Contenido de polifenoles y actividad antioxidante de extractos de siempreviva

Volumen 6, número 2

Investigación

CIENTIFICA

enero–julio 2012, issn 1870–8196

Contenido de polifenoles y actividad antioxidante de

extractos de siempreviva

julio cÉsar mÁrQuez rosales marisol galvÁn valencia sergio m. durÓn torres virginia flores morales Unidad Académica de Ciencias Químicas Universidad Autónoma de Zacatecas

Correo–e: galvanmisol@yahoo.com

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Investigación

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Resumen Sedum praealtum dC (siempreviva) es una planta con propiedades analgésicas, antiinflamatorias y anticonceptivas, probablemente vinculadas con el contenido de compuestos polifenólicos. En el presente estudio se utilizaron hojas de siempreviva de una planta adulta cultivada en Zacatecas, de la que se obtuvieron jugo, extracto etanólico y cinco fracciones orgánicas. Mediante técnicas espectrofotométricas se evaluó el contenido total de polifenoles (Folin–Ciocalteu) y la capacidad antioxidante (ca) por comparación de los métodos de dpph• y abts•+. El antioxidante de referencia, representativo de los polifenoles fue el ácido gálico. Es importante mencionar que en todos los métodos empleados se encontró una relación entre el contenido de polifenoles y la ca de las muestras analizadas, en las que el jugo presentó la velocidad de neutralización y los valores más altos de ambos parámetros.

Palabras clave: plantas medicinales, polifenoles, dpph•, abts•+.

Abstract Sedum praealtum dC locally known as siempreviva is popularly used to treat general inflammatory processes, as an analgesic and contraceptive, probably these properties are related to phenolic compounds content. For the present investigation juice, crude ethanolic extract and five organic fractions were obtained from fresh leaves from siempreviva. The leaves were collected from an adult plant that is grown at Zacatecas. The content of total phenolics in the samples was determined spectrometrically according to the Folin–Ciocalteu procedure and calculated as gallic acid equivalents. The methods dpph• y abts•+ were compared for measuring antioxidant activity. The present study demonstrates the correlation between the high phenolic content and antioxidant activity of Sedum praealtum juice. Reference antioxidant polyphenols was gallic acid. It is noteworthy that in all methods found a relationship between the polyphenol content and the ca of the

samples, in which the juice had the neutralization rate and the highest values of both parameters.

Key words: medicinal plants, polyphenols, abts•+.

dpph•,

Introducción Sedum praealtum, comúnmente conocida como siempreviva, es una planta silvestre utilizada con fines de ornato y en la medicina tradicional mexicana por sus propiedades antiinflamatoria, analgésica y anticonceptiva, para tratar enfermedades de los ojos, erupciones cutáneas y de regeneración de tejidos [1]. En un estudio previo de caracterización cualitativa por cromatografía en capa fina, se identificaron los principales metabolitos secundarios presentes en las hojas de arbustos de siempreviva cultivados en el estado de Zacatecas. La siempreviva contiene una gran variedad de compuestos, de los cuales destacan alcoholes, compuestos carbonílicos, flavonoides, glicósidos, alcaloides y azúcares libres y aminoácidos [2]. La actividad de esta planta medicinal en la prevención y cura de enfermedades se atribuye a la capacidad antioxidante de sus compuestos polifenólicos. Éstos son un grupo amplio de moléculas anfipáticas cuya acción antioxidante se debe a sus características redox que les permiten actuar como agentes reductores, donadores de hidrógeno, neutralizadores de oxígeno singlet y quelantes de metales [3]. Existen una variedad de métodos analíticos empleados en la cuantificación de polifenoles totales y la actividad antioxidante de productos naturales; de ellos, se prefieren los métodos espectrofotométricos porque son sencillos, rápidos y económicos.

El objetivo de este trabajo fue cuantificar el contenido de compuestos fenólicos en extractos de hojas de siempreviva y correlacionarlo con la capacidad antioxidante a través de dos métodos espectrofotométricos: dpph• (2.2–diphenyl–1–picrylhydrazyl) y abts•+ (2.2′–azinobis sulfonato 3–ethylbenzothiazoline 6), cuyas condiciones de reacción fueron estandarizadas.

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Materiales y mĂŠtodos

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Ensayo de la capacidad neutralizadora del radical 2,2–Diphenyl–1–picrylhydrazyl (dpph•)

Preparación de la muestra En la preparación, las hojas frescas de siempreviva (144 g en 200 ml de etanol al 96 por ciento) fueron maceradas durante un mes, en el que se mantuvo agitación constante y una atmósfera libre de oxígeno gracias a la incorporación de N2. El extracto se filtró y concentró en un rotavapor (buchi r–300) e inmediatamente se liofilizó (2.5 Liter Freeze Dry System, labconco). Parte del liofilizado se utilizó para cargar una columna cromatogråfica, empacada con anterioridad con silica gel 60HF254 (J.T. Backer) y solvatada con una mezcla de hexano–acetato de etilo. Al variar la proporción de hexano–acetato de etilo desde 4:6 v/v hasta 100 por ciento de acetato de etilo se obtuvieron cinco fracciones orgånicas. Luego, se eluyó la columna con etanol con la intención de recuperar la sexta fracción. Cada fracción fue concentrada en un rotavapor y se liofilizó para su uso posterior. TambiÊn se obtuvo el jugo de las hojas frescas de siempreviva con un extractor comercial, se filtró y se liofilizó [2].

DespuĂŠs, se prepararon soluciones de cada extracto y fracciĂłn. Debido a la diferente solubilidad de las muestras se usaron como disolventes etanol, acetona y agua, con los que se prepararon soluciones en una concentraciĂłn de 1 mg/ml para cada ensayo espectrofotomĂŠtrico.

La tÊcnica fue aplicada de acuerdo con lo propuesto por Schlesier y colaboradores [5]. En un inicio se preparó una solución 2.4 mg del reactivo dpph (Sigma– Aldrich) en metanol para formar el radical dpph•.

La absorbancia måxima se observó a los 515 nm y la actividad antioxidante de las muestras fue evaluada en función de su disminución. Para el ensayo espectrofotomÊtrico, 1.95 ml de la solución del radical dpph• fueron mezclados con 50 Οl de la muestra problema y se tomaron lecturas a 515 nm cada cinco minutos hasta que la variación en la absorbancia fuera ≤0.003 unidades/min. Cada medición se realizó por triplicado y el porcentaje de inhibición del radical dpph• se calculó mediante la siguiente fórmula [5]: ��

( đ??´đ??´0DPPH ∙ − đ??´đ??´ DPPH ∙ ) %đ??´đ??´đ??´đ??´= đ?‘Ľđ?‘Ľ 100 đ??´đ??´0DPPH ∙ En cada muestra de siempreviva la velocidad de neutralizaciĂłn del radical dpph• se evaluĂł al correlacionar el porcentaje de aa en funciĂłn del tiempo hasta tener lecturas de absorbancia constantes.

Ensayo de la capacidad neutralizadora del radical catión 2,2–azinobis (3–ethylbenzothiazoline–6–sulfonic acid) (abts•+) y persulfato de potasio

Determinación de polifenoles totales Fue evaluado el contenido de polifenoles por el mÊtodo de Folin–Ciocalteu (fc) [4]. 200 Οl de la muestra en solución se mezclaron con 1 ml del reactivo fc (Sigma–Aldrich) diluido 1:10 en agua destilada y 800 Οl de una solución de carbonato de sodio al 7.5 por ciento. El tubo de reacción fue incubado dos horas en obscuridad. La absorbancia medida en un espectrofotómetro (6405 uv–Vis jenway) fue de 760 nm. Como referencia se empleó åcido gålico, por tanto, los resultados se expresaron como equivalentes de åcido gålico (mg ml–1).

TambiÊn para este procedimiento se siguieron los postulados de Schlesier y colaboradores [5, 6], en el que la solución del radical abts•+ (Sigma–Aldrich) se preparó en agua desionizada a una concentración de 7 mM y K2O8S2 a 2.45 mM. Se emplearon entre 16 y 24 hrs en la incubación de la mezcla en la obscuridad y a temperatura ambiente. Mås tarde, se efectuó un estudio de estabilidad del radical abts•+ en función del pH del medio de disolución; las soluciones usadas fueron agua, buffer de fosfatos (10 mM pH 7.4) y buffer de acetatos (20 mM pH 4.5). Al inicio se midió la absorbancia de la solución del radical y dos horas despuÊs (punto final de la reacción), con el propósito de observar la degradación del radical abts•+. En las mediciones espectrofotomÊtricas, la

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solución con el radical abts•+ fue diluida en agua hasta obtener una absorbancia 0.700 + 0.020 a 734 nm; en contraste, para el tubo control se colocaron 1 ml de la solución del radical abts•+ y 20 μl del solvente de la muestra y se tomó lectura tras dos horas. En el ensayo espectrofotométrico se emplearon 1 ml de la solución del radical abts•+ más 20 μl de la muestra problema. En este caso las lecturas de absorbancia se llevaron a cabo a los 30, 60 y 120 minutos a 734 nm. A fin de calcular el porcentaje de neutralización del radical abts•+ se utilizó la misma fórmula que en el ensayo del radical dpph•.

Resultados y discusión Polifenoles totales Dentro del ensayo de Folin–Ciocalteu en un medio alcalino ocurre la transferencia de electrones desde los compuestos fenólicos y otras especies reductoras al molibdeno (por ejemplo, aminas aromáticas y ácido ascórbico), las cuales forman complejos azules que se detectan con el espectrofotómetro entre 750–765 nm; de manera que si no se eliminan las interferencias se recomienda sustituir el término «contenido fenólico total» por el de «capacidad reductora total» [7]. De acuerdo con lo anterior y debido al hecho de que el jugo presentó los valores más altos en la prueba de Folin–Ciocalteau (0.1304 mg ml–1 equivalentes de ácido gálico, lo que representa el 13.04 por ciento del peso de la muestra) se estaría valorando la capacidad reductora total, ya que el jugo puede contener compuestos interferentes (como el ácido ascórbico) y no se efectuó ningún proceso de purificación en él; mientras que para las fracciones, particularmente F3 y F4, aplicaría el término contenido fenólico total (figura 1).

figura 1 2.5

Absorbancia (760 nm)

4

2

y = 11.501x + 0.027 R² = 0.9997

1.5

1

0.5

0 0

0.05

0.1

0.15

0.2

Ácido gálico (mg ml–1)

Curva de calibración de ácido gálico utilizado como compuesto polifenólico estándar en la prueba de Folin– Ciocalteau. En el inserto se muestran los valores promedio del contenido de polifenoles ± D.S. en las muestras de siempreviva obtenidos por interpolación en el gráfico.

Actividad antioxidante (dpph• y abts•+) Para la cuantificación de la actividad antioxidante de productos naturales se usan con frecuencia los métodos dpph• y abts•+. En ese sentido, es preciso tener en cuenta las diferentes condiciones del ensayo de abts•+ que se reportan en diversas investigaciones: agente químico/enzimático que genera el radical abts•+ (dióxido de manganeso, aaph, persulfato de potasio, metmioglobina y peroxidasa de rábano), tiempo de reacción (minutos y horas), longitud de onda en la detección (abts•+ tiene máximos de absorción a 414, 645, 734 y 815 nm), antioxidante de referencia (trolox, ácido ascórbico, ácido gálico) y pH del medio de disolución en el que ocurre la reacción [5, 6]. Las condiciones de reacción dentro del método abts•+ fueron optimizadas en función de la estabilidad del radical abts•+. En la figura 2 se presenta el estudio de estabilidad a tres valores de pH de la solución de reacción durante dos horas. Como puede observarse, en solución amortiguadora de fosfatos pH 7.4 el radical es menos estable y la absorbancia inicial disminuye en más de un 20 por ciento después de 90 minutos de reacción. Por el contrario, en medio ácido y agua la degradación del radical es mínima (3.14 y 1.3 por ciento). Respecto a la longitud de onda de detección, las lecturas se realizaron a 734 nm, ve-

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radical

20

AA del

ABTS (Agua)

15 10

ABTS (PBS)

Porcentaje

Porcentaje de Degradación

Figura 2

Figura 3 ABTS

locidad que minimiza la absorbancia de interferentes y la turbidez [7].

100 90 80

y = 1.2719x + 0.033 R² = 0.9688

70 60 50 40 30 20 10 0 0

5

10

20

30

Porcentaje

0 0

10

20

30

40

50

60

70

80

90 100 110 120

Tiempo (min)

Del estudio de estabilidad se determinó el porcentaje de degradación del radical abts+ en función del tiempo, utilizando tres medios de disolución a pH neutro (7.4 y 4.5).

Una vez identificadas las condiciones de la solución y el tiempo de reacción, se midió la actividad antioxidante de las muestras de siempreviva mediante la lectura de absorbancia a los 30, 60 y 120 minutos, con el fin de tener plena seguridad de los resultados obtenidos. Los valores encontrados por ambos métodos se presentan en la tabla 1, mientras que la figura 3 expone la correlación entre los dos. Cabe destacar que dicha correlación, para las mismas muestras, fue adecuada (r2 = 0.9688).

Tabla 1 Porcentaje de la actividad antioxidante determinada para cada una de las muestras de siempreviva analizadas por los métodos dpph• y abts•+ dpph

abts

Porcentaje de aa

Porcentaje de aa

Jugo

70.85

94.20

E. Etanólico

2.89

4.10

F1

0.42

3.51

F2

0.78

3.67

F3

23.41

17.09

F4

12.27

15.42

F5

3.09

6.87

Muestra

5

40 AA del

50

radical

60

70

80

DPPH

Correlación entre los valores del porcentaje de la actividad antioxidante (% aa) de las siete muestras de siempreviva evaluadas por los métodos de dpph• y abts•+.

Con el método de dpph• se evaluó la velocidad de neutralización del radical de las siete muestras de siempreviva (figura 4). En el extracto etanólico (fracciones 1, 2 y 5) se presentaron las velocidades de neutralización menores, que alcanzaron su máximo desde los primeros cinco minutos y se mantuvieron constantes los quince minutos en que transcurrió la neutralización. Con dichas muestras fue neutralizado ≤3 por ciento de radical dpph•. De igual modo, durante los primeros cinco minutos la fracción 4 neutralizó cerca del 12 por ciento del radical dpph, cifra constante en los quince minutos en que la reacción fue observada.

La fracción 3, como se aprecia en la figura 4, alcanzó una velocidad de neutralización del 20 por ciento en los primeros cinco minutos, posteriormente su velocidad decreció, entre los 20 a 25 minutos llegó a su máximo y se mantuvo estable hasta los 35 minutos en que se terminó el ensayo. Por último, el jugo presentó una neutralización rápida >50 por ciento del radical dpph• en los primeros cinco minutos y continuó aumentando a una velocidad menor hasta el minuto 30, en que llegó a una meseta con un máximo del 70 por ciento de neutralización hasta el final del estudio (45 minutos).

Investigación

6

CIENTIFICA Conclusiones

figura 4 80

Porcentaje

AA del

radical

DPPH

70 60 Jugo 50

E. Etanólico

40

F1

30

F2 F3

20

F4

10

F5

0 0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Tiempo (min)

Estudio cinético de la capacidad de neutralización de los extractos y fracciones de siempreviva por el método de dpph•.

Correlación entre ensayos Se elaboró un análisis de regresión para correlacionar los resultados obtenidos del ensayo de Folin Ciocalteau y la capacidad antioxidante por los métodos del dpph• y abts•+ (figura 5). Al medir la capacidad antioxidante los dos métodos correlacionaron de forma significativa el contenido de polifenoles (r2 = 0.9857 en abts•+ y r2 = 0.9741 en dpph•). El jugo de siempreviva y las fracciones orgánicas 3 y 4 tuvieron los niveles de polifenoles más altos correlacionados con la mayor capacidad de neutralización de los radicales generados artificialmente. figura 5 100 90

y = 731.11x - 2.1369 R² = 0.9857

80 70

Porcentaje AA

60 50 40

DPPH ABTS

y = 562.43x - 1.3199 R² = 0.9741

30

La capacidad antioxidante de extractos de plantas no sólo depende de su composición química sino de las condiciones de los ensayos utilizados. Existen numerosos métodos publicados para medir in vitro la capacidad antioxidante total. Los ensayos basados en la transferencia de electrones miden la capacidad de un antioxidante para reducir un oxidante, el cual cambia de color cuando se reduce y ese cambio se correlaciona con la concentración de antioxidantes en la muestra. Los ensayos de Folin–Ciocalteau, dpph• y abts•+ entran en esa clasificación. Ninguno de ellos es suficiente, más bien es necesario corroborar la capacidad antioxidante de un extracto por varios métodos. En este estudio se determinó el contenido de polifenoles y la capacidad antioxidante de extractos y fracciones orgánicas obtenidos de la planta medicinal Sedum praealtum; para ello se emplearon las técnicas Folin– Ciocalteau, dpph• y abts•+, cuyo mantenimiento y uso son sencillos, no requieren de equipos costosos y los tiempos para los ensayos son adecuados. Todos esos parámetros los convierten en una opción ideal en el análisis de rutina. Además, un punto importante en su implementación es la reproducibilidad de los resultados. Dentro de esta investigación todos los estudios fueron realizados por triplicado y, una vez controladas las variables de las soluciones de reacción, la variación intra ensayos fue mínima. Por otro lado, los métodos de dpph• y abts•+ dieron resultados comparables de la capacidad antioxidante de los extractos y fracciones de siempreviva. La correlación entre concentración de compuestos polifenólicos en los extractos de la planta y su capacidad para neutralizar un radical fue altamente significativa, lo que explica la actividad terapéutica que se le atribuye a la siempreviva.

20 10 0 0.000

0.020

0.040

0.060

0.080

Equivalentes de Ácido Gálico

0.100

0.120

0.140

(mg ml - 1)

Análisis de correlación lineal entre los ensayos de Folin– Ciocalteau y de actividad antioxidante (dpph• y abts•). En ambos la correlación fue altamente significativa.

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