chagas

Volumen 6, número 2

Investigación

CIENTIFICA

enero–julio 2012, issn 1870–8196

Selección del purificado de T. cruzi más adecuado para el inmunodiagnóstico de la

enfermedad de Chagas en el estado de Zacatecas

maría gUaDalUpe aloNso Torres rosa maría ramíreZ saNToYo Jorge lUis aYala lUJÁN marisa herNÁNDeZ barrales araCeli gÓmeZ Corvera Unidad Académica de Ciencias Químicas Universidad Autónoma de Zacatecas

Correo–e: araceligoco@hotmail.com

2

Investigación

CIENTIFICA

Resumen

Introducción

La enfermedad de Chagas es una infección parasitaria sistémica y crónica causada por el parásito Trypanosoma cruzi. Del 20 al 30 por ciento de las personas infectadas desarrollan formas graves de cardiopatías o megaformaciones digestivas. Se han hecho aislamientos del parásito de diversos hospederos y diferentes áreas geográficas, con lo que se ha demostrado una gran variación en su constitución antigénica, virulencia y respuesta inmune a la infección.

En este proyecto se analizan, por medio de las técnicas elisa e Inmunofluorescencia Indirecta (ifi), seis purificados de T. cruzi obtenidos de pacientes del estado de Zacatecas, con treinta sueros positivos a T. cruzi, diez sueros negativos y seis sueros positivos a otras parasitosis. El objetivo es seleccionar el purificado más adecuado para el inmunodiagnóstico de la enfermedad de Chagas en la entidad, de acuerdo con la sensibilidad y especificidad alcanzadas con esas técnicas.

La tripanosomiasis americana o enfermedad de Chagas es una zoonosis muy compleja presente en Sudamérica, Centroamérica y México, y representa una grave amenaza para la salud en los países de la región.

Su historia natural se caracteriza por la poca visibilidad de la infección aguda, un largo curso y una pequeña proporción de casos que progresan a formas crónicas clínicamente manifiestas, lo que dificulta su valoración. No obstante, es necesario conocer la patogenicidad de la infección, sus variaciones regionales y la prevalencia de las diferentes formas clínicas (1).

La enfermedad de Chagas posee un curso clínico variable: incluye una fase inicial o aguda, que puede ser asintomática o sintomática, con fiebre, adenomegalia, conjuntivitis unilateral (signo de Romaña), miocarditis y meningoencefalitis. En cambio, la fase crónica representa un periodo de latencia de diez a quince años, se refiere como indeterminada, después de ella el 27 por ciento de los individuos infectados manifiesta síntomas cardiacos que pueden conducir a la muerte súbita, el 6 por ciento desarrolla daño digestivo y el 3 por ciento puede sufrir alteraciones del sistema nervioso periférico (2).

El diagnóstico serológico de la enfermedad de Chagas se basa en pruebas convencionales de Ensayos Inmunoenzimáticos en fase sólida (elisa), de Hemaglutinación indirecta (hai) y de Inmunofluorescencia indirecta (ifi). Con respecto a las técnicas de elisa es importante considerar que en su mayoría pertenecen a dos categorías: las que usan fracciones antigénicas del lisado parasitario y las que emplean antígenos recombinantes o péptidos sintéticos. A fin de lograr un diagnóstico más efectivo se recomienda utilizar una combinación de ambas categorías (3). En general, los kits que contienen antígenos recombinantes o péptidos sintéticos son más específicos que aquellos que trabajan con el extracto crudo, ya que varían en cuanto a la sensibilidad (4, 5, 6).

Cabe señalar que el diagnóstico por el laboratorio es complejo. Los factores relacionados con la variabilidad antigénica y la respuesta inmune del huésped deben ser considerados en la interpretación final de los resultados de las pruebas (7). En México la mayoría de los estudios han usado extractos antigénicos

Palabras clave: Trypanosoma cruzi, antígenos, diagnóstico.

Abstract The disease of Chagas is a systemic and chronic parasitic infection, is caused by the parasite Trypanosoma cruzi. From 20 to 30 percent of the infected people develop severe forms of cardiopathies or digestive megaformaciones. Isolations of the parasite of diverse hospederos and different geographic areas have been realised, with was has been showing a great variation in their antigenic constitution, its virulence and the immune response to the infection.

In this project they are analyzed, by means of the techniques of elisa and Inmunofluorescencia Indirecta (ifi), 6 purified of T. cruzi obtained of patients of the state of Zacatecas, with 30 positive serums to T. cruzi, 10 negative serums and 6 positive serums to other parasitisms. The aim is to select the more suitable purified one for the immunodiagnostic of the disease of Chagas in Zacatecas, according to obtained sensitivity and specificity by means of these techniques.

Keywords: Trypanosoma cruzi, antigens, diagnosis.

Volumen 6, número 2 enero–julio 2012, issn 1870–8196

de T. cruzi de cepas de otras áreas geográficas (8). En un análisis comparativo para detectar anticuerpos anti–T. cruzi con extractos antigénicos de dos cepas mexicanas y una argentina, se observó que uno de los extractos mexicanos fue más sensible que el de origen argentino, el cual también falló en la detección de individuos con infección en fase asintomática crónica (9).

Posteriormente, en el trabajo de tesis (10) se estudió el medio de cultivo líquido glsh en el crecimiento de los epimastigotes de T. cruzi; además se realizó una cinética de crecimiento de los parásitos con la intención de conocer su proliferación in vitro. En el proyecto de investigación sivilla 96O2176 (11) se trabajó con un purificado de T. cruzi aislado de un triatomino infectado del estado de Zacatecas y con proteínas de fusión T. cruzi donadas por el Instituto Pasteur de Lille, Francia. Se analizaron sueros de pacientes positivos a T. cruzi mediante las técnicas de Hemaglutinación e Inmunodifusión y proteínas de fusión con un extracto antigénico total por medio de elisa e ifi. Las proteínas de fusión mostraron más especificidad con respecto al extracto antigénico total que tuvo una mayor sensibilidad.

Materiales y métodos Purificados Se emplearon seis purificados de T. cruzi aislados a partir de sangre periférica de pacientes de Zacatecas.

Algunos fueron obtenidos en la fase aguda de la infección y otros en la crónica, pero con reactivación de la infección. Los purificados se mantuvieron en un medio semisólido agar sangre–infusión cerebro corazón a 28 °C. Diagnóstico de la infección por T. cruzi para la obtención de sueros positivos A fin de obtener sueros positivos a T. cruzi se tomaron muestras sanguíneas de 28 personas residentes de zonas endémicas para la enfermedad de Chagas en Zacatecas. En su mayoría, los pacientes referían en su mayoría haber sido picados por triatominos (chin-

3

ches) y algunos otros presentaban la sintomatología característica de la fase aguda y de la crónica. El diagnóstico se llevó a cabo directamente a través de frotis sanguíneo y de manera indirecta con las técnicas serológicas ifi y elisa.

De cada muestra se realizaron los frotis sanguíneos teñidos con colorantes Wright–Giemsa y se observaron las laminillas en el microscopio óptico en busca de trypomastigotes de T. cruzi. Enseguida fueron centrifugadas las muestras de sangre a 1800 rpm durante cinco minutos a 4 0C; el plasma de cada muestra fue recolectado y congelado a –20 0C hasta su análisis.

Inmunofluorescencia Indirecta (ifi) A partir de un purificado de T. cruzi, aislado de un triatomino infectado y mantenido en un cultivo semisólido de agar sangre–cerebro corazón, se hicieron de cinco a seis pases en líquido glsh para eliminar las células sanguíneas y los otros componentes del medio semisólido. Los epimastigotes de T. cruzi cultivados en líquido glsh fueron recolectados al séptimo día, se lavaron tres veces con pbs, se fijaron a los portaobjetos con formaldehido y se verificó su fijación y distribución en los pocillos con el microscopio óptico.

Los sueros de los pacientes, al igual que el control positivo y negativo, se diluyeron 1:50 en pbs. Se depositaron 20 ul de cada disolución (por duplicado) en los pocillos de las laminillas para inmunofluorescencia; se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente en cámara húmeda, se lavaron tres veces con pbs. Los anticuerpos anti–IgG humanos conjugados con fluoresceína diluidos en pbs se agregaron a cada uno de los pocillos de los portaobjetos y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Más tarde se colocaron los cubreobjetos con una solución de glicerol–pbs con el propósito de examinarlos en el microscopio de Fluorescencia.

Ensayo Inmunoenzimático en Fase Sólida (elisa) Los sueros de los pacientes se analizaron con el kit comercial Chagas Ab (orgenics) que usa antígenos recombinantes en la detección cualitativa de anticuerpos anti–T. cruzi.

Investigación

4

CIENTIFICA

Resultados

Discusión

En el estudio de las 28 muestras, el análisis de los frotis sanguíneos demostró la presencia de trypomastigotes de T. cruzi en cuatro de ellas, correspondientes a los pacientes P4, P5, P11 y P19 (tabla 1, figura 1). La aparición del parásito en sangre confirma por sí misma el diagnóstico de la infección. Concerniente a los sueros analizados con la técnica de Inmunofluorescencia Indirecta se detectaron anticuerpos contra T. cruzi en siete de ellos (pacientes P1, P5, P6, P15, P19, P24 y P26) (tabla 1, figura 2). Respecto a los sueros probados con elisa, resultaron positivos cinco (pacientes P5, P6, P15, P24 y P26) (tabla 1, figura 3).

La Organización Mundial de la Salud recomienda la realización paralela de un mínimo de dos pruebas serológicas con diferente metodología para el diagnóstico de la enfermedad de Chagas. Por tal motivo fueron tratados como muestras positivas de las técnicas serológicas los pacientes P5, P6, P15, P24 y P26, y se excluyó al P1 por presentar positividad sólo en una prueba serológica (ifi). En resumen, las muestras consideradas positivas son ocho de un total de 28, lo que corresponde a un índice de positividad del 28.57 por ciento.

Como se ha mencionado, en México el diagnóstico de la enfermedad de Chagas se hace principalmente de manera pasiva, a través del tamizaje obligatorio en los bancos de sangre del país (12); sin embargo estas acciones se llevan a cabo en menos del 85 por ciento de los casos. El diagnóstico activo sólo se realiza en algunos laboratorios del sector público, debido a los altos costos de los reactivos comerciales, situación que ha generado un desconocimiento sobre la magnitud del impacto epidemiológico de la enfermedad. En consecuencia, surgió la necesidad de buscar muestras positivas a T. cruzi en el estado a fin de emprender este proyecto de investigación.

Para el diagnóstico de la enfermedad de Chagas se consideraron aspectos epidemiológicos como: el lugar de residencia (zona endémica de la enfermedad), migración, existencia del triatomino, picaduras y presencia de animales de corral cerca de las casas.

El diagnóstico del laboratorio incluye pruebas parasitológicas que detectan la infección en fase aguda, y pruebas inmunológicas, las cuales son útiles en las fases sintomática y asintomática, y para evidenciar la regresión serológica en pacientes tratados (13).

Cuando se interpretan las pruebas diagnósticas es importante revisar la historia clínica de cada paciente. Con respecto a los resultados alcanzados con los frotis sanguíneos (tabla 1), en las muestras de los pacientes P4, P5, P11 y P19 se detectó al parásito en sangre. Su presencia, tal como se ha señalado antes, confirma el diagnóstico de la infección. Sin embargo, en los P4 y P11 las pruebas serológicas fueron negativas. Estos datos son característicos ya sea de la fase aguda temprana en la que todavía no existen anticuerpos detectables o de estados de inmunodeficiencia. Cabe destacar que en la actualidad el P4 recibe tratamiento inmunosupresor porque fue receptor de un trasplante.

Mediante las técnicas serológicas (ifi y elisa) los sueros de los pacientes P5, P6, P15, P24 y P26 resultaron positivos, lo que confirma el diagnóstico de la enfermedad de Chagas según los lineamientos descritos por la ops/oms (14). Los pacientes P1 y P19 sólo presentaron reactividad con la prueba ifi, por lo que se excluyó al P1. Con la prueba ifi se detectaron más

Tabla 1 resUlTaDos posiTivos a T. CRUZI al UTiliZar las TÉCNiCas De froTis saNgUíNeo, ifi Y elisa Pacientes

Frotis sanguíneo

P1 (+)

P5

(+)

P6

(+)

(+)

(+)

(+)

(+)

(+)

(+)

P15 P19

ELISA

(+)

P4

P11

IFI

(+)

(+)

P24

(+)

(+)

P26

(+)

(+)

Total=7

Total=5

Total=4

Volumen 6, número 2 enero–julio 2012, issn 1870–8196

sueros positivos que con elisa debido a que la prueba ifi tiene mayor sensibilidad (15) porque los anticuerpos se unen a los antígenos del parásito; en contraste, en elisa comercial los anticuerpos se unen a algunos antígenos recombinantes con una especificidad superior (16, 17).

Los índices de seropositividad en zonas endémicas del país van del 10 al 63 por ciento y del 0.5 al 2 por ciento en el resto del territorio (18). El 28.57 por ciento resultante en este estudio indica su gravedad al ubicarse en una zona de riesgo. Por tanto, se recomienda ampliar el análisis del número de muestras con la finalidad de obtener datos epidemiológicos más representativos en la entidad y contribuir de ese modo a la toma de decisiones a nivel vectorial, de diagnóstico, tratamiento y seguimiento de las personas que se encuentran en riesgo de contraer la infección.

Agradecimientos La realización de este trabajo fue posible gracias al apoyo del Programa de Mejoramiento del Profesorado (promep), a través del financiamiento del proyecto de investigación con número de registro promep/103.5/08/3087.

Bibliografía World Health Organization on behalf of the Special Programme for Research and Training in Tropical Disease, 2007.

Da Silva, F., M. Caetano, E. Silva, «Implications of genetic variability of Tripanosoma cruzi for the pathogenesis of Chagas disease», en Cad. Saúde Pública, 23(10), Río de Janeiro, 2007, pp. 2263–2274.

Gadelha, A.A., A.F. Vercosa, V.M. Lorena et al., «Chagas’ disease diagnosis: comparative análisis of recombinant elisa with convencional elisa and the haemagglutination test», en Vox Sang., 85(3), 2003, pp. 165–70.

Caballero, Z.C., O.E. Sousa, P. Waldelania et al., «Evaluation of Serological Test To Identify Tripanosoma cruzi Infection in Human and Determine

5

Cross–Reactivity with Tripanosoma rangeli and Leishmania spp», en Clinical and Vaccine Inmunology, 2007, pp. 1045–1049.

Silveira–Lacerda, E.P., A.G. Silva, S. Favorito, Jr. M.A. Souza et al., «Chagas disease: application of Tesa–Blot in inconclusive sera from Brazilian blood bank», en Vox Sang, 87, 2004, pp. 204–207.

Umezawa, E.S., S.F. Bastos, J.R. Coura, M.J. Levin et al., «An improved serodiagnostic test for Chagas’ disease employing a mixture of Tripanosoma cruzi recombinant antigens», en Transfusion, 43, 2003, pp. 91–97.

Ferreira, A.W., S.D. de Avila, «Laboratory diagnosis of Chagas’heart disease», en Sao Paulo Med Journal, 113(2), 1995, pp. 767–71.

Bucio, M.I., M. Cabrera, E.L. Segura et al., «Identification of imunodominant antigens in Mexican atrains of Tripanosoma cruzi», en Immunology Invest, 28(4), 1999, pp. 257–68.

Sánchez, B., V. Monteón, P.A. Reyes et al., «Standadrization of micro–enzyme–linked immunosorbent assay (elisa) and Western Blot for detection of Tripanosoma cruzi antibodies using extracts from Mexican strains as antigens», en Arch. Med. Res., 3(5), 2001, pp. 382–8.

Velásquez Castro, N.L., Inmunodiagnóstico de la enfermedad de Chagas en el estado de Zacatecas, tesis de licenciatura, Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Autónoma de Zacatecas, 1999.

Gómez, C.R., C.A. Gómez, N.L. Velásquez Castro, «Inmunodiagnostico de la Enfermedad de Chagas en el estado de Zacatecas, utilizando las proteínas de fusion Tcac2 y Tc24 de trypanosoma cruzi», 1998.

Salazar Schetino, M.P. et al., «Iniciativa México: Propuesta para el control y vigilancia epidemiológica de la enfermedad de Chagas en México», en Bol. Chil. Parasitol., 57, 2001, pp. 76–79.

Moncayo, A., M.I. Ortiz Yanine, «An update on Chagas disease (human American trypanosomiasis)», en Annals of tropical Medicine and Parasitology, 8, 2006, pp. 663–677.

Cura, E., S. Wendel, Manual de procedimientos de control de calidad para los laboratorios de serología de los bancos de sangre, Washington D.C., Organización Panamericana de la Salud, 1994, p. 61.

6

ops/oms,

Investigación

CIENTIFICA

Taller de control de calidad interno y validación de metodologías diagnósticas, San Salvador, diciembre 2003.

Furucho, C.R., E.S. Umezawa et al., «Inconclusive results in conventional serological screening for Chagas’ disease in blood banks: evaluation of cellular and humoral response», en Tropical Medicine and international health, 12, 2008, pp. 1527–1533.

Da Silveira, J.F., E.S. Umezawa et al., «Chagas Disease: recombinant trypanosoma cruzi antigens for serological diagnosis», en Trends in Parasitology, 6, 2001, pp. 286–291.

Velasco–Castrejón, O. et al., «Seroepidemiología de la enfermedad de Chagas en México», en Salud Pública de México, 34 (002), 1992, pp. 186–196.