 muestra el comportamiento promedio de los porcentajes FDS, para el néctar de zanahoria con sus respectivas concentraciones de enzima pectinex Ulta SPL y Tiempo de acción de esta. Gráfica 8. Comportamiento promedio de FDS del néctar de zanahoria frente al tiempo de hidrólisis enzimática.
%FDS
% FDS Vs Tiempo hidrólisis 0,20 0,18 0,16 0,14 0,12 0,10 0,08 0,06 0,04 0,02 0,00
% FDS Concentración 0,5% % FDS Concentración 2%
0
1
2
3
4
Tiempo (h)
El grado de descomposición del material de la pared celular y el aumento de componentes de fibra dietética oligoméricos y / o poliméricos solubles son causados tanto por la composición de la pulpa como por las actividades de las preparaciones de enzima, Bibbins et al., 2010. Las acciones enzimáticas en el néctar provocaron cambios en la composición del monosacárido (ácido galactouronico, glucosa y arabinosa), aumentando el contenido de FDS (grafica 8), esto mismo fue afirmado por Bibbins et al., 2010 quien manifiesta que el rendimiento de FDS aumenta de 7 a 19% tras tratamiento enzimático. Así mismo otros autores han validado que el tratamiento enzimático aumenta la cantidad de FDS 3 veces más que su valor original sin ninguna disminución marcada en la cantidad de FDT (Bibbins et al., 2010).
80
Tanto en FDI como en FDS ocurren comportamientos similares: La hidrólisis enzimática es completada utilizando las dos concentraciones en el tiempo de acción de dos horas. Durante las dos primeras horas de hidrólisis el rompimiento de la estructura pectica produjo aumento de las fibras, a las dos horas la hidrólisis alcanza su punto de equilibrio y en el rango de dos a tres horas, Pectinex® Ultra SPL inicia su acción en la estructura de fibra ocasionando reducción, debido a que la estructura del polisacárido cada vez es más pequeña.
Comportamiento que se puede observar en las gráficas 25 y 26.
En el análisis de varianza (ANOVA) FDS vs tiempo y FDS vs concentración cuando
α = 0,05 se presentaron diferencias no significativas, es decir que la
hidrólisis enzimática se comportó sobre la FDS de forma similar en el rango de tiempo de acción de cero a tres horas y con 0,5 y 2% (v/v) de enzima.
Tabla 25. Análisis ANOVA de un factor tiempo vs fibra dietaria soluble. ANOVA de un factor Suma de cuadrados FDS
Media cuadrática
gl
Inter-grupos
,001
2
,001
Inter-grupos
,004
8
,000
Total
,005
10
F 1,204
Sig. ,349
Tabla 26. Análisis ANOVA de un factor concentración vs fibra dietaria soluble. ANOVA de un factor Suma de cuadrados FDS
Media cuadrática
gl
Inter-grupos
,000
1
,000
Inter-grupos
,004
9
,000
Total
,005
10
81
F ,801
Sig. ,394
Fibra Dietaría soluble (FDT) La gráfica 9 muestra el comportamiento promedio de los porcentajes FDT, para el néctar de zanahoria con sus respectivas concentraciones de enzima pectinex Ulta SPL y Tiempo de acción de esta. El valor de FDT obtenido en el momento en que la hidrólisis se completó (tiempo: 2 horas) fue de 0,0476% mayor al que se encuentra en el néctar sin hidrolizar (tiempo: 0 horas) que fue de 0,0042%. Esta diferencia se debe a la degradación de la pectina durante el proceso de hidrólisis para la obtención de fibra dietaría. Sin embargo este valor fue menor al obtenido en estudios posteriores (Aguilar A, 2008). Gráfica 9. Comportamiento promedio de FDT del néctar de zanahoria frente al tiempo de hidrólisis enzimática.
%FDT Vs Tiempo hidrólisis 0,70 0,60 % FDT
0,50 0,40
% FDT Concentración 0,5%
0,30 0,20
% FDT Concentración 2%
0,10 0,00 0
1
2
3
4
Tiempo (h)
El análisis (ANOVA) FDT vs tiempo muestra una diferencia no significativa en los cambios de fibra durante la hidrólisis al variar los factores de tiempo y concentración de enzima (Tablas 27 y 28). Sin embargo, se puede observar en las gráficas 7 a 9 el incremento de fibra durante las dos primeras horas, el punto de equilibrio de la hidrólisis y la reducción de fibra en el rango de dos a tres horas de acción enzimática, indicando un comportamiento similar entre estas, aun cuando fueron variados los factores tiempo de acción y concentración de enzima.
82
Tabla 27. Análisis ANOVA de un factor tiempo vs fibra dietaria total. ANOVA de un factor Suma de cuadrados FDS
Media cuadrática
gl
Inter-grupos
,001
2
,001
Inter-grupos
,004
8
,000
Total
,005
10
F 1,293
Sig. ,326
Tabla 28. Análisis ANOVA de un factor concentración vs fibra dietaria total. ANOVA de un factor Suma de cuadrados FDS
Media cuadrática
gl
Inter-grupos
,000
1
,000
Inter-grupos
,005
9
,001
Total
,005
10
F ,796
Sig. ,395
• Comportamiento promedio de las FD del néctar de zanahoria frente al tiempo de hidrólisis enzimática y concentraciones. En el comportamiento de las gráficas 10 y 11 se puede observar que con el tratamiento enzimático, la fracción insoluble de fibra dietaría en el néctar de zanahoria aumenta en menores cantidades comparado con la fibra dietética, aun así, las fracciones de aumento no son significativas.
Sin embargo, según lo establecido en la Resolución 288/2008 de 31 de enero, la fibra dietaria se expresa como la cantidad total de gramos en una porción (100ml) del alimento y como el número de gramos más cercano a la unidad, si es menor a 0,5 g, como es el caso del valor de fibra dietaría que reporta el presente estudio (0,0547g/100ml) la declaración se expresa como contenido de fibra cero (0), lo que indica que la hidrolisis enzimática con Pectinex Ultra SPL, no genera un producto enriquecido o funcional y la declaración en el rotulado del nectar se debe expresar como “cero(0)”.
83
Gráfica 10. Comportamiento promedio de las FD del néctar de zanahoria frente al tiempo de hidrólisis enzimática y concentración de 0,5%.
Comportamiento fibra dietaria durante la hidrolisis y = -0,0007x2 + 0,0026x + 0,0009 R² = 1
0,0600
% Fibra Dietaria
0,0500 y = -0,0083x2 + 0,0373x + 0,0033 R² = 1
0,0400
y = -0,0091x2 + 0,0399x + 0,0042 R² = 1
0,0300 0,0200
FDI vs Tiempo (C 0,5%)
0,0100
FDS vs Tiempo (C 0,5%)
0,0000 0
1
2
3
4
FDT vs Tiempo (C 0,5%)
Tiempo (h)
Gráfica 11. Comportamiento promedio de las FD del néctar de zanahoria frente al tiempo de hidrólisis enzimática y concentración de 2%.
% Fibra Dietaria
Comportamiento fibra dietaria durante la hidrolisis 0,0500 0,0450 0,0400 0,0350 0,0300 0,0250 0,0200 0,0150 0,0100 0,0050 0,0000
y = -0,0043x2 + 0,0123x + 0,0384 R² = 1 y = -0,0039x2 + 0,0109x + 0,0367 R² = 1 y = -0,0005x2 + 0,0014x + 0,0017 R² = 1
FDI vs Tiempo (C 2%) FDS vs Tiempo (C 2%) 0
1
2
3
Tiempo (h)
84
4
FDT vs Tiempo (C 2%)
3.2.8 Percepción sensorial
Los cambios evidenciados en la percepción sensorial del néctar hidrolizado enzimáticamente fueron:
Color: se observó que los néctares que fueron sometidos a hidrólisis (2 y 3 horas) presentaban una mayor luminosidad en comparación con el néctar no hidrolizado. Esto puede atribuirse a la cantidad de sólidos extraídos mediante la acción enzimática. La aplicación de las enzimas pectinasas permite la extracción de compuestos que son los encargados de otorgar colores al néctar de zanahoria (ẞcarotenos) (Pagan, 2001).
Sabor: en los néctares hidrolizados se detectó un sabor más acido en comparación con los no hidrolizados, debido a la reducción de pH que causo esta reacción.
Textura: el néctar que no fue hidrolizado, presentaba partículas de mayor tamaño que generaban una textura más concentrada, mientras que el néctar hidrolizado presentaba una textura ligera y menos viscosa.
85
4. CONCLUSIONES Al evaluar experimentalmente el comportamiento fisicoquímico y funcional que tuvo el néctar de zanahoria (Daucus carota L. var. Chantenay) hidrolizado enzimáticamente se reporta que fisicoquímicamente el producto hidrolizado cumple con las condiciones que lo caracterizan como apto para el consumo, mientras que funcionalmente la hidrólisis enzimática y sus condiciones no fueron las suficientes para aumentar la fibra dietaría y así poder declarar el producto como enriquecido con prebióticos GOS.
Al Identificar el efecto de la concentración enzimática con respecto al tiempo se reporta que para los seis tratamientos, a las dos horas de reacción, se alcanzó la hidrólisis completa en los cambios fisicoquímicos y funcionales. Fisicoquímicamente el pH, la viscosidad del néctar y el peso molecular
tuvieron
descendente
cambios
permitiendo
la
significativos: preservación
el
pH
del
actuó
néctar
de
forma
durante
el
almacenamiento, la viscosidad y el peso molecular actuaron de forma similar otorgando un producto con mayor rendimiento y clarificación, los cambios. Funcionalmente a las dos horas de reacción, la fibra alcanzó su mayor cantidad proporcionándole al producto un contenido de prebióticos más alto en comparación con el néctar sin hidrolizar (0 horas); mientras que durante tres horas de reacción se evidenciaron cambios que indican una regresión de la hidrólisis (repolimerización) Levin y Forchiassin (2006); Aristizábal y Sánchez (2007); Badui, (2006), sin causar cambios significativos en el néctar; razón por la cual, se estableció el tiempo de reacción en dos horas.
Al determinar el peso molecular de los polímeros hidrolizados, utilizando el modelo matemático de Mark Houwink se logró establecer que Pectinex
86
Ultra SPL degradó la pectina, generando polímeros de menor peso molecular para así lograr una mejora en las características del néctar de zanahoria, observando que los pesos moleculares descendieron desde 156.460,36 g/mol hasta 138.002,13 g/mol después de 2 horas de acción enzimática. Sin embargo, la reacción no fue suficiente para llegar al peso molecular de los GOS (522,28 daltons) y con esto hacer un producto adicionado con prebióticos. Al definir el efecto de la hidrolisis enzimática sobre la composición de la fibra dietaría del néctar, se estableció que los valores no representaron diferencia significativas para declarar el néctar hidrolizado como benéfico, ya que la acción de las concentraciones estudiadas de enzima Pectinex Ultra SPL no presento una reacción significativa para reducir el peso molecular de la pectina hasta el de los GOS considerados como prebióticos o fibra dietaría soluble.
El tiempo de hidrólisis para un leve aumento fibra soluble, insoluble y total es de dos horas; para 0,5% de enzima se presentó un aumento de: 1,39, 1,35 y 0,05 % respectivamente, mientras que para 2% de enzima el aumento es leve y tiende a cero. El producto hidrolizado presentó mayor contenido de fibra dietética respecto al néctar sin hidrolizar, esto hace factible el uso de la hidrólisis enzimática con Pectinex Ultra SPL en diversos tipos de néctares funcionales Todo esto hace factible el uso de la hidrolisis enzimática con Pectinex Ultra SPL en el néctar de zanahoria para lograr una mejora de sus características como viscosidad, turbidez y aumentar sus rendimientos.
87
5. RECOMENDACIONES
Es recomendable evaluar las características bromatológicas del néctar de zanahoria adicionado con hidrolizado enzimático de pectina.
Es importante darle otro aprovechamiento a la pulpa y cáscara de la zanahoria con la cual se pueda realizar un proceso de obtención de un néctar con características fisicoquímicas aptas para el consumo y mayores cantidades de fibra dietética.
Para futuras investigaciones con néctar de zanahoria (Daucus Carota L. var. Chantenay) se sugiere la inclusión de pruebas sensoriales para evaluar la calidad y efecto de la enzima frente a los parámetros sugeridos para un néctar. Mediante diferentes análisis de vida útil, se sugiere que se evalué si la adición de la enzima Pectinex Ultra SPL no afecta la conservación y estabilidad del producto.
88
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100
ANEXOS
101
Anexo A. Ficha técnica de enzima Pectinex Ultra SP-L según proveedor. Pectinex® Ultra SP-L Descripción Pectinex Ultra SP-L es un producto enzimático pectolitico altamente activo, producido por una cepa seleccionada de Aspergillus aculeatus. El producto enzimático contiene actividad pectolitica y diversas actividades hemiceluliticas. Es capaz de degradar las paredes celulares de las plantas. Propiedades del producto Tipo de producto: Pectinex Ultra SP-L es un líquido pardo con un ligero olor típico de los productos fermentados y con un pH de aproximadamente 4.5. Actividad: Pectinex Ultra SP-L tiene una actividad estándar de 26.000 PG/ml (pH 3,5). La actividad estándar se determina midiendo la reducción de la viscosidad de una solución de ácido pectico a un pH de 3,5 y una temperatura de 20°C . Revise el método analítico para mayor información. Solubilidad: los componentes activos de Pectinex Ultra SP-L son fácilmente solubles en agua en todas las concentraciones de uso normal. Una turbidez eventual en el producto enzimático no tiene influencia alguna en la actividad volumétrica ni en las características de manejo del producto. Estado alimentario: El producto cumple con las especificaciones recomendadas por la joint FAO/WHO expert committe on Food Additives, (JECFA) y Food chemicals Codex (FCC). Relativas enzimas de uso alimentario, complementadas con niveles máximos de mohos de 102/g. el producto se embotella asépticamente después de una filtración estéril, y está prácticamente exento de microorganismos. Envases: Revise la lista de envases estándar para mayor información. Aplicación: el producto está especialmente diseñado para el tratamiento de pulpa de frutas y vegetales, y la maceración de tejidos vegetales. Además, degrada eficazmente las pectinas solubles e insolubles así como los polisacáridos que provocan la turbidez. Pectinex Ultra SP-L añadido a lo macerados de frutas vegetales y/o orujos mejora drásticamente las capacidades de las separación solido / liquido (por ejemplo, prensa, decantador) y aumenta los rendimientos de jugo.
102
Parámetros de reacción Actividad de Pectinex Ultra SP-L
Seguridad: Las enzimas son proteínas, y la inhalación de polvo o aerosoles puede provocar sensibilización y causar reacciones alérgicas en personas propensas. Tras contacto prolongado, algunas enzimas pueden irritar la piel, ojos y las mucosas. El producto está diseñado para resistir algunos efectos mecánicos. Sin embargo, el uso y desgaste mecánicos excesivos y la trituración pueden generar polvo. Cualquier material derramado debe lavarse con agua abundante. Deben evitarse salpicaduras. El material sobrante puede secarse y generar polvo. Usar indumentaria y guantes adecuados y protección para los ojos/ la cara según las indicaciones en la etiqueta de advertencia. Lávese toda la ropa manchada o salpicada. Todos los productos se suministran con la fecha de seguridad. Previa solicitud facilitamos información detallada sobre el manejo seguro del producto. Almacenamiento: Se recomienda almacenar el producto a 0- 10 °C en envase intacto y protegido de la luz solar. El producto ha sido formulado para mantener una estabilidad óptima. Sin embargo, las enzimas pierden gradualmente su actividad con el tiempo. Puede resultar necesario aumentar la clasificación si la enzima ha experimentado un almacenamiento prolongado o condiciones adversas, como temperatura alta.
103
Anexo B. Cálculos para formulación del néctar de zanahoria.
Inicialmente se realizó la formulación del néctar; para calcular las cantidades de cada uno de los constituyentes de esta se debe conocer:
- El porcentaje de pulpa que va a contener el néctar (25%).
- Los sólidos solubles o °Brix aportados (SSA) por la pulpa.
- Los °Brix que va a contener el producto final.
- La cantidad de néctar a preparar. Cálculos:
Se tuvo 263 g de pulpa de zanahoria que tenía 11°Brix, según la norma los °Brix de un néctar son mínimo 12°Brix (Suarez, 2003; Coronado e Hilario, 2001), por lo tanto el néctar se estandarizó con 13°Brix finales, el contenido mínimo de pulpa en néctares es de 25% (Codex alimentarius, 2005)
Datos: 263 g de pulpa a 11 °Brix. (11%). Néctar final de 13 °Brix. (14%). Con 25% de pulpa se elaborara el néctar.
Si 263g de pulpa corresponden al 25 % de néctar
104
Los ° Brix representan la concentración de sólidos solubles en la solución donde: 0% es la concentración que contiene el agua y 100% la del azúcar. Entonces:
Remplazando en la ecuación:
105
®
Anexo C. Algunos estudios que evalúan el comportamiento de la enzima (Pectinex Ultra SPL), en el momento de hidrólisis.
Condiciones fisicoquímicas Conclusiones
pH
T (ºC)
Concentración
30 a 40
_________
3h
Los tratamientos con diluciones más concentradas fueron los más aceptados por los panelistas con una evaluación entre me gusta poco y moderadamente.
La contribución a la viscosidad se hará menor mientras menor sea el tamaño molecular.
_________ 5,6
37
Referencia
A mayor rendimiento mayor sólidos solubles.
Flores, 2012.
Tiempo
Incremento significativo en sólidos solubles, turbidez y fenoles totales debido al tratamiento enzimático.
3,5 a 4,5
Observaciones
0 a 10 h
La utilización del preparado enzimático Pectinex Ultra SPL para la degradación del polímero de quitosana ofrece la ventaja de una actividad endoquitosanasa marcada que provoca la obtención de fragmentos de quitosana de menor tamaño. Estos a su vez permiten mantener una actividad antifúngica in vitro combinada con un incremento en la percepción de las señales que inducen marcadores de resistencia contra patógenos.
106
La turbidez, no influye en el color (pero si la concentración de pulpa). A mayor tiempo de hidrólisis, mayor Viscosidad. Mayor concentración de sustrato debido a la hidrólisis. A menor molecular viscosidad.
peso menor
Falcón Ramírez, 2004.
y
(Continuación de Anexo C)
4,0
5,6
40
55°C
0,1;0,3; 0,5, 0,75, 1 y2% p/v
2 % p/v
2h
2h
La hidrólisis de harina de cladodios de cactus de la especie Opuntia boldinghiiBritton y Rose con enzimas fibrolíticas (Pectinex® Ultra SP-L y Cellubrix®L., Novozymes, TheNetherlands (Novozymes A/S, Bagsværd, Denmark)), permitió la degradación de constituyentes fibrosos, lo que se tradujo en un incremento de la concentración de azúcares solubles en 6,96 % (p/p), debido a una acción sinérgica entre las enzimas utilizadas.
Agitación continua (250 rpm)
Nazareno y Pereira, 2011.
La combinación de la adsorción de una pectinasa comercial, Pectinex Ultra SP-L que tiene significativa actividad fructosiltransferasa, en Amberlite IRA900 Cl, intercambio aniónico resina y la formación de enlaces cruzados entre las moléculas de proteína adsorbidas, se ha preparado un producto de enzima inmovilizada.
La cantidad de pectinasa agregada para inmovilizar: 0,5g
Csanádi Sisak, 2006.
Valor de pH óptimo del biocatalizador inmovilizado se ha encontrado para ser similar a la enzima libre, pero la inmovilización ha aumentado la temperatura óptima un poco.
5,5 a 6,4
40;60 °C
0,1;0,3 y 2% p/v
3h
La hidrólisis de la CWF con fibrolítica enzimas aumentó la producción de azúcar por 6,96% (w / w) como una consecuencia de la degradación de la fibra constituyentes presentes en la CWF, debido a la evidente acción sinérgica entre Pectinex ® Ultra SP-L y Cellubrix ® L, lo que favoreció la hidrólisis enzimática. Como efecto del contenido de mucílago durante la hidrólisis CWF, podría haber sido afectado por la temperatura de 78 °C del secado inicial durante la obtención de la CWF, mejorando la hidrólisis.
107
y
Valor de pH óptimo del biocatalizador inmovilizado se ha encontrado para ser similar a la de la enzima libre, pero la inmovilización ha aumentado la temperatura óptima un poco.
Agitación (150 rpm). La hidrólisis produce modificaciones de las propiedades funcionales de la harina.
Padron, Pereira, Alvarez, Medina, y Garcia, 2009.
Anexo D. Determinación del peso molecular en función de la viscosidad intrínseca La viscosidad intrínseca [η] de una disolución es la medida del tamaño o longitud de cadena molecular de un polímero y se relaciona empíricamente con el peso molecular (PM) para polímeros lineales (Lopez, 2004 y Pagan, 2000)
El instrumento utilizando para la medición de viscosidad se denomina viscosímetro, el cual tiene diseño capilar y rotacional y ha sido frecuentemente aplicado a la pectina. En la viscosimetría capilar, el flujo se inicia a través de una columna de vidrio vertical capilar a presión y temperatura constante. Los datos son tratados para obtener la viscosidad intrínseca [η]. La unidad de viscosidad intrínseca se expresa como v/w (Pagan, 2000).
Pagan, 2000 expresa que Huggins (1942) relacionó la viscosidad intrínseca con la concentración de soluto y por medio de una ecuación derivada, se abordó el estudio de la funcionalidad de la pectina. Smidsrod y Hang (1971) descubrieron un método que involucra la viscosidad intrínseca [η] y fuerza iónica en un test comparativo de la rigidez de las cadenas del polielectrolito en respuesta a la concentración salina de la disolución.
Procedimiento
La determinación del PM característico de una pectina se relaciona de forma directa con las medidas de viscosidad del siguiente modo: En primera instancia, se hallaron diferentes viscosidades (viscosidad del néctar (η 1) y viscosidad relativa (ηr)) para encontrar la viscosidad intrínseca [η] y de este modo determinar el peso molecular (PM).
Las ecuaciones que expresan las viscosidades son:
108
Ecuación 1. Viscosidad del néctar: η1 =ρ1 * t1 * η2 /ρ2 * t2 Donde: η1: Viscosidad del néctar (cP) ρ1: Densidad del néctar (g/ml) t1: Tiempo caída de néctar (S) η2: Viscosidad del agua a 25°C ( cP) ρ2: Densidad del agua a 25°C (g/ml) t2: Tiempo del agua a 25°C (S)
Ecuación 2. Viscosidad relativa:
ηr = η1/η2
Ecuación 3. Viscosidad intrínseca (Mark Houwink):
[η] = K Ma
Donde: M: peso molecular de pectina K y a: constantes de Mark Houwink para pectina.
Según Alvarado y Aguilera, 2001 la aplicación de las ecuaciones 1, 2 y 3 corresponde a la siguiente secuencia: 1) Relación entre viscosidad η1/η2 y densidad ρ1
y
ρ2, de los líquidos (agua y
néctares) expresada por la ecuación 1. Viscosidad del néctar. 2) Por medio de η1 se determina ηr la cual es expresada por la ecuación 2. Viscosidad relativa. 3) Con los datos obtenidos de ηr se hace elabora un gráfico de la concentración de pectina (C) (0,2 %; 0,4 %; 0,6%; 0,8% (w/v)); frente a ηr/C. Por técnicas de regresión lineal se determina el intercepto, este valor es [η]. 4) La viscosidad intrínseca se relaciona con el peso molecular despejando M de la ecuación 3, expresado como ecuación 4.
Ecuación 4. Peso molecular: 109