Calcium phosphate and danshen compound coating on true bone ceramic

Biotechnology Frontier September 2013, Volume 2, Issue 3, PP.30-36

Calcium Phosphate and Danshen Compound Coating on True Bone Ceramic Hongjiang Jiang 1*, Xunxiang Tan 1, Haiyang Ju 1, Xiugang Song 1, Zhiye Qiu 2 1. Wendeng Hospital of Traditional Chinese Orthopedics and Traumatology, Wendeng Shandong 264400, China 2. Department of Materials Science and Engineering, Tsinghua University, Beijing 100084, China

Abstract The present work is to investigate the physicochemical and biological properties of true bone ceramic coated with calcium phosphate/Danshen compound, and offer an ideal scaffold material for bone tissue engineering. In the study, surface coated true bone ceramic were obtained by fully mixed with Calcium phosphate/Danshen compound and sucked under negative pressure.

Scanning electron microscopy (SEM), X-ray diffraction (XRD) and energy dispersive spectroscopy (EDS) were employed to study the coated composition. The scaffold was co-cultured with osteoblast derived from bone marrow stromal cells, alkaline phosphatase (ALP) activity at 2, 4, 6 and 8 days of cultivation were measured. The results indicated that there was no obvious change in ingredient and Ca/P ratio of surface coated true bone ceramic, and the natural three-dimensional porous structure was remained. The ALP activity was higher in the surface coated group than in the control group, indicated that the surface coated true bone ceramic significantly promoted cells adhesion, proliferation and secretion. Therefore, bioactivity of true bone ceramic was increased by the surface coating of calcium phosphate/Danshen compound, such coating composition with seed cells is an ideal material for bone repair.

Key Words: True Bone Ceramic; Calcium Phosphate; Danshen; Surface Coating; Osteoblast

陶瓷化骨的磷酸钙/丹参涂层及对成骨细胞生长影 响的研究 姜红江 1*，谭训香 1，鞠海洋 1，宋修刚 1，仇志烨 2 1. 山东文登整骨医院，山东 文登 264400 2. 清华大学材料科学与工程系，北京 100084 摘

要：本研究探讨陶瓷化骨磷酸钙/丹参涂层后理化及生物学性能的变化，提供理想的骨组织工程支架材料。在研究中，

将陶瓷化骨与磷酸钙丹参充分混合、负压抽吸，得到均匀涂层。样本分别进行 X 线衍射（XRD）分析及 X 线能谱（EDS） 分析、扫描电镜（SEM）观察，了解理化性能变化；与骨髓来源的成骨细胞联合培养观察，检测 ALP 活性，评价其生物 学性能。结果表明，陶瓷化骨表面涂层后成分、Ca/P 比无明显变化，保留了天然的三维多孔结构，与成骨细胞联合培养 ALP 活性明显高于对照组，能促进成骨细胞的增殖和分泌。因此，陶瓷化骨经含生物活性因子或药物的磷酸钙涂层后， 增加了生物活性，与成骨细胞复合后是一种理想的骨修复材料。 关键词：陶瓷化骨；磷酸钙；丹参；表面涂层；成骨细胞

引言 陶瓷化骨（True bone ceramic，TBC）的化学成分主要为羟基磷灰石(HA)，纯度高，其钙磷比值与人骨 基本相同，具有原骨的骨小梁，小梁间隙及骨内管系统，保持了原骨的精细结构，具有良好的骨传导性，这 

基金项目：受山东省中医药科学技术研究项目资助（2005-2006-83） - 30 http://www.ivypub.org/bf

就解决了化学合成人工骨的孔隙率、孔隙交通及孔径大小等方面的制作难题，并且经高温煅烧后，其有机成 分已经完全去除，因此消除了异种骨的抗原性，同时也消除了异种骨中可能携带的病原微生物，是较为理想 的骨组织工程支架材料。但是，陶瓷化骨不具有促进成骨作用等生物活性，本研究拟采用可降解的磷酸钙丹 参对其表面改性，使其获得生物活性，以更适于临床的需要。

1

材料和方法

1.1 主要仪器与试剂 分析纯试剂：NaOH，氯仿，甲醇，30 % H2O2，CaCl2，LiCl，丹参注射液（每安瓿 2 ml，含有丹参 2 g， 上海中西药业股份有限公司），自固化磷酸三钙（calcium phosphate cement，CPC，上海瑞邦生物材料有限 公司），程控箱式电炉（SXL-1208 型，上海），X 线衍射仪（Rigaku-D/Max-2500 型，日本），扫描电镜（XL30E 型，荷兰）。

1.2 陶瓷化骨的制备 取新鲜成年牛骨胫骨上端或股骨下端的松质骨，彻底清除软组织及骨髓，制成一定结构的块状骨。经以 下步骤脱脂脱蛋白：(1) 0.5 mo1/L NaOH，12 h；(2) 1:1 氯仿甲醇，1 h；(3) 30% H2O2，24 h；(4) 2 mol/L CaCl2， 1 h；(5) 8 mol/L LiCl，1 h；40 °C，恒温干燥。每个步骤之间均用三蒸水清洗 3 次。随后将标本置于箱式电 炉中缓慢加温 800 °C，煅烧 3 h，自然降温取出，清洗，环氧乙烷消毒备用。

1.3 陶瓷化骨的表面涂层 每 2 g CPC 粉末加入丹参注射液（浓度为 1000 mg/ml，pH 值为 7.35），与固化液充分混匀后，与陶瓷 化骨混合，进行负压抽吸使磷酸钙药物混合液充分渗入到陶瓷化骨孔隙中，随机取部分样本做 X 线衍射 （XRD）分析及 X 线能谱（EDS）分析和扫描电镜（SEM）观察。

1.4 复合陶瓷化骨的生物学评价 1.4.1骨髓基质细胞原代培养及诱导 取成年雄性新西兰白兔，无菌条件下于髂嵴部用 16 号骨穿针穿刺，抽取骨髓 1 ~ 2 ml，用 1640 培养液 稀释制成细胞悬液。将骨髓细胞悬液以 2×106/ml 的细胞浓度分别接种于 2 只 50 ml 培养瓶中，置 37 °C， 5% CO2 及饱和湿度条件下培养。4 天后首次换液，细胞长满后 0.25%的胰酶消化传代。传至第 2 代时加入含 15%胎 牛血清、50 mg/L 维生素 C、10-8 mol/L 地塞米松的 1640 培养液进行诱导培养，细胞长满后，传代培养。 1.4.2传代细胞的种植及生长情况 无菌陶瓷化骨及改性陶瓷化骨切割成约 5mm×10mm×10mm 大小备用，实验分两组进行，每组 24 块。 将培养的传代细胞以 2×108/ml 细胞浓度分别接种于置有陶瓷化骨及改性陶瓷化骨的 24 孔培养板，联合培养， 每 2 天换液，倒置显微镜每日观察细胞生长情况。于联合培养第 3、6 天，各取 1 块，D-Hank’s 液冲洗，2% 戊二醛固定 1 小时，乙醇逐级脱水，醋酸异戊酯浸泡过夜，以固体 CO2 作临界点干燥，旋转喷镀金膜，制作 电镜标本，观察细胞在陶瓷化骨孔隙表面内的生长情况。分别于接种培养第 2、4、6 及 8 天，每组取 6 孔， 换液时吸出培养液，使用全自动生化仪（ADZIA-2400 型，SIEMENS）进行 ALP 活性检测，计算平均值。

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结果

2.1 大体标本观察 煅烧后的牛松质骨外观形态不变，保持了原骨组织的多孔网状结构，其原骨组织骨盐支架的三维多孔结 - 31 http://www.ivypub.org/bf

构存在，松质骨孔隙交错相通，色白，质脆（见图 1），力学测试其抗压强度为 196 MPa。

图 1 陶瓷化骨

2.2 TBC 的组成成分 X线衍射分析结果显示，陶瓷化骨的主要组成是结晶HA，表面涂层后陶瓷化骨材料中主要成分仍为结晶 HA，同时还含有微量的CaCO3（图2）。X射线能谱分析结果表明，TBC的钙磷原子数量比为1.67，接近人骨 钙磷比值，涂层后天然陶瓷化骨Ca、P比无明显变化（图3）。

(a)

(b)

图 2 陶瓷化骨的 X 线衍射图谱。（a）天然陶瓷化骨；（b）表面涂层陶瓷化骨

(a)

(b)

图 3 陶瓷化骨的能谱分析。（a）天然陶瓷化骨；（b）表面涂层陶瓷化骨 - 32 http://www.ivypub.org/bf

2.3 TBC 的表面结构和孔隙率 SEM观察发现，TBC呈现天然的高密度孔隙网架结构，骨小梁、小梁间隙和骨内管腔系统同时存在，壁厚 50～260 µm，孔径300～500 µm，涂层后陶瓷化骨表面可见颗粒附着；高倍镜下表面涂层陶瓷化骨颗粒团聚 明显，表面可见团聚颗粒（见图4）。

(a)

(b)

(c)

(d)

图 4 陶瓷化骨形貌的 SEM 观察。（a）天然陶瓷化骨，×50；（b）涂层陶瓷化骨，×100；（c）天然陶瓷 化骨，×2000；（d）涂层陶瓷化，×2000

2.4 改性陶瓷化骨的生物学评价 2.4.1倒置显微镜观察 骨髓悬液培养早期以造血成分为主，随着换液次数增多，血系细胞基本消除，出现了长梭形外观的骨髓 基质细胞，两周左右细胞基本长满。诱导后细胞与改性陶瓷化骨联合培养 48 小时后，可见改性陶瓷化骨周 边细胞增多，并与改性陶瓷化骨附着，不易脱落，细胞由接种时的圆、椭圆形变为长梭或多角形，并伸出长 的突起（图 5）。

图 5 诱导后细胞在陶瓷化骨上培养的光学显微镜观察（×100） 2.4.2扫描电镜观察 陶瓷化骨与细胞联合培养 3 天后，其上可见细胞附着生长，但分布不均，贴近培养瓶底部一侧细胞较多。 细胞沿微孔生长，伸出较多的树枝状突起，其边角开始伸展而未见边角翘起和反褶。细胞呈多角形、矮柱形 及长梭形，部分可见细胞遮盖微孔间隙，涂层陶瓷化骨细胞伸展、生长明显优于天然陶瓷化骨。联合培养 6 - 33 http://www.ivypub.org/bf

天后部分区域可见多角、星形细胞连接成单层可见重叠生长，附着与载体孔壁相互连接，细胞间通过伪足接 触融合，互相形成网状，可见细胞间有部分重叠生长，并分泌大量条索状胶原纤维并向孔内生长，涂层陶瓷 化骨胶原多于天然陶瓷化骨（图 6）；

(a)

(b)

(c)

(d)

图 6 诱导后细胞在陶瓷化骨上培养的扫描电镜观察。（a）涂层 TBC 联合培养 3d；（b）天然 TBC 联合培养 3d；（c）涂层 TBC 联合培养 6d；（d）天然 TBC 联合培养 6d 2.4.3ALP 活性检测 各组 ALP 活性检测见表。经 t 检验，2、4、6 及 8 天陶瓷化骨和改性陶瓷化骨 ALP 分泌量均有显著性差 异（P <0.01）。 表 1 ALP 活性检测（U/ml, n = 6, x ± s） 分组

2d

4d

6d

8d

陶瓷化骨

1.2 ±0.21

1.6 ±0.31

2.3 ±0.15

3.8 ±0.35

涂层陶瓷化骨

1.8 ±0.17*

2.4 ±0.12*

3.2 ±0.32*

5.3 ±0. 19*

注：*P < 0.01。

3

讨论 陶瓷化骨多由松质骨煅烧而来，其成分为精细结晶状态 HA，与正常骨组织成分相似。它具有原骨的骨

小梁、小梁间隙及骨内管腔系统，保留了天然骨的连续多孔结构，其微孔大小和形状，具有人工合成材料难 以相比的天然网孔结构，解决了化学合成人工骨的孔隙率、孔隙连通、孔径大小等方面的制作难题。天然的 三维多孔结构，有利于细胞的植入与贴附，以及细胞营养成分的渗入和细胞代谢产物的排出，有利于传导成 骨。它充分利用了 HA 良好的生物相容性、骨传导性、机械承载能力、细胞易于贴附和可控制降解速度等特 性。同时，其在韧性、功能适应性、理化性能、体内降解等方面也优于人工陶瓷材料[1-5]。陶瓷化骨作为骨组 - 34 http://www.ivypub.org/bf

织工程的支架材料，其来源丰富，制作要求低、难度小、费用低，基本符合骨组织支架材料的要求。理想的 骨组织支架材料应该尽可能模拟天然骨的结构和成分，提高骨传导、骨诱导等生物活性。天然骨是由有机相 的增韧相和纳米无机相的增强相组成的复合材料，为了进一步提高和改善陶瓷化骨的生物活性，可将生陶瓷 化骨与生物活性因子或药物复合，形成多种生物活性陶瓷基复合材料，进一步模拟骨正常结构及生理功能， 是生物活性人工骨的研究方向，目前已有关于陶瓷化骨与水凝胶、骨形态发生蛋白、胶原等复合研究的报道 [6-8]

。 本研究采用磷酸钙丹参对天然陶瓷化骨涂层，涂层后陶瓷化骨具有高度、多孔联系的三维天然多孔结构，

可提供足够的面积供细胞附着；同时具有良好的表面活性，有利于种植细胞的黏附，并为细胞在其表面生长、 繁殖、分泌基质提供良好的微环境。采用的磷酸钙骨水泥（CPC），是一种新型的自固化型骨水泥。具有临 时调和、自固化、易塑形等优点。众多研究表明CPC是良好的药物载体[9-14]，以CPC为载体的药物缓释体可以 达到药物缓释过程可控，药物局部高效、稳定、长期释放的目的，适合于骨修复长期用药的需求。而丹参则 具有促进成骨细胞增殖及分泌、促进骨痂生成、抑制破骨细胞生成等作用[15-18]，以CPC为载体通过丹参的局 部释放，可促进成骨转化及细胞增殖和分泌。验结果表明，成骨细胞在涂层陶瓷化骨上生长活跃，并分泌大 量胶原基质。改性陶瓷化骨通过表面涂层药物缓释，除具有陶瓷化骨的固有优点外，还提高了生物活性，涂 层陶瓷化骨是骨组织工程学中的良好细胞载体。 骨组织的形成是一个极其复杂的过程，受多种因素的调控。成骨细胞在体内环境中，受分泌和旁分泌的 激素、细胞因子、细胞外基质（ECM，extracelluar matrix）等多种因素调节。因此，如何实现载体的多种功 能复合，发挥载体对细胞增殖和分泌调控的作用，仍需进一步研究。

REFERENCES [1]

Baldini N, De Sanctis M, Ferrari M. Deproteinized bovine bone in periodontal and implant surgery [J]. Dent Mater, 2011, 27(1): 61-70.

[2]

Qi-xin ZHENG, Su-nan LIU. The Preparation of Sintered Bovine Cancellous Bone and a Study of Its Mechanical and Chemical Behavior and Biocompatibility [J]. Journal of Biomedical Engineering, 2005, 22(1): 95-98.

[3]

Amerio P, Vianale G, Reale M, et al. The effect of deproteinized bovine bone on osteoblast growth factors and proinflammatory cytokine production [J]. Clin Oral Implants Res, 2010, 21(6): 650-5.

[4]

Li J, Lin Z, Zheng Q, et al. Repair of rabbit radial bone defects using true bone ceramics combined with BMP-2-related peptide and type I collagen [J]. Mater Sci Eng C, 2010, 30(8): 1272-1279.

[5]

Burgers TA, Lakes RS, Garcí a-Rodríguez S, et al. Post-yield relaxation behavior of bovine cancellous bone [J]. J Biomech, 2009, 42(16): 2728-2733.

[6]

Wu G, Hunziker EB, Zheng Y, et al. Functionalization of deproteinized bovine bone with a coating-incorporated depot of BMP-2 renders the material efficiently osteoinductive and suppresses foreign-body reactivity [J]. Bone, 2011, 49(6): 1323-30.

[7]

Da-wei HE,Yan JIN , Kai LUO, et al. Repair of autogenous calvarial defects by marrow stromal cells/ceramic bovine bone/hydrogel complex [J]. Journal of Practical Stomatiology, 2006, 20(2): 116-120.

[8]

Wei-wang GU, Yong-hua XU, Hong-qing CAO, et al. In vivo osteogenic properties of the composite of periosteal-derived osteoblast and collagen- coated true bone ceramics [J]. Journal of First Military Medical University, 2002, 22(6): 518-520.

[9]

Félix Lanao RP, Leeuwenburgh SC, Wolke JG, et al. Bone response to fast-degrading, injectable calcium phosphate cements containing PLGA microparticles [J]. Biomaterials, 2011, 32(34): 8839-8847.

[10] Henriette C. Kroese-Deutman, P. Quinten Ruhe, Paul H.M. Spauwen, et al. Bone inductive properties of rhBMP-2 loaded porous calcium phosphate cement implants inserted at an ectopic site in rabbits [J]. Biomaterials, 2005, 26: 1131-1138.

[11] van de Watering FC, Molkenboer-Kuenen JD, Boerman OC, et al. Ruhe, et al. Differential loading methods for BMP-2 within injectable calcium phosphate cement [J]. J Control Release, 2012, 164(3): 283-290.

- 35 http://www.ivypub.org/bf

[12] Boanini E, Torricelli P, Gazzano M, et al. The effect of alendronate doped calcium phosphates on bone cells activity [J]. Bone, 2012, 51(5): 944-952.

[13] Lopez-Heredia MA, Kamphuis GJ, Thüne PC, et al. An injectable calcium phosphate cement for the local delivery of paclitaxel to bone [J]. Biomaterials, 2011, 32(23): 5411-5416.

[14] Hong-jiang JIANG, Xiang-jie HUANG, Yuan-chao TAN,et al. Physicochemical properties and drug release rate of the calcium phosphate cement

containing Danshen composite injection [J]. Chinese Journal of Reparative and Reconstructive Surgery, 2007,

21(10): 1113-1117.

[15] Xian-gjie HUANG, Hong-jiang JIANG, De-zhong, LIU, etal..Implantation of calcium phosphate cement/Danshen drug delivery system for avascular necrosis of femoral head [J]. Chinese Journal of Reparative and Reconstructive Surgery, 2008, 3: 307-310.

[16] Liao CUI, Li-yi ZOU, Yu-yu LIU, et al. Preventing cancellous bone loss in steroid-treated rats and stimulating bone formation by water extract of salvia miltiorrhixa and danshensu [J]. Chinese Pharmacological Bulletin, 2004, 20(3): 286-291.

[17] Xu-feng HE, Qiang. CHEN Progress of internal research of promotion of Salvia miltiorrhiza Bge on fracture healing [J]. China Journal of Orthopaedics and Traumatology,2007,20(6): 426-427.

[18] Qing-de WANG, Tian-hong ZHANG, Zhen-wei LI, et al. Influence of Intramedullary Given with Salvia miltiorrhiza Injection on Osteoclast of Steroid-induced Necrosis of Femoral Head in Rabbit [J]. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae, 2010, 16(18): 176-178.

【作者简介】 姜红江（1971 年 1 月生），男，汉族，博士学位，主任医师。研究方向：骨与关节创伤及疾病的诊治， E-mail：boneman@163.com

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