Cultivo de tejidos vegetales by Israel Piña

Evaluación de la fidelidad genética

de plantas micropropagadas de orégano mexicano (Lippia graveolens HBK) mediante marcadores RAPD Luis Alfonso Muñoz–Miranda, Araceli Rodríguez–Sahagún, Gustavo Javier Acevedo–Hernández, Osvaldo Adrián Castellanos–Hernández Centro Universitario de la Ciénega Universidad de Guadalajara

correo–e: ocnosc@gmail.com

Resumen Lippia graveolens HBK es una planta aromática de importancia económica en México, ha sido principalmente colectada de poblaciones silvestres. La propagación de manera natural es por lo general con semillas, que presentan un porcentaje de germinación bajo (˂40%). El cultivo de tejidos vegetales con yemas axilares propone una alternativa para la propagación de plantas. En el presente trabajo se reporta la evaluación de la fidelidad genética, mediante marcadores moleculares tipo RAPD de plantas de orégano obtenidas con la técnica de propagación de yemas axilares, que se realizó en medio MS con 0.5 mg/L de BA. Palabras clave: Lippia graveolens, marcadores moleculares, fidelidad genética.

Cultivo de tejidos vegetales

Introducción Lippia graveolens (familia Verbenaceae), conocida como orégano mexicano, es una especie aromática nativa del sur de Estados Unidos de Norteamérica, México y parte de América Central (Villavicencio–Gutiérrez et al., 2010). México es uno de los países con mayor producción de orégano a nivel internacional, ya que aporta el 35 o 40% de la producción mundial. Se calcula que la producción anual en nuestro país es de 4,000 toneladas, de las cuales el 90% es exportado a los Estados Unidos (Villavicencio et al., 2007). El orégano mexicano es usado sobre todo como condimento y conservador en muchos alimentos típicos de México. El aceite esencial extraído a partir de las hojas se ha utilizado en la industria farmacéutica, licorera y cosmetológica. Además se le ha conferido varias propiedades medicinales, antimicrobianas y antioxidantes (Arcila–Lozano et al., 2004; Ávila–Sosa et al., 2010). Su propagación, de forma natural, se realiza principalmente por semillas, aunque también se emplea el cultivo por estacas. El aprovechamiento se efectúa en poblaciones naturales durante el periodo de f loración, alterando el desarrollo normal del fruto y de la semilla. Además de las malas prácticas de recolección, que generan una reducción del tamaño y la densidad de la población, se ha reportado que sólo el 11% de los frutos producen de una a dos semillas. Aunado a ello, la baja germinación de las semillas ha acarreado problemas para la propagación del cultivo (Ocampo–Velázquez 2009; González–Nieves et al., 2010). Para tener una producción estable y continua de plantas de orégano que sirvan para originar plantaciones comerciales, es necesario contar con un sistema de propagación que no genere diferencias significativas en cuanto a la producción de aceite, por lo que los sistemas de propagación in vitro son una buena alternativa para usarse a nivel

comercial. En la búsqueda de alternativas de propagación se debe considerar la evaluación de la fidelidad genética entre las plantas madre y las propagadas, a fin de evidenciar la estabilidad genética entre ambos explantes. El empleo de marcadores moleculares es una herramienta para evidenciar la similitud o la variabilidad que produce el sistema de propagación, sin que se afecte el medio ambiente y la condición fisiológica o geográfica; asimismo, puede evaluarse en cualquier etapa de desarrollo de la planta (Becerra y Paredes, 2000). Las técnicas basadas en PCR, como los marcadores moleculares tipo RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA) se han utilizado ampliamente por su simplicidad, bajo costo, estabilidad, sensibilidad, aunque presenta el inconveniente de baja reproducibilidad. Ese marcador ha sido aplicado con éxito en el análisis de la fidelidad genética en algunas plantas aromáticas micropropagadas: Gloriosa superba L. (Yadav et al., 2013), Pogostemon cablin (Paul et al., 2010), Ocimum gratissimum L (Saha et al., 2011), entre otras. En este estudio se evaluó la fidelidad genética mediante marcadores moleculares RAPD, de plantas obtenidas por la técnica de propagación in vitro.

Metodología Material Vegetal Las semillas maduras de orégano mexicano (L. graveolens) fueron colectadas en el municipio de Colotlán, Jalisco, en el oeste de México, en la temporada de fructificación de marzo a mayo del 2010.

Proliferación de yemas axilares Los segmentos nodales usados para la propagación fueron obtenidos de plantas germinadas in vitro, éstas fueron seleccionadas por sus caracte-

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rísticas fenotípicas (mayor follaje y mayor número de segmentos nodales). Los segmentos nodales de tres plantas seleccionadas como donantes fueron establecidos en medio MS (Murashige y Skoog, 1962), al cual se le adicionó Benciladenina (BA) como regulador de crecimiento, a una concentración de 0.5 mg/L.

genética entre cada individuo con el coeficiente de Jaccard, incluido en el paquete estadístico FreeTree. Los dendrogramas fueron preparados aplicando el algoritmo UPGMA (Unweighted Pair–Group Method with Arithmetical Averages) (Rohlf, 1997), con el programa TreeView versión 1.6.6.

Condiciones RAPD

Resultados y discusión

La extracción de ADN genómico de plantas adquiridas a partir del primer ciclo de propagación, se efectuó conforme al protocolo de Zhang y Hewitt (2001) con algunas modificaciones. La cuantificación del ADN se realizó mediante un NanoDrop® a una longitud de onda de 260 nm, la calidad del ADN fue verificada en geles de agarosa al 1%. Se utilizaron iniciadores OPB 01–12 para evaluar la fidelidad genética del sistema de propagación. La reacción de amplificación se llevó a cabo en un volumen de 12.5 µl: 1 � L de ADN (5 ng/µl), oligonucleótido 1 � L (10mM), mezcla de dNTPs 1.5 � L (0.1 mM), Taq polimerasa 0.15 � L (5 U/� L), MgCl2 2 � L (25 mM), buffer 10X 1.25 � L y agua desionizada estéril 5.60 � L. La amplificación se hizo con el termociclador marca Techne modelo TC– 412: una primera desnaturalización a 94 °C, 4 min: seguido de 45 ciclos a 94 °C, 1 min, 42 °C, 1 min, 72 °C, 1 min y una extensión final a 72ºC por 10 min. Los productos amplificados fueron separados por electroforesis en geles de agarosa al 1.5% a 88 V, en buffer TAE 1X. Los geles fueron teñidos en bromuro de etidio y visualizados bajo trans–iluminador UV.

El patrón de bandeo de las plantas micropropagadas seleccionadas al azar fueron comparadas con la planta madre (obtenida de semilla). Los iniciadores generaron distintos perfiles de amplificación (figura 1). El dendrograma construido a partir de las distancias genéticas (figura 2) muestra que la planta madre, así como sus hijas (obtenidas por proliferación de yemas axilares) se encuentra en un mismo grupo. Por ello es posible determinar que los cambios generados con el método de propagación son mínimos, determinados a partir del marcador RAPD. Saha et al. (2012) reportan fidelidad genética en la planta aromática Ocimum gratissimum L. mediante micropropación por yemas axilares. Aunque se pueden observar variaciones genéticas mediante este sistema de propagación (Gupta et al., 2009). La baja variabilidad del sistema de propagación es importante en las metodologías de mejoramiento genético, ya que asegura la producción del genotipo mejorado sin cambios evidentes por efectos del sistema de propagación.

Análisis de Datos Los polimorfismos detectados se escrutaron como presencia (1) o ausencia (0) de ADN amplificado. Con estos datos se prepararon matrices binarias que se usaron para calcular valores de similitud

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cultivos para lograr mayores rendimientos y así evitar la excesiva depredación de la especie en su hábitat natural.

Agradecimientos Al equipo de trabajo del LBMV del Centro Universitario de la Ciénega.

Bibliografía Figura 1. Patrón electroforético de los marcadores RAPD (iniciador OPB– 08) adquiridos de las plantas madre (M1, M2 y M3) y las plantas obtenidas de los segmentos nodales (1–4).

Figura 2. Dendrograma obtenido a partir de marcador RAPD de las plantas micropropagadas por yemas axilares y su respectiva planta madre.

Conclusiones Mediante el uso de los marcadores moleculares tipo RAPD fue posible evidenciar la alta tasa de fidelidad genética que proporciona el sistema de propagación por medio de yemas axilares. Se propone esta metodología en los sistemas de producción de plantas de orégano con fines comerciales, con ello se garantizaría la homogeneidad de los

Arcila–Lozano, C., Loarca–Piña, G., Lecona–Uribe, S., González–Mejía, E. (2004). El orégano: propiedades, composición y actividad biológica de sus componentes. Archivos latinoamericanos de nutrición, 54:100–101. Avila–Sosa, R., Gastélum–Franco, M.G., Camacho– Dávila, A., Torres–Muñoz, J.V., Nevárez–Moorillón, G.V. (2010). Extracts of Mexican oregano (Lippia berlandieri Schauer) with antioxidant and antimicrobial activity. Food Bioprocess Tech, 3:434–440. Becerra, V., Paredes C., Mario (2000). Uso de marcadores bioquímicos y moleculares en estudios de diversidad genética. Agricultura Técnica, 60(3):270 – 281. González–Nieves, C., Arreola–Ávila, J.G., García– Herrera, G., Rodríguez–Lopez, J.S., Carrillo–Flores, R., Esquivel Arriaga, O., Villa–Castorena, M. (2010). Efectos de tratamientos pregerminativos en la emergencia y crecimiento de plántulas de orégano (Lippia graveolens HBK). Revista Chapingo Serie Zonas Áridas, 9:129–134. Gupta, R., Modgil, M., Chakrabarti, S.K. (2009). Assessment of genetic fidelity of micropropagated apple rootstock plants, EMLA 111, using RAPD markers. Indian Journal of Experimental Biology, 47:925–928. Murashige, T., Skoog, F. (1962). A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plantarum, 15:473–497.

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Ocampo–Velázquez, R.V., Malda–Barrera, G.X., Suárez–Ramos, G. (2009). Biología reproductiva del orégano mexicano (Lippia graveolens Kunth) en tres condiciones de aprovechamiento. Agrociencia, 43:475–482. Paul, A., Thapa, G., Basu, A., Mazumdar, P., Kalita, M.C., Sahoo, L. (2010). Rapid plant regeneration analysis of genetic fidelity and essential aromatic oil content of micropropagated plants of Patchouli, Pogostemon cablin (Blanco) Benth. – An industrially important aromatic plant. Industrial Crops and Products, 32:366 –374. Rohlf, F.J. (1997). NTSYS–pc Numerical taxonomy and multivariate analysis system, Version 2.00. Setauket, New York, USA. Exeter Software Publications. Pp 31. Saha, S., Kader, A., Segupta, C., Ghosh, P. (2012). In vitro propagation of Ocimum gratissimum L. (Lamiaceae) and its evaluation of genetic fidelity using RAPD marker. American Journal of Plant Sciences, 3:64–74. Villavicencio, G.E.E. (2007). Orégano, recurso con alto potencial. Revista Ciencia y Desarrollo, 33:60–66. Villavicencio–Gutiérrez, E., Cano–Pineda A., Garcia–Cuevas, X. (2010). Metodología para determinar las existencias de orégano (Lippia graveolens H.B.K.) en Rodales Naturales de Parras de la Fuente Coahuila. Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas y Pecuarias (ed), Saltillo, p. 42. Yadav K., Aggarwal, A., Singh, N. (2013). Evaluation of genetic fidelity among micropropagated plants of Gloriosa superba L. using DNA–based markers: a potential medicinal plant. Fitoterapia, 89:265–270. Zhang, D.X., Hewitt, G.M. (2001). Special DNA extraction methods for some animal species. En: A Karp, PG Isaac DC Ingram eds. Molecular tools for screening biodiversity. Chapman and Hall. Pp 25–31.

Propagación in vitro de Cuitlauzina pendula la llave & lex. (Orchidaceae) como una alternativa para su conservación

Verónica Adriana Pérez–Decelis, Irene Ávila–Díaz

Facultad de Biología Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo

Rafael Salgado–Garciglia

Instituto de Investigaciones Químico–Biológicas Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo

correo–e: iaviladiaz5@gmail.com

Resumen Se determinaron los medios de cultivo más eficientes para la germinación, desarrollo de protocormos, formación de plántulas y multiplicación de PLBs en Cuitlauzina pendula. Para el establecimiento del cultivo in vitro se probaron los medios: MS al 50% y 100%; MS con BA 0.05 mg/l–1; Phytamax al 50% y 100% y fertilizante comercial N–P–K 17–17–17 al 50% y 100% de la concentración de sus sales basales. Los mayores valores de germinación se obtuvieron en los medios Phy 50% y Phy 100%, con un promedio de 31 y 32 protocormos fuera de la testa de doscientos observados. La transferencia se realizó en medio Phy al 50% con una combinación de ácido naftalenacético y benciladenina en concentraciones de 0, 0.05, 0.1, 0.5 y 1.0 mgl–1 para ambos reguladores de crecimiento; siendo el T18 (0.1/0.5 mgl–1 de ANA / BA) con respecto a los demás tratamientos, en el que se registró mayor crecimiento, desarrollo y producción de PLBs (6.94 PLBs). Los resultados de la investigación son útiles para implementar la propagación masiva de esta especie amenazada, como una alternativa para colaborar a su manejo sustentable. Palabras clave: Cuitlauzina pendula, germinación in vitro, conservación Orchidaceae.

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Introducción La propagación de las orquídeas se dificulta porque sus semillas son diminutas, carecen de endospermo y requieren de hongos en condiciones naturales para su germinación a fin de abastecer azúcares y nutrientes (Arditti 1992). El uso de medios de cultivo en la propagación in vitro es de particular importancia en estas plantas, ya que éstos suministran los nutrientes necesarios para su crecimiento y desarrollo (Lo et al. 2004; Santos–Hernández et al. 2005). Una alternativa de propagación para especies endémicas o en alguna categoría de riesgo es la propagación in vitro, que contribuye indirectamente en la disminución de la presión que se ejerce sobre las poblaciones naturales (Sarabia– Ochoa et al. 2010). La Norma Oficial Mexicana NOM– 059 –ECOL– 2010 incluye a 181 especies de la familia Orchidaceae en alguna categoría de riesgo. Cuitlauzina pendula es una de ellas y se encuentra catalogada como amenazada y endémica de México (SEMARNAT 2010). Presenta la grave problemática de la destrucción de su hábitat y la extracción ilegal; eso ha ocasionando una severa reducción o extinción local de sus poblaciones silvestres, por lo que quedan muy pocas remanentes. Existen pocos trabajos enfocados a la propagación y conservación de especies de orquídeas epifitas mexicanas. Los objetivos de este estudio fueron: 1. Establecer un medio de cultivo eficiente para la germinación in vitro de C. pendula y 2. Determinar los medios de cultivo óptimos para el desarrollo de plántulas y la proliferación de PLBs a fin de conseguir la propagación sexual a través de semillas; esto, con la posibilidad de mantener niveles de variación genética aceptables para un manejo in situ de C. pendula y la propagación vegetativa para coadyuvar en su preservación de manera indirecta, al abrir la posibilidad de la obtención a

gran escala de plantas de calidad en invernaderos para disminuir la extracción de C. pendula. Cabe mencionar que la investigación es parte de un proyecto más amplio (Pérez–Decelis et al., en proceso) que incluye el estudio de algunos factores del sistema reproductivo de C. pendula, así como diversos aspectos de su ecología, con cuyos resultados se espera proponer alternativas de manejo integral de la especie.

Metodología Germinación de las semillas Dos cápsulas cerradas y maduras de C. pendula (desarrolladas en el Parque Nacional Barranca del Cupatitzio, Uruapan, Michoacán, México) fueron desinfectadas de acuerdo con Ávila–Díaz et al. (2009). Cada cápsula fue disectada en condiciones de asepsia en campana de flujo laminares. Se tomó alrededor de 5 mg de las semillas, se distribuyó uniformemente sobre la superficie de los siguientes medios de cultivo: MS1 (MS 50%), MS2 (MS 100%), MS3 (MS 50% con BA 0.05 mgl–1) y MS4 (MS 100% con BA 0.05 mgl–1) (MS es medio de cultivo Murashige y Skoog,1962); el medio de cultivo Phytamax (Phytamax Orchid Maintenance Medium SIGMA®): Phy1 (Phytamax 50%) y Phy2 (Phytamax 100%) y medios con fertilizante comercial triple 17: T1 (100%: 1000mg1) y T2 (50%: 500 mgl–1). Las condiciones de crecimiento in vitro, fueron a una temperatura de 25 °C y un fotoperiodo de 16 horas luz (2000 lux). A los 60 y 90 días del cultivo se hicieron observaciones en un microscopio óptico (Carl Zeiss modelo Primo Star, 10X (60d) y 4X (90d), considerando los estadios de desarrollo que a continuación se enuncian: a) deformes (semillas con el embrión reducido a un 50% o menos dentro de la testa); b) protocormo 1 (aquellas semillas que tenían el embrión en forma globular completo o

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más del 50% dentro de la testa); c) protocormo 2 (aquellas semillas que tenían más del 50% o todo el embrión, fuera de la testa); d) plántula 1 (plántula con una o dos hojas) y e) plántula 2 (plántula con más de dos hojas).

Transferencia de protocormos in vitro con adición de reguladores de crecimiento Para la transferencia de protocormos en estadio 2 de C. pendula se utilizó el medio Phy 1 (medio Phytamax con 50% de sus sales basales), suplementado con distintas concentraciones de una combinación de ácido naftalenacético (ANA) y benciladenina (BA) (0, 0.05, 0.1 y 0.5 mgl1 para ambos reguladores de crecimiento). La evaluación del desarrollo de los protocormos transferidos se realizó a los 125 días; se determinó la longitud del vástago, el número de hojas, largo y ancho de las hojas, número y longitud de raíces y el vigor de las plántulas. Este último parámetro fue determinado en categorías (Pérez– Decelis et al., en proceso). También se evaluó el número de PLBs. Se efectuó un análisis ANOVA y una prueba de Tukey y Kramer con un 95% de confiabilidad cuando hubo diferencias significativas; para las variables categóricas cualitativas (vigor) se llevó a cabo una prueba de Chi–cuadrada con el programa JMP 8 (JMP8, 2009).

Resultados y discusión Germinación de las semillas A los 60 días (F=101.78, gl=7, P<0.0001) se obtuvo la geminación más alta con promedios de 31 y 32 “protocormos en estadio 2” en los medios Phytamax al 50% y 100% y a los 90 días (F=3.23, gl=7, P<0.0146); se registraron valores promedios de 18 y 20.25 de protocormos 2 para esos mismos medios.

Hasta los 90 días sólo los medios Phy1 y Phy2 registraron desarrollo de plántulas de C. pendula. Los medios Phytamax (50% y 100%) fueron los mejores para la germinación in vitro de C. pendula, como en Encyclia adenocaula (Ruíz et al. 2008), con la que se logró el 69.16% de germinación en este medio.

Transferencia de protocormos in vitro con adición de reguladores de crecimiento A los 125 días de la transferencia de protocormos en estadio 2, se registraron los valores más altos de las variables longitud de hojas, número y longitud de raíces en aquellas plántulas sometidas al tratamiento T20 (1/0.5 mgl–1 de ANA/ BA); en los tratamientos T18 (0.1/0.5 mgl–1 de ANA/ BA) y T19 (0.5/0.5 mgl–1 de ANA/ BA) se observaron las mayores longitudes del vástago. El valor más alto del ancho de las hojas fue mostrado por los tratamientos T18 (0.1/0.5 mgl–1 de ANA/ BA) y T20 (1/0.5 mgl–1). En cuanto al número de hojas los tratamientos T5 (1/0 mgl–1 de ANA/ BA), T7 (0.05/0.05 mgl–1), T18 (0.1/0.5 mgl–1 de ANA / BA), T19 (0.5/0.5 mgl–1 de ANA / BA) y T20 (1/0.5 mgl–1) presentaron los valores mayores. Como puede observarse, para C. pendula se exhibe en general una respuesta favorable a moderadas y altas concentraciones de ANA. Otro estudio hecho en C. pendula reportó una alta formación de plántulas en el medio MS adicionado con BA (0.5 mgl–1) o sin reguladores de crecimiento (Mata–Rosas y Salazar–Rojas 2009), similar a lo que ocurre en el T18 ANA/ BA (0.1 mgl– 1 /0.5 mgl–1), T19 ANA/ BA (0.5 mgl–1/ 0.5 mgl–1) y T20 ANA / BA (1 mgl–1/ 0.5 mgl–1) percibido en esta investigación. Se hallaron diferencias significativas (X 2=256.05, gl=144 P<0.000) con respecto a las categorías de vigor de las plántulas de C. pendula, a los 125 días de haberse efectuado la transferencia de protocormos en los distintos tratamientos (ANA/ BA).

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Los valores más altos de vigor se registraron en las plántulas de los tratamientos T18 (0.1/0.5 mgl–1) y T21 (0/1 mgl–1) (Pérez et al., en proceso). Dichos tratamientos fueron los más adecuados para el desarrollo de plántulas de C. pendula.

Multiplicación de PLBs Después de 125 días de efectuada la transferencia de protocormos se observaron diferencias significativas (F=2.3377, gl= 24, P<0.0005). El mayor número de PLBs (en promedio 6.94 PLBs), se registró en el tratamiento T18 (0.1/0.5 mgl–1 de ANA/ BA). En otro estudio también se reportó la formación de PLBs en C. pendula, con BA a una concentración de 0.5 mgl–1 y sin reguladores de crecimiento (Mata–Rosas y Salazar–Rojas 2009); en Cattleya aurantiaca con 0.1 mgl–1 de ANA y 10 mgl–1 de BA (Mauro et al. 1995), en Laelia speciosa con 0.5 mgl–1 de ANA y 0.1 mgl–1 de GA3 (Ávila– Díaz et al., 2009) y con 2.5 mgl–1 de ANA y 1 mgl–1 de BA (Sarabia–Ochoa et al., 2010). La obtención de PLBs es una forma de reproducción asexual para C. pendula, lo cual permitiría obtener una gran cantidad de plantas idénticas a ejemplares con características deseadas. Los resultados de la investigación abren la posibilidad para la propagación masiva y para la obtención de plantas de calidad de C. pendula en invernaderos, para disminuir en cierto grado la extracción de individuos de sus poblaciones y colaborar a un manejo adecuado de esa especie amenazada.

Conclusiones C. pendula presentó la mayor geminación en los medios de Phytamax al 100% y al 50% de la concentración de sus sales basales, a los 60 y 90

días de realizada la siembra. Los medios Phy 50% adicionados con 0.1 y 0.5 mgl–1 de ANA y BA (T18) y con 1 y 0.5 mgl–1 de ANA y BA (T20), respectivamente, fueron los más eficientes para el crecimiento y desarrollo de plántulas de C. pendula; se obtuvieron plántulas sanas, con seudobulbo y raíz desarrollada en los tratamientos T18 y T21 (0/1 mgl–1). El medio T18 fue también el mejor para producir la mayor cantidad de PLBs.

Agradecimientos Al CONACyT por la beca otorgada dentro del Programa Institucional de Maestría en Ciencias Biológicas (2011–2013) para la realización de esta investigación. Asimismo, a la Coordinación de la Investigación Científica de la UMSNH, a través del Proyecto Biología de la Conservación de Orquídeas Michoacanas, a cargo de Irene Ávila D.

Bibliografía Arditti, J. (1992). Fundamentals of orchid biology. Department of Developmental and Cell Biology. Ed. John Wiley and Sons. USA. 691pp. Ávila–Díaz, I., Oyama, K., Gómez–Alonso, C., Salgado–Garciglia, R. (2009). In vitro propagation of the endangered orchid Laelia speciosa. Plant Cell Tiss Organ Cult 99:335–343. Baltazar, R. (2004). Micropropagación de Oncidium tigrinum La Llave & Lex (Orchidaceae) a partir de protocormos. Tesis de Licenciatura. Universidad Veracruzana. 124 pp. Lo, S.F., Nalawade, S.M, Kuo C.L, Chen C.L., Tsay, H.S. (2004). Asymbiotic germination of inmature seeds, plantlet development and ex vitro establishment of plants of Dendrobium tosaense Makino–a medicinally important orchid. In Vitro Cell Dev Biol. Plant., 40:528 –535. Mata–Rosas, M., Salazar–Rojas, V.M. (2009). Propagation and Establishment of Three Endangered

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Regeneración de Sechium edule

mediante organogénesis y uso de marcadores RAMP para evaluar la fidelidad genética

Victor O. Cruz–Martínez, Gustavo J. Acevedo–Hernández, Osvaldo A. Castellanos–Hernández, Araceli Rodríguez–Sahagún Centro Universitario de la Ciénega Universidad de Guadalajara

correo–e: aracelicrs@gmail.com

Resumen Se obtuvieron plantas de chayote mediante el desarrollo de un sistema eficiente de regeneración in vitro vía organogénesis directa (MS suplementado con 0.1 mg/L de BA y 0.1 o 0.5 mg/L de GA3). Se partió de explantes de hoja con peciolo en un tiempo aproximado de 25 días, con una eficiencia en producción promedio de 7.25 brotes por tratamiento. Para el análisis de la variabilidad genética producida por el método de regeneración de Sechium edule se usaron los marcadores moleculares RAMP, se evidenció la fidelidad genética que mantienen la planta donante con las regeneradas por esta vía. Palabras clave: Sechium edule, regeneración, fidelidad genética.

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Introducción El chayote, Sechium edule, es una hortaliza popular ampliamente distribuida en regiones subtropicales con más de 2,100 mm de lluvia. Es originario del trópico americano, donde se encuentra la mayor diversidad genética, pero se cultiva de manera rústica en muchas regiones del mundo, siendo uno de los vegetales más accesibles para los grupos de bajos ingresos (Lira, 1996). Tal especie es considerada un producto de relevancia comercial para México. Al ser éste uno de los países con mayor diversidad genética requiere estrategias para conservar sus poblaciones silvestres y asegurar la disponibilidad de material con características de importancia económica (estándares de exportación) para los agricultores, eso se lograría con la creación y mantenimiento de bancos de germoplasma. Para ello es preciso desarrollar estrategias biotecnológicas que permitan la conservación a mediano y largo plazo del material vegetal. Los métodos de conservación deben garantizar la viabilidad y la estabilidad genética de los materiales almacenados. Lo anterior es imposible de manera convencional; se considera una especie recalcitrante por las características de la semilla (alto contenido de agua y corto periodo de latencia), por lo que las semillas germinan aun durante la vida de anaquel. Una alternativa viable es el establecimiento de la regeneración vía organogénesis, conocida como estrategia de propagación con bajo índice de variabilidad genética en las plantas obtenidas, lo cual puede ser evaluado mediante el uso de marcadores moleculares. Para poder implementar metodologías de conservación y mejoramiento genético es indispensable contar con un sistema de regeneración que no produzca alta variabilidad genética en las plantas obtenidas.

Establecer un protocolo eficiente de regeneración de plantas vía organogénesis es un primer paso en el mejoramiento genético de la especie; éste podrá ser evaluado a través de marcadores moleculares empleados con éxito en la búsqueda de diferencias en los patrones genéticos entre cultivares, variedades y plantas. Los estudios de fidelidad genética constituyen una técnica válida y rápida para detectar variabilidad en las plantas regeneradas, ya que los marcadores morfológicos necesitan más tiempo y en ocasiones son menos confiables.

Metodología Se extrajeron embriones de chayote a partir de frutos maduros, fueron desinfectados 30 segundos en una solución de alcohol al 70%, seguido de 12 min en una solución de hipoclorito de sodio al 50%, finalmente fueron enjuagados tres veces con agua destilada estéril en la campana de flujo laminar; dicho establecimiento y regeneración in vitro de chayote es el primer paso para desarrollar el mejoramiento genético de la especie. Los explantes fueron colocados en un medio MS en condiciones asépticas, los cultivos se mantuvieron en un cuarto de crecimiento a una temperatura de 27±2ºC, con un foto periodo de 16h de luz fluorescente (25 µm/seg/m2). Una vez que los embriones germinaron y presentaron crecimiento de plántulas en alrededor de 10 días de incubación, se eliminaron los cotiledones y se extrajeron las hojas de las plántulas, a cada hoja se le hizo pequeñas incisiones para una mejor respuesta. Se realizaron distintos tratamientos con benciladenina (BA) y ácido giberélico (GA3) y como agente gelificante se empleó Phytagel. Una vez que se hallaron las plantas regeneradas por organogénesis, se evaluaron por medio de marcadores moleculares RAMP, con los cuales se puede estimar la diversidad genética en plantas y

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animales; a la vez, permiten mostrar la base de la variación de los individuos, por mencionar algunas de sus aplicaciones. Se evaluaron 8 oligonucleótidos ISSR y 10 oligos RAPD.

Figura 2. Interacciones de los factores concentración de (GA3) y (BA) para la inducción de brotes en Sechium edule.

Resultados y discusión Se desarrolló un sistema eficiente de regeneración in vitro vía organogénesis directa de Sechium edule; se partió de explantes de hoja con peciolo en un tiempo aproximado de 25 días, siendo la regeneración sólo en la base del peciolo (figura 1).

Figura 1. Regeneración de Sechium edule, ciclo completo. 1) Fase de inducción, explante de hoja con peciolo, 3 días de incubación. 2) Células formando órgano vegetal, 6 días de incubación. 3) Desarrollo de la plántula organogénica, 9 días de incubación. 4) Plántula, 11 días de incubación. 5) Plántula, 15 días de incubación. 6) Plántula, 18 días de incubación. 7) Plántula, 25 días de incubación. 8) Planta con desarrollo de raíz, 30 días de incubación.

Se obtuvieron plantas de chayote mediante regeneración in vitro vía organogénesis directa, cuando el medio MS fue suplementado con 0.1 mg/L de BA y 0.1 o 0.5 mg/L de GA3 (figura 2).

Una vez establecido el protocolo de regeneración de plantas de chayote vía organogénesis, se desarrolló la metodología de enraizamiento in vitro de los brotes; se obtuvo el 80% de enraizamiento a los 10 días de incubación en medio MS sin reguladores de crecimiento (figura 3). La técnica RAMPs permitió evaluar la fidelidad genética del método de regeneración vía organogénesis directa, además que evidenciaron ser una herramienta aplicable a estudios de variabilidad genética para Sechium edule (figura 4).

Figura 3. a) Desarrollo de raíz a los 30 días de ser individualizada la plántula. b) Plántula con raíz, 13 días de ser individualizada. c) Plántula con raíz, 16 días de ser individualizada. d) Plántula con raíz, 14 días de ser individualizada.

Cultivo de tejidos vegetales

regeneración in vitro por organogénesis directa se mantiene la estabilidad genética de las plantas, y con ello mantener las características genotípicas de las mismas. Esto fue evaluado por los marcadores moleculares tipo RAMP (figura 5).

Figura 4. Patrón de bandeo. Electroforesis de la PCR obtenida a través de marcadores RAMPs, combinación 17 con los oligos (2–ISSR y 7–RAPD). 1–28 primeras plántulas regeneradas vía organogénesis directa. M izquierda: mpm 1kb. M derecha: mpm 100 pb.

El uso de marcadores RAMP ha sido utilizado con éxito para evaluar en distintas especies el grado de variabilidad existente, ya sea ocasionado por el sistema de propagación o en cultivos como lo realizado para granada (Zhao et al., 2013).

Conclusiones Se logró la obtención de plantas de Sechium edule a través de la regeneración por organogénesis.Se demostró que ese procedimiento no genera cambios genotípicos en las plantas, lo que se presume será un buen comienzo para trabajos de mejoramiento genético en la especie.Mantener la especie in vitro ayudaría a crearv un banco de germoplasma; las características del fruto imposibilitan hacerlo de forma natural, ya que éste germina poco tiempo después de su corte y ello impide su almacenamiento. Se busca en futuros trabajos establecer protocolos de mejora genética para beneficiar al sector agrícola con la producción de plantas libres de virus, una de las problemáticas que presentan los cultivos de chayote.

Agradecimientos A todo el equipo de trabajo del Laboratorio de Biología Molecular Vegetal del Centro Universitario de la Ciénega.

Figura 5. Dendograma encontrado con marcadores RAMPs a partir de 16 muestras de eventos organogénicos de Sechium edule. H: Plantas organogénicas hijas. M: Plantas madre. 20 y 21: Plantas organogénicas. O1 y O2: Muestras de plantas de orégano como referencia. P1 y P2: Muestras de plantas de Paulownia como referencia.

Se demostró que mediante el sistema de

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Bibliografía Lira–Saade, R. (1996). Chayote. Sechium edule Promoting the conservation and use of underutilized and neglected crops 8. Institute of Plant Genetics and Crop Plant Research. Gatersleben/lnternational Plant Genetic Resources Institute, Rome, Italy. Pág. 57–58. Zhao, L., Li, M., Cai, G., Pan, T., Shan, C. (2013). Assessment of the genetic diversity and genetic relationships of pomegranate (Punica granatum L.) in China using RAMP markers. Scientia Horticulturae, 151:63– 67.

Inducción de poliploidía en Cerdia congestiflora Hemsl., especie vegetal con potencial para remediar suelos

contaminados con metales pesados Yesenia López–López, Miguel Alvarado–Rodríguez

Unidad Académica de Agronomía Universidad Autónoma de Zacatecas

Lenin Sánchez–Calderón, Saúl Fraire–Velázquez

Unidad Académica de Ciencias Biológicas Universidad Autónoma de Zacatecas

correo–e: mialvaro2909@hotmail.com

Resumen La fitorremediación es una tecnología innovadora que consiste en utilizar plantas vivas y los microorganismos asociados a su rizósfera para la remediación in situ y ex situ de suelos, lodos, sedimentos y aguas contaminados a través de la remoción, degradación o estabilización de los contaminantes. Esta tecnología tiene un gran potencial para la remediación de sitios contaminados por sus bajos costos y por lo amigable con el medio ambiente. Existen varias especies vegetales que es posible usar en la fitorremediación de suelos contaminados con metales pesados. Se ha demostrado que Cerdia congestiflora es capaz de tolerar y acumular plomo, ya que presenta un FBC de 1.05. Sin embargo, debido a su pequeño tamaño, no se puede emplear en la fitorremediación de suelos contaminados (Salas–Luevano et al., 2009). El objetivo de este trabajo fue inducir poliploidía en C. congestiflora mediante la utilización de colchicina in vitro, a fin de producir plantas de mayor tamaño que pudieran ser candidatas para el saneamiento de suelos contaminados con plomo y otros metales pesados. Se obtuvieron plantas con un tamaño superior a las control, a partir de semillas que fueron embebidas 48 y 96 h en soluciones de colchicina al 0.05 y 0.1%. Los ejemplares se multiplicaron y se enraizaron in vitro, se usaron diversos reguladores del crecimiento vegetal y posteriormente se aclimataron. Se determinó la poliploidía considerando el fenotipo, contenido de ADN genómico y diámetro nuclear. Palabras clave: Cerdia congestiflora, poliploidía, fitorremediación.

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Introducción La actividad minera genera suelos contaminados con residuos sólidos y semisólidos mediante la producción de desechos comúnmente llamados “jales”, que se caracterizan por sus limitaciones físicas, químicas y biológicas para el establecimiento de la cubierta vegetal, los riesgos a la salud humana y al medio ambiente (Puga et al., 2006). Zacatecas tiene más de 450 años de tradición minera con la consecuente acumulación de residuos. Contiene metales pesados como el Pb, Cd, As, elementos que no tienen funciones metabólicas conocidas y que son tóxicos a muy bajas concentraciones (Méndez–Prieto et al., 2009). Zn, que es esencial para los seres vivos pero puede llegar a ser tóxico conforme aumenta su concentración. Hg, que se usó en el proceso de amalgamación para la extracción de oro y plata; fue usado desde mediados del siglo XVI hasta mediados del siglo XIX, actualmente varias microcuencas del estado están contaminadas con ese elemento (Rodríguez et al., 2011). En el municipio de Guadalupe, las comunidades de La Zacatecana y Osiris son las zonas con mayores concentraciones de metales pesados (As, Pb y Hg), hasta 8 veces más que las concentraciones recomendadas por la PROFEPA (Santos–Santos et al., 2006). En Vetagrande se han detectado concentraciones de hasta 400 mg de Pb por kg de suelo residencial, que es el valor máximo permitido conforme a la NOM–147–SEMARNAT/SSA1–2004. Una tecnología empleada para remover los metales pesados de suelos contaminados es la extracción por plantas que han desarrollado esa capacidad, esto es conocido como fitorremediación. Esas plantas absorben, concentran y precipitan metales tóxicos hallados en suelos contaminados, es la mejor forma de remediar áreas contaminadas, donde los contaminantes están presentes a relativamente bajas concentraciones y de manera superficial (Rulkens, et al., 1998).

Por su parte, Cerdia congestiflora es una planta que crece en suelos contaminados con desechos mineros, en lugares cercanos a la ciudad de Zacatecas; por ello es posible afirmar que está adaptada a tales condiciones y que es capaz de tolerar, traslocar y acumular cantidades relevantes de plomo. Sin embargo, aunque se presenta todo el año y tiene un buen factor de bioconcentración (FBC) de 1.05, no es candidata a utilizarse para fines de fitorremediación debido a su pequeña biomasa (Salas–Luévano et al., 2009). A pesar de lo anterior existen estrategias biotecnológicas para incrementar el tamaño, el vigor y la tolerancia a ambientes desfavorables a las plantas, entre ellas se encuentran la inducción de poliploidía mediante el uso de colchicina. En este trabajo se obtuvieron in vitro plantas poliploides, resultaron ser de mayor tamaño que las plantas obtenidas de semillas no tratadas con colchicina.

Metodología Material biológico Se utilizaron semillas que se colectaron de plantas silvestres maduras de C. congestiflora, localizadas en la zona contaminada con jales provenientes de la Mina El Bote. Ésta se ubica en Morelos, Zacatecas y se aproxima a las comunidades Francisco I. Madero y Noria de Gringos, pertenecientes a los municipios de Zacatecas y Morelos, respectivamente. Se seleccionaron 1,200 semillas C. congestiflora, se lavaron con agua y jabón, a continuación se sumergieron en alcohol etílico 70% durante un minuto; se colocaron en una solución de hipoclorito de sodio comercial (cloralex) al 10% durante 25 min. Finalmente se enjuagaron cuatro veces con agua destilada estéril. Para inducir poliploidía, las semillas se mantuvieron en una solución de colchicina al 0, 0.01, 0.05 y 0.1%, durante 0, 48

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y 96 h, lo que hizo un total de 12 tratamientos con 100 semillas cada uno. Las semillas tratadas se sembraron en medio de cultivo semisólido MS, sin reguladores del crecimiento vegetal.

Determinación de poliploidía Se seleccionaron los ejemplares con un fenotipo diferente a las plantas control. Plantas con mayor altura, con hojas más anchas y de un verde más oscuro. Para aumentar la cantidad de material biológico, las plantas control y las que tuvieron un fenotipo de nuestro interés, se multiplicaron suplementando el medio nutritivo con la citocinina BA a concentraciones de 0, 1.0, 2.0 mg/L y la auxina AIB a concentraciones de 0 y 0.2 mg/L (en combinación), para dar un total de seis tratamientos.

Contenido de ADN genómico La cantidad de ADN de células poliploides es más alta, si se compara con las células diploides. El contenido de ADN se incrementa proporcionalmente con el incremento del nivel de ploidía, por lo tanto la misma unidad de masa de tejido diploide y poliploide tiene diferente cantidad de ADN; el cual puede ser determinado mediante espectrofotome–tría al seleccionar una longitud de onda de 260 nm (Hasnain Raza et al., 2003).En este estudio el ADN de las plantas regeneradas fue extraído por el método de CTAB, de 500 mg de muestra.

Diámetro nuclear Las células con núcleo poliploide son generalmente más grandes que las células de la misma especie vegetal con núcleo diploide. Se ha reportado que existe una fuerte correlación entre el tamaño del genoma y el volumen celular. Las cé-

lulas de gran tamaño tienen más ADN nuclear, y en eucariontes los núcleos son más grandes. Esta correlación se da en células de plantas superiores (Goff and Coleman, 1987). Con base en lo anterior, se tomó como muestra una hoja por cada planta, considerada poliploides y otra de las plantas control. Las hojas se “clarearon” con Metil Salicilato, a fin de eliminar al máximo pigmentos que pudieran interferir durante la observación de los núcleos celulares. Las hojas montadas en portaobjetos, cubiertas y selladas, se observaron en un microscopio Confocal marca Carl Zeiss modelo LSM 6 Pascal. A partir de las fotografías tomadas se midió el diámetro nuclear y se hicieron las comparaciones entre plantas control y poliploides.

Enraizamiento Para inducir un sistema radical vigoroso en los dos tipos de plantas, se probaron cuatro diferentes tratamientos: 1) MS 1X sin fitohormonas, 2) MS 0.5X, 3) MS 1X con 0.5 mg/l de AIB y 4) MS 1X suplementado con 0.5 g/l de carbón activado. Una fracción de esas plantas consideradas ya clonas en esta fase fueron destinadas para mantenerlas in vitro y otra fracción para llevarlas a la etapa de aclimatación.

Aclimatación Se consideraron 20 vitroplantas con un sistema radical bien desarrollado, abundante y vigoroso. Se extrajeron las plantas de los medios de cultivo, se eliminó cuidadosa y totalmente el agar de sus raíces; manera individual a macetas conteniendo una mezcla de peatmoss y tierra de cultivo en una proporción del 49.5% de cada componente, más el 1% del fertilizante de liberación lenta ozmocote triple 14. El trasplante se realizó al humeder el sustrato. Los vasos con las plantas se cubrieron

Cultivo de tejidos vegetales

con una bolsa plástica transparente, se ligó ésta. En forma gradual se eliminó la cubierta en el lapso de dos semanas.

Tabla 1 Valores medios de los parámetros morfológicos de plantas poliploides y de plantas control

Resultados y discusión

Parámetros

Control (mm)

Distancia intermodal

Tratamientos para inducir poliploidía La cantidad de semillas germinadas en promedio para todos los tratamientos fue de 46.66%, luego de 4 semanas de iniciado el proceso con colchicina. Sin embargo, sólo en los tratamientos de 0.1% de colchicina con 48 y 96 h, se produjeron plantas con una gran variación fenotípica, determinada a las 16 semanas después de iniciado el tratamiento. En la figura 1 se aprecia una planta control y una planta poliploide que presenta hojas más anchas y una altura mayor.

Figura 1. Se muestra a la derecha una planta de C. congestiflora poliploide con hojas anchas, y a la izquierda una planta control.

Poliploides mm

3.06

9.5

Largo

5.05

6.92

Ancho

0.475

1.42

Grueso

0.156

0.4

Diámetro del tallo

0.3

0.56

Altura

234

Hoja

Color de la hoja

= 180 = 198 R = 28

= 93 = 129 R = 31 B

Carga cromosómica Sólo en los tratamientos 0.1% de colchicina de 48 y 92 h, germinaron 21 y 18 semillas respectivamente; de las 39 semillas germinadas fue posible obtener tres plantas con el fenotipo deseable: una planta en el primer tratamiento y dos en segundo. Se extrajo ADN genómico de ambos tipos de plantas por el método de CTAB. La concentración de éste se cuantificó, por lo que la planta control tuvo 4.9 µg/ ml, mientras que las plantas poliploides tuvieron una concentración de 20.3 µg/ ml.

Diámetro nuclear En la tabla 1 se expone un comparativo de algunos parámetros morfológicos entre plantas control y plantas poliploides.

Las hojas clareadas y montadas en el portaobjetos se observaron al microscopio Confocal. Se registraron las características señaladas en la siguiente tabla.

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Tabla 2 Comparación de parámetros anatómicos de hojas de plantas control y de plantas poliplides Tipo de planta

Relación N/C

No. E/mm2

No. T/mm2

Longitud de E

C/T

Planta control

0.3579

Planta poliploide

0.4444

Donde: N = Núcleo; C = Célula; T = Tricoma; E = Estoma.

De acuerdo con lo registrado se comprobó que el núcleo de las células de las plantas poliploides es de mayor diámetro con respecto a las plantas control. Cada tricoma de las plantas control se compone por una sola célula, mientras que las poliploides tuvieron tricomas segmentados conformados por seis células cada uno. También se observó una escasa presencia de tricomas en las plantas poliploides, que presentaron un 225% más estomas por mm2 que las plantas control, aunque de un tamaño muy reducido. En la figura 2 se indican segmentos de hoja de una planta control y de una poliploide.

Multiplicación de plántulas La tasa más alta de multiplicación para las plantas control y poliploides se logró con el tratamiento 1 mg/L de BA con 0 mg/L de AIB, seguida de 0 mg/L de BA con 0.2 mg/L de AIB o de 1 mg/L de BA con 0.2 mg/L de AIB. Se obtuvo una tasa media de multiplicación de 5.5 para el primer tratamiento, y de 4.4 para los dos segundos tratamientos.

Figura 2. La imagen A corresponde a una planta control, donde se aprecian estomas de gran tamaño. En B, planta control con gran cantidad de estomas. En C, células de planta poliploide con núcleos de tamaño mayor que los de las plantas control. En D, tricoma segmentado conformado por seis células, mientras que en las plantas control son unicelulares.

Enraizamiento Se obtuvo un sistema radicular abundante y vigoroso con el tratamiento MS suplementado con 0.5 mg/L de AIB, tanto en plantas control como en plantas poliploides. En los otros tres tratamientos probados, luego de 6 semanas de iniciado el proceso no hubo respuesta alguna.

Aclimatación La aclimatación no pudo lograrse cuando las plantas se extrajeron del frasco y fueron trasplantadas en el sustrato ya señalado. Sin embargo, se efectuó una aclimatación del 30% cuando las plantas libres de restos de agar se trasplantaron en condiciones de asepsia, en frascos con peatmoss estéril. Bajo esas condiciones se hizo una preaclimatación durante dos semanas; luego, durante otras dos semanas se mantuvieron en macetas con el sustrato señalado y cubiertas con una bolsa plástica, ésta se perforó gradualmente.

Cultivo de tejidos vegetales

Conclusiones Se generaron plantas poliploides de C. congestiflora mediante el uso de colchicina, a la única concentración de 0.1% a partir de semillas que estuvieron en contacto con dicho alcaloide por un periodo de 48 y 96 h. Las células poliploides presentaron núcleos de mayor tamaño y estomas más pequeños que las células de las plantas control.

Bibliografía Goff Lynda, J., Annette W., Coleman (1987). The Solution to the Cytological Paradox of Isomorphy. The Journal of Cell Biology, 104:739–748 Hasnain Raza, M., Jafar Jaskani, M., Mumtaz Khan, Tanwir, Malik, A. (2003). In vitro induction of polyplids in watermelon and estimation based on DNA content. International Jornal of Agriculture & Biology. Méndez–Prieto, J., Ramírez, C.A., Gutiérrez, A.D., García, F.P. (2009) Contaminación y fitotoxicidad en plantas por metales pesados provenientes de suelos y agua. Tropical and Subtropical Agroecosystems, 10 (1): 29–44. Redalyc, Disponible en: http:// www.redalyc.org/articulo.oa?id=93911243003 Puga, S., Sosa, M., Lebgue, T., Quintana, C., Campos, A. (2006). Contaminación por metales pesados en suelo provocada por la industria minera. Ecología aplicada, 5 (1–2): 149–155. SciELO. Disponible en: http://www.scielo.org.pe/scielo. php?pid=S1726–22162006000100020&script=sci_ arttext Rodríguez, M.C. (2011) La vida cotidiana en el territorio contaminado de la Zacatecana, en Guadalupe, Zacatecas. CIESAS. Centro de Investigaciones y Estudios Superiores en Antropología Social: 216. Tesis doctoral publicada en http://207.248.180.68/ Tesis/PDF/179.pdf Rulkens, W.H., Tichy, J.T., Grotenhuis, C. (1998). Remediation of polluted soil and sediment: pers-

pectives and failures. Water Science and Technology, 37(8):27–35 Salas–Luévano, M.A., Manzanares–Acuña E., Letechipía–De León, C., Vega–Carrillo, H.R. (2009) Tolerant and hyperaccumulators autochthonous plant species from mine tailing disposal sites. Asian J. Exp. Sci., 23(1):27–32 Santos–Santos, E., Yarto–Ramírez, M., Gavilán– García, I., Castro–Díaz, J., Gavilán–García, A., Rosiles, R., Suárez, S., López–Villegas, T. (2006) Analysis of arsenic, lead and mercury in farming areas with mining contaminated soils at Zacatecas, México. Journal of the Mexican Chemical Society, 50 (2): 57–63. Disponible en: http://www. jmcs.org.mx/OLD/PDFS/ V50/N2/02–Analysis.pdf

Micropropagación

de tres variedades de Fragraria ananassa (“portola”, “albión” y “camino real”)

Rodrigo Félix–Hernández

Universidad Politécnica de Zacatecas

Yesenia López–López, Miguel Alvarado–Rodríguez

Unidad Académica de Agronomía Universidad Autónoma de Zacatecas

correo–e: mialvaro2909@hotmail.com

Resumen Se estableció un protocolo para micropropagar tres variedades de Fragraria ananassa, una especie de rápida oxidación al momento de cultivar in vitro. El establecimiento fue a partir de meristemos aislados de estolones, los cuales se sembraron en el medio nutritivo MS suplementado con 0.5 mg/L de BA; se presentó un índice de viabilidad de 50% y contaminación no significativa. La respuesta de los meristemos se realizó en un intervalo entre 2 a 4 semanas. La tasa de multiplicación más elevada que se logró fue de 14 brotes por explante en el medio de cultivo MS suplementado con 0.5 mg/L de BA. Se obtuvieron raíces abundantes y vigorosas en medio MS sin Reguladores de Crecimiento Vegetal. Se consiguió que el 90% de las vitroplantas se aclimataran en un término de 45 días. Palabras clave: Fragraria ananassa, micropropagación, estolones.

Cultivo de tejidos vegetales

Introducción La planta de fresa es herbácea, de porte bajo, generalmente no supera los 30 cm de altura; se reproduce asexualmente por medio de estolones y por corona. En el contexto mundial México destaca entre los diez principales países productores de fresa por el volumen de producción anual. Aunque ha tenido altibajos a través del tiempo, ha habido una recuperación en años recientes respecto a 1966, cuando el país ocupó el segundo lugar en la producción mundial, con el 13% del volumen global. Desde principios de 1950 el cultivo depende del material vegetativo categorías Registrada y Certificada de EUA., ante la falta de un programa nacional para generar variedades y multiplicar planta libre de virus. Cada año se importan de California 20 millones de plantas de fresa, en su mayoría categoría Certificada, para utilizarlas en viveros. El proceso de importación y reproducción de planta se repite cíclicamente por la necesidad de renovar la plantación comercial cada año. Esto se debe a que por la insuficiencia de horas–frío y el ataque de enfermedades, la productividad y la calidad de la fruta bajan drásticamente. En nuestro país los resultados de las investigaciones orientadas a identificar los climas idóneos para propagar plantas de fresa indican que Fresnillo, Zacatecas acumula en campo un mínimo de 300 horas–frío, lo cual ocurre en la primera quincena de noviembre.

Metodología Establecimiento El cultivo in vitro de Fragraria ananassa se inició a partir de estolones, se llevó a cabo un muestreo de estolones jóvenes sin raíz de 3 variedades Por-

tola, Albión y Camino Real en un rancho cercano a la Estación San José, Fresnillo; eso se efectuó el mismo día de su uso para el cultivo in vitro. Para ello se aplicó un lavado con agua corriente para retirar exceso de tierra, luego se envolvieron con papel periódico húmedo para evitar deshidratación de tejidos durante el transcurso de su transporte al laboratorio. En el laboratorio se lavaron con agua y jabón corriente para retirar los residuos de suelo, se realizaron cortes para retirar hojas y dejar sólo las yemas apicales o ápices con una parte del callo de la planta. En un vaso de precipitados se colocaron los ápices y se agregó agua destilada, Nitrasan® y jabón líquido. Se agitaron durante 5 min, se repitió una vez este último paso. A continuación los meristemos se transfirieron a una solución antioxidante (150 mg/L de ácido cítrico + 150 mg/L de ácido ascórbico + 150 mg/L de PVP) y se aplicó vacío durante 5 min. En campana de f lujo laminar y con instrumental estéril se realizó un lavado con etanol al 70% durante 30 segundos. Las yemas se colocaron en una solución de hipoclorito de sodio (cloralex®) al 10% durante 20 min; después se realizaron 3 enjuagues con agua destilada estéril. Las yemas se mantuvieron en agua destilada estéril hasta el momento de su disección con el auxilio de microscopio estereoscópico. Por último, las yemas se colocaron en cajas de petri estériles para aislar los meristemos de 1 mm, con ayuda de un bisturí, pinzas y microscopio hacer la extracción del meristemo. Los meristemos se incubaron en el medio de cultivo MS adicionado con 0.5 mg/L de BA. y en medio de cultivo MS suplementado con antioxidantes (150 mg/L de ácido cítrico + 150 mg/L de ácido ascórbico + 2 ml/L de PPM).

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Multiplicación Esta etapa se efectuó un mes después de la siembra, al segundo mes se hizo un nuevo subcultivo para determinar el promedio de generación de brotes en cada variedad de fresa. Para ello se colocó el brote en una placa Petri estéril y dentro de campana de flujo laminar. Con ayuda de un bisturí y unas pinzas estériles se realizaron los cortes para obtener brotes por separado; una vez hechos los cortes, se plantaron en medio de cultivo MS suplementado con 0.5 mg/L de la citocinina Bencil Aminopurina (BA) para la generación de más brotes.

Enraizamiento Brotes de dos o más cm de longitud se sometieron al proceso de enraizamiento. Para lo anterior se usó el medio de cultivo MS sin Reguladores de Crecimiento Vegetal, ya que se considera una planta con buena generación de raíz.

Aclimatación Se contemplaron 20 vitroplantas de cada variedad con un sistema radicar bien desarrollado. Una vez que las plantas in vitro tuvieron abundante raíz, se extrajeron de los frascos y se colocaron en un recipiente con agua, se sumergen un poco y se dejan en ese ambiente durante una hora. Después de estar en agua durante el tiempo señalado se comenzó a lavar la raíz hasta retirar completamente el medio de cultivo; se colocaron las plantas en una base plástica y a continuación se colocaron en agua como un sistema hidropónico; se cambió el agua diariamente para evitar contaminación; después de 15 días de estar flotando en agua se retiraron las plantas y se plantaron en contenedor, se usó como sustra-

to una mezcla de lombricomposta y agrolita en una proporción de 1:1. Los contenedores con las plantas se colocaron en media sombra y regaron diariamente, (los primeros tres días se regaron 2 veces/ día). La aclimatación de fresa debe realizarse en el mes de diciembre, ya que se obtiene una mejor respuesta de las plantas.

Resultados y discusión El índice de viabilidad de meristemos fue del 50% del total aislados y sembrados (figura 1a); se presentó sólo un 2% de contaminación por bacterias. La metodología permitió alcanzar mejores resultados en comparación a los consultados. La formación de nuevos brotes se efectuó al mes de iniciada la siembra (figura 1b). El medio nutritivo MS suplementado con 0.5 mg/L de BA se considera adecuado para la respuesta de meristemos, así como una rápida proliferación de brotes. En la etapa de inducción de brotación múltiple se manifestaron datos muy diversos en cada una de las variedades de planta de fresa. Esta actividad se hizo durante tres generaciones, se obtuvieron resultados diferentes en cada subcultivo para la variedad. Para la variedad Portola se halló un promedio por generación de 4 brotes en el primer mes y en el segundo 14; para Camino Real, un promedio de 8 brotes en el primer mes y 9 en el segundo; para Albión, un promedio de 3 brotes en el primer mes y 5 en el segundo mes. El medio MS resultó adecuado para la formación de raíz (figura 1c), ya que según algunos autores no es necesario el uso de Reguladores de Crecimiento Vegetal en esa etapa. La formación de raíz se percibió a los 8 días después de estar en el medio, se generó abundante raíz a los 40 días. La metodología para aclimatar fue la adecuada. El sistema hidropónico resultó conveniente

Cultivo de tejidos vegetales

para adaptar las plantas de una forma más rápida y sin estrés por la pérdida de humedad y ataque de patógenos al usar lombricomposta; se logró un 90% de respuesta favorable con una abundante formación de raíz a los 30 días de estar en contenedor, en el sustrato preparado con lombricomposta y agrolita, ambos al 50%. (figura 1d).Tal resultado se considera bastante aceptable.

Figura 1a. Meristemos de Fragraria ananassa, considerado para el establecimiento del cultivo in vitro. 1b. Proliferación de brotes inducidos en la etapa de multiplicación en el primer mes. 1c. Vitroplanta de Fragraria ananassa enraizada para ser transferida a la etapa de aclimatación. 1d. Planta de Fragraria ananassa producida in vitro, aclimatada.

Bibliografía Agralanzarote servicios insular agrario (2012). Ficha técnica de cultivo de fresa. Castillo, Alicia. Propagación de plantas por cultivo in vitro: una biotecnología que nos acompaña hace mucho tiempo, primera edición, Pp: 47–50. Castro, F.J. y Dávalos, G. (1990). Etiología de la “secadera” o pudrición de la raíz y corona de la fresa en Irapuato, Gto. Revista Mexicana de Fitopatología, 8(1):80–86.

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Efecto de antioxidantes

en la inducción de callo embriogénico en dos genotipos de caña de azúcar (Saccharum officinarum)

Marco Tulio Buenrostro Nava, Nicxi Liliana Adame Gómez, Salvador Guzmán González, Juan Alberto Osuna Castro, Gilberto Manzo Sánchez Facultad de Ciencias Biológicas y Agropecuarias Universidad de Colima

correo–e: mbuenrostro0@ucol.mx

Resumen La propagación convencional de la caña de azúcar (Saccharum officinarum) ha sido larga y tediosa, lo que puede llevar hasta diez años. Por eso la propagación in vitro es de gran importancia, ya que es posible obtener plantas libres de patógenos y propagación masiva. En objetivo del presente trabajo fue valuar diferentes tipos de antioxidantes tales como nitrato de plata, ácido ascórbico y cisteína, sobre la inducción de callo de las variedades CP722086 y MEX69290 de caña de azúcar a una concentración de 5 mg·L–1. No se pudo establecer una correlación entre el uso de antioxidantes y la presencia de microorganismos contaminantes en el medio de cultivo; sin embargo, se determinó una mayor contaminación en la variedad CP72 y mayor oxidación en la variedad 290. Se comprobó que los medios adicionados con cisteína y ácido ascórbico favorecen la formación de callo embriogénico en ambas variedades, mientras que el uso de nitrato de plata tiene un efecto inhibitorio en la inducción de callo embriogénico para las variedades CP72 y 290. Palabras clave: Caña de azúcar, Saccharum officinarum, callo embriogénico.

Cultivo de tejidos vegetales

Introducción

Metodología

La caña de azúcar (Saccharum spp.) se cultiva en más de cien países en condiciones templadas, subtropicales y tropicales. A nivel mundial se producen 1,450 millones de toneladas de azúcar proveniente de 22 millones de hectáreas (FAO, 2007). El desarrollo de nuevas variedades mediante mejoramiento genético convencional ha permitido aumentar la producción de sacarosa; no obstante, enfrenta desafíos como el tiempo promedio de diez años que se requieren para generar una variedad (Alejandre, et al., 2010). Debido a la importancia económica que representa la caña de azúcar a nivel mundial, se han mejorado algunas de sus características agronómicas a través de la ingeniería genética: tolerancia a virus, resistencia a insectos y resistencia a enfermedades causadas por hongos, resistencia a herbicidas, mejora de la calidad de la fibra y el uso de plantas de caña de azúcar como biorreactores (Alejandre et al., 1998). La eficiencia de inducción de embriones somáticos y de transformación también es limitada por la formación de fenoles y la oxidación de los tejidos, como respuesta al estrés mecánico producido al momento del establecimiento del cultivo de tejidos in vitro, o como respuesta hipersensitiva a la presencia de Agrobacterium spp.; esos son dos de los factores que reducen de forma notable la eficiencia de inducción de callo y de transformación, respectivamente. Con el propósito de reducir la oxidación de los tejidos en los cultivos in vitro, se ha reportado el uso de antioxidantes como ascorbato de sodio, ácido ascórbico, cisteína, ditiotreitol (DTT), glutatión y tocoferol en dicotiledóneas; también se utilizaron con éxito en especies de plantas monocotiledóneas (Khanam et al., 2007).

Se emplearon ápices de caña de azúcar de las variedades CP722086 (CP72) y MEX69290 (290) del INIFAP campus Tecomán. De los ápices se obtuvieron discos de la región de meristemo apical y se desinfectaron con Clorox® 20% (v/v) y Tween® 20 al 0.002% (v/v) por 20 min. Luego se procedió a exponer una región de 1.5 a 2 cm de largo del meristemo apical. Se realizaron cortes transversales de 2 mm de grosor siguiendo metodología reportada (Zúñiga, 2012), y se colocaron en frascos tipo Gerber® con medio MS (Murashige y Skoog, 1962), mio–inositol 100 mg·L–1, tiamina 1 mg·L–1, caseína hidrolizada 500 mg·L–1, 2,4 –D 5 mg·L–1, sacarosa 30 g·L–1, PhytagelTM 3 g·L–1 y un pH de 5.7 (MIC1). Los tratamientos consistieron de medio MIC1 adicionados con AgNO3 (MIC2), ácido ascórbico (MIC3) o cisteína (MIC4) a una concentración de 5 mg·L–1. Los explantes fueron incubados a 25 ± 2 °C bajo condiciones de oscuridad. Se evaluó la presencia o ausencia de contaminantes de 0 –36 días después del establecimiento, porcentaje de oxidación y la eficiencia de formación de callo embriogénico. Los datos fueron transformados mediante la √x + 1 (7 Steel et al., 1996) y sometidos a análisis estadístico (SAS, 1998).

Resultados y discusión Se observó que no hay diferencias significativas en la adición de antioxidantes sobre la incidencia de contaminantes por microorganismos en los explantes a los 8, 15 y 36 días después de iniciado el experimento (tabla 1). A partir de los 29 días ocurrió un 10% de oxidación en el medio sin antioxidantes, donde el porcentaje de oxidación fue mayor (16%) para el medio sin antioxidantes seguido por el medio adicionado con nitrato de plata (10%) para la va-

Biotecnología y agricultura sustentable. III Simposio Nacional

Tabla 1 Efecto de antioxidantes sobre la contaminación y oxidación de explantes de caña de azúcar bajo condiciones in vitro Días después de establecido el experimento Gen Trat1

% de oxidación

% de contaminación2 8

290

MIC1

4ab

16a

290

MIC2

10ab

290

MIC3

12a

4ab

290

MIC4

4ab

Cp72

MIC1

22ª

58ª

2ab

10a

Cp72

MIC2

8ab

60ª

6ab

Cp72

MIC3

4ab

Cp72

MIC4

6ab

P trat

0.05

0.049

0.0001

0.75

0.019

0.69

C.V. (%)

11.85

18.41

20.36

8.70

16.96

17.24

Trat = tratamiento; MIC1= MS; MIC2= MS + AgNO3; MIC3= MS+ ácido ascórbico; MIC4=MS + Cisteína. 2Cada valor representa la media de diez repeticiones, donde n = 50. Para el análisis de datos los porcentajes fueron transformados mediante √x + 1. Valores promedio seguidos por letras diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos (Tukey 0.05). 1

En la formación de callo embriogénico hubo comportamientos diferentes entre los genotipos, pues para la variedad 290 se observó formación de callo (14%) en los tratamientos sin antioxidantes y ácido ascórbico. En el medio adicionado con nitrato de plata no se percibió la formación de callo embriogénico para ambas variedades. Los tratamientos con ácido ascórbico y cisteína favorecieron la formación de callo en un 16 y 22% en la variedad CP72 (figura 1). Esas divergencias podrían asociarse con las

características fisiológicas de cada variedad, ya que la CP72 es considerada una variedad temprana, mientras que la 290 es intermedia. Esta respuesta dependiente de la fenología del tejido coincide con reportes previos donde se indica que la mayor eficiencia en la formación de callo embriogénico se obtiene cuando los meristemos vegetativos se encuentran en proceso de diferenciación f loral (Yinghui, 2008). % Inducción de callo

riedad 290. Para la variedad CP72 no se observó efecto de los antioxidantes con respecto al control.

30 25

20 15 10 5 0

Var. 290

Var. CP72

Figura 1. Efecto de antioxidantes. 1= MS; 2= MS + AgNO3; 3= MS + ácido ascórbico; 4= MS + Cisteína. Cada barra representa la media de al menos cinco repeticiones y las líneas representan ± el error estándar.

Es posible que tales desemejanzas se relacionen también con las condiciones de campo, ya que a pesar de que provienen del mismo lote y reciben el mismo manejo agronómico, su asociación con microorganismos endófitos puede ser distinta. La presencia de microorganismos endófitos en los explantes se manifestó 29 días después de establecido el cultivo, a diferencia que cuando el proceso de desinfección es ineficiente y se observa durante las primeras dos semanas (Azofeifa, 2009). La adición de antioxidantes al medio de cultivo de tejidos vegetales in vitro ha sido eficaz en la prevención de oxidación; se logró un incremento en la eficiencia de regeneración de brotes sanos (Martínez et al., 2012). En el medio adicionado con 5 mg·L–1 de nitrato de plata se obtuvo un necrosamiento total del tejido vegetal, sin embargo, una baja concentración de nitrato

Cultivo de tejidos vegetales

de plata (1.2 mg·L–1) favoreció la embriogénesis somática en el cultivo de caña de azúcar (Nieves et al., 2007); por lo anterior se deduce que una concentración alta de nitrato de plata causa toxicidad en el tejido vegetal. Estudios similares han demostrado que el uso de nitrato de plata ayudaría a la inducción de brotes. No obstante, éste puede tener efectos negativos en la inducción de callo, donde se notó una reducción de hasta 86% al usar una concentración de 2 mg·L–1 en cultivo in vitro de ajenjo dulce (Artemisia annua L.) (Lei et al., 2013). El uso de ácido ascórbico como antioxidante, adicionado al medio de cultivo en una concentración de 10 mg·L–1 y 30 mg·L–1 con agua de coco (5% v/v), fue fundamental para la regeneración en los genotipos de sorgo (Martínez et al., 2012). La adición de cisteína (200 mg·L–1) o nitrato de plata (20 mg·L–1) mejoraron la máxima recuperación de plántulas de garbanzo in vitro después de la agro–inoculación (Snyman et al., 2006); del mismo modo, una concentración de cisteína (50 mg·L–1) en el medio de crecimiento reduce explantes necrosados en el cultivo de tejidos de banano (Strosse et al., 2004). La inducción de callo y su continuo crecimiento depende de factores como las condiciones de cultivo, genotipo, estado fisiológico del explante, combinación y niveles de reguladores de crecimiento en el medio de cultivo, así como las condiciones ambientales en las que se mantienen los cultivos (Lagunes et al., 2009).

Conclusiones El uso de ácido ascórbico y cisteína favoreció la inducción de callo embriogénico para la variedad CP72 de caña de azúcar, mientras que para la variedad 290 no tuvo un efecto positivo. El empleo de nitrato de plata a una concentración de 5 mg·L–1 tiene un efecto inhibitorio en

la inducción de callo embriogénico para las variedades CP72 y 290. Para posteriores trabajos se recomienda estudiar el efecto de nitrato de plata, acido ascórbico y cisteína en diferentes dosis, para así poder determinar sus posibles efectos.

Agradecimientos A Arturo Vizcaíno Guardado y Marco Antonio Vizcaíno del INIFAP–Tecomán por su asesoría y proveer el material vegetal.

Bibliografía Alejandre, R.J.A., Galindo, T.M.E, Espinosa, L.H.E, Alvarado, G.O.G. (2010). Variabilidad genética en 22 variedades híbridas de caña de azúcar (Saccharum spp. Híbrido) Revista Internacional de BOTÁNICA Experimental, 79:87–94. Arencibie, D.A., Carmona, R.E., Tellez, P., Chan, M.T., Su May Yu, Trujillo, E.L. y Oramas, P. (1998). An efficient protocol for sugarcane (Saccharum spp. L.) transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens. Transgenic Research, 7:1–10. FAO (2007). Perspectivas agroalimentarias. http:// www.fao.org/docrep/ 010 /ah 876 s/ah 876 s 07 .htm (Consultada el 04/10/13). Khanam, J., Begum, M., Ara, J., Jesmin, M., Taher, M., Ali, S. (2007). Antimicrobial Activity of Metal Cystine Complexes. Dhaka University. Journal of Pharmaceutical Sciences, 5:29–32. Murashige, T. y Skoog, F. (1962). A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum, 15:473–497. SAS (1998). Institute Inc. SAS/STAT user guide. Release 6.03 SAS. Instit., Copy, N.C. Steel, R.G., Torrie, J.H., Dickey, D.A. (1996). Principles and Procedures of Statistics: A Biometrical Approach. 3rd edition. New York, McGraw–Hill Co. Inc. 666 pp.

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Antagonismo de Trichoderma spp. sobre Alternaria porri y en la inducción de la

actividad enzimática en cebolla Valeria Camacho–Luna, Gabriela Sepúlveda–Jiménez, Roberto Montes–Belmont

Centro de Desarrollo en Productos Bióticos Instituto Politécnico Nacional

correo–e: valeria.chanuk5@gmail.com

Resumen La actividad antagónica de Trichoderma asperellum, T. harzianum y T. atroviridae contra Alternaria porri mediante confrontaciones por cultivos duales indicó que las tres especies de Trichoderma inhiben el crecimiento micelial y muestran actividad micoparasítica de A. porri. De todas las cepas evaluadas destaca T. asperellum TC3, proveniente del propio cultivo de cebolla. La inoculación con sólo T. asperellum TC3 en plantas de cebolla aumentó la actividad de glucanasas y quitinasas, pero se reprime en presencia de A. porri. Por el contrario, la inoculación tanto con T. asperellum TC3 y A. porri aumentó la actividad de peroxidasas. Palabras clave: micoparasitismo, glucanasa, quitinasa, peroxidasa.

Cultivo de tejidos vegetales

Introducción La cebolla es una hortaliza con un mayor volumen de mercado a nivel mundial y México destaca como el primer país exportador latinoamericano del producto (Madhavi et al., 2012). Entre los hongos patógenos foliares de la cebolla se encuentra Alternaria porri, que ocasiona la enfermedad “Mancha púrpura de la cebolla” que afecta hojas, tallos y bulbos. Los síntomas comienzan con lesiones en las hojas de forma elíptica y de color entre amarillo y café; después, conforme el hongo se desarrolla, las lesiones se tornan a un color rojizo–púrpura. Cuando la infección es fuerte, la planta pierde el follaje y en el bulbo se ocasiona una putrefacción semiacuosa, lo que provoca pérdidas del cultivo (Ortiz–Martínez et al., 2013). En la actualidad, los tratamientos contra A. porri son mediante fungicidas, pero en algunos casos el patógeno genera resistencia hacia ellos. Asimismo, los fungicidas no son específicos y afectan las poblaciones de hongos benéficos del suelo, además, son tóxicos para otros organismos. Debido a lo anterior, el empleo de microorganismos antagónicos de fitopatógenos como Trichoderma podría ser una alternativa viable de control biológico (Verma et al., 2007). Los mecanismos por los que actúan Trichoderma directamente contra el patógeno son: competencia, mico–parasitismo y antibiosis. A la vez establece una relación con las raíces de las plantas, lo cual promueve el desarrollo de la planta e induce su resistencia a través de la activación de enzimas implicadas en la defensa vegetal, glucanasas, quitinasas y peroxidasas (Rodríguez, 2014). En condiciones in vitro, las cepas de T. viridae, T. harzianum y T. pseudokoningii inhiben el crecimiento micelial de A. porri en un 71, 61 y 51% respectivamente (Imtiaj y Lee, 2008). La aplicación in situ de T. harzianum reduce la incidencia

y la severidad de la mancha púrpura de la cebolla en un 56.3 y 71.7% respectivamente (Abo–Elyousr et al., 2014). Sin embargo, su actividad antagónica podría variar por las condiciones ambientales y entre una misma especie. En este trabajo se evaluó la actividad antagónica y parasítica de cepas de T. asperellum obtenidas del mismo cultivo de cebolla y de T. harzianum y T. atroviridae, aisladas de la rizósfera de Macadamia. También se evaluó el efecto de la aplicación de Trichoderma en la inducción de la actividad de enzimas relacionadas con la defensa (glucanasas, quitinasas, peroxidasa y catalasa) en la interacción Trichoderma–A. porri –cebolla.

Metodología Organismos Los aislamientos de Trichoderma se obtuvieron de las raíces de cebolla, suelo y raíces de Macadamia y se identificaron morfológicamente. El patógeno se halló a partir de hojas de cebolla infectadas con A. porri.

Cultivo dual En cada caja de Petri con medio CDM se colocó un disco de micelio con Trichoderma y otro con A. porri separados por 6 cm. Los controles sólo se inocularon con A. porri. La actividad antagónica se evaluó con la escala de Alías y Arcos (1984) y por el porcentaje de inhibición del crecimiento micelial (PICM) del patógeno (El–Katatny et al., 2001).

Antibiosis Las cajas Petri con medio CDM se cubrieron con papel celofán estéril. Cada caja se inoculó en el centro con discos de micelio de cada aislamiento

Biotecnología y agricultura sustentable. III Simposio Nacional

de Trichoderma. Las cajas se incubaron a temperatura ambiente por 3 días, se retiró el papel celofán y se colocó un disco de micelio de A. porri en el centro de la caja. El control únicamente se inoculó con micelio del patógeno. Las cajas se incubaron hasta que el micelio de A. porri del control cubrió la totalidad de la caja. El PICM se determinó con base en la diferencia que se obtuvo entre el crecimiento del patógeno confrontado con Trichoderma y el crecimiento del patógeno sin antagonista.

Micoparasitismo Se realizó la técnica de Ridell (El–Katatny et al., 2001). Dentro de una caja de petri se colocó una varilla de vidrio en forma de “V” y sobre ella un portaobjetos que contiene dos discos de PDA, uno con A. porri y otro con Trichoderma. Las preparaciones se observaron con un microscopio óptico.

Manejo de plantas Cebollas de la variedad Cristal White se inocularon con una solución de esporas de T. asperellum al momento de la siembra, en el trasplante y al tercer mes después de la siembra. Las plantas se inocularon con A. porri mediante discos de micelio sobre las hojas. A las 96h post inoculación del patógeno se colectaron las hojas infectadas y se congelaron con nitrógeno líquido.

Actividad de enzimas La determinación de actividad de glucanasas y quitinasas se efectuó con la metodología propuesta por El–Katatny et al. (2001). Para la actividad de quitinasas se usó como sustrato laminarina y para glucanasas quitina coloidal. La evaluación de los azúcares reductores liberados por la actividad de cada enzima se determinó por la reacción

con ácido dinitrosalicílico (DNS). La actividad de peroxidasas se evaluó de acuerdo con Stasolla y Yeung (2010), la actividad de catalasas se evaluó midiendo el decremento de H2O2 según Beers y Sizer (1952).

Resultados y discusión Confrontación y antibiosis Los tres aislamientos de T. asperellum y T. atroviridae inhibieron el crecimiento micelial de A. porri (tabla 1), pero la cepa de T. asperellum TC3 inhibió en un 56% en crecimiento del patógeno. El efecto antagonista de T. harzianum concuerda con lo reportado por Imtiaj y Lee (2008) y Abo– Elyousr et al. (2014), quienes reportan que esa especie inhibe el crecimiento micelial de A. porri en un 61.9 y 73.12% respectivamente. Dennis y Webster (1971) demostraron que Trichoderma produce diversos compuestos con actividad antimicrobiana y que la producción y actividad varía dependiendo la cepa. El PICM por antibiosis (tabla 1) fue diferente para cada aislamiento, donde TC3 nuevamente destacó porque presentó un PICM de 54%. Debido a lo expuesto, la cepa se aplicó en la planta y se evaluó la actividad de enzimas.

Micoparasitismo Todos los aislamientos de Trichoderma mostraron actividad de parasitismo de A. porri, ello concuerda con lo reportado por Abo–Elyousr et al. (2014).

Cultivo de tejidos vegetales

Tabla 1 Porcentaje de inhibición del crecimiento de A. porri en confrontación con Trichoderma

las hojas de las plantas tratadas con sólo A. porri, con T. asperellum, y las no inoculadas en comparación con las plantas que se inocularon tanto con A. porri como con T. asperellum. El aumento de la actividad de peroxidasas en presencia de A. porri puede indicar que es una enzima implicada en la respuesta al daño causado por el ataque de A. porri.

Conclusiones

En el proceso de parasitismo se observaron los mismos eventos reportados por Elad y Chet (1983), que comprenden: el contacto donde tiene lugar el reconocimiento del micelio del patógeno por Trichoderma, luego la invasión donde Trichoderma rodea el micelio de A. porri para después penetrarlo, invadirlo y finalmente destruirlo.

Actividad de enzimas Las quitinasas y glucanasas son enzimas que degradan la pared celular del patógeno. Las plantas inoculadas con sólo T. asperellum presentaron la mayor actividad de quitinasas y glucanasas seguidas de las plantas no inoculadas. Ello concuerda con Guzmán–Valle et al. (2013), que reportaron el aumento de las enzimas tanto para hojas, raíz y bulbo; mientras que las plantas inoculadas con sólo A. porri y con los dos microorganismos (T. asperellum–A. porri) mostraron una disminución de la actividad de quitinasas y glucanasas con respecto a los otros tratamientos. La menor actividad de catalasas se observó en plantas inoculadas con ambos organismos (T. asperellum–A. Porri) en comparación con las plantas no inoculadas y las inoculadas con sólo T. asperellum y A. porri. Por el contrario, se halló que la mayor actividad de peroxidasa la tuvieron

Las cepas de T. asperellum aisladas de cultivo de cebolla muestran diferente actividad antagónica por antibiosis y parasitismo contra A. porri, destaca la cepa de T. asperellum TC3. La aplicación de T. asperellum TC3 también induce la actividad de glucanasas y quitinasas en hojas de cebolla, pero es reprimida por la presencia del patógeno. Por el contrario, la enzima peroxidasa podría ser una enzima implicada en la respuesta al daño causado por el ataque de A. porri.

Agradecimientos El trabajo se realizó con el apoyo de la SIP (proyecto 20141213) del Instituto Politécnico Nacional.

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Biotecnología y agricultura sustentable. III Simposio Nacional

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Crecimiento y desarrollo de vitroplantas de Saccharum officinarum inoculadas con Rhizophagus intraradices Enrique Alarcón–Gutiérrez, Miriam Calzada–Méndez, YareniPerroni, Lourdes Iglesias y Jericó Bello B.

Instituto de Biotecnología y Ecología Aplicada (INBIOTECA), Universidad Veracruzana

correo–e: enalarcon@uv.mx, yperroni@uv.mx, calzada_miriam@hotmail.com

Resumen La aplicación de inoculantes microbianos en la agricultura constituye una alternativa promisoria a los fertilizantes químicos debido a la tendencia actual hacia un incremento en las dosis aplicadas de éstos. El uso de biofertilizantes, componentes vitales de los sistemas sustentables, puede contribuir en la reducción de insumos y mejorar la cantidad y calidad de las plantas. Los microorganismos más empleados son hongos micorrízicos arbusculares (HMA), implicados en el reciclaje de nutrimentos importantes para la nutrición vegetal como el nitrógeno (N) y el fósforo (P), vitales y no sustituibles en los sistemas biológicos. La inoculación de los HMA se puede realizar en plántulas micropropagadas. Una etapa importante después de la micropropagación es la fase de aclimatación o endurecimiento, durante este proceso la planta va adaptando su estructura y fisiología; lo más importante es que las plantas formen un completo sistema radicular, lo cual le permitirá soportar el estrés al ser trasplantadas en campo. El objetivo de este trabajo fue determinar, bajo condiciones de invernadero, el efecto de la inoculación de Rhizophagus intraradices en la sobrevivencia, crecimiento y desarrollo de vitroplántulas de Saccharum officinarum (caña de azúcar). Se utilizaron vitroplantas de caña de azúcar de la variedad Mex– 69 –290, sembradas en una mezcla de sustratos estériles de musgo turboso (60%), agrolita (20%) y suelo fluvisol (20%); además, se aplicó 5 g/plántula de la cepa R. intraradices. Se usó un diseño en bloques completamente al azar, con 48 réplicas por cada tratamiento. Los tratamientos que se consideraron fueron: 1) Mezcla de sustratos estériles; 2) Mezcla de sustratos más inóculo (5 g/plántula), ambos estériles, y 3) Mezcla de sustratos estériles + inóculo (5 g/plántula) sin esterilizar. Las variables evaluadas fueron supervivencia, altura de la planta, diámetro del tallo, número de brotes, biomasa seca de raíz y follaje, longitud de raíz y porcentaje de colonización de HMA, parámetros que se midieron cada 30 días durante 120 días. De acuerdo a los resultados preliminares no se obtuvieron diferencias significativas (P>0.05) en diámetro del tallo y altura de la plántula. Se observó que después de los 60 días el tratamiento con inóculo tuvo un efecto positivo en el crecimiento y desarrollo de las plántulas de caña de azúcar, esto se vio reflejado en el desarrollo de brotes en las plántulas. Más brotes en las plántulas representaría más biomasa en campo y, posiblemente, mejor rendimiento de azúcar obtenido. Palabras clave: micropropagación, aclimatación, biofertilizacion, caña de azúcar, Rhizophagus intraradices.

Cultivo de tejidos vegetales

Introduccio´ n La caña de azúcar (Saccharum officinarum L.) es una especie originaria de la India, China, Nueva Guinea y zonas inmediatas, por tener ahí el mayor número de especies (Subirós, 1995). Su cultivo en México es importante, ya que de él se obtiene principalmente sacarosa, que puede ser utilizado como fuente de materia prima para productos derivados como la cachaza, jugos del proceso de producción de azúcar para la obtención de etanol, y los derivados a partir del bagazo (SIAP, 2012). De acuerdo a la FAO (2012), en el 2012 México ocupó el sexto lugar a nivel mundial en producción de caña de azúcar, después de Brasil, India, China, Tailandia y Pakistán. Sin embargo, muchos factores han afectado la producción de la caña de azúcar, uno de ellos es el deterioro de las variedades con el transcurso de los años; con el tiempo entran en periodo de agotamiento que obliga a productores a buscar sustitutos. De esta forma, las variedades declinan y por diferentes causas van perdiendo su poder productivo (Flores, 2001). Otro factor es el uso de dosis cada vez mayores de fertilizantes químicos (Chirinos et al., 2006). A lo largo de dos siglos se han desarrollado técnicas tradicionales para propagar la caña de azúcar; sin embargo, actualmente se están dejando atrás las técnicas vegetativas convencionales y se han implementado nuevas técnicas por medio del cultivo de tejidos, como la micropropagación que es considerada un método rápido y adecuado para la multiplicación de varios cultivos, incluyendo la caña de azúcar (George et al., 2007). Debido al actual proceso de producción de caña de azúcar, es importante considerar alternativas que amorticen la pérdida en la producción del cultivo; la aplicación de biofertilizantes, mediante la utilización de microorganismos como los hongos micorrízicos arbusculares (HMA), constituye

un medio económicamente atractivo y ecológicamente aceptable para reducir los insumos externos mejorando la cantidad y calidad de los recursos internos (Chirinos et al., 2006). Estos inoculantes microbianos en la agricultura constituyen una alternativa promisoria. Los HMA, implicados en el reciclaje de nutrientes como el nitrógeno y el fósforo (Ferrera–Cerrato y Alarcón, 2000), son vitales para la nutrición vegetal y no sustituibles en los sistemas biológicos (Bifani, 2007). Fundamentado en lo anterior, el objetivo de este trabajo fue determinar, bajo condiciones de invernadero, el efecto de la inoculación de Rhizophagus intraradices en la supervivencia, crecimiento y desarrollo en vitroplantas de Saccharum officinarum de la variedad Mex 69 –290.

Metodolog´a Etapa de micropropagación de la caña de azúcar Para el establecimiento in vitro se tomaron meristemos apicales (0.5 – 0.8 mm de diámetro) de caña de azúcar (Saccharum sp.) var. MEX– 69 –290. Éstos fueron cultivados en medio semisólido MS (Murashige y Skoog, 1962) suplementado con 0.2 mg L –1 de benziladenina (BA), como agente gelificante se utilizó 0.22 % (w/v) de Gelrite™ (Sigma®), siguiendo la metodología propuesta por Jiménez et al. (1995). Después se llevó a fase de enraizamiento en medio semisólido (MS) suplementado con 3 mg L –1 de ácido indolacético (AIA).

Etapa de aclimatación Una vez que las plántulas desarrollaron su sistema radicular en aproximadamente 60 días, éstas se trasplantaron en charolas y se mantuvieron en invernadero para su aclimatación. Los brotes enraizados con una altura de ≈7 cm in vitro fueron

Biotecnología y agricultura sustentable. III Simposio Nacional

enjuagados repetidas veces con agua corriente para eliminar restos de medio de cultivo. Los brotes enraizados fueron plantados en una mezcla de sustrato estéril compuesto de musgo turboso (60%), agrolita (20%) y suelo fluvisol (20%) en charolas plásticas de 49 cavidades. Se realizó un experimento en bloques completamente al azar, en donde un factor: incidencia de luz en el invernadero, se bloqueó. Y, el efecto de las plantas inoculadas (con 48 réplicas por cada tratamiento), fue el factor principal a evaluar. Se usaron tres tratamientos de los cuales dos se clasifican como controles: el control negativo consistió en suelo estéril (el suelo usado en el experimento se esterilizó tres veces du–rante 15 min en autoclave a 1.5 Kg·cm–2 de presión a 121 °C con intervalos de descanso de 24h) sin inóculo; el control positivo consistió en la mezcla de sustrato estéril, inoculada con los 5 g de inóculo de HMA y esterilizado tres veces (de la forma ya señalada). El objetivo de adicionar un control positivo fue para verificar el efecto sólo del inóculo, ya que el inóculo propagado era una mezcla de arena y raíces; y el tercer tratamiento consistió en la mezcla del sustrato estéril más 5 g del inóculo de R. Intraradices. Todas las muestras (48 x 3) fueron distribuidas en el diseño en bloques y colocadas en invernadero (temperatura entre 25 – 30ºC, humedad relativa entre 50 – 60 % y sombra del 50%). Se realizaron riegos con agua corriente tres veces por semana. Cada 30 días, y durante 120 días, se tomaron 5 muestras al azar por tratamiento, de las cuales se evaluó: diámetro del tallo, altura de la planta, numero de brotes, biomasa seca y fresca (follaje y raíz), sobrevivencia, longitud de raíz y porcentaje de colonización de raíces. La colonización de la raíz se determinó mediante la técnica de clareo y tinción de raíces micorrizadas de acuerdo a Phillips y Hayman (1970) y el porcentaje de colonización se evaluó por la técnica de Trouvelot et al. (1986).

Resultados y discusio´ n El control total (negativo), que contiene solo los sustratos esterilizados, a los 30 días registró el mejor porcentaje de sobrevivencia en comparación con el tratamiento con inoculo; sin embargo, el tratamiento con inoculo estéril (control positivo) registró el menor porcentaje de sobrevivencia. Los tratamientos mantuvieron los mismos porcentajes de sobrevivencia a los 30 y 120 días (tabla 1). El diámetro no mostró diferencias significativas (P>0.05), se observó que las plantas al momento de trasplantarse no tuvieron el mismo diámetro en comparación con el control negativo ya que este tratamiento tuvo un diámetro al momento del transplante (tabla 2). No obstante, después de los 60 días de crecimiento el tratamiento inoculado con la cepa de R. intraradices tuvo un mejor desarrollo en comparación con el control (positivo y negativo) (fig. 1). Esto contrasta con lo mencionado por Soria et al. (2001), quién indica que los HMA generan un mejor efecto en plantas que muestran algún deterioro o no están bien desarrolladas. Tabla 1 Porcentaje de sobrevivencia de S. officinarum a los 30 y 120 días Tratamiento

Sobrevivencia (%) 30

días

120

días

Control negativo

Control positivo

Inóculo

Para la altura de la planta, no se obtuvieron diferencias significativas, de acuerdo a las medias en los primeros 30 días el control tuvo un mejor desarrollo; sobresaliendo las plantas con 1 cm más de altura en comparación con las inoculadas

Cultivo de tejidos vegetales

Tabla 2 Diámetro del tallo de S. officinarum Diámetro del tallo (cm) Tiempo (días)

Tratamiento Inóculo Control negativo Control positivo

120

0.09±0.03

0.13±0.03

0.21±0.04

0.24±0.03

0.09±0.03

0.13±0.03

0.2±0.03

0.21±0.03

0.22±0.03

0.11±0.00

0.15±0.03

0.2±0.03

0.22±0.03

0.23±0.03

(tabla 3). Sin embargo, después de este periodo el tratamiento con R. intraradices mostró un mejor crecimiento continuo, adverso al tratamiento control, que registró un deterioro en su crecimiento; manteniendo una altura de 35 cm en los últimos 60 días de experimento (fig. 2).

Tabla 3 Altura de S.officinarum Altura (cm) Tiempo (días)

Tratamiento Control negativo

Control positivo

Inóculo

7±0.00

23.3±5.96

20.7±6.06

22.2±7.47

36.9±6.61

34.4±6.74

38.1±6.69

35.5±5.16

34.4±5.72

38.8±5.94

120

35.0±4.75

33.9±5.45

39.1±5.72

Figura 1. Diámetro del tallo de S. officinarum

De acuerdo a lo mostrado, estas variables de crecimiento y desarrollo concuerdan conun estudio realizado en cultivo de banano por Usugaet al., (2008), ellos mencionan que la inoculación ex vitro en plantas micropropagadas de banano no mostraron diferencias significativas al inocular HMA, esto indica que las plántulas cuando salen del laboratorio cuentan ya con un sistema radical suficientemente desarrollado para facilitar una asociación adecuada.

Figura 2. Altura de S.officinarum

Los resultados experimentales permiten destacar el tratamiento inoculado con R. intraradices. Se observa un efecto positivo de los HMA en cuanto al número de brotes, ya que después de 30 días este tratamiento mostró mejor desarrollo mostró un mejor desarrollo de brotes hasta los 120

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días, y no mayor a las plantas inoculadas (tabla 4). Cabe destacar que el tratamiento con el inóculo rindió tres veces más de número de brotes en comparación con las plantas control (fig. 3). Resultados similares obtuvieron Roveda et al. (2007), en plantas micropropagadas de mora, puesto que obtuvieron un constante desarrollo de brotes en plantas inoculadas con HMA. Tabla 4 Número de brotes de S. officinarum Número de brotes Tratamientos

días

30 días

60 días

90 días

120

días

Control negativo

Control positivo

Inóculo

Figura 3. Numero de brotes de S. officinarum

Conclusiones Las vitroplantas sin inóculo mostraron un buen desarrollo en los primeros 30 días de la aclimatación. 2. Los efectos positivos de R. intraradices se observaron después de los 60 días en comparación a las no inoculadas. 3. La inoculación a base de R. intraradices genera nuevos brotes en las plántulas después de los 60 días de ser sembradas. 4. El tratamiento con R. intraradices registró un desarrollo continuo. 1.

Agradecimientos Este trabajo se desarrolló con una beca otorgada mediante la Convocatoria 2012 Fortalecimiento de los Cuerpos Académicos con el Proyecto: Procesos de Transformación de Nitrógeno y Carbono en suelo bajo cultivo de caña de azúcar, en el marco del Promep de la Secretaría de Educación Superior. Apoyo otorgado al CA324 Estructura y Funcionamiento de Ecosistemas Forestales de la Universidad Veracruzana. Los autores también agradecen al Dr. Alejandro Alarcón (área de Microbiología, Colegio de Postgraduados, Campus Montecillo Carretera México–Texcoco km 36.5 Montecillo, Estado de México), por la donación del inóculo de R .intraradices usado en este trabajo.

Bibliograf´a Alarcón, A. y Ferrera–Cerrato, R. (2000). Ecología, fisiología y biotecnología de la micorriza arbuscular. Mundi–Prensa México. Bifani, P. (2007). Medio ambiente y desarrollo. Editorial Universitaria. Chirinos, J., Leal, A. y Montilla, J. (2006). Uso de Insumos Biológicos como Alternativa para la Agricultura Sostenible en la Zona Sur del Estado Anzoátegui. Revista Digital CENIAP HOY Número 11, 2006. Maracay, Aragua, Venezuela. Flores, C.S. (2001). Las variedades de caña de azúcar en México. México D.F. George, E.F., Hall, M.A. & Klerk, G.J. (2007). Plant Propagation by Tissue Culture: Volume 1. The Background. Springer Science & Business Media. Roveda, G., Cabra, L., Ramirez, M.M. y Peñaranda, A. (2007). Efecto de las micorrizas arbusculares sobre la aclimatación y endurecimiento de microplántulas de mora (Rubus Glaucus). Revista Corpoica–Ciencia y Tecnología Agropecuaria. Vol. 8 (1), 28–36.

Cultivo de tejidos vegetales

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