Research advances in microbial electron transfer of bio electrochemical system by menez

Development of Energy Science November 2014, Volume 2, Issue 4, PP.39-46

Research Advances in Microbial Electron Transfer of Bio-electrochemical System Yunshu Zhang, Qingliang Zhao #, Wei Li School of Municipal and Environmental Engineering, Harbin Institute of Technology, Harbin 150090, China #

Email: qlzhao@hit.edu.cn

Abstract Bio-electrochemical system (BES) was an emerging biomass-energy recovery technology based on electricigens electron transfer (EET), which was applied to recover electric energy (e.g. microbial fuel cell, MFC) and resources (such as hydrogen and methane) and to enhance the removal of heavy metals and refractory organic pollutants (e.g. POPs). The process of electron transfer to the electrode was identified as the key process in such a BES system. In this paper, the recent research achievements about EET both at home and abroad were analyzed and summarized, and the electricigen diversity, the electron transfer pathways and study methods were systematically presented. Finally, the direction of EET research was pointed out. Keywords: Bio-electrochemical System; Microbial Fuel Cell; Electricigens; Electricigen Electron Transfer

生物电化学系统中微生物电子传递的研究进展* 张云澍，赵庆良，李伟哈尔滨工业大学市政环境工程学院，黑龙江哈尔滨 150090 摘要：生物电化学系统（bio-electrochemical system，BES）是一种新兴的以产电微生物电子传递（EET）为基础的生物质能源回收技术，可用于电能（如微生物燃料电池）和资源回收（包括氢气和甲烷等），此外还可用于强化重金属与难降解有机污染物（如 POPs）的去除，而其中产电微生物将产生的电子传递到电极是 BES 的重要过程。本文分析总结了近年来国内外学者在 EET 方面的研究成果，系统地介绍了产电微生物的多样性、EET 的途径和研究电子传递的方法，在此基础上指明了 EET 研究的发展方向。关键词：生物电化学系统；微生物燃料电池；产电微生物；产电微生物电子传递

引言生物电化学系统（bioelectrochemical system，BES）近年来在环境和能源领域受到广泛的关注。BES 是微生物燃料电池（Microbial Fuel Cell，MFC）研究的拓展，MFC 的发现最早追溯到上个世纪初，英国的植物学家 Potter 在进行厌氧培养时发现可以产生开路电压和电流，拉开了微生物产电研究的序幕[1]。随着化石燃料短缺带来的能源危机，生物质能源作为可再生能源逐渐受到人们的重视。到了 20 世纪中叶，针对微生物产电的研究才逐渐升温，将微生物产电和燃料电池技术相结合，构建了 MFC 系统。近几年，MFC 从产电研究逐渐过渡到生物质资源化的应用方面，BES 应运而生。研究发现，通过 BES，CH4[2]、H2[3]等高附加值生物能源的合成效率显著提高；BES 能够有效提高重金属的还原去除，如 U(Ⅵ)[4]、Cr(Ⅵ)[5]等；BES 可以应用于难降解有机污染物的去除，如石油烃[6]、多氯联苯和硝基苯等[7]；BES 应用于脱盐的研究，发现 BES 可以有效地去除溶液中的阴、阳离子[8]。随着对 BES 研究的逐渐深入，BES 的应用前景会更加广阔。其中电子传递过程是 BES 研究的重要理论基础，因此对电子传递过程的深入研究是十分有意义的。 *

基金资助：本研究得到国家自然科技基金支持资助（51378144）。 - 39 http://www.ivypub.com/des

产电微生物

产电微生物是 BES 电子传递过程中最主要的组成，它将底物氧化产生电子并传递到电极上，完成电子传递。关于产电微生物的研究始于两类异化的金属还原菌 Shewanella 和 Geobactor，这两种微生物可以利用细胞外的金属离子作为电子受体进行呼吸，维持自身代谢。至今为止这两株微生物的全基因测序已经完成 [9,10]

。随着分子生物学的迅猛发展，对不同系统中分离的电极生物膜进行群落结构统计分析，总结发现目前

已分离的产电微生物主要源于 Proteobacteria, Firmicutes, Acidobacteria, Bacteroidetes 等门。产电微生物底物利用的广谱性对 BES 的应用十分重要，Chaudhuri 等人发现 Rhodoferax ferrireducens 可以高效率地利用葡萄糖、乳酸、果糖、蔗糖等较为复杂的有机物进行产电，并且具有很高的库伦效率（80%） [11]

；纯菌接种的 MFC 的功率密度通常低于混合菌种接种的 MFC，Xing 等人分离出一株新的产电菌

Rhodopseudomonas palustris DX-1，它可以高效地氧化乙酸、乳酸和乙醇进行产电，并且通过对比试验发现其与混合菌接种的 MFC 具有相当的功率密度 [12] ；胞外产电菌通常为严格厌氧的微生物，华南师范大学的 Zhang 等人分离出一株兼性厌氧的产电菌 Klebsiella pneumoniae，它以葡萄糖为底物，对培养环境要求低，具有很高的应用前景[13]；Liu 等人发现，BES 中的微生物对环境的变化十分敏感，不同温度环境下电极生物膜微生物群落结构的区别主要体现在 Deltaproteobacteria 和 Gammaproteobacteria 的分布，且低温中的 Simplicispira psychrophila 和 Psychrophilus 明显增多[14]；Geopsychrobacter electrodiphilus 和 Thermincola sp.分别是两株耐寒和耐热的产电菌，这两种微生物的发现使得 BES 的应用温度范围得以扩宽[15,16]。根据 BES 应用领域的不同，其阳极生物膜上的微生物多样性体现的更明显。Zhang 等发现在 MEC 中 Firmicutes 的比例很高，猜测其在 MEC 的电子传递中起到重要的作用[17]。M. Lenin 等人发现通过暗发酵的污水中丰富的可溶酸中间体，包括醋酸、丙酸盐和丁酸盐可以为 MEC 提供碳源，并通过分子生物学技术证明

γ-proteobacteria (50%)，Bacilli(25%) 和 Clostridia (25%)为阳极的优势微生物[18]。Sacco 等人利用美国拉普拉塔河河的岸边的底泥作为阳极的主要底物，构建了沉积物 MFC (SMFC)。提取石墨电极表面生物膜的 DNA 分析，发现膜中的微生物群落组成主要为 Shewanella sp .、Pantoea sp .、Pseudoalteromonas sp.和 Antarctic bacteria R-11381[19]。近年来电缆细菌的发现为产电微生物的发现开拓的新的领域。Pfeffer 等人在 SMFC 中发现，不同于纳米导线，即使沉淀层和覆水层之间的距离在 1cm 以上，氧气在覆水层还原伴随硫化物在沉淀层氧化这一过程会也产生电流。为了探究其产生原因，在沉淀层中的发现一株 Desulfobulbaceae 丝状真菌，实验证实了 Desulfobulbaceae 的电子传输是通过低氧区的连贯的电子通道，而绝非传统的利用电子中介体或纳米导线以及细胞色素 C 等进行电子的传输，实验分析发现剪断沉积层中的丝状物后沉积层中的氧气的消耗率逐渐增加。证明在丝状真菌存在的时候电子可以通过丝状真菌从下层传递到上层使得上层的氧气还原，而当剪断之后电子无法传到上层，因此下层氧气的消耗要比剪断之前高[20]。

电子传递 BES 的运行过程就是电子从电子供体通过一系列的电子传递，直到最终电子受体。电子传递分为阳极电

子传递和阴极电子传递。如何进行高效的电子传递和提高电子的利用率有助于提高 BES 的电活性和库伦效率。因此深入研究电子传递的过程在整个 BES 的发展历程中显得尤为重要。当可溶性电子受体被耗尽后，微生物会通过胞外电子传递将电子传递到不可溶的电子受体上，称之为胞外电子传递（EET）。 BES 的电子来源于底物在微生物细胞内的氧化，形成电子需要从微生物细胞膜的内膜传递到阳极电极上，这个过程是整个 BES 反应中主要的限制因素之一。近些年来，很多学者对 EET 进行了深入的研究，逐渐概况了两种 EET 机制即直接电子传递（DET）和间接电子传递（IET），具体过程如图 1 所示。但相关研究主要局限于模式微生物 shewanella oneidensis 和 - 40 http://www.ivypub.com/des

Geobactor sulfurreducens。

有机底物

CO2+H+

e阳极

微生物

阴极 H+

电子受体

图 1 BES 主要的电子传递方式

2.1

直接电子传递（DET）其中 DET 又分为利用膜束缚性（或附属性）酶复合物（主要是细胞色素 C）参与，和利用导电性的纤毛

和其类似结构进行电子传递。细胞在和电活性表面进行接触时，会在膜结合的电活性化合物的作用下发生电子传递，而不同属的微生物，其将醌/甲基萘醌池中的电子传递到细胞外膜上的电活性氧化还原蛋白的过程也各不相同，很多文献对细胞色素 C 进行研究，并证明它定位在细胞外膜上并作为电子穿梭的通道将电子传递到固相的电极中。 Shewanella oneidensis MR-1 细胞膜结合蛋白 CymA 为四亚铁红素，接受醌/甲基萘醌池的电子并还原周质还原蛋白。后续报道这种结合蛋白可以间接参与不同的电子受体的呼吸反应，如 Fe3+、Mn4+和硝酸盐等，并证明了细胞外的电子传递链和质子穿透内膜的过程是独立的。周质还原蛋白主要由 MtrA、MtrB 和 MtrC 构成，而 MtrD、MtrE、MtrF 分别是 MtrA、MtrB 和 MtrC 的同系物。MtrA 可以作为连接蛋白连接 CymA 和 MtrB。MtrA 与 MtrB 有微弱的关联，锚定在细胞外膜的周质空间内；MtrC 和 OmcA 二聚体形成复合物，并被证明是电子向胞外电子受体转移的最重要的氧化还原酶。得利于蛋白质组学的发展，利用生物信息学和蛋白结晶的方法获得了 MtrA、MtrB 和 MtrC 的空间结构，证明 MtrB 形成一个“套筒”包裹 MtrA 和 MtrC，使得电子可以从 MtrA 传递到 MtrC 进行外源电子受体呼吸[21]。而在 Geobactor sulfurreducens 中，镶在内膜上的二亚铁血红色素 MacA 从醌/甲基醌池中得到电子[22]。 MacA 能够继续还原细胞膜周质三亚铁血红色素 PpcA，PpcA 聚合呈链状，像周质纳米导线一样将内膜电子传递到外膜的氧化还原酶上[23]。针对不同的电子受体，细胞色素 C 家族中基因会发生差异性表达，Aklujkar 等人发现 Geobactor sulfurreducens 细胞的外膜氧化还原酶 OmcS 基因在 Fe3+和 Mn4+作为最终电子受体的环境中表达显著提高； OmcA，OmcE，OmcH，OmcL，OmcN，OmcO 和 OmcP 这些外膜细胞色素基因在 Fe3+作为电子受体的氧化还原反应中表达提高；而外膜细胞色素 OmaB/OmaC，OmcB 和 OmcZ 以及 OmpC 在发生 Mn4+作为电子受体的氧化还原反应中基因表达提高。进一步分析发现 MacA，OmcB，OmcF，OmcG，OmcH，OmcI，OmcJ， OmcM，OmcV 这些细胞色素仅在 Fe3+的氧化还原中起作用而与 Mn4+的氧化还原反应无关[24]。Osorio 等对硫还原细菌 Acidithiobacillus ferrooxidans 的电子传递过程进行研究，通过基因产物浓度、qPCR 和蛋白质组学等分析方法，证明了异种的二氧化硫还原酶（Hdr）将电子送入内膜周质的醌池中，而后电子从醌池中传递给泛醌-细胞色素 C 还原酶（Pet），再由 Pet 传递给细胞色素（Cyc）[25]。尽管很多研究已经证明了细胞色素 C 在固相受体的电子传递中起着重要的作用但是对于这个蛋白家族还存在很多冗余的功能。 - 41 http://www.ivypub.com/des

关于纳米导线的研究是近几年才兴起的，在 2005 年，Reguera 等发现 G. metallireducens 能够附着于阳极表面，并通过胞外伞毛状的“纳米导线”进行电子传递 [26] ，这种纳米导线与 Fe(Ⅲ)氧化物直接接触，将 Fe(Ⅲ)还原成 Fe(Ⅱ)，而不能产生纳米导线的突变菌株不具有 Fe(Ⅲ)的还原性，并利用传导探针结合原子力显微镜揭示了 G. metallireducens 的周生纳米导线具有良好的导电能力[27]。对于纳米导线的组成研究正在进行中，基本认定其成分是混入菌毛蛋白组装的细胞色素。Gorby 等发现外膜细胞色素 MtrC 和 OmcA 缺陷的菌株失去菌毛的导电性 [28] ；Bouhenni 等根据纤毛、鞭毛的基因构建 Shewanella oneidensis MR-1 野生型和△gspG、△DpilM-Q、△mshH-Q、△flg、△pilM-Q mshH-Q 六种缺陷型菌株。对七株菌进行产电分析，发现其中 flg（鞭毛）缺陷型菌株的产电能力最高，其次是 pilM-Q 缺陷型菌株、而后依次是是野生型、mshH-Q 缺陷型菌株、pilM-Q 、mshH-Q 缺陷型菌株和 mtrC/omcA 缺陷型菌株。说明鞭毛在胞外电子传递中起阻碍作用，pilM-Q 这些基因在胞外电子传递过程中并没有作用，而 mtrC/omcA 和 mshH-Q 在胞外电子传递中起着重要的作用[29]；Lovley 在长距离电子传递实验中，发现 pilA 过表达的菌株在整个微生物种群中占支配地位，并且在以电极为电子受体时 pilA 的表达高于以三价铁为电子受体。而敲除 pilA 后会严重影响产电能力。证明菌毛在长距离电子传递中起到重要的作用 [30]。研究发现，光合藻青菌、 Synechocystis PCC6803 和嗜温发酵细菌 Pelotomaculum thermopropionicum 同样能够产生纳米导线，这揭示了具有电传导作用的附属物并不是异化金属还原菌的唯一产物，它代表了常见细菌为了传导电子和分配能量而采用的一种策略。

2.2 间接电子传递（IET） IET 即电活性微生物通过可溶性的内源氧化还原中介体进行胞外电子传递。已知的内源电子中介体已经有很多了，包括吩嗪、黄素、核黄素、醌类物质、黑色素等。 Rabaey 等分离得到一株能够产生内源电子中介体的微生物 Pseudomonas aeruginosa strain KRP1。该菌通过电子中介体绿脓菌青素和吩嗪-1-酰胺向阳极进行电子传递。阳极的存在促进了脓菌青素的分泌。合成绿脓菌青素和吩嗪-1-酰胺缺陷型菌株，不能传递电子，相比于野生型只产生了 5%的能量。加入绿脓菌素后，输出功率逐渐恢复到野生型的 50%。绿脓青菌素作为电子中介体具有一定的广谱性。通过计算，MFC 中的绿脓菌青素被微生物回收再利用的速率是大约每天 11 次[31]。 Shewanella sp. 可以利用内源性黄素作为电子中介体进行电子穿梭。Okamoto 等人发现黄素单核甘酸为 MtrC 上绑定的辅因子，并在不同的氧化还原电位下形成半醌加速电子传递。利用差示脉冲伏安法（DPV）发现不同的电位其黄素的反应峰值不同，说明黄素还参加其他的传递形式，利用 OmcA 缺陷型菌株进行 DPV 实验发现在加入黄素后对缺陷型的产电影响很小，而野生型的产电效率会提高很多，说明了黄素会与 OmcA 联合加强电子传递[32]。 Teravest 和 Rosenbaum 等人近期发现，间接电子传递是 Shewanella oneidensis MR-1 的主要电子传递方式，在阳极存在氧气的连续培养情况下，Shewanella oneidensis MR-1 可以高效的生成黄素以进行电子传递，打破了阳极存在氧气会抑制电子传递的理论，因此 BES 中电子传递是是多种代谢共同调控的复杂的生物行为，单纯运用电化学的思维去理解 BES 的电子传递是片面的[33]。

2.3 阴极的电子传递近年来 MFC 功能不断扩展，生物阴极的不断开发，使得关于阴极电子传递的研究也逐渐升温。Castelle 等通过对阴极进行循环伏安实验发现图上的氧化还原峰值电压与单纯的细胞色素 C 峰值电压基本一致，因此可以断定细胞色素 C 在阴极胞外电子传递中起到重要的作用。生物阴极细胞色素 C 接受阳极传递来的电子并参与很多反应，包括氧气在细胞膜表面的还原[34]。如今阴极的应用逐渐成为了 BES 的研究热点，关于阴极电子传递的研究势必会受到更广泛的关注。 - 42 http://www.ivypub.com/des

研究电子传递的方法

3.1 电化学方法电化学测量的目的是确定不同电极体系的电极界面的结构、界面上电荷和电势的分布，以及在界面上进行的电化学过程规律。电化学实验主要是通过在不同的测试条件下，对电极电势和电流分别进行控制和测量，并对其相互关系分析而实现。其中线性扫描伏安法、循环伏安法、脉冲伏安法是分析 BES 电子传递过程的主要方法。其中循环伏安法的应用范围最为广泛。微生物将分解底物产生的电子传递到电极上的过程包含一系列可逆和不可逆的氧化还原反应，当扫描电压临界反应的电位时，由于氧化还原反应的作用，形成了电子，产生了响应电流，使得电流激增，在图像上就会呈现出来一个氧化还原峰，随着扫描电位的变动，相应电流逐渐变化，并在最适合氧化还原反应发生的电位出现最高的响应电流形成峰。可以根据峰推测氧化还原反应的类型。 Liu 等将导电的碳纳米管水凝胶聚合壳聚糖附着在碳布上作为 BES 的阳极电极，通过交流阻抗分析发现改良后的阳极具有更低的传荷内阻；通过循环伏安法证明了改良后的阳极具有更高的电活性，并证明了是由于改良后阳极表面具有更多的羟基和羰基结构，使得电子传递更容易进行[35]。 Alessandro 等利用循环伏安分析发现了发现 Shewanella oneidensis 在电子传递过程中出现两个氧化还原反应，并证明一种是 DET，一种是 MET。其中细胞色素相关基因 MtrC 和 OmcA 是 DET 的关键基因，而相关的纤毛和鞭毛基因 pilM-Q、mshH-Q、pilM-Q、mshH-Q 以及 flg 也与 DET 紧密相关。而 MET 主要是 Shewanella 细胞相关基因表达和分泌黄素和核黄素作为电子介体加强细胞膜与电极的电子传递[36]。

3.2 HPLC（高效液相色谱）高效液相色谱即根据样品的极性使得在流动相和固定相中的分配系数不同，进而进行分离，利用高效液相色谱来检测产电微生物分泌的电子传递中介体进而分析电子传递过程。 S.oneidensis MR-1 可以分泌两种黄素，FMN 和核黄素。其中二者的含量随着电子受体的不同而改变， Wu 等人通过 HPLC 发现其中加入氧化三甲胺（TMAO）后 FMN 和核黄素在细胞外的量明显高于其他的电子受体。说明 TMAO 可以刺激黄素的分泌。当在水铁矿溶液中加入不同含量的 TMAO 发现随着 TMAO 的浓度的升高，铁还原的效率也明显升高，同时做了加入不同浓度的核黄素对铁还原的影响，其影响程度不是很高，说明加入 TMAO 除了影响其黄素分泌，还影响着微生物的其他作用因此加速三价铁的还原[37]。

3.3 生物信息学生物信息学的发展使得电子传递的研究更高效，通过指纹序列的提取、测序和比对可以得出该反应系统的微生物群落结构，进而根据已知的电子传递途径对该系统进行分析；基于 Shewanella oneidensis MR-1 和 Geobactor sulfurreducens 等模式产电微生物的全基因组已经测序完成，相关电子传递的基因也基于蛋白质组学和生物芯片的发展得以呈现，利用基因敲除技术可以获得相关基因缺陷型的产电微生物，根据缺陷型的产电能力与野生型进行对比，进而得出该敲除基因对微生物电子传递的影响；而如今更多的分子生物学技术活跃在电子传递机理的分析领域，使得分子生物学是当今电子传递机理分子的最主要工具。

结论和展望 BES 的电子传递研究多局限于两种模式产电微生物即 Shewanella 和 Geobactor。但是近年来，越来越多

的研究证明了胞外电子传递是微生物界普遍存在的一种代谢途径。不同条件的底物环境中微生物间存在着复杂的互作关系，单纯分析纯培养的电子传递过程已经无法满足当今 BES 发展的需要。近年来分子生物学蓬勃发展，宏基因组学、转录组学以及蛋白质组学为探寻微生物电子传递提供了技术上的支持。今后电子传递的探究应该从以下两个方面入手，即运用宏基因组和转录组技术得到目标环境中所 - 43 http://www.ivypub.com/des

有微生物的遗传信息，并探寻 BES 系统中产电微生物的分布及其相关基因的表达；利用蛋白质组学技术推测电子传递相关蛋白的结构，得出三维的电子传递结构图，利用生物物理手段探寻 BES 电子传递的途径。由于阴极电子受体不同，将会导致 BES 阴极微生物具有多样性和电子传递方式迥异，而对阴极电子传递机制的认识还远不及阳极，所以针对 BES 系统中生物阴极的研究将是热点方向之一。利用分子生物学技术可以宏观地得到在不同条件下、不同基因的表达，寻找到阴极电子传递的关键途径，阐明阴极的微生物与电极的相互作用机制，有目的地强化生物阴极的电化学活性。总之，BES 中的电子传递是由微生物多种代谢途径共同控制的复杂过程，单纯利用电化学知识难以全面地掌握 BES 的电子传递过程。利用分子生物学手段对 BES 中电子传递途径进行基因水平的描述，以强化 BES 的效能和应用范围，将是今后研究的重点方向。

致谢感谢国家自然科学基金项目（51378144）对本课题研究的支持。

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【作者简介】 1

张云澍（1988-），男，汉，博士研究生

赵庆良（1962-），男，汉，博士，教授，废水处理与资源

在读，主要从事微生物燃料电池和生物

化、微生物燃料电池。1993 年于哈尔滨建筑大学获得博士学

质资源化相关研究。

位。Email: qlzhao@hit.edu.cn

2012.09-至今；哈尔滨工业大学环境科学专业博士在读。 Email: yunzhixuyu@sina.com

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