/VEGF

İÇ İ NDEK İ LER……………………………………………………………………………… ……………………1-2 Gİ R İŞ ………………………………………………………………………………………… ……………………..3 NORMAL VASKÜLER YAPI GEL İŞİ M İ VE ANG İ OGENEZ…………………………………………............4 ENDOTEL PER İ S İ T ETK İ LE Şİ M İ ………………………………………………………………………………..

4 VASKULOGENEZ ANG İ OGENEZ ………………………………………………………………………….6

VE

VASODİLATASYON-PERMEABİLİTE-ENDOTELYAL DESTEK… …………………………….… ..7 ENDOTEL HÜCRE PROLİFERASYONU VE MİGRASYONU…………………… ………………….. .7 LUMEN FORMASYONU……………………… …………………………………………………….… . .8 ENDOTELYAL SURVEY…………………………………………………………………………………..9 ENDOTEL DİFERANSİYASYONU……………………………………………………………………... 10 ENDOTELYAL REMODELİNG …………………………………………………………………………10

F İ ZYOLOJ İ K VE PATOLOJ İ K ANG İ OGENEZ……………………………………………………………….11 ANG İ OGENEZ İ ETK İ LEYEN FAKTÖRLER…………………………………………………………………..12 ANG İ OGENEZ VE KUAGULASYON SİSTEM İ ………………………………………………………………12 VEGF GEN İ , YAPISI, EKSPRESYONU……………………………………………………………………..14 VEGF PROTE İ N YAPISI VE SEKRESYONU……………………………………………………………….15 VEGF EKSPRESYONU…………………………………………………………………………… …………..16 VEGF mRNA SI VE ALTERNAT İ F B İ RLE Şİ MLER İ …………………………………………………….....17 VEGF RESEPTÖRLER İ VE RESEPTÖRLER ………………………………………….19

BENZER İ

ETK İ L İ

VEGFR-1(VEGF RESEPTÖR 1)…………………………………………………………………………...19 VEGFR-2(VEGF RESEPTÖR 2)…………………………………………………………………………...19 VEGFR-3(VEGF RESAPTÖR 3)………………………………………………………………….………..21 NÖROFİLİNLER………………………………………………………………………………………..…..22

VEGF RESEPTÖR UYARIM I SONRASI İ LET İ M İ …………………………………………….…...23

S İNYAL

1

İ NTEGR İ NLER (HÜCRE EKSTRASELÜLER MOLEKÜLÜ………………………………..….24 EKSTRASELÜLER MATR İ KS ANG İ OGENEZ…………………………………………………….…...28 VEGF’LER İ N VE VEGFR’LER İ N İ N ………………………………………………………...30

ADEZYON VE

F İ ZYOLOJ İ S İ

EMBRİYODA …………………………………………………………………………………………….30 ERİŞKİNDE………………………………………………………………………………………………..31

VEGF İ LE İ NDÜKLEN EN ANG İ OGEN İ K BASAMAKLAR I……………………………………33

YANIT I N

ANA DAMARLAR……………………………………………………………………………………….35 ANA DAMAR KAYNAKLI KIZ KAPİLERLER………………………………………………….……36 GLOMERULOİD CİSİMLER……………………………………………………………………….…....36 VASKÜLER MALFORMASYONLAR ………………………………………………………………….37

BAZI MOLEKÜ L LE R İ N ANG İ OGENEZDE ROLÜ………………………………………………………….37 A-FGF(FİBROBLASTGROWTHFAKTÖR)………………………………………………………….37 B-ANGİOPOİETİNLER………………………………………………………………………………….38 C-PEDF…………………………………………………………………………………………………...39 1-PEDF’NİN ÇEŞİTLİ FONKSİYONLARI (İŞLEVLERİ) …………………………………………..40 2-PEDF ANGİOGENEZİ NASIL İNHİBE EDER? …………………………………………………...41 3-PEDF NİN HASTALIKLARIN TEDAVİSİNDE KULLANIMI …………………………………….43 4- PEDF NEDEN CNV GELİŞİMİNİ ENGELLEYEMEMEKTEDİR ?..............................................45

D-NİTRİK OKSİT…………………………………………………………………………………………45

OKÜLER VE NONOKÜLER PATOLOJ İ LERD E VEGF’ ROLÜ ……………………………………….46 A-NONOKÜLERPATOLOJİLERDEVEGF……………………………………………………………46 B-OKÜLERPATOLOJİLERDEVEGF…………………………………………………………………..47 1-DİABETİKRETİNOPAT…… İ ……………………………………………………………………….47

İN

A-NONPROLİFERATİF DİABETİK RETİNOPATİ(NDPR)……………………………………47 B-PROLİFERATİF DİABETİK RETİNOPATİ…………………………………………………..53

2-MAKÜLERÖDEM………………………………………………………………………………….55 3-YAŞLA İLİŞKİLİ MAKÜLERDEJENERASYON……………………………………………….56 4- SRVO…………………………………………………..........................................................58 5-İRİS NV VE NV GLOKOM………………..........................................................................59 6- ROP……………………………........................................................................................60 VEGF VE TERAPÖT İ K YAKLA Ş IMLAR………………………………………………………………………61 A-ANTİ VEGFTEDAVİ STRATEJS İ İNİNREALİTES…… İ …………………………………………….61 B-VASKULERREGRESYONVE VASKULERİNHİBİSYON………………………………………...63 C-ANTİ VEGFİLAÇLAR………………………………….………………………………………………..64 1-LUCENTİS(Ranibizumab),……………………………….…………………………………………64 2-MACUGEN(Pegaptanib sodyum)…………….…………….……………………………………..64

2

-Pegaptanib sodyum ile ilişkili VISION çalışması………………………………………....65

3-AVASTİN (Bevacizumab)…………………..…..……………………………………………………71 a-Aktivitesi ile ilgili preklinik kanıtlar…………………………………………………………….…..71 b-SRVOve Maküler ödemde kullanımı…………………………………………………………….72 c-PDRde kullanımı……………………………………………………………………………………72 d-KMÖde kullanımı…………………………………………………………………………………..73 e-NV glokom ve Rubeosis için kullanımı……………………………………………………………74 f-Triamsinolone ile karşılaştırılması………………………………………………………………….75 g-Yan etkileri…………………………………………………………………………………………76 D-VEGFRESEPTÖRBLOKERLER… İ ……… ………………………………………………………….76 KAYNAKLAR……………………………………………………………………………… …………………78-91

.

GİRİŞ NORMAL VASKÜLER YAPI GELİŞİMİ VE ANGİOGENEZ Normal doku fonksiyonları, kan damarlarından yeterli bir oksijen desteğine,teminine bağlıdır. Kan damarlarının nasıl forme olduğunun yani oluştuğunun anlaşılması, temel mekanizmalarının ne olduğu ancak son dekadda anlaşılmıştır. Bu mekanizmaların açığa çıkartılması, şu an için önde gelen mortalite ve morbidite nedenlerini oluşturan hastalıkları hafifletecek ve hatta bu hastalıklar açısından tedavi edici olabilecek terapötik seçenekler sunabilir.Şu soruları cevaplandırmamız gerekir:diabetik retinopatideki gibi patolojik anjigenezi engellemek veya iskemik kalp hastalıklarını tedavi için myokardial angiogenezi stimule ederek tedavi edebilmemiz mümkün olabilir mi? veya aşırı damar büyümesini 3

(çoğalmasını) süprese ederek kanser ve çeşitli enflamatuar hastalıkları engelleyebilmemiz mümkün olabilecek mi? Ancak angiogenezle ilgili araştırmalar uzun bir zamandan beri kesin sonuçlar vermekten uzaktır. Bunun en önemli nedeni, angiogenezde rol alan “moleküler oyuncuların” henüz tam anlamıyla tanımlanamamış olmasıdır. Endotel hücrelerini stimule yada inhibe edebilecek olan adayların kısa bir süre önce bulunmuş olması, bu moleküllerin terapötik uygulamalarda kullanılması konusuna duyulan ilgiyi büyük ölçüde arttırmıştır.

Embriyoda kan damarları, vaskulogenez yoluyla oluşmaktadır.Yani; farklılaşmamış prekursor hücrelerin (angioblastların) vaskuler bir labirente benzer şekildeki endotel hücrelerine diferansiyasyonu sonucunda gelişmektedir (Şekil 1A) [1]. Angiogenez terimi geçmişte ilk kez, önceden mevcut bulunan postkapiller venülerden endotel tomurcuklarının gelişimini ifade etmek için kullanılmıştır(Şekil 1B) .Bu terim daha yakın zamanlarda, primitif damar ağının kompleks bir ağ yapısına dönüşmesini ve remodeling’ini (yeniden şekillenmesini)

ifade

etmek

için

kullanılmaktadır.

Bu

süreç,

tomurcuklanan

yada

periendotelyal hücre sütunlarıyla (intusepsiyon) veya transendotelyal hücre köprüleri ile bölünen ,ayrılan venüllerin genişlemesini ve daha sonra ayrı ayrı kapillerlere ayrılmasını içermektedir.Erişkinlerde yeni damarlar büyük ölçüde angiogenez yoluyla meydana gelmektedir ancak erişkinlerde vaskulogenez de görülebilmektedir. Vaskulogenez sadece immatür, düşük derecede fonksiyonel bir vaskulatür oluşumuna yol açtığı için, terapötik hedef angiogenezdir. Angiogenezin sellüler ve moleküler mekanizmaları çeşitli dokularda farklılık gösterdiği için (örneğin

psoriatik ciltte vasküler yapılar genişleme gösterirken retinada

tomurcuklanma göstermektedir) angiogenezin terapötik stimulasyonu yada inhibisyonu hedef dokuya göre ayarlanmalıdır.

ŞEKİL 1 A ,B

4

A-Prekürsör hemanjioblastlardan köken alan vaskülogenez B-Mevcut damar ağından köken alan angiogenez

ENDOTEL PERİSİT ETKİLEŞİMİ En büyük ilgiyi endotel hücrelerinin çekmiş olmasına karşın bu hücreler tek başlarına angiogenezi başlatabilmekte ancak bu süreci tek başlarına tamamlayamamaktadır. Vaskuler matürasyonun sağlanabilmesi için periendotelyal hücreler zorunludur. “Vaskuler myogenez” esnasında mural hücreler (Periendotelyal hücreler), endotel hücre proliferasyonunu ve migrasyonunu inhibe ederek ve ekstraselüler matriks üretimini stimule ederek olgunlaşmamış (henüz başlangıç aşamasında bulunan) damarları stabilize ederler.Bu sayede hemostatik bir kontrol sağlarlar ve endotelle döşeli yeni kan damarlarını rüptüre yada regresyona karşı korurlar. Gerçekten de, kan damarları düz kas hücreleri ile kaplanmadıkları sürece daha kolay bir şekilde regrese olmakta yani gerilemektedir [2]. Diabetik hastalarda retinal damarların etrafındaki perisitlerin kaybı anevrizmal dilatasyona, kanamaya ve körlüğe neden olmaktadır.

Bunu izleyen angiogenez süreci boyunca kan damarları bir kas tabakası ile kaplanmakta ve gelişen damarlar böylece viskoelastik ve vasomotor özellikler kazanmaktadır ki bu özellikler, doku

perfuzyonunda

değişen

ihtiyaçlara

akomodasyon/uyum

sağlanması

için

gereklidirler.Periendotelyal hücreler, endotel hücrelerine farklı damar yataklarında özelleşmiş fonksiyonlar kazanmaları konusunda da yardımcı olmaktadır. Önceden mevcut bulunan kollateral damarların patolojik genişlemesi sırasında da angiogenez süreci özet olarak yaşanmaktadır.Dolayısıyla, sürekli ve fonksiyonel yeni kan damarlarının oluşumu sadece kapiller

angiogenezin

indüklenmesiyle

sınırlandırılmamalı

arteryogenezin

varlığıda

unutulmamalıdır.Benzer şekilde, “Muskularize olmuş-Arterleşmiş” damarların terapötik regresyonu, endotelle döşeli damarların inhibisyonu dışındaki diğer mekanizmaları da içermektedir.

VASKÜLOGENEZ Endotelyal ve hematopoetik hücreler ortak bir progenitor hücreyi paylaşırlar: Hemangioblast.

Yolk

sac’da

(yolk

kesesinde)

hemangioblastlar,

içteki

hücrelerin

hematopoetik prekursörlere ve dıştaki hücrelerin de endotel hücrelerine geliştiği agregatlar (hücre toplulukları) oluştururlar.İnsitu diferansiyasyon ve pleksus formasyonundan önce angioblastlar yoğun bir migrasyon yapabilirler. Vaskuler endotelyal büyüme faktörü (VEGF), VEGF-reseptörü 2 (VEGFR-2) ve bazik fibroblast büyüme faktörü (bFGF) angioblast diferansiyasyonunu etkileyen faktörlerdir [3-4]. Diğer yandan, VEGFR-1 hemangioblast

5

gelişimini suprese etmektedir [5].Endotel hücreleri ile matriks makromolekülleri de vaskulogenezi etkilemektedir.Örneğin fibronektin ve matriks reseptörleri αvβ3 integrinler gibi.

Endotel hücrelerinin kaderini yönlendiren mekanizmalar hakkında çok fazla şey bilinmemektedir. Bu konuda Ets-1, Hex, Vezf1, Hox ve GATA gen ailesinin üyeleri, temel heliks-loop-heliks faktörleri ve bunların diferansiyasyon inhibitörleri yer alıyor olabilir. Bu tür moleküller terapötik açıdan önemli olabilirler çünkü endotel hücrelerinin patolojik koşullarda angiogenik hale gelebilme kararını (bu karar, “angiogenik switch”

olarak da

adlandırılmaktadır) bu moleküller belirleyebilir. [6]. Endotel hücrelerinin arter veya venlere entegre olma şeklindeki akıbetlerine kaderlerine angioblast aşamasında bLHL transkripsiyon faktörü ve daha sonra ephrin ailesinin üyeleri aracılık etmektedir [7]. Endotelyal prekursörlerin eskiden sadece embriyonik yaşamda mevcut bulunduklarına inanılırdı. Ancak, erişkinlerin

kemik

iliğinde

ve

periferik

kanında

endotelyal

prekursör

hücreler

tanımlanmıştır.Bu hücrelerin diferansiyasyonunu ve mobilizasyonunu VEGF, granulositmonosit koloni stimulan faktör (GM-CSF), bFGF ve insülin benzeri büyüme faktörü (IGF-1) stimule etmektedir [8]. Bu tür prekürsör hücreler gelecekte tedavi açısından umut vaat ederbilirler.

ANGİOGENEZ Önceden mevcut bulunan kan damarlarından yeni kan damarlarının geliştiği bir süreç olan angiogenez kanser, iskemik kardiyovaskuler hastalıklar, retinopatiler, yara iyileşmesi ve enflamasyon gibi pek çok önemli hastalık durumunu önemli ölçüde etkilemektedir [9,10].

Angiogenezin kendisine benzer olan pek çok durumdan

örneğin vaskulogenezden,

arteryogenezden ve lenfangiogenezden ayırt edilmesi gerekir. Angiogenez başlangıçta özel olarak, embriyonik gelişim sürecinde primitif hücrelerden yeni kan damarlarının de novo (sıfırdan, yeni baştan) bir şekilde formasyonunu ifade etmek amacıyla kullanılmaktaydı. Ancak, kemik iliğinde ve dolaşımda bulunan endotelyal prekursor hücrelerin de bazı durumlarda angiogeneze katkıda bulunabileceklerinin gözlenmiş olması bu ayırımın sınırlarını biraz bulanıklaştırmıştır. Ayrıca, angiogenez terimi genel olarak kullanılan haliyle küçük kan damarlarının formasyonunu ifade etmektedir ve bu yüzden, yeni arterlerin gelişimini ifade eden arteriogenesis teriminden ayırt edilmelidir.Yine

angiogenez ile, yeni lenfatik damarların

formasyonunu ifade eden lenfangiogenez’in de ayırt edilmesi gerekmektedir.

Angiogenik tomurcuklanma, erişkinlerde kan damarı formasyonu mekanizmalarından biridir ancak bu konudaki tek mekanizma değildir. Bununla beraber, üzerinde en fazla çalışılmış olan mekanizmadır. Angiogenezin embryodaki moleküler temeli, erişkinlerde

6

patolojik durumlarda görülen moleküler temellerden farklı olabilir. Bunun çok sayıda aşaması,evresi tanımlanmıştır.Genel olarak; a-Vasodilatasyon, endotelyal permeabilite ve periendotelyal destek Angiogenez, nitrik oksidle ilgili bir proçes olan vasodilatasyonla başlar. Vaskuler permeabilite VEGF’e yanıt olarak artar ve böylece, plasma proteinleri ekstravaze olur.Jel formasyonuna gelen ekstraselüler alan damar dışına çıkarak migrasyon yapan endotel hücreleri için bir yapı iskelesi görevi görür. Permeabilitedeki bu artış;

•

Fenestraların formasyonu,

•

Vezikulo-vakuoler organellerin formasyonu

•

Patelet-endotelyal hücre adhezyon molekülü (PECAM-1) ve

•

Vaskuler endotelyal (VE)-cadherin’in redistribusyonu aracılığıyla meydana gelir ve ,

Src kinazları ilgilendirir .

Permeabilite angiogenez açısından iyi bir şey olmakla beraber, aşırı vaskuler kaçak, sızıntı kötü olabilir ve sirkulatuar kollapsa, intrakranyel hipertansiyona, adhezyon formasyonuna, metastazlara, premenstruel rahatsızlığa ve körlüğe yol açabilir. Endotelyal Tie2 reseptörünün bir ligandı olan angiopoietin (Ang)-1 vaskuler permeabilitenin doğal bir inhibitörü olup önceden mevcut bulunan kan damarlarını sıkılaştırmaktadır. Ang1, erişkin damarlarına akut bir şekilde uygulandığı zaman, vaskuler morfolojiyi şiddetli bir şekilde etkilemeden

plasma

kaçağına

sızıntısına

karşı

koruma

sağlamaktadır

[11].

Endotel hücrelerinin bulundukları yerden migrasyon yapabilmeleri için, interendotelyal hücre temaslarının gevşemesi ve periendotelyal hücre desteğinden

kurtulmaları gerekir. Yani,

matür kan damarlarının destabilize hale gelmesi gerekir.Endotelyal Tie2 reseptör sinyallemesinin inhibitörlerinden biri olan Ang2, düz kas hücre tutunmasında ve matriksin gevşetilmesinde yer alabilmektedir [12]. Proteinazlardan plasminogen aktivatörü, matriks metalloproteinazları (MMP’ler),

chymase (kimaz) yada heparanase aileleri matriks

molekülerini parçalayarak ve ekstrasellüler matriks içinde hapsedilmiş (sekestre edilmiş) büyüme

faktörlerini

serbestleştirerek

(bFGF,

VEGF

ve

IGF-1

gibi)

angiogenezi

etkilemektedir. MMP-1 veya -3’ün yada MMP-2 fragmanı olan PEX’in doku inhibitörleri MMP-2’nin αvβ3’e integrinine bağlanmasını inhibe ederek angiogenezi etkilemektedir [13].

Paradoks olarak, MMP1’in doku inhibitörü ve plasminogen aktivatör inhibitörü-1 farelerde aşırı proteolizi önleyerek tümör angiogenezini arttırmaktadır. Endostatin bunu destekler bir şekilde, plasmin rejenerasyonunu arttırarak tümör angiogenezini inhibe etmektedir.

7

b-Endotel hücre proliferasyonu ve migrasyonu Prolifere olan endotel hücreleri, yolları (yolakları) bir kez belli olduktan sonra uzak yerlere göç etmeye başlarlar. VEGF, Plasental büyüme faktörü (PLGF), VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D ve bunların reseptörleri olan VEGFR2, VEGFR3 ve neurophilin-1 spesifik fonksiyonlara sahiptirler: VEGF ve reseptörü (VEGFR2) embriyonik, patolojik ve neonatal angiogenezi etkiler ancak farklı VEGF isoformlarının yada VEGF ailesi üyelerinin heterodimerlerinin bu süreçte yer almaları konusunda moleküler mekanizmalar tam netleşmemiştir. VEGF120 angiogenezi tek başına başlatabilmekte ancak bu süreci tamamlayamamaktadır [14]. VEGFR3 hem embryonik angiogenezde yer alır [15] hemde patolojik angiogenezde eksprese edilirken, VEGF-C (VEGFR3’ün bir ligandıdır) erişkin patolojilerinde angiogeniktir [16]. VEGF-C’nin angiogenik yada lenfangiogenik aktivitesi işlenmesine

bağlıdır.

bozmamaktadır

ancak

VEGFR1’in VEGFR-1’in

tirozin

kinaz

patolojik

domaini

angiogenezde

embryonik

angiogenezi

aldığı

belirlenmeyi

rol

beklemektedir.Spesifik olarak PLGF’nin(plasenta kökenli büyüme faktörü) kaybı patolojik angiogenezi bozmakta ancak fizyolojik angiogenezi bozmamaktadır. VEGF-B kaybı, koroner okluzyon sonrasında koroner fonksiyonları etkilemektedir. Ang1, Tie2 nin eriyebilen formu tirozini fosforile eder ve endotel hücreleri için kemotaktiktir, tomurcuklanmayı indükler ve VEGF’yi potansiyalize eder ancak endotel proliferasyonunu indükleyememektedir [17].

VEGF’nin aksine Ang1 kendi başına endotel hücre ağı organizasyonunu başlatamaz ancak VEGF tarafından başlatılmış olan network’ları stabilize eder. Bunu muhtemelen, endotel hücreleri ile periendotelyal hücreler arasındaki etkileşimleri stimule ederek yapmaktadır. Bu durum, Ang1’in VEGF’den daha geç aşamalarda etki ediyor olabileceğini düşündürmektedir.

[8,17]. Ang2 de en azından VEGF varlığında angiogeniktir. Erişkinlerin sessiz vaskulatüründe Fosforile Tie2’nin düşük düzeylerinin saptanması damarların sürdürülmesinde Tie2’nin yer aldığını göstermektedir.

Fibroblast büyüme faktörü ve platelet-kökenli büyüme faktörü (PDGF) ailesinin üyeleri normal gelişim esnasında bol miktarda bulunurlar ancak uygulandıkları zaman muhtemelen mezenkimal ve enflamatuar hücreleri çekerek (toplayarak) angiogenezi etkilerler.

TGF-β1 ve tümör nekroz faktörü α (TNF-α) endotel hücre büyümesini inhibe yada stimule edebilirler ve tümör progresyonunu belirleyebilirler [18]. Hücre-hücre yada hücre-matriks etkileşiminde yer alan αvβ3 integrin gibi moleküller endotelyal yayılmaya aracılık ederler ve αvβ3 antagonistlerinin angiogenezi inhibe etmesini açıklayabilirler [19]. PECAM-1 ve Ephrin-B2 de patolojik angiogenezde yer alabilmektedir. VEGF’den sonraki basamaklarda yer alan bir VEGF effektörü olan nitrik oksid, TGF-β1 ve diğer angiogenik faktörler embyonik

8

vaskuler gelişim için zorunlu değillerdir ancak patolojik angiogenezi etkilerler ve soyulmuş (çıplak kalmış) damarların re-endotelizasyonunu geliştirirler. Ekzojen yoldan uygulandıktan sonra angiogenik olduğu keşfedilen ancak endojen angiogenik aktivitesi belirlenmeyi bekleyen moleküllerin listesi giderek uzamaktadır: erythropoietin, IGF-1, Neuropepide-Y, leptin, Thy-1, epidermal büyüme faktörü, doku faktörü (koagulasyonun başlatıcısı olan), hepatosit büyüme faktörü, interlökinler, hormonlar ve kemokinler.

Angiogenik tomurcuklanma, aktivatörler ve inhibitörler arasındaki denge ile kontrol edilmektedir. Endotel hücrelerinin proliferasyonunu veya migrasyonunu suprese eden angiogenez inhibitörleri;

•

Angiostatin (bir internal plasminogen fragmanı)

•

Endostatin (kollajen XVIII’in bir fragmanı),

•

Antitrombin III,

•

İnterferon-β,

•

Lösemi inhibitör faktör

•

Platelet-factor 4

yer almaktadır. Doğal olarak oluşan angiogenez inhibitörleri anti angiogenik tedavi yönünden test edilmektedirler. c-Lümen formasyonu (oluşumu, şekillenmesi) Endotel hücreleri çoğunlukla, daha sonradan lümenlenen solid bir kordon şeklinde bir araya gelirler. Endotel hücrelerinin

incelmesi ve önceden var olan damarlarla füzyonu

damarlarda çap ve uzunluğun artmasına imkan verir. Tümör damarları ve patolojik angiogenezde damarlar normal damarların aksine genellikle anormal şekilde genişlemişlerdir ama

tümör

damarlarının

içindeki

kan

akımı

genellikle

kaotik(yönü

tam

anlaşılamayan,türbülan) biçimde olmaktadır, yavaştır ve metabolik ihtiyaçları karşılamada etkisiz kalmaktadır [20]. VEGF189 lümen çapını azaltırken VEGF121, VEGF165 ve reseptörleri lümen formasyonunu arttırır ve ayrıca damar çapını da arttırır. Bazı belirli dokularda (örneğin psoriatik cilt dokusunda) VEGF , mevcut olan kan damarlarını büyüterek morfogenetik bir aktivite sergilemektedir. Ang1 de VEGF ile kombine bir şekilde lümen çapını arttırır [17]. Lümen formasyonunu etkileyen diğer moleküller integrinler ve myocyte enhancer binding factor 2C (MEF2C) transkripsiyon faktörüdür. Aşırı ekstraselüler proteoliz,

9

endotel hücrelerinin kistik bir şekilde toplanmasına yol açabilir ve tüp formasyonunu önleyebilir. Thrombospondin (TSP)-1, lümen formasyonunun endojen bir inhibitörüdür. d-Endotelyal sürvey (sağkalım) Endotel hücreleri yeni damarlarda bir kez toplandıktan sonra sessiz bir hale gelirler ve uzun yıllar boyunca hayatlarını sürdürürler ,canlı kalırlar. Azalmış sağkalımın embriyoda vaskuler regresyona yol açtığının gözlenmesi, endotel sürveyinin önemini demonstre etmektedir [21]. Endotel apoptosisi, retinada ve overlerde doğumdan sonraki damar regresyonunun doğal bir mekanizmasıdır. Endotelyal apoptosis;

•

Lümenin spasm ile daralması,

•

Trombus ile oklüzyonu

•

Ölü endotel hücrelerinin lümene dökülmesi ve sonrasında oklüzyon

sonucunda nutrientlerin veya sürvey sinyallerinin eksikliği ile indüklenebileceği gibi angiogenik gen profilinde değişiklikler meydana geldiğinde de indüklenebilmektedir [14]. Örneğin, prematüre bebeklerin hiperoksiye maruz kalması VEGF düzeylerini düşürür ve retinada damar regresyonuna yol açar [22]. VEGF’nin sürvey fonksiyonu; •

VEGFR2,

•

β-catenin

•

VE-cadherin

arasındaki etkileşimlere bağlıdır [21]. Ang1 endotel sürveyini arttırırken Ang2 süprese etmektedir. Matriks makromolekülleri ile etkileşimin αvβ3 antagonistleri yada desintegrin accutin kullanılarak engellenmesi de endotel apoptosisi ile sonuçlanabilir ancak αvβ3 sadece proliferatif hücrelerde eksprese edildiği için önceden mevcut bulunan sessiz kan damarları etkilenmeden kalmaktadır .Farklı damar yataklarında spesifik sürvey mekanizmaları bulunabilmektedir; örneğin, beyinden köken alan neurotrophic faktörün koroner endotel hücrelerindeki etkisi gibi. Hemodinamik kuvvetler de damarın sürdürülmesinde zorunludur çünkü fizyolojik makaslama stresi endotel turnover’ını azaltır ve TNF-α aracılı endotel apoptosisini ortadan kaldırır. Endotel apoptosisi ayrıca nitrik oksid, reaktif oksijen türleri, angiostatin, TSP-1, metallospondin METH-1, interferon-γ, doku faktör yolağı inhibitörü ve vaskuler endotelyal büyüme inhibitörü (VEGI) ile de indüklenebilmektedir.

10

Çeşitli endotelyal sürvey faktörleri (VEGF, Ang1, αvβ3) p53, p21, p16, p27 ve Bax’ı suprese ederken sürvey PI3-kinaz/Akt, p42/44 mitogenle aktive edilen protein kinaz, Bcl-2, A1 ve sürvivin yolaklarını farklı derecelerde aktive edebilirler. Protrombin kringle-1 ve kringle-2, TSP-2, PECAM-1 antagonistleri, interlökin 4 ve 12, interferon α, siklooksigenaz-2 (Cox-2) inhibitörleri, 1,25 dihidroksi vitamin D3 ve prolaktinin N-terminal fragmanı gibi diğer pek çok faktörün etki mekanizması ise bilinmemektedir. Transkripsiyon faktörlerinden Braf da endotel hücre sürveyinde yer alıyor olabilir. e-Endotel diferansiyasyonu Endotel hücreleri, lokal fizyolojik gereksinimlere uyum sağlayabilmek için, kısmen konak doku tarafından belirlenen bazı özel karakteristik özellikler kazanırlar .Örneğin, glial fibriler asidik protein eksprese eden astroglial hücreler, perisitler ve normal angiotensinogen düzeyleri arasındaki etkileşim kan beyin bariyerinin gelişimi açısından esansiyeldir. Tam tersine, endokrin glandlarda bulunan endotel hücreleri aralıklı ve fenestralı hale gelirler. Buna muhtemelen, VEGF ile ekstrasellüler matriks arasındaki etkileşimler aracılık etmektedir.

Tümörlerde ve patolojik angiogenezde bulunan endotel hücreleri pek çok bakımdan anormaldir: çok katlıdırlar, damarları bölen/ayıran ve köprüleyen dışa doğru çıkıntılar yaparlar, intersellüler ve transsellüler delikler içerirler, nısbeten kontrolsüz bir permeabilite sergilerler ve sürekli bir remodeling’e uğrarlar. Tümör damarlarının “mozaik” damarlar oldukları(hem endotel hem tümöre ait hücreler içerir) ve hem endotelyal hücrelerle hem de malign “vaskulojenik” tümör hücreleriyle kaplı oldukları şeklindeki yeni ve tartışmalı bir bulgu anti-angiogenik tümör tedavisini daha anlamlı hale getirmiştir.. Tümör endotel hücreleri tarafından yapılan hücre yüzeyinde

spesifik olan epitoplar, anti-kanser tedavisinde pro-

apoptotik veya trombotik moleküllerin yapışması için cazip hedeflerdir. Mikroçevresel faktörler de tümörlerdeki endotel bariyerini belirleyebilmektedir çünkü tümörler ciltte büyüdüklerinde, beyinde büyümeleri durumunda olduğundan daha fazla fenestra içermektedir. f-Remodeling (yeniden modellenme, şekillenme) Endotel hücrelerine doğru yönde gelişmeleri yönünde ve üç boyutlu ağlar oluşturacak şekilde yol gösteren, kılavuzluk eden spatial (mekansal) ipuçları hakkında şu ana dek çok az şey bilinmektedir. Bu, terapötik angiogenez için önemli bir hedef teşkil etmektedir. Endotel ağının matürasyonu, uniform büyüklükteki kapiller-benzeri damarların remodeling’ini ve bazılarının budanmasını, ayıklanmasını ve dallanan damar yapılarından oluşan yapılandırılmış bir ağ yapısına düzensiz bir şekilde organize olmayı içermektedir.Damarların matriksle yer değiştirmesiyle sonuçlanan intusepsiyon, budanmanın ve dallanmanın altında yatan olaydır.

Gen inaktivasyon çalışmaları, farklı VEGF isoformlarının ve VEGFR3’ün endotelyal 11

“orphan” reseptörü Tie1, T-hücreli-lösemi protein stem cell lösemi faktörü/tal-1, TEL, GTP bağlayıcı protein Gα13, kemokin reseptörü 4, jagged, VCAM-1, α4 integrin ve fibronektin açısından değişik morfogenetik fonksiyonlarının olduğunu göstermektedir.

FİZYOLOJİK VE PATOLOJİK ANGİOGENEZ Angiogenezin iki türünün olduğu düşünülebilir: normal ya da fizyolojik ve patolojik.

Bu ayırım, söz konusu angiogenez türlerinin indüklediği çok farklı kan damarı türlerine dayanmaktadır. Fizyolojik angiogenez gelişmekte olan fetüsde başlar ve doğum sonrasında, erişkin dokulardaki normal kan damarlarını oluşturacak biçimde devam eder. Normal kan damarları, düzenli ve birbirinden yakın boşluklarla ayrılmış bir biçimde dağılım gösterirler ve elastik ve muskuler arterler, arterioller, kapillerler, postkapiller venüller ve ufak ve büyük venler şeklinde hiyerarşik bir düzenlenmeye sahiptirler. Normal vaskulatürün bu iyi düzenlenmiş yapısının ve fonksiyonlarının aksine, patolojik angiogenezde indüklenen yeni kan damarları (örneğin tümörler tarafından, MI sonrasında ve yara iyileşmesinin yada enflamasyonun diğer türlerinde) son derece anormaldir. [23]. Patolojik angiogenez tarafından indüklenen damarlar uniform olmayan bir biçimde dağılırlar, düzensiz dallanırlar, arteriovenöz (AV) şantlar oluştururlar ve belirli kesin bir hiyerarşik paterne uymazlar. Ayrıca yapısal ve fonksiyonel

açıdan

gösterirler.Plasma

heterojenlerdirler.Değişken

proteinlerine

ve

plasmaya

ve karşı

farklı

biçimde

genellikle

fenestrasyon

yüksek

derecede

geçirgendirler.Yüzeylerinde pek çok büyüme faktörü reseptörleri taşırlar.

Sekilde patolojik ve normal vaskuler sistem şematik olarak gösterilmiştir.

Şekilde normal ve patolojik vaskulaturün şematik olarak endoteli çizilmiştir 12

ANGİOGENEZİ ETKİLEYEN FAKTÖRLER VEGF ailesine mensup olan proteinlerin vaskulatür gelişiminde en önemli proteinler olduğuna genel olarak inanılmaktadır. Vaskulogenezde, ayrıca hem fizyolojik hem de patolojik angiogenezde ve lenfangiogenezde esansiyel rolleri vardır [24]. VEGF ailesinin içinde VEGF-A , VEGF-B, C ve D ve plasental büyüme faktörü (PIGF) [25] yer almaktadır. Bunlardan, üzerinde en fazla çalışılmış olan VEGF-A’dır ve VEGF-A’nın bu konuda en önemli faktör olduğu düşünülmektedir. Koroner arter gelişimindeki rolü dışında VEGF-B hakkında çok fazla şey bilinmemektedir. VEGF-C ve D, lenfatik sistemin gelişiminde esansiyeldirler ve aynı zamanda angiogenezi ve artmış vaskuler permeabiliteyi indükleyebilmektedirler.Her ikisi de, posttranslasyonel işleme gerektiren preproteinler şeklinde sentez edilir. PIGF adından da anlaşılacağı gibi ilk kez plasentada saptanmıştır ve normal embryonik yada erişkin dokularda yüksek düzeylerde eksprese edilmemektedir. PIGF

patolojik angiogenez formlarında VEGF-A

aktivitesini tamamladığı ve potansiyalize edebildiği gösterilmiştir. [25] ANGİOGENEZ VE KUAGULASYON SİSTEMİ VEGF-A 164 tümörler, yara iyileşmesi ve enflamasyon tarafından indüklenen angiogenik yanıtın ilk basamaklarında vaskuler tromboz ve ekstravaskuler fibrin açığa çıkartan temel faktördür. Pıhtılaşma intravaskuler de olsa ekstravaskuler de olsa doku faktörü tarafından başlatılır ve trombin üretimine, platelet aktivasyonuna (ve bunun sonucunda çeşitli büyüme faktörlerinin salgılanmasına), ve fibrin formasyonuna yol açar ki bunların tümü proangiogenik etkilidir [26]. Çeşitli insan tümörlerinde mikrovaskuler dansite ile doku faktörü ve VEGF-A ekspresyonu arasında sıkı bir korelasyon tespit edilmiştir. Daha yeni veriler, doku faktörünün pıhtılaşmadan bağımsız mekanizmalarla da angiogenezi etkileyebildiğini göstermektedir. İlk olarak; doku faktörü VEGF-A ekspresyonunu upregüle eder ve angiogenez inhibitörlerinden thrombospondin-2’nin transkripsiyonunu downregüle eder [26]. Doku faktörü tarafından indüklenen VEGF-A upregulasyonu, kendi kendini devam ettirebilen bir feedback ,döngü kurabilme potansiyeline sahiptir çünkü

VEGF-A ekspresyonu da doku faktörünün

ekspresyonunu upregüle etmektedir. Yani VEGF-A ve doku faktörü birbirlerinin ekspresyonunu upregüle etmektedir. İkinci bir kanıt, doku faktörü olmayan farelerden gelmektedir. Kesin mekanizmanın halen tam olarak belli olmamasına rağmen, bu fareler yolk sac’ta vaskuler bütünlüğün bozulması ve kan damarı gelişimindeki defektler nedeniyle embryoda, pıhtılaşma sisteminin fonksiyonel hale gelmesinden çok uzun bir zaman önce 10.5.nci günde ölmektedir [27]. Doku faktörü ile ilişkili bir protein olan doku faktörü yolağı inhibitörü (TFPI) de angiogenezden sorumlu tutulmaktadır. Solid tümörleri olan hastalarda dolaşımdaki TFPI

13

düzeyleri artmıştır. İkinci bir doku faktörü inhibitörü olan TFPI-2 için de angiogenik bir rol öne sürülmektedir .

Trombinin, pıhtılaşmadaki ve fibrin oluşumundaki rolünün dışında da angiogenezde önemli rollerinin olduğu saptanmıştır. Trombin; plateletler ve endotel hücreleri gibi pek çok farklı hücre türünün yüzeyinde eksprese edilen 7 transmembran segmentli G proteini ile kenetli reseptörleri yani proteazla aktive olan reseptörleri (PAR’ları) aktive eder. PAR aktivasyonu, depolanmış olan büyüme faktörlerinin plateletlerden salgılanmasına (açığa çıkmasına); VEGFR-1 ve 2 de dahil olmak üzere angiogenezle ilişkili genlerin transkripsiyonuna; hücre migrasyonunun ilk basamaklarından biri olan endotel hücrelerinin basal membrandan ayrılmasına; MMP-2 gibi metalloproteazların aktivasyonuna; artmış vaskuler permeabiliteye ve hücre bölünmesinin stimule edilmesine yol açar [28].

Trombin, integrinlein β3 alt-ünitesinin ekspresyonunu arttırarak endotel hücre fonksiyonunu da etkileyebilmektedir. αvβ3, pek çok tümör kan damarını döşeyen endotel tarafından eksprese edilmektedir. αvβ3, fibrin, fibronektin, vitronektin, trombospondin ve osteopontin gibi pek çok substratla etkileşime giren afinitesi yüksek bir integrin’dir αvβ3’e ligand bağlanması hücrenin tutunmasının, migrasyon ve proliferasyonunun lehine olan ve apoptosisi önleyen intrasellüler sinyalleri indükler. Trombinle kaplı plaklar üzerinde kültürü yapılan endotel hücreleri apoptosisden korundukları için trombinin ek bir αvβ3 ligandı olduğu da öne sürülmüştür. (28) Trombinin antiangiogenik özellikleri de vardır. Antitrombini (AT) parçalayarak, in vitro koşullarda VEGF-A ve bFGF ile indüklenmiş endotel hücre proliferasyonunun ve in vivo koşullarda angiogenezin potent bir inhibitörünü oluşturmaktadır.

AT’nin trombinle

indüklenmiş mitojenisiteyi bloke edebildiği, doku faktörünün endotel hücreleri tarafından ekspresyonunu inhibe edebildiği ve VEGF-A ile indüklenmiş endotel hücre proliferasyonunu bloke edebildiği gösterilmiştir.Trombinin pro-enzimi olan pro-trombin’in de antiangiogenik özellikleri vardır [28]. Trombinin kendisinin endotelyal hücre tüp formasyonunu inhibe ettiği bildirilmiştir (ancak daha yüksek konsantrasyonlarda) [29]. Yine trombin thrombomodulin’e (TM) bağlandığında fibrinogeni parçalayabilme özelliğini kaybeder ve fibrinogeni parçalamak yerine; faktör VIIIa ve Va’yı inaktive eden, koagulasyonu downregule eden ve böylece dengeyi angiogenez aleyhine çeviren protein C’yi aktive eder. VEGF-A endotel hücrelerinde TM sentezini arttırır, TM’nin IL-1 ve TGF-β tarafından indüklenen down-regulasyonunu zayıflatır ve böylece genel pıhtılaşma aktivitesinde net bir kayba yol açar. Trombinin angiogenez

14

üzerindeki etkileri genel olarak önemlidir ancak son derece kompleks, karmaşıktır ve lokal çevresel faktörlerin etkisine açıktır.

Diğer fibrinolitik proteinlerin ve pıhtılaşma sistemi ile ilişkili proteinlerin de angiogenezde rolleri vardır. Urokinaz ve plasminogen gen aktivitesi olmayan farelerde bozulmuş bir angiogenez bulunur [30]. Ayrıca, hemostaz sisteminde yer alan en az 6 farklı protein de antiangiogenik fragman içermektedir: angiostatin (plasminogen fragmanı), antiangiogenik AT, yüksek molekül ağırlıklı kininogen’in 5.domain’i ve protrombin fragmanları 1 ve 2 Diğer pek çok büyüme faktörü, sitokin ve bazı ufak moleküller de yeni kan damarları oluşturabilmektedir.

Bunlar

arasında

öne

çıkanlar

fibroblast

büyüme

faktörleri

(FGF-1 ve FGF-2), hepatosit büyüme faktörü (HGF), platelet kökenli büyüme faktörü (PDGF), angiopoietin-1 ve -2, transforming growth factor alfa ve beta (TGF-α ve β), IL-8, EG-VEGF, Leptin, prostoglandinler, çeşitli lipidler vb’dir. Listede yer alan bu faktörlerden bazıları (TGFα, HGF, FGF-2 vb) en azından kısmen de olsa, VEGF ekspresyonunu düzenleyerek (regüle ederek) etki göstermektedir. Diğerlerinin ise damar formasyonunda ve diferansiyasyonunda sekonder rolleri vardır [31]. Örneğin, endotel hücrelerinden salgılanan PDGF perisitleri çekecek bir şekilde etki eder. Perivaskuler hücrelerden salgılanan TGF-β endotel hücre proliferasyonunu inhibe eder, damar matürasyonunu ve matriks depozisyonunu indükler. Ang-1’in ise damar permeabilitesinin düzenlenmesinde rolü söz konusudur.

VEGF GENİ, YAPISI, EKSPRESYONU Angiogenez, önceden mevcut bulunan kan damarlarından yeni kan damarlarının köken aldığı kompleks bir proçestir (karmaşık bir süreçtir). Kapiller endotel hücrelerinin proliferasyonundan, migrasyonundan ve dokuya infiltre olmalarından önce extrasellüler matriksin (ECM’nin) lokal bir şekilde yıkılması (parçalanması) söz konusu olmaktadır. Zaman içinde bu hücreler tekrar kapiller strüktürlere re-modeling gösterirler ve yeni bir ECM birikimi olur.

Angiogenez, embryonik gelişimde ve yara iyileşmesinde olduğu kadar ayrıca kadın üreme sisteminde ve kemiğin oluşumunda, şekillenmesinde ve büyümesinde de önemli bir rol oynamaktadır. Ancak angiogenezin disregulasyonu yani iyi bir şekilde regüle edilememesi çeşitli patolojik süreçlere katkıda bulunur; örneğin diabetik retinopati, romatoid artrit ve solid tümörlerin gelişimi gibi.

Normal sessiz (inaktif, istirahat halindeki) vaskulatürün angiogenez haline geçmesi, esas olarak çevrede bulunan perisitlerden ve lenfositlerden salgılanan faktörler tarafından indüklenmektedir. Bu tür angiogenik faktörler arasında direkt olarak angiogenik etki gösteren

15

asidik fibroblast büyüme faktörü (aFGF), bazik fibroblast büyüme faktörü (bFGF) ve timidin fosforilaz (TP) ve ayrıca indirekt şekilde etki eden transforme edici büyüme faktörü-b (TGF-b) ve tümör nekroz faktörü-alfa (TNF-alfa) gibi faktörler bulunmaktadır. Ancak, hemen hemen sadece angiogenez yerlerinde bulunan ve düzeyleri (konsantrasyonları) kan damarlarının büyümesi ile en yakın spatial ve temporal (zamansal ve mekansal) korelasyon gösteren tek büyüme faktörü vaskuler endotelyal büyüme faktörüdür (VEGF). a-Vegf geni - protoin yapısı ve sekresyonu İnsanlardaki VEGF geni kromozom 6p21.3 üzerinde yerleşmiştir. Kodlayıcı bölge ~14 kb’lik bir alan kaplamaktadır ve 8 exon’dan oluşmaktadır.(Şekil 2A) Tek bir pre-mRNA’nın alternatif splicing’i ( birleştirilmesi) çok sayıda farklı VEGF türünü oluşturur.(32) Bir VEGF fragmanının X-ışını kristalografisi VEGF’nin, dimerik sistein-boğumlu (ilmekli) büyüme faktörü superailesine mensup olduğunu göstermektedir. Her bir monomer, dörtzincirli bir beta tabakasının bir ucunda yer alan zincir-içi disülfid bağlı boğumlu bir motif ile karakterizedir. Bu super-aile, alt bölümlere ayrılmaktadır. VEGF, bu alt bölümlerden plateletkökenli büyüme faktörü (PDGF) ailesine mensuptur. Bu alt-ailede yer alan monomerler, “yanyana” bir oryantasyonla bir arada tutulmaktadırlar. 2 beta tabakası, 2 kıvrımlı simetriye dik olacak bir şekilde uzanmaktadır. Tüm VEGF isoformları, kovalent bağlı homodimerler şeklinde sekrete edilir. Monomerler başlangıçta, hidrofobik bağlantılarla bir arada bulunurlar ve daha sonra, bir zincirin Cys51’i ile diğer zincirdeki Cys61 arasında oluşan disülfid bağları ile stabilize edilirler.

Amfipatik bir alfa heliksini içeren sinyal peptidi, bu dimerizasyon için esansiyeldir ve sekresyon sırasında

klevaja

uğrayarak

parçalanmaktadır.(posttranslasyonel

modifikasyon).

Asn74

noktasında, VEGF fonksiyonları üzerinde bir etkisi yok gibi görünen ancak etkin bir sekresyon için gerekli olan potansiyel bir N-glikozilasyon yeri mevcuttur.

Exon 3’de üç asidik rezidünün olduğunu ve exon 4’de üç bazik rezidünün bulunduğu gösterilmiştir. Bu rezidüler, sırasıyla VEGFR-1 ve VEGFR-2 reseptörlerine bağlanmak için esansiyeldir. Dimer ara biriminde VEGF’nin her bir kutbunda son derece fleksibl üç loop kümelenmektedir. Bunlardan loop-2, VEGFR-1 bağlanma determinantları içerir ve VEGFR-2’ye bağlanan karşı monomerin loop-3’üne yakın bir şekilde uzanır. VEGF’nin her bir kutbunda bu reseptör-bağlanma ara birimlerinin pozisyonlandırılması; transfosforilasyon ve sinyalleme için esansiyel olan reseptör dimerizasyonunu kolaylaştırıyor gibi görünmektedir çünkü sadece tek bir reseptör bağlanma yerinin bulunduğu mutant dimerler VEGF aktivitesini antagonize etmektedir.

(33)

16

ŞEKİL2A VEGF geni exon ve intronları b-Vegf ekspresyonu Pek çok sitokin ve büyüme faktörü, VEGF mRNA’sını upregüle etmekte yada VEGF salgısını indüklemektedir. Bunlar arasında PDGF, TNF-alfa, TGF-beta,

FGF-4, Keratinosit

büyüme faktörü (KGF/FGF-7), Epidermal büyüme faktörü (EGF), IL-1alfa, IL-1beta, IL-6 ve insülin benzeri büyüme faktörü (IGF-1) bulunmaktadır. Bunların çoğu direkt bir angiogenik etkiden yoksundur ancak VEGF ve bFGF üzerinde angiogenik aktivite sergilerler.Koagulasyon faktörlerinden factor VII/VIIa’nın bir reseptörü olan doku faktörünün sitoplazmik kuyruğu da VEGF üretimini regüle eder ve yara iyileşme yerlerinde önem taşıyabilir.

Hipoksi, VEGF mRNA düzeylerinde hızlı ve güçlü bir artışı indüklemektedir. Bu durum özellikle, tümörlerin nekrotik alanları etrafında daha belirgin bir şekilde görülmektedir. İşin ilginci, VEGF ailesinin diğer üyeleri ve bFGF hipoksi tarafından indüklenmemektedir. Bu nedenle VEGF, hipoksi ile indüklenmiş neovaskularizasyonun

esas, en önemli mediatörü

olmalıdır. Hipoksik hücrelerden salgılanan adenosin, adenosin A2 reseptörlerine bağlanır ve cAMP bağımlı protein kinaz (PKA) yolağı üzerinde VEGF’yi upregüle eder. (34) Hipoksi yanıt elemanı (HRE), VEGF geninin üst basamaklarında yer alan bir VEGF artırımı ile ilgili bir gen bölgesidir.Bu HRE hipoksi ile indüklenebilir faktör I (HIF-1) için bir bağlanma yeri içerir. Düşük oksijen basıncı HIF-1 düzeylerini post-transkripsiyonel düzeyde arttırır ve ayrıca HIF-1’in DNA-bağlayabilme kapasitesini de arttırır.

Von Hippel-Lindau tümör supresörü (VHL) VEGF de dahil olmak üzere hipoksi ile indüklenen genleri negatif bir şekilde regüle etmektedir. VHL Protein kinaz C(PKC) yi sekestre

17

ederek hücre membranına transloke olmalarını ve buna bağlı olarak MAPK aktivasyonunu ve VEGF’nin indüklenmesini önler. Diferansiyasyon yoluyla hücre sinyallemesinde görülen değişiklikler

de

VEGF

ekspresyonunu

PKC

ve

cAMP/PKA

yolakları

üzerinden

etkileyebilmektedir.VEGF promoter’i, PKC ve PKA’nın gen ekspresyonunu etkilemelerine aracılık eden Sp1, AP-1 ve AP-2 gibi transkripsiyon faktörleri için çeşitli potansiyel bağlanma yerleri içermektedir.

Translasyona uğramayan 5’ ve 3’ gen bölgesinin içindeki 3 sinerjik sekans elemanının varlığına bağlı olarak yapısal açıdan labil olan VEGF mRNA'sının yarı ömrü hipoksi etkisiyle uzamaktadır.(35) Hipoksi-ile indüklenmiş stabilite faktörünün (HuR) bağlanması bu mRNA’nın yarı ömrünü 3 – 8 kat uzatmaktadır.Alternatif bir transkripsiyon başlama yeri sürecin aşağı basamaklarında yer alan ribozomal bir giriş yerinden VEGF mRNA transkripsiyonuna izin,imkan vermektedir. Bu durum, cap-dependent translasyon inhibe edilebildiği hipoksik stres durumlarında avantaj sağlayabilmektedir.

VHL geninin inaktivasyonu, aktivatör p53 mutasyonları ve RAS’ın onkojenik mutasyonu yada amplifikasyonu gibi çeşitli spesifik transformasyon olayları da VEGF ekspresyonunu indükleyebilmektedir. c-Vegf mRNAsının alternatif birleşimleri İnsan VEGF’sinin bugüne dek 6 isoformu tanımlanmıştır.Bu isoformların uzunluğu 121 ile 206 amino asidlik rezidüler arasında değişmektedir.(36) İmmortal (ölümsüz) fare fibroblastları, 37 rezidülük tuhaf bir C-terminusu olan daha kısa bir VEGF formunu, VEGF115’i kodlarlar.

Ancak bunun insanlarda homologu ,benzeri saptanmamıştır. VEGF üreten hücrelerin çoğu tercihen VEGF121, VEGF165 ve VEGF189’u eksprese ediyor gibi görünmektedir. VEGF183’ün de geniş bir doku dağılımı vardır. Bu isoform, daha önceleri VEGF183 ile karıştırıldığı için keşfedilmesi gecikmiştir. Aksine, VEGF145 ve VEGF206 nısbeten daha seyrek bulunurlar ve görünürde sadece plasental kökenli hücrelere sınırlı bir şekilde bulunurlar.Sıçanlarda dokuyaspesifik VEGF mRNA birleşimlerini gösterilmiştir.İnsan deri mast hücreleri normalde VEGF121, VEGF165 ve VEGF189’u eksprese ederler ancak bunun dışında, PKC aktivitesini stimule eden phorbol myristate acetate (PMA) ile enkübasyon sonrasında VEGF206’yı eksprese etmek üzere indüklenebilirler. (37) VEGF isoformları, alternatif mRNA birleşimleri yoluyla 6 ve 7 nolu exonlar tarafından kodlanan sekansların varlığına yada yokluğuna göre birbirlerinden ayrılmaktadır. VEGF165 ~46 kDa’luk homodimerler şeklinde sekrete edilirler. Bu homodimerler bazik bir karaktere sahiptir ve heparine orta derecede bir affinite gösterirler. Bu durum, 7 nolu exon tarafından kodlanan 44 rezidü içindeki 15 bazik amino asidin varlığına bağlıdır. Tam tersine, bu bölgeyi içermeyen 18

VEGF121 zayıf asidik bir proteindir ve heparini bağlamamaktadır. VEGF121 kendisini üreten hücrelerden serbest bir şekilde salgılanırken salgılanan VEGF165’in yaklaşık %50-70’i hücreyle ve ECM ile ilişkili bir şekilde kalmaktadır. Bu muhtemelen, heparan sülfat proteoglikan (HSPG) etkileşimlerinin bir sonucudur. VEGF189 ve VEGF206 ek olarak, 6 nolu exon tarafından kodlanan ve heparini güçlü bir şekilde bağlayan bir sekans daha içerirler. Bu isoformlar tamamen ECM’de sekestre edilirler ve daha az ölçüde hücre yüzeyinde sekestre edilirler.

VEGF 145’in exon-6a tarafından kodlanan sekansı, VEGF165’in 7.exon tarafından kodlanana benzer şekilde heparin için bir affinite sağlamaktadır. Ancak bu sekans aynı zamanda, heparinden yada heparan sülfattan bağımsız bir şekilde ECM komponentlerine bağlanmaya da aracılık etmektedir. ECM’ye bağlı VEGF145, bir endotelyal mitogen şeklinde aktif kalmaktadır.

VEGF145 kendisini üreten hücrelerden serbest bir şekilde sekrete edildiği için heparan sulfat etkileşimlerinden oluşan kombinasyonun VEGF189’un ve VEGF206’nın hücre yüzeyinde kalmasından sorumlu olduğu düşünülmektedir.Yakın bir zaman önce, exon 6 tarafından kodlanan sekansın ECM’den bioaktif bFGF salgılattığı ve böylece VEGF189’a, etkilerinin bir kısmını bFGF sinyalleme yolakları üzerinden gösterebilme özelliği kazandırdığı da gösterilmiştir. (38) ECM’de bulunan VEGF isoformları heparinle, heparan sulfatla ve heparinazlarla temas sonrasında yavaş bir şekilde açığa çıkan veya plasmin ve uPA gibi spesifik proteolitik enzimlerle temas sonrasında daha hızlı bir şekilde mobilize olan bir büyüme faktörü rezervuarına komşuluk etmektedirler.Bu enzimler zaten ECM depolimerizasyonu yoluyla ve ayrıca hücre yüzeyinde ve ECM’de sekestre olmuş olan VEGF’i buralardan serbestleyerek de angiogeneze katkıda bulunmaktadır.Rekombinant VEGF189 ve VEGF206 endotel hücre mitogenezini stimule edememektedirler çünkü daha büyük olan bu isoformlarda proteinlerin kendi üzerine kıvrılması sonucu reseptör ile bağlanan kısmı iç kısımlarda kalarak etkisiz kalmaktadır. VEGF189 VEGFR1’e bağlanır ancak VEGFR-2’ye bağlanabilmesi için uPA yada plasmin ile enzimatik maturasyon gerektirir ve mitogenik etkilerini endotel hücreleri üzerinde sergiler.Bütün VEGF isoformları plasmin tarafından klevaj edilebilmektedir. Bu VEGF (VEGF110), VEGF165 ve uPA- VEGF189 ile karşılaştırıldığında endotel hücreleri üzerinde 50 kat daha az mitogenik etki ortaya çıkartır. Bu etki, VEGF121 için gözlenen etkilere benzer düzeydedir. Bu durum, exon 6 ve 7 tarafından kodlanan VEGF sekanslarının sadece HSPG(Heparin sülfat proteoglikan) bağlanması yoluyla VEGF bioyararlanımını düzenlemekle kalmadıklarını, bunun dışında başka şeyleri de regüle ettiklerini düşündürmektedir: Mitojenik sinyallenmeyi gerçekten arttırabilmektedirler. (39) VEGF RESEPTÖRLERİ VE BENZERİ ETKİLİ RESEPTÖRLER 1A-VEGFR-1(VEGF RESEPTÖR 1)

19

VEGFR-1 ve VEGFR-2, yüksek affiniteli VEGF reseptörleridir ve VEGFR-3 ile birlikte reseptör tirozin kinazların flt alt-ailesini oluştururlar. Bu reseptörler, 7 adet ekstrasellüler immunglobulin (Ig)-benzeri domain ve bu domainleri izleyen membranı-katedici bir bölge ve korunmuş bir intrasellüler tirozin kinaz domain’i ile bu domain’in arasına giren bir kinaz insert sekansı ile karakterizedir. (40) ~180 kDa’luk bir glikoprotein olan VEGFR-1 tanımlanan ilk VEGFR’dir ve VEGF’ye karşı en yüksek affiniteye sahiptir.(40) VEGFR-1, VEGF dışında PIGF ve VEGF-B gibi benzer büyüme faktörleri tarafından da paylaşılmaktadır.(Şekil 3B) Farelerdeki ekspresyonu erişkinlerde ve embriyolarda endotel hücrelerine sınırlıdır. Bunun dışında ayrıca iyileşmekte olan cilt yaralarındaki neovaskularizasyonda da eksprese edilmektedir. Sessiz (inaktif durumdaki) endotel hücrelerinde olduğu kadar prolifere olan endotel hücrelerinde de VEGFR-1 mRNA’sının bulunması, bu reseptörün endotelin sürdürülmesinde sürekli bir rolü olduğunu düşündürmektedir.

VEGFR-1 vaskulogenez süresince esansiyeldir: VEGFR-1 oluşturamayan

fareler embryonik

dönemde 8,5.nci günde ölmektedir. Bu farelerde hem embriyonik hem de embriyo dışı yerlerde endotel hücreleri normal bir şekilde forme olabilmekte ancak doğru bir şekilde bir araya gelerek kan damarları halinde organize olamamaktadırlar. Bu defekt, mezenkimal hücrelerin hemangioblast haline gelebilmek için VEGFR-1 ‘in gerekli olduğunu göstermektedir.

VEGFR-1’in VEGF stimulasyonuna yanıt olarak gerçekleşen tirozin fosforilasyonunun tespit edilmesi zordur ve endotel hücrelerinde bu reseptör aracılığıyla düzenlenen belirgin, görünür direkt proliferatif, migratuar yada sitoskletal (hücre iskeleti ile ilgili) etki söz konusu değildir. Ancak VEGFR-1, endotel hücrelerinde doku faktörünün, uPA’nın ve plasminogen aktivatör inhibitörü-I’in (PAI-1’in) upregüle edilmiş ekspresyonundan da sorumlu tutulmuştur.

VEGFR-1’in diğer hücre tiplerinde başka rolleri olabilir; örneğin monositlerde doku faktörünün indüklenmesi ve kemotaksis ve vaskuler düz kas hücrelerinde matriks metalloproteinaz ekspresyonunun arttırılması gibi.

1B-VEGFR-2(VEGF RESEPTÖR 2) VEGFR-2 (kinaz-insert-domaini-içeren reseptör; KDR olarak da bilinmektedir) 200 – 230 kDa’luk yüksek affiniteli bir VEGF reseptörüdür.(41) Ayrıca VEGF-C ve VEGF-D için de reseptör görevi yapabilmektedir.(Şekil 4) İnsanlarda, tirozin kinaz reseptörleri için yapılan endotelyal cDNA taramaları sırasında tanımlanan bu reseptör, daha önceden keşfedilmiş olan fare fetal karaciğer kinazı-I (flk-1) ile %85 oranında ortak bir sekans kimliğine sahiptir. VEGFR-2 oluşturamayan fareler, endotelyal ve hematopoietik prekursorlerin gelişiminde çeşitli defektler göstererek embryoda 9,5.nci günde ölmektedir. Bu tür prekursor hücrelerde olduğu kadar endotel hücrelerinde, başlangıç aşamalarında bulunan hematopoietik stem cell’lerde ve umblikal kordun stromasında normalde VEGFR-2 reseptörleri eksprese edilmektedir. Ancak inaktif durumda

20

bulunan erişkin vaskulatüründe VEGFR-2 mRNA’sı down-regüle edilmiş gibi görünmektedir.

VEGFR-1 her ne kadar VEGF için daha yüksek bir affiniteye sahip olsa da, VEGFR-2 ligandla bağlandıktan sonra tirozinle çok daha etkin bir şekilde fosforile edilir.Sonrasında intraselüler pek çok yolak aktive olur ve endotel hücrelerinde mitogeneze, kemotaksise ve morfolojik değişikliklere yol açar. (Şekil 3)

ŞEKİL 3 Ig-Benzeri domain’lerin VEGFR fonksiyonlarındaki spesifik rollerini tek tek ortaya çıkartmak için yeni bir çalışma başlatılmıştır. Her 2 reseptörün 2.ci ve 3.cü Ig-benzeri domain’i yüksek affiniteli ligand bağlanması için gerekli gibi gözükmektedir. VEGFR-1’de 2.ci Ig-benzeri domain’in delesyonu ligand bağlanmasını ortadan kaldırırken VEGFR-2’de 3.cü domain’in kaybı en kritik öneme sahip değişiklik gibi görünmektedir. Ig-benzeri 4.cü domain’in VEGFR-1’de reseptör dimerizasyonuna aracılık ettiği sanılmaktadır. Bu durum, VEGFR-2 için de geçerli olabilir. VEGFR-2’nin 5 ve 6.cı Ig-benzeri domain’leri, ligandla bağlanma sonrasında VEGF retansiyonu için gerekli gibi görünmektedir. Birinci Ig-benzeri domain ise ligand bağlanmasına aracılık etmektedir çünkü bu domain’in çıkarılması VEGF ilişkisini arttırmaktadır. Her 2 VEGF reseptörü de glikozillenmiştir; bu, VEGFR-1 ligand bağlanması için esansiyel bir durum değildir ancak VEGFR-2’nin sadece matür glikozillenmiş şekli etkin bir şekilde otofosforile olabilmektedir.

HUVEC(umblikal kord venöz endotelyal hücreleri) cDNA kitaplığından VEGFR-1’in sadece ilk 6 Ig-benzeri domain’ini içeren dallanmış solübl bir formu (sFlt-1) klonlanmıştır. sFlt-1 VEGF’ye, tam-uzunluktaki VEGFR-1 kadar güçlü bir şekilde bağlanır ve VEGF’yi sinyalleme

21

reseptörlerinden uzaklaştırarak VEGFR-2 ile sinyalleme yapmayan heterodimerler oluştur ve VEGF aktivitesini inhibe eder. Özellikle plasentada yüksek düzeylerde sFlt-1 meydana gelmektedir. sFlt-1 plasentada, gebeliğin belirli dönemlerinde VEGF aktivitesini kontrol ediyor olabilir. VEGFR-2’nin kinaz domain’inin c-terminal yarısını içermeyen dallanmış bir formu bu hücrelerde tam uzunluktaki VEGFR-2’den daha düşük düzeylerde eksprese edilir ama VEGF tarafından en azından etkin bir şekilde aktive edilebiliyor gibi görünmektedir.

1C-VEGFR-3(VEGF RESAPTÖR 3) VEGFR-3 (Flt-4) de reseptör tirozin kinazların flt alt-ailesinin bir üyesidir. Ancak bu reseptörün ekspresyonu esas olarak, erişkin dokuların lenfatik endoteline sınırlı gibi gözükmektedir. VEGFR-3, VEGF-C ve VEGF-D’yi bağlar ancak VEGF’yi bağlamaz. Bu reseptörün lenfangiogenezi kontrol ettiği düşünülmektedir.

ŞEKİL 4 VEGFR-1,2,3 ve Nörofilin reseptörüne bağlanabilen moleküller gösterilmiştir.

.

2-VEGF BENZERİ RESEPTÖRLER NÖROFİLİNLER 125I-işaretli VEGF kullanılarak yapılan çapraz-bağlantı denemeleri, VEGFR’lere karşılık gelmeyen VEGF reseptörlerinin mevcut bulunduğuna işaret etmektedir. Bu reseptörler, VEGF’nin exon 7 tarafından kodlanan domain’ini tanırlar ve dolayısıyla da VEGF121’e değil ama 22

VEGF165’e bağlanırlar. Bu tür reseptörlerden biri neurophilin-1’dir (NRP-1) (Şekil 4). NRP-1, collapsin/semaphorin ailesinin belirli üyeleri için nöronal bir reseptör olarak daha önceden karakterize edilmiş olan 120 – 130 kDa ağırlığında bir glikoproteindir. NRP1’in tümör kökenli hücreler ve endotel hücreleri de dahil olmak üzere çok geniş bir doku dağılımı mevcuttur.

Embriyonik nöronlar üzerinde bulunan NRP-1 akson büyümesinin kontrolünden ve semaphorin ailesine mensup olan belirli üyelerin bağlanması yoluyla akson büyümesine kılavuzluk etmekten sorumlu tutulmaktadır. Fare embriyolarında yapılan çalışmalar NRP1’in angiogenezde ve vaskulogenezde de bir rolünün olduğunu düşündürmektedir. aşırı NRP-1 ekspresyonu embryoda 17,5.ci günde aşırı derecede fazla kan

damarları oluşturarak ölüme yol açmaktadır. Bu kan

damarları dilate ve hemorajiye yatkın durumdadırlar. NRP1 defektif fareler embriyoda 10,5 – 12,5.cu günler arasında kardiovaskuler anomaliler nedeniyle ölmektedir.

NRP1, VEGF165 için bir ko-reseptör şeklinde etki ederek bu isoformun VEGFR-2’ye bağlanmasını ve bioaktivitesini arttırmaktadır(42).Endotel hücrelerinde indirekt etkili bir angiogen olan TNF-alfa tarafından hem NRP1 hem de VEGFR-2 Upregüle edilmektedir. NRP1’in sadece çok kısa bir intrasellüler domaini vardır ve VEGFR-2’nin bulunmadığı hücrelerde VEGF165’e karşı yanıtlar gözlenmemektedir. Kemik iliği stroma hücrelerinde VEGF165 bağlanmasının eritropoetin düzeylerini ve Flt-3 ligandı ekspresyonunu arttırdığı göz önüne alındığında NRP1 sinyallemesi hematopoeze de katkıda bulunuyor olabilir.

VEGF ile ilişkili diğer büyüme faktörleri de NRP1 reseptörlerini paylaşmaktadır (Şekil 4). Hem PIGF-2 hem de VEGF-B167, VEGF’nin exon 7 ile kodlanan domaini aracılığıyla NRP1’e HSPG’lere bağlanır. Ancak heparin bağlayıcı olmayan VEGF-B186’nın prolinden zengin kısa bir NRP1 sekansı ile etkileşime girebilmesi için kendine özgün C-terminal bölgesinin proteolitik klevaja uğraması gerekmektedir. NRP1’in VEGF-B ve PIGF-2’ye bağlanmasının biolojik rolü henüz belli değildir çünkü bu büyüme faktörleri sadece VEGFR-1’e bağlanmaktadır.

PIGF-2, NRP1 eksprese eden endotel hücrelerinin proliferasyonu üzerinde herhangibir etkiye sahip değildir ve VEGFR-1 aracılı migrasyonu stimule etmede PIGF-1’den daha etkili değildir.

NRP1 reseptörü angiogenez, vaskulogenez ve sinir sisteminin gelişimi gibi çok çeşitli proçeslerde

rol

oynamaktadır.VEGF165

periferik

sinir

sisteminde

bulunan

hücrelerin

proliferasyonu ve sürveyi ile birlikte aksonal büyümeyi stimule eden nörotrofik bir faktör şeklinde etki edebilmektedir(43)Benzer şekilde, chemorepulsif (kimyasal itici) bir molekül olan semaphorin Sema III (NRP1’e bağlanır ve akson mobilitesini inhibe eder) aynı zamanda endotel hücre motilitesini de inhibe etmekte ve NRP1’e bağlanmak için VEGF165 ile yarışmaktadır.

VEGF RESEPTÖR UYARIMI SONRASI SİNYAL İLETİMİ

23

VEGF reseptörleri dimerlerden oluşmaktadır.Dimer ara biriminde VEGF’in her bir kutbunda, birbirinden ayrı olan ancak iç-içe geçen, örtüşen VEGFR-1 ve VEGFR-2 bağlanma yerleri mevcuttur. VEGF üzerindeki bu yerlerde bulunan reseptör monomerlerinin etkileşimi reseptör dimerizasyonunu ve buna bağlı olarak transfosforilasyon yoluyla aktivasyonu indüklemektedir.Yani VEGF reseptöre bağlanınca monomerler dimerize olmakta ve intraselüler aktivasyon başlamaktadır. VEGFR-1 ve VEGFR-2 ve aynı zamanda oluşan homodimerler de heterodimerize olabilmektedir. sFlt-1(erimiş haldeki VEGFR1) ve VEGFR-2 sinyallemeyapmayan kompleksler oluşturabilir.İn vivo koşullarda endotel hücreleri için mitogenik ve kemotaktik etkili olan PIGF-VEGF heterodimerleri de mevcuttur.

VEGFR-2, endotel hücrelerinin VEGF’ye karşı verdiği hemen hemen bütün cevaplara aracılık ediyor gibi görünmektedir. Tam tersine, VEGFR-1 her ne kadar monosit migrasyonunu indükleyebilse de VEGFR-1’e yanıt olarak ortaya çıkan endotelyal hücre migrasyonu kesin bir şekilde gösterilememiştir. VEGFR-1 stimulasyonuna karşı belirgin endotelyal hücre yanıtlarının olmaması bazı kimselerin, VEGFR-1’in esas rolünün VEGFR-2 aracılığıyla oluşan sinyallemeyi engelleyerek VEGF’i sekestre eden yalancı bir reseptör olduğu spekulasyonun öne sürülmelesine yol açmıştır. Gerçekten de, tirozin kinaz domain’i bulunmayan VEGFR-1 eksprese eden fare embryoları normal bir gelişim ve angiogenez sergilerler. Bu farelerde sadece, VEGF-aracılı makrofaj migrasyonu etkilenmektedir (44) .VEGFR-1 baskın olarak ligand-bağlayıcı bir molekül şeklinde etki ediyorsa PIGF ve VEGF-B esas olarak VEGF ve VEGFR-2 bağlanmasını sağlamak için mevcut bulunuyor olabilir. Bu tür bir kompetisyon (rekabet, yarışma) PIGF’nin düşük konsantrasyonlardaki VEGF’nin bioaktivitesini potansiyalize edebilmesini açıklamaktadır. ortamdaki PIGF VEGFR1’e bağlanarak mevcut bulunan VEGF’i indirekt bir yol ile VEGFR2 ‘ye yönlendirmektedir.

VEGF ile ilişkili sinyal transdüksiyon olaylarının ortaya çıkartılması VEGFR’lerin ekspresyonundaki ve sinyal iletimindeki hücrelere spesifik ve dokulara spesifik farklılıklardan dolayı kolay olmamıştır. HSPG’ler ve neurophilinler gibi potansiyel olarak modulatör grupların varlığı tabloyu daha da karmaşıklaştırmaktadır. VEGF sinyallemesi ile ilgili mevcut güncel bilgiler hala tam alamıyla ortaya konamamıştır

İNTEGRİNLER (HÜCRE EKSTRASELÜLER ADEZYON MOLEKÜLÜ)

İntegrin’ler, ekstrasellüler matrikse yada bazı durumlarda komşu hücrelere adhezyona aracılık eden hücre yüzeyi reseptörleridir [45]. Pek çok integrin’in ve integrin ligandının

24

angiogenezde rol oynadıklarını bilmemize karşın bu moleküllerin kesin fonksiyonları halen tam olarak belli değildir. İntegrinler antikorlara, peptidlere veya peptidomimetiklere kolaylıkla ulaşabilmekte ve bu tür moleküller tarafından kolaylıkla inhibe edilebilmektedir ki bu özellik, integrinleri ilaçlar için mükemmel bir hedef haline getirmektedir. Plateletlerdeki majör integrin olan αIIbβ3 molekülü, efektif antitrombotik ilaçların moleküler hedefidir ve çeşitli lökosit integrinlerini hedef alan ilaçlar anti-enflamatuar ilaçlar olarak klinik denemelerin son dönemlerinde bulunmaktadır. Bu temel bilgiler dikkate alınacak olursa, integrinler antiangiogenik tedavi hedefleri olarak oldukça ilgi ve dikkat çekmiş bulunmaktadır. αvβ3 molekülünün belirli tümör damarlarında upregüle edildiğinin ilk kez gözlenmesinden sonra

pek çok model sistemde anti-angiogenik aktivite ile αvβ5 arasında yakından bir ilişki

kurmuşlardır.Brooks ve diğerleri, LM609 monoklonal antikorunun ve bu 2 integrin tarafından tanınan tripeptid RPG bazlı çeşitli düşük-molekül-ağırlıklı reaktanların tümör dokularında ve retinal angiogenezde büyüme faktörlerine yanıt olarak ortaya çıkan angiogenezi bloke ettiğini bildirmişlerdir [46]. Bu sonuçlar, söz konusu 2 integrinin proangiogenik olduğu şeklindeki makul ve mantıklı fikrin ortaya atılmasına yol açmış ve bu konsept incelenmiş ve gözden geçirilmiştir.

LM609’un Vitaxin adıyla bilinen humanize (insanlaştırılmış) bir versiyonu bu modele dayanılarak erken-faz klinik denemelere girmiş bulunmaktadır.

Ancak, genetik olarak değişikliğe uğramış farelerle ilgili bir dizi yayın, bu 2 integrinin proangiogenik oldukları ve hatta angiogenez için gerekli oldukları düşüncesini bile ciddi bir şekilde sorgulamaktadır. αv integrin alt-ünitesi, dört farklı β alt-ünitesi ile (β3, β5, β6 ve β8) selektif bir şekilde ve ayrıca, bir düzine kadar α alt birimi ile birleşebilen β1 alt ünitesi ile birleşirler. β1’in genetik ablasyonu şaşırtıcı bir şekilde embryonik lethalite ile sonuçlanır [47] ve diğer çalışmalar β1 integrinlerin angiogenezde yer aldıklarını göstermektedir.Ancak αvβ3 ve/veya β5 angiogenez için esansiyel olsa idi, αvβ3 ve/veya β5 ablasyonunun angiogenez açısından önemli etkilerinin/sonuçlarının olması beklenirdi. Ancak durum böyle değildir. β3 olmayan fareler veya kişiler yaşayabilmektedir ve fertildir. Tıpkı β5, β6 yada β3, β5 veya β6 çiftlerinin çeşitli kombinasyonlarının bulunmadığı fareler ve kişiler gibi. Üstelik, αv’si bulunmayan fareler de yaygın bir angiogenez göstermektedir [48]. Bu fareler beyinlerinde vaskuler defektler sergilerler ancak kanıtlar bunun, vaskuler hücrelerin kendilerindeki defektlerden çok beyin parenkim hücrelerinin beyin vaskulatürü ile olan etkileşimlerindeki defektlerden kaynaklandığını göstermektedir.β8 bulunmayan (β8-null) fareler buna çok benzer defektler göstermektedir. Bu durum, söz konusu fenotipin αvβ8 kaybından kaynaklandığını düşündürmektedir. Tam tersine, β3/β5-çift null fareler bu defektleri sergilememektedirler ve canlılıklarını sürdürebilmekte ve 25

fertil özellikler gösterebilmektedir. Bu durum, αvβ3 ve/veya αv/β5’in angiogenez için gerekli olmadığını kanıtlamaktadır.

Tümör angiogenezinin αvβ3 ve/veya αv/β5’e selektif bir şekilde bağımlı olabilme olasılığı vardır ancak Reynolds ve arkadaşları yakın bir zaman önce bunun doğru olmadığını göstermişlerdir [49]. Gerçekten de, bu integrinlerden birinin yada her ikisinin bulunmadığı fareler artmış, hızlanmış bir tümör büyümesi ve hızlanmış bir angiogenez göstermektedir [49]. Bu durum, söz konusu integrinlerin proangiogenik oldukları fikrini desteklemekten çok, bunların anti-angiogenik oldukları yada angiogenezin önemli uzunluktaki bir zaman dilimi boyunca en azından negatif regülatörleri (düzenleyicileri) oldukları hipotezinin doğmasına neden olmaktadır.

Yukarıda belirtilen αv integrinler ve angiogenez örneğinde, genetik sonuçlarla bu integrinleri hedef alan antikorlar yada düşük molekül ağırlıklı reaktanlar kullanılarak elde edilen sonuçlar arasında bir tutarsızlık vardır. Angiogenezde yer alan diğer integrinlerle ilgili veriler birbiriyle tutarsız değildir. α5β1 integrini ve onun ligandı olan fibronektin kesinlikle proangiogeniktir. Bunlardan birinin genetik ablasyonu majör vaskuler defektlerle birlikte embryonik lethaliteye yol açmaktadır.Ve bunlardan birine karşı gelişen antikorlar yada birbirleriyle olan etkileşimlerini bloke eden peptidler angiogenezi inhibe ederler [50]. Kollajen reseptörü integrinlerinden 2 tanesi olan α1β1 ve α2β1 de genel olarak uyumlu sonuçlar vermektedir. Bu integrinlerin her ikisi de angiogenik büyüme faktörleri tarafından upregüle edilirler ve bu integrinlere karşı gelişmiş olan antikorlar tümörle-indüklenmiş angiogenezi inhibe ederler.α1-null fareler bu sonuçlara uygun bir şekilde, azalmış tümör büyümesini ve angiogenezi desteklemektedir.

Genetik sonuçların integrinlerin karmaşık fonksiyonları nedeniyle integrinlerin önemini olduğundan daha düşük düzeyde gösterebileceği akılda tutulmalıdır..Genetik veriler, αvβ5’in αvβ3 eksikliğini kompanze edemediğini göstermektedir ve diğer integrinlerin upregulasyonu konusunda herhangibir kanıt mevcut bulunmamaktadır [49]. Dolayısıyla bu integrinler arasında bir kompanzasyon henüz belirlenememiştir. Ancak bilinmeyen bazı formlardaki kompanzasyon olasılığı da tam olarak elimine edilememektedir. Gelecekte, hücre tipine spesifik ve/veya regüle edilmiş gen ablasyonunun kullanılacağı çalışmalar bu noktada ek bilgiler sağlayabilir. Yine de, şu an için genetik çalışmalardan elde edilmiş kesin olan bilgi, αv integrinlerin angiogenez için gerekli olmamalarına rağmen α5β1 ve fibronektinin angiogenez için gerekli olduklarıdır. αv integrinler negatif regulatörler olarak nasıl etki edebilmektedir? Her biri, bu integrinlerin bilinen özellikleri üzerine kurulu olan çeşitli modelleri düşünebiliriz. αvβ3 ve αvβ5 integrinlerin bir grup negatif regulatuar modeli, bu molekülleri bilinen negatif regulatuar 26

moleküllerin birer reseptörü olarak ele almaktadır (Şekil 6). Thrombospondin (TSP-1), angiogenezin iyi belirlenmiş bir negatif regulatörüdür [51]. Transforming growth factor-β’nın (TGF-β) aktivatörü olarak ve matriks metalloproteinaz-9 (MMP-9) aktivasyonunun negatif bir regulatörü olarak etki edebilir. TGF-β da sonuçta, metalloproteinazların doku inhibitörlerini (TIMP’leri) upregüle eder ve MMP-9 da sekestre edilmiş olduğu depolardan VEGF salgılanmasını uyarabilme özelliği sayesinde angiogenezi aktive ettiği bilinen bir faktördür.

Böylece VEGF’nin reseptörüne bağlanabilmesine ve onu aktive edebilmesine imkan vermektedir [30]. TSP-1 ayrıca endotel hücrelerinde bulunan CD36 reseptörlerine de bağlanabilir ve apoptotik yolakları aktive edebilir. Bu mekanizmalar thrombospondin’in anti-angiogenik etkilerini kısmen yada tamamen açıklayabilse de açıklayamasa da, çeşitli çalışmalar TSP-1 ve TSP-2’nin kesinlikle angiogenezi suprese ettiğini göstermiş bulunmaktadır [29]. αvβ3, TSP-1 ve TSP-2 için reseptör şeklinde etki gösterebildiği için bu moleküllerin etkilerine aracılık ederek ve dolayısıyla antiangiogenetik etkilerine de katkıda bulunarak fonksiyon gösteriyor olabilir. Çeşitli araştırma grupları αvβ3’ün ayrıca, antiangiogenik faktörler olarak etki eden ECM (ekstrasellüler matriks) proteinlerinin çeşitli proteolitik fragmanlarının bir reseptörü olma konusunda da sorumlu tutmuşlardır [45]. Maeshima ve arkadaşları bunu en kesin bir şekilde, tip IV kollajen α3 zincirinin bir fragmanı olan tumstatin için göstermişlerdir [52]. Tumstatin endotel hücrelerinde protein sentezini inhibe etmek, apoptosisi indüklemek ve angiogenezi inhibe etmek üzere αvβ3, fosfatidilinositol-3 (PI3) kinaz, protein kinaz B (PKB/Akt) ve rapamisin’in memelilerdeki hedef molekülü (mTOR) üzerinden etki gösterir [52]. Tumstatin ve diğer ECM fragmanları gerçekten de angiogenezin endojen negatif regülatörleri şeklinde etki ediyorlarsa, bu durumda kesin olmayan bir olasılık bunların αvβ3 yada diğer integrinler üzerinden etki ediyor olabilecekleri olasılığıdır .αvβ3, MMP-2’yi aktive ederek bu ECM fragmanlarının üretilmesinde de yer alabilmektedir ve MMP-2 de kendi kendisini parçalayarak yine αvβ3 üzerinden etki gösteren antiangiogenik bir fragman olan PEX’i oluşturabilmektedir [53].

Bazı araştırmacılar da integrinlerle büyüme faktörü reseptörleri arasındaki karşılıklı etkileşimlerden bahsetnektedir.Örneğin αvβ3’ün VEGF reseptörü olan flk-1’i (VEGFR2 yada KDR olarak da bilinen) downregüle edebildiğini ve bunun, angiogenezin negatif feedback regulasyonunda yani düzenlenmesinde normal bir mekanizma olabileceği gösterilmiştir. Bu modelde, β-3 eksikliği bulunan farelerde bu negatif feedback mekanizmasının olmaması VEGFR2’nin upregulasyonuna ve bu farelerde görülen artmış angiogeneze katkıda bulunabilen artmış VEGF duyarlılığına imkan vermektedir.

27

Şekil5 αvβ3 defektif farelerde retinal neovaskülarizasyonun artığı gösterilmiştir. αvβ3 ve αvβ5 tarafından negatif regulasyon için bir diğer çok mantıklı model endotel hücrelerinde

diğer

proangiogenik

integrinlerin

(α5β1,

α1β1,

α2β1)

inhibisyonunu

ilgilendirmektedir (şekil 6b). Diaz-Gonzalez ve arkadaşları, α5β1 ve α2β1’in, αvβ3’ün yakın bir akrabası olan αIIbβ3 tarafından negatif regulasyonunu kesin bir şekilde demonstre etmişlerdir αIIbβ3’ü spesifik olarak hedef alan moleküllerin aynı hücrelerde yani endotel hücrelerinde α5β1 ve α2β1 fonksiyonlarını (indirekt bir şekilde) inhibe ettiğini gösterilmiştir(54). α,vβ3’e karşı gelişmiş antikorların α5β1’in fagositozdaki ve hücre migrasyonundaki rolünü inhibe edebildiğini gösteren kanıtlar da mevcuttur [55]. αvβ3 ve/veya αvβ5’e yönelik reaktanların, bu integrinlerin bazı proangiogenik etkilerini inhibe ederek değil daha ziyade, fibronektin ile bağlantılı olan α5β1 gibi diğer bazı integrinlerin iyi belirlenmiş proangiogenik rollerini indirekt bir şekilde inhibe ederek etki gösteriyor olabilmeleri de oldukça mantıklıdır. İntegrinlerin apoptosis regülatörleri olarak potansiyel rolünü de düşünmemiz gerekmektedir. . Oldukça sağlam kanıtlarla desteklenen Klasik görüşe göre integrin bağlanması hücre sürveyi için bir sinyal sağlamakta (PI3 kinaz-Akt yolağı üzerinden) ve hücreler yaşamak için bu tutunmaya bağımlılık göstermektedir.Bu görüşe göre, integrin aracılı adhezyonlarını yitirdiklerinde apoptosise uğramaktadırlar.Bu tür integrin her türlü angiogenez inhibisyonunda görülen apoptosise katkıda bulunup bulunmadığı belli değildir.. Cheresh ve Stupack, bu “integrin aracılı ölümün” β-3 eksikliği bulunan farelerde görülen artmış angiogenezi açıklayabileceğini öne sürmüşlerdir [56].

Bu moleküllerin kendilerinin antiangiogenik olabileceklerine inanmak için yeterli miktarda iyi kanıtlar mevcuttur. Bu integrinlerin, angiogenezin farklı fazlarında hem pozitif hem de negatif rollerinin olabilmesi ve/veya pozitif ve negatif sinyallerin dengeleyicileri yada entegre

28

edicileri şeklinde etki edebilmeleri oldukça mantıklıdır. Ancak genetik veriler, rollerinin daha çok negatif regulatör olmak şeklinde olduğunu düşündürmektedir. (54)

ŞEKİL 6 a,b Fonksiyonlarının en azından bir kısmını integrinler üzerinden gösterdikleri düşünülen bazı moleküller gösterilmiştir..

EKSTRASELÜLER MATRİKS VE ANGİOGENEZ Angiogenez sırasında endotel hücrelerinin ekstrasellüler matriksden (ECM’den) migrasyonu ve invazyonu, integrin ailesine mensup olan hücre adhezyon moleküllerinin şefliğinde olmaktadır. Çeşitli integrinler, ECM’de bulunan kollajen, fibronektin, fibrinojen, laminin, fibronektin, vitronectin ve von Willebrand faktörü gibi adhezyon proteinleri ile etkileşime girerek migrasyonu kolaylaştırırlar. Bu proçes, proteolitik enzimler olan doku metalloproteinazlarının metalloproteinazların

(MMP’lerin) doku

inhibitörleri

sekresyonuyla (TIMP’ler)

potansiyalize tarafından

modüle

edilirken (kontrol)

edilmektedir. Endotelyal hücre proliferasyonu, integrin ailesine ait adhezyon reseptörleri aracılığıyla düzenlenen endotelyal tutunmaya bağımlı bir şekilde gerçekleşmektedir.

Gelişmekte olan kan damarlarında FGF2 ve tümör nekroz faktörü α -(TGF-α) ,αvβ3 ekspresyonunu indüklerken VEGF ve transforme edici büyüme faktörü- α (TGF-α) αvβ5’i indüklemektedir [57]. αvβ3

[58] ve αvβ5’ [59] integrinlerinin ekspresyonu AMD’li

hastaların CNV’sinde saptanmaktadır. αv integrinlerinin siklik bir peptid antagonisti, bir fare modelinde normal vasküler yapıyı bozmadan retinal neovaskularizasyonu inhibe

29

etmiştir [60]. αvβ3 integrin’ine karşı geliştirilmiş ve mitomycin C-dextran ile konjuge edilmiş monoklonal bir antikor bir sıçan modelinde deneysel CNV’yi inhibe etmiştir [61].

MMP’ler, neovaskuler proçeslerde ECM’nin remodeling’i ile ilişkili olan bir enzim ailesidir. AMD’li hastalarda CNV membranlarında çeşitli MMP’ler eksprese edilmektedir ve VEGF, MMP üretimini indükleyebilmektedir [62]. MMP-2 yeni vaskuler proliferasyon alanlarına lokalize olurken MMP-9 ekspresyonu en fazla, CNV membranlarının kenarlarında olmaktadır [63]. Bu durum, sinerjik bir enzim etkisini düşündürmektedir.

Tümör

progresyonundan

sorumlu

tutulan

MMP-7,

CNV

membranlarının

Bruch

membranında eksprese edilmektedir [64]. Laserle indüklenmiş CNV modelinde MMP-9 ekspresyonu upregüle edilmektedir ve MMP-9 eksikliği bulunan farelerde daha düşük oranlarda laserle indüklenmiş CNV olmaktadır [65].

RPE tarafından üretilen TIMP-3 (metalloproteinaz doku inhibitörü), Bruch membranının bir ECM komponentidir. TIMP-3, vaskuler endotel hücrelerinin VEGF ve FGF2’ye doğru kemotaksisini inhibe eder, in vitro koşullarda kapiller morfogenezini ve kollajen jel invazyonunu inhibe eder ve in vivo olarak FGF-2 ile indüklenmiş angiogenezi inhibe eder [66]. Makuler alanda Bruch membranındaki TIMP-3 içeriği normal yaşlanma sırasında belirgin bir artış gösterir. AMD’li gözlerdeki TIMP-3 içeriği de, yaşa-göre eşleştirilmiş normal gözlerle karşılaştırıldığında yükselmiştir. Yükselmiş TIMP-3 düzeyleri, AMD’de gözlenen Bruch membranı kalınlaşmasına katkıda bulunabilir.

TIMP-3 endotel hücre motilitesini inhibe eder [66]. TIMP-3 geninin RPE tarafından virüs aracılı bir şekilde aşırı eksprese edilmesi, sıçanlarda laserle indüklenmiş CNV gelişimini inhibe etmiştir . Bu modelde, MMP-2 mRNA ekspresyonu laser fotokoagulasyon sonrasında belirgin bir artış göstermiş ve esas olarak koroidi, subretinal boşluğu ve iç retinayı invaze eden makrofaj-benzeri ve RPE-benzeri hücrelere lokalize olmuştur. Buna göre, MMP-2 eksikliği bulunan farelerde azalmış oranlarda laserle indüklenmiş CNV olmaktadır [67].

AMD hastalarının subretinal boşluğunda artmış miktarlarda MMP-2’nin ve yaşın ilerlemesiyle Bruch membranında artan MMP-2 ve MMP-9 düzeylerinin bildirilmiş olmasına rağmen[68], tespit edilen enzimler hemen hemen tamamen inaktif durumda bulunmuştur. Dolayısıyla bu enzimlere direkt olarak patojenik bir rol atfetmek zordur. İnaktif MMP’lerin akümülasyonunun, olayın nedeni olmaktan çok Bruch membranındaki remodeling’in bir sonucu olabilme olasılığı daha yüksektir. Kollajenin ve diğer ECM

30

komponentlerinin artan depozisyonu MMP’lerin sentezini indükleyebilir; ancak, artmış TIMP konsantrasyonları ve Bruch membranının azalmış porositesi (gözenekliliği), MMP’lerin

aktivasyonunu

önleyebilir

ve

diffüzyonlarını

kısıtlayabilir.

MMP

aktivasyonunun CNV’ye katkıda bulunup bulunmadığı henüz tam anlaşılamamıştır.

RPE hücrelerinin kendi ECM’siyle etkileşiminin bozulması neovaskülarizasyon rol oynayabilir. RPE hücrelerinin vitronektin’e adhezyonu  αvβ5 aracılığıyla, ve fibronektine adhezyonları da α5β1 aracılığıyla düzenlenmektedir. Solubl vitronektin, fibrinogen ve fibronektin RPE hücrelerinin VEGF salgılamalarını stimule etmektedir. Bu proçes, thrombospondin-1 (TSP1) tarafından potansiyalize edilir. TSP1, RPE hücrelerinde bu hücrelerin proliferatif durumlarıyla ilişkili bir şekilde üretilir ve CNV’nin modüle edilmesinde rol oynayabilir. plateletler ve monositler tarafından da üretilir . TSP-1 ayrıca, αvβ5

ve α5β1 integrinlere bağlanmaya bağımlı olan VEGF sekresyonunu

da

indüklemektedir. Bu veriler ECM ,  αvβ5 ve α5β1 integrinlerin RPE’den VEGF salgısının potansiyel bir modulatörü rolünün söz konusu olduğunu düşündürmektedir [69].

TSP-1 Zıt gibi görünmekle beraber endotel hücre proliferasyonunu, migrasyonunu ve angiogenezi de inhibe etmektedir. Platelet kökenli TSP-1, sıçanlardaki bir ROP modelinde angiogenezi inhibe etmiştir. Sığır retinal mikrokapiller endotel hücrelerinde, VEGF bifazik bir TSP-1 ekspresyonu yanıtını indüklemektedir: başlangıçta bir downregulasyon ve ardından belirgin bir upregulasyon olmaktadır. VEGF ile indüklenmiş endotel hücre proliferasyonu ekzojen TSP-1 ile inhibe edilirken anti-TSP-1 antikoru ile potansiyalize

edilmektedir.

Dolayısıyla,

iskemik

retinada,

iskemiyle

indüklenen

angiogenezde VEGF aracılı TSP-1 indüksiyonu negatif bir feed-back mekanizması olabilir [70].

VEGF’LERİN VE VEGFR’LERİNİN FİZYOLOJİSİ 1- Embriyoda Vaskulatürün gelişimi, embriyogenez dönemi boyunca organ gelişiminde ve diferansiyasyonunda temel, zorunlu bir gerekliliktir. Hemangioblast aşamasından kompleks bir vaskuler ağ aşamasına kadar olan vaskulatür gelişimi değişik aşamalarla karakterizedir. Bu fazların her birinde VEGF-A’nın önemli bir rol oynadığı öne sürülmektedir. Bu görüş in vitro ve in vivo çalışmalarla desteklenmektedir. Farelerde VEGF-A’nın tek bir allelinin hedefli inaktivasyonu vaskuler gelişimin lethal bir şekilde bozulmasına neden olur ve bu fareler embriyoda 11.günün ötesinde yaşamlarını sürdürememektedir.(71) Bu gözlem, VEGF-A’nın ve

31

VEGF/

VEGFR

sinyallemesinin

normal

vaskuler

morfogenez

açısından

önemini

vurgulamaktadır ve VEGF/ VEGFR sinyallemesinin bozulmasından kaynaklanan etkilerle ilgili in vivo çalışmalarla doğruluğu gösterilmiştir. (72).

VEGF-A ekspresyonu ilk olarak, implantasyondan sonraki bir kaç gün içinde trofoblast dev hücrelerinde saptanabilmektedir. Farelerdeki daha ileri gelişim dönemlerinde VEGF-A mRNA’sı kalp, böbrek, spinal kord ve beyin gibi çeşitli organlarda eksprese edilmektedir.

Gelişmekte olan fare beyninde en yüksek VEGF-A mRNA düzeyleri choroid pleksusta ve ventriküler epitelde saptanmaktadır. İnsan fetüsünde gestasyondan 16 – 22 hafta sonra VEGF-A mRNA’sı hemen hemen bütün dokularda tespit edilir ve en bol şekilde akciğerlerde, böbreklerde ve dalakta eksprese edilir.

Gen hedefleme çalışmaları, her 3 VEGFR geninin embryonik vaskulatürün normal gelişimi için esansiyel olduğunu demonstre etmiştir. Ancak bu 3 reseptörün endotelyal hücre proliferasyonu ve diferansiyasyonundaki rolleri birbirinden farklı gibi görünmektedir.

VEGFR-1 açısından defektif olan fareler embryoda 8,5 – 9.5.cu günler arasında ölmektedir. Embriyonik yerlerde endotel hücreleri gelişir ancak bu hücreler normal vaskuler strüktürlere gelişim gösteremezler.Perisitlerin migrasyonunda ve proliferasyonunda yer alan PDGF-B ekspresyonundan veya reseptör geninden yoksun olan farelerde perisitleri bulunmayan kapillerler ve ayrıca endotelyal hücre hiperplazisi olabilmektedir. Bu yüzden, endotel hücrelerinin anormal şekilde büyümesi ve çoğalması, VEGFR-1 defektif farelerde gözlendiği gibi, VEGFR-1 yokluğunun bir sonucu olarak perisitlerin kaybına yada disfonksiyonuna bağlı bir durum olabilir. Bu görüş, VEGFR-1’in baskın olarak bir perisit reseptörü olabileceği şeklinde yorumlanmaktadır.

VEGFR-2 açısından defektif olan fareler de embriyoda 8,5 – 9,5.ci günler arasında ölürler. Bu farelerde vaskulogenez görülmez ve kan adacıkları gelişmez. Hematopoietik prekürsörler şiddetli bir şekilde hasara uğramıştır ve embriyoda ve yolk kesesinde organize kan damarları gelişememektedir.

VEGFR-3 açısından defektif fareler embriyoda 9,5.ci günde ölürler. Bu farelerde vaskulogenez ve angiogenez gerçekleşir ancak büyük kan damarları defektif lümenlerle anormal şekilde organize hale gelerek perikard kavitesinde sıvı akümülasyonuna (birikimine) ve kalp yetmezliğine yol açar .

2- Erişkinlerde VEGF-A erişkinlerde menstruel siklus gibi fizyolojik angiogenezin görüldüğü yerlerde rol oynar.VEGF-A mRNA’sı ayrıca, sağlıklı erişkin insanlarda angiogenez göstermeyen çeşitli

32

dokularda da eksprese edilmektedir. Örneğin beyinde choroid pleksus epitelinde ve böbrekte glomeruler epitelde, gastrointestinal mukozada ve saç foliküllerinde olduğu gibi. VEGF-A’nın endotel hücrelerine çok yakın konumda bulunan epitel hücreleri tarafından üretilmesi oldukça dikkat çekicidir. VEGF-A’nın endotel hücre bütünlüğünü anti-apoptotik sinyalleme yoluyla sürdürdüğü öne sürülmektedir. VEGF-A umblikal kord venöz endotel hücrelerinde en azından kısmen de anti-apoptotik kinaz olan Akt/PKB’yi PI3-kinaza bağımlı yolak aracılığıyla aktive ederek inhibe etmektedir. VEGF-A’nın endotel hücre sürveyi üzerindeki uzun dönemli etkileri muhtemelen, upstream caspase’ların aktivasyonunu inhibe eden ve “apoptosis inhibitörleri” ailesinin üyelerini upregüle eden anti-apoptotik proteinlerden bcl-1 ve A1 upregülasyou aracılığıyla düzenlenmektedir (73).

Diğer taraftan, rodentlerde VEGF-A aktivitesi inhibe edildiğinde, doku morfolojisinde yada vaskulatürde kısa vadede gross etkiler görülmemektedir. Bu durum, VEGF-A’nın dokuların sürdürülmesinde esansiyel olmadığını düşündürmektedir.

Kısa bir süre önce, VEGF-A’nın in vitro koşullarda retinal pigment epiteli (RPE) hücreleri tarafından basal tarafa doğru salgılandığı gösterilmiştir. (Şekil 7). Ayrıca, in vivo koşullarda RPE hücrelerine bakan taraftaki koriocapillaris endoteli üzerinde her 3 VEGFR’nin birden eksprese edildiği demonstre edilmiştir.(Şekil 7).(74) İnsan gözünde RPE hücreleri kaybının yada deneysel hayvan modellerinde RPE’nin deneysel olarak yıkılmasının koriokapiller atrofisine neden olduğu bilinmektedir.Bulgular, RPE kökenli VEGF-A’nın sessiz/inaktif koriokapillaris endoteli için bir permeabilite/sürvey faktörü şeklindeki rolü ile uyumludur. Buna uygun olarak, diğer epitellere yakın bir komşuluk halinde bulunan çeşitli endotellerde VEGFR’lerin ekspresyonunu da saptanmıştır. Bunlar sadece koroid pleksus veya böbrek glomerüllerindeki endotel hücrelerini değil aynı zamanda gözdeki silier proçeslerin kapillerlerini, karaciğerin biliyer traktüslerindeki kapillerleri, saç foliküllerinin etrafındaki ve gastrointestinal sistemdeki lamina propriada bulunan kapillerleri de içermektedir .(75). VEGFA hipoksi ile yüksek düzeyde upregüle edildiği için bulguların da düşündürdüğü gibi parakrin bir ilişki, bu epitel hücrelerinin fizyolojik koşullarda damar formasyonunu arttırarak yetersiz doku oksijenizasyonuna uyum sağlayabilmesi için bir feedback mekanizması sağlamaktadır.Bu tür bir feedback mekanizmanın hasar uğraması veya anormal feedback ile eksüdatif AMD’de görülen kontrolsüz angiogenezde olduğu gibi hastalıklara neden olmada önemli olabilir. Bu bulgular, VEGF’lerin sessiz/inaktif dokulardaki fizyolojik fonksiyonlarının daha iyi anlaşılması açısından önemlidir.

33

Şekil 7 B ‘de VEGF’ in normoksik koşullarda dağılımı(kırmızı) C,D,E ‘de VEGFR lerin hipoksik koşullarda RPE ye doğru polarizasyon gösterdiği gösterilmiştir VEGF İLE İNDÜKLENEN ANGİOGENİK YANITIN BASAMAKLARI Angiogenez endotel hücre bölünmesini, migrasyonunu, eski bazal membranın yıkımını ve yenisinin sentezlenmesini, tüpler halinde organizasyonu, perisitlerin kazanılmasını ve muhtemelen henüz tanımlanamamış olan diğer bazı aşamaları içeren çok aşamalı bir süreçtir.

Bu yüzden, angiogenezin endotel hücre bölünmesi veya migrasyonu gibi tek bir komponentini ölçen in vitro testler sadece kısıtlı bir bilgi sağlayabilmektedir. Angiogenezin eninde sonunda in vivo olarak çalışılması zorunludur çünkü normal ve patolojik dokularda bulunan çeşitli farklı tiplerdeki kan damarlarının sadece yaşayan, canlı bir organizmada oluşturulabilmesi beklenmektedir. Ancak angiogenezin in vivo olarak çalışılabilmesi zordur. Bu konuda faydalı bir yaklaşım, angiogenik sitokinleri eksprese edecek şekilde genetik mühendisliğe tabi tutulmuş olan replike-olmayan adenoviral vektörlerin kullanıldığı yaklaşımdır [23]. Bu vektörler, bütün fare dokularına enjekte edilebilir ve konaktaki hem bölünen hem de bölünmeyen hücreleri hızlı

34

bir şekilde enfekte edebilirler. Enfekte hücreler sitokin mRNA’sını ve proteinini haftalar boyunca oldukça kararlı düzeylerde eksprese ederler. Adenoviral vektörler konak genomuna entegre olmadıkları için sitokin ekspresyonu eninde sonunda kesilir ancak aslında bu bir avantaj olabilir çünkü sitokin çekilmesinin yeni oluşmuş kan damarları üzerindeki etkisinin incelenmesine imkan vermektedir. Virüs dozunun ayarlanmasıyla sitokin ekspresyonu kolaylıkla modüle edilebilir.Bu yaklaşım uygulanarak, tümörlerde ve iyileşmekte olan yaralarda indüklenen çeşitli anormal damar tiplerine yapısal ve fonksiyonel açıdan yakından benzerlik gösteren yeni damarlar in vivo koşullarda oluşturulabilmiştir. [76].

Ad-VEGF-A 164 (adenoviral) ile indüklenen angiogenik yanıt VEGF-A 164/5, patolojik angiogenezden en sık şekilde sorumlu tutulmuş olan sitokindir. Fare VEGF-A 164’ünü eksprese eden adenoviral vektörler (Ad- VEGF-A 164), farelerde ve sıçanlarda çok çeşitli normal dokularda görülene kantitatif olarak çok benzeyen son derece tekrarlanabilir, doza- ve süreyebağımlı angiogenik bir yanıtı indüklemektedirler [76]. İlk yanıt (1 – 3 gün içinde görülen) vaskuler hiperpermeabiliteden, fibrin birikimi ve ödemden, ve ayrıca “ana” damarların formasyonundan oluşmaktadır [76]. Ekstravaskuler fibrin jelinin formasyonu için, fibrinogenin ve diğer pıhtılaşma faktörlerinin ekstravazasyonuna ve ayrıca pıhtılaşma sisteminin aktivasyonuna izin verecek sızıntı yada kaçak yapan kan damarlarının varlığı gerekmektedir. tümör hücrelerinde ve diğer pek çok normal doku hücresinde eksprese edilen bir prokoagulan olan doku faktörü tarafından plasma sızıntısının gerçekleşmesinden sonraki dakikalar içinde pıhtılaşma tetiklenmektedir [77]. Doku faktörü, pıhtılaşma faktörlerinden factor XIIa ile ve daha sonra da ekstravaze olan diğer pıhtılaşma faktörleri ile reaksiyona girerek trombus oluşumuna, fibrinogenin fibrine pıhtılaşmasına ve daha sonra da fibrinin aktive olmuş factor XII ile çaprazbağlanmasına yol açar. Çapraz-bağlanmış olan fibrin bir kez depozisyona uğradıktan sonra tümörlerde, iyileşmekte olan yaralarda ve enflamasyonda olduğu gibi ödematöz, proangiogenik bir stromal matriks sağlayan bir jel oluşturur.

VEGF-A164 ile İndüklenen Yeni Kan Damarları Ad- VEGF-A164 ile indüklenen angiogenik yanıt, en az 4 farklı tipte yeni kan damarının formasyonuna yol açar (ana damarlar, küçük kız kapillerler, glomeruloid cisimcikler (GB) ve vaskuler malformasyonlar [23,76] (Şekil 8).

35

Şekil 8 VEGF ile indüklenen yanıtta oluşan dört esas damar yapısı görülmektedir. a-Ana damarlar Oluşan ilk yeni kan damarları “ana” damarlardır. Bu isim iyileşmekte olan cilt yaralarında ve myokard infarktüslerinde, tümörlerde, enflamasyonda vb yaygın bir şekilde saptanan özgün bir damar tipine vermiş olan bir isimdir . Ana damarlar, önceden var olan mikrodamarlardan ve özellikle de primer (esas) olarak venüllerden köken alan büyük ölçüde genişlemiş, ince-duvarlı, kıvrımlı, perisitten-fakir, hiperpermeabl, güçlü şekilde VEGFR-pozitif sinusoidlerdir [23,76].

Yavaş ve turbulan bir kan akımı ile karakterizedirler ve trombus oluşumuna yatkındırlar. Ana damarlar, normal fare dokularına Ad- VEGF-A 164 enjeksiyonundan sonra ilk olarak 18 – 24.saatte ortaya çıkarlar ve daha sonraki ~5 günlük dönem boyunca gelişmeye devam ederler.

Vaskuler basal membran yıkımını, perisit ayrılmasını ve endotel hücrelerinin yayılıp incelerek büyük ölçüde genişlemiş bir yüzey alanını kaplamalarını içeren bir proçes sonucunda meydana gelirler. Endotel hücre bölünmesi daha sonra 2 – 3 gün içinde başlar.

Vaskuler bazal membran, mikrodamar büyümesi, genişlemesi için önemli bir engel teşkil etmektedir çünkü bu basal membran, vaskuler genişlemeyi kesit alanının ~%30’una sınırlandıran non-kompliant ( elastik olmayan) bir yapıdır.Bu nedenle, vaskuler basal membranda meydana gelen değişikliklerin ana damar formasyonu ile birlikte görülen yaygın mikrodamar artışlarına uyum sağlaması gerekmektedir. Bu değişiklikler için muhtemelen

36

proteoliz gerekmektedir ve VEGF-A’nın, vaskuler basal membranı yıkan

endotel hücre

proteazlarını upregüle edebildiği bilinmektedir [78].

Basal membran yıkımı sonucunda meydana gelen büyük ölçüde artmış yüzey alanını

kaplamak

için

endotelyal

hücrelerinde

plasma

membranı

ekspansiyonuna

(genişlemesine) de ihtiyaç duyulmaktadır. Son aşamaya başlangıçta, sitoplazmik bir organel olan vezikülo-vakuoler organelin (VVO) membranlarının hücre yüzeyine transfer edilmesi eşlik etmektedir. VVO’lar, venuler endotelyal hücre sitoplazmasını lümenden ablümene kadar kateden birbirleriyle bağlantılı, kaplı olmayan vezikül ve vakuollerdir . VVO’lar, makromolekül ekstravazasyonu için VEGF-A ile düzenlenen trans-sellüler bir yolak sağlamaktadır [79]. Aynı zamanda, damar genişlemesine imkan vermek için endotel hücre yüzeyi alanını arttırmak üzere hızlı bir şekilde mobilize edilebilecek intrasellüler bir membran deposu görevi de görürler.

Normal venüler endotel hücreleri VVO’larında, plasma membranında bulunanın 2.5 katına eşdeğer miktarda membran depolarlar. Dolayısıyla VVO membranlarının hücre membranına transferi (aktarılması, taşınması), yeni bir membran sentezine gerek olmadan endotel hücresinin çevresinde 3 kattan daha fazla bir artışa uyum sağlanabilmesine imkan sağlar. Bu membran transferine uygun olarak, ana damarlarda büyük ölçüde azalmış VVO vezikülleri ve vakuolleri bulunmaktadır. b-Ana damar kaynaklı kız kapillerler Ana damarlar, çeşitli farklı “kız” damar tiplerine dönüşen geçici oluşumlardır. Pek çoğu, endotel hücrelerinin ana damar lümenlerine ve ana damar lümenleri boyunca çıkıntı yaparak kan akımını çok sayıda daha küçük çaplı kanallara ayıran

translüminal köprüler

oluşturan bir internal bölünme proçesi ile daha küçük boyutlardaki kapiller-benzeri kanallara bölünürler. Birkaç günlük bir dönem içinde bu yapılar birbirlerinden ayrılarak tek tek, küçük çaplı kız kapillerler oluştururlar [23,76]. İlk olarak tümör vaskulatüründe tanımlanan Bridging (köprüleşme) iyileşmekte olan cilt yaralarının ana damarlarında ve kronik vasodilatasyona yanıt olarakda gözlenmiştir. c-Glomeruloid cisimler Glomeruloid mikrovaskuler malformasyonlar olarak da adlandırılan Glomeruloid cisimcikler (GB), Ad-VEGF-A164 uygulanmasından yaklaşık olarak 7 gün sonra ortaya çıkmaya başlayan bir diğer ana damar türevidir [76]. GB’ler, renal glomerüllere benzeyen kötü şekilde organize olmuş vaskuler yapılardır. (bu yüzden glomeruloid adını almışlardır) GB’ler, ana damarların endotel tabakalarında primitif, CD31(+) hücre kolleksiyonları şeklinde görülmeye başlar [80]. Bu hücrelerin lokal olarak mı ortaya çıktıkları yoksa kemik iliğinden mi köken aldıkları belli değildir. Kökenleri ne olursa olsun hızlı bir şekilde prolifere olurlar, ve hem ana 37

damar lümenine hem de dışarıda ekstravaskuler konnektif dokuya doğru projekte olurlar.

Replike olan perisitler bu hücrelere eşlik ederler. GB’ler için sürekli bir ekzojen VEGF-A 164 desteği gereklidir ve VEGF-A 164 ekspresyonu azaldıkça, hem apoptosisi hem de normal görünümdeki kapillerlere re-organize olmayı içeren bir süreçle gerilerler. [80]. d-Vasküler malformasyonlar Vaskuler malformasyonlar, ana damar soyunun üçüncü bir şeklidir. Ana damarların düz kas hücreleriyle ve/veya perivaskuler fibrosis ile düzensiz bir şekilde kaplanmasıyla oluşurlar [23]. Bu tanımlamaya uyan damarlar hastalarda saptanan vaskuler malformasyonlara yakın bir benzerlik gösterir.Bu, söz konusu malformasyonların oluşumundan aşırı VEGF-A ekspresyonunun sorumlu olabileceğini düşündürmektedir. Vaskuler malformasyonlar ana damarların ve GB’lerin aksine, farelerde bir kez oluştuktan sonra VEGF-A 164 ekspresyonunun kesilmesinin ardından sonsuza kadar (1 yıldan daha uzun bir süreyle) persistan kalırlar.

Dolayısıyla GB’ler, ekzojen VEGF-A 164’dan bağımsız bir hale gelirler.

VEGF-A164 ile indüklenmiş angiogenezin genel

süreci şekil 8’de şematik olarak

özetlenmiştir.

BAZI MOLEKÜLLERİN ANGİOGENEZDE ROLÜ A-FGF (FİBROBLAST GROWTH FAKTÖR)

CNV veya neovaskülarizasyondan sorumlu tutulan tek büyüme faktörü VEGF değildir. Bazik fibroblast büyüme faktörü (FGF2), cerrahi yolla çıkartılan CNV membranlarındaki RPE hücrelerinde mevcuttur. FGF2 mRNA’sı sıçanlardaki laserle indüklenmiş CNV lezyonlarında bulunan fibroblastlarda, RPE’de ve koroidal vaskuler endotel hücrelerinde upregüle edilmektedir [81]. Subretinal pelletlerden sürekli FGF2 salgısı domuzlarda

ve tavşanlarda CNV’yi indüklemektedir. Ancak FGF2 geninin

hedeflenmiş bir şekilde hasara uğratılması farelerde laserle indüklenmiş CNV gelişimini inhibe etmemiştir. Bu durum, FGF2’nin CNV gelişimi için gerekli olmadığını düşündürmektedir [82].

FGF2’nin CNV’deki rolü, fotoreseptörleri ve RPE hücrelerini parçalayan bu hücrelerin intrasellüler içeriklerini açığa çıkartan düşük şiddette laser fotokoagulasyonu ve Bruch membranını parçalayan ve koriokapillerlere zarar veren yüksek yoğunlukta laser fotokoagulasyonu kullanılarak daha ileri düzeyde

aydınlatılmıştır. Düşük yoğunluktaki

laser fotokoagulasyon, fotoreseptörleri aşırı miktarda FGF2 ekspresyonu yapan farelerde CNV oluşturmazken yüksek yoğunluktaki laser fotokoagulasyonu CNV oluşturmuştur. Bu

38

veriler

retinal aşırı FGF2 ekspresyonunun tek başına vaskülarizasyon için yeterli

olmadığını, beraberinde selüler hasar var ise angiogenik olduğunu düşündürmektedir.

B-ANGİOPOİETİNLER Angiopoietin (Ang) ailesine mensup moleküller, VEGF dışında endotel hücreleri için hemen hemen özel bir spesifisite gösterdiği bilinen moleküllerdir.

Ang1, periendotelyal destek hücrelerinin endotelyal hücre etrafına toplamalarını ve endotelyal hücrelerin ekstrasellüler matriks ve mezenkimle ilişki kurmasını indükleyerek vaskuler bütünlüğü arttırır. Vaskuler gelişimde vazgeçilmez bir role sahiptir çünkü yokluğu embriyonik dönemde ölümcül olarak sonuçlanmaktadır [83]. Ang1’in normal insan damarlarında eksprese edilmesi, bu faktörün erişkin vaskulatürünün sürdürülmesinde de bir rolü olduğu anlamına gelmektedir. Aşırı VEGF ekspresyonunun çok sayıda geçirgen (sızıntı yapan) damar gelişimine yol açmasına rağmen aşırı Ang1 ekspresyonu, artmış yoğunluktaki ve kalibredeki (çaptaki) geçirgen-olmayan damarların oluşumuna neden olmaktadır [84].

Ang2, Ang1’in doğal bir antagonisti olup onunla aynı endotelyal hücre reseptörüne, yani

Tie2 reseptörüne bağlanmaktadır. Ang2’nin aşırı ekpresyonu, ang-1

eksikliği durumunda görülenlere benzer angiogenik defisitlere yol açar. Ang2 insanlarda, sadece vaskuler remodeling yerlerinde eksprese edilir. Ang1’e doğru olan endotel hücre kemotaksisi Ang2 tarafından bloke edilir. VEGF’nin aksine ne Ang1 ne de Ang2 endotel hücre proliferasyonunu indükleyebilmektedir [85]. Her 2 molekül de VEGF ile indüklenmiş neovaskularizasyonu modüle etmektedir.

Hem hipoksi hem de VEGF endotel hücrelerinde Ang2 ekspresyonunu upregüle ederken endotel hücrelerinde Ang1 ekspresyonunu upregüle etmezler [86]. İskemi ile indüklenmiş retinal neovaskularizasyon ile ilgili bir fare modelinde Ang2, retinanın iskemik tabakalarında ve ayrıca yeni kan damarlarında upregüle etmektedir. Bu durum, Ang2’nin mevcut olan vaskulatürü destabilize ederek, hipoksi ve VEGF ile indüklenmiş neovaskularizasyonu kolaylaştırdığını düşündürmektedir.

AMD’de ve diğer hastalıklarda görülen CNV’nin histolojik incelemesi, bu hastalıklarda Ang1’in ve Ang2’nin mevcut bulunduğunu ortaya çıkartmıştırç Ang2, VEGF dağılımına paralellik gösteren son derece vaskuler CNV membranı alanlarında eksprese edilmektedir. Tie2 reseptörü, vaskuler yapılarda olduğu kadar RPE’de ve fibroblast-benzeri hücrelerde de eksprese edilmektedir. Ang1 ve Ang2 ayrıca, CNV membranındaki makrofajlarda da eksprese edilmektedir. VEGF RPE hücrelerinden Ang1 sentezini ve

39

sekresyonunu selektif bir şekilde upregüle etmektedir [87]. Bir Ang antagonisti şeklinde etki gösteren solübl Tie2 reseptörünün adenovirüs-aracılı sistemik uygulanması farelerde laserle indüklenmiş CNV gelişimini belirgin bir şekilde inhibe etmiştir. Ang1 ICAM-1, VCAM-1 ve E-selectin ekspresyonunu inhibe ederek VEGF ile indüklenmiş lökostazı ve enflamasyonu suprese ettiği yani baskıladığı için potansiyel bir terapötik kullanım alanına sahip olabilir.

C-PEDF Pek çok sağlıklı normal dokuda olduğu gibi sağlıklı erişkin gözlerinde de yeni damarlar mevcut değildir. Böyle dokulardan angiogenezi hem indükleyen hem de inhibe eden proteinlerin pürifiye edilebilmesine karşın, damarların sessiz, inaktif durumda bulunması nedeniyle in situ inhibitörlerin baskın olduğu görüşü genel olarak kabul edilmektedir. Göz, kendi içinde bulunan çok sayıdaki büyük kompartmanda kan damarlarının bulunmaması yönünden kendine özgüdür: vitrözde, anterior kamerayı dolduran aköz humorda ve korneada kan damarları bulunmamaktadır. Bu dokular kültür ortamında incelendiklerinde yeni kan damarı oluşumunu inhibe ettikleri için bu durum aktif devam eden bir proçes olarak değerlendirilmiştir.. Gözden, angiogenezi inhibe ettiği bilinen çeşitli farklı proteinler izole edilmiştir (Tablo 1). Bu faktörler içinden şu ana

kadar sadece

PEDF’nin bu okuler dokularda avaskularitenin sürdürülmesine esansiyel bir şekilde katkıda bulunduğu gösterilebilmiştir. Damarların korneayı invaze etmesini önlemedeki anahtar rolü korneaya basitçe non-enflamatuar bir pelletin implante edilmesiyle demonstre edilebilir.

Korneanın bu prosedürle hafifçe yaralanmasına karşın neovaskularizasyon söz konusu olmamaktadır. Ancak implante edilen pellet endojen korneal PEDF’yi inaktive eden antikorlar taşıyorsa, o zaman normalde avaskuler olan korneayı damarlar invaze eder ve bu damarlar kesi yerine doğru büyüme gösterirler [88]. PEDF ayrıca, gözün anterior kamerasını dolduran aköz humorda da primer bir inhibitördür. Vitreal sıvı angiogenezi inhibe eder ancak bir aköz humordan PEDF spesifik bir şekilde çekilecek olursa sıvının doğal anti-angiogenik aktivitesi kaybolur ve aköz humor sıvısı damar çoğalmasını stimule eder bir hale gelir [88]. Bu tür sonuçlar elbette ki PEDF’nin bu lokalizasyonlarda bulunan tek inhibitör olduğu anlamına gelmemektedir ancak PEDF bu yerlerde en kritik inhibitör faktörlerden biridir.

40

Tablo 1 Gözden elde edilen endojen angiogenez inhibitörleri gösterilmiştir

C1-PEDF’NİN ÇEŞİTLİ FONKSİYONLARI (İŞLEVLERİ) Anti-angiogenez, PEDF’nin fonksiyonlarından sadece bir tanesidir. PEDF bundan 10 yıl önce Joyce Tombran Tink tarafından, retinanın arka kısmını döşeyen retinal pigment hücreleri (RPE) tarafından salgılanan ve hücrelerin, normal nöronların çeşitli karakteristik özellikleriyle retinoblastoma tümör hücrelerine diferansiye olmasını indükleyebilen 50 kDa ağırlığında bir protein şeklinde keşfedilmiştir. PEDF

farklı alanlarda çalışan çeşitli

araştırmacılar tarafından bağımsız bir şekilde klonlanmıştır. Bu klonlamaların her biri PEDF’nin farklı bir fonksiyonuna dayanılarak yapılmıştı ve dolayısıyla da PEDF aktivitesinin yeni bir yüzünü yansıtmaktaydı. Bu fonksiyonlardan en dikkat çekici olanı, PEDF’nin apoptosisi indükleme özelliği de dahil olmak üzere nöronları çeşitli hasarlardan koruyabilme özelliğidir. PEDF gözde fotoreseptör nöronların gelişimini destekler ve genetik defektlere bağlı olarak ve ayrıca ışık hasarından [89] ölmelerini geciktirir. PEDF vücudun her yerinde bulunur ve özellikle karaciğerde yüksek düzeyde eksprese edilir. Diğer dokulardaki fonksiyonunun neovaskularizasyonu kontrol etmek mi, differansiyasyonu sağlamak mı, nöral komponentleri yada başka bir şeyleri korumak mı olduğu henüz tam olarak bilinmemektedir ancak tespit edilebilir düzeylerde PEDF’si olmadan doğan fareler yaşamlarını sürdürdükleri ve sağlıklı göründükleri için viabilite (canlılık, yaşam, ) için esansiyel gibi görünmemektedir.

41

C2-PEDF ANGİOGENEZİ NASIL İNHİBE EDER? PEDF Endotel hücrelerine, sellüler bir reseptörle etkileşime girdiğini düşündüren bir affinite ile bağlanır. Retinoblastoma tümör hücrelerinden ve normal nöral retinal hücrelerden 80 – 85 kDa ağırlığında bir PEDF reseptörü izole edilmiştir ancak bunun endotel hücrelerinde eksprese edilen herhangi bir reseptörle aynı şey mi yoksa farklı bir şey mi olduğu henüz bilinmemektedir. İn vivo koşullarda PEDF, retinada iskemi tarafından indüklenen angiogenezi inhibe eder (90). PEDF yeni damarlar oluşturmaya çalışan endotel hücrelerinde apopitozise neden olmaktadır. Korneada bu apoptosisin PEDF aracılı olduğu gösterilebilmektedir çünkü apoptosis için gerekli olan capsase enzimlerinin işlev görmesi engellendiğinde PEDF etkisiz kalmaktadır.

Angiogenezin PEDF tarafından inhibisyonu, tıpkı bütün normal dokularda doğal bir şekilde oluşan diğer angiogenez inhibitörlerinde olduğu gibi, hem selektif hem de kolaylıkla tersine çevrilebilir bir şekilde olmalıdır. PEDF’nin yeni oluşan kan damarlarını yıkması ancak önceden var olanları etkilememesi yönünden selektiftir. Özellikle bu inhibitörlerin anti-angiogenik ilaçlar olarak başarılı bir şekilde kullanılmaları isteniyorsa bu tür bir selektivite esansiyeldir. PEDF’nin etkisi ayrıca, normal okuler dokuda oluşturduğu antiangiogenik ortamın gerektiğinde reversible olmasıda önemlidir. Çünkü bazen geçici ancak sıkı bir angiogeneze gerek duyulmaktadır. Örneğin doku injurisi sonrasında doku onarımını desteklemek üzere angiogenez ihtiyaç duyulması gibi.

PEDF, endojen inhibitörler içinde alışılmadık özelliklere sahiptir.En son veriler, PEDF’nin yeni kan damarı oluşturan endotel hücrelerini (yıkacağı hücreler) ile önceden var olan damarlar içinde bulunan endotel hücrelerini (zarar vermemesi gereken hücreleri) immün sistemin istenmeyen lenfositleri apoptotik bir şekilde elimine etmek için kullandığı reseptör sisteminin aynısı olan Fas Ligandı – Fas reseptörü sistemini kullanarak ayırt edebildiğini göstermektedir [90]. Fas, kendisi gibi bir transmembran proteini olan ligandı (FasL) tarafından aktive edildiğinde hücre ölümü ile sonuçlanan caspase’a bağımlı bir apoptotik kaskadı başlatan bir transmembran proteinidir. PEDF, endotel hücrelerinde Fas ligandının yüzey ekspresyonunu indükler. Ancak hücre ölümüne neden olmak için bu tek başına yeterli değildir. 2 faktör daha gerekmektedir: Birisi FasL ile etkileşime girecek olan hücre yüzeyinde FasL reseptörü ve Fas’ın kendisi de mevcut olmalıdır. İkincisi apoptosise zıt yönde etki eden ve endotel hücrelerine sürvey sinyalleri sağlayan Bcl-2, survivin FLIP gibi proteinler, hücre içinde Fas-ile indüklenen apoptosisi bloke etmeye yetecek kadar yüksek konsantrasyonlarda olmamalıdır.

42

Önceden mevcut bulunan damarlardaki endotel hücrelerinde Fas reseptörü eksprese edilmez ve matür matriksden ve aksesuar hücrelerden gelen sürvey sinyalleri oldukça güçlüdür. Sonuçta, bu hücreler PEDF ile indüklenen apoptosisden korunmaktadırlar.

Aksine, VEGF gibi angiogenez indükleyicilerine yanıt olarak yeni damarlar oluşturmak üzere damar dışına migrasyon yapan aktive edilmiş endotel hücreleri bundan oldukça farklı görünmektedir. Angiogenez indükleyicilerinin etkisi altında esansiyel olan Fas reseptörünü sergilerler. Üstelik yeni ortamlarında, gücü angiogenez indükleyicilerinin ortamdaki düzeyi ile orantılı gibi görünen yeni sürvey sinyallerine bağımlıdırlar. Böylece, migrasyon yapan hücreler angiogenez indükleyicileri ılımlı konsantrasyonlarda mevcut bulunduklarında PEDF ile indüklenen apoptosise karşı duyarlı hale gelmektedir. Ancak indükleyici konsantrasyonları ciddi bir şekilde azaldığında indükleyici ile stimule edilen sürvey sinyalleri, PEDF ile stimüle edilen Fas tarafından üretilen apoptotik sinyallere zıt yönde etki etmeye yetecek kadar güçlü olduğunda ve hücreler yaşamını sürdürerek yeni damarlar oluşturmaya devam etmektedir [90].

Bu yüzden, gelişmekte olan bir damarda bulunan bir endotel hücresi, hücre reseptörleri

yoluyla

hem

angiogenez

indükleyicilerinden

hem

de

angiogenez

inhibitörlerinden çeşitli sinyaller almaktadır. Kanıtlar, inhibitör madde PEDF olduğunda yada benzer şekilde etki eden başka bir inhibitör olan thrombospondin-1

olduğunda

hücrenin, migrasyona devam ederek yeni kan damarı oluşturmaya devam mı edeceği yoksa hücrenin indükleyicilerden ve diğer kaynaklardan aldığı anti-apoptotik sinyallere karşı PEDF tarafından başlatılan Fas-FasL aktivasyonu tarafından oluşturulan pro-apoptotik

43

sinyalleri baskılamaya devam mı edeceği konusunda bir karar verdiğini düşündürmektedir .

Şekil 8 PEDF yıkacağı hücrelerde FAS ligandlarını arttırmakta sonrasında apopitotik sinyaller ile apopitozis gerçekleşir.Fasl-fas etkileşimi yetersiz ise hücreler yıkılamamaktadır.

C3-PEDF TEDAVİSİNİN GÖRMEYİ TEHDİT EDEN HASTALIKLAR İÇİN KULLANILMASI İLE İLGİLİ OLASILIKLAR

PEDF, vizyonu tehlikeye sokan okuler angiogenezin farmakolojik inhibisyonu için bir ilaç geliştirilmesi konusunda pek çok nedenden dolayı iyi bir adaydır. İlk olarak; angiogenezin pek çok indükleyicisine karşı etkilidir [108]. Örneğin; okuler angiogenezin indüklenmesinde önemli roller oynadıkları düşünülen VEGF ve IL-8’e karşı etkilidir [91] ve iskemi ile indüklenen retinal angiogeneze karşı da son derece etkilidir.

Pürifiye edilmiş PEDF sistemik yoldan verildiğinde, farelerdeki iskemi ile indüklenmiş retinal bir angiogenez modelinde aberrant neovaskularizasyonu tam olarak elimine edebilmektedir [90].

44

İkinci olarak; PEDF kullanılırken; sağlıklı dokularda normalde mevcut bulunan ancak hastalık nedeniyle kaybedilmiş olan bir protein basitçe yerine konuyor olabilir. Okuler angiogenezin çoğu iskemi ile sürdürülmektedir. İskeminin, angiogenez indükleyicilerini stimüle ettiği bilinmektedir . Son zamanlarda, oksijen düzeylerinin de inhibitör PEDF’yi regüle ettiği gözlenmiştir. Oksijen desteği az olduğunda stimülatör etkili VEGF ve IL-8 artmakta ancak inhibitör etkili PEDF azalmaktadır. Oksijen aşırı bol miktarda bulunduğunda ise, hem kültürdeki hücrelerde hem de retinal dokularda angiogenez indükleyicilerinin azalmasına karşın PEDF üretimi artmaktadır [90]. İskemi ile indüklenmiş okuler neovaskularizasyona karşı genetik olarak daha rezistan (dirençli) olan sıçanlarda iskemi ile stimule edilmiş VEGF artışlarının ve PEDF azalmalarının daha az ve daha kısa süreli olduğunu gösteren yeni bir çalışma, bu in vivo değişikliklerin önemini vurgulamaktadır [92]. Üçüncü olarak; hayvan modellerinde okuler PEDF konsantrasyonlarında tanımlanmış olan bu değişiklikler, insanlardaki göz hastalıklarında meydana gelmeleri ve bu hastalıkların gelişimini kolaylaştırmaları mümkün gibi görünmektedir. Diabetik hastalarda inhibitör PEDF’nin vitröz ve retinal dokularda daha düşük olduğu bildirilmektedir.[93]. Retinadaki PEDF’nin majör kaynağını teşkil eden RPE hücreleri de dahil olmak üzere pek çok hücre türünde, yüksek düzeylerde PEDF üretebilme özelliği genç hücrelerin karakteristik bir özelliğidir ancak hücreler yaşlılık dönemine yaklaştıkça bu yetenekleri azalmaktadır. RPE hücreleri in vivo koşullarda inaktif gibi göründükleri için , PEDF’deki bir düşüşün yaşla ilişkili makuler dejenerasyonun zarar verici neovaskularizasyonuna katkıda bulunabilmesi mümkündür. Yaşla ilişkili makuler dejenerasyon nedeniyle koroidal neovaskularizasyonu olan kişilerin vitrözündeki PEDF konsantrasyonlarının, yaşa göre eşleştirilmiş olan kontrol olgularının vitrözlerindekinden belirgin bir şekilde daha düşük olduğunu gösteren çalışmalar bunu desteklemektedir [94]. PEDF’nin RPE hücrelerine adenoviral transfeksiyonu, laser injurisiyle ilgili bir fare modelinde CNV’yi parsiyel bir şekilde inhibe etmiştir. Ayrıca, fotoreseptörleri

VEGF’yi

aşırı

eksprese

eden

transgenik

farelerde

de

retinal

neovaskularizasyonu inhibe etmiştir [95]. En son kanıtlar, PEDF’nin yerleşmiş CNV’nin regresyonuna neden olduğunu göstermektedir [96]. PEDF eksprese eden otolog iris pigment epiteli hücrelerinin subretinal transplantasyonu, sıçanlarda laserle indüklenmiş CNV’yi inhibe etmiştir [97]. İskemiyle indüklenmiş retinopatide artmış bir VEGF/PEDF oranı retinal neovaskularizasyon varlığı ile korelasyon göstermektedir.

Bruch membranı ile nörosensoryel retina arasındaki kritik bölgede yerleşmiş bulunan RPE hücrelerinin CNV modulasyonunda rol oynadığı yönünde uzun zamandan beri

45

spekulasyonda bulunulmaktadır. VEGF’nin RPE tarafından üretildiğinin keşfedilmesi her ne kadar CNV gelişiminde RPE için nedensel bir rolün söz konusu olduğunu düşündürüyor olsa da, RPE’nin aynı zamanda PEDF de ürettiğinin bulunması RPE’nin dual bir rolü olabileceğini düşündürmektedir. (98) İn vitro olarak, yaşlı (eski) RPE hücrelerinin PEDF üretiminin azaldığı görülmektedir. Gözün yaşlanmasıyla azalan vitröz PEDF konsantrasyonları AMD’li hastalarda daha belirgindir. Bunun vitrözde artmış proteolitik aktiviteye mi yoksa azalmış senteze mi bağlı olduğu belli değildir [99].

Dördüncüsü; PEDF hakkında bilinenlerden ön görülebilecek olan yan etkiler ve diğer angiogenez inhibitörleri ile ilgili olarak bilinenlerden tahmin edilebilecek olan yan etkiler, bu faktörlerin tolere edilebileceğini düşündürmektedir.

PEDF tümörlerin büyümesini yavaşlatır ve nöron sürveyini uzatır. Bunların her ikisi de istenen ve arzu edilen etkilerdir. Ancak angiogenezin PEDF ile inhibe edilmesinin, özellikle PEDF’nin sistemik yoldan uygulandığı durumlarda diğer medikal sorunları, örneğin diabetik hastalarda sıkça görülen iskemik kalp hastalıklarını yada ülser gibi sorunları arttırıp arttırmayacağı cevap bekleyen bir sorudur.

Sistemik PEDF tedavisi, protein yapıdaki büyük angiogenez inhibitörleriyle yapılan diğer tedavilerde olduğu gibi pahalı bir öneridir ve uygulanması kolay değildir. PEDF’nin strüktürü yani yapısı yakın bir zaman önce aydınlatılmıştır ve strüktür-fonksiyon çalışmalarının kullanımı bütün halindeki proteinin kullanımından daha kolay olan küçük bir aktif bölgeyi tanımlayabilmesi beklenmektedir. Tümör hücrelerinin diferansiyasyonunu indükleyebilen ve nöronları koruyup diferansiye edebilen 44 amino asid uzunluğunda bir peptid türevi tanımlanmıştır.(Muhtemel aktif bölgesi)[100]. Ancak bunun angiogenezi bloke edip etmeyeceği şu an itibariyle belli değildir. PEDF nöronları apoptosisden korurken aktive edilmiş endotel hücrelerinde apoptosisi indüklemektedir. Bu yüzden, anti-angiogenez süreci ayrı bir sellüler reseptörü ilgilendiriyor olabilir ve böylece PEDF molekülünün özgün bir bağlanma domain’i ile ilgili olabilir.

C4- PEDF (ENDOJEN ÜRETİLEN) NEDEN CNV GELİŞİMİNİ ENGELLEYEMEMEKTEDİR ?

Farklı modellerde gösterdiği potent anti-angiogenik aktivitesinin ışığında, endojen PEDF’nin CNV gelişimini önlememesi oldukça ilginç bir bulmacadır.

•

Muhtemelen, konstitütif olarak üretilen ufak miktarlar angiogenik faktörler tarafından baskılanmaktadır.

46

•

Yada, apikal olarak polarizasyon gösteren PEDF sekresyonunun, yine RPE hücrelerinin bazal polarizasyon gösteren VEGF salgısının dezavantajında kalıyor olabilmesi de mümkündür [101].

•

PEDF’ göz içi dağılımının homojen olmaması. PEDF’nin interfotoreseptör matriks havuzunda

toplanması

CNV’nin

nörosensoryel

retinayı

invaze

etmemesini

açıklayabilmektedir .

•

PEDF’nin FGF2’ye maruz kalan endotel hücrelerinin büyümesini inhibe etmesine karşın yüksek VEGF düzeylerine maruz kalan endotel hücrelerinin proliferasyonunu muhtemelen arttırdığı gösterilmiştir.[102]. Bu durum, önemli bir uyarı olabilir.

Farelerde düşük PEDF düzeylerinin laserle indüklenmiş CNV’yi inhibe etmesine

karşın yüksek PEDF düzeylerinin aslında CNV gelişimini arttırdığı şeklindeki yeni bir bulgu PEDF’nin paradoks etkilerinin altını çizmektedir [103].

D-NİTRİK OKSİT Sistemik kan basıncının düzenlenmesinde rol alan Nitrik Oksid (NO), VEGF ile indüklenen angiogenez ve hiperpermeabilitede de kritik, hayati bir role sahiptir. VEGF, endotelyal nitrik oksid sentaz (eNOS) enziminin upregulasyonunu ve buna bağlı olarak NO salgısını indükler. Endojen olarak üretilen NO da sonuçta VEGF sentezini arttırır. eNOS’un farmakolojik blokajı yada genetik olarak bozukluğa uğraması VEGF ile indüklenmiş angiogenezi ve hiperpermeabiliteyi inhibe eder [104]. eNOS blokajı yada eksikliği, oksijenle indüklenen retinal vasoklüzyonu ve vitröz neovaskularizasyonunu azaltmaktadır [105].

NO, endotel hücrelerinin üzerinde bulunan ve hücre-matriks adhezyonu ve migrasyon açısından kritik bir öneme sahip bulunan  αvβ3 integrin’i upregüle ederek endotel hücrelerinin migrasyonunu ve kapiller yapılara diferansiyasyonunu uyarmak suretiyle angiogenezi indüklüyor gibi görünmektedir. NO ayrıca, ekstrasellüler matriks formasyonunu azaltarak hücrelerin migrasyonuna da imkan vermektedir. eNOS’un aksine, indüklenebilir NOS (iNOS), VEGF reseptörünü down-regüle ederek angiogenezi inhibe edebilmektedir. İskemik retinopati ile ilgili bir fare modelinde iNOS, VEGF ile sürdürülen neovaskularizasyonu inhibe etmektedir. NO’nun CNV’de rol oynadığı sanılmaktadır. İnsan CNV membranları RPE hücrelerinde ve makrofajlarda yüksek miktarlarda iNOS eksprese ederler [106]. Bruch membranında laserle indüklenmiş rüptür

47

olan farelerden, iNOS eksikliği bulunan farelerde CNV inhibe edilmiş ancak eNOS eksikliği bulunanlarda inhibe edilmemiştir.

OKÜLER VE NONOKÜLER PATOLOJİLERDE VEGF’ İN ROLÜ A-NONOKÜLER PATOLOJİLERDE VEGF VEGF gözdeki rolünün dışında ayrıca, vücudun diğer yerlerinde de yeni kan damarlarının büyümesi için gereklidir. VEGF, VEGFR-1 veya VEGFR-2’yi kodlayan genler farelerde selektif bir şekilde ortadan kaldırıldığında embriyolar uterusda erken dönemde ölmüşlerdir. Histopatolojik analizler gross şekilde eksik olan kan damarlarının varlığını ortaya çıkartmıştır. Bu veriler, doğanın VEGF eksikliğini yedeklemek için henüz yedek bir molekül tasarlamadığını göstermektedir. Birbirinden ayrı yapılan denemelerde tek bir VEGF allelinin delesyonu farelerin uterusda ölmelerine neden olmuş ve bu fareler yine gross şekilde eksik olan damar gelişimleri sergilemişlerdir. Bu veriler, uygun kan damarı gelişimi için VEGF düzeylerinin sıkı bir şekilde kontrol edildiğini göstermektedir. VEGF düzeylerinde %50’lik bir azalma bile defektif kan damarı formasyonu ile sonuçlanmaktadır. VEGF dozunun 2 katına çıkması da uterusda ölümcül bir şekilde sonuçlanmaktadır.

Rodent tümörogenez modellerinde VEGF-bloke edici bir antikor tümör gelişimini, tümör angiogenezinin inhibisyonu yoluyla potent bir şekilde inhibe etmiştir [107]. Çok sayıda solid tümör tipinin VEGF inhibisyonuna yanıt verdiği gösterilmiştir. Bu preklinik veriler, aynı antikorun humanize edilmiş yani insansılaştırılmış formuyla kanser denemelerinin yapılmasına yol açmıştır (Avastin, Genentech Inc). Randomize plasebo kontrollü denemelerin müspet sonuçlar vermesi kolon ve böbrek kanseri için uzamış sürvey (sağkalım) sürelerini göstermektedir ve Avastin şu anda, metastatik kolorektal kanserin birinci basamak tedavisi için intravenöz 5-florourasil-bazlı kemoterapi ile kombine bir şekilde kullanılmak üzere onaylanmış durumdadır. Ancak bu antikor geç dönem meme kanseri hastalarında test edildiği zaman herhangibir fayda göstermemiştir. Bunun olası nedenleri çok çeşitlidir; örneğin dokulara yetersiz erişim, son-dönem hastalık ve büyüme faktörü fazlalığı gibi. Ancak şunu da önemle belirtmek gerekir ki başarılı denemelerde bile tümör büyümesi yavaşlamış olmakla beraber yine de progresyon göstermiştir. Gerçek anlamda başarılı bir angiogenez supresyonu için pek çok moleküler hedefi hedef alan ajanlar gerekebilir ki bu durum da angiogenik yolakların kompleksliğini (karmaşıklığını) ve fazlalığını göstermektedir. Bu, okuler neovaskularizasyon için de doğru olabilir.

48

VEGF bioaktivitesi inhibe edildiğinde angiogenezin gerekli olduğu diğer proçesler (ovulasyon, yara iyileşmesi ve kemik büyümesi vb) de suprese olmuştur. İskemik bir kalpte yada ekstremitede kollateraller geliştiğinde kompanzatuar kan damarı büyümesi VEGF’ye bağımlı olabilmektedir. [108]. Bu verilerin dışında, klinik denemelerde halen VEGF uygulamalarının iskemik ekstremitelerin ve kalplerin revaskularizasyonundaki faydalı rolü de incelenmektedir.

Tam

tersine,

vasa

vasorum’dan

köken

alan

neovaskularizasyon

aterosklerozda plak formasyonunun gelişimi için gerekli görünmektedir .Bu bağlamda, angiogenez inhibisyonunun deneysel plak formasyonunu önlediği de gösterilmiştir. Bu yüzden, VEGF inhibitörlerinin sistemik olarak anlamlı konsantrasyonlarda ilerlemiş kardiovaskuler hastalığı bulunan hastalarda pozitif yada zararlı etkilerinin olup olmayacağı halen bilinmemektedir. Önemle belirtmek gerekir ki okuler antiangiogenik ilaçlarla ile ilgili olarak yapılan klinik denemelerin çoğunun lokal intravitreal yada periokuler ilaç sunum yollarını ilgilendirmesine karşın bu bileşiklerin sistemik dolaşıma girebilmeleri de mümkündür. Bu denemeler ilerledikçe, dolaşıma geçen bu yeni ilaçların potansiyel sistemik sonuçlarına büyük bir dikkat gösterilmelidir.

B-OKÜLER PATOLOJİLERDE VEGF 1-DİABETİK RETİNOPATİ

a-Non-proliferatif diabetik retinopati (NDPR) DM’de retinada DR’nin klinik olarak farkedilmesinden uzun süre önce çeşitli metabolik dengesizlikler ve vaskuler değişiklikler meydana gelmektedir; örneğin basal membran kalınlaşması, perisitlerin ve endotel hücrelerinin apoptosisi ve diffüz şekilde artmış vaskuler permeabilite vb. Hipergliseminin DR gelişimi ve progresyonu için majör bir risk faktörü olduğu belirlenmiştir.. Retina, glukozun hücre içine taşınması için insüline gerek duyulmayan az sayıdaki bir kaç dokudan biridir. İnsülin yerine, glukozun retina hücrelerine girmesini glucose-transporter-1 (Glut-1) molekülü kolaylaştırmaktadır. Bunun sonucunda, hiperglisemi yüksek intrasellüler glukoz düzeylerine yol açarak sorbitol yolağı, protein kinaz C (PKC) aktivasyonu , serbest radikal formasyonu (oksidatif stress) ve NADH eksilmesi yoluyla artmış glukoz girişine neden olmaktadır. Bu etkilerden sonuncusu, yani NADH eksikliği intrasellüler bir “pseudohipoksi” durumuna yol açmaktadır. Hipergliseminin bir diğer etkisi ise, proteinlerin non-enzimatik glikasyonu sonucunda ileri-glukasyon son ürünlerinin (AGE’lerin) oluşumudur. Diabetik retinada AGE’lerin arttığı tespit edilmiştir . AGE’ler artmış oksidatif strese ve buna bağlı olarak hücre ölümüne yol açar. Preklinik DR’nin erken dönemlerinde dejenere oldukları bilinen 49

perisitler AGE reseptörlerini eksprese ederler ve bu nedenle AGE’lerin olumsuz ve zararlı etkilerine karşı daha duyarlı (yatkın) olabilirler. Hipergliseminin tüm bu etkileri retinada muhtemelen birlikte etki göstererek retinal hücrelerin kademeli bir şekilde yavaş yavaş kaybına neden olmaktadır. DM’nin retinada artmış apoptosisi indüklediği yönünde giderek artan miktarda kanıtlar mevcuttur. İnsan diabetik retinalarında perisitler, apoptosis ile ilişkili bir protein olan Bax’ın artmış düzeylerini sergilemektedir (109). Apoptotik perisitler endotel hücreleri ile kapiller basal membranı arasında sıkışıp kaldıkları için replase edilememekte ve bu nedenle de perisitlerin ölümü direkt bir şekilde perisit kitlesine bir azalma ile sonuçlanmaktadır.Aksine, retinal endotel hücreleri artmış proliferasyon ile yenilenebilmektedir.DM’in üzerinden uzun yıllar geçtikten sonra, endotel hücreleri replikatif yaşlılık dönemine ulaşırlar. Bu durum asellüler kapillerlere ve iskemik alanlara yol açmaktadır. Bu alanlar klinik olarak, non-proliferatif DR (NPDR) şeklinde tanınmaktadır. Mikrovaskuler sürveyi arttıran faktörlerin salgısında azalma da, iç retinanın apoptosise daha duyarlı hale gelmesinde etkili olan bir diğer mekanizma olabilir.

Bu açıdan önemli bir aday, insülin benzeri büyüme faktörü-1 (IGF-1)’dir. İç retinada ve in vitro olarak retinal endotel hücrelerinde IGF-1 ve reseptörleri mevcuttur. IGF-1 reseptörlerinin aktivasyonu belirgin anti-apoptotik etkiler sergileyerek çeşitli hücre türlerini ölüm sinyallerine karşı korumaktadır (110). insan ve sıçan diabetik retinalarında, non-diabetik kontrol olgularıyla karşılaştırıldığında IGF-1 ekspresyonunun azaldığı tespit edilmektedir (111).

VEGF ailesinin bu olaylar siklusundaki rolü nedir? Yukarıda da belirtildiği gibi bazı deneysel kanıtlar, VEGF’nin normal retinada fonksiyonel bir rolünün olduğunu düşündürmektedir. Ancak VEGF-A’nın retinadaki patolojik durumlarda yer alması literatürde daha belirgin bir durumdur. Artmış VEGF-A NPDR’de bir permeabilite faktörü şeklinde etki etmektedir. İnsan retinalarında ve deneysel NPDR’de VEGF-A ve ekstravaze olmuş albumin birlikte lokalize (co-lokalize) olmaktadır. Sıçanlarda ve maymunlarda yüksek dozlarda tekrarlanan VEGF-A enjeksiyonları florosein boyasının retinal damarların sızıntı yapmasına neden olmakta ve NPDR’de görülen değişikliklere benzer retinal

değişiklikler

oluşturmaktadır

(vaskuler

tortusite

=

kıvrımlanma

ve

mikroanevrizmalar gibi). VEGF, endotel proliferasyonu indüklemenin dışında ayrıca, endotel hücreleri için ve muhtemelen retinadaki diğer hücre türleri için bir sürvey/sağkalım faktörü olarak da etki etmektedir. İn vitro koşullarda VEGF, serum açlığı (yokluğu) ile indüklenen apoptosisi önlemektedir. VEGF bağımlılığı, önceden gelişmiş damarlardan çok

50

yeni oluşmakta olan damarların endotel hücreleri için daha önemli gibi görünmektedir.

Endotelin perisitler tarafından kaplanmasının, VEGF bağımlılığının kaybı ile sonuçlanan anahtar olay olduğu öne sürülmüştür. VEGF endotel hücre migrasyonu, proliferasyonu ve artmış vaskuler permeabilite açısından önemlidir. En son veriler VEGF-A’nin retinal vaskuler permeabilite üzerindeki etkilerini, artmış veziküler transport ve/veya occludin gibi tight-junction proteinlerinin içeriğindeki azalma ile sergilediğini düşündürmektedir. (Şekil 9). İn vivo olarak, insanlardaki NPDR’de ve deneysel NPDR modellerinde artmış VEGF-A ekspresyonu tanımlanmaktadır. VEGFR-1’in iskemik retinalarda hipoksi ile indüklenmiş upregulasyonunun, VEGF-A duyarlılığını arttırabilecek bir mekanizma teşkil ettiği

öne

sürülmektedir.

Ancak

VEGFR-1’in

mikrodamarlarında da eksprese edilebildiğini

aynı

zamanda

normal

retina

gösterilmiştir.(112). Bu reseptörün

boyanma paterni, perisitlerde lokalize olduğu yönünde güçlü bir izlenim vermiştir. Bu durum, in vitro ve in vivo şartlarda perisitlerdeki VEGFR-1 ekspresyonu ile uyumludur..

Dolayısıyla başlangıçtaki

perisitlerdeki (ilk)

VEGFR-1

sinyallemesi, etkilerinden

artmış

VEGF-A

sorumlu

düzeylerinin olabilir.

Şekil 9 VEGF ile artmış veziküler transport hiperpermeabiliteden sorumlu tutulmaktadır.

51

Resim A da VEGF enjeksiyonu öncesi veziküllerin durumu .Resim B de oniki vegf enjeksiyonu sonrası intraselüler veziküler cisimlerin yerleşiminde değişim gösterilmiştir.Ayrıca endotelyal hiperplazide dikkati çekmektedir.

Sıçanlarda streptozotocin ile indüklenmiş DM’de, preklinik DR’nin erken dönemlerinde VEGFR-2 upregulasyonu gözlenmiştir. (113). İnsan DR’sinde VEGFR-2 varlığı sızıntı yapan retinal damarların varlığı ile korelasyon göstermektedir. Bu durum, VEGFR-2’nin vaskuler ekspresyonunun sadece yerleşmiş DR alanlarında meydana geldiğini düşündürmektedir. Endotelyal VEGFR-2 ekspresyonu lokal hipoksi ile direkt olarak indüklenebilmektedir. Bir başka mekanizma ise VEGF-A’nın kendisinin indüksiyonudur ki bu beyin mikrodamarlarında ve maymun retina ve irisinde gösterilmiştir bir durumdur. Bu muhtemelen, retinal perisitlerin VEGFR-1 sinyallemesi ve ikinci bir habercinin yer almasıyla gerçekleşmektedir. İn vitro VEGFR-2 gen ekspresyonu, kardiovaskuler homeostasisde kritik bir faktör olan ama aynı zamanda DR gelişiminde ve progresyonunda

da

rol

oynayan

angiotensin-II

(AT-II)

ile

direkt

bir

şekilde

arttırılmaktadır (114). VEGFR-2’nin AT-II tarafından upregulasyonu VEGF ile artmış doku yanıtlarına(sızıntı) yol açabilir. Ancak bu durum deneysel olarak henüz demonstre edilememiştir. Ayrıca, sızıntı/kaçak yapan retinal mikrodamar alanlarında özellikle; VEGF-C ve D’ye affinite gösteren VEGFR-3’ün ekspresyonu saptanmıştır. Bu durum, DR patogenezinde VEGF ailesinin VEGF-A dışındaki diğer üyelerinin yer aldığını düşündürmektedir.

AT-II, VEGFR-2’yi indükleyebilmenin dışında ayrıca, DM’deki hiperpermeabilite ile de direkt bir şekilde ilişkilidir. Kronik hiperglisemi durumunda reninangiotensin sistemi aktive edilmektedir ve AT-II de in vitro olarak vaskuler düz kas hücrelerinde ve sıçan kardiak endotel hücrelerinde VEGF-A sekresyonunu direkt olarak stimüle etmektedir. ACE inhibisyonu diabetik retinopatide ve kardiovaskuler hastalıklarda faydalı bir etkiye sahiptir. Üstelik, diabetik hastaların ACE inhibitörü lisinoprille tedavisi hem NPDR’nin progresyon hızını düşürmüş hem de proliferatif değişiklikleri azaltmıştır bu nedenle, ACE inhibisyonunun diabetteki faydalı etkilerinin VEGF-A ekspresyonunun modüle edilmesi aracılığıyla gerçekleştiği öne sürülmüştür. ACE inhibisyonunun retinal VEGF-A ekspresyonunu ve retinal vaskuler hiper permeabiliteyi azalttığı deneysel bir sıçan diabet modeli bu bulguyu desteklemektedir (114). Bu durum diabetik retinal hastalıklarda DM, VEGF-A ve RAS (renin-angiotensin) sisteminin bloke edilmesinin

52

terapötik

etkileri

arasında

potansiyel

bir

mekanizmal

ilişkinin

bulunduğunu

düşündürmektedir.

VEGF-A’nın DR’nin erken dönemlerinde yer aldığına dair ciddi kanıtların bulunmasına karşın DR başlangıcını ve metabolik ve biokimyasal değişiklikleri tetikleyen ilk faktörün ne olduğu belli değildir. İntrasellüler pseudohipoksi (NADH tükenmesi ile artan glikolizasyon), yüksek glukoz düzeyleri ve AGE gibi değişikliklerin hepsi hücrelerde in vitro VEGF-A ekspresyonunu arttırmıştır.Glukoz tarafından direkt bir şekilde aktive edilen endotelyal PKC-B, VEGF-A’nın proliferatif ve permeabilite ile ilgili etkilerinden sorumlu olan sinyalleme kaskadının esansiyel bir parçasıdır. İnsanlardaki NPDR’de ve deneysel hayvan modellerinde ekspresyonunun artmış olduğu saptanmıştır.

Dolayısıyla, endotel hücreleri için bir sürvey faktörü olarak etki ettiği bilinen VEGF-A preklinik DR’nin başlangıcında retinal damar yatağı bütünlüğünü sürdürecek bir mekanizma olarak artıyor olabilir. Daha ileri dönemlerde, VEGFR-2’nin upregüle edildiği iskemik alanlarda yüksek miktarlardaki VEGF-A üretimi DR’nin iyi bilinen bulgularına yol açmaktadır; vaskuler kaçak ve neovaskularizasyon gibi .

DR’nin ilk bulguları genellikle, DM’nin başlamasından bir kaç yıl sonra fundoskopi ile tanınmaktadır. Artmış vaskuler permeabilitenin bir sonucu olarak plasma proteinleri retinal kapillerlerden retinaya sızarak ödeme neden olurlar ve dış pleksiform tabakada lipoproteinler akümüle olur. Bu proçes klinikte sert eksüda şeklinde gözlenmektedir. Bunun dışında, kapiller duvarından dışarıya doğru hipersellüler sakküler bir poşlanma şeklinde gelişen mikroanevrizmalar (MA’lar) ve ufak hemorajiler tüm retina boyunca diffüz bir şekilde gelişir. Genel olarak kabul gören görüş MA’ların perisit dejenerasyonuna ve buna bağlı olarak kapiller duvarının mekanik desteğinde meydana gelen azalmaya bağlı olarak geliştiği şeklindedir. Beyin kapillerlerinde perisit bulunmayan PDGF-defektif ve PDGFR-B defektif farelerde MA-benzeri vaskuler oluşumların olduğu yönündeki en son gözlemler bu görüşü desteklemektedir (115).

DR’de kapiller non-perfuzyon (perfuzyon olmaması) florosein angiogramlarında koyu alanlar şeklinde görülür. Bu alanlar iskemiktir ve buralarda VEGF-A lokal olarak oluşmuştur.. Maymun gözlerinde tekrarlanan VEGF-A enjeksiyonları yaygın kapiller nonperfuzyona yol açmaktadır (116). Kapiller non-perfuzyonun patogenezi bilinmemektedir ancak bu konuda çeşitli hipotezler öne sürülmüştür. Retinal kapillerlerin (aktive olmuş) lökositlerle tıkanmasının önemli bir mekanizma olduğu düşünülmektedir. Son zamanlarda, hem streotozocin ile indüklenmiş diabetin erken dönemlerinde hem de sıçanlarda VEGF 53

ile indüklenmiş retinopatinin erken dönemlerinde, lökositlerin tutunduğu adhezyon molekülü olan ICAM-1’in retina endotelinde upregüle edildiği bildirilmektedir. Bu durum, lökosit adhezyon teorisini üst düzeyde desteklemektedir. Bu kapillerlerin lümenleri ufak olduğu için, damar duvarına tutunan lökositler kan akımını obstrukte ederler ve non-perfuzyona neden olurlar.Kapiller non-perfuzyonun gelişebileceği başka bir mekanizma belirlemiştir. VEGF-A ile indüklenmiş retinopatide retinal kapillerlerin endotel hücreleri kontrol gözleri ile karşılaştırıldığında hipertrofiktir ve kapiller lümeninde ciddi düzeyde bir daralmaya yol açmaktadır.(Şekil 10) Aynı modelin daha geç dönemlerinde yapılan gözlemler, retinanın daha yüzeyel tabakalarında bozulmuş ve yeniden modellenmiş damarlarda endotelyal hücre hiperplazisini göstermiştir. Bu durum, kapiller non-perfuzyon patogenezinin merkezinde endotelyal değişikliklerin olduğunu desteklemektedir (117). Kalınlaşmış ve sert bir basal membranı olan retinal bir kapillerde (uzun süren DM’de olduğu gibi), lokal VEGF-A üretimi ile indüklenmiş endotel hücre hiperplazisinin progressif lüminal daralmaya ve kapiller non-perfuzyona yol açacağı düşünülmektedir. Bu durum iskemiyi ve sonuçta VEGF-A upregülasyonunu arttırdıkça DR’de

kısır

bir

döngü

oluşabilir.

54

Şekil 10-VEGF’ e maruz kalan normal kapiler endotelinde(A) zamanla endotelyal hipertrofi(B,C) ve sonrasında hiperplazi ve lümen obstruksiyonu (D) olmaktadır.Bu durum kapiler nonperfüzyondan sorumlu tutulmaktadır.

b-Proliferatif DR (PDR) VEGF-A PDR gelişiminde diğer büyüme faktörleriyle, örneğin PDGF(platelet kökenli büyüme faktörü), IGF-1, PIGF(plasental büyüme faktörü) ve HGF ile sinerjik bir etkileşim gösterebilmektedir.

PDR’de okuler neovaskularizasyon muhtemelen, vitrözde bu faktörün iskemik retinadan kaynaklanan yüksek düzeylerine bağlı olarak meydana gelmektedir. PDR’li hastaların aköz humor ve vitrözlerinde yükselmiş VEGF-A düzeyleri saptanmıştır. PDR hastalarının neovaskuler membranları ile ilgili immunohistokimyasal çalışmalar genel bir VEGF-A ekspresyonunu ortaya çıkartmaktadır. Oksijenle indüklenmiş neonatal retinopati ile ilgili sıçan ve fare modellerinde VEGF-A ekspresyonu angiogenezle zamansal bir korelasyon göstermekteydir ve neovaskularizasyon regrese oldukça yani geriledikçe yavaş bir şekilde azalmaktaydır. Bu modelde ve iskemik retinal hastalığı bulunan insanlarda hipoksi ile indüklenmiş VEGF-A ekspresyonunu sürdüren önemli bir güç rod fotoreseptörlerin karanlığa adapte durumda yüksek oksijen tüketimleri olabilir (118). Rod disfonksiyonu olan insanların ve farelerin retinal iskemi varlığında neovaskuler bir yanıt sergileyemediklerinin gözlenmesi bu görüşü destekler niteliktedir.

Retinal mikrovaskuler endotel hücrelerinin in vitro proliferasyonu, aktif PDR’de saptanan

düzeylerden

daha

düşük

VEGF-A

düzeylerinde

artış

göstermektedir.

Maymunlarda tekrarlanan intravitreal VEGF-A enjeksiyonları (bu enjeksiyonlar PDR’de saptanandan 10 – 100 kat daha yüksek VEGF-A düzeylerine yol açmaktadır) preretinal neovaskularizasyonu indüklememiştir (119). Diğer yandan, iris neovaskularizasyonu hızlı bir şekilde gelişmiştir ki bu, iris ile retina arasında VEGF-A’ya yanıt olarak hızlı bir neovaskularizasyonu başlatabilme özelliği açısından ciddi farklılıkların bulunduğunu düşündürmektedir. Bu farkın bir açıklaması retinada yada ekstrasellüler matriksde lokal angiogenez inhibitörlerinin ekspresyonu şeklinde veya bu dokuların vaskulatürünün angiogenez duyarlılığının farklı olması şeklinde olabilir, veya irisde zayıf olmakla birlikte konstitüsyonel (yapısal, sürekli) bir şekilde VEGFR-2 ekspresyonu görülmekte oysa retinada böyle bir VEGFR-2 ekspresyonu sürekliliği bulunmamaktadır.(112)

55

Neonatal farelerde VEGF-A’nın iskemi ile indüklenmiş neovaskularizasyon için gerekli olduğunun direkt kanıtı, 3 farklı nötralizan ajanın kullanılmasıyla elde edilmiştir.

Bunlar ajanlar arasında VEGF reseptör kimerik proteinleri, selektif kinaz inhibitörleri ve antisense (anlamsız) fosforothioate oligodexynukleotide’ler (120) yer almaktadır.

Primatlarda iris neovaskularizasyonunda bu 3 değişik VEGF-A nötralize edici ajanın kullanılmasıyla benzer sonuçlar elde edilmiştir . Bu veriler, angiogenik bir yanıtın şüphesiz bir şekilde çeşitli faktörler tarafından düzenlenmesine karşın VEGF-A’nın rodentlerde retinal neovaskularizasyonu ve primatlarda iris angiogenezini indüklemek için yeterli ve gerekli gibi göründüğünü göstermektedir. Bu durum, VEGF-A’yı bloke edebilme yada VEGF-A reseptörlerine bağlanabilme özelliğine sahip olan bir ajanın intraokuler

neovaskularizasyonu

en

azından

kısmen

de

olsa

azaltabileceğini

düşündürmektedir. Şu an için PDR’nin esas en önemli tedavi şekli panretinal laser fotokoagulasyonudur (PRP). PRP tedavisi daha fazla retinal neovaskularizasyon olmasını önler. Randomize klinik denemeler laser fotokoagulasyon tedavisinin azalmış görme kaybı ve retinal neovaskularizasyonla ilişkili olduğunu demonstre etmiştir. Ancak PRP’nin faydalı etkilerinin altında yatan mekanizmalar belli değildir. PDR’li hastalarda PRP sonrasında vitrözdeki ve aközdeki VEGF-A düzeylerinin azalması, angiogenezin bu pozitif regülatörünün ekspresyonundaki azalmanın faydalı tedavi etkilerinden sorumlu olduğunu

düşündürmektedir.

Bu,

angiogenik

stimulusun

üretilmesinden

ve

salgılanmasından sorumlu olan hücrelerin yıkımına bağlı bir durum olabilir ama daha büyük bir ihtimalle fotoreseptörlerin kaybı nedeniyle dış retinanın azalmış oksijen tüketimine bağlıdır. Yada, laser fotokoagulasyon tedavisinin etkinliği angiogenezin negatif regülatörlerinin artmış ekspresyonuna da bağlı olabilir. Gerçekten de, hastaların PRP ile tedavi edilen gözlerinde normalde gözde bulunmayan angiogenez inhibitörü angiostatin salgısı ile azalmış VEGF-A üretimi arasında bir ilişki saptanmıştır. Diğer taraftan, PRP sonrasında bu gözlerde proliferatif aktivite hala devam etmektedir. Bu durum, angiostatin salgısının pro-angiogenik aktiviteyi nötralize etmeye yetmediğini göstermektedir. İkinci bir potent endojen angiogenez inhibitörü, pigment epiteli kökenli faktördür (PEDF). PEDF aynı zamanda retinada nörotrofik etki de göstermektedir ve retinada angiogenez homeostasisinin sürdürülmesinde esansiyel olduğu düşünülmektedir.

PDR’de tedavi edilmemiş neovaskularizasyon alanlarında PEDF düzeylerinin, kontrol olgularına göre azalmış olmasına karşınVEGF-A düzeylerinin arttığı saptanmıştır. PRP

56

sonrasında vitrözde angiostatin gibi PEDF düzeyleri de artmaktadır. RPE hücreleri tarafından PDEF üretimi PRP sonrasında upregüle olmaktadır (121). Bu bulgular PEDF’nin retinayı patolojik angiogenezden korumada ciddi bir rol oynadığı anlamına gelmektedir. Bu durum retinal hastalıklarda patolojik neovaskularizasyonu kontrol altına alabilme umudunu doğurmakla kalmamakta, ama aynı zamanda her diabetik hastada PDR gelişmediği şeklinde iyi bilinen bir gerçeğin anlaşılması konusunda da ipuçları sağlamaktadır.

2-VEGF VE MAKULER ÖDEM

VEGF’nin permeabiliteyi indükleyici etkileri, makuler ödem gelişiminin altında yatıyor gibi görünmektedir. Diabetik bir retinopati modelinde, VEGF inhibisyonuyla kanretina bariyerinin parçalanması hem engellenebilmiş hem de tersine çevrilebilmiştir [122].

Diabetik makuler ödemli hastalarda VEGF düzeyleri yükselmiştir ve sorunun varlığı ile korelasyon gösterir [123]. VEGF ayrıca, retinal ven okluzyonuna ve uveite eşlik eden makuler ödemin de nedensel faktörü olabilir. Rodentlerdeki bir uveit modelinde vitröz hücre ve kan retina bariyeri parçalanması potent bir şekilde suprese edilebilmiştir. Uveite sekonder makuler ödemi bulunan insan gözlerinde artmış retinal VEGF düzeyleri mevcuttur [123].

VEGF ile indüklenmiş kan-retina bariyeri parçalanmasının altında yatan mekanizmalar kompleks gibi görünmektedir.

•

VEGF lökosit-aracılı endotel injurisi [124],

•

Fenestra formasyonu [125],

•

Sıkı bağlantıların çözülmesi [126]

•

Transsellüler kitlesel akım [127]

gibi çeşitli mekanizmalarla sızıntılı damarlar oluşturabilmektedir. Bu mekanizmalar tek başlarına yada birlikte etki ederek kan-retina bariyerinin parçalanmasına neden olabilirler.

Permeabilitede VEGF ile indüklenmiş artışlar VEGF’nin tonik bir şekilde bulunmasını gerektirir. VEGF’nin inhibe edilmesiyle yada geri çekilmesiyle kan-retina bariyeri yeniden yapılanabilmektedir.

kan-retina

bariyerinin

parçalanması

için

gerekli

olan

VEGF

maruziyetinin miktarı ve süresi, yine artmış bir vaskuler permeabilite gerektiren başka bir proçes olan neovaskularizasyon için gerekli olan temas süresinden ve miktarından daha az olabilir [84,116].Neovaskularizasyonun gerçekleşmesinden önce vaskuler permeabilite

57

artışının görüldüğü ve bunun, neovaskularizasyon için gerekli bir aşama olduğu sanılmaktadır.

Makuler ödemde kortikosteroidlerin kullanılmasının efektif olduğu pek çok raporda açıklanmıştır. Bu pozitif etkinin meydana gelebilme mekanizmaları arasında retinal VEGF ekpsresyonunun down-regulasyonu [128] ve VEGF ile indüklenmiş lökosit injurisinin inhibisyonu yer almaktadır.

3-YAŞLA İLİŞKİLİ MAKÜLER DEJENERASYON (AMD)

AMD’li otopsi gözlerinin RPE’sinde (retinal pigment epitelinde) ve cerrahi olarak eksize edilen CNV membranlarının transdiferansiye olmuş RPE hücrelerinde VEGF aşırı eksprese edilmektedir. İntravitröz VEGF enjeksiyonları insan-dışı primatlarda koroidal endotel

hücrelerinin

proliferasyonunu

indüklemektedir.

Rekombinant

humanize

(insanlaştırılmış) bir monoklonal VEGF antikorunun aktif bir fragmanı olan rhu-FabV2’nin tekrarlayan intravitröz enjeksiyonları primat modelinde laserle indüklenmiş CNV’nin gelişimini inhibe etmektedir. VEGF geninin sıçan RPE’sine adenoviral transfeksiyonu, sonunda Bruch membranını bozarak florosein benzeri klinik CNV kaçağı/sızıntısı yapan subretinal yeni damarların oluşmasıyla sonuçlanan CNV gelişimine yol açmıştır. Solubl VEGF reseptörünün sıcan RPE hücrelerine adenoviral transfeksiyonu laserle indüklenmiş CNV gelişmesini inhibe etmiştir. VEGF sekansına hedeflenmiş (bu sekansı hedef alan) bir oligonükleotidin intravitröz enjeksiyonu sıçanlarda laserle indüklenmiş CNV’yi inhibe etmiştir [129] VEGF’nin endotelyal fenestrasyonları indükleyebildiği gösterilmiştir [130]. Bu değişiklikler, koriokapillaris’in RPE tarafından, bilinen bir sürvey (sağkalım) faktörü olan VEGF aracılığıyla trofik bir şekilde sürdürülmesi

ile uyumludur. RPE’den VEGF

sekresyonu polarize bir sekresyondur; yani, normoksik koşullarda basal (hücrenin basal tarafından olan, Bruch membranına doğru olan) sekresyon apikal sekresyondan 2 – 7 kat daha fazladır [101]. Hipoksik koşullarda aradaki bu fark daha da artmaktadır. Dahası, VEGF reseptörleri de iç koriokapiller endoteline tercihli bir şekilde lokalize olmaktadır.

RPE hücrelerinin üzerinde VEGF reseptörlerinin varlığı otokrin bir fonksiyonu da düşündürmektedir.

AMD’de intraretinal neovaskularizasyonun hemen hemen hiç olmaması ve ayrıca, fotoreseptörler tarafından aşırı VEGF ekspresyonu ile ilgili bir fare modelinde koroidal değil

58

ama intraretinal neovaskularizasyonun saptanması [131] uyaran yerinin önemini demonstre etmektedir. Bruch membranının artmış kalınlığı ve hidrofobikliği VEGF’nin kapillerlere ulaşmasını engelleyerek atrofiye neden olur ve bu da sonuçta, oluşan debrisin Bruch membranından temizlenmesini önler. İleriye doğru beslenen bu olaylar dizisi mevcut olan hipoksi ve Bruch membranı yıkımı ile birlikte VEGF’yi indükleyerek CNV’yi uyarabilir.

Koroidal damarlardan köken alan yeni oluşmuş damarlar ve bu damarlara eşlik eden kan ve sıvı Bruch membranını parçalayıp geçerek subretinal pigment epiteli boşluğuna ve/veya subretinal boşluğa girerek retina yüzeyinde düzensiz elevasyonlara sebep olur. Hastalar, metamorfopsi olarak adlandırılan deforme olmuş nesnelerden şikayet ederler. Bu neovaskularizasyonun kesin tetikleyicisi halen bilinmemektedir. Retinal neovaskularizasyonun önemli bir özelliği olan hipoksi CNV gelişiminde de rol oynuyor olabilir. Bruch membranında lipofilik materyalle meydana gelen kalınlaşma sonucunda Oksijenin koroidden RPE epiteline ve retinaya difüze olmasının azaldığıda öne sürülmüştür. En son kanıtlar, CNV gelişiminde VEGF-A için merkezi bir rolün söz konusu olduğunu düşündürmektedir. Cerrahi olarak eksize edilen koroidal neovaskuler membranlardaki fibroblastik hücrelerde ve trans-diferansiye olmuş RPE hücrelerinde VEGF-A mevcuttur. CNV gelişimi açısından yüksek bir risk taşıyan AMD hastalarının makulalarında bulunan RPE hücrelerinde ve deneysel hayvan modellerinde de VEGF-A ekspresyonu artmaktadır. Sağlıklı kontrol olgularıyla karşılaştırıldığında, AMD ve CNV’si bulunan hastalarda VEGF-A düzeylerinin belirgin bir şekilde daha yüksek olduğu saptanmıştır.

Normal gözdeki en son verilere dayanarak, AMD’de CNV patogenezi için olası bir senaryo; İn vitro koşullarda, normal RPE hücreleri VEGF-A’yı baskın bir şekilde yani esas olarak basolateral taraflarında koriocapillaris’e doğru sekrese ederler. Basolateral taraftaki VEGF-A sekresyonu in vitro koşullarda hipoksi esnasında belirgin bir şekilde artmaktadır. İn vivo olarak, normal gözlerde VEGFR’lerin her üçü RPE hücrelerine bakan koriocapillaris endoteli tarafında lokalize bulunmaktadır.Bu durum, RPE hücreleri ile koryokapillaris arasında parakrin bir ilişkiyi düşündürmektedir.

Yaşlanmayla, ama

özellikle de AMD durumunda, Bruch membranının kalınlaşmasıyla bu parakrin ilişkinin bozulabileceğini düşünmek oldukça çekici ve caziptir (132). Böylece VEGF-A, destekte bulunmak üzere koriokapilarise ulaşamıyor olabilir. Bu durum, yaşlanmakta olan gözlerde gerçekten de gözlenen koryokapillaris atrofisi ile uymludur. RPE hücrelerinin deneysel bir şekilde tahrip edilmesinin koryokapillaris atrofisi ile sonuçlandığının gözlenmesi bunu

59

desteklemektedir. Bunun sonucunda dış retinada hipoksi gelişebilmekte ve Bruch membranının RPE tarafında VEGF-A akümülasyonuna yol açmaktadır.Bunun CNV’ye yol açmasının CNV’yi indüklemeye yetecek düzeyde olduğu saptanmıştır. Bu bulgular birlikte değerlendirildiğinde AMD-ile ilişkili CNV patogenezinde VEGF-A’nin önemli bir rolü olduğunu düşündürmektedir.

Yukarıda da belirtildiği gibi neovaskularizasyon, endojen anti-angiogenik faktörerin azalmış üretimine ve/veya pro-angiogenik faktörlerin artmış üretimine bağlı olarak gelişebilmektedir. Laserle indüklenmiş CNV ile ilgili deneysel bir sıçan modelinde koroidal neovaskuler dokulardaki hücrelerde PEDF düzeyi azalmış olarak saptanmıştır.

Bu dokularda VEGF-A proteini güçlü bir şekilde saptanmıştır. Aksine, CNVyi kapatan RPE hücrelerinde PEDF güçlü bir şekilde eksprese edilmektedir. Laserle CNV’nin indüklenmesinden bir kaç hafta sonra VEGF-A ekspresyonu düşmüştür. Bu yüzden, esas olarak RPE hücrelerinden salgılanan PEDF’nin CNV regresyonuna yol açmış olabileceği öne

sürülmüştür.(112).

PEDF

eksprese

eden

adenoviral

vektörlerin

intraokuler

enjeksiyonundan sonra CNV’nin belirgin bir şekilde azaldığını gösteren bir diğer yeni çalışma bunu daha da desteklemektedir (98).

4-VEN OKLÜZYONLARI Santral retinal ven okluzyonu (CRVO) tutulan segmentlerde azalmış doku perfüzyonuna ve artmış hidrostatik basınca neden olan vaskuler obstruksiyondur. Bu durum intraretinal hemorajiyi, sıvı eksüdasyonunu, farklı derecelerde iskemiyi ve rubeosis iridis ve neovaskuler glokom gibi olası neovaskuler komplikasyonlarıbarındırır.CRVO ile ilişkili vizüel azalmanın kanıtlanmış bir tedavisi bulunmamaktadır. İntravitreal triamcinolone enjeksiyonu bazı hastalarda makuler ödemin belirgin bir şekilde azalmasına neden olmuş ve buna venöz dilatasyonda, intraretinal hemorajilerde ve optik disk şişmesinde azalma eşlik etmiştir. [133]. İntravitreal triamcinolone enjeksiyonu sonrasında görme keskinliği ve santral makula kalınlığı iyileşiyor gibi görünmektedir ancak potansiyel faydaların yükselmiş intraokuler basınç (IOP) ve özellikle tekrarlanan enjeksiyonların uygulanması durumunda hemen hemen kesin şekilde katarakt formasyonu gelişimi [134] gibi risklere karşı tartılması gerekmektedir.

Retinal ven okluzyonu, özellikle neovaskularizasyonla komplike olmuş olgularda daha belirgin olmak üzere vaskuler endotelyal büyüme faktörünün (VEGF) artmış intravitreal düzeyleriyle ilişkilidir.[135]. CRVO’lu gözler intraretinal VEGF mRNA ekspresyonu artmaktadır. [136]. VEGF’nin anti-sense oligodeoksinukleotidle veya anti-VEGF bir 60

monoklonal antikorla [137] inhibe edilmesi hayvanlardaki CRVO modellerinde iris neovaskularizasyonunun azalması veya tam olarak önlenebilmesi ile sonuçlanmıştır. İntraokuler VEGF enjeksiyonu retinal mikrovaskuler anormalliklere ve retinal iskemiye yol açtığı ve ayrıca retinal ven okluzyonunun kendisi de hastalık şiddetine göre değişen biçimde artmış intraokuler VEGF düzeylerine yol açtığı için [138], insan CRVO’sunda VEGF inhibisyonu terapötik bir potansiyele sahip olabilir.

5-İRİS NEOVASKULARİZASYONU VE NEOVASKÜLER GLOKOM İris neovaskularizasyonu (INV) ve daha sonrasında (INV’ye bağlı olarak) neovaskuler glokom gelişimi proliferatif diabetik retinopatili (PDR) hastalarda ciddi vizyon kaybıyla seyreder. Rubeosis iridis regresyonu için en etkili tek rutin tedavi panretinal fotokoagulasyondur. Ancak tek başına fotokoagulasyon her hastada INV’nin durdurulmasında tam bir başarı sağlayamamaktadır. Daha önceden yapılan çalışmalar INV’nin, okuler neovaskularizasyonda kritik bir molekül olan vaskuler endotelyal büyüme faktörünün üretimini uyaran retinal iskemi ile yüksek düzeyde korele olduğunu göstermiştir [139].

Dolayısıyla neovaskularizasyonu tedavi etmenin bir diğer potansiyel terapötik stratejisi, İNV için intravitreal Bevacizumab uygulanmasının efektif olduğu öne sürülmüş ve giderek artan sayıda çalışma bunu desteklemektedir.Yapılan çalışmalarda INV de bir hafta içinde gerileme, vaskuler kaçakta azalma gösterilmiştir.Bazı gözlerde ikinci bir enjeksiyon gerekebilir.IOP genellikle normale dönmektedir.Takip dönemileri boyunca intraokuler enflamasyon ya da komplikasyon gözlenmemiştir. (140) VEGF’ye karşı gelişmiş olan nötralizan antikorun intravitreal olarak enjeksiyonu, insan

olmayan

primatlarda

retinal-iskemi

ile

ilişkili

INV’yi

efektif

bir

şekilde

önlemiştir.Rekürrens mümkündür ancak belirgin değildir ve tekrarlanan enjeksiyonlarla önlenebilmektedir.Erken dönem neovasküler glokomu bulunan olgularda bile IOP çoğunlukla kontrol altına alınabilmiştir.Bulgular INV için Avastin uygulamasının en seçkin acil tedavi olabileceğini düşündürmektedir. İntravitreal Bevacizumab enjeksiyonu, özellikle fundusuörten kataraktı veya vitröz hemorajisi bulunan gözlerde laser fotokoagulasyonundan çok daha avantajlı bir tedavi olabilir. Ancak bu tedavinin etkinliği geçici gibi görünmektedir ve tedavinin uygulama sıklığı bilinmemektedir.

6-PREMATÜRE RETİNOPATİSİ (ROP)

Hipoksi DR ve AMD gelişiminde önemli bir rol oynarken, hiperoksi de Prematürite Retinopatisinin (ROP) gelişiminde önemli bir rol oynamaktadır. ROP,

61

respiratuar distress altında bulunan premature neonatallerin sürveyini arttırmak için yaygın bir şekilde uygulanan hiperoksinin bir yan etkisidir. Hiperoksi, gelişmekte olan retinal damarların oblitere olmasına yol açmaktadır çünkü muhtemelen normal gelişim ve/veya sürvey sinyali ortadan kaybolmaktadır. Bu stimulus, hiperoksi ile suprese edildiği bilinen VEGF-A ekspresyonu olabilir. Hiperoksi bir kez sonlandıktan sonra, hipoksi ile sürdürülen

vaskuler

proliferasyon

indüklenmektedir.

Aynı

zamanda

VEGF-A

ekspresyonu, normal bir şekilde gelişen retinada olduğundan bile daha yüksek düzeylerde güçlü bir şekilde upregüle edilmektedir. Bu proliferatif büyüme mekanizmalarının aslında, normal damar büyümesinin ekzajerasyonları yani abartılı bir hali olduğu öne sürülmüştür.

Son zamanlarda, IGF-1’in normal retina gelişimde ve ayrıca muhtemelen patolojik ROP gelişiminde de kritik bir rol oynadığı saptanmıştır. Erken neonatal dönemde IGF-1’in yokluğu, normal vaskuler büyümenin olmaması ve bunun sonucunda proliferatif ROP’un görülmemesi ile ilişkilidir. Bu fenomen, IGF-1 açısından defektif olan farelerde ve 32 haftadan önce doğan çocukların kan örneklerinde incelenmiştir. Her ne kadar IGF-1 defektif farelerde VEGF-A’nın normal bir şekilde eksprese edildiği saptanmış olsa da retinal vaskuler büyüme belirgin bir şekilde retarde bulunmuştur. Bu durum, IGF-1 yokluğunda

VEGF-A’nın

normal

vaskuler

büyümeyi

stimüle

edemediğini

düşündürmektedir. Ayrıca, prematüre infantlarda, doğumda düşük olan IGF-1 düzeyleri hızlı bir şekilde yükseldiğinde normal bir vaskuler büyüme olabilmekte ve ROP gelişmemektedir. IGF-1 uzun bir süre boyunca düşük düzeyde kaldığında damar büyümesinin durduğu, olgunlaşmakta olan retinanın hipoksik hale geldiği ve vitrede VEGF-A akümülasyonunun görüldüğü hipotezi geliştirilmiştir. IGF-1, yüksek VEGF-A düzeyleriyle birlikte belli bir eşik değerine ulaştığında yeni damarlarda hızlı bir büyüme (retinal neovaskularizasyon) tetiklenmektedir (141) VEGF VE TERAPÖTİK YAKLAŞIMLAR A-ANTİ VEGF TEDAVİ STRATEJİSİNİN REALİTESİ Tümör hücrelerine ve neovasküler dokuya nutrientleri ve oksijeni taşıyacak yeterli bir vaskulatürün gelişimi tümör büyümesi için şarttır.Yeni kan damarlarının gelişmesinden ibaret olan angiogenez süreci, konak vaskulatürün yeni kapillerler tomurcuklandıracak bir şekilde stimule edilmesiyle meydana gelir. Angiogenezin çeşitli hastalıklarda hayati bir öneme sahip olduğunun anlaşılması, angiogenezi düzenleyen faktörlerin yoğun bir şekilde araştırılmasına ve angiogenezi etkileyen çeşitli moleküllerin tanımlanmasına yol açmıştır. Bu moleküllerin çoğu, örneğin bazik fibroblast büyüme faktörü (bFGF) ve matriks metalloproteinazları nısbeten geniş 62

bir etki aralığına (spektrumuna) sahip olup angiogenezdeki potansiyel rollerine ek olarak diğer sistemler üzerinde de etki gösterirler.

Vaskuler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) angiogenezin santral ,merkezi en önemli mediatörü olarak tanımlanmıştır. Angiogenezde anahtar bir mediatör olarak tanımlanmıştır.

VEGF ekspresyonu kolorektal kanser (CRC), meme kanseri, akciğer kanseri ve diğer tümörler gibi pek çok kanserde ve tüm neovasküler dokularda yükselmektedir.VEGF ekspresyon düzeyi CRC, serviks ve meme kanseri ve melanom gibi bazı tümörlerde ayrıca mikrodamar

dansitesi

(yoğunluğu)

ve

metastatik

yayılım

ile

de

korelasyon

göstermektedir.Neovasküler doku yogunluğu ile tam bir korelasyonu yoktur. VEGF’nin tümör angiogenezindeki santral rolü ve tümör büyümesiyle olan korelasyonu göz önüne alındığında VEGF, angiogenez inhibisyonu için en fazla umut vaat eden terapötik hedef olarak ortaya çıkmıştır.

VEGF’yi hedef almanın en güçlü gerekçesi, mantığı tümör ve neovasküler angiogenezindeki santral rolü ve pek çok tümör tipinde eksprese edilmesidir. Diğer çeşitli karakteristikleri de VEGF’yi çekici bir hedef haline getirmektedir. VEGF kanda dolaştığı ve endotel hücreleri üzerinde direkt olarak etki ettiği için, tümör angiogenezinin VEGF yoluyla inhibe edilmesi için bu molekülün tümör dokularına penetre olması gerekmemektedir. VEGF endotel hücreleri için potent bir mitogen olmasına rağmen diğer hücre türleri üzerinde çok az bir etkiye sahiptir ve bu yüzden diğer fizyolojik proçesleri pek etkilememektedir. Angiogenez, yara iyileşmesi ve kadın üremesi haricinde normal fizyolojide sınırlı bir öneme sahiptir ve bu nedenden dolayı, VEGF inhibisyonunun diğer kanser tedavileriyle, bilhassa kemoterapiyle meydana gelebilen çeşitli yan etkileri oluşturması beklenmemektedir.

VEGF ayrıca, erişkinlerde nısbeten stabil ve sessiz bir durumda bulunan ve uyun bir yaşam süresine sahip bulunan endotel hücreleri üzerinde de etki etmektedir. Bu stabilite, söz konusu endotel hücrelerinin tedaviye rezistan bir fenotipe mutasyon gösterme olasılıklarının unstabil tümör hücrelerinden çok daha az olacağı anlamına gelmektedir ki bu özellik endotel hücrelerini, uzun-dönemli bir tedavi için özellikle neovaskülarizasyonda çekici bir hedef haline getirmektedir.

Fizyolojik angiogenezde VEGF, yeni kan damarlarının formasyonunu stimule eder ve immatür damarların diğer faktörlerle koordinasyonunu sürdürerek normal bir yapı ve fonksiyona sahip olmalarını sağlar. VEGF ile stimüle edilen neovasküler kan damarlarında bu koordinasyon kaybolmuştur ve bu durum, bozuk damarların kör uçlarla proliferatif bir şekilde çoğalmasına yol açar. VEGF ayrıca kan damarlarının permeabilitesini de arttırarak kötü şekilde perfüze olan dokulara ve sonuta VEGF üretimini daha da arttıran hipoksi oluşumuna yol açar.

63

Sızıntı yapan kan damarları ayrıca dokularda yüksek bir intersisyel basınca da neden olur. Bu etkiler

bazı

tedavi

stratejilerinin

dokuya

ulaşmasını

zorlaştırır.

VEGF

inhibisyonu

permeabilitenin normale dönmesi ve azalmış intersisyel basınç ile sonuçlanır ve bu da nevasküler dokuların tedaviye daha duyarlı dokular haline gelmesi demektir.

VEGF’nin hipoksik durumlarda upregüle edilmesi son derece spesifiktir.

HIF’ler(hipoksi indusible faktör), VEGF ailesinde bulunan diğer üyelerin ekspresyonunu upregüle etmemektedir.Bu gerçekte hedef olarak duyarlı ve merkezi rolü olan bir molekül seçimini haklı kılmaktadır.

VEGF üretimi, tümörler tarafından sıklıkla (yaygın şekilde) eksprese edilen epidermal büyüme faktörü, transforme edici büyüme faktörü alfa ve beta, fibroblast büyüme faktörü (FGF) ve platelet kökenli büyüme faktörü (PDGF) gibi çeşitli majör önemli büyüme faktörleri tarafından upregüle edilmektedir . Östrogen ve TSH gibi hormonlar [172] ve IL-1 ve IL-6 gibi enflamatuar sitokinler de pek çok hücre türünde VEGF üretimini indüklemektedir . P53 gibi tümör supresör genlerinde ve ras gibi onkojenlerde meydana gelen mutasyonların da VEGF’yi upregüle ettikleri gösterilmiştir. VEGf üretiminin indüklenmesi pek çok tümör ve neovasküler dokuda karakteristik gibi görünmektedir ve VEGF inhibisyonunun bu tümörlerde ve neovasküler dokularda angiogenik aktiviteyi inhibe etmesi de mümkün gibi gözükmektedir.

VEGF ekspresyonunun tümör hücre büyümesini ve sürveyini arttırmada angiogenezi arttırmanın dışında direkt, otokrin etkilerinin de bulunduğu gösterilmiştir.Bu nedenle antiVEGF stratejiler bu otokrin döngüyüde kırmaktadır. İnsan tümörlerinde artmış neovaskuler formasyon ve artmış intratümöral mikrodamar dansitesi daha kötü bir prognozla ilişkilidir [142]. Bu bulgular, VEGF ekspresyonu derecesi ile korelasyon gösteriyor gibi görünmektedir çünkü VEGF ekspresyonunun çeşitli solid tümörlerde güçlü bir prognostik indikatör (gösterge) olduğu gösterilmiştir [142]. VEGF ekspresyonunun prognostik önemi daha sonraları, çeşitli farklı solid tümörlerde ve hematolojik malignitelerde de gösterilmiştir.Fakat neovasküler doku dansitesi ile veya bu dokunun yayılımı ile korelasyonu belirsizdir.Yani az miktardaki VEGF agresif bir neovasküler doku oluturabilirken fazla miktarları daha az neovasküler doku oluşturabilir.Muhtemelen VEGF etkilerine aracılık eden moleküllerinde doku davranışı üzerine etkileri vardır.

VEGF ideal bir terapötik hedeftir. VEGF’yi yada hücre yüzeyindeki reseptörlerini hedef alan yaklaşımlar da dahil olmak üzere çeşitli yaklaşımlar geliştirilmiştir. Reseptörü hedef alan çeşitli moleküller arasında VEGF reseptör tirozin kinaz inhibitörleri ve monoklonal antikorlar yer almaktadır. Reseptörü hedef alan yaklaşımların bir dezavantajı, VEGF reseptörlerinin aynı zamanda VEGF ailesinin diğer üyelerini de bağlayabilmeleri ve angiogenez 64

dışındaki diğer sistemleri etkileyebilmeleridir [143]. Aynı argüman, VEGF dışındaki faktörleri de bağlayabilen solubl reseptör yapıları için de geçerlidir. Dolayısıyla, VEGF’yi hedef almanın majör avantajlarından biri, yani normal fizyolojik proçesler üzerindeki etkilerin minimize edilmesi, VEGF molekülünü yüksek bir spesifisite ile hedef almayan yaklaşımlarla azalabilmektedir.

VEGF inhibisyonu konusunda, üzerinde en iyi çalışılmış ve en ileri gelişmelerin sağlanmış olduğu yaklaşım humanize monoklonal bir antikor olan Bevacizumab (Avastin)’dir.

Bu, kanser tedavisi için şu anda onaylanmış bulunan tek anti-angiogenik ajandır. Büyük bir randomize kontrollü denemede, daha önceden tedavi görmemiş olan metastatik CRC’li hastalarda kemoterapiye Avastin eklenmesi medyan sağkalım yaşam sürelerinde %30’luk bir artışa neden olmuştur.Bevacizumab, insan VEGF’sine karşı gelişmiş bir fare antikorundan rekombinant DNA teknolojisiyle geliştirilmiştir [144] ve yüksek bir antiangiogenik ve antitümöral aktivitesinin olduğunu gösteren preklinik deneylere dayanılarak klinik geliştirme için seçilmiştir.

B-VASKULER REGRESYON VE VASKULER İNHİBİSYON Anti-VEGF stratejileri yeni kan damarlarının büyümesini ,çoğalmasını yavaşlatmada ve inhibe etmede etkili gibi görünmektedir. Ancak aynı statejiler, damarların regresyonu üzerinde farklı sonuçlara sahip gibi de görünmektedir. VEGF çekilmesi (kesilmesi yada blokajı) yeni büyümüş olan damarların regresyonuna yol açabilir ancak daha önceden gelişip yerleşmiş damarların regresyonunu sağlayamamaktadır. Yeni angiogenik tomurcuklar ortaya çıktıkça bu tomurcuklar lökositler tarafından remodele edilirler ve nöral hücreler tarafından hızla çevrelenirler (perisitler). Yeni oluşan kan damarları 10 – 14 gün içinde, kendilerini VEGf çekilmesine/kesilmesine karşı refrakter bir duruma getirecek matura duruma ulaşmaktadır (yani bu süreden sonra VEGF kesilse bile damarlar regrese olmamaktadır) [145]. Bu VEGf rezistansı durumu mural hücrelerin kendilerine bağlı olabilir.

Tümör angiogenez literatüründen elde edilen yeni veriler, başlangıç aşamasında bulunan vaskulatürden perisitlerin uzaklaşması (çıkartılması) durumunda yeni damarların VEGF eksikliğine duyarlı hale geldiğini ve sonuçta regrese olduklarını düşündürmektedir [145].

Perisitlerin toplanmasında ve maturasyonnuda yer alan büyüme faktörlerinin bazıları arasında PDGF-B de bulunmaktadır [145]. Bu faktörler, perisitlerin yeni kan damarlarından ayrılmalarını sağlayacak şekilde manüple edilecek olursa VEGF inhibisyonu yeni damarların regresyonuna yol açabilir.. Bunun AMD gibi hastalıklarda vizyon iyileşmesine yol açıp açmayacağı belirlenmeyi beklemektedir.

C-ANTİ VEGF İLAÇLAR 65

Oftalmik hastalıklar için en az 3 VEGF inhibitörü ileri klinik geliştirme aşamasında bulunmaktadır: Lucentis (Ranibizumab, rhuFab V2; Genentech Inc) ve Macugen (Pegaptanib sodium, Eyetech Pharmaceuticals) ve Avastin(bevacizumab, ).

1-Lucentis(Ranibizumab), yüksek affiniteli bir antikor fragmanıdır. AMD için bir antikor fragmanı tercih edilmektedir çünkü bu ilaç intravitreal olarak uygulanabilmektedir. Bu şekilde verildiğinde ilacın internal limitan membranı geçerek subretinal boşluğa ulaşabilmesi için 50 – 70 kDa’dan daha küçük olması gerekmektedir {146). Genentech’in ürettiği ürün, rekombinant DNA teknolojisi ile üretilmiş olan humanize edilmiş bir fare antikorudur. Lucentis bütün VEGF isoformlarını inhibe etmektedir ve AMD denemelerinde 4 haftada bir vitröz içine enjekte edilmiştir.

2-Macugen (Pegaptanib sodyum) V EGF165 isoformunu spesifik bir şekilde bloke eden bir aptamerdir [147].

Aptamer’ler, spesifik bir şekilde kıvrılmış olan ve ekstrasellüler hedeflere çok yüksek bir affinite ile bağlanan birer antikor şeklinde hareket eden kimyasal olarak sentezlenmiş oligonukleotidlerdir. Eyetech firmasının ürettiği bu aptamer 28 baz uzunluğundadır ve vitröz içindeki yarı ömrünü arttıracak 2 tane polietilen glikol grubuna sahiptir. Bu aptamer VEGF165 isoformuna çok yüksek bir affinite ve spesifisite ile bağlanır ve böylece söz konusu isoformun reseptörlerine bağlanmasını önler. AMD denemelerinde Macugen 6 haftada bir vitröz içine enjekte edilmiştir.

Pegaptanib sodyum ile ilişkili VISION çalışması

Yaşla ilişkili makuler dejenerasyon (AMD) gelişmiş dünyada irreversibl şiddetli görme kaybının önde gelen bir nedenidir. Neovaskuler form, bu olguların küçük bir kısmını temsil etmesine karşın (yaklaşık olarak %10 olguda görülmesine rağmen) şiddetli görme kaybı olgularının %90’ından sorumludur. V.I.S.I.O.N (Okuler neovaskularizasyonda VEGF İnhibisyon Çalışması) denemeleri pegaptanib sodyum’un angiografik alt-tipleri, başlangıçtaki vizyon durumu yada lezyon büyüklüğü ne olursa olsun çok geniş bir neovaskuler AMD’li hasta spektrumuna istatistiksel açıdan önemli ve klinik açıdan anlamlı faydalar sunabildiğini göstermiştir. Çalışma Dizaynı (Tasarımı) VISION Çalışmalarının çalışma tasarımları Kısaca özetlemek gerekirse; eş-zamanlı, randomize, çift-maskeli, çok-merkezli, yalancı-kontrollü 2 klinik çalışma benzer bir şekilde

66

dizayn edilmiş ve yürütülmüştür. Çalışmaların istatistiksel planı, verilerin kombine edileceği önceden belirtmiştir.

AMD’ye sekonder subfoveal koroidal neovaskularizasyonu bulunan ve en iyi düzeltilmiş görme keskinliği (VA) çalışma gözünde 20/40 – 20/30 ve diğer kontrol gözünde 20/800 yada daha iyi olan 50 yaş ve üzerindeki olgular çalışmaya alınmıştır. Bütün angiografik AMD alt tipleri bulunan hastalar çalışmaya kabul edilmiştir. Total lezyon boyutu 12 total disk alanını geçememekte ve lezyonun en az %50’si aktif koroidal neovaskularizasyondan olmalı ve lezyonun %50’den fazlasının subretinal hemoraji alanını içermemesi ön koşul olarak belirlenmiştir. Skarlaşma yada atrofi en fazla %25 oranında olması , ayrıca göz içi basıncının (IOP) <= 23 mmHg olması istenmiştir. Verteporfin ile 1’den fazla olmamak üzere fotodinamik tedavi uygulanması öyküsü bulunan hastalar da çalışmaya alınmıştır. Ayrıca, baskın şekilde klasik lezyonları bulunan hastalar da başlangıçta ve çalışmaların yürütülmesi esnasında araştırmacının taktirine göre fotodinamik tedavi görebilmelerine izin verilmiştir.

Hastalar başlangıçta, 54 hafta süreyle her 6 haftada bir kez toplam 9 tedavi kürü olacak şekilde intravitreöz enjeksiyon yoluyla 0.3, 1 ve 3 mg pegaptanib sodyum veya yalancı enjeksiyon uygulanacak şekilde gruplara randomize edilmişlerdir. 1.yıl sonunda olgular, 54 haftalık tedavi süresinin yeterli bir tedavi sağlayıp sağlamadığının belirlenebilmesi amacıyla 2.ci bir yıl için tekrar-randomize edilmişlerdir. İlk yıl boyunca pegaptanib sodyum grubuna randomize edilen olgular 54.haftada tedavi kesilecek şekilde yada aynı doz ve aralıklarla tedavi sürdürülecek şekilde 2 farklı gruptan birine 1:1 oranında tekrar randomize edilmişlerdir. İlk 1 yıl boyunca yalancı enjeksiyonlar uygulanan olgular ise tedavinin kesileceği yalancı enjeksiyonların sürdürüleceği yada 1 veya 3 mg’lık pegaptanib sodyum dozlarıyla tedavinin sürdürüleceği şekilde 4 gruptan birine 1:1:1:1 oranında tekrar randomize edilmişlerdir. Etik nedenlerden ötürü, tedavinin kesilmesi grubuna randomize edilen olguların 1.yıl boyunca tedaviden bir fayda görmüş olmaları ve ilacın kesilmesinin ardından en az 2 satırlık

(10

harflik)

bir

vizyon

kaybının

gelişmesi

durumunda

tekrar

tedaviye

başlayabilmelerine izin verilmiştir.

Enjeksiyon Protokolü Tüm olgulara, protokolde belirtilen okuler antisepsi prosedürü uygulanmış ve subkonjonktival anestezik verilmiştir. Antiseptik protokolünde rutin intraokuler cerrahide kullanılan şekilde steril preparatların ve örtülerin kullanılmasını enjeksiyondan önceki 3 gün süreyle topikal oftalmik antibiotik damlalarının yada enjeksiyondan hemen önce 10 ml’lik povidone-iyodür 67

yıkamalarının uygulanmasını zorunlu kılmaktaydı. Vitröze aktif dozlar enjekte edilirken yalancı enjeksiyon uygulanan olgularda identik boyutta ancak iğnesiz bir şırıngayla konjunktiva üzerine bası yapılmıştır. .

Klinik Monitorizasyon Vizyon ve IOP ölçümünü, anterior kamaranın (AC) enflamasyon ve diğer anomaliler yönünden inspeksiyonunu, Yaşla-ilişkili göz hastalıkları çalışması derecelendirme protokolü kullanılarak derecelendirilenlens opasitlerinin inspeksiyonunu ve vitröz cisim ile retinanın inspeksiyonunu kapsayan oftalmolojik bir muayene çalışmanın başında (başlangıçta), enjeksiyondan tam 6 hafta önce ve enjeksiyondan 30 dakika ve 1 hafta sonra uygulanmıştır.

Renkli stereoskopik fundus fotoğrafları ve florosein angiogramları başlangıçta ve 3, 5, 78 ve 102.ci haftalarda çekilmiştir.

Kan basıncı (BP), sıcaklık ve nabız gibi vital bulgular çalışma tedavisinden önce rutin bir şekilde kaydedilmiştir. Kan örnekleri, başlangıçta ve çalışma süresi boyunca her çalışma tedavisinden önce alınmıştır. Uygulanan laboratuar testleri hematolojik (komple kan sayımı) ve kimyasal (elektrolitler, renal ve hepatik fonksiyon testleri) değerlendirmeleri içermekteydi.

Veri Analizleri Analiz edilen tüm periyodlarda güvenlik populasyonu, en az 1 yıl boyunca tedavi almış olan tüm olgulardan yada tedavinin sonlandırılacağı gruba randomize edilen olgular için belirtilen dönem boyunca en az 1 yıl boyunca tedavi görmüş olan tüm olguları kapsamaktaydı.

SONUÇLAR 1.Yıl (başlangıçtan 54.haftaya kadar) Her 2 çalışmaya randomize edilen 1208 olgudan 1190 tanesi en az 1 yıllık tedavi görmüştür.Bazal yani başlangıçtaki demografik ve okuler karakteristikler tedavi grupları arasında farklılık göstermemekteydi .Başlangıçta tromboembolik olaylar açısından risk faktörleri bulunan (hipertansiyon, yüksek kolesterol düzeyleri, diabet, stroke veya geçici iskemik atak öyküsü, sigara içme öyküsü vb) hastalar pegaptanib sodyum grubunda, yalancı tedavi grubundaki olgularda olduğundan biraz daha yüksekti.

Toplam olarak 7545 intravitröz pegaptanib sodyum enjeksiyonu ve toplam 2557 yalancı enjeksiyon uygulanmıştır. Pegaptanib sodyum her 3 dozda iyi bir şekilde tolere edilmekteydi ve yalancı tedavi grubu da dahil olmak üzere tedavi grupları arasında genel

68

yanetki

oranı

veya

tedaviyi

sonlandırma

oranları

açısından

anlamlı

farklılıklar

bulunmamaktaydı. Okuler yanetkiler pegaptanib sodyum alan 892 olgunun 820’si (%92) ve yalancı tedavi alan 298 olgunun 260’ı (%87) tarafından yaşanmıştır. Şiddetli yanetkiler ise pegaptanib sodyum grubunda bulunan 892 olgunun 169’unda (%19) görülürken yalancı tedavi grubunda bulunan 298 olgunun 45’inde (%15) görülmüştür. Pegaptanib sodyum veya sham tedavisi almış olan az sayıdaki olgu tedaviyi yarıda bırakmıştır. (%10 ve %8) ve pegaptanib sodyum grubunda bulunan olguların %1-2’si ve sham tedavi grubunda bulunan olguların %1’i yanetkiler nedeniyle tedaviyi sonlandırmıştır.

Pegaptanib sodyum ile tedavi edilen gözlerde en sık rastlanan okuler yanetkiler göz ağrısı (%34), vitröz floater’lar (%33), punktat keratit (%32) ve artmış IOP idi (%20). Yaygın şekilde saptanan bu okuler yanetkilerin büyük bir çoğunluğu geçiciydi ve hafif – orta şiddetteydi. Şiddetli AC enflamasyonu görülmemiştir ve Pegaptanib sodyum ile tedavi edilen 892 olgunun sadece 9’unda (%1) orta dereceli enflamasyon meydana gelmiştir. Pegaptanib sodyuma karşı sensitizasyonun geliştiği görülmemiştir.

Kombine veri analizinde, sham grubuyla karşılaştırıldığında aktif tedavi gruplarında bulunan fakik olguların biraz daha büyük bir oranında katarakt gelişimi bildirilmiştir. İntravitröz enjeksiyon ile ilişkili olma olasılığı en fazla katarakt türü olan posterior subkapsüler kataraktta belirgin bir artış söz konusu değildi. 1 yıl boyunca, başka bir nedene bağlanamayan (travma, endoftalmit, vitröz hemoraji vb) sadece 3 olgu katarakt ekstraksiyonuna alınmıştır.

Pegaptanib sodyum gruplarında bulunan toplam 12 olguda endoftalmit bildirilmiştir.

Bunlardan sadece 1 tanesi (olgu yılı başına %0.1) eş-zamanlı şiddetli görme kaybı yaşamıştır ve 12 olgunun 8’i (%67) 2 satırlık görme kaybına uğramıştır (10 harf yada daha az). Bu olguların 9’unda vitröz biopsiden pozitif bir kültür sonucu alınmış olup en sık şekilde izole edilen organizma koagulaz-negatif Staphylococcus olmuştur. 12 olgunun 9’u (%75) endoftalmitin çözümlenmesinden sonra tedaviye devam etmiştir ve ek Pegaptanib sodyum enjeksiyonları almıştır. Endoftalmit olgularının büyük bir kısmı (9/12 yani %75’i) enjeksiyon hazırlama protokolünün ihlal edilmesi ile ilişkiliydi; bu olgularda örneğin göz kapağı spekulumunun kullanılması ihmal edilmiştir. Çalışma gözleridne 6 retinal dekolman (RD) bildirilmiştir. 2 olguda (0.3 ve 3 mg Pegaptanib sodyum gruplarında yer alan birer olguda) eksüdatif/hemorajik nitelikte olan

69

RD’lar vardı ve bunlar, altta yatan hastalık proçesine sekonder olabilirdi. Diğer 4 olguda regmatojen komponenti olan bir RD vardı. Çalışmaların ilk 54 haftası boyunca 5 olguda travmatik katarakt gelişmiştir. Bunların hepsi iatrojenik nitelikteydi. intravitröz enjeksiyon iğnesiyle lense teması ve/veya penetrasyonu söz konusuydu. Bu olguların tümü daha sonra katarakt ekstraksiyonu geçirmiş ve bir olgu dışında kalan diğer tümü çalışma tedavisini sürdürmüştür. Çalışma gözünde santral retinal arter perfuzyonunda geçici bir azalma 4 olguda görülmüştür.Bu durum 4 olgunun tümünde, enjeksiyondan hemen sonra yükselen IOP ile ilişkiliydi ve parasentez sonrasın da tüm olgular düzelmişti. Pegaptanib sodyum ile tedavi edilen olguların hiç birinin çalışma gözünde retinal ven okluzyonu bildirilmemiştir. Çalışmanın birinci yılında, Pegaptanib sodyum ile tedavi edilen olgularda enjeksiyon başına %0.21’lik bir insidansla sonuçlanan 16 vitröz hemoraji olgusu bildirilmiştir. 16 olgunun 7’sinde (%44) hemorajinin, altta yatan koroidal neovaskularizasyon ile ilişkili olduğuna karar verilmiştir. 9 olguda ise olayın enjeksiyon prosedürü ile ilişkili olduğuna hükmedilmiştir. Hemoraji hafif nitelikteydi. Ayrıca 2 olguda, eş (yan) gözde vitröz hemorajiler vardı.Vitröz hemorajilerin hiç biri retinal yırtıklarla veya dekolmanlarla birlikte değildi.

Enjeksiyondan hemen sonra (30 dk sonra) ölçülen ortalama IOP, enjeksiyon öncesi ölçülen IOP’den 2 – 4 mmHg daha yüksekti ve en yüksek ortalama artışlar 3 mg grubunda görülmekteydi. Bir sonraki, yani enjeksiyondan 1 hafta sonra yapılan IOP ölçümlerinde ortalama IOP değeri enjeksiyon-öncesi değerlere dönmüştü Enjeksiyon sonrasında toplam IOP için yapılan parasentez sıklığı düşüktü.Hiç bir olguda trabekülektomi gerekmemiştir ve hiç bir olgu artmış IOP yada ilerleyen glokom bulguları nedeniyle çalışmadan ayrılmamıştır. Çalışma gözünde, retinal yada koroidal vaskulatürde VEGF inhibitörü aracılı bir toksisite kanıtı mevcut değildi.

Sistemik toksisite bulguları gözlenmemiştir. Pegaptanib sodyum gruplarında dozyanıt ilişkisi gözlenmiştir .Hem Pegaptanib sodyum tedavisiyle hem de yalancı tedaviyle ilk 1 yıl boyunca %2’lik bir ölüm oranı görülmüştür ki bu, hastaların yaş grubunda beklenen bir ölüm oranıdır.İntravitröz Pegaptanib sodyum, nonselektif VEGF inhibitörü ajanların uygulanmasından

beklenen

potansiyel

VEGF-inhibisyonu

ile

ilişkili

yanetkilerle

-hipertansiyon, tromboembolik olaylar yada ciddi hemorajik olaylar – ilişkili değildi.

70

2.Yıl verileri (54 – 102.ci haftalar arası) Tüm alt gruplarda Pegaptanib sodyum, çalışmaların 2.yılında olumlu bir enjeksiyon güvenliği profili sergilemeyi sürdürmüştür. Çalışmanın ikinci yılı boyunca tüm gruplarda endoftalmit insidansı enjeksiyon başına %0.10, travmatik katarakt insidansı enjeksiyon başına %0.02 ve RD insidansı da enjeksiyon başına %0.17 idi. İkinci yılda endoftalmit geçiren 4 olgudan hiç biri şiddetli vizyon kaybı yaşamamıştır. 2 olgu <=1 satırlık bir görme kaybı geçirmiştir (<= 5 harflık). İkinci yıldaki tüm gruplarında, Pegaptanib sodyum alan olguların çalışma gözlerinde 11 vitröz hemoraji olgusu bildirilmiştir. Bu, enjeksiyon başına %0.27’lik bir insidans demektir.

TARTIŞMA Bu 2 prospektif randomize çalışmadan elde edilen veriler Pegaptanib sodyum tedavisi için hem sistemik hem de oftalmolojik açıdan olumlu bir güvenlik profilini göstermektedir.

Bu çalışmalarda hastalar hem 1.ci hem de 2.ci yılda yüksek uyum oranlarını sergilemektedir.

2.yılda aynı tedaviye devam eden olgular 17 olası tedavinin ortalama olarak 16’sını almıştır.

Bütün Pegaptanib sodyum dozları iyi bir şekilde tolere edilmiştir.

Sık rastlanan okuler advers olaylar, yalancı tedavi uygulanan hastaların çalışma gözlerinde her bir aktif tedavi grubunun

gözlerindekine göre daha yüksek bir oranda

bildirilmiştir. Bu durum, olayların çoğunun intravitröz enjeksiyon öncesi hazırlık prosedürü ile ilişkili olabileceğini düşündürmektedir.

Tedavi için bir aptamerin kullanılmasından

bekleneceği gibi, immunolojik yanıtta ciddi bir tetiklenme olmamıştır. Bu durum, şiddetli AC enflamasyonunun olmaması ile kendini belli etmektedir. Bu çalışma esnasında görülen geçici IOP artışları, her türlü intravitröz enjeksiyon uygulamasından beklenenlere uygundur. Retinal dekolman ve travmatik katarakt seyrekti ve tedavi ve yalancı tadavili hastalar arasında katarakt progresyonu açısından anlamlı farklılıklar mevcut değildi. Florosein angiografisinde, eksüdatif AMD’nin doğal seyrinden beklenenin dışında bir retinal vaskuler anomali tanımlanmamıştır.

Vitröz içine enjekte edilen herhangibir ajan için geçerli olduğu gibi, bu çalışmada da en korkulan güvenlik meselesi endoftalmi gelişimi ve ona bağlı olarak meydana gelen görme kaybı idi. (11636 enjeksiyonun 16’sında endoftalmit gelişmişti (yani insidans, enjeksiyon başına %0.14 idi] ve 16 endoftalmit olgusunun birinde görme kaybı gelişmişti). Hasta hazırlığına daha fazla dikkat edilerek endoftalmitis oranı enjeksiyon başına %0.07’lik bir insidans oranına düşmüştür..Enfeksiyon olayının insidansında istatistiksel açıdan anlamlı bir

71

azalmadır ve intravenöz pegaptanib sodyumla endoftalmitis gelişme riskinin düşük olmasına rağmen bu riskin aslında modifiye edilebilir olduğunu ve aseptik tekniğe özen gösterilerek daha da düşürülebileceğini düşündürmektedir. İşin en önemli tarafı; Pegaptanib sodyum, nonselektif VEGF inhibitörü ajanların uygulanmasından beklenen potansiyel VEGF-inhibisyonu ile ilişkili advers olaylarla – hipertansiyon, tromboembolik olaylar yada ciddi hemorajik olaylar – ilişkili değildi.

AMD tedavilerinin farmakolojisi ilerledikçe, başarılı bulunan ajanlar etkinliklerine ve güvenliklerine göre ölçülecektir. Pegaptanib sodyum tedavisinin fotodinamik tedaviyle karşılaştırıldığında bildirilen akut görme kaybı kaybı riski göz önüne alındığında, pegaptanib sodyumun güvenlik profili daha üstün gibi görünmektedir. Bu çalışmalarda intravitröz pegaptanib sodyumun oluşturduğu okuler enflamatuar bir yanıtın bulunmaması, patolojik olayları sürdüren en yaygın isoformun (VEGF165’in) selektif şekilde blokajı ve ilaçla ilişkili tromboembolik olayları düşündürecek kanıtların olmadığı düşünüldüğünde pegaptanib sodyumun 2 yıllık güvenlik profili ikna edici görünmektedir.(148)

3-BEVACİZUMAB (AVASTİN) A-AKTİVİTESİ İLE İLGİLİ PREKLİNİK KANITLAR Farelerdeki asıl Bevacizumab antikoru olan muMAbA.4.6.1 ilk olarak, rhabdomyosarkom

neovaskularizasyonunu

tamamen

suprese

ettiği

fare

modellerinde

değerlendirilmiş. Bu modellerde vaskuler permeabiliteyi, damar çapını ve turtositesini azaltmıştır.

muMAbA.4.6.1,

>=2.5

mg/kg

dozlarda

tümör

büyümesini

suprese

edebilmekteydi .Bunun ardından, humanize (insanlaştırılmış) antikor olan Bevacizumab’ın antitümöral etkileri olduğu ve in vitro koşullarda endotel hücrelerinin VEGF ile indüklenen büyümesini farelerdeki asıl antikora benzer bir şekilde inhibe ettiği saptanmıştır.

Hayvan xenograft modellerinde Bevacizumab’ın tümör vaskulatürü üzerinde şiddetli etkilerinin olduğu gösterilmiştir. Kolon Tümör damar dansitesi belirgin bir şekilde azalıp intersisyel basınç %75 oranında azalırken , atimik sıçanlarda meme tümöründe vaskuler permeabilite azalmaktadır. Bevacizumab in vitro koşullarda, kemoterapiyle yada radyoterapiyle yapılan kombinasyonda sinerji göstermektedir. Bevacizumab, endotel hücrelerinin docetaxel tedavisine karşı VEGF ile indüklenen korunmalarını yenmekte ve in vivo koşullarda hayvanların cisplatin (Platinol), topotecan (Hycamtin), capecitabine (Xeloda) veya radyasyon eklenmesi durumunda ortaya çıkan endotel hücre korunmasını ortadan kaldırmaktadır.

72

Bevacizumab’ın güvenliği ve farmakokinetik özellikleri genç erişkin cynomolgus maymunlarında değerlendirilmiştir. 50 mg/kg’a varan dozlarda haftada 2 kez uygulanan Bevacizumab tedavisinin ardından görülen yan etkiler sadece epifizyal displazi ve over ve uterusda ağırlık azalması olmuştur. Bu etkilerin her ikisi de tedavinin kesilmesiyle geriye dönmüştür. Bevacizumab’ın farmakokinetik özellikleri 1 – 2 haftalık terminal bir yarılanma ömrü, 5 ml/gün/kg’lık bir klerens değeri ve %100’lük bir biyoyararlanımla ön görülebilir nitelikteydir. Bu preklinik çalışmalardan sağlanan cesaret verici veriler; metastatik CRC tedavisi için kemoterapiyle kombinasyon halinde Bevacizumab uygulanmasının onaylanmasına yol açan sebepler bu antikorun diğer solid tümörlerde ve hematolojik malignitelerde ve neovaskülarizasyon ile yıkıcı etkiler oluşturan hastalıklarda gösterdiği anlamlı ve olumlu sonuçlardır.

Her 3 antiangiogenik drogda güvenli ve iyi tolere ediliyor gibi görünmektedir. Erken fazdan ve büyük ölçüde kontrolsüz denemelerden elde edilen veriler umut vaat etmektedir [149,150]. Hem Lucentis hem de Macugen, yaş AMD’li hastalarda vizüel stabiliteye ve düzelmeye yol açmaktadır. Macugen’in faz 2 ve 3 klinik denemeleri tamamlanmıştır ve bu ajanın neovaskuler AMD’li hastalara istatistiksel ve klinik açıdan anlamlı bir fayda sağlayabildiği gösterilmiştir [151]. Bu ilaç, neovaskuler AMD’de kullanılması için kısa bir süre önce FDA tarafından onaylanmıştır

B-SANTRAL RETİNAL VEN OKLUZYONUNDA MAKULER İNTRAVİTREAL BEVACİZUMAB (AVASTİN) İLE TEDAVİSİ

ÖDEMİN

Kanser tedavisi için VEGF’ye yönelik rekombinant monoklonal, insanlaştırılmış bir antikor (Bevacizumab, Avastin, Genentech) mevcut bulunmaktadır. İnsanlarda intravitreal Bevacizumab daha önceden, CRVO ve yaşla-ilişkili makuler dejenerasyon tedavisinin bir temeli olarak açıklanmış bulunmaktadır.

CRVO morbiditesini azaltabilme umuduyla CRVO’lu hastalara intravitreal Bevacizumab enjeksiyonu uygulanmıştır. Bu çalışmalarda intravitreal Bevacizumab ile tedavi dilen CRVO’lu gözler hem anatomik hem de fonksiyonel iyileşme göstermiştir. Hastalar, büyük bir bölümü intravitreal triamcinolone enjeksiyonuna daha önceden kötü bir yanıt göstermiş olsalar bile makuler ödemde belirgin bir azalma ve görme keskinliğinde bir iyileşme göstermişlerdir. İntravitreal Bevacizumab enjeksiyonuyla ortaya çıkan enflamasyon, enfeksiyon, yükselmiş IOP, retina yırtığı veya retinal dekolmanı hastalarda hiç gözlenmemiştir.Rubeosis’in bulunup bulunmadığı sonucu etkilememiştir. CRVO’da VEGF salgısının iskemi tarafından stimule edildiği düşünüldüğü için, CRVO’lu tüm gözlerin bir

73

dereceye kadar iskemik olduğu görülmektdir.Bu iskemik retina VEGF kaynagını teşkil eder Bu açıdan Avastin iyi bir terapötik adaydır.(152) Bu bulgular VEGF’ye karşı geliştirilmiş tam uzunluktaki monoklonal bir antikor olan Bevacizumab’ın retinayı penetre ederek vaskuler permeabiliteyi indüklemekten sorumlu olan VEGF’e bağlanabildiğini ya da vitrözde makuler ödemi indükleyebilen VEGF’e bağlanabildiğini düşündürmektedir.

Bevacizumab’ın makuler ödemi efektif/etkili ve güvenli bir şekilde geçirebildiği çalışmalarda kesin olarak gösterilecek olursa, ven okluzyonlarına sekonder makuler ödem tedavisinde birinci basamak tedavimizin sadece Bevacizumab olması mümkün olabilecektir C-PDR DE KULLANIMI Preklinik çalışmalarında, VEGF’ye karşı geliştirilmiş antikorların uygulanmasıyla, deneysel olarak indüklenmiş olan rubeosisin kaybolduğu bildirilmektedir. Pegaptanib’in (Macugen, Eyetech Pharmaceuticals Inc, New York) de ufak retinal neovaskularizasyon alanlarının regresyonuna neden olduğu bildirilmiştir. Bevacizumab ile görülen çok hızlı, dramatik yanıt, bu antikorun VEGF’nin tüm izoformlarına karşı olan aktivitesiyle ilişkili olabilirken pegaptanib sadece VEGF165’i inaktive etmektedir. Bevacizumab’ın modifiye edilmiş bağlanma yerinden ibaret olan Ranibizumab (Lucentis, Genentech Inc, South San Fransisco, CA) daha küçük boyutta olması nedeniyle daha iyi bir retinal penetrasyon amacıyla geliştirilmiştir. Ancak, proliferatif diabetik retinopatide neovaskularizasyonun preretinal lokalizasyonda olduğu düşünüldüğünde daha iyi bir retinal penetrasyon çok da faydalı olmayabilir. Aslında, daha büyük boyuttaki Bevacizumab daha avantajlı olabilir çünkü Bevacizumab gözde, Ranibizumab’dan daha uzun bir ön görülen yarı-ömre sahip bulunmaktadır. İntravitreal Bevacizumab’un proliferatif diabetik retinopatiye sekonder neovaskularizasyonun regresyonuna neden olabileceği çalışmalarda

gösterilmiştir.Bu

regresyonun ne kadar süre persistan kalacağı (devam edeceği) bilinmemektedir ancak geçici bir etki bile çeşitli klinik durumlarda faydalıdır. Örneğin PRP’ye engel olan media opasitelerinin varlığında uygulanan avastin hemoraji ve vaskuler yapıların çekilmesini arttırarak faydalı olabilmektedir. İntravitreal Bevacizumab için yayınlanmış uzun-dönemli güvenlik raporlarının mevcut olmamasına rağmen bugüne dek yayınlanan kısa süreli çalışmalarda bu ilaç iyi tolere ediliyor gibi görünmektedir. İntravitreal Bevacizumab’ın proliferatif diabetik retinopati tedavisindeki rolünü muhtemelen, bu ilacın uzun dönemdeki güvenliği ve etki süresi belirleyecektir. Bevacizumab 74

yine de, etkisi geçici bile olsa, hızlı ve dramaitk biolojik etkisi nedeniyle en azından PRP’ye adjuvan (yardımcı) bir role sahip olabilir. PDR tedavisinde İntravitreal Bevacizumab’ın güvenliği ve etkinliği ile ilgili olarak daha fazla çalışma yapılması gerekmektedir.

D-REFRAKTER PSEUDOFAKİK KMÖ İÇİN KULLANIMI Katarakt ekstraksiyonu sonrasında gelişen Kistoid makuler ödem (KMÖ) genellikle spontan bir şekilde yada ilaç tedavisiyle geçmektedir. Ancak nadir durumlarda agresif tedaviye rağmen azalmış bir görme keskinliğiyle persistan olarak kalabilmektedir. KMÖ için periokuler steroidlerle yada intravitreal steroidlerle uygulanan tedavi artmış intraokuler basınca (IOP) ve glokoma neden olabilmektedir.Topikal nonsteroid antienflamatuvar tedavi, periokuler steroid uygulaması, intravitreal kortikosteroidler, pars plana vitrektomi ve/veya intravitreal Bevacizumab gibi seçenekler KMÖ de tedavi seçenekleridir.

1 mg intravitreal Bevacizumab, komplikasyon olmadan KMÖ’lü hastalarda uygulanmıştır. Bevacizumab enjeksiyonundan sonra, topikal NSAİ tedavisi çalışmalarda kesilmiştir (sonlandırılmıştır). Enjeksiyondan sonraki 10.günde hastanların vizyonları tam sıraya yaklaşmış ayrıca FA da KMÖ’nün tamamen geçtiğini gösterilmiştir.. Enjeksiyondan 6 hafta sonra hastaların vizyonları stabil kalmış ve KMÖ rekurrensi gözlenmemiştir.(153) İntraokuler lens implantasyonu ile birlikte uygulanan fakoemulsifikasyon şiddetli postoperatif CME ile komplike olabilmektedir. Bazı olgularda KMÖ topikal kortikosteroidler, topikal non-steroidller ve periokuler steroid tedavisini içeren tıbbi tedaviye refrakter olabilmektedir. İntravitreal triamcinolone’un olduğu kadar sub-tenon triamcinolone’un da refrakter pseudofakik KMÖ olgularında efektif olduğu gösterilmiştir. Ancak periokuler steroidlerin kullanımıyla glokom riski çok artmaktadır.

VEGF aynı zamanda, KMÖ’den sorumlu tutulan güçlü bir permeabilite faktörüdür.

Bevacizumab (Avastin) bir VEGF inhibitörüdür ve OCT ile Bevacizumab’ın intravitreal enjeksiyon sonrasında makuladaki ödemi azalttığı da gösterilmiştir. Uzun dönemdeki sonuç şu anda bilinmemektedir. KMÖ rekurrensi ihtimal dahilindedir ve ek tedavi gerektirebilir.

Sonuç olarak, intravitreal Bevacizumab kronik refrakter KMÖ’nün çarpıcı regresyonuyla birlikte görme keskinliğinde ortaya çıkan iyileşmeyi indükleyebilmektedir. Bu tedavi, topikal ilaçlara duyarsız olan KMÖ’nün bulunduğu hastalarda veya steroide yanıt veren fakat kortikosteroid tedavisi uygulanması konusunda tereddütleri bulunan hastalarda iyi bir tedavi seçeneği olabilir.

E-NEOVASKULER GLOKOMDA ANTERİOR SEGMENT NEOVASKULARİZASYONU ÜZERİNDE KISA-DÖNEMLİ SONUÇLARI

75

İskemik retinopatiler, iris yüzeyinde ve anterior kamera açısında bulunan kan damarlarının büyümesine bağlı olarak neovaskuler glokoma (NVG) yol açabilirler. Vaskuler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) iskemik retinal hastalıklarda ve NVG’de üzerinde en fazla çalışılmış olan angiogenik peptiddir. Anti-VEGF bir ajan olan Bevacizumab’ın neovaskuler hastalıkların tedavisi için intravitreal olarak enjekte edilmesi umut vaat edici sonuçlar vermiştir. 1.5 mg Bevacizumab’ın intravitreal yoldan enjekte edilmesinin diabetik retinopatiye sekonder NVG’si bulunan bir hastada iris ve açı neovaskularizasyonu üzerindeki etkilerini tatmin edici olmuştur. Biomikroskobide her iki gözde açıda NV ve retinada NVD olan hastada IOH de tespit edilmiş ve vitre hemorajisi her 2 gözde panretinal laser fotokoagulasyonunun

uygulanmasına

mani

olmuştur.Hastaya,

sağ

gözde

endofotokoagulasyon ile birlikte pars plana vitrektomi önerilmiştir. Hasta cerrahiyi reddetmiş ve bunun üzerine kendisine, sağ gözüne intravitreal Bevacizumab enjeksiyonu uygulanması önerilmiştir.İntravitreal Bevacizumab enjeksiyonundan 1 gün sonra yapılan muayene iris ve açı neovaskularizasyonunun parsiyel şekilde regrese olduğu görülmüştür. Bir hafta sonra yapılan iris florosein angiografisi (IFA) iris ve açı neovaskularizasyonunun komple regresyonunu ve florosein sızıntısının bulunmadığı gösterilmiştir. Gonioskopi ile iris ve açı neovaskularizasyonunun komple regrese olduğu görülmüştür. Tedavi sonrasında 8 hafta boyunca hastada progresyon olmamıştır. IOP 8 haftada 19 mmHg olarak ölçülmüştür. Vitre hemorajisi ciddi düzeyde temizlenmiştir . Bu olguda tek bir Bevacizumab enjeksiyonunun uygulanmış olmasına rağmen, daha uzun dönemli tedavi için tekrarlanan enjeksiyon(lar)ın yapılması gerekebilir Bevacizumab enjeksiyonu irisin azalmış neovaskularizasyonuna, IOP’de belirgin azalmalara ve ağrı geçmesine yol açmıştır. Sabit hızdaki VEGF sekresyonunun azaltılması ve neovaskuler döngünün durdurulması vitre hemorajisinin azalması panretinal fotokoagulasyon tedavisinin tamamlanmasına imkan tanır. İskemik retinopati ile birlikte görülen (ilişkili olan) NVG’nin standart tedavisi retinal argon laser fotokuagulasyondur.Tedavi edilen gözlerin %1.6’sında NVG’nin persistan kaldığı bildirilmektedir. Neovaskularizasyonun angiogenik stimulusuna yönelik bir farmakolojik tedavi iskemik retinal hastalıklar için alternatif yada yardımcı bir tedaviyi temsil edebilir. İntravitreal

Bevacizumab

enjeksiyonları,

yetersiz

bir

vizüalizasyonun

retinal

fotokoagulasyonla tedaviyi engellediği NVG’li hastalr için faydalı alternatif bir tedaviyi temsil ediyor olabilir.

F-TRİAMSİNOLONE ASETONOİD İLE KARŞILAŞTIRILMASI

76

Kesin etki mekanizması ne olursa olsun, Bevacizumab’ın steroidlere göre bazı teorik avantajları bulunmaktadır. Bu avantajlardan biri, glokoma yada katarakt progresyonuna neden olmasının olası olmamasıdır. Bir diğer avantajı ise koruyucu içermemesi ve retina için toksik olduğu bilinen herhangibir içeriğinin bulunmamasıdır. Bevacizumab ayrıca, berrak bir solusyon halinde bulunmaktadır ve triamcinolone acetonide enjeksiyonundan sonra sık bir şekilde bildirilen bir şikayet olan floaterlara neden olması söz konusu değildir.Triamcinolone acetonide enjeksiyonu ile maliyet açısından karşılaştırıldığında bile Bevacizumab, triamcinolone acetonide ile benzer maliyettedir.. İntravitreal Bevacizumab’ın majör dezavantajı, intravitreal triamcinolone acetonide ile karşılaştırıldığında daha sık enjeksiyon uygulanmasına ihtiyaç duyulabilmesidir çünkü triamcinolone acetonide vitröz içinde muhtemelen çok daha uzun bir yarı ömre sahiptir. Bir diğer dezavantaj ise Bevacizumab sistemik istenmeyen olaylarla ilişkili teorik risktir.

Bevacizumab intravenöz olarak enjekte edildiğinde en dikkat çekici riskler arasında hipertansiyon ve tromboembolik olaylar yer almaktadır; ancak intravenöz tedavi yaklaşık 400 kat daha yüksek ilaç dozlarını gerektirir ve infüzyonlar her 2 haftada bir uygulanır.

Neovaskuler yaşla-ilişkili makuler dejenerasyon tedavisi için intravenöz Bevacizumab kullanarak elde ettiğimiz sınırlı/kısıtlı deneyimlerde gözlenen tek istenmeyen olay hafif hipertansiyon olmuştur. Vitröz için 1.0 mg Bevacizumab enjekte edildiğinde, sistemik Bevacizumab düzeylerinin herhangibir ciddi istenmeyen olaya yol açmaya yetecek kadar olması olası görünmemektedir.

Tek bir hastada sadece 4 haftalık takiplerle elde edilen sonuçlar provakatiftir (kışkırtıcıdır) ve ek inceleme gerektirmektedir. Gelecekteki çalışmalar, doz-yanıt eğrisinin belirlenebileceği bir şekilde doz-arttırma stratejisini de içermelidir G-BEVACİZUMAB’IN YANETKİLERİ Avastin ile ilişkili yanetkiler literatürde şöyle sıralanmıştır; GİS kanaması ve perforasyonu, Yara iyileşmesinda gecikme, Arteryel tromboemboli, Burun kanaması, Hipertansiyon,

Proteinüri,

,

Ağrı,

Daire,

Halsizlik,

Lökosit

sayısında

azalma

bildirilmiştir.Oküler yanetkileri konusunda yeterli bir çalışma yoktur.Belirtilen tüm yanetkiler ilacın kendi farmakolojisinden değil uygulama yeri , uygulama prosedürü vb ile ilgili bulunmuştur.Retina dekolmanı, katarat progresyonu, endoftalmi, vitre hemorajisi gibi.Avastin enjeksiyonu sonrası halisünasyon gören bir olgu bildirilmiştir.

Avastin gebelikte kullanımı ile ilgili bilgi bulunmamaktadır.IgG nin plasentadan geçtiği bilinmektedir.Bu nedenle avastininde geçme ihtimali yüksek olup hayvan 77

çalışmalarında vaskulogenezi bozduğundan avastin kullanımı süresince etkili bir gebelikten korunma yöntemi reprodüktif çağdaki tedavi alacak kadınlara önerilmelidir.

VEGF RESEPTÖRLERİNE YÖNELİK TEDAVİLER VEGF sistemi aynı zamanda monoklonal antikorlarla yada spesifik tirozin kinaz inhibitörleri aracılığıyla VEGF’in reseptörleri hedef alınarak da inhibe edilebilir. Bunlar anjiojenezde direk veya indirek olarak rol alan VEGFR-1 (flt-1), VEGFR-2 (Flk-1), Tie-1 ve Tie-2 gibi reseptörleri hedef alan küçük moleküllerdir. Bunların içinde ise en önemlisi, özellikle tümör dokusunda endotel hücre proliferasyonu ve kemotaksisinden sorumlu olan Flk-1 (VEGFR-2)’ dir .

SU5416; klinik olarak test edilmiş ilk VEGF reseptör tirozin kinaz inhibitörüdür. Parenteral uygulanan kinolon derivesi olarak SU5416, VEGFR-2 (Flk-1)’i inhibe eder (154). Kısa yarılanma ömrü, aktif plazma konsantrasyonu için sık aralıklarla kullanılması, ve özellikle gemcitabine/cisplatin kemoterapisi ile kombine kullanımda ortaya çıkan pulmoner emboli, myokardiyal enfarktüs ve serebrovasküler olay geliştirmesi kullanımını kısıtlamaktadır.

SU6668; VEGF, bFGF ve PDGF reseptörlerini inhibe eden oral kullanımlı anti-anjiojenik ajandır (106). Günde tek dozluk uygulamalar hastalar tarafından tolere edilebilirken doz arttıkça nefes darlığı, göğüs ağrısı ve perikardiyal effüzyona sebep olabilmektedir .

SU11248; ise geniş spektrumlu oral tirozin kinaz inhibitörüdür ve VEGF, PDGF, c-Kit ile Flt-3 kinaz aktivitesini inhibe eder (155).

PTK787/ZK22854; oral VEGFR-1 ve –2 reseptör inhibitörüdür. Ataksia, vertigo, hipertansiyon ve venöz tromboembolizm görülen yan etkileridir. Hepatik metastazı olan kolorektal kanserli hastalarda kan akımını belirgin azalttığı gözlemlenmiştir. Kombine faz II ve III çalışmaları sürmektedir (156).

ZD6474; ise hem VEGF hem EGF reseptör tirozin kinaz inhibitörüdür. Kullanımı sırasında diyare ve cilt kızarıklığı görülmesi özellikle EGF reseptörlerinin yaygın olarak bloke edildiğini göstermektedir (157).

CP-547,632 ise selektif VEGFR-2 tirozin kinaz inhibitörüdür. Paz I çalışmaları sevindirici farmakokinetik sonuçlar vermektedir (158).

78

KAYNAKLAR 1. Riseu, W.Mechanisms of angeogenesis. Nature 386, 671-74 (1997).

2. Benjamin, L.E., Herno, I.& Keshet, E. A plasticity window for blood vessel remodelling is difined by pericyte coverage of the proformed endothellal network and is regulated by PDGF- B and VEGF. Devolopment 125, 1591-98 (1998).

3. Carmeliet, P.et al. Abnormal blood vessel devolopment and lethality in embryoslacking a single vascular endothelial growth factor allele. Nature 380, 435-39 (1996).

4. Ferrara, N. et al. Heterozygous embryonic lethality induced by targeted inactivation of the VEGF gene.Nature 380, 439-42 (1996).

5. Fong, G.H., Zhang, L Bryce, D.M.& peng, I.Increased hemangioblast commitment, not vas cular disorganization, is the primary defect in flt-1 knock-out mice.Development 126, 3015-25 (1999).

6. Carmeliet, P. Devolopmental biology. Controlling the cellular brakes (news).Nature 401, 657-58(1999) 7. Gale,N.W.&Yancapoulos,G.D.Growth factor acting via endothelial cell-specific reseptor tyrosine kinases:VEGFs,angiopoietins,and ephrins in vask端ler development.Genev Dev 13,1055-66 (1999)

79

8. Takahashi, T. et al. Ischemia- and cytokine-induced mobilization of bone marrowderived endothelial progenitor cells for neovascularization. Nat Med 5, 434-438 (1999) 9. Dvorak HF. Rous-Whipple Award Lecture. How tumors make bad blood vessels and stroma. Am J Pathol 2003; 162: 1747–57. 4 Carmeliet P. Angiogenesis in health and disease. Nat Med 2003; 9: 653–60.

10. Ferrara N, Gerber HP, LeCouter J. The biology of VEGF and its receptors. Nat Med 2003; 9: 669–76 11. Thurston, G. et al. Angiopoietin-1 protects the adult vasculature against plasmaleakace.

Nature Medicine 6, 1-4 (2000).

12. Maisonpierre, P.C. et al. Angiopoietin-2, a naturel antagonist for tie2 that disrupts in vivo angiogenesis. Sciense 277, 55-60 (1977).

13. Brooks, P.C., Siletti, S., von Schalscha, T.L., Friedlander, M. & Cheresh, D.A. Disruption of angiogenesis by PEX, a noncatalytic metalloproteinase fragment with İntegrin binding activity. Cell 92, 391-400 (1998).

14. Carmeliet, P. et al. Imparied myocardial angiogenesis and ischemic cardiomyopathy in mice lacking the vascular endothellar growth factor isoforms VEGF164 and VEGF188.

Nat Med 5, 495-502 (1999).

15. Dumont, D.J. et al. Cardiovascular failure in mause embryos deficient in VEGF receptor-3. Sciense 282, 946-949 (1998).

16. Ferrara. N. & Alitalo, K. Clinical application of angiogenic growth factors and their inhibitors. Nat Med. 5, 1359-1364 (1999).

17. Suri, C. et al. Increased vascularization in mice overexpressing angiopoietin-1. Science 282, 468–471 (1998).

18. Ferrara, N. & Alitalo, K. Clinical applications of angiogenic growth factors and their inhibitors. Nat Med 5, 1359–1364 (1999 19. Varner, J.A., Brooks, P.C. & Cheresh, D.A. Review: The integrin αvβ3: angiogenesis and apoptosis. Cell Adhesion Communication 3, 367–374 (1995).

20. Helmlinger, G., Yuan, F., Dellian, M. & Jain, R.K. Interstitial pH and pO2 gradients in solid tumors in vivo: high- resolution measurements reveal a lack of correlation. Nat Med 3, 177–182 (1997).

21. Carmeliet, P. et al. Targeted deficiency or cytosolic truncation of the VE-cadherin gene in mice impairs VEGF-mediated endothelial survival and angiogenesis. Cell 98, 147– 157 (1999).

80

22. Alon, T. et al. Vascular endothelial growth factor acts as a survival factor for newly formed retinal vessels and has implications for retinopathy of prematurity. Nat Med 1, 1024–1028 (1995).

23. Dvorak HF. Rous-Whipple Award Lecture. How tumors make bad blood vessels and stroma. Am J Pathol 2003; 162: 1747–57. 4 Carmeliet P. Angiogenesis in health and disease. Nat Med 2003; 9: 653–60 24. Ferrara N. Role of vascular endothelial growth factor in physiologic and pathologic angiogenesis: therapeutic implications. Semin Oncol 2002; 29: 10–4.

25. Carmeliet P, Moons L, Luttun A, Vincenti V, Compernolle V, De Mol M, Wu Y, Bono F, Devy L, Beck H, Scholz D, Acker T, DiPalma T, Dewerchin M, Noel A, Stalmans I, Barra A, Blacher S, Vandendriessche T, Ponten A, Eriksson U, Plate KH, Foidart JM, SchaperW, Charnock-Jones DS, Hicklin DJ, Herbert JM, Collen D, Persico MG. Synergism between vascular endothelial growth factor and placental growth factor contributes to angiogenesis and plasma extravasation in pathological conditions. Nat Med 2001; 7: 575–83.

26. Dvorak HF, Rickles FR. Malignancy and hemostasis. Part I. Basic hemostasis and thrombosis in cancer. In: Colman RW, Hirsh J, Marder VJ, ClowesAW, George JN, eds.Hemostasis and Thrombosis. Basic Principles and Clinical Practice, 5th edn.

Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins 2005: in press.

27. Carmeliet P, Mackman N, Moons L, Luther T, Gressens P, Van Vlaenderen I,Demunck H,KasperM, Breier G, Evrard P,MullerM, Risau W, Edgington T, Collen D. Role of tissue factor in embryonic blood vessel development. Nature 1996; 383: 73–5 28.

Tsopanoglou NE, Maragoudakis ME. Role of thrombin in angiogenesis and tumor progression. Semin ThrombHemost 2004; 30: 63–9.

29. Chan B, Merchan JR, Kale S, Sukhatme VP.Antiangiogenic property of human thrombin.

Microvasc Res 2003; 66: 1–14.

30. Oh CW, Hoover-Plow J, Plow EF. The role of plasminogen in angiogenesis in vivo. J Thromb Haemost 2003; 1: 1683–7.

31. Carmeliet P. Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis. Nat Med 2000; 6: 389–95 32. Vincenti V.Cassano C,Rocchi M, and Persico G.Assignment of the vascular endothelial growth factor gene to human chromosome 6p21.3 Circulation 1996;93:1493-95 33.

Siemester G.,Marme D, and Martini Baron G.The alfahelical domain near the amino terminusis essential for dimerization of vascular endothelial growth factor .J.Biol Chem 1998b;273:11115-120

34. Takagi H., King G.,Robinson G.,Ferrara N., and Aillo L.P.Adenosine mediates hypoxic induction of vascular endothelial growth factor in retinal pericytes and endothelial cells.Invest oftalmol Vsi Since 1996;37:21676

81

35. Dibbens J.A, Miller D.L, Damert A.,Risau W.,Vadas M., and goodal G.J. Hypoxic regulations of vascular endothelial growth factor mRNA stability requires the cooperation mutiple RNA elements. Mol Biol Cell 1999;10:907-19 36.

Leung D.W.,Cachianes G.,Kuang W.J.,Goeddel D.V., and Ferrara N. Vascular endothelial growth factor is a secreted angiogenic mitogen. Science 1989;246:1306-309

37. Grutzkau A.,Kruger-Krasagakes S.,Baumeister H.,Schwartz C.,Koegel H.,Weker P.,Lippert U.,Henz B., and Moller A . Synthesis, storage and relase of vascular endothelial growth factor permeability factor by human mast cells :implications for the biological significance of VEGF206 . Moll Biol Cell 1998;9:875 -84 38. Jonca F.,Ortega N.,Gleizes P.E.,Bertrand N., and poluet J. Cell release of bioactive fibroblast growth factor 2 by exon 6 –encoded sequence of vascular endothelial growth factor.J Biol Chem 1997;272:24203-209 39. Cristopher J.,Robins E.,Sally E., The splice variants of vascular endothelial growth factor and their receptors. Journal of cell science 114(5);853-65 40. Shibuya M.,Yamaguchi S.,Yamane M.,Ikeda T.,Tojo A.,Matsushime H., and Sato M. Nucteotide sequence and expression by of a novel human reseptor type tyrosine kinase gene closely related to the fms family. Oncogene 1990;5:519-24 41. Terman B.I., Dougher Vermazen M.,Maglione D.,Lassam N.J.,Gasporadowicz D., and Bohlen P. Identification of the KDR tyrosine kinase a reseptor for vascular endothelial cell growth factor . Biochem Biophys.Res Commun 1992;187:1579-86 42. Soker S.,Takashima S.,Miao H.,Neufeld G., and Klagsbrun M. Neurophilin -1 is expressed by endothelial and tumor cells and an isoform-specific reseptor for vascular endothelial growth factor. Cell 1998;92:735-45 43. Sondel M.,Loundberg G., and Kanje M. Vascular endothelial growth factor has neurotrophic activity and stimulates axonal outgrowth , enhancing cell survival and schwann cell proliferation in the peripheral nervous system. J Neurosci 1999;19:573140 44. Hiratsuka S.,Minowa O.,Kuno J.,Noda T., and Shibuya M.Flt -1 lacking the tyrosine kinase domain is sufficient for normal development and angiogenesis in mice. Proc Nat Acad Sci USA 1998;95:9349-54 45. Hynes, R.O. Integrins: versatility, modulation, and signaling in cell adhesion. Cell 69, 11–25 (1992).

46.

Brooks, P.C. et al. Antiintegrin αv β3 blocks human breast cancer growth and angiogenesis in human skin. J. Clin. Invest. 96, 1815–1822 (1995).

47. Fassler, R. & Meyer, M. Consequences of lack of β1 integrin gene expression in mice. Genes Dev. 9, 1896–1908 (1995).

82

48.

Bader, B.L., Rayburn, H., Crowley, D. & Hynes, R.O. Extensive vasculogenesis, angiogenesis, and organogenesis precede lethality in mice lacking all αv integrins. Cell 95, 507–519 (1998).

49. Reynolds, L.E. et al. Enhanced pathological angiogenesis in mice lacking β3 integrin or β3 and β5 integrins. Nature Med. 8, 27–34 (2002).

50. Kim, S., Bell, K., Mousa, S.A. & Varner, J.A. Regulation of angiogenesis in vivo by ligation of integrin α5β1 with the central cell-binding domain of fibronectin. Am. J. Pathol. 156, 1345–1362 (2000).

51. Jimenez, B. et al. Signals leading to apoptosis-dependent inhibition of neovascularization by thrombospondin-1. Nat Med 6, 41–48 (2000).

52. Maeshima, Y. et al. Tumstatin, an endothelial cell-specific inhibitor of protein synthesis.

Science 295, 140–143 (2002).

53. Brooks, P.C., Silletti, S., von Schalscha, T.L., Friedlander, M. & Cheresh, D.A. Disruption of angiogenesis by PEX, a noncatalytic metalloproteinase fragment with integrin binding activity. Cell 92, 391–400 (1998).

54. Rıchard O. H .A reevaluation of integrins as regulators of angiogenesis. Nature Medicine.

Volume 8(9); Sep 2002 55. Blystone, S.D., Slater, S.E., Williams, M.P., Crow, M.T. & Brown, E.J. A molecular mechanism of integrin crosstalk: αvβ3 suppression of calcium/calmodulin-dependent protein kinase II regulates α5β1 function. J. Cell Biol. 145, 889–897 (1999).

56. Cheresh, D.A. & Stupack, D.G. Integrin-mediated death: an explanation of the integrinknockout phenotype? Nat. Med. 8, 193–194 (2002).

57. Friedlander M, Brooks PC, Shaffer RW, et al: Definition of two angiogenic pathways by distinct αv integrins. Science 270:1500–2, 1995 58. Dulak J, Jozkowicz A, Dembinska-Kiec A, et al: Nitric oxide induces the synthesis of vascular endothelial growth factor by rat vascular smooth muscle cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol 20:659–66, 2000 59. Razavi S, Corjay MH, Thomas MA, et al: Expression of integrins avb3 and avb5 in human choroidal neovascular membranes. Invest Ophthalmol Vis Sci 42:S773, 2001 60. Hammes HP, Brownlee M, Jonczyk A, et al: Subcutaneous injection of a cyclic peptide antagonist of vitronectin receptor- type integrins inhibits retinal neovascularization. Nat Med 2:529–33, 1996 61.

Kamizuru H, Kimura H, Yasukawa T, et al: Monoclonal antibody-mediated drug targeting to choroidal neovascularization in the rat. Invest Ophthalmol Vis Sci 42:2664– 72, 2001

83

62. Sundelin S, Wihlmark U, Nilsson SE, Brunk UT: Lipofuscin accumulation in cultured retinal pigment epithelial cells reduces their phagocytic capacity. Curr Eye Res 17:851– 7, 1998 63. Steen B, Sejersen S, Berglin L, et al: Matrix metalloproteinases and metalloproteinase inhibitors in choroidal neovascular membranes. Invest Ophthalmol Vis Sci 39:2194– 200, 1998 64. Kadonosono K, Yazama F, Itoh N, et al: Expression of matrix metalloproteinase-7 in choroidal neovascular membranes in age-related macular degeneration. Am J Ophthalmol 128:382–4, 1999 65. Lambert V, Munaut C, Jost M, et al: Matrix metalloproteinase- 9 contributes to choroidal neovascularization. Am J Pathol 161:1247–53, 2002 66. Anand-Apte B, Pepper MS, Voest E, et al: Inhibition of angiogenesis by tissue inhibitor of metalloproteinase-3. Invest Ophthalmol Vis Sci 38:817–23, 1997 67. Berglin L, Sarman S, van der Ploeg I, et al: Reduced choroidal neovascular membrane formation in matrix metalloproteinase- 2-deficient mice. Invest Ophthalmol Vis Sci 44: 403–8, 2003 68. Haas A, Prettenhofer U, Stur M, et al: Morphologic characteristics of disciform scarring after radiation treatment for age-related macular degeneration. Ophthalmology 107:1358–63, 2000 69. Mousa SA, Lorelli W, Campochiaro PA: Role of hypoxia and extracellular matrixintegrin binding in the modulation of angiogenic growth factors secretion by retinal pigmented epithelial cells. J Cell Biochem 74:135–43, 1999 70. Suzuma K, Takagi H, Otani A, et al: Expression of thrombospondin- 1 in ischemiainduced retinal neovascularization. Am J Pathol 154:343–54, 1999 71. Carmeliet, P., Ferreira, V., Breier, G., Pollefeyt, S., Kieckens, L., Gertsenstein, M., Fahrig, M., Vandenhoeck, A., Harpal, K., Eberhardt, C., Declercq, C., Pawling, J., Moons, L., Collen, D., Risau, W., Nagy, A., 1996. Abnormal blood vessel development and lethality in embryos lacking a single VEGF allele. Nature 380, 435–439.

72.

Drake, C.J., LaRue, A., Ferrara, N., Little, C.D., 2000. VEGF regulates cell behavior during vasculogenesis. Dev. Biol. 224, 178–188.

73. Gerber, H.P., Dixit, V., Ferrara, N., 1998b. Vascular endothelial growth factor induces expression of the antiapoptotic proteins Bcl-2 and A1 in vascular endothelial cells. J. Biol. Chem. 273, 13313–13316.

74. Vascular endothelial growth factors and angiogenesis in eye disease A.N. Witmera, G.F.J.M. Vrensenb, C.J.F. Van Noordenc, R.O. Schlingemanna Progress in Retinal and Eye Research 22 (2003) 1–29

84

75.

Witmer, A.N., Blaauwgeers, H.G., Weich, H.A., Alitalo, K., Vrensen, G.F.J.M., Schlingemann, R.O., 2002a. Altered expression patterns of VEGF receptors in human diabetic retina and in experimental VEGF-induced retinopathy in monkey. Invest.

Ophthalmol. Vis. Sci. 43, 849–857.

76. PetterssonA,Nagy JA, Brown LF, Sundberg C,Morgan E, Jungles S, Carter R, Krieger JE, Manseau EJ, Harvey VS, Eckelhoefer IA, Feng D, Dvorak AM, Mulligan RC, Dvorak HF. Heterogeneity of the angiogenic response induced in different normal adult tissues by vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor. Lab Invest 2000; 80: 99–115.

78.

Dvorak HF, Senger DS, Dvorak AM, Harvey VS, McDonagh J. Regulation of extravascular coagulation by microvascular permeability. Science 1985; 227: 1059–61.

79.

Feng D, Nagy J, Hipp J, Dvorak H, Dvorak A. Vesiculo-vacuolar organelles and the regulation of venule permeability to macromolceules by vascular permeability factor, histamine, and serotonin. J Exp Med 1996; 183: 1981–6.

80.

SundbergC,Nagy JA, BrownLF, FengD, Eckelhoefer IA,Manseau EJ, Dvorak AM, Dvorak HF. Glomeruloid microvascular proliferation follows adenoviral vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor-164 gene delivery. Am J Pathol 2001; 158: 1145–60

.

81. Yi X, Ogata N, Komada M, et al: Vascular endothelial growth factor expression in choroidal neovascularization in rats. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 235:313–9, 1997 82. Suri C, Jones PF, Patan S, et al: Requisite role of angiopoietin- 1, a ligand for the TIE2 receptor, during embryonic angiogenesis. Cell 87:1171–80, 1996 83. Suri C, Jones PF, Patan S, et al: Requisite role of angiopoietin- 1, a ligand for the TIE2 receptor, during embryonic angiogenesis. Cell 87:1171–80, 1996 84. Tolentino MJ, Miller JW, Gragoudas ES, et al: Intravitreous injections of vascular endothelial growth factor produce retinal ischemia and microangiopathy in an adult primate. Ophthalmology 103:1820–8, 1996 85.

Witzenbichler B, Maisonpierre PC, Jones P, et al: Chemotactic properties of angiopoietin-1 and -2, ligands for the endothelial- specific receptor tyrosine kinase Tie2.

J Biol Chem 273:18514–21, 1998

86. Oh H, Takagi H, Suzuma K, et al: Hypoxia and vascular endothelial growth factor selectively up-regulate angiopoietin- 2 in bovine microvascular endothelial cells. J Biol Chem.274:15732–9, 1999 87.

Hangai M, Murata T, Miyawaki N, et al: Angiopoietin-1 upregulation by vascular endothelial growth factor in human retinal pigment epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci 42:1617–25, 2001

85

88. Dawson, D.W. et al. (1999) Pigment epitheliumderived factor: a potent inhibitor of angiogenesis. Science 285, 245–248 89. Cao, W. et al. (2001) In vitro protection of photoreceptors from light damage by pigment epithelium-derived factor. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 42, 1646–1652 90. Stellmach, V. et al. (2001) Prevention of ischemia induced retinopathy by the natural ocular anti-angiogenic agent pigment epithelium-derived factor. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98, 2593–2597 91.

Yoshida, A. et al. (1998) Role of NF-kappaBmediated interleukin-8 expression in intraocular neovascularization. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 39, 1097–1106

92. Gao, G. et al. (2002) Difference in ischemic regulation of vascular endothelial growth factor and pigment epithelium-derived factor in Brown Norway and Sprague Dawley rats contributing to different susceptibilities to retinal neovascularization. Diabetes 51, 1218–1225 93…Colombo, E.S. et al. (2001) Pigment epitheliumderived factor (PEDF), an endogenous angiogenesis inhibitor is down regulated in ocular tissues in proliferative retinopathy.

Invest.Ophthalmol. Vis. Sci. 42, S809 94. Holekamp, N.M. et al. Pigment epitheliumderived factor is deficient in the vitreous of patients with choroidal neovascularization due to age-related macular degeneration. Am. J.Ophthalmol. (in press) 95. Mori K, Duh E, Gehlbach P, et al: Pigment epitheliumderived factor inhibits retinal and choroidal neovascularization. J Cell Physiol 188:253–63, 2001 96. Mori K, Gehlbach P, Ando A, et al: Regression of ocular neovascularization in response to increased expression of pigment epithelium-derived factor. Invest Ophthalmol Vis Sci 43:2428–34, 2002 97. Sheraidah G, Steinmetz R, Maguire J, et al: Correlation between lipids extracted from Bruch’s membrane and age. Ophthalmology 100:47–51, 1993 98. Jayakrishna Ambati, MD, Balamurali K. Ambati, MD, Sonia H. MD, Sean Ianchulev, and Anthony P. Adamis, MD Age-Related Macular Degeneration: Etiology, Pathogenesis, and Therapeutic Strategies Surv Ophthalmol 48 (3) May–June 2003 99. Wu YQ, Becerra SP: Proteolytic activity directed toward pigment epithelium-derived factor in vitreous of bovine eyes. Implications of proteolytic processing. Invest Ophthalmol Vis Sci 37:1984–93, 1996 100. Alberdi, E. et al. (1999) Binding of pigment epithelium-derived factor (PEDF) to retinoblastoma cells and cerebellar granule neurons. J. Biol. Chem. 274, 31605–31612

86

101. Blaauwgeers HG, Holtkamp GM, Rutten H, et al: Polarized vascular endothelial growth factor secretion by human retinal pigment epithelium and localization of vascular endothelial growth factor receptors on the inner choriocapillaris. Evidence for a trophic paracrine relation. Am J Pathol 155:421–8, 1999 102. Hutchings H, Maitre-Boube M, Tombran-Tink J, Plouet J: Pigment epithelium-derived factor exerts opposite effects on endothelial cells of different phenotypes. Biochem Biophys Res Commun 294:764–9, 2002 103. Ferguson TA, Kaplan H, Tezel T, et al: Augmentation of choroidal neovascularization in a laser induced Mouse model by PEDF. Association for Research in Vision and Ophthalmology Annual Meeting, Abstract 2756, 2002 104. Fukumura D, Gohongi T, Kadambi A, et al: Predominantrole of endothelial nitric oxide synthase in vascular endothelial growth factor-induced angiogenesis and vascular permeability. Proc Natl Acad Sci USA 98:2604–9, 2001 105. Brooks SE, Gu X, Samuel S, et al: Reduced severity of oxygen-induced retinopathy in eNOS-deficient mice. Invest Ophthalmol Vis Sci 42:222–8, 2001 106. Rosen L, Rosen P, Kabbinavar F et al. Phase I experience with SU6668, A novel multiple receptor tirosine kinase inhibitor in patients with advanced malignancies. Proc Am Soc Clin Oncol 2001; 20:97a (abstract 383).

107. Kim KJ, Li B, Winer J, et al. Inhibition of vascular endothelial growth factor-induced angiogenesis suppresses tumour growth in vivo. Nature 1993;362:841– 844.

108. Matsunaga T, Warltier DC, Weihrauch DW, Moniz M, Tessmer J, Chilian WM. Ischemia-induced coronary collateral growth is dependent on vascular endothelial growth factor and nitric oxide. Circulation 2000;102:3098 –3103.

109. Podesta, F., Romeo, G., Liu, W.H., Krajewski, S., Reed, J.C., Gerhardinger, C., Lorenzi, M., 2000. Bax is increased in the retina of diabetic subjects and is associated with pericyte apoptosis in vivo and in vitro. Am. J. Pathol. 156, 1025–1032.

110. Peruzzi, F., Prisco, M., Dews, M., Salomoni, P., Grassilli, E., Romano, G., Calabretta, B., Baserga, R.,. Multiple signaling pathways of the insulin-like growth factor 1 receptor in protection from apoptosis. Mol. & Cell. Biol. 1999; 19: 7203–7215.

111. Gerhardinger, C., McClure, K.D., Romeo, G., Podesta, F., Lorenzi, M., 2001. IGF-I mRNA and signaling in the diabetic retina. Diabetes 50, 175–183.

112. A.N. Witmera, G.F.J.M. Vrensenb, C.J.F. Van Noordenc, R.O. Schlingemann.Vascular endothelial growth factors and angiogenesis in eye disease.Progress in Retinal and Eye Research 22 (2003) 1–29 113. Hammes, H.P., Lin, J., Bretzel, R.G., Brownlee, M., Breier, G., 1998.Upregulation of the vascular endothelial growth factor/vascular endothelial growth factor receptor

87

system in experimental background diabetic retinopathy of the rat. Diabetes 47, 401– 406.

114. Gilbert, R.E., Kelly, D.J., Cox, A.J., Wilkinson-Berka, J.L., Rumble, J.R., Osicka, T., Panagiotopoulos, S., Lee, V., Hendrich, E.C., Jerums, G., Cooper, M.E., 2000.

Angiotensin converting enzyme inhibition reduces retinal overexpression of vascular endothelial growth factor and hyperpermeability in experimental diabetes. Diabetologia 43, 1360–1367.

115. Hellstrom, M., Gerhardt, H., Kalen, M., Li, X., Eriksson, U., Wolburg, H., Betsholtz, C., 2001a. Lack of pericytes leads to endothelial hyperplasia and abnormal vascular morphogenesis. J. Cell Biol. 153, 543–553.

116. Tolentino, M.J., Miller, J.W., Gragoudas, E.S., Jakobiec, F.A., Flynn, E., Chatzistefanou, K., Ferrara, N., Adamis, A.P., 1996. Intravitreous injections of vascular endothelial growth factor produce retinal ischemia and microangiopathy in an adult primate.

Ophthalmology 103, 1820–1828.

117. Tolentino, M.J., McLeod, D.S., Taomoto, M., Otsuji, T., Adamis, A.P., Lutty, G.A., 2002. Pathologic features of vascular endothelial growth factor-induced retinopathy in the nonhuman primate. Am. J. Ophthalmol. 133, 373–385.

118. Arden, G.B., 2001. The absence of diabetic retinopathy in patients with retinitis pigmentosa: implications for pathophysiology and possible treatment. Br. J. Ophthalmol. 85, 366–370.

119. Hofman, P., Blaauwgeers, H.G., Tolentino, M.J., Adamis, A.P.,Nunes Cardozo, J.J., Vrensen, G.F.J.M., Schlingemann, R.O., 2000. VEGF-A induced hyperpermeability of blood–retinal barrier endothelium in vivo is predominantly associated with pinocytotic vesicular transport and not with formation of fenestrations. Curr. Eye Res. 21, 637–645 .

120. Ozaki, H., Seo, M.S., Ozaki, K., Yamada, H., Yamada, E., Okamoto, N., Hofmann, F., Wood, J.M., Campochiaro, P.A., 2000. Blockade of vascular endothelial cell growth factor receptor signaling is sufficient to completely prevent retinal neovascularization.

Am.J. Pathol. 156, 697–707.

121. Ogata, N., Tombran-Tink, J., Jo, N., Mrazek, D., Matsumura, M.,2001b. Upregulation of pigment epithelium-derived factor after laser photocoagulation. Am. J. Ophthalmol.

132, 427–429.

122. Qaum T, Xu Q, Joussen AM, et al. VEGF-initiated bloodretinal barrier breakdown in early diabetes. Invest Ophthalmol Vis Sci 2001;42:2408 –2413.

123. Vinores SA, Youssri AI, Luna JD, et al. Upregulation of vascular endothelial growth factor in ischemic and non-ischemic human and experimental retinal disease. Histol Histopathol 1997;12:99 –109.

88

124. Joussen AM, Murata T, Tsujikawa A, Kirchhof B, Bursell SE, Adamis AP. Leukocytemediated endothelial cell injury and death in the diabetic retina. Am J Pathol 2001;158:147–152.

125. Roberts WG, Palade GE. Neovasculature induced by vascular endothelial growth factor is fenestrated. Cancer Res 1997;57: 765–772.

126. Antonetti DA, Barber AJ, Hollinger LA, Wolpert EB, Gardner TW. Vascular endothelial growth factor induces rapid phosphorylation of tight junction proteins occludin and zonula occluden 1. A potential mechanism for vascular permeability in diabetic retinopathy and tumors. J Biol Chem 1999;274:23463–23467.

127. Qu H, Nagy JA, Senger DR, Dvorak HF, Dvorak AM. Ultrastructural localization of vascular permeability factor/ vascular endothelial growth factor (VPF/VEGF) to the abluminal plasma membrane and vesiculovacuolar organelles of tumor microvascular endothelium. J Histochem Cytochem 1995;43:381–389.

128. Nauck M, Karakiulakis G, Perruchoud AP, Papakonstantinou E, Roth M. Corticosteroids inhibit the expression of the vascular endothelial growth factor gene in human vascular smooth muscle cells. Eur J Pharmacol 1998;341:309 –315.

129. Gass JD: Drusen and disciform macular detachment and degeneration. Arch Ophthalmol 90:206–17, 1973 130. RobertsWG, Palade GE: Increased microvascular permeability and endothelial fenestration induced by vascular endothelial growth factor. J Cell Sci 108:2369–79, 1995 131. Okamoto N, Tobe T, Hackett SF, et al: Transgenic mice with increased expression of vascular endothelial growth factor in the retina: a new model of intraretinal and subretinal neovascularization. Am J Pathol 151:281–91, 1997 132. Holz, F.G., Sheraidah, G., Pauleikhoff, D., Bird, A.C., 1994. Analysis of lipid deposits extracted from human macular and peripheral Bruch’s membrane. Arch. Ophthalmol.

112, 402–406 133. Cekic O, Chang S, Tseng JJ, et al. Intravitreal triamcinolone treatment for macular edema associated with central retinal vein occlusion and hemiretinal vein occlusion.

Retina 2005; 25:846–850.

134. Cekic O, Chang S, Tseng JJ, et al. Cataract progression after intravitreal triamcinolone injection. Am J Ophthalmol 2005; 139:993–998.

135. Pe’er J, Shweiki D, Itin A, et al. Hypoxia-induced expression of vascular endothelial growth factor by retinal cells is a common factor in neovascularizing ocular diseases.

Lab Invest 1995;72:638–645.

136. Pe’er J, Folberg R, Itin A, et al. Vascular endothelial growth factor upregulation in human central retinal vein occlusion. Ophthalmology 1998;105:412–416.

89

137. Adamis AP, Shima DT, Tolentino MJ, et al. Inhibition of vascular endothelial growth factor prevents retinal ischemiaassociated iris neovascularization in a nonhuman primate. Arch Ophthalmol 1996;114:66–71.

138. Boyd SR, Zachary I, Chakravarthy U, et al. Correlation of increased vascular endothelial growth factor with neovascularization and permeability in ischemic central vein occlusion. Arch Ophthalmol 2002;120:1644–1645.

139. Adamis AP, Miller JW, Bernal MT, et al. Increased vascular endothelial growth factor levels in the vitreous of eyes with proliferative diabetic retinopathy. Am J Ophthalmol 1994; 118:445– 450.

140. Yusuke Oshima, MD, Hirokazu Sakaguchi, MD, Fumi Gomi, MD, and Yasuo Tano, MD Regression of Iris Neovascularization After Intravitreal Injection of Bevacizumab in Patients With Proliferative Diabetic Retinopathy Am J Ophthalmol 2006;142:155–157.

141. Hellstrom, A., Perruzzi, C., Ju, M., Engstrom, E., Hard, A.L., Liu, J.L., AlbertssonWikland, K., Carlsson, B., Niklasson, A., Sjodell, L., LeRoith, D., Senger, D.R., Smith, L.E., 2001b. Low IGF-I suppresses VEGF-survival signaling in retinal endothelial cells: direct correlation with clinical retinopathy of prematurity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 5804–5808.

142. Poon RT-P, Fan S-T, Wong J: Clinical implications of circulating angiogenic factors in cancer patients. J Clin Oncol 2001; 19: 1207–1225.

143. Park JE, Chen HH, Winer J, Houck KA, Ferrara N: Placenta growth factor. Potentiation of vascular endothelial growth factor bioactivity, in vitro and in vivo, and high affi nity binding to Flt-1 but not to Flk-1/KDR. J Biol Chem 1994; 269: 25646–25654.

144. Presta LG, Chen H, O’Connor SJ, Chisholm V, Meng YG, Krummen L, Winkler M, Ferrara N: Humanization of an anti-vascular endothelial growth factor monoclonal antibody for the therapy of solid tumors and other disorders. Cancer Res 1997; 57: 4593–4599.

145. Bergers G, Song S, Meyer-Morse N, Bergsland E, Hanahan D. Benefits of targeting both pericytes and endothelial cells in the tumor vasculature with kinase inhibitors. J Clin Invest 2003;111:1287–1295.

146. Marmor MF, Negi A, Maurice DM. Kinetics of macromolecules injected into the subretinal space. Exp Eye Res 1985; 40:687– 696 147. Bell C, Lynam E, Landfair DJ, Janjic N, Wiles ME. Oligonucleotide NX1838 inhibits VEGF165-mediated cellular responses in vitro. In Vitro Cell Dev Biol Anim 1999;35:533– 542.

148. VEGF Inhıbition Study in Ocular Neovascularizations (V.I.S.I.O.N.) Clinical Trial group.Pegaptanib Sodium For Neovascular Age Related Macular degeneration.Ophtalmology 2006;113:992-1001

90

149. Eyetech Study Group. Anti-vascular endothelial growth factor therapy for subfoveal choroidal neovascularization secondary to age-related macular degeneration: phase II study results. Ophthalmology 2003;110:979 –986.

150. Eyetech Study Group. Preclinical and phase 1A clinical evaluation of an anti-VEGF pegylated aptamer (EYE001) for the treatment of exudative age-related macular degeneration. Retina 2002;22:143–152.

151. Gragoudas ES, Adamis AP, Cunnigham ET Jr., Feinsod M, Guyer DR, VEGF Inhibition Study in Ocular Neovascularization Clinical Trial Group. Pegaptanib for neovascular agerelated macular degeneration. N Engl J Med 2004;351:2805– 2816 .

152. Ituralde D.,Rıchard F.S.,Catherine B.M.,jay M.,Lawrence A.Y.,Yale L.F.,John S.,Jason S.,Slakter K.,Baıley F.,Mıchael C. Intravitreal bevacizumab(Avastin) treatment of maculer edema ın central retinal veın occlusıon.Retina 2006;26;279-84 153.

John O.,Mason III.,Mıchael A.,Albert JR.,Rachel Vaıl C. Intravitreal Bevacizumab(Avastin) for refractory pseudophakıc cystoıd macular edema. Retina 2006;26;356-58

154. Fong TA, Shawver LK, Sun L et al. SU5416 is a potent and selective inhibitor of the vascular endothelial groeth factor receptor (Flk-1/KDR) that inhibits tyrosine kinase catalysis, tumor vascularization, and growth of multiple tumor types. Cancer Res 1999; 59(1):99-106 155..Mendel D, Laird A, Xin X et al. Development of a preclinical pharmacokinetic/pharmacodynamic relationship for the angiogenesis inhibitor SU11248, a selective inhibitor of VEGF and PDGF receptor tyrosine kinases in clinical development. Proc Am Soc Clin Oncol 2002; 21 (abstract 94).

156. Trarbach T, Shleucher N, Riedel U et al. Phase I/II study of the oral vascula ebdothelial growth factor (VEGF) receptor inhibitor PTK787/ZK222854 in combination with irinotecan/5-fluorouracil/leucoverin in patients with metastatic colorectal cancer. Proc Am Soc Clin Oncol 2003; 22:285 (abstract1144).

157. Minami H, Ebi H, Tahara M et al. A phase I study an oral VEGF receptor tirozin kinaz inhibitor ZD6474 in Japanese patients with solid tumors. Proc Am Soc Clin Oncol 2003; 22: 194 .

158. Tolcher AW, O’Leary, J, DeBono, JS et al. A phase I and biologic correlative study of an oral endothelial vascular growth factor receptor-2 (VEGFR-2) tyrosine kinase inhibitor, CP-547,632 in patients with advanced solid tumors. Proc ASCO 2002; 21: 84a

91

92