primer simposio by JORGE CASTRO

Presentación Teniendo en cuanta el Decreto Único Reglamentario del Sector Educación, indicado bajo el número 1075 del 26 de mayo de 2015, emanado por el Ministerio de Educación Nacional; En la sección concerniente a la educación superior, en su apartes de justificación e investigación, se sugiere la constante revisión del estado de la educación en el área, y de la ocupación, profesión arte u oficio, en los ámbitos nacional e internacional. Igualmente las necesidades del país o de la región que, puedan tener relación con el programa en concordancia con referentes internacionales. En el mismo decreto, en lo referente a la Investigación Universitaria, particularmente las actividades que permitan desarrollar una actitud crítica y una capacidad creativa para encontrar alternativas de avance de la ciencia, la tecnología, las artes o las humanidades y del país indica, que los programas de educación superior deben prever la manera cómo van a promover la formación investigativa de los estudiantes o los procesos de investigación, o de creación, en concordancia con el nivel de formación y sus objetivos. Igualmente considerando la propuesta de Política Pública construida sobre lo que el país espera para su educación superior reflejada en el acuerdo por lo superior 2034, particularmente en lo referido a los objetivos de desarrollar una educación superior universal y de calidad en todo tiempo y lugar, gracias a las tecnologías de la información, promoviendo el uso y apropiación de las tecnologías de la información y de la comunicación, y que las Instituciones de Educación Superior asuman éstas en sus procesos internos y modalidades de oferta académica, así como a la búsqueda de que la investigación responda mejor a las necesidades locales. Finalmente, en consecuencia con el Plan Nacional de Desarrollo 2014 – 2018 en su capítulo IV sobre educación “Colombia la más educada en 2025” en donde plantea en su visión que el País requiere un sistema de formación que permita a los estudiantes no solo acumular conocimientos, sino saber cómo aplicarlos, innovar, y aprender a lo largo de la vida para el desarrollo y actualización de sus competencias. Por otro lado, que el País debe promover espacios de divulgación y formación dentro del sector educativo y otros ámbitos que faciliten los procesos de transformación cultural y actitudinal necesarios para el avance del país en aspectos sociales, ambientales, institucionales, y para el establecimiento de una paz sostenible. Tomando en cuenta los anteriores referentes nacionales y en concordancia con la Visión y Misión del Programa de Ingeniería de Procesos de la Universidad Mariana, se realizó el II Simposio Virtual de Investigación Aplicada a la Ingeniería de Procesos, evento anual que se programa desde la Facultad de Ingeniería; para abrir un espacio de divulgación de experiencias investigativas y empresariales exitosas, en la aplicación de las áreas de formación en ingeniería y afines como estrategia de aprendizaje; y perfeccionamiento de la formación específica. En el evento se realizaron diversas ponencias, producto de resultados de trabajos de investigación y experiencias aplicadas por expertos de carácter nacional e internacional en el campo de los Procesos, así como experiencias exitosas en la aplicación de las áreas de formación en ingeniería, en donde se trataron temas relacionados con procesos fisicoquímicos,

biotecnológicos, en alimentos, agroindustriales y áreas afines que requieren de operaciones o procesos unitarios. De igual manera se presentan trabajos realizados dentro de procesos administrativos o de gestión, obedeciendo a que el programa de Ingeniería de Procesos tiene a los mismos como áreas de desempeño de los profesionales de formación.

Ponentes

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Ing. Andrés M. Montenegro Jaramillo, M.Sc.

Ingeniero Agroindustrial, con Maestría en Diseño y Gestión de Procesos, su experiencia profesional ha estado en la intersección entre el sector de desarrollo y la industria a través de diversos proyectos en sistemas productivos agroindustriales, particularmente en café. En la actualidad, se desempeña como director en Colombia del proyecto Binacional Coffee Borderlands de CRS, en donde promueve nuevos modelos empresariales para el sistema productivo cafetero de Nariño y desarrolla una agenda de investigación para la influencia, en política pública y prácticas del sector privado, en alianza con centros de investigación, universidades internacionales, regionales y empresas líderes de la industria de cafés especiales. Conferencia: “Ingeniería y Desarrollo sostenible”

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Ing. Annamaria Filomena, M.Sc.

Ingeniera de Producción Agroindustrial y Magister en Diseño y Gestión de Procesos con énfasis en Alimentos de la Universidad de La Sabana, con experiencia en química y microestructura de los alimentos. Realizó una estancia de investigación con el grupo MiQuali de la Universidad Politécnica de Valencia, España. Ha trabajado en investigación con diferentes alianzas Universidad – Empresa. Actualmente se desempeña como docente investigadora en el programa de Gastronomía de la Universidad de La Sabana. Conferencia: “Evaluación de la actividad ATP-asa en surimi con diferentes estabilizantes y su relación con las principales propiedades funcionales y estructurales al aplicar ultrasonido”

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Ing. Nidia Casas, M.Sc.

Ingeniera de Producción Agroindustrial y Magister en Diseño y Gestión de Procesos con énfasis en Alimentos, con experiencia en las áreas de desarrollo de nuevos productos, propiedades físicas, manejo de postcosecha, tecnologías de procesamiento de vegetales, buenas prácticas de manufactura y gestión empresarial. Experiencia en la planeación, gestión y ejecución de proyectos de innovación e investigación. Ha participado en proyectos de: mejoramiento de productos innovadores con potencial exportador, evaluación de Luz UVC como tecnología alternativa para garantizar inocuidad microbiológica y mantenimiento de la capacidad antioxidante de una bebida funcional, desarrollo de productos funcionales de V gama a partir de materia prima procedente de agricultura orgánica, desarrollo y determinación de la estabilidad de un producto funcional - gama V, con alta capacidad antioxidante, elaborado a partir de vegetales. Actualmente, se desempeña como docente investigador en el programa de Ingeniería de Alimentos de la Fundación Universitaria Agraria de Colombia de la ciudad de Bogotá. Conferencia: "Análisis de imágenes como una herramienta de evaluación de calidad: aplicaciones en la industria agroalimentaria".

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Ing. Yudtanduly Acuña M, M. Sc.

Ingeniera de Producción Biotecnológica, Master en Diseño y Gestión de Procesos. Ha trabajado en gestión y ejecución de proyectos “Acreditación y estandarización de técnicas de Biodiesel según la norma NTC 5444 del laboratorio de análisis físico-químico de Corpodib; en el Desarrollo proyecto: Obtención de Alcohol Carburante a Partir de Remolacha Azucarera (B. Vulgaris variedad saccharifera) Cultivada en el Altiplano Cundiboyacense. Ha realizado asesorías técnicas a empresas agroindustriales, gestión de proyectos de innovación y desarrollo tecnológico, gestión comercial en el marco del programa MEGA – Modelo Empresarial de Gestión Agroindustrial –Cámara de Comercio de Bogotá, ha desarrollado proyectos relacionados con caracterización de microorganismos en diferentes procesos biotecnológicos, entre otros. Actualmente, hace parte del equipo de docentes investigadores del programa de Ingeniería Agroindustrial de la Fundación Universitaria Agraria de Colombia de la ciudad de Bogotá. Conferencia: “Caracterización de cepas con potencial probiótico”

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Luis Eduardo Díaz Barrera, PhD.

Químico y Doctor en Ciencia Química de la Universidad Nacional de Colombia. Hace parte del grupo de investigación de Procesos Agroindustriales (GIPA), de la Universidad de La Sabana. Trabaja en las líneas de investigación de Bioprocesos y propiedades físicas y funcionales de los materiales agroalimentarios. Es líder del grupo de Investigación en Bioprospección de la Universidad de La Sabana. Dentro de su amplia experiencia se destaca su trabajo en áreas de las ciencias biológicas, bioquímica y biología molecular. Ha participado en proyectos relacionados con: Búsqueda de moléculas de interés agrícola como biocontroladores de patógenos en diferentes cultivos, Bioprospección de micrororganismos, Obtención y caracterización de hidrofobinas a partir de hongos filamentosos aislados de residuos agroindustriales para su potencial aplicación como biosurfactantes, caracterización y mejoramiento de la acción de la lipasa de P. aeuroginosa para su utilización en la producción de biodiesel y oleoquímicos, capacidad de cepas de Lactobacillus fermentum para reducir colesterol in vitro, evaluación de propiedades funcionales de pulpa de Borojo (Borojoa patinoi) y su relación con la inhibición antimicrobiana para la aplicación en alimentos y cosméticos, entre otros proyectos de interés. Actualmente, se desempeña como docente en la Universidad de La Sabana, en pregrado, Maestría y en el Doctorado en Biociencias. Conferencia: "Evaluación de una cepa acido láctica con potencial probiótico hipocolesterolémico".

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Ing. Johanna Andrea Serna, M.Sc.

Ingeniera Agroindustrial y Magister en Diseño y Gestión de Procesos con énfasis en Bioprocesos, con experiencia en microbiología, investigación y desarrollo de productos, tecnologías avanzadas de procesamiento cárnicos, bioconservación, biotecnología, bioinformática, experiencia docente y formulación de proyectos. Ha participado en proyectos de: obtención de plántulas por propagación in vitro, bioconservación de productos lácteos, identificación factores alterantes en lácteos, desarrollo e implementación de nuevas tecnologías en cárnicos, desarrollo e implementación de nuevas tecnologías en lácteos, desarrollo de alimentos funcionales no lácteos, implementación de nuevas tecnologías en la obtención de metabolitos con capacidad antioxidante y mejoramiento de procesos para industria. Actualmente se desempeña como docente en el área de Biotecnología y Alimentos en la Universidad La Gran Colombia- Seccional Armenia.

Evaluación de la actividad ATP-asa en surimi con diferentes estabilizantes y su relación con las principales propiedades funcionales y estructurales al aplicar ultrasonido

Ing. Annamaria Filomena Ambrosio, Msc.

Universidad de La Sabana

“1er Simposio Virtual de Investigación Aplicada a la Ingeniería de Procesos” Pasto, 2014

Contenido Introducción Objetivos Metodología

Resultados y Discusión Conclusiones

Recomendaciones

Introducción

Actividad ATP-asa

ATP + H20 ADP + Pi + H+

Indicador de degradación proteíca Índice degradación actiomiosina Imágenes: Science Photo Library

Bowker et. al, 2005

Masniyon et. al, 2007; Khan et. al. 2004; Koseki et. al, 2005).

Introducción

Surimi

Producto extraído del músculo de pescado (Suzuki, T. 1981; Hall, 2001; Sadhan et. al. 2010)

Tradicionalmente elaborado a partir de especies marinas (Nopianti et. al, 2011)

Tilapia (Oreochromis niloticus)

FAO, cultivo estrategia de seguridad alimentaria (Zubieta et. al, 2007).

Imágenes: Autor, Shiraoi.net, Science Photo Library

Introducción

Surimi

Las propiedades de gelificación del surimi se deben principalmente a las interacciones del complejo actomiosina (Hossain et. al, 2011), lo que

permite una textura elástica característica de este tipo de productos (Nopianti et. al,

2011)

Diagrama de la estructura sarcomérica del músculo (Adaptado de: Park, 2005; Watabe, 1992)

Introducción

Ultrasonido

Ondas de sonido. Vibraciones mecánicas. Rango mayor al audible por el ser humano > 20 kHz. (Kocis et. al, 1996; Mulet et. al, 2002)

ALTA INTENSIDAD/ ALTA POTENCIA ( Frecuencias 20 kHz – 100 kHz; potencias > 1 W/cm2) BAJA POTENCIA( Frecuencias 100 – 1 MHz; potencias < 1 W/cm2)

ANTECEDENTES UNIVERSIDAD DE LA SABANA “Estudio

de los cambios fisicoquímicos y de la fracción proteica miofibrilar de Cajaro (Phractocephalus hemiliopterus) por efecto del tratamiento ultrasonido y su aplicabilidad en la obtención de Surimi” Filomena A (2007); Belacazar, F.y Romero, P. (2007); Alarcón, W, y Naranjo, E. (2008); Reyes, C.y Quintero, M. (2008) Imágenes: Science Photo Library, Autor

Introducción

Estabilizantes Emulgentes, estabilizadores, emulgentes y gelificadores Polifosfato de sodio E452 (i) (NaPO3), Citrato de sodio E331 (i) (C6H5O7Na3) Fosfato de sodio E339 (NaH2PO4)

“Sustancia que no se consume normalmente….se añade con un fin tecnológico u organoléptico….”(CODEX, 1995)

Imágenes: Naet Europe, UFS químicos

Introducción

Microestructura Organización de sus elementos estructurales y la interacción entre ellos (Llorca, 2003), siendo el nexo necesario entre el proceso industrial y los mecanismos finos de transporte (Hernando et. al, 2010).

Elaboración de surimi la estructura del músculo se ve modificada sustancialmente, relacionada directamente con los parámetros de textura y la interacción entre sus componentes (Sato et. al, 1992; Jafarpour y Gorczyca, 2009).

Imágenes: Autor

Objetivos Evaluar la actividad ATP-asa, en surimi obtenido de Tilapia (Oreochromis niloticus) con diferentes estabilizantes, y su relación entre sus principales propiedades funcionales y estructurales, al aplicar ultrasonido. Obtener surimi a partir de filetes de Tilapia (Oreochromis niloticus), comparando la adición de tres estabilizantes de forma independiente (fosfato de sodio 0.3% p/p, polifosfato de sodio 0.3% p/p y citrato de sodio 0.3% p/p); por medio de dos métodos: tradicional (relación agua: materia prima 3:1) y ultrasonido (40 kHz, 150 W) durante 15 minutos. Evaluar el efecto de los métodos de obtención de surimi (tradicional y ultrasonido) con la adición de estabilizantes (fosfato de sodio, polifosfato de sodio y citrato de sodio) en la actividad de la ATP-asa. Evaluar las propiedades funcionales y estructurales, en surimi obtenido por método tradicional y con ultrasonido (40 kHz, 150 W), con la adición de los estabilizantes.

Metodología •Elaboración de Surimi •Tradicional •Ultrasonido

Polifosfato de Sodio E452(i) , Citrato de Sodio E 331(i), Fosfato de Sodio E339

•Métodos de análisis (Variables de Respuesta) •Actividad ATP-asa •Proteína Total •pH •CRA •Humedad •TPA •SEM

Metodología

Elaboración de Surimi (Tradicional) Filetes de Tilapia (Oreochromis niloticus)

Troceados (aprox. 6 cm2) 3 etapas de lixiviación (-2ºC ) p/p 1:3 (filete:agua)

Retiró exceso de agua

Imágenes: Autor

Metodología

Elaboración de Surimi (Tradicional) Homogenizó NaCl (2%), Sacarosa (1%) Estabilizante (0,3%)*** *Polifosfato de sodio E452 (i)

Tratamiento térmico * Citrato de sodio E331 (i) 60 º C, 15 min * Fosfato de sodio E339

Producto tradicionalmente, llamado KAMABOKO

Imágenes: Autor

Metodología

Elaboración de Surimi (Ultrasonido) Filetes de Tilapia (Oreochromis niloticus)

Troceados (aprox. 6 cm2) Lixiviación (-2ºC ) p/p 1:3 (filete:agua)

Retiró exceso de agua

Imágenes: Autor

Metodología

Elaboración de Surimi (Ultrasonido) US (40 kHz, 150 W) 15 min. 2da Lixiviación

Homogenizó NaCl (2%), Sacarosa (1%), Estabilizante (0,3%)*** *Polifosfato de sodio E452 (i) Tratamiento térmico Citrato 60 º C, *15 min de sodio E331 (i) * Fosfato de sodio E339

Producto tradicionalmente, llamado KAMABOKO Imágenes: Autor

Metodología

Métodos de análisis Actividad ATP-asa

Proteína Total

• Phatcharat et. al, (2006) • 2,0 g ± 0.1 g (40 ml KCl (0,6 M, pH 7,0 a 4 ºC)), (9000 r.p.m, 4 ºC, 20 min.). 0,25 ml (AM), 0,125 ml Tris maleato, 0,125 ml CaCl2.Rxn se detuvo con 1,125 ml de ácido tricloacético. 660 nm

• AOAC 984.13 Kjeldahl • 2,0 g ± 0,1 g. El contenido de proteína total se determinó multiplicando el nitrógeno por el factor f = 6,25

• Sotelo (2000) adaptado de Toldra et. al, (1992) • 4,0 g ± 0,1 g (Tampón fosfato de potasio (0,03 M)), (9000 r.p.m, 4 ºC, 20 min.) Tampón tris HCl (0.1 M pH 7.0 + 1% w/v Extracción Proteína de SDS) (9000 r.p.m, 4 ºC, 20 min.)

• Previa cuantificación de proteínas por el método de ácido bicinconinico. Mini Protean BIO-RAD. Gel de concentración 4%, (10 mA) Gel de resolución 12% (15 mA) SDS-PAGE

Metodología

Métodos de análisis

Humedad

CRA

• AOAC 985.14 • 5,0 g ± 0,1 g se secaron durante 4 horas a 102 ºC± 0,1 ºC

• Jauregui et. al, (1981) • 1.5 g ± 0.1 g se recubrieron en papel filtro Whatman # 3 previamente pesado y se recubrió nuevamente con papel Whatman # 50 (9000 r.p.m,, 4 ºC, 20 minutos)

• Benjakul et. al, (2003). • 1,0 g ± 0,1g homogenizadas con agua destilada 1:5 (p/v) se determinó el pH.

Metodología

Métodos de análisis

TPA

• Análisis de Perfil de Textura (TPA), TA.XT. Plus de Stable Microsystems. Sonda P/50, velocidad de ensayo 2,0 mm/s,distancia 8 mm.

SEM

• Microscopia electrónica de Barrido • 2-3 mm3 , liofilización (45 ºC, 2.5X10-4 bar, 48 h). Acopladas con plata coloidal, metalizadas con oro (40 mA, 120 s). Voltaje de aceleración 15 kV.

• Multifactorial Categórico • Dos Factores: Método – Estabilizante • Diferencias mínimas significativas (LSD), nivel de Análisis significancia p<0,05 Estadístico • Statgraphics Plus versión 5.1®

Resultados y discusión

•Caracterización de la Materia Prima. • Evaluación de la actividad ATP-asa y principales propiedades funcionales al aplicar ultrasonido. •Evaluación de la actividad ATP-asa y principales propiedades funcionales al aplicar diferentes estabilizantes. •Interacción entre los métodos de obtención y la aplicación de estabilizantes.

•Características microestructurales.

Resultados y Discusión

Caracterización Materia Prima

Características similares al Abadejo de Alaska, humedad (80,9 ± 1,2) y proteína total (15,6 ± 1,8) (Park, 2005). Si bien, los valores de proteína para el Abadejo de Alaska son mayores que los encontrados para la Tilapia, diferentes investigadores han elaborado surimi a partir de esta especie (Zhang et. al, 2009; Murthy et. al, 2011; Ingadottir, 2004).

Resultados y Discusión

Características evaluadas (Trad. / US)

Imágenes: Adaptadas de Mundo Tilapia

Resultados y Discusión

Características evaluadas (Trad. / US) Electroforegrama extracto de ATP-asa

1. Filete Tilapia, 2. Surimi + E 455 (i) M. Tradicional, 3. Surimi + E 331 (i) M. Tradicional, 4. Surimi + E 339 M. Tradicional 5. Surimi + E 455 (i) M. Ultrasonido, Asociado con mayor desnaturalización proteica, generada por 6. Surimi + E 331 (i) M. Ultrasonido, 7. Surimi + E 339 M. Ultrasonido, efecto de cavitación y8.rotura enABM los espacios miofibrilares (Dondero et. Marcador / G252

al, 1996; Mulet et. al, 2002). Surimi de Abadejo de Alaska (0,025) (Kang, 2007)

Resultados y Discusión

Características evaluadas (Trad. / US) Según metodología de Kittiphattanabawon et. al, (2012).

Gráfica del porcentaje de actividad ATP-asa residual para surimi obtenido por método tradicional y con ultrasonido.

Surimi obtenido con la aplicación de ultrasonido (47,06%) frente al obtenido por el método tradicional (18,18%).

Resultados y DiscusiĂłn

CaracterĂsticas evaluadas (Trad. / US)

Relacionada con la formaciĂłn de redes tridimensionales proteicas que incrementan el porcentaje de agua ligada (Alvarez-Parrilla et. al, 1997). Valores mayores con US, debido posiblemente a que los pulsos generados afectan directamente el espacio formado entre las miofibrillas (Zhang et. al, 2009).

Resultados y Discusión Características evaluadas (Estabilizantes) Los estabilizantes aplicados sobre una matriz de proteínas cárnicas actúan de acuerdo con su fuerza iónica definida como la capacidad de atracción que tienen los iones en solución debido a sus cargas electrostáticas (West et. al, 2005)

Fosfato de sodio (: 0,364 M) Citrato de sodio (: 0,403 M)

Polifosfato de sodio (: 0,493 M)

> Fuerza iónica > espacio entre las miofibrillas el cual puede variar de 37 a 57 nm (Offer et. al, 1980) > CRA lo cual se ve reflejado en un gel más elástico (Wilding et. al, 1986; Stone y Stanley, 1992).

Imágenes: Autor, Science Photo Library

Resultados y DiscusiĂłn CaracterĂsticas evaluadas (Estabilizantes)

Se relaciona con la naturaleza estabilizante de estos aditivos (CODEX, 1995)

Resultados y Discusión Características evaluadas (Estabilizantes) Según metodología de Kittiphattanabawon et. al, (2012).

Gráfica del porcentaje de actividad ATP-asa residual para surimi obtenido con diferentes estabilizantes: S + E455 (i): Surimi con adición de Polifosfato de Sodio, S + E331 (i): Surimi con adición de Citrato de Sodio, S + E339: Surimi con adición de Fosfato de Sodio

Surimi obtenido con polifosfato de sodio (30,77%) y para el citrato y fosfato de sodio el porcentaje fue de (40,00%)

Resultados y Discusión Características evaluadas (Estabilizantes)

Aunque los fosfatos son utilizados en la industria de procesamiento de surimi, es posible que afecten negativamente la fuerza de gel, debido a que secuestran iones Ca+ (Julavittayanukul et. al, 2006)

Indistintamente del estabilizante utilizado, se presentó un comportamiento cohesivo característico para este tipo de producto.

Resultados y Discusión Interacción entre método y estabilizante Actividad ATP-asa Gráfica de medias y de interacciones con intervalos LSD: Interacción entre el método de obtención y el estabilizante utilizado

Resultados y Discusión Interacción entre método y estabilizante CRA Gráfica de medias y de interacciones con intervalos LSD: Interacción entre el método de obtención y el estabilizante utilizado

Resultados y Discusión Interacción entre método y estabilizante Dureza

Gráfica de medias y de interacciones con intervalos LSD: Interacción Medias para entre el método durezade según obtención el método y el de estabilizante obtenciónutilizado

Resultados y Discusión Microestructura Corte longitudinal de músculo de Tilapia (SEM) (A) 100x, (B) 150x

Almacenamiento en congelación provoca deshidratación parcial de los espacios intermiofibrilares y compresión de las fibras debido al crecimiento de los cristales de hielo (Llorca, 2003)

Derecha (B) se observa un mayor detalle en donde se ve la degradación el efecto de la separación de los miotomas atribuido a la degradación del tejido conectivo. Imágenes: Autor

Imรกgenes: Autor

Conclusiones

• La obtención de surimi requiere un análisis

sistémico, en el que la disponibilidad y características de las materias primas, la tecnología de procesamiento, el uso de aditivos; puedan explicar las variaciones sobre las características fisicoquímicas y microestructurales que definen este tipo de producto.

Conclusiones â&#x20AC;˘ Las caracterĂsticas estudiadas en Tilapia (Oreochromis niloticus) evidenciaron el potencial que tiene esta especie de acuicultura, para la obtenciĂłn de surimi que es comparable al obtenido con especies tradicionales, abriendo posibilidades para el aprovechamiento industrial que genere valor agregado con productos de alto nivel proteico y nutricional.

Conclusiones

• La actividad ATP-asa al ser un indicador de la degradación proteica permitió evidenciar que con la aplicación de ultrasonido, el complejo actomiosina en surimi, presentó una mayor desnaturalización frente al método tradicional, reflejándose en una disminución en la concentración de proteína total, lo que sugiere una mayor extracción de las proteínas sarcoplásmicas con el método tradicional.

Conclusiones • Indistintamente del método de elaboración y estabilizante utilizado, se presentó un comportamiento cohesivo característico para este tipo de producto. La microestructura del músculo durante la elaboración del surimi se pierde completamente; sin embargo, con respecto a la aplicación de ultrasonidos se observaron matrices más ordenadas y compactas.

Conclusiones

•En general, las propiedades funcionales del surimi se ven influenciadas positivamente al emplear ultrasonido, como un método que reduce el uso de agua, combinado con estabilizantes orgánicos como el citrato de sodio, permiten obtener un surimi con características similares o mejores que con el método tradicional

Recomendaciones Análisis de Imágenes Panel Sensorial

Aplicación de Ultrasonido Modelos

Otras especies

• Identificar matemáticamente tamaño y disposición de alveolos

• Percepción del consumidor

• Balances de Materia-Energía • Sonda

• Efecto variable de estudio

• Valor agregado, especies de poco valor comercial

Productos y presentaciones asociados • Poster Congreso Iberoamericano de Ingeniería de Alimentos, CIBIA VIII. Perú.

•Poster Jornada de Socialización Universidad de La Sabana

Investigación,

•Ponencia Oral Congreso Internacional en Investigación e Innovación en Ciencia y Tecnología de Alimentos, IICTA

•Articulo publicado en revista Vitae •Poster Congreso IUFOST, Brasil

Bibliografía •Álvarez-Parrilla, E.; Puig, A.; and Lluch, M.A. (1997). Preparación y caracterización química y microestructural de surimi de Merluza (Merluccius merluccius) y de Jurel (Trachurus trachurus). Journal of Food Science and Technology International. Vol. 3: 49-60 •AOAC, (1990). Official methods of analysis. 14th edition. Association of Official Analytical Chemist, Washington. D.C. •Benjakul, S.; Visessanguan, W.; and Tueksuban J. (2003). Changes in physico-chemical properties and gel-forming ability of lizardfish (Saurida tumbil) during post-mortem storage in ice. Journal of food chemistry. 535-544. •Bowker, B.; Swartz, D.; Grant, A.; and Gerrard, D. (2005). Myosin heavy chain isoform composition influences the susceptibility of actin-activated S1 ATPase and myofibrillar ATPase to pH inactivation. Journal of Meat Science. Vol. 71, 342-350 •Chaijan, M.; Benjakul, S.; Visessanguan, W.; Faustman, C. (2006). Physicochemical properties, gelforming ability and myoglobin content of sardine (Sardinella gibbosa) and mackerel (Rastrelliger kanagurta) surimi produced by conventional method and alkaline solubilisation process. European Food Research and Technology 222: 58-63 •CODEX (1995). Norma general para los aditivos alimentarios •Creighton, T. E. (1993). Proteins: structures and molecular properties. USA, W.H. Freeman and Company.

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UNIVERSIDAD MARIANA FACULTAD DE INGENIERÍA INGENIERÍA DE PROCESOS

ANÁLISIS DE IMÁGENES COMO UNA HERRAMIENTA DE EVALUACIÓN DE CALIDAD: APLICACIONES EN LA INDUSTRIA AGROALIMENTARIA MSc. Nidia Casas Forero

Contenido  Introducción  Análisis de Imágenes  Aplicaciones en la industria agroalimentaria

Introducciรณn Anรกlisis de imรกgenes

Inspecciรณn de calidad

Mayor informaciรณn sobre el comportamiento de los alimentos frente a las condiciones de proceso y/o almacenamiento.

Análisis de Imágenes ¿Qué es el análisis de imágenes? Imagen Digital. Es una representación visual de un objeto y está compuesta por un número finito de elementos, llamados pixeles

Conjunto de técnicas destinadas a obtener datos numéricos relativos al objeto de estudio.

Las imágenes se pueden obtener : Fotografía macroscópica, Microscopia confocal, Microscopia electrónica y Tomografía computarizada

[Color, formas, tamaños y texturas] Aproximarse a la realidad

Análisis de Imágenes Aplicaciones Astronomía Medir la distancia entre estrellas a partir de imágenes tomadas por telescopios

Geografía Estudiar la orografía de una región a partir de fotografías tomadas por un satélite

www.fondobook.com

allan-astronomia.blogspot.com

Neurociencias Medir el perímetro de una neurona, determinar la presencia de una determinada molécula en el tejido nervioso

www.forotiempo.com

Análisis de Imágenes Aplicaciones Biotecnología vegetal

Medicina

Medir el crecimiento de hongos

(Guedez , 2009)

salud.discapnet.es

Análisis de Imágenes Pre procesamiento

Segmentación de la imagen

Adquisición de la imagen

Representación y descripción

Muestra

Reconocimiento e interpretación

Evaluación del Color

Características Características Morfométricas Morfométricas

Análisis de Imágenes Pre procesamiento

Segmentación de la imagen

Adquisición de la imagen

Representación y descripción

Muestra

Reconocimiento e interpretación

Evaluación del Color

Características Características Morfométricas Morfométricas

Análisis de Imágenes Pre procesamiento

Segmentación de la imagen

Adquisición de la imagen

Muestra

Representación y descripción

Macroscópica

Microscópica

Iluminación, cámara y fondo

Evaluación del Color

Características Morfométricas

Reconocimiento e interpretación

Análisis de Imágenes Pre procesamiento

Segmentación de la imagen

Adquisición de la imagen

Representación y descripción

Muestra

Reconocimiento e interpretación

Mejorar la imagen, principalmente ﬁltrando el ruido y aumentando el contraste

Evaluación del Color

Características Morfométricas

Análisis de Imágenes Pre procesamiento

Segmentación de la imagen

Adquisición de la imagen

Representación y descripción

Muestra

Reconocimiento e interpretación

La separación de los objetos presentes en la imagen

Evaluación del Color

Características Morfométricas

Análisis de Imágenes Pre procesamiento

Segmentación de la imagen

Adquisición de la imagen

Representación y descripción

Muestra

Reconocimiento e interpretación

Evaluación del Color

Características Morfométricas

Análisis de Imágenes Pre procesamiento

Adquisición de la imagen

Tamaño Área Perímetro Diámetros Longitudes

Segmentación de la imagen

Forma Factor de forma Circularidad Compacidad Elongación

Textura Dimensión Fractal

Muestra

Representación y descripción

Reconocimiento e interpretación

Evaluación del Color

Características Morfométricas

Análisis de Imágenes Pre procesamiento

Segmentación de la imagen

Adquisición de la imagen

Muestra

Representación y descripción

Coordenadas RGB

Reconocimiento e interpretación Coordenadas CIELab

Evaluación del Color

Características Morfométricas

Análisis de Imágenes Pre procesamiento

Segmentación de la imagen

Adquisición de la imagen

Representación y descripción

Muestra

Reconocimiento e interpretación

Evaluación del Color Coordenadas RGB

Características Morfométricas Coordenadas CIELab

Aplicaciones

Cambios de color por procesos – Pérdida de pigmentos

Encogimiento

Cambios micro estructurales

Relación estructura - calidad

Clasificación de productos

Cambios de color Efecto de los tratamientos de secado en los cambios de color en diferentes frutas

Leiva, D (2012)

Cambios de color CorrelaciĂłn cambios de color con la pĂŠrdida de compuestos bioactivos (Antocianinas) Proceso de secado: LiofilizaciĂłn Almacenamiento: Diferentes condiciones de humedad

Agudelo-Laverde, L. et al (2013)

Cambios de color Indicador colorimétrico maduración

para clasificación de bananas durante la

Exportación de frutas. Se debe buscar una herramienta para estandarizar y mejorar la calidad de las frutas para cumplir con los requerimientos. Estandarización la calidad comercial, y reducir el error humano. Santos, J., et al (2013)

Cambios de color Medición de la calidad de productos alimenticios empleando el análisis de imágenes.

Papas freídas

aros de manzana

Kang, S. & Sabarez, H. (2009)

Cambios de color El efecto de la incorporación de harina de champiñón Agaricus Bisporus (Lange) en el color, características sensoriales y vida útil del pan de queso

Casas, N. & Mogollon, C. (2014)

Encogimiento Evaluación del encogimiento y deformación de uvas durante su deshidratación usando el análisis de imágenes

Describir el encogimiento de uvas durante su deshidratación. Utilizar esta herramienta durante la deshidratación pueden ser utilizadas para la predicción de las características finales del producto, así como para una mejor comprensión de los fenómenos de transporte durante la deshidratación de productos biológicos Santacruz-Vázquez V., et al (2010)

Encogimiento Determinación de cambios morfométricos de extruido a base de harina de trigo durante el proceso de freído Relacionar la variación de la impregnación de aceite y de la textura con los cambios morfométricos. Se observó que el uso de alta temperatura del aceite (200°C) generó una mayor deshidratación, mayor absorción de aceite, parámetros que presentaron una alta correlación con los cambios morfométricos. Santacruz-Vázquez, C., et al. (2011)

Encogimiento Evaluar el nivel de encogimiento y el cambio de color frente a la velocidad de secado por aire caliente (dos espesores y dos temperaturas de secado)

Casas, N. et al (2014)

Cambios micro-estructurales Cambios micro-estructurales durante la deshidratación osmótica del tejido de calabaza

Condiciones de la deshidratación: * Solución sacarosa 45% a 25°C * Relación fruta: solución 1:20

0,5 hora

1 hora

Las principales modificaciones observadas fueron la contracción de las células, plasmólisis y disminución de área celular . 3 horas Mayor, L. et al. (2012)

Cambios micro-estructurales Determinar el efecto de aplicación de calcio en el tejido de melón precortado durante el almacenamiento Disminución del tamaño celular manteniendo la estructura con un empaquetamiento uniforme similar al tejido fresco.

Incremento en la elongación celular, asociado con un cambio en la redondez Muestra Patrón

Melón tratado con cloruro de calcio (14 días)

Muestra Control (14 días)

Melón tratado con lactato de calcio (14 días)

Casas, N (2011)

ClasificaciĂłn de productos CaracterizaciĂłn morfomĂŠtrica de granos de arroz Morelos y una variedad comercial

Valenzuela, J (2007)

Clasificaciรณn de productos Anรกlisis de color y de textura para la clasificaciรณn de papas en chips comerciales Caracterizar la calidad de las papas

Papas claras

Papas un poco oscuras

Papas con manchas oscuras

Papas con defectos naturales

Mendoza, F. et al (2007)

Clasificaciรณn de productos Inspeccionar el % de ingredientes en la pizza y su distribuciรณn por anรกlisis de imรกgenes

Da-Wen Sun(2000)

Clasificaciรณn de productos Inspeccionar el % de ingredientes en la pizza y su distribuciรณn por anรกlisis de imรกgenes

Da-Wen Sun(2000)

Conclusiรณn

Industria

Mecanismo que les aporte informaciรณn cuantitativa para sus procesos de control de calidad. Anรกlisis de Imรกgenes

Referencias • •

• • • •

• •

• • •

•

Agudelo-Laverde, L. M., Schebor, C., Buera, M. 2013. Water content effect on the chromatic attributes of dehydrated strawberries during storage, as evaluated by image analysis. LWT - Food Science and Technology 52: 157 -162 Casas, N., Caez G. 2011. Cambios morfométricos y de calidad por aplicación de tres fuentes de calcio bajo tratamiento térmico suave en melón (Cucumis melo L.) fresco precortado. Revista Mexicana de Ingeniería Química. 10(3): 431 - 444 Fernández, L., Castillero, C., Aguilera, J.M. 2005. An application of image analysis to dehydration of apple discs. Journal of Food Engineering 67: 185–193 González, R.C., Woods, R.E. 2007. Digital image processing. Addison-Wesley. Kang, S.P., Sabarez, H.T. 2009. Simple colour image segmentation of bicolour food products for quality measurement. Journal of Food Engineering .94: 21–25 Leiva, D. 2012. Evaluación del efecto de las combinación de tecnologías de deshidratación aplicadas en tejido de piña sobre el consumo energetico del proceso y la calidad del producto terminado. Mayor, L., Pissarra, J., Sereno, A. M. (2008). Microstructural changes during osmotic dehydration of parenchymatic pumpkin tissue. Journal of Food Engineering, 85(3), 326-339. Mendoza, F., Dejmek, P., Aguilera, J.M. 2007. Colour and image texture analysis in classiﬁcation of commercial potato chips. Food Research International 40: 1146–1154 Romani, S., Rocculi, P., Mendoza, F., Dalla, M. 2009. Image characterization of potato chip appearance during frying Rosa. Journal of Food Engineering 93: 487–494 Santacruz-Vázquez V., Santacruz-Vázquez C., Huerta-Espinosa V.M., Laguna-Cortés J.O. 2010. Evaluación del encogimiento y deformación de uvas durante su deshidratación por fluidización usando el análisis fractal . Superficies y Vacío 23(S) 6166. Santos, J., Rezende, R., Rodrigues, F. 2013. Colorimetric indicator for classiﬁcation of bananas during ripening. Scientia Horticulturae, 4: 201–205 Valenzuela, J. 2007. Caracterización Morfometrica y Colorimetrica del grano pulido de arroz morelos y comercial, utilizando reconocimietno de patrones y análisis fractal de imágines digitales. Tesis Unisabana.

MSc. Nidia Casas Forero Programa de IngenierĂa de Alimentos FundaciĂłn Universitaria Agraria de Colombia - Uniagraria casas.nidia@uniagraria.edu.co

Marzo 2014

UNIVERSIDAD MARIANA FACULTAD DE INGENIERÍA INGENIERÍA DE PROCESOS

ALIMENTOS FUNCIONALES M. Sc. Johanna Andrea Serna Jiménez

San Juan de Pasto, Marzo 18 de 2014

Contextualizaciรณn

Afecciones negativas sobre la salud Obesidad

Gastritis

Diabetes

Hipertensiรณn

Contextualizaciรณn Afecciones positivas sobre la salud

Cambio de hรกbitos alimenticios

Cantidad vs calidad

Bienestar mรกs allรก de alimentar

Tracto gastrointestinal Funciones

Ingestión

Características • 2 superficie más extensa. • Principal zona de contacto. • Mayor cantidad de Digestión Absorción microorganismos. • Gran cantidad de receptores Defecación nerviosos e inmunológicos. Tracto GI

Microbiota gastrointestinal • • • • • • • • • • • • • (Iannitti y Palmieri. 2010)

Streptococcus Veillonella Lactobacillus Bifidobacterium Fusobacterium Staphylococcus Ruminococcus Coprococcus Peptostreptococcu Bacteroides Corynebacterium Neisseria Levaduras

Disbiosis

Iannitti y Palmieri. (2010)

Contextualizaciรณn

http://www.eluniversal.com.mx/img/2011/04/Cie/probioticos302x238.jpg http://www.todonatacion.com/images/deporte/alimentacion/comida.jpg

http://www.bienestar-natural.es/wp-content/uploads/2011/10/foto_salud1.gif http://evidasana.com/wp/wp-content/uploads/2012/02/Alimentos-Funcionales.jpg

Adquisiciรณn de la flora

Nacimiento

Lactancia

Alimentaciรณn

Modulaciรณn

Alteraciones de la flora

Estrés

Antibióticos

Probióticos

Infecciones

Alimentación

edad

Alimento funcional

Antecedentes

• El concepto de alimento funcional fue usado por primera vez en 1984 por científicos Japoneses que estudiaron las relaciones que existen entre nutrición y satisfacción, fortificación y modulación de los sistemas fisiológicos

Definición

• “alimentos que proveen de bienestar y salud, más allá de la nutrición básica” (Siró et al., 2008).

¿Por qué alimentos funcionales? Food Science • Avance en el campo científico • Biotecnología e ingeniería genética

Salud • Aumentar expectativa y calidad de vida • Incremento de población de la tercera edad

Demanda • Creciente aumento de la demanda por parte del consumidor • Controlar y mejorar estado de salud

Por qué probióticos? Alimentos funcionales

Beneficios de los alimentos probióticos

Matrices diferentes

Cepas aisladas de alimentos

• Más allá de la nutrición básica • Mercado creciente estimado 47,6 billones de dólares (2002) (Siró, et al. 2008).

• Inmunomodulación, reducción colesterol, exclusión patógenos. (OMGE, 2008; Iannitti y Palmieri, 2010)

• Bajo costo, vegetarianos, alérgicos, variedad de frutas.(Prado,y otros,2008)

• Adaptación condiciones gastrointestinales, bajo costo, Espinoza,et al. (2010); Yan,et al.(2010); Liu, Han y Zhou.(2011); Klayraung, et al.(2010); Cueto-Vigil,et a. (2010).

Probiรณticos Bienestar

Cรณmo funcionan

Para que Sirven? Que son? FAO/WHO (2001); OMG (2008)

Requisitos (OMS, 2002) No ser patógenas ni toxigénicas. Sobrevivir en medios ácidos.

Resistir sales biliares. Resistir diferentes antibióticos. Inhibir el crecimiento de patógenos.

Mantenerse en altas concentraciones en el medio (107 y 108UFC/g o ml). Facilidad de adherencia a células

Desarrollo de probióticos ANTIBIÓTICOS

SALES BILIARES

ACCIÓN ANTIMICROBIANA

POTENCIAL PROBIÓTICO

ADHERENCIA

Desarrollo de probióticos

Propiedades Sobre la salud

Propiedades tecnológicas

Evaluación potencial in vitro Aislamiento e identificación

Género y especie

• Dosis efectivas • Ensayos clínicos

• Estabilidad • Producción • Concentración

• pH • Sales biliares • Antibióticos • Acción antimicrobiana • Adherencia (FAO- WHO 2006)

Efectos Función barrera o protectora

• Por la acidificación del medio, exclusión

Modificación selectiva de la microbiota.

• Sustrato para microorganismos benéficos

Producción de AGCC

Absorción de minerales Metabolismo de Lípidos

Metabolismo Lactosa Inhibición de la diarrea Biodisponibilidad de aminoácidos

Aporte de vitaminas

• Propiónico (Hígado), butírico (Fuente de energía), acético (Músculo) • Disminución de pH- aumenta solubilidad (difusión pásiva) • A. Propiónico disminuye expresión de enzimas lipogénicas en hígado • Actividad betagalactosidasa bacteriana • Asociado a la presencia de probióticos • Hidrolisis de proteínas

• Producción B6, B12 y ácido Fólico (Bifidobacterium)

(Mussatto and Mancilha (2007); Sanz,. et al (2004))

Funcionales

Probiรณtico

Simbiรณtico Prebiรณtico

JUSTIFICACIÓN • Más allá de la nutrición básica. • Mercado creciente estimado 47,6 billones de dólares (2002) (Siró, et al. 2008).

Alimentos funcionales

Beneficios de los alimentos probióticos

Cepas aisladas de alimentos

Matrices diferentes

• Adaptación condiciones gastrointestinales, bajo costo. Espinoza,et al. (2010); Yan,et al.(2010); Liu, Han y Zhou.(2011); Klayraung, et al.(2010); Cueto-Vigil,et a. (2010).

• Inmunomodulación , reducción colesterol, exclusión patógenos. (OMGE, 2008; Iannitti y Palmieri, 2010)

• Bajo costo, vegetarianos, alérgicos, variedad de frutas.(Prado,y otros,2008)

OBJETIVOS Evaluar el potencial probiótico de bacterias ácido lácticas aisladas de alimentos para utilizarlas como aditivo en la elaboración de jugos de fruta.

Evaluar in vitro el Identificar y caracterizar potencial probiótico las cepas de bacterias básico de las cepas de ácido lácticas aisladas de bacterias ácido lácticas alimentos. aisladas e identificadas.

Determinar la viabilidad Evaluar las propiedades fisicoquímicas y de las cepas con organolépticas de los potencial probiótico jugos de fruta seleccionadas, en tres adicionados con cultivos jugos de fruta microbianos. estandarizados: fresa (Fragaria vesca), mango (Mangifera indica) y lulo (Solanum quitense).

METODOLOGÍA

Alimento

Fermentación

Siembra en Agar MRS.

Tinción de Gram y catalasa

Prueba API 50CHL

CARACTERIZACIÓN E IDENTIFICACIÓN

PCR

Secuenciación

METODOLOGÍA EVALUACIÓN IN VITRO

Resistencia a pH ácido Sensibilidad a Antibióticos

Actividad antimicrobiana

Resistencia a sales biliares Adherencia a células intestinales

Cepa referencia: L. acidophilus ATCC 4356

Cálculo del potencial probiótico

METODOLOGÍA Característica probiótica

Indicación Sensible Tolerancia a pH bajo Resistente Sensible Tolerancia a sales biliares Resistente Sensible Susceptibilidad a antibióticos Resistente <3,0mm Actividad antimicrobiana 3,0-6,0mm >6,0 mm Adherencia a células + intestinales ++ Potencial probiótico total Potencial probiótico (%) = Puntaje observado para cada cepa Puntaje máximo posible x 100%

Puntaje 0 1 0 1 0 1 1 2 3 0 1 2

Puntaje máximo posible 1 1 1 3

2 8 Tambekar y Bhutada (2010)

METODOLOGÍA

Estandarización de jugos.

Preparación del cultivo.

Evaluación por un mes.

• pH. • °Brix. • Acidez.

• Cultivo de entre 107 a 109 UFC/mL.

• Microbiológico.

VIABILIDAD DE BAL SELECCIONADAS EN JUGOS DE FRUTA

METODOLOGÍA

COMPORTAMIENTO FÍSICO-QUÍMICO

ANÁLISIS SENSORIAL

• Pruebas duo-trio (Escala hedónica). • Sabor, olor, apariencia.

Aislamiento e identificación

RESULTADOS No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Fuente de Morfología aislamiento microscópica Queso fresco Bacilos Suero costeño Cocos Suero costeño Bacilos Achiras Bacilos Repollo Bacilos Brócoli Cocos Coliflor Bacilos Totumo Bacilos Arroz Bacilos Queso Paipa Cocos Queso crema Bacilos Harina de maíz Bacilos Tomate de árbol Bacilos Galleta de cuca Bacilos Almojábana Bacilos Pera común Bacilos Manzana común Bacilos Sidra Bacilos Papa criolla Bacilos Guanábana

Levaduras

Gram

Crecimiento aeróbico en agar MRS, 37°C, 24H

Catalasa

(+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+)

Colonias blancas, cremosas y pequeñas. Colonias blancas, translúcidas y muy pequeñas. Colonias transparentes, translúcidas y muy pequeñas. Colonias blancas, cremosas y muy pequeñas. Colonias blancas, translúcidas y pequeñas. Colonias blancas, translúcidas y muy pequeñas. Colonias blancas, cremosas y muy pequeñas. Colonias blancas, cremosas y pequeñas. Colonias transparentes, translúcidas y muy pequeñas. Colonias, blancas, traslúcidas, pastosas y pequeñas. Colonias blancas cremosas y grandes. Colonias blancas, cremosas y pequeñas. Colonias beige, cremosas y muy pequeñas. Colonias blancas, translúcidas y muy pequeñas. Colonias transparentes, cremosas y muy pequeñas. Colonias, blancas, traslúcidas, pastosas y pequeñas. Colonias blancas, cremosas y muy pequeñas. Colonias blancas, cremosas y muy pequeñas. Colonias blancas, cremosas y muy pequeñas. Colonias blancas, cremosas, muy grandes, con bordes dentados

(-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (+) (-) (-) (-) (-) (-)

(+)

Caracterización e identificación

RESULTADOS Nº

Fuente

Identificación bioquímica por API 50CHL y API 50CHB Biomereux®

Identificación Molecular por secuenciación de fragmento 16S

Coliflor

L. plantarum 98,7%

L. plantarum 99,0%

Quesillo

L. brevis 96,5%

L. fermentum 97,0%

Harina de maíz

L. delbrueckii 97,3%

L. plantarum 99,0%

Pera

L. brevis 99,9%

L. fermentum 97,0%

Amplímero entre 400 y 500 bp Electroforesis en gel de agarosa al 3% para fragmentos de DNA de las cepas en estudio. Marcador de peso molecular: Hyperladder IV de Bioline® 1001000pb.

Resistencia a pH ácido

RESULTADOS Ls X Li

Mayor resistencia en un tiempo de cuatro horas: la cepa No. 7 (L. plantarum), la No. 12 (L. plantarum) y la No. 16 (L. fermentum). La cepa No. 11 (L. fermentum disminuyó significativamente casi 4,0 ciclos logarítmicos.

♦: Cepa No. 7 (L. plantarum). ♦: Cepa No. 11 (L. fermentum). ♦: Cepa No. 12 (L. plantarum) ♦: Cepa No.16 (L. fermentum). ♦: L. acidophilus ATCC 4356

R= UFC/mlpH6,5 tiempo 0*100 UFC/mlpH 2 tiempo 4 Yan, et al. (2010)

Cepas

Resistencia a pH 2,0

Cepa No. 7 (L. plantarum)

76,8%

Cepa No. 11 (L. fermentum)

68,7%

Cepa No. 12 (L. plantarum)

89,7%

Cepa No. 16 (L. fermentum)

81,8%

L. acidophilus ATCC 4356

37,8%

Resistencia a antibióticos

RESULTADOS

Porcentaje

Resultados antibiograma 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

12 Cepas

Ref

Antibiótico Amox/ A clavulónico Sensibilidad porAmp/ encima del 78,0% sulbctam Ampicilina Cafazolina Ceftriaxona Sensibilidad a los antibióticos con sus Clindamicina diferentes mecanismos de acción. Cloramfenicol Pared, membrana, de Daptomicina síntesis Eritromicina proteínas. Gentamicina Imipenem Levofloxacina Linezolid En general, los resultados obtenidos Meropenem indican que las cinco bacterias Moxifloxacina evaluadas presentaron un alto Oxacilina Penicilina porcentaje de sensibilidad antibiótica. Rifampicina Synercid Tetraciclina Trimet/ sulfa Vancomicina

Sensibilidad Resistencia

Inhibiciรณn de patรณgenos

RESULTADOS Patรณgeno Cepas

Cepa No. 7 (L. plantarum)

Cepa No. 11 Cepa No. 16 Cepa No. 12 (L. (L. (L. plantarum) fermentum) fermentum)

L. acidophilus ATCC 4356

Listeria monocytogenes

Listeria innocua

+++

Salmonella enteritidis

+++

Escherichia coli

+++

Shiguella sonnei

+++

Staphylococcus aureus

+++

+: halo <3mm; ++: halo 3-6mm; +++: halo >6mm

Las cepas No. 7,12 y 16; pueden inhibir efectivamente el crecimiento de diferentes tipos de patรณgenos tanto Gram positivos cรณmo Gram negativos.

Inhibición de patógenos

RESULTADOS Patógeno Cepas

Cepa No. 7 (L. plantarum)

Cepa No. 11 Cepa No. 16 Cepa No. 12 (L. (L. (L. plantarum) fermentum) fermentum)

L. acidophilus ATCC 4356

Listeria monocytogenes

Listeria innocua

+++

Salmonella enteritidis

+++

Escherichia coli

+++

Shiguella sonnei

+++

Staphylococcus aureus

+++

+: halo <3mm; ++: halo 3-6mm; +++: halo >6mm

A nivel biológico, además de la producción de bacteriocinas, la exclusión competitiva y la disminución del pH, podrían también estar involucradas en los procesos de antagonismo (Wohlgemuth et al., 2010).

Autores como Yan et al. (2010), Klayraung et al. (2010), Lin et al. (2007), Martín et al. (2009) y Annuk et al., (2003), reportan que bacterias como L. fermentum y L. plantarum poseen una actividad antagónica.

En el caso de L. plantarum, se ha reportado que esta especie produce plantaricina teniendo un gran espectro de inhibición frente a otros microorganismos. (Wohlgemuth et al., 2010; Monroy et al., 2009).

Resistencia a sales biliares

RESULTADOS 10,0

Log UFC/ml

9,0 8,0

Ls X

7,0

6,0

Las cepas se mantuvieron dentro de los límites críticos establecidos, la cepa con mayor capacidad de adaptación y resistencia fue la No.7, seguida esta vez por la No.12, la No.16, la de referencia y la No.11 produjeron las mayores reducciones sin estar por encima de los dos ciclos logarítmicos. Porcentajes de resistencia por encima del 70,0%.

5,0 4,0 0

2 Tiempo (horas)

♦: Cepa No. 7 (L. plantarum). ♦: Cepa No. 11 (L. fermentum). ♦: Cepa No. 12 (L. plantarum) ♦: Cepa No.16 (L. fermentum). ♦: L. acidophilus ATCC 4356

R= UFC/mlsales tiempo 0*100 UFC/mlsales tiempo 4 Yan, et al. (2010)

Cepas

Resistencia al 2,0% de sales biliares por 4 horas

Cepa No. 7 (L. plantarum)

86,0%

Cepa No. 11 (L. fermentum)

72,0%

Cepa No. 12 (L. plantarum)

81,0%

Cepa No. 16 (L. fermentum)

79,0%

L. acidophilus ATCC 4356

77,0%

Adherencia a tejido intestinal

RESULTADOS Control negativo

Microfotografías (40x) de células de mucosa intestinal (Mucin Tissue-Trol SIGMA-ALDRICH)

Control Positivo

Microfotografías (100x) de células de mucosa intestinal (Mucin Tissue-Trol SIGMA-ALDRICH) más adición de células de E. coli.

12L.L. L.plantarum plantarum Cepa 16 L. acidophilus 7Referencia 11 L. fermentum Cepa fermentum ATCC 4356

Microfotografías (100x) de células de mucosa intestinal (Mucin Tissue-Trol SIGMA-ALDRICH) más adición de Lactobacilos

Adherencia a tejido intestinal

RESULTADOS fermentum es y laL. cepa No.7 (L. plantarum) encontrada lacomúnmente cepa No.12 (L. plantarum) en el un nivel tracto de presentaron gastrointestinal adherencia alto, similar de a lo animales (Lin al., 2007). observado enetlos controles positivos.

Control negativo Microfotografías (40x) de células de mucosa intestinal (Mucin Tissue-Trol SIGMA-ALDRICH)

Cepa 7

Microfotografías (100x) de células de mucosa intestinal (Mucin Tissue-Trol SIGMA-ALDRICH) más adición de L. plantarum

Jin et favorecer al. (2001), Podrían los encontraron cepas de procesos deL. fermentum y L. plantarum antagonismo celular con alta capacidad frente a patógenos ade adhesión adelcélulastracto de la nivel mucosa intestinal animal. gastrointestinal.

Control Positivo Microfotografías (100x) de células de mucosa intestinal (Mucin Tissue-Trol SIGMA-ALDRICH) más adición de células de E. coli.

Cepa 12 Microfotografías (100x) de células de mucosa intestinal (Mucin Tissue-Trol SIGMA-ALDRICH) más adición de L. plantarum

Resumen potencial In vitro

RESULTADOS pH1%

Antibióticos % sensibilidad

Inhibición2

Sales Potencial Biliares3 Adherencia4 probiótico % %

Cepas

Especie

L. Plantarum

77,0

78,0

16 +

86,0

100,0

L. Fermentum

69,0

83,0

12 +

72,0

50,0

L. Plantarum

90,0

87,0

13 +

81,0

87,5

L. Fermentum

82,0

83,0

13 +

79,0

75,0

Referencia

L. acidophilus ATCC 4356

38,0

87,0

11 +

77,0

37,5

1 Porcentaje de resistencia de las cepas a un pH de 2.0 2 Número de cruces que presenta de acuerdo a los diámetros en halos de inhibición 3 Porcentaje de resistencia a una concentración de sales biliares del 2% 4 Capacidad de adhesión de las cepas (++ comparable con el control negativo, + se presenta adhesión pero no es comparable, - no se presenta adhesión)

Requerimientos FAO

RESULTADOS Identificación taxonómica Resistencia a la acidez gástrica

Resistencia a los ácidos biliares Adhesión a células intestinales Actividad antimicrobiana

Determinación de la resistencia a antibióticos

RESULTADOS

Identificaciรณn Potencial In vitro

Aislamiento

Cepa con potencial probiรณtico. L. plantarum

JUGOS CON POTENCIAL PROBIร TICO

Evaluación microbiológica

11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

Concentraciones celulares por encima de 8,0 Log UFC/mL. Disminución de 2 ciclos log en 30 días. La viabilidad de la cepa durante los ensayos, sugiere que esta cepa podría ser aplicada para el desarrollo de bebidas de fruta funcionales. 0

Tiempo (días)

●: Fresa. ●: Lulo. ●: Mango, con adición de L. plantarum

Log UFC/ml

RESULTADOS

11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 0

Tiempo (días)

●: Fresa. ●: Lulo. ●: Mango, control negativo

Evaluación microbiológica

11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

El uso de frutas y vegetales, podrían llegar a tener efecto protector para el microorganismo (Pereira et al., 2011). 0

Tiempo (días)

●: Fresa. ●: Lulo. ●: Mango, con adición de L. plantarum

Log UFC/ml

RESULTADOS

11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 0

Tiempo (días)

●: Fresa. ●: Lulo. ●: Mango, control negativo

Acidez

RESULTADOS 1,40

Lulo + BAL 1,20

Lulo ctrl

Aumento significativo (p<0,05) en los tres tipos de jugos evaluados.

% Acidez

1,00

0,80

Fresa + BAL Fresa ctrl

0,60

Mango +BAL

Mango ctrl

0,40

0,20

0,00 0

tiempo en dĂas

Los jugos inoculados con la BAL presentaron valores de acidez significativamente mayores que los controles .

RESULTADOS 4,50

4,50

Mango ctrl

4,00

3,50

Fresa ctrl Fresa + BAL

4,00

Mango +BAL

3,00

3,50 3,00

2,50

2,00 0

2,00 30 Tiempo en días

Tiempo en días

4,50

4,00

Lulo ctrl Lulo + BAL

3,50 3,00

Relación entre acidez y pH fue inversamente proporcional en todos los casos, como era de esperarse. En todos los jugos se observó un decrecimiento significativo (p<0,05). Los jugos inoculados con la BAL presentaron un pH significativamente menor (p<0,05) que los controles.

2,50

2,00 0

30 Tiempo en días

°Brix

RESULTADOS 14,00 13,00 12,00

°BRIX

11,00

Mango + BAL Mango ctrl

La evaluación en el tiempo de los grados Brix mostró un descenso significativo para esta variable en los tres jugos.

10,00 9,00

Fresa + BAL Fresa ctrl

8,00 7,00

Lulo + BAL Lulo ctrl

6,00 5,00

tiempo en días

no se presentaron diferencias significativas entre los jugos adicionados con la BAL y los jugos control

Pruebas sensoriales

RESULTADOS 80%

54%

44%

41%

38%

47%

56%

Lulo

Mango

Fresa

La aceptabilidad de los jugos adicionados con L. plantarum en cuanto a sus atributos sensoriales, es comparable con los resultados obtenidos con los controles.

60% 40% 20% 0% muy buena buena malo muy malo

54% 38% 7% 0%

44% 47% 7% 1% Jugos control

41% 56% 4% 0%

Los resultados obtenidos sugieren que las tres frutas trabajadas podrían ser una buena opción para el desarrollo de bebidas funcionales ya que sus características sensoriales no se afectaron significativamente con la adición de la BAL.

100% 80% Porcentaje

Porcentaje

100%

47%

44%

47%

44%

Lulo

Mango

42%

60% 40% 20% 0% muy buena buena malo muy malo

47% 44% 47% 44% 5% 7% 1% 4% Jugos con adición de BAL

37%

Fresa

42% 37% 19% 2%

CONCLUSIONES •

•

Los procesos fermentativos y deteriorativos de los alimentos, pueden crear las condiciones necesarias para el crecimiento y desarrollo de microorganismos ácido lácticos con características importantes de tolerancia y adaptabilidad a medios hostiles, lo que hace que los microorganismos que se recuperen de estos procesos, tengan propiedades tecnológicas para ser usadas como eventuales aditivos en la industria de alimentos funcionales. Con las pruebas in vitro realizadas se comprobó que cuatro de ellas, pertenecientes a las especies L. plantarum y L. fermentum, cumplieron con los requisitos establecidos por la FAO para la identificación de bacterias con potencial probiótico. A través de los ensayos in vitro se comprobó que todas las cepas nativas evaluadas presentaron un porcentaje de resistencia a pH 2,0 por encima del 68,7%, un porcentaje de resistencia a sales biliares (2,0%) por encima del 72,0% y una sensibilidad antibiótica superior al 78,0%.

CONCLUSIONES •

•

Con la cepa de L. plantarum, se logró comprobar que su concentración celular no se afectó significativamente por las condiciones extrínsecas e intrínsecas de los jugos evaluados y se mantuvo viable en concentraciones por encima de 108 UFC/mL, después de 30 días de almacenamiento a 8,0ºC. El uso de frutas tropicales como matrices en la elaboración de jugos adicionados con bacterias ácido lácticas permite se enmascaren los sabores y olores característicos de este tipo de productos favoreciendo la aceptabilidad por parte de consumidores potenciales. Los resultados obtenidos representan una gran oportunidad para el desarrollo a futuro de alimentos probióticos a partir de medios no lácticos para la producción de alimentos funcionales.

RECOMENDACIONES Y PERSPECTIVAS

Ensayos in vivo.

Evaluación tecnológica. Nuevas matrices.

• Dosis efectivas. • Efectos sobre la salud.

• Producción. • Conservación. • Estabilidad. • Efectos simbióticos. • Caracterización sustancias antimicrobianas. • Perfiles de transferencia de resistencia

• Diferentes Jugos. • Otros productos.

DETERMINACIÓN DE ESPECIES DE BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS CON POTENCIAL PROBIÓTICO PRESENTES EN EL SUERO COSTEÑO Yudtanduly Acuña Monsalve Ingeniera de Producción Biotecnológica M.Sc. Diseño y Gestión de Procesos

San Juan de Pasto, Marzo 18 de 2014

PROYECTO DE INVESTIGACIÓN Código: ING-35-2007, Fondo Patrimonial Especial DETERMINACION DEL POTENCIAL PROBIOTICO DE CEPAS DE BACTERIAS ACIDO LACTICAS AISLADAS DE SUERO COSTEÑO, ESTABLECIENDO SUS PRINCIPALES CARACTERISTICAS FISIOLOGICAS IN VITRO

Código: ING-59-2008, Fondo Patrimonial Especial DETERMINACIÓN DE LAS ESPECIES DE BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS CON POTENCIAL PROBIÓTICO PRESENTES EN EL SUERO COSTEÑO Contacto: acuna.yuta@uniagraria.edu.co

Línea de Investigación: Funcionales Grupo de Investigación: Procesos Agroindustriales

Contacto: acuna.yuta@uniagraria.edu.co

INTRODUCCIÓN Suero costeño  Lácteo artesanal  Costa Atlántica  Fuente importante BAL

Bacterias ácido lácticas BAL  Generan ácido láctico  Productos lácteos: yogurt, quesos madurados  Inhiben crecimiento de patógenos

Microorganismos probióticos Efectos benéficos Probióticos

Contacto: acuna.yuta@uniagraria.edu.co

 Lactobacillus, Bifidobacterium, Enterococcus, Streptococcus, Lactococcus, Leuconostoc y Pediococcus

PROBIOTICOS!

“[...] microorganismos vivos que, cuando se administran en cantidades apropiadas, confieren al huésped un beneficio para la salud [...]”

Consulta de Expertos FAO/OMS sobre Evaluación de las Propiedades Saludables y Nutricionales de los Probióticos en los Alimentos, incluida la Leche en Polvo con Bacterias Vivas del Ácido Láctico, 1-4 de octubre de 2001

Contacto: acuna.yuta@uniagraria.edu.co

CARACTERÍSTICAS DE RESISTENCIA DE LOS MICROORGANISMOS PROBIÓTICOS Criterios para selección de probióticos in vitro Identificación de cepas

Tolerancia a condiciones gastrointestinales

Adherencia

-Género y especie - Valores bajos - Mucosa -Secuenciación pH intestinal -ADN/ADN - concentración de sales - Líneas celulares -PFGE (Cepas) biliares

Funcionalidad Ensayos eficacia in vivo Contacto: acuna.yuta@uniagraria.edu.co

In vitro animales

Inocuidad

Etiquetado, contenido, viabilidad bacterias

Efecto patógenos -reducir adhesión superficies -sustancias antimicrobianas

INTRODUCCIÓN Beneficios de los probióticos en la salud Género Lactobacillus, degrada parcialmente la lactosa, lo cual favorece que haya mayor tolerancia a los lácteos (Parvez et al., 2006)

Lactobacillus rhamnosus GG, L. reuteri, L. acidophilus, S. boulardii y B. lactis, prevención y tratamiento de pacientes con diarrea (Castro y Rovetto, 2006)

Intolerancia a lactosa

Combatir la diarrea

Enfermedades inflamatorias del intestino Combinación de Lactobacillus spp, S.boulardii, Streptococcus spp y Bifidobacterium spp, mejoran síntomas y recaídas enfermedad de Crhon y colitis ulcerativa (Hung-Chih, 2005) Contacto: acuna.yuta@uniagraria.edu.co

INTRODUCCIÓN Cáncer de colon

Lactobacillus salivarus 118 podría disminuir la prevalencia de cáncer de colon asociado a colitis. Viabilidad y dosis de los probióticos serían factores fundamentales en su efecto sobre el cáncer colorectal (Quera et.al., 2005).

E. thermophilus, Bifidobacterium, L. acidophilus, Lactobacillus plantarum, L. casei, L. delbrueckii bulgaricus, y E. faecum tienen efecto terapéutico, reduciendo el riesgo de sangrado (Parvez et al., 2006) Enfermedad hepática

Pacientes ancianos hipertensos consumieron leche fermentada con Lactobacillus helveticus y S. cerevisiae y se obtuvieron reducciones en la presión arterial sistólica y diastólica (Korhonen y Pihlanto, 2006). Contacto: acuna.yuta@uniagraria.edu.co

Hipertensión

REGULACIÓN EN COLOMBIA Resolución 333/2011 Establecen las condiciones y requisitos que debe cumplir el rotulado nutricional de alimentos envasados nacionales e importados con el fin de proporcionar al consumidor información nutricional CLARA, COMPRENSIBLE. Evitando confusión o engaño y que permita la ELECCION INFORMADA.

¿?

Contacto: acuna.yuta@uniagraria.edu.co

REGULACIÓN EN COLOMBIA Probióticos, funciones digestivas y sistema inmune. Las declaraciones de propiedades de salud relacionando el consumo de probióticos con una mejor función digestiva, pueden ser efectuadas en el rótulo si cumplen los siguientes requisitos: Estar vivo, no ser patógeno y su medio natural es el tracto digestivo humano.

Ser capaz de sobrevivir en el tracto intestinal, es decir, ser resistente a los jugos gástricos y los ácidos biliares.

Tener la capacidad de adherirse a la mucosa intestinal.

Tener la capacidad de colonizar el intestino.

Tener la capacidad de sobrevivir a lo largo de la vida útil del producto en que se reproduzca.

Contacto: acuna.yuta@uniagraria.edu.co

REGULACIÓN EN COLOMBIA El alimento debe contener un número mayor o igual de bacterias viables de origen probiótico a 1 x 106 UFC/g en el producto terminado hasta el final de la vida útil. c) La declaración debe indicar que el consumo adecuado y regular de microorganismos probióticos no es el único factor para mejorar las funciones digestivas y que existen otros factores adicionales a

considerar como el ejercicio físico y el tipo de dieta.

Contacto: acuna.yuta@uniagraria.edu.co

MODELOS DE DECLARACION

Una dieta saludable y el consumo

Una adecuada alimentación y un

regular de alimentos con

consumo regular de alimentos con

microorganismos probióticos,

puede ayudar a reducir las

puede ayudar a normalizar las

condiciones ácidas del estómago,

funciones digestivas, regenerar la

contribuyendo a la formación de

flora intestinal y favorecer las

una capa protectora.

defensas naturales.

Una dieta saludable y el consumo regular de

alimentos con microorganismos probióticos puede ayudar a normalizar las funciones digestivas, regenerar la flora intestinal y disminuir el

crecimiento de bacterias causantes de las infecciones del colon.

Contacto: acuna.yuta@uniagraria.edu.co

MODELOS DE DECLARACION

Contacto: acuna.yuta@uniagraria.edu.co

INTRODUCCIร N Mercado mundial de probiรณticos

http://www.bccresearch.com/report/FOD035B.html Contacto: acuna.yuta@uniagraria.edu.co

INTRODUCCIÓN Productos probióticos en el mercado mundial Nombre comercial Actimel

Descripción

Fabricante

Bebida probiotica (yogurt) con cultivo de L. casei Imunitass ®

Danone, Francia

Activia

Crema de yogur contiene Bifidus ActiRegularis ®

Danone, Francia

Gefilus

Amplio rango de productos LGG

Valio, Finnlandia

Hellus

Productos lácteos que contienen Lactobacillus fermentum ME-3

Jovita Probiotisch

Mezcla de cereales, frutas y yogur probiótico

Pohadka

Yogur, leches con cultivos probióticos

ProViva

Bebida refrescante de frutas y yogur en diferentes sabores que contienen Lactobacillus plantarum

Rela

Yogur, leche y jugos con L. reuteri

Revital Active

Yogur y bebidas con probióticos

Snack Fibra

Snacks, barras con fibras naturales, minerales y vitaminas Gama de productos a base de soja y avena, incluyen bebidas refrescantes, yogur con probióticos Kefir con seis probióticos Bebida Láctea que contiene Lactobacillus casei

SOYosa

Soytreat Yakult Yosa

Vitality Vifit Fuente: Siró et al. 2008 Contacto: acuna.yuta@uniagraria.edu.co

Yogur de avena con sabor a frutas y bayas con probióticos (Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium lactis) Yogur con probióticos, probióticos y omega 3 Yogur con LGG, vitaminas y minerales

Tallinna Piimatööstuse AS, Estonia H&J Bruggen, Alemania Valašské Mezirňčí Dairy, Republica Checa Skáne mejerier, Suecia

Ingman Foods, Finlandia Olma, Republica Checa Celigüeta, España Bioferme, Finlandia

Lifeway, USA Shirota Yakult, Japon Bioferme, Finlandia

Müller, Alemania Campina, Netherlands

INTRODUCCIÓN Productos probióticos en mercado Colombiano Nombre Comercial Regeneris Yogurt

Yox con Defensis Regeneris Cuchareable Activia Actimel

Vaalia

Descripción del Producto Cultivos probióticos (Bifidibacterium lactis BB12) y fibra soluble. Bebida lactea funcional y semidescremada que mezcla dos cultivos, Lactobacillus gasseri y Lactobacillus coryniformis los cuales refuerzan el sistema de defensas. Yogurt cremoso sin grasa ni colesterol. Endulzado con fructosa y edulcorante. Enriquecido con Bifidobacterium lactis. Esta avalado por la sociedad de gastroenterología. Fermento exclusivo de Bifidus ActiRegularis (BifidoBacterium animalis), ayuda a regular el tránsito intestinal en 14 días. Fermento de Lactobacillus casei que ayuda a reforzar las defensas. Yogurt entero con dulce, contiene Bifidobacterium BB-12 y Lactobacillus acidophilus que contribuyen a desarrollar flora intestinal y a mantener un correcto equilibrio de las funciones digestivas, también esta adicionado con fibras naturales Prebióticas que estimulan el desarrollo de bacterias benéficas.

Fuente: 1 www.alpina.com; 2 www.danonw.com; Contacto: acuna.yuta@uniagraria.edu.co

www.parmalat.com.co

Fabricante ALPINA1, Colombia

ALPINA, Colombia

ALPINA, Colombia DANONE2 DANONE

PARMALAT3

PROBLEMATICA DE LA INVESTIGACIÓN Beneficios en la salud

Caracterizar potenciales probióticos

Investigación

DIETA & SALUD Disminuir costos

Probióticos

Alimentos funcionales

Generar interés industrias

ALIMENTO PROBIÓTICO Contacto: acuna.yuta@uniagraria.edu.co

META El Capitulo II Objetivos de Salud del Milenio en su objetivo I que se refiere a la reducción del hambre y la pobreza, enuncia que los países que presentan las situaciones más críticas en materia de alimentación podrían reducir a la mitad el porcentaje de la población que padece hambre si disminuyeran moderadamente las desigualdades de acceso a los alimentos (Naciones Unidas, 2005).

OBJETIVO Seleccionar e identificar bacterias ácido lácticas (BAL) con potencial probiótico aisladas del suero costeño.

Contacto: acuna.yuta@uniagraria.edu.co

METODOLOGÍA Identificación de género y especie de las bacterias ácido lácticas en estudio. Identificación molecular

-Extracción de ADN

Identificación bioquímica

-Amplificación por PCR del gen que codifica la subunidad 16S ribosomal

Secuenciación

-API®50CHL

-Macrogen ubicado en Corea

-API 20 STREP

-Análisis bioinformático

Base de datos - genero y especie -% identidad y concordancia

Contacto: acuna.yuta@uniagraria.edu.co

METODOLOGÍA Identificación molecular

Extracción

• kit UltraClean™ Microbial DNA Isolation (Mo Bio Laboratories) • Cuantificador de ADN (Eppendorf) • Dilución ,198 μL de agua ultrapura + 2 μL de ADN teniendo en cuenta la relación de la absorbancia 260 y 280 nm

Amplificación

Contacto: acuna.yuta@uniagraria.edu.co

• 27 F: 5`- GAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG-3` • 787 R: 5´CTA CCA GGG TAT CTA AT- 3´ Condiciones PCR • Primer 0,3 µM -MgCl2 2 mM • dNTPs 200 µM -Taq polimerasa 1.5 U • Buffer 10 X Programa • 30 ciclos de 30s a 94° C, 30s a 55° C

METODOLOGÍA Análisis bioinformático

Alineamiento con algoritmo BLAST

Edición manual programa Chromas Lite versión 2.01 (Technelysium, Queensland, Australia) Contacto: acuna.yuta@uniagraria.edu.co

-Base de datos de secuencias de nucleótidos GenBank

El control de calidad comparó las secuencias obtenidas con las almacenadas en la base de datos GenBank mostrando una similitud del 100%,

RESULTADOS & DISCUSIÓN

Bioquímica 26 cepas identificadas

Identificación de género y especie de las bacterias ácido lácticas

70,6% - 99,9% Molecular 26 cepas identificadas 42% coincidieron las dos técnicas

Siete cepas Potencial probiótico Contacto: acuna.yuta@uniagraria.edu.co

IDENTIFICACIÓN BIOQUIMICA

26 Cepas BAL pH 2,0 y sales biliares 0,3 % se identificaron

Morfología microscópica en cocos o bacilos Gram positivos, no móviles y no formación de esporas

API®50CHL y API-20Estrep

Contacto: acuna.yuta@uniagraria.edu.co

19 cepas seleccionadas

IDENTIFICACIÓN MOLECULAR

Potencial probiótico

7 cepas

inicialmente se realizó la extracción ADN, para luego amplificar éste mediante iniciadores universales de la región 16S y proceder a secuenciar cada muestra por ambas cadenas forward y reverse. Así mismo se realizó el análisis bioinformático de cada una de las muestras secuenciadas Contacto: acuna.yuta@uniagraria.edu.co

Concentración µg/µL Lactobacillus fermentun 11 0,154 Lactobacillus fermentun 72 0,25 Lactobacillus fermentun 75 0,184 Lactococcus lactis sp lactis 1-1 0,54 Lactobacillus fermentun 73 0,172 Enterococcus faecium 381 0,317 Enterococcus faecium 02 1,128 Cepa

Relación 260/280 1,83 1,78 1,86 1,92 1,87 1,98 190

Cromatograma de la secuenciación del iniciador 27F cepa L. fermentum 11

Contacto: acuna.yuta@uniagraria.edu.co

Cepa L. fermentum 11

En la primera edición del cromatograma obtenido para el iniciador 27F se logró depurar 699 pb y 730 pb para el 787R. Al realizar la secuencia consenso las primeras 97 pb de la secuencia del 787R se adicionan al inicio de la secuencia del 27F ya que están incluidas en la secuencia que se logró depurar. Finalmente se obtuvo una secuencia final con 795 pb. La comparación con las secuencias del GenBank presenta alineamiento con Lactobacillus fermentum que reporta secuencia completa del gen 16S, este resultado coincide con la caracterización API que se realizó anteriormente.

Cromatograma de la secuenciación del iniciador 27F cepa L. fermentum 11 Contacto: acuna.yuta@uniagraria.edu.co

Secuencia depurada de la cepa L. fermentum 11 TCAGGATGAACGCCGGCGGTGTGCCTAATACATGCAAGTCGAACGCGTTGGCCCAATTGATTGATGGTGC TTGCACCTGATTGATTTTGGTCGCCAACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGTAACCTGCCCAG AAGCGGGGGACAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACGTTGTTCGCATGAACAACGCTTA AAAGATGGCTTCTCGCTATCACTTCTGGATGGACCTGCGGTGCATTAGCTTGTTGGTGGGGTAACGGCCT ACCAAGGCGATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACAATGGGACTGAGACACGGCCCATA CTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGGCGCAAGCCTGATGGAGCAACACCGCGTG AGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGTTAAAGAAGAACACGTATGAGAGTAACTGTTCATA CGTTGACGGTATTTAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCA AGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGAGAGTGCAGGCGGTTTTCTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCG GCTTAACCGGAGAAGTGCATCGGAAACTGGATAACTTGAGTGCAGAAGAGGGTAGTGGAACTCCATGTG TAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTACCTGGTCTGCAACTGAC GCTGAGACTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAG

795 Pb Contacto: acuna.yuta@uniagraria.edu.co

Cepa L. fermentum 72 En la primera edición del cromatograma obtenido para el iniciador 27F se logró depurar 687 pb y 701 pb para el iniciador 787R. Al realizar la secuencia consenso las primeras 91 pb de la secuencia del 787R se adicionan al inicio de la secuencia del 27F ya que están incluidas en la secuencia que se logró depurar. Finalmente se obtuvo una secuencia final con 778 pb. La comparación con las secuencias del GenBank presenta alineamiento con Lactobacillus fermentum que reporta secuencia completa del gen 16S, este resultado coincide con la caracterización API que se realizó anteriormente.

Cromatograma de la secuenciación del iniciador 27F cepa L. fermentum 72 Contacto: acuna.yuta@uniagraria.edu.co

Cepa Lactococcus lactis ssp lactis 1-1 (API) En la primera edición del cromatograma obtenido para el iniciador 27F se logró depurar 752 pb y 742 pb para el iniciador 787R. Al realizar la secuencia consenso las primeras 47 pb de la secuencia del 787R se adicionan al inicio de la secuencia del 27F ya que están incluidas en la secuencia que se logró depurar. Finalmente se obtuvo una secuencia final con 799 pb. La comparación con las secuencias del GenBank presenta alineamiento con Lactobacillus fermentum que reporta secuencia completa del gen 16S este resultado no coincide con la caracterización API que se realizó anteriormente.

Cromatograma de la secuenciación del iniciador 27F cepa Lactococcus lactis ssp lactis 1-1 Contacto: acuna.yuta@uniagraria.edu.co

RESULTADOS MORFOLOGIA IDENTIFICACION

Bacilos Bacilos

Bacilos Bacilos Bacilos Cocos

Cocos

% DE CONCORDANCIA

% DE IDENTIDAD

TAMAÃ&#x2018;O SECUENCIA (pb)

100

795

100

778

100

787

Lactobacillus fermentun 11 Lactobacillus fermentun 72 Lactobacillus fermentun 75 Lactobacillus fermentun 1-1 Lactobacillus fermentun 73 Enterococcus faecium 381 Enterococcus faecium 02

Contacto: acuna.yuta@uniagraria.edu.co

100

799

100

710

100

414

100

765

NUMERO DE ACCESO GenBank

IDENTIFICACION API

Lactobacillus fermentum 11 Lactobacillus AF302116.1 fermentum 72 Lactobacillus AP008937.1 fermentum 75 Lactococcus AF302116.1 lactis ssp lactis 1-1 Lactobacillus AF302116.1 rhamnosus 73 Enterococcus DQ672262.1 faecalis 381 Enterococcus AY675247.1 faecium 02 AF302116.1

% DE IDENTIDAD

89.6 99,9

99,5 85

99,9 89,9 95.2

CONCLUSIONES De los 53 aislamientos evaluados fueron preseleccionados 26 por tolerar condiciones hostiles de pH 2.0 y 0.3 % sales biliares, y 7 aislamientos se seleccionaron como potenciales probióticos debido a la sensibilidad que estos presentaban a antibióticos de importancia epidemiológica. El antibiograma realizado a las 26 cepas preseleccionadas, demostró que algunas de estas cepas identificadas bioquímicamente como Enterococcus presentaron resistencia a vancomicina considerando este resultado de importancia clínica debido a que puede generar resistencia en la microbiota del hospedero, por esta razón no fueron seleccionadas para continuar con su caracterización como potenciales probióticos. .

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CONCLUSIONES Se identificaron 26 cepas por API así como por secuenciación parcial del gen 16S, de las cuales 11 cepas coincidieron en género y especie con las dos técnicas representando el 42% de las cepas identificadas, estos resultados confirman la importancia de la técnica a utilizar al caracterizar microorganismos, ya que el perfil bioquímico no es suficiente para la identificación de bacterias acido lácticas. La utilización de técnicas moleculares como la secuenciación de la subunidad del 16S constituye una herramienta de gran importancia para la identificación de bacterias acido lácticas debido a que es un método identificación con una alta especificidad.

Contacto: acuna.yuta@uniagraria.edu.co