INFORME LABORATORIO MICROBIOLOGICO DE CALIDAD EN ALIMENTOS
Presentado por:
QUEDNNITH HAWIB VILLAMIL MANUEL ARTURO PARRA FREDDY MOYANO LEIDY PESCA Ficha: 520114
Instructora: ALEXANDRA CUCAITA
SENA CENTRO NACIONAL DE HOTELERÍA, TURISMO Y ALIMENTOS CONTROL DE CALIDAD DE ALIMENTOS BOGOTÁ D.C 2014
INFORME LISTERIA MONOCYTOGENES MARCO TEORICO Listeria monocytogenes es una bacteria que se desarrolla intracelularmente y es causante de la Listeriosis. Es uno de los patógenos causante de infecciones alimentarias más virulentos, con una tasa de mortalidad entre un 20 a 30%, más alta que casi todas las restantes toxico infecciones alimentarias. L. monocytogenes es un bacilo Gram positivo, pequeño (0,4 a 0,5 micrones de ancho x 0,5 a 1,2 de largo) no ramificado y anaerobio facultativo capaz de proliferar en un amplio rango de temperaturas (1 °C a 45 °C) y una elevada concentración de sal. Es catalasa positiva y no presenta cápsula ni espora. Tiene flagelos perítricos, gracias a los cuales presenta movilidad a 30 °C o menos, pero es inmóvil a 37 °C, temperatura a la cual sus flagelos se inactivan. Listeria monocytogenes es un patógeno humano que se transmite a través de los alimentos y que causa infecciones graves, con una alta tasa de mortalidad. A pesar de la ubicuidad del microorganismo, la tasa real de la enfermedad es bastante baja y se asocia casi siempre a condiciones predisponentes. El género Listeria comprende un grupo de bacterias Gram-positivas relacionadas con otras de los géneros Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Streptococcus y Staphylococcus. Los microorganismos del género Listeria son bacilos anaerobios facultativos que no forman esporas ni contienen cápsula y se aislan de suelos, agua, efluentes, numerosos alimentos y de las heces de personas y animales. Los rumiantes domésticos probablemente juegan un gran papel en el mantenimiento de Listeria spp. en el medio rural, mientras 2-10% de las personas son portadoras de LM en heces sin, aparentemente, efectos adversos en su salud. LM puede convertirse en endémico en las plantas de procesado de alimentos. El género Listeria actualmente comprende seis especies: L. monocytogenes, L. Ivanovii, L. seeligeri, L. innocua, L. welshimeri y L. grayi. Dos de estas especies, LM y L. ivanovii son potencialmente patógenas para el hombre y animales y la Enfermedad que ocasionan se conoce con el nombre de listeriosis. LM se Considera un patógeno oportunista con tasas de mortalidad del 20-30%. Todas Las cepas de LM se consideran patógenas, aunque su virulencia es variable. De LM se reconocen 13 serovares potencialmente patógenos, de los que los más Involucrados en el desarrollo de listeriosis de origen alimentario son el 4b (3764%), 1/2b (10-35%), 1/2a (15-25%) y 1/2c (0-4%). LM es un microorganismo Psicotrofo que se desarrolla adecuadamente a temperaturas de refrigeración y Sobrevive a condiciones ambientales más duras que, incluso, algunos Microorganismos esporulados.
ALIMENTOS QUE GENERALMENTE SON CONTAMINADOS Carne de rumiantes, otros animales de abasto y aves: Aunque la prevalencia de LM en carnes difiere significativamente, algunos estudios han citado tasas de prevalencia de hasta el 92% de los productos analizados. La presencia de LM en las canales se atribuye a su contaminación durante el desollado. Un número elevado de animales de abasto (11-52%) se consideran portadores sanos. En mataderos, la presencia de LM puede ser endémica, particularmente en efluentes y suelos. Leche y derivados lácteos: LM se ha descrito en leches y derivados lácteos y en plantas de procesado de dichos alimentos, así como en productos pasterizados y en derivados frescos, probablemente, debido a una recontaminación tras su pasterización. En el caso de quesos elaborados con leche pasterizada o no pasterizada, la ausencia de LM depende de parámetros intrínsecos (aw, acidez, péptidos antimicrobianos, etc.) y extrínsecos (Tª, humedad, recontaminación, etc.), mientras su presencia es siempre problemática debido a su capacidad extraordinaria de supervivencia en condiciones hostiles. Pescado fresco, congelado y ahumado: La presencia y supervivencia de LM en pescado fresco y congelado es poco probable, mientras en el pescado ahumado es variable dependiendo del método de ahumado (en frío o caliente) empleado pero, en cualquier caso, siempre preocupante. Frutas y verduras: Se conoce que hasta el 10-20% de productos vegetales listos para su consumo pueden estar contaminados con LM incluyendo semillas germinadas (brotes), lechugas, rábanos, tomates, cebollas, pepinos, coliflores y setas cultivadas y que algunos brotes de listeriosis se han debido al consumo de este tipo de productos. De especial preocupación son los productos ecológicos abonados con estiércol posiblemente contaminado con LM de animales enfermos. Huevos y ovoderivados: la contaminación de huevos y ovoderivados con LM es muy poco frecuente, aunque su contaminación a partir de la cáscara y del equipamiento de las plantas de procesado es posible. 6. Alimentos listos para consumo (RTE): Los primeros brotes de listeriosis asociados al consumo de hortalizas y quesos frescos al inicio de los años 80 no solamente originaron el reconocimiento de LM como un microorganismo responsable de toxiinfecciones alimentarias (TIA), sino también el papel de algunos alimentos en la transmisión de la enfermedad. Por ello, los alimentos más comúnmente asociados a brotes de listeriosis son los: (i), alimentos listos para consumo (RTE) de origen vegetal, lácteo, cárnico y de pescados
ahumados, (ii), alimentos que se mantienen durante mucho tiempo en refrigeración (iii), alimentos no sometidos a tratamientos listericidas durante su conservación y procesado, (v), alimentos con riesgo de contaminación tras su procesado (vi), alimentos cuyos ingredientes facilitan el desarrollo de LM y (vii) alimentos consumidos por individuos inmunocomprometidos y mujeres embarazadas. En el caso de derivados cárnicos picados y en los emulsionados de mucha preparación y manejo, la posible contaminación con LM es muy elevada. En los derivados cárnicos fermentados, posiblemente, la presencia de LM es menor aunque su supervivencia sea posible.
RECUENTOS EXIGIDOS EN LA NTC 1325 PARA ALIMENTOS n= Número de muestras a examinar. m=Indice máximo permisible para identificar nivel de buena calidad. M=Indice máximo permisible para identificar nivel de aceptable calidad. c=Número demuestras permitidas con resultados entre m y n.
MUESTRA PARA ANALISIS (AVENA)
NOMBRE : SUPERAVENA PROCESADA POR CEREALES CLEMENT REGISTRO SANITARIO: RSAD 10100498 FECHA DE VENCIMIENTO: 28/04/2015 LOTE: 898 PRESENCIA PONDERADA EN ALIMENTOS CEREALES DE Listeria monocytogenes ALIMENTO Harinas y sémola
Listeria monocytogenes Listeria monocytogenes n=5 c=0 100 ufc/g
Cereales
Listeria monocytogenes n=5 c=0 100 ufc/ g
OBSERVACIONES Sólo de aplicación si se consideran que son listas para el consumo Fase de aplicación del criterio: productos comercializados durante su vida útil. Su búsqueda regular no es de utilidad. Fase de aplicación del criterio: productos
comercializados durante su vida útil. Se ha estimado que no puede favorecer el desarrollo de Listeria por aw ≤ 0,92.No es útil realizar pruebas regulares a alimentos con tratamiento térmico eficaz y sin Posibilidad de recontaminación
INTERPRETACIÓN DE PROPIEDADES MORFOLÓGICAS, FISIOLÓGICAS Y REACCIONES BIOQUÍMICAS Todas las especies de Listeria spp. son bacilos cortos Gram positivos móviles, catalasa positivos. Listeria monocytogenes se distingue de las demás especies por las propiedades presentadas en la siguiente tabla.
Especie L.monocytogenes L. innocua L. ivanovii L. seeligeri L. grayi sub. grayi L. grayi sub. murrayi
Hemólisis + + (+) -
V: reacción variable (+): reacción positiva débil
manitol + +
ramnosa + v v v
xilosa S. + + + -
aureus + (+) -
R. equi + -
MEDIO DE CULTIVOS CARACTERISTICAS Y COMPONENTES AGAR Listeria Composición*
Concentración del medio
Mezcla peptona
15.2 g/litro
Extracto de levadura
2.0 g/litro
Encima caseína
4.0 g/litro
Glucosa
0.5 g/litro
Almidón
1.0 g/litro
Cloruro de sodio
5.0 g/litro
Fosfato di potasio de
0.8 g/litro
hidrogeno
15.0 g/litro
Asculina
1.0 g/litro
Agar
12.0 g/litro
Citrato ferrico de amonio
0.5 g/litro
pH final
7.0 ± 0.2
MAST Peptone Water (DM185) y después subcultivar medio: las placas de Listeria Selective Agar (Oxford). Incubar a 30°C durante 48 horas y examinar a las 24 y 48 horas para ver colonias típicas de Listeria spp. Este medio puede ser también usado conjuntamente con MAST Listeria Selective Enrichment Broth (DM257).
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS Después de la incubación, registrar el crecimiento de microorganismos. La mayoría de las cepas de L. monocytogenes y otras Listeria spp. forman colonias Citrato blancas de aproximadamente 1mm de diámetro que está rodeado de un halo negro tras pasar 24 horas. Después de 48 horas, estas colonias típicamente tienen un diámetro de 23mm permaneciendo negras con un halo negro, pero desarrollando un centro hundido. CONSERVACIÓN Y CADUCIDAD Todos los contenedores deben ser mantenidos cerrados característica de ennegrecimiento es causada por la herméticamente y almacenados en un lugar seco a 25°C reacción positiva a la Asculina exhibida por la Listeria spp. o menos hasta la fecha de caducidad mostrada en la etiqueta del envase. Algunos medios requieren Control de calidad almacenamiento a 2-8°C, referirse a la etiqueta del Comprobar si hay signos de deterioro. El control de envase. calidad debe ser llevado acabo con al menos un organismo que demuestre la actuación esperada. AGAR (EB) El medio de cultivo contiene los nutrientes necesarios para el adecuado desarrollo bacteriano. Las sales de fosfato, forman un sistema buffer que evitan cambios bruscos de pH y así se favorece el desarrollo de Listeria spp. El piruvato de sodio permite recuperar células injuriadas presentes en la muestra.
Fórmula (en gramos por litro) Tripteína soya caldo 30.0 Extracto de levadura 6.0 Fosfato monopotásico 1.35 Fosfato disódico 9.6 Piruvato de sodio 1.11 pH final: 7.3± 0.2
Instrucciones Suspender 24 g de polvo en 500 ml de agua destilada. Mezclar y calentar con agitación frecuente. Llevar a ebullición para disolución total. Esterilizar en autoclave a 121 ºC durante 15 minutos.
Siembra Consultar en la bibliografía de referencia, la metodología apropiada para cada producto a analizar. Generalmente se procesan 25 ml o gramos de alimento en 225 ml de Caldo de Enriquecimiento Bufferado según FDA. Incubación Se incuban los tubos 48 horas a 30 ºC, en aerobiosis. Características del medio Medio preparado: claro, amarillo ámbar. Almacenamiento Medio deshidratado: a 10-35 ºC. Medio preparado: a 2-8 ºC. OBJETIVOS El presente procedimiento tiene como objetivo describir la metodología llevada a cabo por el Laboratorio de Microbiología para realizar la detección, aislamiento e identificación de Listeria monocytogenes en muestras de alimentos. Este procedimiento se aplica para realizar la detección, aislamiento e identificación de Listeria monocytogenes en muestras de alimentos. MATERIALES • • • • • • •
Cajas Petri Erlenmeyer Tubos de ensayo Agua peptonada 0.1% Pipeteador Frascos Agua bufferada EQUIPOS
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Balanza Incubadora Nevera MEDIOS DE CULTIVO
• •
Agar listeria Caldo listeria (EB)
METODOLOGIA PARA CEREALES la tecnica utilizada para el aislamiento e identificación de L .Monocytogenes es recomendada por la FDA modificada en algunos aspectos el aislamiento de listeria incluya 4 etapas fundamentales 1. 2. 3. 4.
Preenrequecimiento enriquecimiento Siembra en placa en agar selectivo y diferencial Identificación
• Preenrequecimiento se toma 10 gr de la muestra en 90 ml de agua buferada se llevan al autoclave y luego a incubación durante 24 hrs. Se toman dos tubos de ensayo en dilución de 10 -2 y 10-3 sucesivamente en las cuales se pondrá el caldo EB para dejarlos en la nevera posteriormente para su siguiente proceso.
Enriquecimiento selectivo se toma el Preenrequecimiento y se inocula en dos cajas petri cada una con 10 ml de la muestra preparada con anterioridad en el agar listeria y se llevan a incubación durante 24 hrs. •
• Siembra en la placa con medios selectivos a las 24-48 horas Transferir en una asa del cultivo obtenido del caldo de enriquecimiento (EB) a cajas petri con agar listeria y se llevan a incubar a 35 ª c +/- durante 24 -48 horas.
PREENREQUECIMIENTO
Muestra 10 gr
90 ml muestra ENREQUECIMIENTO
agua bufferada 90 ml
autoclave a esterilizacion 45 min aprox
incubar a 35째C x 24 hrs
10-2
90 ml muestra
Tubos con caldo EB 10 ml
Se incuba a 35°C durante 24 hrs
cajas petri con agar listeria + muestra 1 ml
EXPRESION DE RESULTADOS ANALISIS 10-2
10-2
MEDIO DE INDICADOR # DE CARACTERISTICAS CULTIVO COLONIAS AGAR Listeria 0 UFC No hay presencia LISTERIA monocytogenes de microorganismos en el medio selectivo AGAR LISTERIA
Listeria monocytogenes
0 UFC
IMAGEN
No hay presencia de este microorganismo en el medio selectivo
DISCUSION La mayoría de los aislamientos de L monocytogenes obtenidos en pacientes y en muestras ambientales corresponden a los serotipos 1 y 4. Más del 90 % de los aislamientos de L. monocytogenes pueden ser serotipificados con sueros disponibles en el comercio. Todas las especies no patogénicas excepto L. welshimeri comparten uno o más antígenos somáticos con L. monocytogenes. De acuerdo a la interpretación de resultados, indicar presencia o ausencia de Listeria monocytogenes en la cantidad de muestra analizada (por gramos o mililitros para muestras líquidas). Junto con la muestra, realizar un control positivo con un inóculo de una cepa de Listeria monocytogenes de referencia, y proceder de la misma manera que la muestra para demostrar que el cultivo positivo es recuperado.
Dado que no se dio presencia en ninguna de las muestras que se evaluaron quiere decir que el producto se encuentra muy bien elaborado y que se siguieron los procesos dentro del marco del manejo de laboratorios y se puede decir que este producto es de muy buena calidad ya que cumple con las caracteristicas de inocuidad y se encuentra libre de organismos patógenos que puedan alterar sus caracteristicas. RECOMENDACIONES ACERCA DE LA CORRECTA MANIPULACION DE PRODUCTOS QUE SE ENCUENTREN EXPUESTOS A LA CONTAMINACION DE Listeria monocytogenes
El mayor peligro como fuente de contagio por Listeria monocytogenes para el hombre son los alimentos listos para el consumo, especialmente los que se conservan refrigerados por periodos prolongados. En la industria alimentaria el patógeno sobrevive a los procesos de limpieza e higienización por su capacidad de formar biopelículas (biofilms) sobre superficies de trabajo y equipos, contaminando los alimentos que allí se procesan. En la industria de alimentos una de las medidas para controlar la presencia de microorganismos patógenos como Listeria monocytogenes es la desinfección de equipo, superficies y alimentos (como frutas y hortalizas) con compuestos químicos. El cloro es uno de los germicidas más comúnmente empleados en la industria de alimentos. La eficacia de los tratamientos de desinfección que se aplican a frutas y verduras varía considerablemente. La efectividad de un desinfectante está determinada por diversos factores como el tipo y concentración del germicida, el tipo y estado fisiológico de los microorganismos a inactivar y la naturaleza de la superficie a desinfectar. La interacción entre el germicida y el microorganismo puede verse limitada por la presencia de suciedad, por la infiltración o atrapamiento de los gérmenes en el alimento, o bien, por la presencia de biopelículas bacterianas. Una biopelícula es una matriz constituida principalmente por polisacáridos, hidratada y predominantemente aniónica, en la cual los microorganismos se encuentran inmersos Las células de L. monocytogenes expuestas a concentraciones subletales de cloro expresan o activan una serie de genes y mecanismos que le confieren resistencia contra el mismo, los cuales están silenciados en células que no se encuentran expuestas bajo estas mismas condiciones de estrés. Determinar estos mecanismos y genes expresados en la tolerancia de agentes germicidas tales como el cloro, es de suma importancia en el sector alimentario ya que es necesario conocer que tratamiento es el más eficaz contra mecanismos fisiológicos y genéticos como los presentados por L. monocytogenes para así poder aplicar estrategias de saneamiento más efectivas que nos permitan tener un control en el manejo, procesamiento y consumo de alimentos. En cuanto a la detección de la expresión de genes asociados a la resistencia a cloro en cepas de Listeria monocytogenes
inmersas en biopelículas así como la identificación de estos genes, aun se lleva a cavo por lo cual es difícil hacer una conclusión definitiva. CONCLUSIONES ACERCA DE LAS PRUEBAS REALIZADAS Gracias a las pruebas realizadas en el alimento que escogimos para la verificación de presencia o ausencia de listeria monocytogenes en esta clase de alimentos nos pudimos dar cuenta que el alimento en cuestión que en este caso es la avena en hojuelas se encuentra en perfectas condiciones para el consumo humano y para su respectiva utilización en la cadena alimentaria. También aprendimos a seguir paso a paso cada una de las etapas las cuales sirven dentro del proceso de dicha cepa la cual no se presentó dentro de la muestra escogida y aunque sus caracteristicas son más representativas en las carnes según los estudios que se le realizaron en alimentos como los cereales no se puede decir que estén alejados de su contaminación. Se logró conocer acerca de la enfermedad que este microorganismo crea dentro de su contaminación en los alimentos y se aprendieron los diferentes pasos que se efectuaron dentro del proceso en el laboratorio así como el manejo de medios de cultivo como el agar listeria y el caldo EB que sirven de ayuda en la obtención de resultados favorables para hallar la presencia de listeria en alimentos.
BIBLIOGRAFIA http://www.mastgrp.com/IFUS/IFU366_SPA.pdf http://www.britanialab.com.ar/espanol/listeriaCaldo%20Base%20de %20Enriquecimiento%20Bufferado%20seg%FAn%20FDA.htm http://www.anmat.gov.ar/renaloa/docs/Analisis_microbiologico_de_los_alimentos_V ol_I.pdf http://www.uaq.mx/investigacion/difusion/veranos/memorias-2010/12%20Verano %20Ciencia%20Region%20Centro/UAQ%20Saavedra%20Perez.pdf