Yavafl dondurma yöntemleri ile insan embriyolar›n›n dondurulmas› 271
fiekil 20.1 Befl y›ldan uzun süre önce dondurulmufl olan üç embriyo çözme s›ras›nda, üç embriyodan ikisi tümüyle sa¤lam (alt ve üstteki) görülen üçüncü embriyonun toplam dört blastomerin üçü canl›l›¤›n› sürdürmekte. Dejenere blastomer mikromaniplatif prosedürle embriyodan uzaklaflt›r›ld› taze siklusunda gebelik elde edilmifl olan 42 yafl›nndaki hastaya bu üç embriyonun transferi sonras› implantasyon sa¤lanamad›¤› gözlendi.
fiekil 20.2 Bu örnekte, dört embryodan ikisi, 861 gün boyunca saklanm›fl, çözme sonras› tüm blastomerler sa¤lam olarak tespit edilmifltir. Kalan iki embriyo birer blastomerlerini bu ifllem s›ras›nda kaybetmifllerdir. Embriyolar, 35 yafl›ndaki hastaya transfer edilmeden önce dejenere hücreler ç›kar›lm›flt›r. Oluflan tekiz gebelik, sa¤l›kl› erkek bebek do¤umu ile sonuçlanm›flt›r.
fiekil 20.3 Yumurta toplanmas›ndan üç gün sonra foto¤raf› çekilen dört embriyo (dondurma iflleminin gerçekleflmesi öncesi)
fiekil 20.4 fiekil 20.3 deki ayn› dört embriyo 68 gün sonra çözmeden birkaç saat sonra. Bunlardan ikisi foto¤raf çekilmeden önce dejeneratif blastomerler ve fragmanlara sahipti. 37 yafl›ndaki hasta bu embriyolar transfer edildikten sonra ultrasonda iki kese ve bir fetal kalp at›m› ile gebe kald›. Sa¤l›kl› bir k›z çocu¤u do¤du.
rum, y›llard›r evcil hayvanlar›n blastokistlerinin araflt›rma veya ticari amaçl› olarak y›llard›r baflar›l› bir flekilde dondurulup çözülmesini aç›klamaktad›r. ‹nsanda blastokist dondurulmas› ilk olarak, 10 artan konsantrasyonlarda gliserol serilerinin kullan›ld›¤›, Cohen ve ark.’n›n5 çal›smas›nda belirtilmifltir. Bu ilk çal›flmadan sonra, blastokist dondurma ifllemi in vitro flartlarda yüksek oranda blastokist gelifliminin elde edilme zorlu¤u nedeniyle, nadiren klinik protokollerde yer alm›flt›r.
1990’larda blastokist çözme sonras› klinik gebelik oranlar› transer bafl›na %10-30 civarlar›nda olmufltur29 ve bu oran, daha erken aflamadaki dondurma-çözme sonuçlar›na göre anlaml› oranda yüksek de¤ildir. Birçok grup, blastokist dondurmada oldukça baflar›l› sonuçlar›n› sunmufl olmakla birlikte, eski çal›flmalarda embriyo geliflimini desteklemek için kokültür sistem-
272 Yard›mla Üreme Teknikleri Temel Kitab›
fiekil 20.5 Dondurma öncesi foto¤raflanan 3.gün embriyolardan yedi sa¤l›kl› embriyo ortaya ç›kt›.
leri kullan›lm›flt›r.18,30,31 Bugün, ard›fl›k kültür ortamlar›n›n kullan›m›yla beraber blastokist dondurma uygulamalar›nda ciddi art›fl olmufl ve çözme sonras› blastosist transferlerinde %50’nin üzerinde gebelik oranlar› rapor edilmeye bafllanm›flt›r. Ard›fl›k kültür ortamlar›nda geliflen blastokistlerin dondurma verimlili¤i konusunda çok az rapor yay›nlanm›flt›r. Langley ve ark., 30 ayl›k periyotta çözülmüfl 3.gün embriyolar› ve blastokistleri karfl›laflt›rm›flt›r.32 Bu çal›flmada, blastokistlerin çözme sonras› canl›l›k oran› daha yüksek ve implantasyon oran› 2 kat fazla bulunmufltur (72 blastosist siklusunda, %21.9’a %10.1). 2002’de, Behr ve ark. 64 blastosist çözme siklusu sonras› %36 klinik gebelik ve %16 implantasyon oran› bildirmifltir33. Ard›fl›k kültür ortamlar›nda uzun süreli kültür sonras› yay›nlanan bu sonuçlara ra¤men hala insan için blastokist dondurman›n optimal oldu¤una dair yeterli veri olmad›¤› söylenebilir. Yine de Cornell program›, blastokist dondurma protokollerinin uygulanmas›ndan oldukça fayda sa¤lam›flt›r (Tablo 20.1). Bölünme aflamas›ndaki embriyolardan, dondurma-çözme ifllemi sonras› %40 klinik gebelik elde edilirken, blastokistlerden daha yüksek oranlar (%57) elde edilirken dondurma uygulanan hasta oran›nda hiçbir düflme gözlenmemiflir. 40 yafl›n alt›ndaki kad›nlar›n yaklafl›k %25’ine 3.gün transferi sonras› blastosist dondurma uygulanm›fl ve 5.gün transferi yap›lan kad›nlar›n %60’›nda en az bir blastokist 5. veya 6.gün de dondurulmufltur. Yaklafl›k 3 y›l içinde 2000’in üzerinde blastokist dondurulmufl fakat taze sikluslar›nda gebe kalan hastalar ikinci bir çocuk iste¤iyle geri dönmedikleri için flu ana kadar sadece 1/5’i çözülmüfltür. Cornell program›nda dondurulan blastokistlerin ço¤unlu¤u taze 3.gün transferlerinden sonra devam ettirilen embriyolard›r. Transfer sonras› kalan embriyolar 2-3 gün daha, hergün dondurmaya uygun olup
fiekil 20.6 20.5 numaral› flekildeki embriyolardan dördü 122 gün sonra çözüldü¤ünde hepsi canl› görülüyor.
Tablo 20.1 Geliflim evrelerine göre gebelik ve implantasyon.*
Transfer dönemleri
Klinik gebelik/ transfer (%)
Sadece embriyolar 172/441 (39.0)a Sadece blastosistler 88/154 (57.1)b
‹mplante olanlar transfer edilmeyenler (%) 257/1635 (15.7)c 121/320 (37.8)d
blastokistler a ve b oranlar›, c ve d oranlar› karfl›laflt›r›ld›¤›nda p < 0,05 düzeyinde anlaml› bir flekilde avantajl› bulunmufllard›r. *1995 Ocak ay›nda 2003 mart ay›na dek dondurulmufl embriyolar; 2000 haziran›ndan 2003 mart›na dek dondurulmufl olan blastosistler.
olmad›klar› kontrol edilerek, kültüre edilir. Bu süre, transfer sonras› gözlem periyodu olarak tan›mlan›r. 5. ya da 6.günde oluflan blastokistler gelecekte kullan›lmak üzere dondurulur. Nadiren ve sadece çok özel durumlarda 7.gün dondurma uygulan›r. Blastokistler için çözme sonras› gebelik oran› %77 civarlar›ndad›r. Blastokist çözme ve transfer sonras› siklus bafl›na gebelik oran› %57; devam eden veya canl› do¤um oran› %48 ve implantasyon oran› %38’dir. Do¤al ve programlanm›fl döngüler aras›nda, blastosist transferi sonras› gebelik oranlar›nda farkl›l›k görülmemektedir. Ayr›ca, blastokistlerin gebelik oranlar› bütün yafl gruplar› için birbirine yak›nd›r; 40 yafl›n üzerindeki 14/21 kad›n (%67) gebelik elde ederken, di¤er taraftan bu grubun düflük oran› genç kad›nlarda gözlenenin iki kat›d›r (%24 düflük, %43 devam eden). In vitro flartlarda beklenen zamanda geliflen blastokistlerin yavafl geliflenlere k›yasla daha kaliteli oldu¤u genel olarak kabul edilmektedir. Bununla birlikte, bu çal›flma ve program›m›z sürecinde yap›lan blastokist çözmelere ait
Yavafl dondurma yöntemleri ile insan embriyolar›n›n dondurulmas› 273
fiekil 20.7 Çözüldükten sonra canl› olmayan iç hücre kitlesine ra¤men blastosölün yeniden genifllemesi görülüyor.
fiekil 20.8 Dondurmadan hemen önce genifllemifl blastokist: büyük iç hücre kitlesi ve trofoektoderm aral›kl›.
retrospektif bir analiz aksini göstermektedir. Blastokist çözme ifllemi uygulanan 154 hastan›n 60’›na 5.gün dondurulmufl-çözülmüfl blasokist transferi ve 94 ‘üne 6.gün blastokist transferi yap›lm›flt›r. Bu iki grup aras›nda, hasta yafl›, blastokist canl›l›k ve devam oran›, ortalama transfer edilen blastokist say›s›, çözülen blastokisterin morfolojileri, klinik gebelik oranlar›, devam eden gebelik oranlar› ve implantasyon oranlar›nda anlaml› farkl›l›k gözlenmemifltir. Bu bulgular, bu34 ve di¤er merkezlerin daha önce yay›nlanan sonuçlar› ile uyumludur10,33. Blastokist aflamas›na daha h›zl› ulaflan embriyolar›n (5.günde) 6.gün blastokistlerine göre daha sa¤l›kl› olduklar› düflünülse de bu sonuçlar, geliflim h›z›n›n çözme sonras› baflar›s› için çok önemli olmad›¤›n› göstermektedir. fiafl›rt›c› olarak, bu durum, yavafl geliflen 6.gün blastokistlerinin gebelik oranlar›n›n oldukça düflük bulundu¤u taze 5. ve 6.gün blastokist transferi sonuçlar› ile ters düflmektedir35. Ayn› zamanda, bizim çal›flmam›z›n aksine, Marek ve ark. 5.gün ve 6.günde dondurulan blastokistleri karfl›laflt›rd›klar› 127 çözme döngüsünün sonuçlar›n› bildirmifllerdir. Çözme sonras› devam etme oranlar› iki grup içinde iyi olmakla birlikte, çözme bafl›na klinik gebelik (%50 ve %29, s›ras›yla), devam eden gebelik oran› (%43 ve %23) ve implantasyon oran› (%34 ve %25) 5.gün blastokistleri için anlaml› flekilde yüksek bulunmufltur. Bu sonuçlar›n bizimkilerden niçin bu kadar farkl› oldu¤u aç›k de¤ildir. Bizde, di¤erleri gibi, çözme sonras› yaflama flans› yüksek blastokistlerin ozmometre gibi hareket ettiklerini yani ortam›n ozmolaritesine göre büzüfltü¤ünü, tekrar geniflledi¤ini ve fliflti¤ini gözlemledik. Hemen çözme sonras› blastokistlerin canl› olup olmad›¤›n› anlamak zordur
çünkü ço¤unlukla kültür ortam›nda inkübe edilirken, birkaç saat boyunca kas›l› kal›rlar. Bizim tecrübemize göre, kriyoprotektan ajanlarla karfl›laflt›¤›nda düzgün büzüflen ve çözme sonras› kas›lm›fl, sa¤l›kl› bir görüntüsü olan hücreler daha yüksek canl›l›k oran›na sahiptirler (fiekil. 20.7-13). Gebeliklerin hepsi, en az›ndan, yeniden genifllemeye bafllam›fl blastokistlerden elde edilmifltir. Yar›klanmam›fl morula aflamas›ndaki embriyolar›n kullan›ld›¤› 2 tedavi döngüsünde gebelik elde edilememifltir.
Embriyo ve blastokist geliflim aflamalar›ndan gebelik potansiyelinin hesaplanmas› Bir dondurma program›n› yürütmekle ilgili en önemli sorunlardan en rahats›z edici olan›, embriyolo¤un çal›smas›n›n sonuçlar›n› (çözme sonras› gebelik) aylar veya y›llar geçtikten sonra alacak olmas›d›r. Genel olarak hastalar negatif sonuç al›nan taze bir döngüden sonra bir süre beklemeyi, e¤er çocuklar› olmuflsa 2 veya daha fazla sene geciktirmeyi tercih etmektedirler. Bu durum bir dondurma periyodu boyunca sonuçlar›n izlenmesinde problemlere yol açmakta ve ayn› zamanda yeni bir protokolün etkisini belirlemeyi güçlefltirmektedir. Dondurma-çözme sonuçlar›n› analiz etmek için kullan›lan 3 genel yol vard›r: (1) Çözme denemesi bafl›na gebelik oran› hesaplanmas› (2) Çözülmüfl embriyolar›n transfer edildi¤i döngüler bafl›na gebelik oran› hesaplanmas›
274 Yard›mla Üreme Teknikleri Temel Kitab›
fiekil 20.9 Ayn› blastokist,flekil 20.8 deki, 56 gün sonra çözüldü¤ünde ço¤u hücreler canl› görülüyor. Bu blastokist transfer edildi ve implante oldu,sa¤l›kl› bir k›z çocu¤u do¤du. Bu blastokist çözüldükten sonra 1 gün tutuldu, trofoektoderm çok daha fazla hücre oluflumu ile uzam›fl kültür sonucu biraz farkl› görülüyor
fiekil 20.10 Dondurulduktan ve çözüldükten sonra transfer edilen ve implante oldu¤u bilinen bir blastokist dondurmadan 57 gün sonra bu blastokist çözüldü ve sa¤l›kl› bir k›z çocu¤u olmas›n› sa¤lad›.
Son analizde belirtilen artt›r›lm›fl gebelik oran›, hastalar›n taze ve çözme döngülerinden elde edilen gebeliklerin birlefliminden oluflan toplam gebelik oran›d›r:
fiekil 20.11 Dondurma, çözme ve transfer ifllemleri sonras› implante oldu¤u bilinen blastosist.558 günlük dondurulmufl olarak saklanma süreci sonras›, 1 kalp at›fl› gözlenen devam eden gebelik saptanm›flt›r.
(3) Taze ve dondurulmufl- çözülmüfl sikluslarda elde edilen gebeliklerin beraber de¤erlendirilmesine dayal› olarak, dondurma uygulanan siklus bafl›na artt›r›lm›fl gebelik oran› hesaplanmas› Son analizde belirtilen artt›r›lm›fl gebelik oran› bir çok yay›nda tart›fl›lm›flt›r38-42:
(1) Bazal taze gebelik oran›, dondurulmam›fl embriyolar›n transferinden elde edilen klinik gebelik say›s›n›n dondurulmam›fl (taze) transfer döngülerinin say›s›na oran› olarak tan›mlan›r, örne¤in (250/500)x100=%50. (2) Artt›r›lm›fl gebelik oran›, dondurulmam›fl embriyolar›n transferinden elde edilen klinik gebelik say›s› art› taze transferle gebelik elde edilemeyen tedavi döngülerinde çözülmüfl embriyolar›n transferiyle elde edilen gebelik oran›n›n transfer döngülerinin say›s›na oran› olarak tan›mlan›r, yani [(250+125) /500]x100=%75. (3) Planl› artt›r›lm›fl gebelik oran›, dondurulmam›fl embriyolar›n transferinden elde edilen klinik gebelik say›s› art› taze transferle gebelik elde edilemeyen döngülerde çözülmüfl embriyolar›n transferiyle elde edilen gebelik oran›, art› taze veya çözülmüfl denemelerinde henüz gebelik elde edilmemifl olan hastalar›n hala dondurulmufl olarak saklanan embriyolar›n›n potansiyel transferiyle elde edilmesi tahmin edilen klinik gebelik say›s›n›n (bu son hesaplamada o ana kadar elde edilmifl çözme gebelik oran› kullan›l›r) transfer yap›lan döngülerin say›s›na oran› olarak tan›mlan›r, yani [(250+125+25)/500]x100=%80. Bu planl› toplam gebelik oran›n›n sonuçlar›n›n veril-
Yavafl dondurma yöntemleri ile insan embriyolar›n›n dondurulmas› 275
Tablo 20.2 1995 ocak ay› ile 2003 mart ay› aras›ndaki Kümülatif gebelikler.
fiekil 20.12 Dondurma, çözme ve transfer sonras› implante olmufl olan iki blastosist dönemindeki embriyo. 84 gün dondurulmufl olarak saklanma sonras› iki sa¤l›kl› erkek çocu¤un do¤umu ile sonuçland›.
Sadece dondurulmufl embriyolar (%)
Sadece dondurulmufl olan blastokistler (%)
69.3
71.5
73.9
79.7
74.6*
87.1*
Taze embriyolarla sa¤lanan klinik gebelikler/transfer Gerçek artt›r›lm›fl kümülatif Tahmini toplam kümülatif *p < 0.0001
Genel hususlar
fiekil 20.13 Dondurma,çözme ve transfer ifllemleri sonras› implante oldu¤u bilinen iki blastosist 68 günlük dondurulmufl olarak saklanma süreci sonras›, 2 ayr› kalp at›fl› gözlenen gebelik saptanm›flt›r ve bu yaz›n›n haz›rlanmas› sürecinde de gebeli¤in sürmekte oldu¤u bildirilmifltir.
mesi, gelece¤e yönelik beklentilerin geçmifl performansla benzer olmas› durumuna dayal› olmas› nedeniyle tart›flmaya aç›kt›r. Burada tarif edilen artt›r›lm›fl gebelik modelinin kullan›ld›¤› Cornell sonuçlar› Tablo 20.2’de gösterilmektedir ve burada blastokistlerin dondurma için optimum aflama oldu¤u ortaya ç›kmaktad›r.
Dondurma ve çözme sonras› do¤an çocuklar Dondurma iflleminin perinatal sonuçlar üzerinde görünen bir negatif etkisi yoktur ve yine bebeklik ve erken çocukluk evresinde de geliflim ve sa¤l›k bak›m›ndan olumsuz etkisi gözlenmemifltir. Ayr›ca, mevcut veriler de dondurma-çözme ifllemi sonras› do¤an çocuklarda konjenital malformasyonlarda art›fl gözlenmemektedir44-45. Dondurma iflleminin, bu yolla dünyaya gelen çocuklar için uzun dönemli risk tafl›y›p tafl›mad›¤› aç›k olmasada, flu ana kadar bu endifleyi artt›racak bir veriye rastlanmam›flt›r.
Bir ÜYTE laboratuar›nda dondurma program›na bafllamadan önce dikkate al›nmas› gereken baz› noktalar vard›r. ‹lki ve en önde geleni personelin yeterli e¤itimidir. Bu e¤itim, dondurma teknikleri konusunda becerikli ve tecrübeli bir embriyolog taraf›ndan verilmelidir. E¤itim alanlar klinik embriyoloji konusunda temel bilgilere sahip olmal› ve stereo mikroskop alt›nda oosit ve embriyolarla çal›flmaya al›fl›k olmal›d›r. E¤er mümkünse yedek bir biyolojik dondurucu bulundurulmas› uygundur. Böylece cihaz›n ar›zalanmas› durumunda örneklerin kaybedilmesi engellenebilir. Ayr›ca bugünün yo¤un laboratuarlar›nda 1,3 ve 5.gün dondurma ifllemlerinin ayn› gün olmas› s›k rastlanan bir durumdur. Ekstra bir donducunun bulundurulmas› ile hem harcanan zaman› hem de bir makine üzerine düflen yükü azalt›labilinir. Yedek bir s›v› nitrojen kayna¤› bulundurulmas› önemlidir. Herhangi bir nedenle (ar›zal› valf veya gösterge) as›l kaynaktan nitrojen al›namamas› veya nitrojen sa¤layan firman›n zaman›nda teslimat yapmamas› gibi durumlarda alternatif bir kayna¤›n bulundurulmas› iyi bir çözümdür. Yang›n veya beklenmeyen bir afet durumunda uygulanacak bir acil durum ve zarar plan› belirlenmeli ve uygulamaya geçirilmelidir. Böyle bir durumda dondurma veya çözme esnas›ndaki embriyolar› kurtarmak imkans›z olsa da depolanan örneklerin kurtar›lmas› önemlidir. Bu tarz bir planda saklama tanklar›n›n yeri, nas›l göründükleri, içlerinde ne oldu¤u, say›s› ve tehlike bölgesinden nas›l uzaklaflt›r›lacaklar› ayr›nt›l› olarak belirtilmelidir. Plan›n kopyalar› program yöneticisinde, bina bak›m personelinde ve binada bulunan bütün güvenlik görevlilerinde bulunmal›d›r. ‹yi oluflturulmufl bir planlama, gerçek bir acil durumda kurtarma görevlilerinin saklama tanklar›n› bulmas›n› ve tan›mas›n› oldukça kolaylaflt›racakt›r.