A preliminary study on extraction, isolation, purification and structure identification of pleurotus

Journal of Modern Agriculture July 2014, Volume 3, Issue 3, PP.42-48

A Preliminary Study on Extraction, Isolation, Purification and Structure Identification of Pleurotus Ostreatus Polysaccharides Xiao Liu 1, Jinxi Wang 1, 2, Lin Gu 1, #, Hai Yu 1 1. College of Food Science and Engineering/Yangzhou University, Yangzhou 225127, China 2. Jiangsu Fufeng Biotechnology Co., Ltd, Jinhu 211600, China #Email: gulin@yzu.edu.cn

Abstract The process for the removal of protein from Pleurotus ostreatus crude polysaccharide was carried out by Sevga treatment after enzymatic hydrolysis. Then isolated by DEAE-cellulose-52 ion exchange column chromatography, POP-I, POP-II and POP-III were obtained and purified by Sephadex G-100 column chromatography again. After that four homogenous pure polysaccharides were got and named POP-I-1, POP-II-1, POP-III-1 and POP-III-2. Neither protein nor nuclear acid characteristic absorption peaks were shown in the UV-visible spectra of POP-I-1and POP-II-1, and the result of IR, TLC and NMR showed they were mainly composed of glucose and α and β glycosidic bond.

Keywords: Pleurotus Ostreatus Polysaccharide (POP); Isolation and Purification; UV-Visible Spectra; IR; TLC; NMR

平菇多糖提取分离纯化及其结构鉴定初探* 刘 笑 1，王金玺 1, 2，顾 林 1，于 海 1 1. 扬州大学食品科学与工程学院，江苏 扬州 225127 2. 江苏阜丰生物科技有限公司， 江苏 金湖 211600 摘

要：平菇粗多糖(POP)在 Sevga 试剂和中性蛋白酶联合作用下脱蛋白处理后，经 DEAE-52 分离得到三个不同组分多

糖 POP-I，POP-II 和 POP-III，分别通过 Sephadex G-100 分离纯化进一步得到 POP-I-1，POP-II-1，POP-III-1 和 POP-III-2 四组分纯多糖。对 POP-I-1 和 POP-II-1 进行紫外可见光谱扫描，无蛋白核酸吸收峰。其红外扫描、核磁共振和薄层层析 分析的结果显示，两组分纯多糖主要由葡萄吡喃糖构成，含有 α 与 β 两种构型的糖苷键。 关键词：平菇多糖；分离纯化；紫外可见光谱；红外扫描；薄层层析；核磁共振

引言 平菇(Pleurotus ostreatus)又名白平菇、侧耳，属担子菌亚门，层菌纲，伞菌目，口磨科，是我国种植量 最大的食用菌之一[1]。平菇性味甘、温，是典型的药食两用菌，具有祛风散寒、舒筋通络的功能，对腰腿疼 痛、手脚麻木、筋络不舒等病症有显著的治疗效果[2]。长期食用可降低血糖、血压，增强免疫力，防止血脉 硬化，尤其适用于更年期综合症的调理。 多糖是平菇主要的活性物质，目前多糖的纯化方法主要有蛋白质脱除，树脂和凝胶柱层析等 [3-4]，结构 分析方法有红外扫描，核磁共振，气质联用等 [5-7]，各种方法的研究也都取得了较好进展。目前，国内有关 平菇多糖提取方法及生物活性的研究较多，而对平菇多糖的分离纯化及结构研究相对较少。本文用热水浸 提平菇多糖，中性蛋白酶和 Sevag 试剂联合脱除蛋白质，经 DEAE-52 和 Sephadex G-100 柱层析分离，对平 *基金资助： “十二五”国家科技支撑计划项目（2012BAD36B05）。

- 42 www.jma-journal.org

菇多糖进行了分离纯化，并结合红外光谱(IR)，薄层层析(TLC)和核磁共振(NMR)等方法对平菇多糖结构做 了初步的研究。

材料与方法

1

1.1 材料与试剂 平菇子实体，市售；中性蛋白酶，上海蓝季科技发展有限公司；氘代试剂，美国 CIL 公司；乙醇、三 氯甲烷、正丁醇、氯化钠等试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备 电热鼓风干燥箱，南京实验仪器厂；粉碎机，上海嘉定粮油检测仪器厂；HH-6 数显恒温水浴锅，常州 国华电器有限公司；SHZ-Ⅲ循环水真空泵，郑州长城科工贸有限公司；RE-52D 旋转蒸发器，上海亚荣生化 仪器厂；Centrifuge 5804 离心机，德国 Eppendorf 公司；UV-2550 紫外可见分光光度计，日本岛津； BS2000S 电子天平，北京赛多利斯有限公司；Alphal-2 LD Plus 冷冻干燥机，德国 Christ 公司；AVANCE 600 核磁共振波谱仪，德国 Bruker；Cary 5000 紫外-可见-近红外吸收光谱仪，美国 Varian。

1.3 方法 1.3.1

平菇粗多糖的提取

取新鲜的平菇洗净，40℃的鼓风干燥箱烘干后粉碎，称取一定质量的干粉，按固液比 1:40(g：ml)加入 蒸馏水溶解，90℃浸提 3.5h，5000r/min 离心 10min，抽滤得到提取液，经旋转蒸发器浓缩，加 4 倍提取液 体积的无水乙醇过夜醇沉，离心取多糖沉淀，即得平菇粗多糖[8-11]。 1.3.2

平菇纯化多糖的制备

热水浸提得到的多糖中通常含有大量的蛋白质，含有蛋白质的多糖溶液在柱层析分离时会堵塞凝胶而 影响分离效果，并且会对后续的多糖结构分析造成影响。多糖脱蛋白的常用方法有 Sevag 法，TCA 法，盐 酸法和酶解法等，酶解和 Sevga 试剂联用法因其环保高效而被广泛采用[12-16]。 取平菇多糖提取液，采用中性蛋白酶-Sevag 试剂联用法脱除蛋白，减压浓缩除去残留的有机溶剂，4 倍 体积无水乙醇沉淀多糖，离心取沉淀复溶得脱蛋白的多糖溶液 [17]。然后将脱蛋白的多糖溶液进行 DEAE-52 柱 层 析 (1.6cm × 50cm) ， 用 去 离 子 水 和 0.1mol/L-0.5mol/L 的 NaCl 溶 液 进 行 梯 度 洗 脱 ， 控 制 流 速 为 0.67mL/min，每支试管接洗脱液 5mL，苯酚-硫酸法跟踪检测，根据苯酚-硫酸法检测的结果合并收集相同峰 位的组分，浓缩后用自来水透析 24h，去离子水透析 24h，每 6h 更换一次去离子水[18-19]。再将分离组分浓缩 后进行 Sephadex G-100 柱层析(2.6cm×40cm)，用去离子水进行洗脱，后续处理步骤同上，将组分浓缩后进 行冻干即得平菇纯多糖[20-21]。 1.3.3

多糖纯度鉴定

称取平菇纯多糖粉，配制成质量浓度为 10mg/mL 的多糖溶液，使用紫外可见分光光度计在 200-600nm 波长范围内扫描，鉴定多糖纯度[22-23]。 1.3.4

薄层层析法分析平菇多糖的单糖组分

称取 20mg 多糖样品，加入 6mL 浓度为 1mol/L 的硫酸溶液，在 100℃条件下封管水解 8h，BaCO3 中和 溶液至中性，4000r/min 离心 10min 收集上清液，即可进行薄层层析。准确称取 D-葡萄糖、D-甘露糖、D-半 乳糖、L-鼠李糖、D-阿拉伯糖、D-果糖和 D-木糖，配制成 1mg/mL 溶液，作为标准糖的点样液。展层剂为 体积比为乙酸乙酯：甲醇：乙酸：水=13:3:3:1 的混合溶液，显色剂为 10mL 85%磷酸，100mL 丙酮及 2mL - 43 www.jma-journal.org

溶有 2g 二苯胺的苯胺溶液的混合溶液。薄层层析时距离硅胶板下端 1cm 处点样，展层剂液面距离顶端 1cm 处停止展层，待硅胶板自然风干后将显色剂喷于硅胶板上，85℃恒温箱中显色 10min，观察分析结果[24]。 1.3.5

平菇多糖的红外扫描与核磁共振图谱分析

称取 1mg 多糖纯样与适量的 KBr 粉末在白炽灯下干燥研磨均匀，压片机压片，红外光谱仪在 4004000cm-1 扫描透射光谱进行红外分析。称取 10mg 多糖纯样，加 0.5mL 氘代试剂进行溶解，进行多糖核磁共 振分析[25-30]。

结果与分析

2

2.1 平菇多糖的提取及脱蛋白 平菇干粉经水提醇沉后，得到棕褐色的平菇粗多糖 POP，得率为 3.25%，不溶于乙醇、乙醚等有机溶 剂。经中性蛋白酶-Sevag 试剂联用方法脱除蛋白，蛋白质脱除率达 82.3%，POP 呈浅棕色，不溶于有机溶 剂。

2.2 平菇多糖的 DEAE-52 分离纯化 DEAE-52 凝胶柱分离纯化脱除蛋白的 POP，上样量为 5ml，得到洗脱曲线见图 1。图 1 结果表明，在用 去离子水和不同浓度的 NaCl 溶液洗脱 POP 时，分离得到了三个不同的组分，第一个组分是在去离子水洗脱 下得到，从第 8 管到第 20 管部分，将此部分命名为 POP-I。第二个组分是由终浓度为 0.1mol/L 的 NaCl 溶液 梯度洗脱得到，从第 39 管到第 60 管部分，将此部分命名为 POP-II。第三个组分是由浓度为 0.1-0.3mol/L 的 NaCl 溶液梯度洗脱得到，从第 67 管到第 89 管部分，将此部分命名为 POP-III。不同离子浓度的洗脱液洗脱 POP 得到的三组分的峰型单一显著，说明 POP 分离的三组分较为均一。

图 1 平菇多糖(POP)DEAE-52 洗脱曲线

图 2 POP-I Sephadex G-100 洗脱曲线

2.3 平菇多糖的 Sephadex G-100 分离纯化 平菇多糖(POP)经 DEAE-52 离子交换柱层析分离后得到三个组分，分别命名为 POP-I，POP-II 和 POPIII。为进一步分离纯化多糖，POP-II 和 POP-III 在透析除盐后再将三组分多糖再进行 Sephadex G-100 柱层析 分离纯化，得到三个洗脱曲线见图 2，3，4。 图 2 是 POP-I 的 Sephadex G-100 的洗脱曲线，得到了一个单一的组分，说明 POP-I 的组分较均一，从 第 15 管到第 40 管部分，将此部分命名为 POP-I-1。 图 3 是 POP-II 的 Sephadex G-100 的洗脱曲线，得到了一个较为单一的组分，从第 11 管到第 40 管部 分，但是第 29 管开始略有起伏，说明可能存在分子量差别不大的部分，因此只收集第 11 管到第 29 管部分 作进一步研究，将此部分命名为 POP-II-1。 图 4 是 POP-III 的 Sephadex G-100 的洗脱曲线，得到了两个组分，说明 POP-III 存在两个不同的组分， - 44 www.jma-journal.org

两者分子量存在差别，但是相差不大，第一组分为从第 11 管到第 23 管部分，将此部分命名为 POP-III-1。 第二组分为从第 23 管到第 40 管部分，将此部分命名为 POP-III-2。 POP-I，POP-II 和 POP-III 三组分的 Sephadex G-100 洗脱曲线表明 POP-I 的组分较为均一，POP-II 和 POP-III 两部分多糖是由不同分子量的多糖组成，并且在实验过程中发现 POP-III-1 和 POP-III-2 两组分多糖 的冻干量不够高，因此本实验主要对 POP-I-1 和 POP-II-1 两组分进行集中收集作进一步的研究。

图 3 POP-II Sephadex G-100 洗脱曲线

图 4 POP-III Sephadex G-100 洗脱曲线

2.4 多糖的纯度鉴定 图 5 为 POP-I-1 和 POP-II-1 的紫外扫描图谱。结果表明 POP-I-1 和 POP-II-1 在波长 260nm 和 280nm 处

5.000

5.000

4.000

4.000

Abs.

Abs.

没有明显的吸收峰，说明多糖中蛋白质脱除程度较高，已获得较纯的多糖组分。

2.000

2.000

POP-I-1

POP-II-1

0.000

0.000

-1.000 200.00

300.00

400.00 nm.

500.00

600.00

-1.000 200.00

300.00

图 5 POP-I-1 和 POP-II-1 紫外扫描图谱

图 6 POP-I-1(1)和 POP-II-1(2)薄层层析图谱 - 45 www.jma-journal.org

400.00 nm.

500.00

600.00

2.5 多糖薄层层析鉴定 POP-I-1 和 POP-II-1 的薄层层析结果如图 6 所示，POP-I-1 为 1 号板，POP-II-1 为 2 号板，层析板从左到 右点样顺序依次为：多糖水解样，D-葡萄糖、D-半乳糖、D-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露糖、L-鼠李糖和 D果糖。POP-I-1 的薄层层析的 Rf 值分别为 0.455,0.477,0.420,0.500,0.592,0.477,0.699,0.443。POP-II-1 的薄层层 析的 Rf 值分别为 0.446,0.441,0.379,0.497,0.610,0.492,0.718,0.452。POP-I-1 和 POP-II-1 两组分水解后的多糖 层析后只得到一个斑点，从 Rf 值和颜色上判断，此斑点为葡萄糖，说明多糖 POP-I-1 和 POP-II-1 主要由葡 萄糖构成，是否含有其他单糖还需进一步的研究。

2.6 多糖红外扫描光谱 POP-I-1 和 POP-II-1 的红外扫描图谱如图 7 所示，3200-3600cm-1 为 O-H 的伸缩振动峰，是多糖吸收的 一个特征吸收峰。2800-3000 cm-1 之间的峰为多糖的另一个特征吸收峰，即多糖物质的次甲基 C-H 振动吸收 峰。1650 cm-1 附近的吸收峰是 C=O 伸缩振动引起的。此外两个多糖组分在 1000-1200 cm-1 间有多个吸收 峰，说明两个多糖为吡喃糖。POP-I-1 在 872.7 cm-1 处的吸收峰是多糖 α 与 β 型的末端 C 共同作用的结果， POP-II-1 在 913.9 cm-1 处的吸收峰是 D-葡萄吡喃糖的 C-O-C 骨架非对称伸缩振动引起的。多糖红外扫描光 谱说明了平菇多糖主要为吡喃糖，同时含有 α 与 β 两种构型的糖苷键。 100

100

1 2097.2

90

2 2125.2

90

872.7 1246.7

80

80

70

70

913.9

2934.1

50

1352.7 1417.3

%透射光谱

%透射光谱

1250.9

60

800.1

1650.8 40

10

1077.5

2929.2 1647.7

1418.6

602.7 537.5

30

1149.2

20

801.1 50 40

603.3 577.5 30

60

1046.2

1149.4

20

3390.6

10

3389.9

1076.9

1045.6

0 0

3800 3600 3400 3200 3000 2800 2600 2400 2200 2000 1800 1600 1400 1200 1000 波数

800

600

400

200

3800

3600 3400 3200

3000 2800

2600 2400 2200

2000 1800 1600 波数

1400 1200

1000

800

600

400

200

图 7 POP-I-1 和 POP-II-1 红外扫描图谱

2.7 多糖的核磁共振 POP-I-1 和 POP-II-1 的 1HNMR 核磁图谱如图 8 所示，α 构型糖苷异头氢的 δ 大于 5.0ppm，而 β 构型糖 苷异头氢的 δ 小于 5.0ppm，POP-I-1 的信号多集中于 δ3.0-5.5ppm 范围内，说明 POP-I-1 多糖组分含有 α 与 β 两种构型的糖苷键。POP-II-1 的信号大部分集中于 δ3.0-5.0ppm 范围内，5.09ppm 处有一个信号，说明 POPII-1 多糖组分以 β 构型的糖苷键为主。这与多糖扫描结果相符合。

POP-I-1

POP-Ⅱ-1

图 8 POP-I-1 和 POP-II-1 1HNMR 核磁图谱 - 46 www.jma-journal.org

3

结论 平菇多糖在提取纯化后，经 DEAE-52 阴离子交换柱层析分离得到 POP-I，POP-II 和 POP-III 三个均一组

分的多糖，再将三组分分别进行 Sephadex G-100 柱层析分离纯化，得到 POP-I-1，POP-II-1，POP-III-1 和 POP-III-2 四组分纯多糖，并初步探究了 POP-I-1 和 POP-II-1 纯多糖主要由葡萄糖构成，含有 α 与 β 两种构 型的糖苷键。且薄层层析、红外扫描和核磁共振分析结果一致，为多糖的分离纯化提供了参考，有关两组 分多糖的具体结构组成有待深入研究。

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【作者简介】 1

刘笑（1991- ），女，汉族，硕士研究

2

王金玺（1987- ），男，汉族，硕士研究生，农产品加工及

生，农产品加工及贮藏。

贮藏。Email: monkeyet@126.com

Email: 867068809@qq.com

3

顾林（1956- ），男，汉族，学士，教授，农产品加工及贮

藏。Email: gulin@yzu.edu.cn 4

于海（1973- ），男，汉族，博士，副教授，食品微生物资

源利用。Email: yuhai@yzu.edu.cn

- 48 www.jma-journal.org