Farmacognosia 1 - Introdução à Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE): Análise de extratos

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ FACULDADE DE FARMÁCIA, ODONTOLOGIA E ENFERMAGEM DEPARTAMENTO DE FARMÁCIA CURSO DE FARMÁCIA

Introdução a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE): análise de extratos vegetais Rayanne Brito de Freitas Mestranda em Ciências Farmacêuticas

 O que é Cromatografia?  Cromatografia Líquida  Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)

 Características  O sistema de CLAE  Aplicações

 Vantagens e Desvantagens  Considerações Finais

O que é Cromatografia?

Método físico-químico que separa individualmente os constituintes de uma mistura de substâncias

Fase móvel

Fase estacionária

Cromatografia Líquida

A cromatografia fundamenta-se na migração diferencial dos componentes de uma mistura, o que ocorre devido a diferentes interações entre duas fases imiscíveis, sendo uma fase fixa que tem uma grande área superficial chamada fase estacionária (FE) e a outra um fluido que se move através da fase estacionária sendo chamada de fase móvel (FM). Na cromatografia líquida a fase móvel é líquida!

(LANÇAS, 1993; DEGANI; CASS; VIEIRA, 1998)

O princĂ­pio da cromatografia

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA COLUNA

PLANAR

CCD

C O N VEN CI O N AL

CP CLAE

ADSORÇÃO

Longo tempo de análise; Monitorização E X C L US Ã O I Ô N I CA visual PA R T I ÇÃ O

CLAE

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

HPLC = High Performance (Pressure) Liquid Cromatography CLAE = Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) é uma técnica cromatográfica que utiliza uma elevada pressão para forçar a passagem do solvente pelas colunas, contendo partículas muito finas que proporcionam separações muito eficientes.

(HARRIS, 2001).

Características da CLAE

• Fase móvel líquida • Fase estacionária finamente dividida • Pressões elevadas Alto desempenho • Diferencial: bomba propulsora – tipo de eluição

Aplicações - CLAE

•

Identificação de compostos;

•

Quantificação dos componentes;

•

Purificação de compostos;

•

Separação dos componentes de uma mistura.

Aplicações CLAE

Indústria

Analitos

Alimentos

Açúcares, ácido ascórbico, ácido benzóico, parabenos, vitaminas, proteínas, peptídeos, aminoácidos

Tintas

Resinas, Tensoativos, biocidas

Química

Polímeros

Clínicas

Metabólitos, proteínas, peptídeos, aminoácidos

Farmacêutica

Princípios ativos

Vantagens - CLAE

 Economia  Versatilidade  Sensibilidade

 Análise qualitativa: Tr  Análise quantitativa: baixa dispersão < 5%.  Automação.

Desvantagens - CLAE

 Alto custo do equipamento e manutenção  Recursos humanos altamente qualificados

 Falta de detector universal sensível

O sistema de CLAE

CLAE

O sistema de CLAE

O sistema de CLAE

1. RESERVATÓRIOS DA FASE MÓVEL

2. SISTEMA DE BOMBEAMENTO 3. SISTEMA DE INJEÇÃO DE AMOSTRAS 4. COLUNA

5. DETECTOR 6. AQUISIÇÃO DE DADOS

1. Reservatรณrios da fase mรณvel

1. Reservatórios da fase móvel

Frascos de vidro para armazenamento de fase móvel (1 – 3L) Filtros do reservatório de aço inoxidável (10 a 40 µm): capta a fase móvel e evita que partículas suspensas na FM obstruam os capilares ou contaminem a bomba

Características da fase móvel

• Apresentar alto grau de pureza, • Miscível com a amostra e não decompor seus componentes, • Não alterar a fase estacionária, • Apresentar baixa viscosidade, • Compatível com o tipo de detector, • Característica química que permita a separação dos componentes da amostra (extratos vegetais).

2. Sistema de bombeamento

2. Sistema de bombeamento • Vazão contínua

• Vazão constante independentemente da pressão (0,1 – 10 mL/min)

• Alta resistência à corrosão – inércia química a solventes

comuns • Opera a altas pressões (até 6000 psi)

• Material inerte

2. Sistema de bombeamento

Tipos de eluição Isocrátic o  A composição da fase móvel permanece constante ao longo da análise

Gradiente  A composição da fase móvel altera ao longo da análise

3. Injeção da amostra

3. Injeção da amostra

Injetor manual

- As amostras são introduzidas com seringas.

Injetor automático

- As amostras são postas em um frasco localizado dentro do amostrador Injetor: • Mede o volume correto da injeção; • Injeta a amostra; • Prepara o injetor para a próxima amostra

4. Coluna Cromatogrรกfica

4. Coluna Cromatográfica

Analíticas

Preparativas

Controle de qualidade

Estudo fitoquímico

Análises quali e quantitativas

Usada para fins de purificação

Pré- Coluna

É utilizada para proteger e aumentar a vida útil da coluna analítica.

 Localiza-se entre o injetor e a coluna.  Colunas de 2 a 5 cm.  Utiliza-se a mesma FE da coluna.

4. Coluna Cromatográfica

• Coluna: suporte (aço) + fase estacionária*. *partículas de sílica com diâmetro de 1,8 – 5 μm.

Estas partículas porosas na coluna têm geralmente uma fase ligada quimicamente sobre a sua superfície, que interage com os componentes da amostra para separá-los um do outro.

Separação Cromatográfica

Em função da fase estacionária utilizada, tem-se os seguintes mecanismos de separação:

CLAE

ADSORÇÃO

PA R T I ÇÃ O

I Ô N I CA

E X C L US Ã O

CARGA IÔNICA: TAMANHO: Fasee estacionária líquida FE sólida FM líquida ou A fase estacionária é uma é resina a recheada com forma um filme fino na A coluna gasosa. O soluto é adsorvido qual gruposinerte iônicoscujos poros matéria superfície de um suporte na superfície da partícula esão o- ligados (— SO 3, — NR+3); fase móvel é sólido.

O soluto está em líquida. têm tamanho equilíbrio entre FE e FM controlado. equilíbrio entre dos FM e FE. justifica a separação componentes.

Fase Normal

x

Fase Reversa

Fase Normal • fase estacionária polar;

• fase móvel menos polar. * Solventes mais polares têm

Fase Reversa •

fase estacionária apolar ou

fracamente polar; •

fase móvel mais polar.

* Solventes menos polares têm de eluição

força

força de eluição

Fase Normal

Fase Reversa

5. Detector

5. Detector

O detector é um dispositivo conectado na saída da coluna que percebe a presença de componentes e emite um sinal elétrico a ser registrado na forma de um pico cuja área é proporcional a quantidade do componente analisado.

5. Detector

 Características ideais:

• Sensibilidade e seletividade adequada • Ampla faixa linear • Baixo volume interno

• Resposta rápida • Boa estabilidade • Precisão

5. Detector

 Tipo de detectores: • Índice de refração • Espectrofotometira UV-Visível

• Fluorescência • Eletroquímico • Espectrometria de massa LC/MS

Detector - Espectrofotometria UVVisível

Um feixe de luz ultravioleta é dirigido através de uma célula de fluxo e um sensor mede a luz que passa através desta

célula.

Quando um composto que absorve a energia da luz elui da

coluna, ocorrerá uma alteração na quantidade de energia que incide sobre o sensor.

Detector - Espectrofotometria UVVisível A alteração na

Por conseguinte, um

quantidade de energia é

espectro de UV é obtido,

amplificada e dirigida

podendo auxiliar na

para um sistema de

identificação de alguns

registro de dados.

compostos.

Detector - Espectrofotometira UVVisível Ácido Clorogênico

Catequina

Detector - Espectrofotometira UVVisível

Aplicações

6. Aquisição de dados

6. Aquisição de dados

Processa os dados obtidos pelo detector.

Monitoramento contínuo dos parâmetros da separação e detecção de possíveis problemas.

Registro da composição da fase móvel; vazão da bomba; injeção da amostra; temperatura da coluna.

Considerações Finais

Referências Bibliográficas

Argenton, A. Conceitos Fundamentais de Cromatografia a Líquido de Alto Desempenho, 2010.

COLLINS, C. H., BRAGA, G. L., BONATO, P. S. Introdução a métodos cromatográficos.

HARRIS, D.C. Análise química quantitativa. V Ed. Rio de Janeiro: Livros técnicos e científicos Editora S.A. 2001.

Obrigada!!