Productos Naturales promotores del crecimiento vegetal como estimulantes de micorrizas arbusculares Hongos micorrícicos en plantas medicinales usados por comunidades Mapuches Desamargo del lupino Análisis molecular en hechos delictivos ambientales Snack de charqui de caballo con distintos aditivos Arándanos en alta densidad como alternativa de primeros años Efectos del programa de recuperación de suelo Digestión ruminal de proteínas Hidrolizado de pescado en la concentración de polifenoles en plántulas Toxicidad por aluminio en arándanos
Dirección: Dr. Alejandro Velásquez B. Comité Editor: Dr. Gabriel Vivallo P. Dr. Rodrigo Arias I. Dr. Marcelo Toneatti B. Dra. Claudia Castillo R. Dra. Ximena Araneda D. Dra. Gina Leonelli C. Dr. Jaime Solano S. Dr. Marcelo Rodríguez B. Dr. Orlando Andrade V. Recepción de trabajos, revisión y 1ª selección: MSc. Ricardo Tighe N. Ing. Agr. Armin Cuevas R. Diseño, diagramación y edición: Ing. Agr. Armin Cuevas R. Publicación electrónica y página web: Ing. Agr. Armin Cuevas R. Secretaria: Srta. Rocío Burgos Universidad Católica de Temuco, Escuela de Agronomía. Rudecindo Ortega 02950, Edificio Cincuentenario, 3er piso. Fono: 45-205521, 45-205534. Edición Digital Chile, Temuco, Diciembre 2012.
INDICE EDITORIAL...........................................................................................................................................................................................5 El valor salud de la alimentación ancestral...........................................................................................................6 Productos Naturales promotores del crecimiento vegetal como estimulantes de micorrizas arbusculares............................................................................................................................................8 Programa de difusión y transferencia para el mejoramiento de la competitividad de las empresas del rubro apícola de la región de la Araucanía....................................................................10 EQUIPAMIENTO PARA EL MEJORAMIENTO DOCENTE UNIVERSITARIO............................................................................12 Publicaciones CIENTÍFICAS Agronomía UC Temuco....................................................................................................15 PROSPECCIÓN DE HONGOS MICORRÍCICOS ARBUSCULARES (HMA) EN PLANTAS MEDICINALES UTILIZADAS POR COMUNIDADES Mapuche PERTENECIENTES A LA REGIÓN DE LA ARAUCANÍA......................................16 DESAMARGADO DE LUPINO (Lupinus albus L.) MEDIANTE EXTRACCIÓN DE ALCALOIDES..........................................21 Análisis molecular de evidencia pericial en el contexto de los hechos delictivos ambientales.......................................................................................................................................................................34 EVALUACIÓN DE UN SNACK TIPO CHARQUI DE CARNE DE CABALLO (Equus caballus L.) CON DISTINTOS ADITIVOS ELABORADO EN CONDICIONES DE LABORATORIO.................................................................................40 PLANTACIÓN DE ARÁNDANOS EN ALTA DENSIDAD, UNA ALTERNATIVA PARA LOS PRIMEROS AÑOS DE PRODUCCIÓN.........................................................................................................................................................................52 EFFECTS OF A PROGRAM FOR THE RECOVERY OF ACIDIC VOLCANIC ASH SOILS IN THE ARAUCANIA REGION (SOUTH CHILE): IMPACTS ON ACIDITY AND PHOSPHORUS AVAILABILITY............................................................57 DIGESTIÓN RUMINAL DE PROTEÍNAS.........................................................................................................................................65 EFECTO DE UN HIDROLIZADO DE PESCADO SOBRE LA PRODUCCIÓN DE BIOMASA Y CONCENTRACIÓN DE POLIFENOLES TOTALES EN PLÁNTULAS DE AJÍ (Capsicum annuum L.).....................................................................72 ASPECTOS FISIOLÓGICOS, BIOQUÍMICOS Y MOLECULARES DE LA TOXICIDAD POR ALUMINIO (Al3+) EN ARÁNDANOS CULTIVADOS EN EL SUR DE CHILE........................................................................................................76
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EDITORIAL
PALABRAS DIRECTOR DE ESCUELA Vivimos en un mundo vertiginoso, donde el cambio es permanente a todo nivel, tanto en el conocimiento científico-tecnológico como en el de las comunicaciones y muchas otras áreas. La gran cobertura de los medios y de la Internet nos permiten manejar una gran cantidad de información. Sin embargo, no toda esa información circulante es confiable y una visión sesgada de la misma, con o sin intención, puede resultar en grandes prejuicios o errores de interpretación. En este sentido, en el plano nutricional cada cierto tiempo surgen ciertas “modas” que la sociedad en su conjunto sigue sin mayores cuestionamientos, asumiéndolas como verdades absolutas casi de forma inmediata. Así por ejemplo, hasta hace algunas décadas atrás se recomendaba reducir el consumo de grasas en la dieta, dada su asociación positiva con diversas enfermedades. En esos años, las grasas fueron “demonizadas” entendiéndose que todo alimento que tuviese grasa era dañino. Posteriormente, se ha descubierto que no todas las grasas tienen un efecto negativo en la salud de las personas y que en efecto muchas de ellas son necesarias y benéficas. Este periplo incluyó dentro de los primeros focos de atención el contenido de colesterol de los alimentos, incluso a fines de la década de los 80’s se promocionaban una serie de productos con 0% colesterol. Luego, surgió el tema del ácido linoleico conjugado (también conocido como CLA) y sus propiedades benéficas para la salud de las personas. Casi paralelamente se señalaba que se debía poner especial cuidado con la ingesta de ácidos grasos de tipo “trans”, dada su negativa relación con enfermedades cardiovasculares. Más recientemente, en 1994, se descubrió que el tejido adiposo secreta una importante hormona “leptina”, que inhibe el apetito y la ingesta calórica. Final y más recientemente, el tema se ha centrado en los ácidos grasos mono y polinsaturados, particularmente la relación omega-3:omega-6 y los beneficios de incluirlos en la dieta en forma equilibrada. Un caso similar al recién presentado se observó con las recomendaciones de consumo de huevo, el que pasó de ser fuertemente restringido a ser nuevamente promocionado, sin mayores restricciones. En la actualidad, no existe lugar a dudas de que en general una gran mayoría de las personas están cada vez más preocupadas de los alimentos que ingieren, no sólo desde el punto de vista nutritivo sino también de su inocuidad y sustentabilidad. No obstante, a pesar de la mucha información disponible y de su fácil acceso, persiste aún un gran desconocimiento respecto de elementos básicos del origen y del como se producen los alimentos. Asimismo, ciertos grupos activistas han “demonizado” ciertas tecnologías productivas del rubro agropecuario, acusándolos de ser contaminantes y destructivos, promoviendo otras que no permiten dar respuesta a la creciente demanda mundial de alimentos. A mi juicio no existe un sistema productivo superior, sino que cada realidad particular determina el mejor sistema posible, siendo factible que todos ellos cumplan con la urgente necesidad de ser sustentables y amigables con el medioambiente. Para ello, el país debe implementar un marco regulatorio que permita fiscalizar con facilidad los aspectos antes mencionados y contar con profesionales sólidos tanto desde el punto de vista técnico como ético. Esto último, es nuestro gran desafío como institución formadora, educar a las futuras generaciones de agrónomos con esas cualidades, pero también tenemos el desafío de instruir a la sociedad en su conjunto sobre el origen de los alimentos que consumen así como también la forma en que éstos se producen y las propiedades que poseen, por ello somos los “ingenieros de la vida”. Finalmente, los artículos que se presentan en esta edición de nuestra revista apuntan en esta dirección antes planteada. Esperamos que el lector disfrute de los temas que aquí se presentan y estos contribuyan a una mejor compresión del tema alimentario. Dr. Rodrigo A. Arias Inostroza Director Escuela de Agronomía UC Temuco
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El valor salud de la
alimentación ancestral A partir de iniciativas vinculadas a I+D, donde un equipo de profesionales de la Escuela de Agronomía pudo visualizar la necesidad de conocer el valor salud de los alimentos y cómo este se modifica con diversos procesos industriales o artesanales en que están presentes los mismos principios científico-tecnológicos y desarrollando estudios de posgrado y trabajando con las familias campesinas en un programa de innovación territorial alimentario Mapuche junto a la Fundación para la Innovación Agraria (FIA) se plantea la importancia que la sociedad valore la ciencia y tecnología asociada a estos procesos y el potencial que tienen los alimentos ancestrales para nuestra alimentación y salud, de esta manera nace esta iniciativa denominada “El valor salud de la alimentación ancestral” financiada por EXPLORA CONICYT en el marco del I Concurso nacional de apoyo a la realización de actividades de apropiación social de la Ciencia y Tecnología.
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En el transcurso de esta iniciativa se contempla que a través de talleres se den a conocer el proceso de elaboración y conservación del alimento Mapuche, tal como es el merkén, el mote, la harina tostada, las galletas de quinua, entre otros. El proyecto está enfocado principalmente a los alumnos de educación básica y media del Complejo Educacional La Granja de Cajón y la Escuela Truf Truf de Padre Las Casas, y tiene como objetivo principal, aumentar la visibilidad, interés y valoración de la comunidad por la alimentación ancestral Mapuche saludable, vinculada al origen a través de la Ciencia y Tecnología. En cada oportunidad, se realizarán charlas acompañadas de un desayuno saludable en ambos establecimientos. Dentro de los invitados principales, participará la especialista e investigadora del alimento Mapuche, María Sepúlveda Vivanco, quien trabaja hace más de 5 años en el área de la Gastronomía Intercultural. Expresa que se ha perdido la tradición de cómo se prepara la comida Mapuche, y por eso la comunidad no le saca todo el potencial al proceso de preparación de alimentos saludables Mapuche.
Durante las actividades del proyecto se desarrollarán: • Cafés científicos: a través de cinco encuentros, los expositores relatarán al público objetivo temas tales como: la historia de la alimentación del pueblo Mapuche, su gastronomía típica, la importancia de la alimentación saludable, la calidad e inocuidad alimentaria y conservación de alimentos ancestrales. • Taller de gastronomía: el público objetivo podrá conocer y practicar los procesos de elaboración y conservación de alimentos típicos de la cultura Mapuche tales como: harinas de cereales y de otros frutos y semillas, mote, merkén, bebidas e infusiones como chicha de manzana y muday, té de canelo, locro, chuchoca, galletas de quinua, entre otros. • Exposiciones: estas se realizarán en espacios públicos, donde se darán a conocer los mecanismos utilizados en la elaboración y conservación de los alimentos desarrollados por los propios participantes. • Concursos: se realizará un concurso para premiar la receta más atractiva y saludable elaborada por el público seleccionado, utilizando los conocimientos adquiridos. • Feria: se realizará en un espacio público donde se expondrán los trabajos realizados por los participantes; además, de todas las actividades desarrolladas.
Autor: Dra. Gina Leonelli, Ricardo Tighe y Armin Cuevas.
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Productos Naturales promotores del
crecimiento vegetal como estimulantes de micorrizas arbusculares
En la actualidad, los métodos tradicionales utilizados en la agricultura usan grandes cantidades de fertilizantes para incrementar los rendimientos de los cultivos causando contaminación del suelo y el agua; por lo tanto, la agricultura ecológica se presenta como una solución a este problema mundial. Esta disciplina evita el uso de productos químicos y busca alternativas que no causen daños a los ecosistemas agrícolas. Entre los manejos conservacionistas, se encuentra el uso de biofertilizantes, que incluyen a los hongos micorrícicos arbusculares (HMA), los cuales forman asociaciones simbióticas mutualistas con la mayoría de los cultivos de interés agrícola, incrementando la cantidad de nutrientes absorbidos por la planta, especialmente P, Cu y Zn. Sin embargo, los HMA son simbiontes obligados, es decir, no se reproducen en ausencia de una planta hospedera, lo que limita la inoculación, restringiéndola a nivel de frutales y plantas de vivero y almácigo. Por lo tanto, a nivel de cultivos extensivos sólo se podrían manipular las poblaciones HMA a través del uso de diferentes sistemas agrícolas, que incluyen por ejemplo, la rotación de cultivos. 8 | INNOVAGRO | www.agronomiauct.cl
Por otra parte, existen productos naturales (PN) que se utilizan en la agricultura para estimular el crecimiento de las plantas. Algunos de ellos incluyen como ingrediente activo, la formononetina, un isoflavonoide que se extrae de las raíces del trébol rosado. Estudios recientes, han demostrado que este PN también tiene un efecto estimulante sobre los HMA. Sin embargo, no se ha estudiado la influencia de otros PN que se aplican actualmente en la agricultura extensiva. Por tanto, el proyecto Fondecyt de iniciación N° 11090014 en ejecución investiga el efecto de algunos productos de uso nacional e internacional en la estimulación temprana de la micorrización y diversidad HMA en cultivos extensivos que son de interés agrícola para la zona centro-sur de Chile, como trigo. Para realizar esta investigación, se han montado varios ensayos a nivel de cámara de crecimiento e invernadero, buscando PN que permitan estimular la colonización HMA en las raíces del trigo, y de acuerdo a los resultados obtenidos, se han seleccionado algunos PN para ensayarlos en campo. Así, se han establecido parcelas con trigo en rotaciones de ciclo corto, con plantas hospederas y no hospederas HMA, como trigo-avena y trigo-lupino o trigo-raps, respectivamente. En tres localidades de la Región de La Araucanía Huichahue, Fundo El Carmen y Vilcún, actualmente se estudia la interacción entre estos PN y las poblaciones de HMA nativas de los suelos, junto con la micorrización temprana, proyectando que la adición de dichos PN a un sistema de cultivo determinado aumentará el rendimiento del cereal, como resultado de una aceleración en el desarrollo de la colonización HMA en los primeros estadios de la simbiosis.
Autor: Dra. Claudia Castillo R.
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Programa de difusión y transferencia para el mejoramiento de
la competitividad de las empresas del rubro
apícola de la región de la Araucanía
La Universidad Católica de Temuco, a través de su Escuela de Agronomía, postuló y se adjudicó durante el año 2011 un Programa de Difusión Tecnológica del rubro Apícola, para 36 empresas de la región de La Araucanía, iniciativa generada a través de la Asociación Gremial de Apicultores de la Región de La Araucanía, Red APINOVENA A.G. y el equipo técnico de la Universidad Católica de Temuco. Escuela de Agronomía de la Facultad de Recursos Naturales. El objetivo de la propuesta se orientó en “Mejorar la competitividad del rubro apícola en La Araucanía, por medio de la prospección, difusión y transferencia de nuevos conocimientos y tecnologías apícolas que contribuyeran a la incorporación de innovación, desarrollo de estrategias productivas sustentables y consolidación de nuevos mercados y productos”. 10 | INNOVAGRO | www.agronomiauct.cl
El programa que se desarrolló en dos etapas: Etapa 1, donde se realizó una prospección que incluyó una Misión Tecnológica Internacional a Buenos Aires - Argentina - para visitar una feria apícola mundial APIEXPO, participación en Apimondia, que es el congreso apícola de mayor importancia a nivel mundial y donde se realizaron visitas técnicas a explotaciones apícolas complementarias al evento científico. La Etapa 2 fue compuesta por la Difusión y Transferencia Tecnológica, donde se desarrollaron quince actividades conformadas por ocho cursos de formación, dos seminarios que incluyeron tres traída de expertos internacionales, dos giras nacionales y dos días de campo. En la segunda etapa del programa se realizó un diagnóstico y seguimiento de la competitividad de las empresas beneficiarias del programa, se transfirió tecnologías en producción, transformación, gestión y comercialización a través de sus 15 iniciativas de difusión, con énfasis en la diversificación de la oferta y la agregación de valor, la promoción de las BPA, cumplimiento de normas y estándares de calidad del mercado nacional e internacional. Los resultados del programa fueron el desarrollo de un diagnóstico de capacidades y problemáticas en las empresas apícolas beneficiarias, el fortalecimiento de competencias técnico profesionales en los apicultores, el aumento de la producción y comercialización de miel, la diversificación y valor agregado en productos apícolas y la implementación de buenas prácticas apícolas y normativas de aseguramiento de calidad. El costo total de la iniciativa ascendió a $71.373.000, considerando un aporte de Innova Chile de $56.023.000.- (78% de participación) ejecutable en 15 meses, y contempló un aporte de contraparte del 22% del costo total equivalente a $15.350.000.-
Autor: Dra. Ximena Araneda, Mixsy Neira, Raúl Flores y Daniza Morales.
EQUIPAMIENTO PARA EL MEJORAMIENTO DOCENTE UNIVERSITARIO La Escuela de Agronomía de la UC Temuco mejora sus ambientes educativos mediante la adquisición de nuevo equipamiento de laboratorio ($90.000.000), intercambio estudiantil ($20.000.000), recursos humanos ($15.000.000) y un nuevo invernadero en campus Norte ($35.000.000), gracias al Proyecto FIAC2 “Mejoramiento de la calidad en la formación de ingenieros agrónomos: estrategias de enseñanzaaprendizaje para la implementación del modelo educativo UC Temuco”.
Jornadas de AgronomĂa 2012
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Publicaciones Científicas Agronomía UC Temuco
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PROSPECCIÓN DE HONGOS MICORRÍCICOS ARBUSCULARES (HMA) EN PLANTAS MEDICINALES UTILIZADAS POR COMUNIDADES Mapuche PERTENECIENTES A LA REGIÓN DE LA ARAUCANÍA Claudia G. Castillo Rubio1, Juan I. Espinoza Morales1. 1 Escuela de Agronomía, Facultad de Recursos Naturales, Universidad Católica de Temuco. Rudecindo Ortega 02950. Temuco. Email: ccastill@uct.cl; fono: 45-205541.
Introducción Según la medicina Mapuche una enfermedad tiene un origen sobrenatural y se produce por seres o fuerzas cósmicas como el “wecufu” (fuerza del mal) que causa un daño y desequilibrio no sólo en el individuo, sino en la familia dentro de la comunidad, es decir, en la “mapu” (tierra). La salud, es una armonía entre el hombre y las fuerzas cósmicas y en una enfermedad, física o mental, deberá buscarse nuevamente el equilibrio (Carbonell, 2001). Al tratar al paciente, primero se invocan los espíritus y “Antunian” (alma del sol) y de acuerdo con lo que percibe el sanador, prepara la medicina utilizando plantas, flores o cortezas de árboles que son mezcladas con agua medicinal siendo las machis las personas que conocen las propiedades curativas de las plantas. En nuestro país, una alta densidad de Mapuches se concentra en la Región de La Araucanía y desde sus orígenes han estudiado y utilizado el patrimonio vegetal con fines medicinales conociendo las propiedades curativas de las plantas (Montes y Wilkomirsky, 1987). Dentro de las plantas medicinales Mapuche, sólo tienen aceptación científica 132 encontrándose este sub-grupo constituido principalmente por especies introducidas y aclimatadas en nuestro país, lo que implica que la flora autóctona medicinal continúa desconocida y el amplio universo de las plantas medicinales aún adolece de validación (alrededor del 88% del total). Antiguamente, en la zona de Lonquimay se recogían alrededor de 200 variedades de hierbas medicinales, las cuales se han ido extinguiendo por ausencia de un manejo sustentable y en la actualidad nacen, crecen y se reproducen alrededor de unas 100 especies nativas (Mapulawen, 2009). Por otra parte, el desarrollo de la herbolaria tradicional Mapuche, requiere en primer lugar conocer la magnitud de dicho universo, tarea prioritaria por tres razones: a) la flora está desapareciendo aceleradamente ante la degradación de zonas naturales y transformación de las culturas tradicionales, b) el conocimiento específico de las culturas aborígenes se encuentra seriamente amenazado por el avance en el desarrollo de la cultura dominante, que no respeta y aún destruye los ecosistemas naturales, y c) la cultura de las comunidades Mapuche está sufriendo cambios muy acelerados, en particular, por la escolarización de las nuevas generaciones, seguida de emigración a las ciudades. A partir de los años setenta, el comercio internacional de hierbas medicinales se ha triplicado de acuerdo con el crecimiento de la población mundial y en nuestro país, en relación a la producción agronómica de este tipo de cultivo, la zona Centro-Sur, posee características edafoclimáticas favorables que la hacen una potencial productora a gran escala de este tipo de productos (Wilckens et al. 2005).
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Las primeras etapas del ciclo de vida de una especie y el establecimiento de la plántula dependerá de la adquisición eficiente de nutrientes y además, de que las raíces se encuentren protegidas de patógenos, lo que en la mayoría de los cultivos se logra a través de los hongos micorrícicos arbusculares (HMA) (Smith y Read, 1997), los que incrementan principalmente la captación de nitrógeno (N), fósforo (P), cobre (Cu) y zinc (Zn) (Souchie et al. 2006) y reducen la aplicación de fertilizantes y fitosanitarios (Sieverding, 1991). La simbiosis cumple un rol fundamental en el desarrollo y mantenimiento de los ecosistemas encontrándose HMA en todos los suelos y climas terrestres. Dentro de la variedad de plantas medicinales utilizadas comúnmente en las comunidades Mapuches de la Región de La Araucanía resulta interesante conocer cuáles se encuentran asociadas con HMA, para poder realizar estudios sobre inoculación con HMA nativos, con la finalidad de aumentar el rendimiento de este tipo de cultivos. De aquí que, el objetivo de este estudio fue realizar en la localidad de Cunco, Región de La Araucanía, una primera prospección de plantas herbáceas, arbustivas y arbóreas de la herbolaria medicinal Mapuche para determinar cuales forman asociaciones simbióticas con los HMA. MATERIALES Y MÉTODOS Recolección de muestras del herbolario Mapuche. En las localidades de Colico, Cunco, Leufuche y Los Laureles pertenecientes a la comuna de Cunco, Región de La Araucanía (38°56’; 72°02’) se realizó un muestreo de herbáceas, arbustivas y arbóreas medicinales. La selección se realizó de acuerdo a entrevistas personales con el Lawentuchefe de dichas comunidades basándose principalmente en las propiedades medicinales que presenta la vegetación del sector, la utilización recurrente por las comunidades y la extinción sistemática de algunas especies, con la consiguiente pérdida cultural para las comunidades Mapuche. Colonización HMA en las raíces de plantas medicinales (%). Las raíces se tiñeron con solución de azul de tripán al 0,05% y para la lectura de la colonización HMA, se utilizó el método del intercepto de líneas (Giovannetti y Mosse, 1980). RESULTADOS Y DISCUSIÓN En el Cuadro 1, se observa el porcentaje de colonización HMA en las raíces de las 25 herbáceas medicinales muestreadas. Se obtuvo un amplio rango de colonización que fluctuó entre 3,7% para la alcachofa y 71,9% en manzanilla, con una media de 31,1%; mientras que, en tres especies ajo, éter y tusílago no se observó presencia HMA. Este promedio resulta elevado si se compara con otros cultivos agrícolas de la región (Castillo et al. 2008), lo que señalaría que la mayoría de las herbáceas pertenecientes a la localidad de Cunco, son simbiontes obligados, con una alta dependencia micorrícica, en particular, la manzanilla.
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Cuadro 1. Efecto medicinal y porcentaje de colonización por hongos micorrícicos arbusculares (HMA) en raíces de plantas herbáceas de la localidad de Cunco, Región de La Araucanía. Nombre
Nombre
Uso
HMA (%)
vernacular
científico
Ajo
Allium sativum
Antifúngico, antiparasitario
0
Alcachofa
Cynara scolymus
Antifebril, antifúngico
3,7 ± 0,8
Apio
Apium glaveolens
Antiasmático, diurético
8,5 ± 1,2
Avena
Avena sativa
Antidepresivo, diurético
15,7 ± 4,5
Cadillo
Acaena ovalifolia
Astringente, diurético
33.1 ± 4,3
Cardo mariano
Silybum marianum
Hipertensor
16,5 ± 0,3
Cilantro
Coriandrum sativum
Antiespasmódico, antifúngico
5,6 ± 0,2
Culle colorado
Oxalis rosea
Emenagogo
27,4 ± 8,0
Éter
Artemisia abrotanum
Analgésico, sedante
0
Hierba San Juan
Hypericum perforatum
Antidepresivo
61,1 ± 16,5
Hinojo
Foeniculum vulgare
Digestivo, antiinflamatorio
13,3 ± 3,7
Llantén
Plantago major
Antibacteriano
38,3 ± 2,3
Manzanilla
Matricaria chamomilla
Antialérgico, antiinflamatorio
71,9 ± 11,5
Menta blanca
Mentha piperita
Analgésico, antifúngico
70,2 ± 2,5
Menta negra
Mentha arvensis
Analgésico, antifúngico
12,0 ± 3,1
Ortiga
Urtica dioica
Diurético, antianémico
9,6 ± 3,1
Paico
Chenopodium ambrosioides
Antiparasitario, antidepresivo
21,9 ± 9,5
Perejil
Petroselinum hortense
Diurético, antiinflamatorio
23,3 ± 2,8
Pichoa
Euphorbia portulacoides
Antirreumático
51,2 ± 1,7
Poleo
Mentha pulegium
Expectorante, diurético
41,1 ± 3,2
Siete venas
Plantago lanceolata
Cicatrizante, antiinflamatorio
23,3 ± 2,3
Toronjil
Melossa officinalis
Antidepresivo, estimulante
25,4 ± 0,1
Toronjil cuyano
Marrubium vulgare
Depurativo, cicatrizante
55,0 ± 3,4
Tusílago
Tussilago farfara
Expectorante
0
Violeta
Viola odorata
Antiinflamatorio
56,6 ± 7,8
Este promedio resulta elevado si se compara con otros cultivos agrícolas de la región (Castillo et al. 2008), lo que señalaría que la mayoría de las herbáceas pertenecientes a la localidad de Cunco, son simbiontes obligados, con una alta dependencia micorrícica, en particular, la manzanilla.
En el Cuadro 2, se muestran los resultados obtenidos para la presencia y porcentaje de colonización HMA en 10 arbustivas medicinales de la localidad de Cunco. La única arbustiva que no presentó colonización HMA fue la quila mientras que, en las restantes arbustivas el porcentaje fluctuó entre 1,2% para el natre y hasta 50,9% en ajenjo, con una media de 27,2%, levemente inferior a la media obtenida para las herbáceas.
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Cuadro 2. Efecto medicinal y porcentaje de colonización por hongos micorrícicos arbusculares (HMA) en raíces de plantas arbustivas de la localidad de Cunco, Región de La Araucanía. Nombre
Nombre
Uso
HMA (%)
vernacular
científico
Ajenjo
Artemisia absinthium
Estimulante, digestivo
50,9 ± 3,9
Chascúo
Thymus vulgaris
Antiséptico, antiespasmódico
10,1 ± 1,7
Hierba de la plata
Equisetum giganteum
Depurativo, diurético
29,4 ± 6,2
Natre
Solanum ligustrinum
Antifebril, hipertensor
1,2 ± 0,6
Orégano
Origanum vulgare
Antiespasmódico, cicatrizante
48,1 ± 15,8
Quila
Chusque quila
Antirreumático, diurético
0
Rosa Mosqueta
Rosa moschata
Antidiarreico, antiinflamatorio
28,8 ± 8,9
Ruda
Ruta glaveolens
Antiespasmódico, antiparasitario
20,5 ± 0,1
Salvia
Salvia officinalis
Sedante, antiinflamatorio
19,4 ± 6,4
Zarzamora
Rubis discolor
Hemostático, astrigente
36,2 ± 7,5
En el Cuadro 3, se observa que de los árboles medicinales seleccionados sólo el laurel y maqui, no estuvieron colonizados por HMA; sin embargo, las otras especies presentaron una colonización similar, pero baja. Así, el castaño alcanzó sólo un 6,1% en comparación con el cerezo que fue la más elevada alcanzando 19,9%, con una media de 11,2%, bastante menor que la encontrada para las herbáceas y arbustivas medicinales. Probablemente, la ausencia o baja colonización HMA obtenida fue resultado de que la mayoría de las especies arbóreas boscosas se encuentran colonizadas por otro tipo de hongos simbiontes, los llamados hongos ectomicorrícicos. Cuadro 3. Presencia y porcentaje de colonización por hongos micorrícicos arbusculares (HMA) en raíces de plantas medicinales arbóreas de la localidad de Cunco, Región de La Araucanía. Nombre
Nombre
Uso
HMA (%)
vernacular
científico
Araucaria
Araucaria araucana
Cicatrizante, diurético
10,0 ± 0
Avellano
Corylus avellana
Astringente, antipirético
8,3 ± 4,5
Canelo
Drymis winteri
Antifúngico, antibacteriano
10,2 ± 5,6
Castaño
Castanea sativa
Antihemorrágico, astringente
6,1 ± 2,7
Cerezo
Prunus avium
Diurético, analgésico
19,9 ± 9,1
Durazno
Prunus persicae
Diurético, analgésico
12,9 ± 2
Eucaliptus
Eucalyptus globulus
Antitúsico, antiséptico
12,5 ± 3,5
Roble
Nothofagus obliqua
Antitúsico
10,0 ± 4,1
Laurel
Laurus nobilis
Antirreumático, diurético
0
Maqui
Aristotelia chilensis
Antidiarreico, antiespasmódico
0
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En este estudio se encontraron familias que no presentaron colonización como Quenopodiaceae y Liliaceae, lo que concuerda con lo informado por Azcón-Aguilar y Barea (1997) quienes informaron que las asociaciones micorrícicas se producen en la mayoría de las plantas vasculares con algunas excepciones como las familias Crucíferas, Quenopodiáceas, Ciperáceas, Liliáceas, Cariofiláceas y Juncáceas. Una de las familias que presentó mayor porcentaje de colonización fue Asteraceae con un promedio de 18,4%, corroborado con lo informado por Melgares de Aguilar et al. (2004) en lechuga del tipo Iceberg, variedad Fortunas, perteneciente a la misma familia mencionada anteriormente, que después de realizado el trasplante desde almácigo a campo, alcanzó cifras cercanas al 20% de colonización. De acuerdo con los resultados obtenidos en el estudio, donde se comprobó que la mayoría de las plantas medicinales utilizadas por comunidades Mapuche de la Región de La Araucanía se encuentran colonizadas por HMA se podría proyectar que la inoculación con HMA en cultivos de plantas medicinales podría considerarse como una alternativa viable para mejorar la rentabilidad de este tipo de cultivos en comunidades Mapuche, por disminución en la aplicación de fertilizantes y factores asociados, proyectando una agricultura sustentable y conservacionista, minimizando los daños ambientales. Finalmente, este estudio permitió conectar un trabajo científico con la cultura Mapuche mediante la participación activa del Lawentuchefe y dirigentes de las comunidades, quienes son los principales protagonistas del exterminio sufrido en la flora, con la consiguiente pérdida cultural que trae consigo dicho proceso. CONCLUSIONES · Del total de especies medicinales evaluadas, en 84% de ellas se observó presencia de hongos micorrícicos arbusculares, correspondiendo este porcentaje a 88% de herbáceas, 90% de arbustivas y 80% de arbóreas. · El porcentaje de colonización promedio de las herbáceas fue 34,6%, de las arbustivas 27,1% y arbóreas 9,8 %. LITERATURA CITADA Azcón-Aguilar C., and Barea, J.M. 1997. Applying mycorrhiza biotechnology to horticulture: Significance and potentials. Scientia Horticulturae 68: 1–24 Castillo, C., I. Astroza, F. Borie, y R. Rubio. 2008. Efecto de cultivos hospederos sobre propágulos micorrícicos arbusculares. Revista de la Ciencia del Suelo y Nutrición Vegetal 8(1): 37-54. Carbonell, B. 2001. La cultura Mapuche y su estrategia para resistir estructuras de asimilación. Experiencias antropológicas en Patagonia fundamentan alternativas de cambio para superar conflictos étnicos. Universidad de Fasta. Argentina. Disponible en http//www.ugr.es/~pwlac/G17_05Beatriz_Carbonell. html. Leído el 12 de octubre de 2012. Giovanetti, M., and Mosse, B. 1980. An evaluation of techniques for measuring vesicular-arbuscular mycorrhizal infection in roots. New Phytologist 84: 489-500. Melgares de Aguilar, J., D. González-Martínez, A. Gutiérrez, M. Honrubia, y A. Morte. 2004. Efectos del hongo endomicorrícico Glomus intraradices en el cultivo ecológico de lechuga tipo Iceberg. 6 p. VI Congreso de la sociedad Española de agricultura ecológica. Septiembre 2004. Almería, España. Montes, M., y T. Wilkomirsky. 1987. Medicina tradicional Chilena. 205 p. Editorial de la Universidad de Concepción. Concepción, Chile. Mapulawen. 2009. Hierbas medicinales Mapuche. Manejo sustentable y desarrollo participativo. Disponible en http://www.mapulawen.cl/hierbas.htm. Leído el 12 de julio de 2010. Sieverding, E. 1991. Vesicular –arbuscular mycorriza management in tropical agrosystems. 371 p. GTZ, Eschborn, Germany. Smith S.E., and D.J. Read. 1997. Mycorrhizal symbiosis. 154 p. Academic Press, London, England. Souchie, E. L., R. Azcón, J.M. Barea, O. J. Saggin- Júnior, and E.M. Ribeiro da Silva. 2006. Phosphate solubilization and synergism between P-solubilizing and arbuscular mycorrhizal fungi. Pesquisa Agropecuaria Brasileira 41(9): 1405-1411. Wilckens, R., M. Berti, H. Felicitas, y S. Fischer. 2005. Adaptación de plantas medicinales en la zona CentroSur y Sur de Chile. 162 p. Fundación para la Innovación Agraria. Chillán, Chile. 20 | INNOVAGRO | www.agronomiauct.cl
DESAMARGADO DE LUPINO (Lupinus albus L.) MEDIANTE EXTRACCIÓN DE ALCALOIDES Ximena Araneda1, Marco Duguet1, Rufino Pereda1, Isabel Martínez1, Marcelo Toneatti1. 1 Escuela de Agronomía, Facultad de Recursos Naturales, Universidad Católica de Temuco. Rudecindo Ortega 02950. Temuco. Email: xaraneda@uct.cl; fono: 45-205526.
ABSTRACT The Lupin it´s a leguminous plant pre-Incan originally amply distributed. By its alkaloids concentration mostly in its seeds presents toxic characteristics. As been used as an ingredient to the elaboration of human and animal food. In Chile it cultivates principally to exportation to middle orient countries, where is processed and sold it as snack. Bitter lupin (Lupinus albus) Boroa-INIA variety was submitted to hydration, cooking and rinsing process to finally determine the alkaloids concentration by the qualitative comparison of snack samples and lupine without treaty. Was possible to take bitter lupin seeds whit a good final caliber and disbittered. It discusses processes and final quality of elaborate products. Key Words: lupin, disbittered, alkaloids, toxicity.
RESUMEN El lupino es una planta leguminosa de origen preincaico ampliamente distribuida. Debido a la concentración de alcaloides mayoritariamente en sus semillas, presenta características tóxicas. Ha sido usado como ingrediente para la elaboración de alimento para consumo animal y humano. En Chile se cultiva principalmente para la exportación a países del medio oriente, donde es procesado y vendido como snack. Lupino amargo (Lupinus albus) variedad Boroa-INIA fue sometido a procesos de hidratación, cocción, enjuague para finalmente determinar la concentración de alcaloides mediante comparación cualitativa de muestras tipo snack comercial y lupino sin tratado. Fue posible obtener semillas de lupino amargo con buen calibre final y desamargadas. Se discute procesos y calidad final de productos elaborados. Palabras clave: lupino, desamargado, alcaloides, toxicidad.
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INTRODUCCIÓN A nivel mundial, la superficie cosechada de lupino ha ido en descenso en los últimos años, llegando a 687 mil hectáreas en 2009 (ODEPA, 2011). En este mercado el lupino dulce es el que lidera las exportaciones, producto utilizado como forraje o leguminosa de grano (Toledo et al., 2004). En tanto, el lupino amargo tiene en la Región de La Araucanía su principal zona productora, donde es exportado para luego ser procesados como snack. Se trata de una variedad que tiene un 40% de proteína en el grano, el cual lentamente se instala en diferentes segmentos productivos debido a su capacidad de adaptación a suelos pobres y climas secos, principalmente de la zona secano interior (Vallejos et al., 2004) (Vallejos, Silva, & Acevedo, 2004). El lupino amargo es un cultivo propio de la agricultura familiar campesina (Galdames y Neira, 2007), por esto es que existe la posibilidad de dar un valor agregado al lupino de descarte que no es exportado y que además posee un bajo precio para su venta en mercado nacional siendo muchas veces utilizado para resiembras o como desecho debido a que no puede ser consumido por animales o humanos por su alto contenido de alcaloides, compuestos orgánicos generalmente de origen natural, que en altas dosis pueden generar la muerte de quien lo ingiere (Rodríguez, 2009). Origen El lupino, altramuz o lupini (Lupinus albus L.) corresponde a un conjunto de plantas del género Lupinus de la familia Leguminoseae, subfamilia Papinoloideae (Toledo et al., 2004). El género Lupinus comprende alrededor de 500 especies, de las cuales 10 se encuentran en Chile. Entre éstas, cuatro están consideradas nativas (Marticorena y Quezada, 1985). Los pobladores preincas domesticaron esta planta, lo cual fue plasmado en cerámicas y tejidos, sin embargo, fue desplazada por la introducción de cultivos europeos (Jacobsen y Mujica, 2006). El primer lupino introducido en Chile fue el Lupinus angustifolius, de flor azul, amargo y dehiscente. Fue utilizado como abono verde en viñas a partir de los inicios del siglo pasado. En 1949 comienzan a introducirse el Lupinus albus (lupino blanco), de flor blanca, destinado como forraje animal y Lupinus luteus (de flor amarilla). Ambas especies denominadas dulces o de bajo contenido de alcaloides (componente que confiere característico sabor amargo) (Toledo et al., 2004). Características El lupino es una leguminosa, cuya principal característica de importancia para la agricultura es fijar nitrógeno atmosférico en cantidades apreciables de 100 kg ha-1 según estimaciones realizadas por Jacobsen y Mujica (2006). Según Toledo et al. (2004), es una leguminosa capaz de aportar 50 a 200 unidades de nitrógeno por hectárea al año, restituyendo la fertilidad del suelo cultivada en el área andina desde épocas preincaicas. Barrientos et al. (2002) demostraron la alta capacidad de fijar nitrógeno de L. albus (282 kg de N ha-1) y L. angustifolius (197 kg de N ha-1) en el Sur de Chile. Esta planta se desarrolla en valles templados y áreas alto-andinas. El cultivo y consumo del grano paulatinamente está disminuyendo en los países andinos, sobre todo en Colombia, Argentina y Chile por falta de difusión de las formas de uso a pesar de su gran valor nutritivo y resistencia a factores climáticos adversos en las zonas donde se siembra (Jacobsen y Mujica, 2006). La variedad Boroa-INIA proviene de una selección individual por peso de grano dentro de una población tipo local mediante la cosecha de éste en tres comunas de la Región de La Araucanía, comenzando los ensayos en temporada 2001-2002 hasta que en la temporada 2004-2005 se establecieron macroparcelas de multiplicación de semilla de las tres líneas seleccionadas, decidiendo al final de la temporada la liberación de una de ellas (Boroa-INIA) debido a que mantuvo mejor peso promedio de grano (Galdames y Neira, 2007). 22 | INNOVAGRO | www.agronomiauct.cl
Se trata de una variedad que tiene un 40% de proteína en el grano y que lentamente se instala en diferentes segmentos productivos. En el Sur de nuestro país es una alternativa para la rotación de cultivo. De acuerdo a ODEPA (2011) para la temporada 2011-2012 se proyecta una recuperación de la producción, con una variación de 13%, determinada principalmente por un aumento de 12% en los rendimientos. A partir de estas estimaciones, se proyecta que la producción mundial de lupino se situará cerca de 1.000.000 de toneladas para la temporada 2011-2012. Situación del cultivo Históricamente, la producción mundial de lupino ha sido ampliamente liderada por Australia, su participación en 2010 alcanzó a 67%, seguida por Alemania (7%), Ucrania (6,7%) y Bielorrusia (4,2%). Chile, con una producción aproximada de 39.500 toneladas, se ubicó en el mismo nivel de este último país, ocupando la cuarta posición a nivel mundial (ODEPA, 2012). El principal competidor de Chile es Australia, país que ofrece un lupino catalogado por los importadores como de calidad superior al chileno, el que se usa en la industria de elaboración de alimentos para animales, aunque en el año 2010 los principales destinos de los envíos de lupino chileno fueron Portugal, España, Egipto, Israel, Italia y el Líbano, donde es consumido como snack (ODEPA, 2011). Galdames y Neira (2007) señalan que el lupino amargo no se consume en Chile, sino que tiene un nicho de exportación en países europeos del Mediterráneo, principalmente España, y países de Medio Oriente, principalmente Egipto. El mercado europeo es más exigente y ofrece mejores precios de acuerdo al tamaño o calibre del grano, demandando grano de calibre 13 mm o superior. Al mercado árabe se exportan calibres entre 8 y 12 mm y también se pagan mejor los calibres mayores. El área sembrada y la producción de lupino en Chile han pasado por ciclos variables de alzas y bajas, principalmente asociados al desarrollo de la industria productora de salmones que es una de las más importantes fuentes de demanda de lupinos dulces, utilizados en la elaboración de alimentos para estos peces (Toledo et al., 2004). (Toledo, y otros, 2004). El lupino amargo, es cultivado en Chile mayormente por pequeños agricultores de etnia Mapuche (Galdames y Neira, 2007), el cual es de gran importancia para la agricultura en la Región de La Araucanía, donde se encuentran concentrados la mayor parte de las comunidades y agrupaciones indígenas del país. En las últimas dos temporadas se ha observado una importante disminución en la superficie sembrada con lupinos, lo que junto con una baja de rendimientos, ha hecho que en este lapso la producción haya disminuido a casi la mitad de la que se obtuvo en 2009/10, históricamente una de las más altas obtenidas y que alcanzó a 73.707 toneladas (ODEPA, 2012). La reducción de siembras se encuentra relacionada, en principio, con que el repunte de 2009/10 fue demasiado rápido, luego de que paulatinamente se comenzara a controlar el virus ISA en la industria salmonera a partir del año 2008. Así, dicho repunte tendió a generar cierta sobreoferta en el mercado e influyó en que los precios no fuesen tan atractivos como los que esperaban los productores agrícolas. De allí que en las temporadas siguientes no hubo incentivos significativos para seguir incrementando las siembras de lupino (ODEPA, 2012). En el caso del lupino dulce, en la última temporada se aprecia un aumento de siembras cercano a 3.000 ha, probablemente como consecuencia de la entrada en escena de la empresa Copeval, que habría contratado siembras por una superficie similar a la señalada, sin embargo, el incremento fue a expensas de una caída de siembras del lupino australiano, en tanto que las siembras de lupino amargo, aunque bajaron 12% respecto a la temporada anterior, se mantuvieron en torno a 10.000 ha, aproximadamente, con lo que siguieron representando cerca de 50% del total (ODEPA, 2012). 23 | INNOVAGRO | www.agronomiauct.cl
Variedades de lupino dulce y amargo Todas las variedades de lupino originalmente fueron amargas, pero a través del mejoramiento genético se han obtenido variedades de lupino dulce, que corresponden a aquellos en que el contenido de alcaloides es inferior a 0,05%. Los amargos presentan de un 1 a un 2% de alcaloides (Toledo et al., 2004). De acuerdo a este criterio es que se pueden clasificar las variedades de lupino más utilizadas (Cuadro 1). Cuadro 1. Variedades de lupino más importantes cultivadas. Especie
Variedad
Grano
Flor
Ciclo
L. albus
Multolupa
Blanco dulce
Azul clara
Tardío
Amargo
Blanco amargo
Azul clara
Tardío
Victoria
Blanco dulce
Azul clara
Tardío
Rumbo B
Blanco dulce
Azul clara
Semi-tardío
Typtop B
Blanco dulce
Azul oscuro
Semi-tardío
Azul
Semi-tardío
Blanca
Precoz
Blanca
Precoz
Amargo, semilla L. angustifolius
Azul
gris dehiscente Dulce, semilla
Australiano
blanca Dulce, semilla
Gungurru
blanca
Fuente: Toledo et al. (2004). L. albus variedad Boroa-INIA (lupino blanco) La variedad Boroa-INIA tiene un hábito de crecimiento indeterminado, plantas con este hábito mantienen su crecimiento vegetativo luego de iniciada la fase reproductiva, desarrollándose y produciendo floraciones hasta que la humedad del suelo es escasa y se presentan mayores temperaturas (Toledo et al., 2004). Sembrada en otoño-invierno (abril-junio), la variedad Boroa-INIA alcanza normalmente 1,7 a 2,0 m de altura, ligeramente inferior a la de los lupinos provenientes de Italia y Marruecos. También la altura es inferior en siembras realizadas a salidas de invierno o en suelos compactados (Galdames y Mera, 2007). El grano de Boroa-INIA es blanco marfil, sin ornamentación, de cotiledones amarillos, de forma más o menos cuadrangular, con una ligera depresión central en ambos lados. Estas características son comunes a la gran mayoría del lupino amargo cultivado en el país (Galdames y Neira, 2007). Alcaloides Según lo señalado por Rodríguez (2009) se considera alcaloide a un compuesto orgánico de origen natural (generalmente vegetal), nitrogenado, derivado generalmente de aminoácidos, de carácter más o menos básico, de distribución restringida, con propiedades farmacológicas importantes a dosis bajas y que responde a reacciones comunes de precipitación. Se han descrito 26 alcaloides diferentes, todos derivados de la quinolizidina y cuya naturaleza varía según la especie de lupino (Schmidt-Hebbel, 1986). De acuerdo a las características de esta definición se pueden clasificar en:
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- Alcaloides verdaderos, los que cumplen estrictamente con las características de la definición de alcaloide, por lo que son formados a partir de aminoácidos, tienen siempre un nitrógeno intracíclico, son de carácter básico y existen en la naturaleza normalmente en estado de sal. - Protoalcaloides, son aminas simples con N extracíclico, de carácter básico y son productos del metabolismo de los aminoácidos. - Pseudoalcaloides, presentan algunas de las características de la definición de alcaloide, pero no son derivados de aminoácidos. - Alcaloides imperfectos, son derivados de bases púricas, no precipitan con los reactivos específicos para alcaloides. La función de los alcaloides en las plantas no es aún muy clara, existen algunas sugerencias sobre el rol que juegan estas sustancias en los vegetales, tal como ser productos de desecho o almacenamiento del N sobrante, esta función es equivalente a la del ácido úrico o de la urea en los animales (Rodríguez, 2009). Saavedra (1995) señala que los principales alcaloides presentes en el lupino son sustancias nitrogenadas que poseen anillos quinolizinídicos sintetizados a partir de la lisina. Asimismo Rodríguez (2009) plantea que éstos son la lupanina en un 46%, la esparteína en un 14%, la 4-hidroxilupanina en un 10%, la n-metilangustifolina en un 3% y la 13-hidroxilupanina en un 1%. En concordancia con Cubillos et al. (1999) quienes establecen la concentración de lupanina en un 70,9% confirmándola como el alcaloide de mayor importancia en las semillas de L. albus. La lupanina es el alcaloide que se encuentra en mayor concentración en el lupino, pudiéndose encontrar la d y l-lupanina, así como también sus mezclas. La d-lupanina es un líquido espeso cristalino con diferentes puntos de ebullición que la l-lupanina, el cual es un aceite viscoso que posee actividad antibacteriana, nematócera, que puede utilizarse como insecticida contra lepidópteros y coleópteros (Rodríguez, 2009). Lo que puede ser una aplicación potencial de los alcaloides en lupino en el control de plagas y parásitos intestinales de los animales. En general, todas las partes de una planta de lupino contienen alcaloides, aunque su biosíntesis se limita a los tejidos verdes, especialmente las hojas. Los alcaloides se producen en cantidades abundantes en las semillas, que son también una buena fuente de proteínas y lípidos (Muzquiz et al., 1994). Toxicidad de los alcaloides del lupino En términos de ecología química, los alcaloides confieren importante resistencia a patógenos y herbívoros (Muzquiz et al., 1994). Afirmando esto, Saavedra (1995) y Rodríguez (2009) exponen que la toxicidad de los alcaloides ha sido demostrada en animales y seres humanos, siendo los síntomas principales de envenenamiento la midriasis, calambres, trastornos visuales, cianosis, parálisis respiratoria, violentos dolores estomacales, vómitos e incluso coma. Los efectos tóxicos de estos alcaloides no son acumulativos y son rápidamente excretados por el riñón, siempre que la cantidad total de alcaloides no exceda un determinado nivel. Los límites de toxicidad que están aceptados son 0,02% para nutrición humana y 0,03% para nutrición animal. Es por lo tanto importante conocer la cantidad de alcaloides presentes y los niveles tóxicos de los alcaloides individuales ya que no todos tienen la misma toxicidad (Muzquiz et al., 2006). Los alcaloides comunican al lupino cierto sabor amargo y son de carácter tóxico, por lo que deben eliminarse. Esto se logra por el procedimiento convencional, usado desde tiempos antiguos en la región andina: cocción en agua de la semilla entera, remojada previamente durante unos 30 min, seguida de inmersión prolongada (3 a 4 días) en corriente de agua. Una alternativa de tipo industrial consiste en una extracción previa con hexano del aceite, el cual puede usarse como comestible pues no retiene prácticamente alcaloides y contiene, en cambio, ácido linoleico y gama-tocoferol (Schmidt-Hebbel, 1986). 25 | INNOVAGRO | www.agronomiauct.cl
El objetivo del presente trabajo fue realizar la extracción de alcaloides de manera semiartesanal mediante hidratación e identificar la presencia o ausencia de alcaloides en lupino de descarte variedad Boroa-INIA para ser utilizado en alimentación humana. MATERIALES Y MÉTODOS La investigación se realizó en el Laboratorio de Bromatología de la Escuela de Agronomía de la Universidad Católica de Temuco ubicado en Edificio Cincuentenario del Campus Norte, Rudecindo Ortega N° 02950. Se seleccionaron manualmente 700 g de semillas de descarte de lupino amargo (L. albus) variedad BoroaINIA, destinado al mercado externo donde es procesado. Para esta tarea fueron seleccionados granos que estuviesen libres de hongos, residuos, semillas de mala calidad o con alguna anormalidad. Luego, utilizando una forma de extracción mediante calor se procedió al remojo y lavado de las semillas, para esto se utilizó un recipiente de acero inoxidable donde las semillas fueron hervidas. Una parte del material resultante se utilizó para realizar las pruebas cualitativas de presencia de alcaloides deshidratándolas. Metodología de desamargado de lupino La técnica utilizada se basó en lo que describe Jacobsen y Mujica (2006) donde se establecen métodos de deslupinización industriales y artesanales, caracterizándose estos últimos por los procesos de remojo e hinchado del lupino (Cuadro 2). El método utilizado para el desamargado del lupino posee varias etapas descritas por Palacios y Ortega (1998) dentro de las cuales incluye: Medición de parámetros físicos. Se midieron semillas de lupino Boroa-INIA de descarte, aproximadamente 1 kg, donde se obtuvo un promedio de esta medición, la cual fue repetida al término del proceso de hidratación y desamargado de la muestra. Hidratación inicial. En balanza electrónica (marca SHIMADZU modelo TX2202L), se pesó 0,7 kg de grano de lupino Boroa-INIA, luego en un recipiente se vertieron 2,5 L de agua potable, por un tiempo estimado de 12 h observándose el aumento en la turbiedad de ésta, logrando así la hidratación completa de los granos. Cocción a presión. Posterior a la hidratación del lupino, se realizó un hervido y un cambio de agua a igual temperatura. Remojo del grano. Luego de 24 h se realizó un cambio de agua y comenzaron las etapas de remojo con agua fría y caliente sobre cocinilla cada 6 h. Lavado. Transcurridos 6 d de haber realizado el proceso de remojo del grano, se procedió a lavar la muestra con aproximadamente 5 L de agua fría escurriendo, haciendo disminuir a temperatura ambiente. Conservación. A -18ºC, y en 2,5 L de agua fría, se procedió a guardar en refrigerador la muestra, para luego realizar la separación de ésta con distintas soluciones experimentales. A continuación se detallan las diferentes etapas y procedimientos que se llevaron a cabo sobre las muestras de lupino en base a lo descrito por Jacobsen y Mujica (2006).
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Cuadro 2. Resumen procedimientos realizados en laboratorio. Fecha
Hora
Nยบ maceraciones
14-06-2011
22:00 1 Maceraciรณn /12h
15-06-2011
10:00
1 Hervido 1h
15-06-2011
10:30
Cambio de agua
15-06-2011
11:00
1ยบ Maceraciรณn
15-06-2011
17:00
2ยบ Maceraciรณn
15-06-2011
23:00
3ยบ Maceraciรณn
16-06-2011
5:00
4ยบ Maceraciรณn
16-06-2011
23:00
5ยบ Maceraciรณn
16-06-2011
17:00
6ยบ Maceraciรณn
16-06-2011
23:00
7ยบ Maceraciรณn
17-06-2011
5:00
8ยบ Maceraciรณn
17-06-2011
11:00
9ยบ Maceraciรณn
17-06-2011
17:00
10ยบ Maceraciรณn
17-06-2011
23:00
11ยบ Maceraciรณn
Agua Frรญa
Agua (L) Gramos (g) 2,5
700
2,5
700
2,5
700
Frรญa
2,5
700
Frรญa
2,5
700
2,5
700
2,5
700
2,5
700
2,5
700
2,5
700
2,5
700
2,5
700
2,5
700
2,5
700
Caliente 100ยบC Caliente 100ยบC
Caliente 100ยบC Caliente 100ยบC Caliente 100ยบC Caliente 100ยบC Caliente 100ยบC Caliente 100ยบC Caliente 100ยบC Caliente 100ยบC Caliente 100ยบC
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Metodología de determinación de alcaloides en forma cualitativa La muestra previamente hidrolizada se procesó en molinillo eléctrico, al igual que una muestra de semillas sin desamargar del mismo origen y semillas comerciales de producto importado denominado CANTOLIVA (Tremoco extra), elaborado en Portugal con semillas de primera selección producida en Chile. Obteniendo de esta manera tres muestras de harina de lupino como se observa en la Figura 1.
Figura 1. Harinas de lupino procesadas. A) lupino desamargado, B) lupino sin desamargado C) lupino comercial (CANTOLIVA). Identificación de muestras Para identificar la presencia o ausencia de alcaloides en las muestras procesadas, se utilizaron tres reactivos; el primero de ellos conocido como reactivo de Mayer, el cual se emplea para la caracterización no específica de alcaloides, éste se basa en la acidez de éstos en su forma de sales (clorhidratos) debido que en medios básicos el reactivo de Mayer no precipita. La mayoría de los alcaloides reaccionan dando un precipitado blanco o amarillo claro, amorfo o cristalino (Vargas, 2009). Este reactivo es preparado mediante la disolución de 1,358 g de cloruro de mercurio II en 60 mL de agua, lo que se agrega a una solución de 5 g de yoduro de potasio en 10 mL de agua; finalmente se agrega agua hasta completar 100 mL (Villanueva, 2006). El reactivo de Hager consiste en una solución saturada de ácido pícrico en agua, este reactivo precipita la mayoría de los alcaloides, los picratos se pueden cristalizar y ello permite por medio de resinas intercambiadoras, separar los alcaloides (Arango, 2008). El reactivo de Bouchardt (yodo ioduro de potasio), consiste en una solución de 2 g de yodo y 4 g de yoduro de potasio en 100 mL de agua, la cual genera precipitados de color rojo pardo en presencia de alcaloides. El procedimiento para estos reactivos comenzó con la evaporación de dos a tres gotas del extracto etanólico en los tubos de ensayo que se encuentran con harina de lupino. Se agregaron luego dos a tres gotas de ácido clorhídrico 5% hasta solubilizar los residuos. Posteriormente se procedió a centrifugar las soluciones a 6000 rpm durante 10 min hasta que se extrajeron de la centrifuga y a cada tubo de ensayo se le agregó una gota del reactivo correspondiente agitando la muestra para su posterior análisis visual. Por último, se midieron con un calibrador milimétrico, 100 semillas de lupino secas luego de pesadas y luego aquellas semillas que resultaron del proceso de hidratación.
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Envasado y conservación de lupino La muestra de lupino proveniente de la hidratación y que no fue procesada como harina de lupino, fue envasada con agua destilada para posteriormente ingresar a autoclave durante 15 min a 121°C siendo congelada durante 21 días a -18°C para determinar si es posible utilizar lupino desamargado previamente congelado, siendo ésta una posibilidad para el agricultor de acumular materia prima para épocas de mayor escasez. Al término de este periodo, se procedió a descongelar en agua tibia y utilizar las muestras en tres frascos con 100 g de lupino, 100 mL de agua destilada con ácido cítrico y sal al 1%, 100 mL de agua destilada con vinagre de manzana y sal al 1% y finalmente un frasco con sólo 100 mL de agua destilada. Estas fueron ingresadas a autoclave y puestas en conservación durante 12 meses en condiciones de oscuridad y temperatura ambiente (Figura 2). Los datos obtenidos de cada evaluación fueron comparados y discutidos en base a la literatura existente a fin caracterizar el proceso y calidad final de productos elaborados.
Figura 2. Lupino envasado, 12 meses. A) 100 mL de agua destilada con ácido cítrico y sal al 1%, B) 100 mL de agua destilada con vinagre de manzana y sal al 1%, C) 100 mL de agua destilada. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Proceso de desamargado de lupino El líquido resultante de los sucesivos remojos y hervidos fue un extracto acuosos de color amarillo obscuro, debido a la liberación de los alcaloides. Según Cubillos et al. (1999) y Rodríguez (2009), la mayor concentración de alcaloides está dada por la presencia de lupanina. La mayor coloración acuosa se presentó al comenzar el sexto día, 24 h después de lo descrito por Palacios y Ortega (1998) quienes también señalan que los tratamientos que aumentan sus tiempos de exposición al lavado, presentan ciertos grados de putrefacción del grano, situación que no ocurrió en las pruebas prácticas llevadas a cabo en el laboratorio. Según Rodríguez (2009) el agua resultante puede ser utilizada para el control de plagas. Sin embargo, Quintana et al. (2011) estiman que el extracto o infusión de lupino no posee una acción insecticida significativa, sino que posee un efecto insectisático sobre eclosión de huevos de determinados insectos, lo cual debe ser estudiado con mayor profundidad. Dado que los alcaloides parecen jugar un papel muy importante en el sistema defensivo de la planta se ha estudiado la capacidad antigerminativa (Muzquiz et al., 1994), fungicida (De la Cuadra et al., 1994) y bactericida (De la Vega et al., 1996) de los alcaloides mayoritarios de las diferentes especies del género Lupinus a fin de evaluar la posibilidad de emplearlos en el desarrollo de plaguicidas naturales. 29 | INNOVAGRO | www.agronomiauct.cl
Es posible observar que el calibre promedio del lupino hidratado es mayor que el lupino deshidratado, con diferencia de ± 2,72 mm, esto debido a la hidratación que sufrieron los granos de lupino luego de los diferentes procesos a los cuales fueron sometidos para la extracción de alcaloides y almacenaje en distintas soluciones. De esta manera, el proceso de hidratación del lupino aporta a mejorar características físicas, otorgando un mayor tamaño al producto final el cual pueda competir con productos derivados de la exportación. Sin embargo, estos valores aún no pueden ser comparables con el del lupino comercial, Galdames y Neira (2007) determinaron que más de 80% del grano de Boroa-INIA puede alcanzar un calibre 13 mm o superior, dependiendo esto de la época de siembra y disponibilidad de agua, lo que concuerda con el calibre de la muestra comercial CANTOLIVA evaluada, la cual presentó un calibre promedio de 15,6 mm hidratada, aproximadamente ± 2,6 mm más que lupino de interés comercial (Cuadro 3 y Figura 3). Cuadro 3. Calibre de lupino Boroa-INIA de descarte v/s lupino comercial.
Figura 3. Semillas de lupino. A) calibre de lupino sin procesar, B) procesado, C) comercial. Resultado determinación de alcaloides en forma cualitativa Después de realizadas las pruebas de Mayer, Hager y Bouchardt se observa el resultado de las muestras con la aplicación de estos diferentes reactivos sobre muestras de harina de lupino amargo sin procesar, lupino desamargado y lupino comercial, resultando diferentes reacciones de ácido pícrico, mercurio y yodo sobre las muestras centrifugadas anteriormente. Fue posible determinar mediante la condensación de la muestra la presencia o ausencia de alcaloides en la muestra de lupino, aunque se puede observar la mayor o menor condensación por concentración de alcaloides en cada una de ellas.
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Se pudo observar la respuesta de las tres muestras analizadas frente a cada uno de los reactivos evaluados, donde se apreció la alta condensación que se presentó principalmente en la muestra número tres (lupino amargo) la que se utilizó como base para realizar una comparación visual, más aún, con la respuesta a reactivos de Mayer y Bouchardt, donde se pudo apreciar una disminución significativa en las condensaciones sobre todo en la muestra uno (deslupinizada) donde incluso no se observó fragmentos mayormente condensados, principalmente en la muestra donde se aplicó el reactivo de Mayer (Figura 4).
Figura 4. Resultados de reactivos. Se estima de este modo, que los niveles de alcaloides presentes en la muestra tratada disminuyeron luego de ser hidrolizada lo que podría concordar con Koleva et al. (2012) que luego de llevar a cabo este proceso, obtuvieron una disminución de concentración de alcaloides de 1 a 2% a 0,05%. Sin embargo se debe tener en cuenta que la presencia de éstos en bajas dosis, son incluso beneficiosas para la salud ya que con dosis de 0,03% incorporadas a pacientes que presentan diabetes tipo II, los alcaloides tienen efectos hipoglicemiantes, siendo una alternativa factible y de bajo costo para tratamientos de enfermedades crónicas como la hiperglicemia (Fornasini et al., 2012).
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Resultado envasado y conservación de lupino Se puede determinar que el proceso de congelamiento, descongelamiento y conservación de las muestras de lupino desamargada no influyó en la calidad de las semillas tratadas, tanto en su sabor como composición física, la cual se verificó en laboratorio 12 meses después del envasado mediante determinación de grado de acidez pH 4,7 y la ausencia de agentes extraños en las soluciones. Aunque sí se notó un cambio de color por turbiedad en una solución con sal abierta a los 6 meses de haber sido envasada (Figura 5). Según Mohamed y Rayas-Duarte (1995) la composición, color y pigmentos totales son importantes propiedades del lupino el cual puede ser utilizado como ingrediente para consumo humano o fuente de proteína animal.
Figura 5. Lupino conservado. A) muestra agua destilada con sal abierta 12 meses, B) muestra agua destilada con sal abierta hace 6 meses. CONCLUSIONES • Es posible hidrolizar alcaloides con métodos artesanales replicables a la pequeña agricultura y evaluar su presencia con técnicas de condensación de muestras. En las muestras evaluadas se pudo determinar mediante pruebas cuantitativas la ausencia de alcaloides, principalmente con reactivo de Mayer y Bouchardt. • Se puede utilizar lupino de descarte desamargado para ser procesado de diferentes formas y elaborar un producto tipo snack manteniendo las cualidades iniciales del producto conservado. • A través de la hidrolización y desamargado de lupino se logran aumentos de calibres en granos de descarte siendo esto una oportunidad para el agricultor de dar un valor agregado a un producto que normalmente se comercializa sin procesar. • Los residuos acuosos del proceso de desamargado podrían ser evaluados para su utilización en control de insectos, debido al alto índice de alcaloides quinolizidínicos entre otros.
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LITERATURA CITADA
Arango, G. 2008. Alcaloides y compuestos nitrogenados. 88 p. Universidad de Antioquia. Medellin, Ecuador. Barrientos, L., A. Montenegro, y I. Pino. 2002. Evaluación de la fijación simbiótica de nitrógeno de Lupinus albus y L. angustifolius en un Andisol Vilcún del Sur de Chile. Terra Latinoamericana (México) 20:39-44. Cubillos, A., M. Gädicke, D. Von baer, y F. Ahumada. 1999. Determinación de la dosis letal media (DL50) de alcaloides del lupino en pollas de reposición blancas y marón. Archivos Medicina Veterinaria (Chile) 31:249-256. De la cuadra, C., J. Tello; M. Muzquiz, and R. Calvo. 1994. Poder fungicida «in vitro» de esparteína y gramina, alcaloides del lupino amargo. Studia Botánica (España) 13:99-101. De la vega, R., M. Gutierrez, C. Sanz, R. Calvo, R. Robredo, C. De la cuadra, and M. Muzquiz. 1996. Bactericide-like effect of Lupinus alkaloids. Industrial Crops and Products (España) 2:141-148. Fornasini, M., J. Castro, E. Villacrés, and L. Narvá. 2012. Hypoglycemic effect of Lupinus mutabilis in healthy volunteers and subjects with dysglycemia. Nutrición Hospitalaria (Ecuador) 27:425-433. Galdames, R., y M. Neira. 2007. Boroa-Inia, primera variedad de lupino (Lupinus albus) amargo exportable obtenida en chile. Agricultura Técnica (Chile) 67:320-324. Jacobsen, S., y S. Mujica. 2006. El tarwi (Lupinus mutabilis Sweet.) y sus parientes silvestres. Botánica Económica de los Andes Centrales (Perú) 28:458-482. Koleva, I., T. van Beek, A. Soffers, B. Dusemund and I. Rietjens. 2012. Alkaloids in the human food chain-Natural occurrence. Molecular Nutrition & Food Research (The Netherlands) 56:30–52. Marticorena, C., y M. Quezada. 1985. Catálogo de la flora vascular de Chile. Gayana Botánica 42:1-2. Mohamed, A., and P. Rayas-Duarte. 1995. Composition of Lupinus albus. American Association of Cereal Chemists 72:643-647. Muzquiz, M., M. Pedrosa, E. Varela, E. Guillamon, C. Goyoaga, C. Cuadrado, y C. Burbano. 2006. Factores no-nutritivos en fuentes proteicas de origen vegetal. Su implicación en nutrición y salud. Brazilian Journal of Food Technology (Brazil) 87-98. Muzquiz, M., C. Cuadrado, G. Ayet, C. De la Cuadra, C. Burbano, and A. Osagie. 1994. Variation of alkaloid components of lupin seeds in 49 genotypes of Lupinus albus L. from different countries and locations. Agricultural Journal Food Chemistry (España) 42:1447-1450. ODEPA. 2011. Perspectivas del lupino. Disponible en http://www.odepa.gob.cl. Leído el 17 de mayo de 2012. ODEPA. 2012. El mercado del lupino en 2012/13: perspectivas. Disponible en http://www.odepa.gob.cl. Leído el 01 de octubre de 2012. Palacios, J., y R. Ortega. 1998. Efecto del tiempo de remojo, coccion y lavado sobre el contenido de alcaloides y proteina en chocho (Lupinus mutabilis S.). 67 p. Tesis Ingeniero en Alimentos. Universidad Técnica de Ambato. Ambato, Ecuador. Quintana, R., A. Palma, and R. Rebolledo. 2011. Effect of an infusion of canelo and bitter lupin on Aegorhinus superciliosus adults. Ciencia e Investigacion Agraria (Chile) 38:397-403. Rodriguez, A. I. 2009. Evaluación “in vitro”de la actividad antimicrobiana de los alcaloides del agua de cocción del proceso de desamargado del chocho (Lupinus mutabilis Sweet). 83 p. Tesis Bioquímico Farmacéutico. Escuela Politécnica de Chimborazo. Riobamba, Ecuador. Saavedra, L. 1995. Intoxicación por agua de Lupinus mutabilis (¨Chocho¨). Boletin Sociedad Peruana de Medicina Interna (Perú) 8:35-37. Schmidt-Hebbel, H. 1986. Tóxicos químicos en alimentos. Avances en su identificación, previsión y desintoxicación. 82 p. Editorial Universitaria. Santiago, Chile. Toledo, M. I., E. V. Baer, G. Olivares, P. Soto, A. Manriquez, C. Harrison, D. Mex, y F. Garrido. 2004. Lupino dulce, leguminosa en la producción de alimentos para salmónidos. 44 p. Pontificia Universidad Católica de Valparaiso. Santiago, Chile. Vallejos, E., P. Silva, y E. Acevedo. 2004. Evaluación del rendimiento de nueve genotipos de lupino en la zona central. 37 p. Facultad de Ciencias Agronómicas de la Universidad de Chile. Santiago, Chile. Vargas, A., L. La Torre, N. Luciani, y L. Mamani, 2009. Alcaloides. 33 p. Laboratorio de Química Orgánica IV. Universidad Nacional Federico Villareal. Lima, Perú. Villanueva, M. 2006. Manual de reactivos químicos. 87 p. Universidad Católica de Temuco. Temuco, Chile.
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Análisis molecular de evidencia pericial en el contexto de los hechos delictivos ambientales Jaime Solano1, Leonardo Anabalon3, Mario Romero3, Gabriel Vivallo1, Marcelo Toneatti1, Gustavo Donoso2, Carlos Esse2, Ximena Cofre1, Angélica Francois3, Ramiro Díaz3, Oriana Betancour4, Alexander Ortloff4, Patricio Peña4, Alejandra Figueroa5, Cristian Lizama5 y Juan Carlos de la Fuente5. 1 Escuela de Agronomía UC Temuco, 2Escuela de Ciencias Forestales UC Temuco, 3Escuela de Ciencias Ambientales UC Temuco, 4Escuela de Medicina Veterinaria UC Temuco, 5Policía de Investigaciones de Chile. Proyecto FONDEF: D11I1024. INTRODUCCIóN Los delitos ambientales corresponden a aquellos delitos vinculados a las plantaciones de especies arbóreas introducidas y a los bosques de especies nativas (robo de madera, leña, metro ruma, rollizo). En este grupo de delitos se pueden incorporar también aquellos delitos económicos vinculados a la falsificación de muebles de madera, comercializados de ellos y el transporte de madera. Por otra parte, los datos estadísticos muestran que el 40% de la superficie forestal de la Región de La Araucanía, se encuentra en poder de las grandes empresas forestales, mientras que el 60% de la superficie restante se encuentra en manos de pequeños y medianos productores forestales. En este contexto, entre los años 2004 y 2010 las cifras de CONAF (Corporación Nacional Forestal) muestran que los delitos ambientales que involucran a los productos de la foresta (metro ruma, leña, etc.), alcanzaron los 495 casos denunciados y están relacionados principalmente con la tala ilegal de madera nativa. Por otra parte, el Ministerio Público señala de recibir al menos una denuncia semanal por el delito de robo o hurto de madera desde predios forestales, lo que en el análisis por especie ello incide en un 64% a pino, en un 32% a eucaliptus y el resto a otras especies forestales. Con todo, el problema radica en el hecho de la existencia de un importante número de delitos que concluye sin imputados, a causa de la falta de pruebas que permitan sostener registros para un juicio, lo cual se explica y vincula con una limitada disponibilidad de pericias botánicas que permitan esclarecer en forma científica dichos delitos. La Botánica forense es la aplicación de la ciencia de la flora a las investigaciones penales. Esta es una disciplina relativamente nueva que incorpora varias sub-disciplinas: palinología (estudio del polen), la dendrocronología (estudio del crecimiento de los árboles), limnología (el estudio de los ambientes marinos), la sistemática (la clasificación de las plantas), ecología (el estudio de los ecosistemas), y la biología molecular (disciplina que estudia los procesos que se desarrollan en los seres vivos desde un punto de vista molecular, ADN). El objetivo principal en botánica es establecer relaciones entre “la evidencia y un delito”. Al igual que todos los investigadores de criminalística, los botánicos deben reunir, documentar y preservar sus pruebas con mucho cuidado para asegurarse de que sus interpretaciones sean válidas y admisibles en los tribunales. Por ejemplo, el polen puede ser utilizado para conectar a un sospechoso con una víctima o con el escenario del crimen.
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Por otra parte, la actual incapacidad de aplicación rutinaria, de manera rápida y precisa de pruebas de identificación botánica en rastros remanentes, sigue siendo el principal obstáculo de la botánica forense, y dada la falta de información en base de datos, diferentes autores han utilizado con éxito la búsqueda de homología de secuencias de ADN en bases de datos utilizando partidores universales, para así poder identificar correctamente muestras desconocidas (especies forestales nativas). Diversas técnicas de biología molecular están hoy disponibles para la detección de la variabilidad genética a nivel de secuencia del ADN; es decir, para determinar el polimorfismo genético. Estas técnicas permiten la obtención de un número virtualmente ilimitado de marcadores moleculares cubriendo todo el genoma del organismo. Estas técnicas permiten evidenciar variaciones (polimorfismo) en la secuencia del ADN, modifiquen o no su fenotipo. En vegetales son utilizados en estudios evolutivos y de genética de poblaciones, manejo de bancos de germoplasma, identificación, protección legal de germoplasma, mapeo, selección asistida y clonado de genes. Un marcador molecular ideal debe ser altamente polimórfico o variable dentro o entre especies, de herencia mendeliana no espistática (sin interacción entre genes), insensible a los efectos ambientales, codominante, de rápida identificación y simple análisis y de posible identificación en los estadios tempranos del desarrollo de la planta. En los análisis genómicos, se han utilizado varios tipos de marcadores genéticos; morfológicos, isoenzimas, proteínas y marcadores basados en ADN. Un marcador de ADN es simplemente un punto de referencia en un cromosoma, que puede o no corresponder a un gen. Luego, diversas técnicas de biología molecular se encuentran disponibles para detectar la variabilidad en la secuencia de ADN. Después de la invención de la reacción en cadena de polimerasa (PCR) (Mullis y Faloona, 1987), un gran número de métodos para la generación de marcadores moleculares basados en PCR fueron detallados, debido principalmente a su aparente sencillez y alta probabilidad de éxito. El uso de cebadores aleatorios superó la limitación del conocimiento antes de la secuencia para el análisis de PCR y facilitó el desarrollo de marcadores genéticos para una variedad de propósitos. Las técnicas basadas en PCR se puede subdividir en dos categorías: (1) PCR basadas cebadores arbitrarios y (2) las técnicas de PCR basadas en secuencia específicos. Los marcadores se pueden agrupar en al menos tres grupos: 1.- Los marcadores basados en hibridación del ADN. Los más ultilizados en plantas son los RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism). En el proceso el ADN en estudio es digerido con una enzima de restricción. Los fragmentos clivados por la enzima de restricción se separan por su tamaño mediante electroforesis y se transfieren a una membrana donde son hibridados con una sonda. 2.- Marcadores basados en amplificación del ADN, mediante PCR. Para que exista amplificación del fragmento es imprescindible que ambos oligonucleótidos hibriden en secuencias complementarias presentes en las hebras del ADN en estudio. La presencia de mutaciones en el sitio de hibridación de cualquiera de los oligonucleótidos impide la amplificación del fragmento. En este grupo encontramos los RAPDs (Random Amplified Polymorphic DNA), en este caso el polimorfismo que se puede observar entre distintos individuos está dada por la presencia o ausencia de fragmentos de ADN amplificado.
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La disminución de los costos de secuenciación y del PCR, junto a la creciente información sobre los genomas de plantas y animales, ha permitido el desarrollo de marcadores basados en PCR con diferentes características, entre ellos el más frecuentemente utilizado es: SSR (simple sequence repeats o microsatelites). Los microsatélites son repeticiones en tándem de secuencias cortas o simples repeticiones monótonas de muy corto (de uno a cinco) motivos de nucleótidos, que se producen como elementos intercalados repetitivos en todos los genomas eucarióticos (Tautz y Renz, 1984). La variación en el número de unidades repetidas en tándem se debe principalmente a deslizamientos de la hebra de ADN durante la replicación de éste. Es decir, se produce la escisión o la adición de juego de bases repetida (2-6 pb). Como el deslizamiento en la replicación es más probable que las mutaciones puntuales, los loci de microsatélites tienden a ser hipervariables. Ensayos de microsatélites muestran extenso polimorfismo entre individuos (Schlotterer y Tautz, 1992). Los SSR muestran una alta reproducibilidad entre los laboratorios y presentan una base genética codominante y por lo general, pueden detectar todos los alelos de un locus. Por lo general, el grado de polimorfismo aumenta con la longitud total de la SSR (Ortiz et al., 2000). La reproducibilidad de los microsatélites es tal, que pueden ser utilizados de manera eficiente por los laboratorios de investigación diferentes generando datos consistentes. Marcadores microsatélitales basados en sitio específico han sido registrado en muchas especies de plantas como el tomate (Solanum lycopersicum L.) (Benor et al.,2008), arveja (Pisum sativum L.) (Gong, et al., 2010), cebada (Hordeum vulgare L.) (Saghai Maroof et al., 1994), arroz (Oryza sativa L.) (Wu and Tanksley, 1993), y papa (Solanum tuberosum L.) (2005; Ghislain et al., 2004; Ghislain et al., 2006; Ghislain et al., 2009a; Ghislain et al., 2009b). Trabajos en especies forestales han sido reportados por Rojas et al., (2010). Éstos autores utilizaron marcadores microsatelitales (SSR) en el proceso de selección de Eucaliptus globulus tolerante a sequía mediante 10 marcadores SSR, de los cuales tres pertenecen a la serie EMCRC y siete son de la serie EMBRA. Ambas series son capaces de diferenciar claramente los distintos clones de eucaliptus provenientes de los cruzamientos entre material resistente a la sequía y material de alta productividad. A modo de ejemplo, en el Cuadro 1, se muestran partidores específicos del tipo plastídicos, mitocondrial y nuclear usados por Deguilloux et al., (2002), para pruebas de amplificación (PCR) del ADN de Querqus petraea (Matt.) Liebl para estudios de certificación de madera y de botánica forense. Cuadro 1. Secuencia de pares de partidores usados para pruebas de amplificación, de muestras de ADN aisladas de madera (Querqus petraea (Matt.) Liebl).
Fuente: Deguilloux, Pemonge and Petit (2002). 36 | INNOVAGRO | www.agronomiauct.cl
3.- Marcadores mixtos. Por ejemplo, los marcadores AFLP (amplified fragment length polymorphisms), pueden considerarse como una combinación de RFLP y RAPDs. Esta técnica consiste en esencia de cuatro etapas: Cortar el ADN con enzimas de restricción, adherir adaptadores de doble cadena en forma específica a los extremos de los fragmentos obtenidos en el paso anterior, generando así un molde para la amplificación del ADN, amplificación selectiva por la acción de primer específicos que fueron diseñados para reconocer la secuencia de los adaptadores que fueron ligados en el segundo paso, el sitio de la enzima de restricción, más una a tres bases selectivas al azar agregadas en el extremo 3´. Finalmente, el análisis de la subpoblación de fragmentos amplificados mediante su desnaturalización por electroforesis de alta resolución (poliacrilamida) y visualización por autoradiografia o tinción con nitrato de plata. Estos marcadores presentan un alto poder de detección de la variabilidad genética, ya que se explora simultáneamente el polimorfismo de ausencia/ presencia de sitios de restricción y la ocurrencia o no de amplificación a partir de secuencias arbitrarias. Para el análisis de la variabilidad genética, a futuro se podrá evaluar la aplicación de nuevos marcadores moleculares o nueva clase de elementos de ADN, los cuales incrementan la cobertura del genoma, tales como retrotransposones, DNA mitocondrial y DNA cloroplasto, etc. Los marcadores moleculares y la evidencia pericial forestal En una primera etapa, la aplicación de los marcadores moleculares en un programa de mejoramiento genético permiten la identificación genética–molecular de clones producidos por los programas de mejoramiento. Esta información es de gran utilidad en el proceso de propagación clonal, planificación de las plantaciones operacionales (plantación de un clon en forma masiva, del que será el bosque) y selección de clones para plantaciones en mosaico (corresponde a la plantación operacional de varios clones, separados entre ellos, pero dentro de un mismo sector). Además, favorece y controla el intercambio de material genético entre las empresas nacionales y extranjeras (con lo que se evitan duplicidades), estimula la apropiación de clones elites generados por las diversas empresas, e impulsa la certificación de calidad del material genético producido por los programas de mejoramiento forestal. Una segunda aplicación es la identificación de híbridos provenientes de programas de cruzamientos controlados, intra (pino y eucalipto) e inter específicos (eucalipto). La no–discriminación o identificación inadecuada del material genético puede traer serias consecuencias en el cumplimiento de las metas planteadas en los programas de mejoramiento genético, con las consiguientes pérdidas económicas para las empresas. Por ejemplo, si se identifica material autofecundado significa que el cruzamiento dirigido no fue exitoso, y estaremos seleccionando o usando algo que no es un híbrido. También, la presencia de material con polen contaminante y errores en el etiquetado son problemas comunes en diferentes programas de cruzas controladas, que resultan difíciles de detectar mediante la inspección visual de los árboles. La aplicación de marcadores moleculares podría permitir la eliminación temprana del material no deseado, y la intensificación del trabajo en el material adecuado, para, de esta manera, ahorrar importantes recursos. En evidencias forenses, rastros de fragmentos de hojas y de polen pueden ser utilizados como evidencia. Históricamente la identificación de rastros botánicos se han sustentado sobre análisis morfológicos e histológicos. Con la técnica de PCR y la posibilidad secuenciar el ADN dentro de bases de datos (GeneBank) vía taxonomía molecular, permitirán alcanzar la identificación de plantas en diferentes especies vegetales. En botánica forense se requiere primero de la identificación de la especie para la extracción de su ADN, la amplificación y la secuenciación. La generación de información desde bases de datos de ADN de plantas, pueden ser usados para realizar correlaciones de marcadores específicos de una especie, para establecer ligamiento forense usando herramientas homólogas y luego, usar secuencias similares. El NCBI (National Center for Biotechnology Information) contiene miles de secuencias de ADN de plantas que son útiles para tales identificaciones. 37 | INNOVAGRO | www.agronomiauct.cl
Estos locis incluyen genes nucleares ITS1, ITS2 (región espaciador transcrito interno) y genes del cloroplasto que codifican para la ribulosa 1,5 bis – phosphate carboxylase (rbcL), ATP synthase Beta (atpB), y subunidad 5 NADH deshidrogenasa (ndhF). El locis más usado es el del gen rbcL, de aproximadamente 1400 pares bases de largo, que es moderadamente conservado entre diferentes especies y que ha sido reportado por sobre 6500 especies de plantas. Se realizan amplificaciones por PCR del Locus rbcL mediante juegos universales de cebadores rbcL o locus ITS utilizando un conjunto variado de primers ITS. En este contexto, Ferri et al., (2008), desarrollaron un sistema de identificación molecular basada en ADN, igual como una clave taxonómica morfológica tradicional que ofrece criterios que progresivamente permiten identificar una muestra de plantas desconocidas para un rango taxonómico. La generación de información en bases de datos ADN de plantas, se puede utilizar para ser correlacionada con marcadores específicos conocidos y establecer la vinculación forense esgrimiendo como herramientas de búsqueda la similitud y la homología de secuencias, lo que sugiere un sistemática de marcadores de “códigos de barras” para investigar a nivel de especie en base a amplificación utilizando partidores universales. La actual incapacidad de aplicación rutinaria, de manera rápida y precisa de pruebas de identificación botánica en rastros remanentes, sigue siendo el principal obstáculo de la botánica forense, y dada la falta de información de las bases de datos, estos autores han utilizado con éxito este enfoque para identificar correctamente muestras desconocidas, lo que confirma la utilidad de este método y la posibilidad de aplicación a gran escala en el ámbito forense. Para lo anterior, se han evaluado diferentes partidores (primer) de regiones conservadas, usando el programa PRIMER3. Las especies forestales que han sido analizadas buscando secuencias homólogas usando BLAST son Pinus nigra, Pinus sylvestris. En base a lo anterior, se puede concluir, que la Botánica forense es la aplicación de la ciencia de la flora a las investigaciones penales y es una disciplina relativamente nueva que incorpora varias sub-disciplinas: palinología, la dendrocronología, limnología, la sistemática, la ecología y la biología molecular. El objetivo final en botánica es establecer relaciones entre “la evidencia y un delito”. Los problemas principales radican en el hecho de la existencia de un importante número de delitos que concluye sin imputados, lo cual está vinculado con una limitada disponibilidad de pericias botánicas que permitan esclarecer en forma científica estos delitos ambientales. Glosario Amplificación: Proceso por la que secuencias génicas se replican diferencialmente en un termociclador. ADN: ácido desoxirribonucleico. Principal molécula que contiene información genética. Está conformada por cadenas polinucleotídicas antiparalelas. pb: pares de bases. ATP: trifosfato de adenosina. PRIMER: Partidor o cebador de la reacción en cadena de la polimerasa. POLIMORFISMO: Existencia de dos o más fenotipos discontinuos que segregan en una población. PCR: Reacción en cadena de la polimerasa. Método para amplificar segmentos de ADN que utiliza ciclos de denaturalización, de emparejamiento a cebadores y de síntesis de ADN, dirigida por la DNA polimerasa. AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphisms. RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism. RAPDs: Random Amplified Polymorphic. SSR: Simple Sequence Repeats o Microsatélites. ITS: Espaciadores internos transcritos (Internal transcribed spacer).
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LITERATURA CITADA Benor, S., M. Zhang., Z. Wang and H. Zhang. 2008. Assessment of genetic variation in tomato (Solanum lycopersicum L.) inbred lines using SSR molecular mrkers. Journal of Genetic and Genomics 35: 373379. Deguilloux, M., Pemonge, M. and R. Petit. 2002. Novel perspectives in wood certification and forensics: dry wood as a source of DNA. Proc. R. Soc. Lond B. 269: 1039-1046. Ferri, G., M. Alu`, B. Corradini, A. Angot, and G. Beduschi. 2008. Land plants identification in forensic botany: Multigene barcoding approach. Genetics Supplement Series 1:593-595. Ghislain. M., D. Andrade., F. Rodríguez., R. Hijmans and D. Spooner. 2006. Genetic analysis of the cultivated potato Solanum tuberosum L. Phureja Group using RAPDs and nuclear SSRs. Theor Appl Genet. 113:1515-1527. Ghislain. M., J. Nuñez. M. del R. Herrera and D. Spooner. 2009a. The single Andigenum origin of NeoTuberosum potato materials is not supported by microsatellite and plastid marker analyses. Theor. Appl. Genet. 118:693-969. Ghislain. M., J. Nuñez. M del R. Herrera., J. Pignataro., F. Guzman., M. Bonierbale and D. Spooner. 2009b. Robust and highly informative microsatellite-based genetic identity kit for potato. Mol. Breeding. 23:377-388. Gong, Y., S. Xu., W. Mao., Q. Hu., G. Zhang., J. Ding and Y. Li. 2010. Developing new SSR markers from ESTs of pea (Pisum sativum L.). Biomed & Biotechnol. 11(9):702-707. Mullis KB, Faloona F (1987) Specific synthesis of DNA in vitro via polymerase chain reaction. Methods Enzymol 155:350–355 Rojas, P., B. Gutierrez. C. Muñoz, M. Molina, O. Ortiz, L. Koch, A. Bello, M. Pino., C. Muñoz, H. Prieto, G.Sellez, P. Hinrinchsen y M. Reyes. 2010. Generación y producción de plantas de Eucaliptus globulus tolerantes a la sequía. En: V Congreso Chileno de Ciencias Forestales. Universidad Católica de Temuco. 220 p. Ortiz, J., I. Aguimagalde and J. Martín. 2000. Varietal identification. P. 515-560. In: F. Nuez y J.M. Carrillo (eds). Los marcadores genéticos en la mejora vegetal. Editprial de la UVP, Valencia, España. Saghai Maroof M. A., R. M. Biyashev., G. P. Yang., Q. Zhang and R. W. Allard. 1994. Extraordinarily polymorphic microsatellite DNA in barley: species diversity, chromosomal locations, and population dynamics. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91:5466–5470. Schlotterer, C. and D. Tautz. 1992. Slippage synthesis of simple sequence DNA. Nucleic Acids Res 20:2211– 2215. Tautz, D. and M. Renz. 1984. Simple sequences are ubiquitous repetitive components of eukaryotic genomes. Nucleic Acids Res 12(10):4127–4138. Van de Wiel, C., P. Arens and B. Vosman. 1999. Microsatellite retrieval in lettuce (Lactuca sativa L.). Genome 42:139–149. Wu, S. D. and K. S. Tanksley. 1993. Abundance, polymorphism and genetic mapping of microsatellites in rice. Molecular and General Genetics vol 241:225–235.
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EVALUACIÓN DE UN SNACK TIPO CHARQUI DE CARNE DE CABALLO (Equus caballus L.) CON DISTINTOS ADITIVOS ELABORADO EN CONDICIONES DE LABORATORIO Gina Leonelli1, Melissa Aguilera1, Rodrigo Arias1, Ricardo Tighe1. 1 Escuela de Agronomía, Universidad Católica de Temuco. Rudecindo Ortega 02950. Temuco. Email: ginalc@uct.cl; fono: 45-205521 INTRODUCCIÓN La palabra charqui o charky proviene del quechua “ch’arki” y su origen es ancestral, usado principalmente para cánticos y rituales (INDECOPI, 2006), y se define como carne que se conserva por salazón y secado (MamaniLinares y Gallo, 2011). Para elaborar este producto se utiliza carne cortada en láminas finas que son marinadas y secadas. El marinado según la RAE (2012a) es un proceso por el cual se conserva en crudo ciertos alimentos con adobo de hierbas y especias, con el fin de que se ablanden y adquieran aroma. Se puede preparar una gran variedad de charquis empleando carne de vacuno, cerdos, aves y otras especies (Lonnecker et al., 2010). La deshidratación es una de las técnicas más ampliamente utilizadas para la conservación de alimentos (Nijhuis et al., 1996; Marin et al., 2006). Este es un proceso que se emplea para la preservación de alimentos, el cual consiste en la eliminación del agua libre de un sólido, permitiendo la reducción de las reacciones químicas e inhibiendo el crecimiento microbiano, y por ende, prolongando la conservación de los materiales biológicos (García et al., 2010). El charqui, además de ser un producto nutritivo rico en proteínas y bajo en grasa, es estable al medio ambiente y tiene una gran demanda en el mercado (Mamani-Linares y Gallo, 2011). La carne de caballo presenta sólo 2,1 mg 100 g-1 de grasa, contenido similar a la pechuga de pollo (EROSKI, 2010). Además, la carne de caballo es la fuente de hierro más alto de origen animal (4 mg 100 g-1), presentando un color rojo oscuro y opaco (Mamani-Linares y Cayo, 2011) mientras que la carne de vacuno sólo presenta 3,5 mg 100 g-1 y antioxidantes como el beta-caroteno, el cual se obtiene por el consumo de pasturas y forrajes verdes, este mismo puede decaer dramáticamente hasta un 97% en dos meses si el animal es insertado en un sistema de alimentación con granos (Grupo CEO, 2005). Debido a que los caballos son principalmente alimentados en pasturas y con forrajes verdes la carne de caballo es considerada como un alimentos funcional (Marin et al., 2006). Este es un producto magro (Leistner, 1987), lo que permite que sea integrado en la dieta de personas que padecen enfermedades crónicas no transmisibles. En cuanto a los aditivos utilizados en el snack tipo charqui, cinco de ellos son hierbas, como el laurel, el romero, el tomillo o frutos de alguna especie aromática como la pimenta o las semillas de cilantro, a excepción del merkén que es un condimento elaborado artesanalmente por la etnia Mapuche de la Región de La Araucanía, en base a ecotipos locales de ají rojo “Cacho de cabra” (Capsicum annuum L.), cuyos frutos son secados, ahumados, tostados y molidos y mezclados con sal y otros condimentos, como semillas de cilantro tostadas y molidas (Thomet y Sepúlveda, 2006). Con base a lo anterior, el objetivo de este estudio fue evaluar la aceptabilidad de un “snack” tipo charqui obtenido a base de carne salada, sazonada y deshidratada con un flujo de proceso que presenta características nuevas en relación a un flujo base.
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MATERIALES Y MÉTODOS El desarrollo de los snacks tipo charqui fue realizado en el Laboratorio de Alimentos de la Escuela de Agronomía de la Universidad Católica de Temuco, entre noviembre de 2011 y junio de 2012. Las muestras cárneas utilizadas para este ensayo corresponden a posta rosada equina, obtenida de una carnicería equina establecida en la ciudad de Temuco. El aditivo esencial para la elaboración de este producto es la sal, para este ensayo se utilizó sal fina de mesa. Los aditivos adicionales utilizados fueron tomillo, merkén, semillas de cilantro secas y molidas, romero, pimienta blanca y laurel. Cuadro 1. Materia prima, lugar de adquisición, presentación y valor de cada una de los insumos utilizados. Muestra
Lugar de adquisición
Presentación (g)
Valor por kilo ($)
Carne
Carnicería “Venegas”, Temuco
Granel
3990
Sal
Supermercado local
Envases de 1000
300
Tomillo
Supermercado local
Envases de 7
99857
Merkén
Feria libre
Granel
6000
Semillas de cilantro
Feria libre
Granel
3000
Romero
Supermercado local
Envases 10
26000
Pimienta blanca
Supermercado local
Envases 15
23333
Laurel
Supermercado local
Envases 5
54000
Flujo base El proceso artesanal de producción de charqui tiene como característica principal el ser estacional, debido a que la fuente de calor usada para deshidratar la carne es el sol y el aire tibio circulante en épocas de verano, es por esto que las tiras de carne marinadas con sal son colgadas en cordeles o dispuestas en secadores hechos de malla, para evitar que insectos o algún otro animal pueda tener acceso a la carne durante el secado, y de esta forma son expuestas al sol durante las horas más calurosas del día, y retiradas durante las horas de la noche para evitar que absorban humedad nuevamente. La Figura 1 muestra el flujo base o flujo A, con el cual la señora María Angélica Valdeavellano, productora local, elabora su producto, sobre el cual se realizaron algunas variaciones dadas por el aliño agregado a cada tratamiento, enfocadas a un mercado que busca una forma más fácil de consumir alimentos que sean también nutritivos.
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Figura 1. Flujos de proceso, A) flujo base, B) flujo con moltura de aliño, C) flujo con aliños ya molidos. Elaboración de snack tipo charqui Una vez obtenida la muestra de carne fresca se llevó al laboratorio. Posteriormente, se dimensionaron las muestras a 10 cm de largo, 5 cm de ancho y 1 cm de grosor. Las muestras se agruparon en seis tratamientos, con tres repeticiones cada uno, cada tratamiento fue identificado con una letra y un número, siendo estos: T1: sal y tomillo, T2: sal y merkén, T3: sal y semillas de cilantro, T4: sal y romero, T5: sal y pimienta blanca y T6: sal y laurel. Para los tratamientos 1, 3, 4 y 6 se siguió el flujo B de la Figura 1 y para los tratamientos 2 y 5 el flujo C de la misma figura. La proporción utilizada para todos los tratamientos fue de 50 g de sal por cada kilo de carne fresca y 1 g del aditivo seleccionada para cada tratamiento por cada kilo de carne fresca. El tiempo de marinado fue de 10 horas, a una temperatura de 4°C para evitar la contaminación y descomposición de la carne. Una vez concluido el tiempo de marinado de la carne ésta fue llevada a estufa de aire forzado (Binder, modelo FD 23), ya que el aire caliente es el método de deshidratación más usado en la industria alimentaria (Krokida et al., 2003), en donde fueron dispuestas aleatoriamente sobre un papel aluminio, para evitar contacto directo con las rejillas de la estufa. El proceso de secado comenzó a una temperatura de 45°C, por 30 minutos, los siguientes 30 minutos fueron a una temperatura de 55°C. Pasado este período de tiempo se comenzó un nuevo ciclo térmico a 75°C por 30 minutos, trascurrido este período de tiempo la temperatura se mantuvo a 75°C, las muestras fueron evaluadas cada 1 hora hasta lograr un peso constante. El paso siguiente fue el ablandado de la carne deshidratada, el que se realizó utilizando un mortero de piedra con el cual se golpeó la carne, hasta evidenciar un cambio de coloración y textura del producto. La carne una vez seca fue ablandada, este proceso se realizó envolviendo la carne en una tela limpia y gruesa para luego, golpearla con un mazo también envuelto en tela, hasta obtener la textura deseada para este producto y lograr un cambio en la coloración. Posterior a esto se separó por peso y se envasó en bolsas de celofán. 42 | INNOVAGRO | www.agronomiauct.cl
Determinación de humedad Transcurrido cada lapso de tiempo del proceso de deshidratado, se realizó una evaluación del peso de la muestra, el que se registró hasta obtener un peso constante, utilizando la Ecuación 1 (González et al., 2008). El porcentaje de humedad fue determinado para los productos elaborados en este estudio, ya que es un factor determinante en la calidad de este tipo de productos.
Donde: Pi: peso inicial de la muestra. Pf: peso final de la muestra.
(Ecuación 1)
Volumen de la muestra y rendimiento Los parámetros de peso, largo, ancho y grosor fueron registrados al comienzo de la etapa de secado y al finalizar los diversos ciclos térmicos para evidenciar los cambios de volumen. En base a esta magnitud se pudo calcular la variación del volumen de las muestras. La determinación de los parámetros de largo, ancho y grosor se realizaron utilizando un pie de metro, debido a su unidad de medida (mm). Los resultados obtenidos se multiplicaron para obtener el volumen. El rendimiento de este producto se determinó basado en la relación entre la materia inicial y el producto final obtenido (RAE, 2012b). Para determinar el peso de las muestras se utilizó una balanza analítica (marca O´Hauss, modelo AS200). Evaluación sensorial Los snack tipo charqui fueron envasados en bolsas de celofán y puestos a disposición de un panel de jueces no entrenados para ser evaluados. Se utilizó una escala hedónica de cinco puntos en la cual cada juez eligió entre las siguientes opciones, las que en orden descendente son: ‘me agrada mucho’, ‘me agrada’, ‘me es indiferente’, ‘me desagrada’ y ‘me desagrada mucho’ (Pacheco-Delahaye y Testa, 2005). En una primera evaluación se contó con la participación de seis jueces no entrenados de ambos sexos y edades comprendidas entre 18 y 27 años, pertenecientes a la comuna Temuco, los cuales evaluaron los seis tratamientos. Los jueces necesitaron utilizar los sentidos del olfato, vista, gusto y tacto para completar la encuesta de evaluación sensorial de los productos (Benson Institute, 1996). Para las calificaciones se consideraron las notas del 1,0 al 5,0, tomando como nota mínima para que el producto sea aceptable la nota igual o sobre 4,0 (Astorga, 2012). La aceptabilidad, fue considerada como el promedio de todos los parámetros evaluados, este parámetro es de gran importancia en el desarrollo de productos, ya que determina si éste será aceptado o rechazado por el consumidor, o simplemente si le será indiferente (Fellow, 1994). Con los resultados obtenidos de la primera evaluación se realizó una segunda evaluación sensorial, donde 18 jueces no entrenados tuvieron que utilizar las habilidades sensitivas antes mencionadas, para juzgar a los tres tratamientos elegidos por el primer panel. Para esta evaluación los jueces comprenden individuos de ambos sexos y edades entre 18 y 59 años, pertenecientes a las comunas de Parral, Santiago, Gorbea, Quillón y Temuco, esta cantidad de jueces fue mayor a la utilizada por Morales de León et al. (2000); Hurtado et al. (2001); Alasino et al. (2008). La evaluación sensorial se realizó sobre los mismos parámetros y utilizando la misma escala hedónica de calificación que en la primera evaluación. 43 | INNOVAGRO | www.agronomiauct.cl
Análisis de datos Los resultados obtenidos se sometieron a un análisis de varianza y a la prueba de comparación múltiple de Tukey (p>0,05), en el programa JMP 8.0. El análisis de los datos para la evaluación sensorial se realizó comparando las medias obtenidas en las encuestas y con un nivel de significancia del 5%. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Evaluación de humedad Los porcentajes de humedad obtenida en el desarrollo de esta línea de proceso, para cada uno de los tratamientos se muestran en la Figura 2. Los porcentajes de humedad fluctuaron entre 27,03 y 32,45%, valores por debajo de los presentados por Youssef et al. (2007) quienes informan un rango de 46,4 a 48,8%, y asegurando una durabilidad de los snacks de hasta un año, almacenándolos en condiciones óptimas de temperatura y humedad.
Figura 2. Porcentaje de humedad de todos los tratamientos. T1: carne con sal y tomillo, T2: carne con sal y merkén, T3: carne con sal y semillas de cilantro, T4: carne con sal y romero, T5: carne con sal y pimienta blanca, T6: carne con sal y laurel. La humedad de los snack fue determinada en distintas instancias, siendo éste el parámetro utilizado para determinar que el producto ya estaba listo y no necesitaba más tiempo de deshidratado, lo que permitió deshidratar la carne el tiempo adecuado para así evitar tener residuos grasos en la carne consecuencia de un tiempo de secado insuficiente o una carne sobre secada, lo cual habría afectado los parámetros organolépticos como el color, textura, aroma y apariencia de la misma. Estos parámetros pueden ser usados para definir la calidad sensorial de un alimento (Di Monaco et al., 2008). La textura es uno de los factores más importantes para la elección de un alimento por parte de un consumidor (Bertozzi y Panari, 1993), se define como la propiedad sensorial de los alimentos, que es detectada por los sentidos del tacto, la vista y el oído, y que se manifiesta cuando el alimento sufre una deformación (Razeto et al., 2004), además de ser el parámetro en el que tiene mayor influencia el proceso de deshidratado, ya que un sobre secado o falta de éste podría ocasionar una mala textura, siendo una desventaja para éste o cualquier producto deshidratado.
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La elección de temperaturas para el ciclo térmico se realizó apuntando a favorecer la deshidratación paulatina inicial de la carne, para evitar un inconveniente común cuando se quieren alcanzar niveles altos de deshidratación, que es el incremento casi en igual medida de la ganancia en sólidos, lo cual no siempre es conveniente, debido a que se alteran considerablemente las propiedades organolépticas del producto y se dificulta la eliminación de la humedad remanente, en el caso en que el soluto ganado se acumule superficialmente formando una corteza (Zapata-Montoya y Castro-Quintero, 1999). Curva de deshidratado Para determinar la curva de deshidratado, se realizaron evaluaciones del peso de las muestras en distintas intervalos de tiempo de deshidratado, resultado de esto se determinó que el tiempo de secado total para todos los tratamientos fue de 5,5 horas, alcanzando un peso constante a las 4,5 horas. El realizar esto, permitió conocer los tiempos necesarios para planificar la línea de proceso, ya que los productos deshidratados tienen múltiples beneficios. Algunos de los más importantes y de gran valor para la sociedad de hoy en día, que busca el ahorro de energía tanto en el almacenaje como otras etapas de la producción de alimentos. Además, esta técnica previene el colapso de las estructuras internas, pérdida de textura, desarrollo microbiano y decoloración, problemas frecuentes al momento de determinar la calidad de un alimento. Por otro lado, los productos deshidratados permiten ser almacenados a temperatura ambiente por largos períodos de tiempo (Jarayaman y Das Gupta, 1995). Por lo mismo, se hace necesario controlar estos factores, con el propósito de minimizar su impacto sobre la calidad y garantizar la vida útil del alimento (Watada et al., 1990). Los pesos obtenidos en las distintas etapas del deshidratado de la carne fueron registrados en la Figura 3, la cual evidencia que a partir de los 270 minutos de secado las muestras no variaron su peso, lo que se mantuvo así por tres evaluaciones consecutivas. Esto permitió determinar cuándo concluir el deshidratado de la carne.
Figura 3. Curva de deshidratado de los snack tipo charqui. Variación de volumen Las variaciones de volumen entre la carne fresca y la carne deshidratada, se muestran en la Figura 4. Estas fluctuaron entre un 70,8 y un 78,2%, lo que demuestra una gran variación de volumen durante el proceso de secado. Los tratamientos T3 y el T2 fueron los que presentaron la mayor y menor variación, respectivamente.
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Figura 4. Cambio de volumen de los snack tipo charqui. La contracción de las muestras durante el secado afectó a cada uno de los parámetros medidos para obtener el volumen de forma diferente, el parámetro que más varió fue el largo de las muestras debido a que el dimensionado se orientó en favor de las fibras musculares, el que en promedio varió 78,82%, seguido por el ancho de las muestras que varió en promedio 73,9% y por último el parámetro que menos fue alterado por el deshidratado fue el grosor, el cual varió un 37,15%. A continuación, en el Cuadro 2 se muestran el valor inicial, el valor final y el porcentaje de variación para cada tratamiento. Cuadro 2. Variación porcentual de los parámetros medidos (±E.E). Parámetro Largo
Ancho
Grosor
Tratamiento T1 T2 T3 T4 T5 T6 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T1 T2 T3 T4 T5 T6
Inicial (mm) 134,8±7,4 115±5,1 138,7±3,7 109,1±2,0 115,1±6,8 119,4±57 59,8±3,9 58,4±2,7 56,7±0,4 58,3±2,7 62,5±2,8 64,3±7,8 9,6±1,0 9,4±1,0 10,3±0,3 8,4±0,3 12,0±1,0 9,8±0,2
Final (mm) 108,7±8,7 84,8±0,3 113,3±0,9 83,7±6,1 92,7±6,2 95,1±5,5 45,7±4,4 41,1±2,5 43,7±1,1 44,1±1,5 46,3±2,0 44,1±2,0 3,4±0,1 3,6±0,2 3,8±0,1 3,9±0,2 3,5±0,2 3,6±0,4
Porcentaje de variación (%) 80,63 73,73 81,68 76,71 80,53 79,64 76,42 70,37 77,07 77,07 74,08 68,58 35,41 38,29 36,89 46,42 29,16 36,73
Estos valores son de gran utilidad en una línea de proceso para reducir las pérdidas, ya que al tener en conocimiento cómo se comportará el material primario durante el proceso de deshidratado permite dimensionar el material fresco, considerando la forma en la que la carne variará de tamaño al secarse. Esto permite que el producto se adecue al tamaño del envase final.
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Rendimientos El rendimiento para los productos realizados en este ensayo se muestra en el Cuadro 3. Cabe destacar que el tratamiento que mayor rendimiento obtuvo fue el charqui con sal y merkén con un 38,1% y el que menor rendimiento presentó fue el tratamiento de charqui con sal y semilla de cilantro seca con 32,3%. No hubo diferencia significativa entre los tratamientos para el rendimiento. Cuadro 3. Rendimientos para todos los tratamientos (±E.E). Producto T1 T2 T3 T4 T5 T6
Peso inicial (g) 65±7,6 60,3±4,4 67,7±3,2 55,5±2,0 59,7±5,1 64,1±5,3
Peso final (g) 21,3±1,8 19,2±2,0 25,8±0,7 20,3±0,4 21,2±1,6 22,2±1,6
Rdto. (%) 32,3 38,1 31,8 36,6 35,5 34,6
diferencia significativa según prueba de Tukey (P > 0,05) No hubo
En general, el rendimiento de los productos deshidratados es bajo, pero presentan variadas ventajas ya que al reducir el contenido de humedad de ellos se previene el crecimiento de microorganismos y se minimizan las demás reacciones que los deterioran (Doymaz y Pala, 2003), conservando así los mismos nutrientes y vitaminas en un menor volumen de producto. Además, el valor de estos productos es elevado, ya que por lo general se comercializan como productos gourmet. Panel sensorial Los seis tratamientos fueron evaluados para obtener una calificación que permitiera determinar si son aceptables o no para los jueces evaluadores. De acuerdo con Risvik et al. (1997), el realizar una evaluación por parte de un panel sensorial permite conocer la percepción popular de un producto y con esto reconocer las preferencias de los consumidores. El Cuadro 4 muestra las calificaciones de todos los tratamientos para los parámetros de apariencia, color, textura, aroma y sabor, con lo que se calculó la aceptabilidad de los productos elaborados en este estudio. Cuadro 4. Promedios de la evaluación sensorial realizada a los seis snack tipo charqui (±E.E). Tratamiento Apariencia Color T1 3,2±0,3 a 2,5±0,2 b T2 4,0±0,3 a 4,0±0,2 a 3,0±0,3 a 3,0±0,2 ab T3 4,3±0,3 a 3,8±0,4 a T4 4,0±0,3 a 4,0±0,2 a T5 3,0±0,2 a 3,8±0,1 a T6
Textura 3,0±0,4 ab 4,3±0,3 a 2,8±0,3 b 4,2±0,3 ab 4,3±0,3 a 3,3±0,3 ab
Aroma 2,8±0,5 b 4,0±0,2 ab 3,0±0,2 ab 4,3±0,2 a 3,8±0,3 ab 4,3±0,3 a
Sabor 3,5±0,3 a 4,7±0,2 a 3,7±0,2 a 4,7±0,3 a 4,7±0,2 a 3,7±0,4 a
Aceptabilidad* 3,0 b 4,2 a 3,1 b 4,3 a 4,2 a 3,6 ab
Letras distintas dentro de las columnas indican diferencias estadísticamente significativas para la prueba Tukey (p>0,05). *La nota que define la aceptabilidad de los tratamientos es sobre 4,0.
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Los resultados obtenidos de esta primera evaluación permitieron seleccionar los tres tratamientos con la diferencia significativa de mejor aceptabilidad. Estos fueron T2: merkén, T4: romero y T5: pimienta blanca. Además, de contar con la aceptabilidad de los jueces, éstos poseen, gracias a sus aditivos, otras características que los hacen interesantes para el desarrollo de un producto alimenticio. Dentro de los tratamientos uno de los que presenta buena aceptabilidad es el charqui con merkén. Este condimento es elaborado ancestralmente por la etnia Mapuche de la Región de La Araucanía (Leonelli et al., 2011) el que además presenta un componente cultural y tiene una reconocida aceptación en diversas preparaciones, incluyendo las carnes rojas. Incluido dentro del grupo de los mejor evaluados el charqui con romero, que es un condimento que va muy bien con las carnes rojas en términos culinarios (Castillo, 2011), y pimienta blanca también es uno de los que por su aceptabilidad es una apuesta innovadora apuntando a paladares más refinados, por tener un sabor suave y a la vez intenso, además por sus aceites esenciales es un buen antioxidante y tiene propiedades anticancerígenas (Montane, 2012). Una vez seleccionados los tres tratamientos, se revisaron los comentarios de los jueces en relación a estos productos, los tratamientos que no fueron seleccionados fueron mayormente criticados por, su apariencia y textura, ya que los aliños como el tomillo y laurel, tiñen levemente la carne, dándole así una apariencia negativa para los consumidores. La textura de las semillas de cilantro no fue agradable al paladar. Los jueces también tuvieron comentarios para los tratamientos con una mejor aceptabilidad, entre los que destacaba que el “sabor de los productos no fue claramente identificable” y “tenían un sabor muy suave”, sin tener influencia negativamente en la evaluación del producto. Con esta información se realizaron algunas mejoras, como moler más los aliños con el fin de mejorar la impregnación y con esto el sabor final del producto. Una vez realizadas estas mejoras a los tres tratamientos seleccionados, se realizó un panel sensorial, con un mayor número de jueces, los que evaluaron los productos utilizando el mismo sistema que en la primera evaluación sensorial (Cuadro 5). Cuadro 5. Aceptabilidad para los tratamientos elegidos por los jueces (±E.E). Tratamientos Apariencia T2 4,3±0,1 T4 4,0±0,2 4,2±0,2 T5
Color 4,3±0,2 4,2±0,1 4,1±0,1
Textura 4,2±0,2 4,4±0,2 4,3±0,1
Aroma 4,5±0,1 4,1±0,1 4,3±0,1
Sabor 4,5±0,1 4,6±0,1 4,7±0,1
Aceptabilidad 4,4 4,2 4,3
No hubo diferencia significativa según prueba de Tukey (P >0,05) El análisis de las evaluaciones de los tratamientos seleccionados no evidenció diferencia significativa para los parámetros evaluados. En cuanto a la apariencia, para todos los tratamientos evaluados en esta segunda instancia fue considerada buena ya que presentan evaluaciones sobre 4,0 siendo los tres tratamientos bien evaluado debido a que la presencia de estos aditivos en la carne le da un aspecto descrito como “apetitoso” y “deseable” a este producto. El color de los snack tipo charqui, se ve influenciada por los aditivos, en el caso del merkén influyó que este aditivo mantiene su coloración durante el deshidratado y esto se nota en el producto final, dándole así un color que a criterio de los jueces lo hace “apetitoso” al realzar los colores naturales de la carne. En tanto, para el charqui con romero y el charqui con pimienta blanca, la evaluación del color fue igual de satisfactoria ya que el romero fue molido evitando así que las partículas de la hierba fueran muy notorias y la pimienta blanca no es detectable, dejando sólo el color de la carne como único detectable. 48 | INNOVAGRO | www.agronomiauct.cl
Por otra parte, el aroma de un producto es un parámetro muy importante para la evaluación de un alimento, si algo no huele bien no apetece comerlo, es por esto que un aroma extremadamente fuerte es tan perjudicial como un aroma poco perceptible. Para este parámetro los evaluadores consideraron que el aroma a pesar de ser suave y no evidenciar fuertemente el aditivo asignado era “agradable” y “deseable”. El sabor de un alimento está influenciado por todas las etapas de su procesamiento, tanto las etapas previas a algún proceso térmico como la cocción o el deshidratado, y en los tiempos o en los ingredientes que se le añadan. Al ser un aspecto tan importante en la evaluación esta cualidad es determinante para la aceptabilidad del snack tipo charqui. Los tres tratamientos fueron bien evaluados para este parámetro y algunos de los comentarios de los jueces se basaban en lo poco usuales que eran para un charqui, el cual asociaban con sabores descritos como “monótonos” o “típico”, dejando así al producto aquí desarrollado con comentarios como “innovador” y “novedoso”. La aceptabilidad general es el promedio de las calificaciones de todos los parámetros evaluados, los tres tratamientos elegidos tuvieron buenas calificaciones lo que generó una buena aceptabilidad de los productos desarrollados. El charqui con romero, si bien presentó una aceptabilidad buena, sufrió críticas en la apariencia, debido a que las partículas de la hierba, aunque se redujeron de tamaño aún son visibles y poco apetecidas por los jueces. CONCLUSIONES • La evaluación del snack tipo charqui a base de carne de caballo salada y aromatizada obtuvo nota 4,0 dentro de una escala hedónica del 1,0 a 5,0, considerándose un producto apetecible para el consumidor. • La línea de proceso tuvo una duración de alrededor de 20 horas hasta obtener un producto terminado, lo que podría ser mejorado con algunas implementaciones tecnológicas de baja complejidad, haciendo de esta línea de producción, una línea eficiente para el desarrollo de alimentos. • Todos los tratamientos para los snacks tipo charqui presentan una potencialidad en el mercado ya que fueron bien evaluados por los jueces en los parámetros de apariencia, color, aroma, textura y sabor. LITERATURA CITADA Astorga, A. 2012. Protocolo para la elaboración de harina y snack crocante de garbanzo (Cicer arientinum L.). 21 p. Tesis Ingeniero Agrónomo. Facultad de Recursos Naturales. Universidad Católica de Temuco. Temuco, Chile. Alasino, M., O. Andrich, y N. Sabbag. 2008. Panificación con harina de arvejas (Pisum sativum) previamente sometidas a inactivación enzimática. Archivos Latinoamericanos de Nutrición 58(4): 397-402. Bertozzi, L., and G. Panari. 1993. Cheeses with Appellation d’Origine Controlée (AOC). Factors that affect quality. International Dairy Journal 3:297-312. Benson Institute. 1996. Aceptabilidad de tortillas elaboradas a base de maíz + soya en tres comunidades del oriente de Guatemala. Disponible en http://www.bensoninstitute.org/Publication/RELAN/V14/ Aceptabilidad.asp. Leído el 15 enero de 2012. Castillo, E. 2011. El acento en la cocina. Disponible en http://www.estampas.com/2011/05/29/el-acento-en-lacocina.shtml. Leído el 24 de agosto de 2012. Di Monaco, R., S. Cavella, and P. Masi. 2008. Predicting sensory cohesiveness, hardness and springiness of solid foods from instrumental measurements. Journal Texture Studies 39:129-149. Doymaz, I., and M. Pala. 2003. The thin-layer drying characteristics of corn. Journal of Food Engineering 60(2): 125-130.
49 | INNOVAGRO | www.agronomiauct.cl
EROSKI. 2010. Aporte de hierro y vitamínico de la carne equina. Disponible en http://www.consumer.es/ web/es/alimentacion/aprender_a_comer_bien/alimentos_a_debate/2001/09/04/193832.php. Leído el 21 de julio de 2012. Fellow, P. 1994.Tecnología del procesado de los alimentos. 549 p. Ed. Acribia. Zaragoza, España. García, M., M. Cortez, y E. Rodríguez. 2010. Evaluación del secado de perejil aplicando técnicas de deshidratación osmótica como pretratamiento. Revista de la Facultada de Agricultura de Medellín 63(2): 223. Gatica, A., Í. Pereira, y O. Vallejos. 2011. Líquenes epífitos: una herramienta para estudiar la continuidad ecológica en Isla Mocha, Chile. Gayana Botánica 68(2): 226-235. González, A., A. Espinoza, A. Cañizares, y J.R. Mendez. 2008. Obtención de un polvo de ají dulce (Capsicum chinense) producido mediante deshidratación por aire forzado. Revista Científica UDO Agrícola 8 (1): 118-126. Grupo CEO. 2005. Carnes de pasturas. Revista Angus 227: 58-61. Hurtado, M. L., B. Escobar, y A. Estevez. 2001. Mezclas legumbre/cereal por fritura profunda de maíz amarillo y de tres cultivares de frejol para consumo “snack”. Archivos Latinoamericanos de Nutrición 51 (2):303308. INDECOPI. 2006. Disponible en http://www.pronaa.gob.pe/intranet/pagina_intranet/archivos/RAL/ especificaciones_tecnicas/Especificaciones_2012/ET_CHARQUI_1M2012.pdf. Leído el 8 de agosto del 2012. Jarayaman, K.S., and D.K. Das Gupta. 1995. Handbook of industrial drying. 690 p. Marcel Dekker Inc. New York. Krokida, M. K., V.T. Karathanos, Z.B. Maroulis, and D. Marinos-Kouris. 2003. Drying kinetics of some vegetables, Journal of Food Engineering 59(4): 391-403. Leistner, L. 1987. Water activity: theory and applications to foods. 328 p. Marcel Dekker. New York, EE.UU. Leonelli, G., C. Díaz, R. Tighe, C. Castillo, F. Pardo, y I. Birlouez-Aragon. 2011. Heterogeneidad del color en formulaciones de merkén elaboradas a partir de ecotipos de ají (Capsicum annuum L.) cv. “Cacho de cabra”. Idesia 29(3): 109-115. Lonnecker, S., E. Boyle, K. Getty, D. Buege, S. Ingham, G. Searls, and N. Harper. 2010. Production methods and product characteristics of jerky produced by small and very small meat processing businesses. Journal Muscle Foods 21: 826-833. Mamani-Linares, W., y C. Gallo. 2011. Composición química y calidad instrumental de carne de bovino, llama (Lama glama) y caballo bajo un sistema de crianza extensiva. Revista de Investigación Veterinaria de Perú 22(4):301-311. Mamani-Linares, W., y R. Cayo. 2011. Características físico-químicas del charqui de llama. Revista de Investigación Veterinaria de Perú 22(4):290-300. Mani. 2012. Amimani, productos de valle de Aconcagua, charqui. Disponible en http://www.mani.cl/charqui. html. Leído el 16 de agosto de 2012. Marin, E., M. Lemus, V. Flores, y A. Vega. 2006. La rehidratación de alimentos deshidratados. Revista Chilena de Nutrición 33(3):527-538. Montane, J. 2012. Para qué sirve la pimienta beneficios, propiedades, tipos, usos. Disponible en http://suite101. net/article/para-que-sirve-la-pimienta-beneficios-propiedades-tipos-usos-a43113. Leído el 24 de agosto de 2012. Morales de León, J., M.L. Cassis, y P. Cecisn. 2000. Obtención de un extracto de garbanzo (Cicer arietinum L.) fermentado y su uso como extensor lácteo. Archivos Latinoamericanos de Nutrición 50(2): 157-163. Nijhuis, N., E. Torringa, H. Luyten, F. René, P. Jones, T. Funebo, and T. Ohlsson. 1996. Research needs and opportunities in the dry conservation of fruits and vegetables. Drying Technology 14(6): 1429-1457. Oyague, J., B. Ramos, D. Canales, I. Prieto, y B. Gonzalez. 2010. Características de la carne de alpaca y procesamiento de charki en los departamentos de Puno y Cusco (Perú). 230-233. Ed. Bettit Salvá. Lima, Perú. 50 | INNOVAGRO | www.agronomiauct.cl
Pacheco-Delahaye, E., y G. Testa. 2005. Evaluación nutricional, física y sensorial de panes de trigo y plátano verde. International Nomenclature of Cosmetic Ingredients 30(5): 300-304. RAE. 2012a. Real academia española. Disponible en http://lema.rae.es/drae/?val=marinado. Leído el 22 de julio de 2012. RAE. 2012b. Real Academia Española. Disponible en http://lema.rae.es/drae/?val=rendimiento. Leído el 11 septiembre de 2012. Razeto, B., F. Romero, y E. Araya. 2004. Influencia de algunas propiedades organolépticas en la aceptabilidad del fruto de palto (Persea americana Mill.). Agricultura Técnica 64(1): 33-37. Risvik, E., J.A. McEwan, and M. Rodbotten. 1997. Evaluation of sensory profling and projective mapping data. Food Quality 8:63-71. Schnettler, B. 2012. Satisfacción con la alimentación en personas Mapuches de la Región de La Araucanía, Chile. Revista Chilena de Nutrición 39 (1):18-29. Thomet, M., y J. Sepúlveda. 2006. Estudio de factibilidad para la promoción y comercialización del merkén de Lumaco. 81 p. Programa Araucanía Tierra Viva. Lumaco, Chile. Watada, A.E., K. Abe, and N. Yamauchi. 1990. Physiological activities of partially processed fruits and vegetables. Food Technology 40(5): 116-122. Youssef, E., Y. Garcia, C. Rocha, F. Yamashita, and M. Shimokomaki. 2007. Chemical basis for beef charqui meat texture. Brazilian Archives of Biology and Technolology 50(4) 719-724. Zapata-Montoya, H., y G. Castro-Quintero. 1999. Deshidratación osmótica de frutas y vegetales. Revista Facultad Nacional de Agronomía 52(1): 451-466.
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PLANTACIÓN DE ARÁNDANOS EN ALTA DENSIDAD, UNA ALTERNATIVA PARA LOS PRIMEROS AÑOS DE PRODUCCIÓN Marcelo Rodríguez B.1. Cristóbal Castillo B., Christian Gallegos M2. 1 Escuela de Agronomía, Universidad Católica de Temuco. Rudecindo Ortega 02950. Temuco. Email: marodrig@uct.cl; fono: 45-205536. 2Viveros Maranello. christian@maranello.cl INTRODUCCIÓN En las especies frutales cada vez se ha ido aumentando la densidad de plantas por hectárea, para frutales mayores se han utilizado patrones enanizantes, como en el caso de los cerezos, los portainjertos Gisela han sido probados y posteriormente, plantados en forma importante en los principales países productores de cerezas, llegando a ser el portainjerto enanizante y semienanizante más utilizado en el mundo. Para el caso de berries el uso de patrones e injertos no es una alternativa, ya que en su mayoría poseen una estructura de multieje, no obstante, desde que fue introducido el arándano en Chile, el marco de plantación se ha ido disminuyendo, especialmente la distancia sobre hilera. Es así como en los inicios de las plantaciones de arándano en Chile se utilizaban marcos de plantación de 1,5 m x 3,0 m, por lo que la densidad de plantación era de 2200 plantas por ha. Posteriormente, a partir del año 2000 se utilizaron distancias de 1,0 m x 3,0 m lo que corresponde a 3.333 plantas por ha. No obstante lo anterior, las empresas han ido aumentando la densidad de plantas a fin de optimizar sus recursos y obtener un mayor ingreso económico por superficie, estos ensayos comúnmente no son publicados y a veces carecen de rigor científico para su validación, razón por la cual se presenta el siguiente estudio (Muñoz y Moreira, 2002). En las últimas dos décadas, se puede ver un incremento notable de la producción frutícola en la zona sur del país, una de las razones es el aumento de la demanda a contra estación. El hecho de producir fruta en los meses de escasez en los grandes mercados consumidores de arándano fresco de calidad, ha sido una gran ventana para las exportaciones chilenas, lo cual ha llevado a un incremento importante en el sector frutícola y en la industria de los frutos congelados. Su cultivo comercial se inicia a mediados de los 80 en el sur del país. Durante la temporada 2007- 2008 presenta aumentos en el volumen exportado del orden de las 30 mil toneladas, mostrando un incremento de un 42%, con respecto a la temporada anterior, con valores superiores a los 195 millones de dólares (US$ FOB) (Contreras, 2010). En los últimos años, la producción frutícola es una de las más importantes actividades económicas de Chile. Esto se debe fundamentalmente, a las ventajas comparativas que posee el país, para enfrentar las exigencias de los mercados externos, ya sea de contra estación o bien, de aquellos países que por condiciones climáticas se ven limitados de una buena producción. El arándano es un frutal que en los últimos años ha logrado posicionarse como un fruto de importancia en nuestro país. Esto se debe a dos motivos principales: las características nutricionales del fruto, el cual es rico en antioxidantes, vitaminas y minerales y por otro lado, por poseer un mercado capaz de demandar fruta por sobre las 250.000 toneladas al año (Estados Unidos). Dado estos antecedentes, más la ventaja de Chile de producir fruta en contra estación, hacen de este rubro una alternativa de producción muy interesante y con buenas perspectivas (García, 2006).
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Una de las decisiones más importante al momento de hacer una inversión, es saber cómo optimizar los recursos, y qué tan pronto se recuperará la inversión. Es por esto, que saber cuántas plantas se pondrán por ha-1 y su rendimiento estimado, es fundamental dentro de cualquier proyecto. El rendimiento de los frutales varía en función de la edad de las plantas: a medida que avanzamos en el tiempo, el rendimiento aumenta hasta llegar a un tope que se mantiene durante algunos años, entre estos factores que influyen, están las enfermedades, malezas y plagas, granizo, heladas, lluvia y otros (Forbes et al., 2009). Otros aspectos relevantes en el rendimiento, es la variedad a utilizar y el clima de la zona, por ejemplo el arándano alto “highbush” puede alcanzar rendimientos cercanos a los 7000 kg ha-1 en variedades tempranas, variedades tardías cercano a los 11.000 kg ha-1 en su pick de producción. Se estima que el arándano tiene un pick de producción a los 7 años, al menos con los marcos de plantación más utilizados en los últimos años respectivamente (Muñoz, 2010), la producción se inicia al segundo o tercer año de la plantación, pudiendo obtenerse entre 1 y 4 t ha-1. Esta cosecha se incrementa de forma gradual hasta alcanzar la plena producción al sexto o séptimo año, estabilizándose en torno a las 12 a 15 t ha-1. En algunos casos, con determinados cultivares pueden superarse las 20 t ha-1 (García y García, 2011). MATERIALES Y MÉTODOS Ubicación del huerto y material vegetal El ensayo se llevó a cabo en la temporada 2010-2011, en el Fundo el Sauce, ubicado en la comuna de Nacimiento, kilómetro 3 Nacimiento, Región del Biobío, Chile. Ubicación: 37°30’12’’ lat. Sur, 72°40’42’’ long. Oeste. El clima de la región corresponde a mediterráneo templado. El cultivo utilizado fue arándanos (Vaccinium sp.), variedad Duke de 3 años de edad. Descripción de la variedad Duke Esta variedad presenta una alta precocidad con un período tardío de floración. Como arbusto es muy vigoroso, erecto y abierto. El fruto es de tamaño mediano en comparación a otras variedades como Blueray pero de sabor suave y se vuelve más aromático al cabo de varias horas en frío, al contrario de la antes nombrada la cual presenta un sabor pobre. Es de color azul claro, firme, cicatrización pequeña y seca. Una de las ventajas de esta variedad es tener una maduración uniforme, por lo que es apropiado para cosecha mecánica. Es susceptible al cáncer del tallo (Forbes et al., 2009). Condiciones del ensayo El suelo correspondió a serie negrete, textura franco arcilloso. La plantación se encuentra sobre camellones de 20 cm de altura x 70 cm de ancho, en hileras separadas a 0,3 m y 0,6 m sobre la hilera y 3,20 m entre hilera, lo que daba una población de 10.417 y 5.208 plantas ha, orientación Norte-Sur. El predio tiene un sistema de riego goteo de 2 L h -1 por gotero, con una distancia de goteros de 30 cm, con un riego de 20,8 m3 h -1 ha -1, y con una frecuencia de riego 3,5 horas (tiempo de riego toda la temporada), menor cada 3 días (enero a febrero), y mayor cada 5 días los meses de (octubre-noviembre-diciembre). Tratamientos y diseño experimental Se estudiaron dos tratamientos el primero con un marco de plantación de: 0,3 m x 3,2 m (Tratamiento 1) y el segundo de 0,6 m x 3,2 m (Tratamiento 2). Cada tratamiento estuvo constituido por 12 plantas con tres bloques al azar, dando un total de 36 plantas por tratamiento.
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Las mediciones realizadas fueron: número de frutos por planta, peso y calibre de frutos. El número de fruto se evaluó con el fruto en estado de pinta, el peso y calibre de fruto se evaluó en estado de cosecha. Para el conteo de frutos totales por planta, se marcaron con pegote (cinta de papel), desde la base a la copa, comenzando con los brotes de corona de la base, de izquierda a derecha, marcando cada ramilla con cinta. A los resultados se les aplicó análisis de varianza (ANDEVA), al nivel P= 0,05. Para todo el análisis se usó el programa estadístico SPSS 15.0. En la temporada de cosecha 2011, de cada planta se cosecharon cinco frutos al azar. Estos frutos fueron pesados individualmente en una balanza de precisión (0,01 g). Los pesos fueron registrados en una hoja de campo, para posteriormente ser registrados en una base de datos. El calibre fue medido con un pie de metro digital (marca Veto). RESULTADOS Y DISCUSIÓN Efecto de la densidad de plantas sobre rendimiento El inicio de cosecha fue el 04 de diciembre 2010, las densidades de plantación de 0,3 m x 3,2 m (10.416 plantas ha-1), presentó un mayor rendimiento por ha, siendo muy superior como se observa en la Figura 4, dentro de este gráfico se observan diferencias significativas del Tratamiento 1 sobre el Tratamiento 2. Ambos, marcos de plantación se consideran de alta densidad, en Chile a partir del año 1979, el marco de plantación para arándano alto ha evolucionado de 2 m x 3 m a 1 m x 3 m, es decir de 1.667 a 3.333 plantas ha-1. Por razones prácticas, asociadas al uso de maquinaria agrícola, la distancia de 3 m entre hileras se ha mantenido inalterable, por la cual el incremento de la densidad de plantación se realizado ajustando la distancia sobre la hilera. No obstante, se considera que Chile utiliza altas densidades de arándano en comparación a las utilizadas por otros países. En la actualidad predomina la idea que las plantas deben ser distribuidas en rectángulo (Muñoz, 2010). Uno de las razones que explica la utilización de una baja densidad de plantación, es que antiguamente existía la necesidad de regar por surcos y controlar malezas en forma mecánica. Actualmente, el uso de riego por goteo, de herbicidas y mulch, permiten una mayor densidad (Donoso y Lemus, 2008). La mayor densidad de plantación es una tendencia en la fruticultura mundial y entre los factores que justifican su utilización están: el mayor rendimiento sobre todo en los primeros años de producción, y en algunos casos una mayor precocidad, es decir, las plantas entran en la etapa productiva más temprano. En una alta densidad en arándano, se espera que la etapa de formación sea más corta que en plantaciones de baja densidad, de modo que la entrada en producción sea precoz, principal objetivo de la alta densidad (COPEFRUT, 2007). Para el caso de frutales mayores el uso de portainjertos enananizantes a permitido un incremento significativo de la densidad de planta, especialmente en manzano y cerezo. Para el caso del avellano europeo se a utilizado como estrategia una alta densidad inicial para reducir el periodo de baja productividad inicial y aumentar los rendimientos; posteriormente, se eliminan árboles hasta quedar con la densidad adecuada para plantas adultas. Este manejo de la densidad se conoce como marco dinámico (Ellena, 2009).
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Figura 4. Rendimientos promedio de arándano (V. corymbosum) en plantas de 3 años bajo dos densidades de siembra. La línea sobre la barra indica el error estándar de la media. Calibre del fruto Para ambos tratamientos se logró obtener un calibre promedio que califica en su totalidad dentro de los parámetros de calidad para la exportación de fruta fresca, 14,2 mm para ambos tratamientos sin diferencias estadísticas. Para no tener rechazo no puede tener un tamaño menor a 10 u 11 milímetros (Forbes et al., 2009). Al respecto, Contreras (2010) señala que existen factores genéticos que inciden en el desarrollo del calibre del fruto, como ejemplo, menciona el arándano bajo (lowbush), cuyo carácter dominante es el calibre pequeño. Estudios realizados en arándano ojo de conejo (rabbiteye), señalan que el tamaño de la fruta y el número de semillas estarían ligados genéticamente. Otro aspecto importante, es el número de frutos por planta lo cual se regula con la poda, lo que incide finalmente en el calibre del fruto (Bañados, 2009). Peso del fruto En el peso del fruto tampoco se encontraron diferencias estadísticamente significativas. Los pesos promedio de los tratamientos fueron para el Tratamiento 1 (30 cm) 1,45 g y para el Tratamiento 2 (60 cm) 1,47 g. Estos datos reflejan pesos promedios aceptables para exportación, el peso va muy ligado al calibre, por ejemplo los frutos que registran el mayor calibre ecuatorial presenta el mayor peso promedio, y que éstos a su vez presentan el mayor porcentaje de firmeza, lo que mejora la calidad de la fruta, y la hace mejor viajera a la hora de exportar. Número de frutos por planta Los promedios de número de fruto por plantas fueron: Tratamiento 1, 516 frutos planta-1, y el Tratamiento 2, 544 frutos planta-1. Realizado el análisis de varianza, se puede inferir que en esta variable no se observaron diferencias estadísticamente significativas entre los tratamientos 1 y 2. De lo anterior se puede inferir que las densidades de plantas utilizadas en este ensayo no afectaron al número de flores por planta, ni la polinización y cuaja. El número de frutos puede ser modificado a través de la intensidad de la poda invernal, ya que ésta define el número de yemas florales que quedaran en cada planta (Bañados, 2005).
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CONCLUSIONES • El incremento de la densidad de plantas no afectó el calibre promedio del fruto, ni el peso del fruto, ambos parámetros superaron la exigencias mínimas para la exportación, tampoco se registró un efecto en el número de frutos por planta. • Por otra parte tampoco se observaron diferencias significativas en el calibre; sin embargo, puede ser que a medida que el cultivo avance en edad las diferencias sean significativas por efecto de la competencia. • El tratamiento 1, con un marco de plantación de 0,3m*3,20m, tuvo un mayor rendimiento por ha, debido básicamente a la mayor densidad utilizada en comparación al tratamiento 2. • Si bien es cierto la mayor densidad involucra un mayor costo de establecimiento debido al mayor número de plantas utilizadas, no obstante, el establecimiento de arándanos en alta densidad debe considerarse como una alternativa para obtener un más rápido retorno de la inversión inicial. También, debemos considerar que el costo de la planta de arándano a disminuido en los últimos años, esto responde a una sobreoferta de los viveros y una desaceleración de la superficie plantada. • No obstante, los buenos resultados obtenidos con alta densidad, se necesita seguir evaluando los próximas temporadas ya que probablemente la diferencial de rendimiento se estrechará; por otra parte, es probable que pudieran también haber cambios en la fenología en especial con la fecha de cosecha LITERATURA CITADA Bañados, P. 2009. Algunos factores de pre-cosecha que inciden en la producción de arándanos de calidad. Disponible en http://www.asoex.cl/admin/PaginaWeb/Biblioteca/Archivos/bajar2.asp?id_ c=1554&tabla=biblio_archivo. Leído el 26 de septiembre de 2011. Bañados, P. 2005. Claves para la poda de arándano. Agronomía y Forestal U.C. 25(1): 28-31. Contreras, M. 2010. Efecto de la aplicación de CPPU sobre calidad de fruta en arándano alto (Vaccinium corymbosum L.) cultivar Elliott. 52 p. Tesis Ingeniero Agrónomo. Universidad de la Frontera. Facultad de Recursos Naturales. Escuela de Agronomía. Temuco, Chile. COPEFRUT S.A. 2007. Especial de Arándanos. Revista frutícola Copefrut S.A. 28 (3): 118. Donoso, J., y G. Lemus. Establecimiento de huertos frutales. 104 p. Boletín INIA N° 173. Rengo, Chile. Ellena, M. 2009. Frutales y viñas, avellano europeo. Tierra Adentro N° 83 p. 27- 28. Forbes, P., E. Mangas y N. Pagano, 2009. Producción de arándanos.67 p. Tesis ingeniero en Administración de Negocios Agropecuarios. Universidad Nacional de la Pampa, Facultad de Agronomía. La Pampa, Argentina. García, F. 2006. Uso de distintos tipos de mulch como alternativa orgánica de control de malezas en arándano (Vaccinium corymbosum L.) ‘O’neal’. 21 p. Tesis Ingeniero Agrónomo. Universidad de Concepción, Facultad de Ciencias Agropecuarias y Forestales. Chillan, Chile. Muñoz, C. 2010. Cultivo del arándano en Chile. p. 52 – 55. In V Simposio Nacional do Morango IV Encontro sobre Pequenas frutas e Frutas Nativas do Mercosul. Embrapa, Pelotas Río Grande Do Sul. 21 - 23 de septiembre del 2010. Embrapa, Pelotas Rio Grande, Brasil. Muñoz, C., y I. Moreira. 2002. Prácticas actuales recomendadas para el cultivo de arándanos. Tierra Adentro N° 47 p. 28.
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EFFECTS OF A PROGRAM FOR THE RECOVERY OF ACIDIC VOLCANIC ASH SOILS IN THE ARAUCANIA REGION (SOUTH CHILE): IMPACTS ON ACIDITY AND PHOSPHORUS AVAILABILITY.
Marcelo Toneatti B1., Jean Roger-Estrade2. Área de Producción Animal, Escuela de Agronomía, Facultad de Recursos Naturales, Universidad Católica de Temuco. Rudecindo Ortega 02950. Temuco. Email: mtoneatt@uct.cl. 2 AgroParisTech, Francia. 1
INTRODUCTION In the Southern temperate part of Chile, Andisols are the dominant soil type. In this area (the Region Araucania), they are called « Trumaos ». Those soils exhibit a clay fraction dominated by allophane, which induces a strong retention of phosphorus (P), and, consequently, a low availabilty of this nutrient, essential for plant growth. Moreover, acidity is high in those soils, which is also detrimental to phosphorus availability (Pinochet et al., 2005) and promotes a high level of aluminium (Al3+), toxic for crops (Besoain, 1999). These characteristics considerably limit soil productivity, especially in the meadows, which are vital for small cattle breeders. The same characteristics not only hinder plant growth in general but also block the growth of legumes (Ritchie, 1989). Native pastures of this region thus have a very low productivity and express a very peculiar flora, which consists essentially of grass, some legumes adapted to the high acidity of the soil, and some other aluminiumtolerant species adapted to an acidic environment (Mora et al., 2000). Moreover, since they have been used for agriculture, these soils received minimal doses of fertilizers, calcium and organic amendments. This has worsened the problems. Finally, overgrazing caused also problems of erosion. These conditions are very hard on the Mapuche farmers of this area, whose main activity is cattle breeding (ovine and bovine) and whose farms are very small. As a response, since 1997 the State of Chile has developed a program called “Incentive System for the Recovery of Degraded Soils ” (hereafter called the SIRSD program), whose aim is to help producers improve the fertility of trumaos lands. The program focuses on improving the availability of P through phosphate supplements and liming, in order to decrease acidity and the content of free aluminium in the soil. The program also aims at establishing a meadow (generally a mixture of grass and legumes) to ensure a permanent coverage of the soil, thus limiting erosion and increasing productiviy and quality of forages. The program also includes other actions (such as the creation of terrasses to fight erosion, the set up of cover-crops, etc.) but these have been seldom applied in the area object of this study, and therefore they will not be discussed in this paper. This program has been operational for more than a decade. The aim of this study is to evaluate its effects on soil properties and on meadow productivity in the region of the Araucania, home of small producers Mapuche. In order to answer these questions, we selected a series of fields that participated in the program in four municipalities of the precordillera and in one municipality of the Andes Cordillera. We analysed the soil in those fields, for two consecutive years characterized by very different weather conditions: year 2007 was relatevely humid and hot, while year 2008 was marked by a severe drought, a cold winter and a cold beginning of spring.
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Materials and methods Hypothesis on the effects of the SIRSD program on P availability Arrows in Figure 1 shows relations between program actions and changes expected in the soil. The liming supplied brings about an increase in the pH. This, in turn, causes an increase in the mineralization of organic matter (arrow 1a) (Campillo, 1995) and, by favouring the insolubilization of aluminium, affects the quantities of exchangeable aluminium (arrow 1c) and extractable Al (arrow 2). The decrease of extractable aluminium favours phosphorous availability (arrow 3) (De la Fuente and Herrera, 1999), and decreases exchangeable aluminium. The establishment of grasslands increases the restoration of organic matter, which contributes to the fixation of H+ ions (arrow 1b). Phosphoric fertilizers affect directly P availability (Helyar, 1998). Finally, the productivity and the quality of the meadow benefit from the decrease in pH (arrow 7), the decrease of exchangeable aluminium and the increased availability of P (arrow 5).
Figure 1. Hypothesis on the effects of the program SIRSD. The actions of the program (establishment of the meadow, liming, phosphoric fertilization) are boxed with continuous lines, the soil properties acted upon are boxed with thick dashed lines, the sought-after quality and productivity of the meadow are boxed with fine dotted lines. Site description We worked in four municipalities in the precordillera zone of the Araucania Region (Curacautín, Vilcún, Cunco et Villarrica) and in one municipality in the Cordillera area (Lonquimay). We chose a synchronic approach. In each area, we selected fields that had not been subjected to the program (these old permanent grasslands were considered to represent the soils in their natural, poor fertility status, and therefore these soils were used to estimate the baseline or “initial” soil test values for the properties considered in this study). They were compared to fields subjected to the program one, two, three or four years earlier. The number of fields studied and the dates of the treatment are shown in table 1. In each community the locations have been selected in order to cover the spectrum of trumaos soils of the region. In Lonquimay, the soil appears as N. R. (not registred in the map of soils): it is a very recent soil of vulcanic origin, still in the process of formation. It shows characteristics different from those typical of trumaos, and there is almost no literature about it (Mella and Kühne, 1985).
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The fields received calcium carbonate (2 tha-1) and superphosphate (450 kg P2O5.ha-1). They were sown with a mixture grass/legume in the Precordillera area, and with Alfalfa (Medicago sativa) at Lonquimay, in the cordillera. Phosphorus and calcareous lime were added only once 2, 3, 4 and 5 years before soil analysis (performed in 2007 and 2008). All fields that did not receive the SIRSD program (the controls) supported very old native pastures. Each value in Figures 2-4 is the average of 4 to 8 measured values. For a better analysis of time related variations, data are presented with their relative value in reference to the control. Table 1. Subdivision of the 32 fields sampled in each municipality, with reference to the application of the program at the time of measurement.
Soil analysis Soil samples were taken in October 2007 and in October 2008, using a gauge. The 0-20 cm layer was sampled. We mixed the soil of eight sub-samples for each field. Each sample was analyzed at the soil laboratory of the Catholic University of Temuco. All samples were prepared and analysed according to the rules of the Commission for Normalisation and Accreditation of the Chilean Society of Soil Science (Sadzawka et al., 2004). To determine the pH value, 20 g of soil were suspended in water (ratio soil/solution = 1/2.5); the pH of the solution was measured after 2 hours. For the analysis of exchangeable aluminium, 10 g of dry soil were added to a solution of KCl 1 M, then shaken for 30 minutes at room temperature. After filtering, measurements were taken using an atomic absorbtion spectrophotometer. For the analysis of extractable aluminium, 5 g of dry soil were added to a solution of ammonium acetate 1 M, and shaken for 30 minutes, before filtering. 1 mL of filtrate was then mixed with 9 mL of a potassium chloride solution. Then the concentration of aluminium was measured with an atomic absorbtion spectrophotometer. To determine the amount of organic matter, we weighed 2 g of dry soil in an Erlenmeyer flask, then we added 10 mL of sodium dichromate 0.5 mol L-1 and 20 mL of sulphuric acid. After a gentle shake, we let the solution rest for 30 minutes, then added 70 mL of water. After an additional night rest, we measured the organic matter using a colorimetric reaction with reduced chrome. In order to measure phosphorus, we took a sample of 2.5 g of dry soil, we added 0.3 g of active carbon and 50 mL of sodium bicabonate 0.5 M. The solution was shaked for 30 minutes and filtered. The phosphorus was determined by colorimetry with the blue of molybdene method, using ascorbic acid as a reducing agent.
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Results and discussion Application of the program had different effects on the pH of the soil in the different locations studied (Figure 2). At Vilcùn and Villarrica, the program had no effect, and the pH remained unchanged. The increase in pH was temporary at Curacautín and Cunco, where the pH returned to its initial value four years after the program was applied. At Lonquimay, the pH was stable over the whole period, and slightly higher than the control value 4 years after the programm was applied.
Figure 2. Relative pH value in the five studied localities. Different letters above bars correspond to significant differences (p=5% ; the absence of letter indicates the absence of difference). pH values of the controls are 5.83, 5.38, 5.31, 5.51, and 5.80, respectively for Lonquimay, Vilcún, Cunco, Villarrica, and Curacautín. 60 | INNOVAGRO | www.agronomiauct.cl
These changes show poor effectiveness of the program in the precordillera area. This can be ascribed to a number of reasons. First, liming in the precordillera was insufficient (2t.ha-1); this is probably the case for Vilcún and Villarrica, where the pH was not altered and at Curacautín, where liming did not prevent soil acidification. Second, liming had a temporary effect: within three to four years, the pH value returned to the same level as before the program, as in Cunco. This outcome is consistent with a number of studies on liming in Southern Chile, and it can be explained by the high rainfalls in the region, causing significant leaching of bases and release of H+ ions.
Figure 3. Relative content of the exchangeable Al (Alex) in the five studied municipalities. Different letters above bars correspond to significant differences (p=5% ; the absence of letter corresponds to an absence of difference). Alex values of the controls are 0.15, 0.24, 0.73, 0.16, and 0.13 (cmol kg-1), respectively for Lonquimay, Vilcún, Cunco, Villarrica, and Curacautín. 61 | INNOVAGRO | www.agronomiauct.cl
The program had also contrasted effects on the exchangeable Aluminium (Alex) content (Figure 3). Alex decreased significantly at Lonquimay, while it increased at Vilcún and Curacautín between the first and the fourth year after the program was applied. Alex remained unchanged at Villarica and Cunco. We can put forward different hypotheses explaining these results. First of all, it appears that the actions taken in the program are unable to correct consistently the pH in all municipalities but in Lonquinay. The program consisted of only one lime addition, and lime quantity was small. Lime addition was not sufficient to achieve the results observed by Pérez (1986) or by Pinochet et al. (2005), who showed pronounced effects on the levels of exchangeable aluminium (and on the saturation rate of the complex by aluminium). A second possible explanation of the disappointing results can be given by the generalized use of urea for nitrogen fertilization (in this area, it is the cheapest nitrogen source). Urea acidifies soils and can cause an increase in the amount of exchangeable aluminium. Finally, the impact of the program on P availability (P-Olsen) was also different between municipalities (Figure 4). At Lonquimay, P-Olsen initially significantly increased, showing a positive short-term effect of the program. However, P-Olsen gradually decreased after the first year, until it returned to its initial level. In this location, the decrease of P-Olsen probably results from phosphorus consumption by alfalfa. This explanation is more likely than the fixation by the soil, as the content of exchangeable aluminium is less than 500 mg kg-1. In this area phosphoric fertilizer was first applied (200 kg.ha-1 of P2O5) just before the alfalfa was sown. During the first year of alfalfa cropping, a second fertilization was performed (200 kg.ha-1 of P2O5). These two fertilizations were not sufficient to guarantee the maintenance of available phosphorus levels in the years after the application of the program. Moreover, alfalfa is able to absorb significant quantities of phosphorus, thanks to its well-developed root system. At Vilcún, an increase with time of the P-Olsen content was observed during the whole period. The quantity of exchangeable aluminium was the highest among the all our samples, which caused high toxicity and a poor growth in the grassland; this, in turn, strongly limited phosphorus uptake, which probably explains the observed imbalance. At Vilcún, the untreated control sample was a pasture whose flora is adapted to the particular conditions of the soil. That flora consists mainly of grasses (Agrostis Modesta, Holcus Lanatus). Establishing ray-grass and violet clover (Trifolium pratense L.), not well adapted to acid soil, caused poor productivity in the meadows and, consequently, very low phosphorus uptake. At Curacautín, Villarrica and Cunco, the P-Olsen increased during the first years after the application of the program, but began to decline at the end of the period. In those locations, phosphorus uptake by grasses was hampered by the presence of free aluminium. Moreover, grasslands in those municipalities are grazed, as opposed to Lonquimay, where only hay is harvested. It is likely that the presence of livestock implies P return to the soil via the animal manure.
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Figure 4. Relative content of the P-Olsen content in the five studied municipalities. Different letters above bars, correspond to significant differences (p=5% ; the absence of letter corresponds to an absence of difference). P-Olsen values of the controls are 8.0, 4.10, 3.60, 4.25, and 3.50 mg.kg-1 respectively for Lonquimay, Vilcún, Cunco, Villarrica, and Curacautín.
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Conclusions This analysis leads us to propose several possible ways to improve the program’s effectiveness. 1. The quantities of lime provided initially must be reconsidered and, most of all, it is necessary to repeat the liming (every 3-4 years) in order to have more lasting effects on the pH. An even more important aspect is to curb the washing out of bases, an important risk in this area prone to conspicuous rainfalls. 2. In a similar way to the liming, the phosphoric fertilization must be part of a global strategy for improving P availability. Such strategy should be based on a balance of P that takes into account the increase of output with the increase of the meadow productivity. P supply should be repeated in time. Lastly, this strategy must also integrate phosphurus recycling through cattle manure. This whole strategy is essential to keep a sufficient proportion of legumes in the meadow. 3. The program should also integrate some actions on the meadow management. For example, new methods of nitrogen fertilization, based on a nitrogen balance, should be spread. Use of urea should be avoided; cattle population per surface area should be limited, to avoid overgrazing. References Besoain, E. 1999. Los suelos volcánicos y la fertilización fosfatada. p. 13-21. In Besoain, E., W. Rojas, y A. Montenegro (Eds.). Las rocas fosfóricas y sus propiedades de uso agrícola en Chile. Colección de libros INIA. Santiago, Chile. Campillo, R. 1995. Encalado de alfalfa en suelos Trumaos del Sur de Chile. 16 p. Boletín Técnico N° 223. Centro Regional de Investigación Remehue. Osorno, Chile. De la Fuente, J., and L. Herrera. 1999. Advances in the understanding of aluminum toxicity and the development of aluminum-tolerant transgenic plants. Advanced in Agronomy 66:103-120. Helyar, K. 1998. Efficiency of nutrient utilization and sustaining soil fertility with particular reference to phosphorus. Fields Crops Research 56:187-195. Mella, A., y A. Kühne. 1985. Sistemática y descripción de las familias, asociaciones y series de los suelos derivados de materiales piroclásticos de la zona Central-Sur de Chile. p. 548-716. In Tosso, J. (Ed.). Suelos volcánicos de Chile. Instituto de Investigaciones Agropecuarias. Santiago, Chile. Mora, M.L., F. Gallardo, F. Borie, y R. Demanet. 2000. Algunos avances en la relación suelo-planta en suelos ácidos de Chile. Boletín de la Sociedad Chilena del Suelo, 14: 163-168. Ordóñez, R., D. Kheraiwish, M.J. Polo, J. V. Giráldez, y P. González. 2005. Influencia del encalado sobre la movilidad de metales en un suelo contaminado en el valle del Río Guadiamar (Sevilla). Estudios de la Zona No Saturada del Suelo 7: 29-32. Pérez, R. 1986. Efectos del encalado en la neutralización del aluminio intercambiable y sobre el crecimiento del tomate (Lycopersicon esculentum). Agronomía Tropical 36(1-3): 89-110. Pinochet, D., F. Ramírez, y D. Suárez. 2005. Variación de la capacidad tampón en suelos derivados de cenizas volcánicas. Agricultura Técnica 65(1): 55-64. Ritchie, G. 1989. The chemical behavior of aluminium, hydrogen and manganese in acid soils. p. 1-60. In Robson, A. (Ed.). Soil acidity and plant growth. Academic Press, Australia. Sadzawka, A., M. Carrasco, R. Grez, y M. Mora. 2004. Métodos de análisis recomendados para los suelos chilenos. 113 p. Comisión de Normalización y Acreditación, Sociedad Chilena de la Ciencia del Suelo (CNA). Santiago, Chile.
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DIGESTIÓN RUMINAL DE PROTEÍNAS Alejandro Velásquez1, Rodrigo Arias1. 1 Área de Producción Animal, Escuela de Agronomía, Facultad de Recursos Naturales, Universidad Católica de Temuco. Rudecindo Ortega 02950. Temuco. Email: avelasquez@uct. cl; fono: 45-553929. Núcleo de Investigación en Producción Alimentaria. ABSTRACT In this review it examines the importance of understanding the dynamics of protein degradation in the rumen ecosystem. It stands for these purposes a component of efficiency and sustainability in productive ruminants systems. Also, it introduces the concepts of synchronization energy-nitrogen, microbial protein synthesis and proteolysis kinetics. Moreover, it discusses the factors of physiology and protein digestibility in the rumen. Key words: proteins, digestión, rumen. INTRODUCCIÓN La predicción de la dinámica de degradación de las proteínas en el ecosistema ruminal, constituye una información de trascendental importancia para obtener una alta y sustentable eficiencia en la nutrición de rumiantes productivos. Su dimensión conceptual y práctica puede ser apreciada en los sistemas de formulación de raciones, en la fisiología de la utilización del nitrógeno y de la energía en el rumen, en la búsqueda del bienestar animal y en el impacto ambiental de la excreción de compuestos nitrogenados desde el rumiante a su entorno natural (Givens et al., 2000; Van Duinkerken et al., 2005; Kaswari et al., 2007; Riasi et al., 2008). Los alimentos poseen diferentes compuestos nitrogenados en su constitución química y presentan una alta variabilidad en su composición molecular, magnitud y ubicación celular, provocando un comportamiento nutricional y en su cinética de degradación en el rumen muy impredecible (Van Soest, 1994; Stern et al., 1997; Encinias et al., 2005). La falta de información insesgada respecto a la real degradabilidad de las proteínas en el rumen, puede provocar errores importantes al momento de alimentar a los rumiantes. La subestimación del verdadero aporte de N al medio ruminal, es un fenómeno que normalmente sucede en las estrategias de nutrición, incrementando de esta forma los compuestos nitrogenados disponibles. Si bajo estas circunstancias se produce además una baja disponibilidad de energía para los microorganismos, se incrementará la excreción de N fecal. Simultáneamente, el epitelio ruminal tenderá a absorber el exceso de N, no utilizado por los microbios, para mantener el equilibrio nitrogenado en el rumen, y para generar una homeostasis entre este último y el nivel plasmático de N en el animal. Esta alta absorción de N traerá posteriores consecuencias metabólicas a nivel hepático, renal y en la glándula mamaria, con el consecuente incremento de compuestos nitrogenados en la orina y en la leche (Kornegay, 1996; Van Duinkerken et al., 2005). La variación en la disponibilidad de nitrógeno para los microorganismos del rumen, tiene efectos múltiples, no sólo en la cinética de degradación de las proteínas y en la síntesis de proteína microbiana, sino que también, en la dinámica de degradación del resto de los nutrientes de la dieta, principalmente de los carbohidratos estructurales y no estructurales de las células vegetales (Stern et al., 1994; Kornegay, 1996; Yan y Agnew, 2004; Hristov et al., 2008). También, se debe considerar el perjuicio económico para el productor al incluir en forma desajustada suplementos proteicos en las raciones alimenticias. Luego, el conocimiento de la real disponibilidad de los compuestos nitrogenados, para los planos de alimentación en rumiantes, constituye una información, que en parte, deberá provenir de tablas de aporte de nutrientes de los alimentos cuyos datos se basen en métodos para la predicción de la degradabilidad de las proteínas lo más exactos y representativos del ecosistema ruminal (Givens et al., 2000). Si bien las metodologías usadas comúnmente para predecir la cinética de proteolisis en el rumen estiman dicha degradabilidad con un cierto grado de aproximación y seguridad, la mayoría de estas técnicas, en general, presentan una serie de limitaciones y factores perturbadores, los cuales pueden provocar estimaciones sesgadas de la real degradabilidad de las proteínas en el medio ruminal (Nocek y Grant, 1987; Broderick, 1987; Russell et al., 1992; Sniffen et al., 1992; Robinson et al., 1996; Mustafa et al., 2001; Yan y Agnew, 2004; Encinias et al., 2005). 65 | INNOVAGRO | www.agronomiauct.cl
Estas limitaciones en las metodologías tradicionales, constituyen uno de los principales obstáculos para optimizar la eficiencia del uso de los recursos proteicos en la alimentación de rumiantes, creando la necesidad de investigar alternativas metodológicas innovadoras, de tal forma que permitan establecer sistemas de predicción de la degradabilidad de las proteínas lo más representativas de los eventos hidrolíticos involucrados en la proteolisis ruminal (Roe et al., 1991; Calsamiglia et al., 1992; Shannak et al., 2000; Broderick et al., 2004). Factores y fisiología de la proteolisis ruminal La cinética de degradación de las proteínas en el rumen se ve afectada por factores bióticos y abióticos, los cuales regulan y determinan la dinámica de hidrólisis de los compuestos nitrogenados y también, la variabilidad del metabolismo nitrogenado en el ecosistema ruminal. Entre los factores abióticos más relevantes del medio ruminal, se pueden citar, junto a sus valores normales: temperatura (39ºC); pH (6,0 a 7,0); osmolalidad (300 a 400 mOsml-1); potencial de oxidación (Eh=-250 a -450 mV); concentración de O2 (10-22 M); CO2 (58 a 65%); H2 (0,15 a 0,2%); CH4 (20 a 27%); N2 (6 a 7%); NH4 (1 a 100 mM) y H2O, proporción variable (Asplund, 1994; Van Soest, 1994; Pawelek et al., 2008). Los factores biológicos más incidentales tienen relación con la disponibilidad de energía y nitrógeno para los microorganismos del rumen, involucrando todos los procesos de fermentación de los carbohidratos (estructurales y no estructurales) y de los compuestos nitrogenados. Ocupan además un lugar destacado dentro de los factores bióticos, las interacciones entre los microbios y los sustratos a degradar (mecanismos de adherencia y colonización de partículas), el reciclaje del N a nivel ruminal e intermediario del rumiante, también, todos los mecanismos de regulación (genéticos y no genéticos) de la actividad proteolítica microbial, la cinética de escape de partículas y retención ruminal, así también, el consumo y frecuencia de alimentación. Se agrega a lo anterior, la interacción hidrolítica que exhiben los grupos de microorganismos al momento de degradar la materia orgánica en el rumen. El hecho que bacterias proteolíticas presenten simultáneamente una actividad amilolítica o fibrolítica, determina los acontecimientos sintróficos que exhiben los consorcios microbiales del rumen al degradar las proteínas de los alimentos. En efecto, se pueden citar como ejemplo las bacterias Succinimonas amylolytica; Bacteroides amylophilus; Selenomonas ruminantium y Streptococcus bovis, las cuales presentan simultáneamente actividad proteolítica y amilolítica, o las bacterias Prevotella ruminícola y Butirivibrio fibrisolvens, cuya actividad hidrolítica se sustenta tanto en la degradación de proteínas como de celulosa. Estos grupos de bacterias exhiben una estrecha relación trófica en la de-polimerización de celulosa (amorfa o cristalina), hemicelulosa o almidón. En la degradación de los carbohidratos estructurales (pared celular), diversos tipos de microorganismos aprovechan este fenómeno para poder hidrolizar proteínas ubicadas en estas paredes y también, para poder ingresar al interior de las células y así proseguir con su actividad proteolítica. También, proteínas comprometidas físico-químicamente con complejos almidonosos, de difícil accesibilidad, pueden ser liberadas producto de la acción de amilasas bacterianas o de algunos grupos de protozoos. Este fenómeno de sintrofía es probablemente la principal estrategia trófica que presentan los consorcios microbiales del rumen al degradar la materia orgánica de los alimentos (Chamberlain y Choung, 1995; Kornegay, 1996; Bull, 2001; Hristov et al., 2008). En consecuencia, estos fenómenos degradativos permiten establecer que la actividad proteolítica depende en forma importante de la acción cooperativa y sinérgica de diversas enzimas hidrolíticas ruminales (Kornegay, 1996). Cabe señalar, que las proteínas de los alimentos son degradadas a péptidos, oligopéptidos, dipéptidos y aminoácidos en el rumen, bajo la acción nucleofílica llevada a cabo por diversas proteasas sobre los enlaces peptídicos, cuya estrategia de ataque puede ser endoproteolítico o exoproteolítico. Esta proteolisis ocurre generalmente al exterior de las células, en algunos casos íntimamente asociada a la pared bacteriana (adsorción de proteínas) y en otros, en forma libre en el medio ruminal. Algunas bacterias hidrolizan péptidos intracelularmente, dependiendo de la especie y cepa bacteriana, y también, del tamaño y características bioquímicas de los péptidos a degradar (Asplund, 1994). Los protozoos, por otro lado, suelen engullir proteínas, partículas, bacterias e incluso otros protozoos. 66 | INNOVAGRO | www.agronomiauct.cl
Por lo tanto, su actividad proteolítica generalmente sucede a nivel intracelular. De esta forma, se esperaría una alta concentración de proteasas al interior de los protoplasmas de estos microbios, en el periplasma de las bacterias, en la superficie de éstas, como así también, en el medio ruminal más íntimo y cercano al microhábitat establecido al interior y exterior de las partículas alimenticias colonizadas (Figura 1).
Figura 1. Fluido ruminal de vaca mostrando algunas interacciones bióticas de este ecosistema; degradación de la materia orgánica por bacterias y protozoos, previa colonización y adherencia de estos microorganismos sobre las partículas de alimento (Velásquez, 2008). Los aminoácidos generados luego de la proteolisis ruminal, según la estrategia metabólica, pueden ser destinados directamente para la síntesis de proteína microbial, o bien, deaminados, produciendo amonio e isoácidos. Probablemente, esta última opción sea la más recurrente. Por ejemplo, en la deaminación de valina, leucina e isoleucina se obtienen como productos finales de la reacción isobutirato, isovalerato y 2-metilbutirato, respectivamente, más amonio y dióxido de carbono. Estos ácidos pueden constituir factores de crecimiento para muchos organismos celulolíticos y otras especies de bacterias que utilizan estos ácidos grasos como cadenas carbonadas. Estos isoácidos más amonio, normalmente sirven para la síntesis de novo de aminoácidos microbianos (Ørskov, 1992; Van Soest, 1994; Chamberlain y Choung, 1995; Bull, 2001). Esta síntesis de aminoácidos es regulada en parte por la actividad de las enzimas glutamina sintetasa, NADP-glutamato dehidrogenasa y NAD-alanina dehydrogenasa, cuyos Km para la fijación de amonio son de 1,8; 1,8 a 3,1 y 70 mM de amonio, respectivamente (Asplund, 1994). Este grado de afinidad enzima sustrato, implicará por un lado, que el nivel de actividad de las enzimas precedentemente señaladas, dependerá de la concentración de N en el medio ruminal e intracelular de los microorganismos (Figura 2). A su vez, esta variabilidad en la acción de estas enzimas, influirá en la magnitud y en la diversidad de los aminoácidos sintetizados y consecuentemente, en el posterior anabolismo proteico de las bacterias y protozoos del rumen. Esto último, por extensión, influirá en los niveles de disponibilidad de proteasas para hidrolizar los polipéptidos de los alimentos (Chamberlain y Choung, 1995; Bull, 2001). Se ha sugerido además, que la concentración de amonio, aminoácidos y péptidos en el ambiente ruminal e intracelular, pueden regular la expresión génica de las enzimas amino-sintetasas y también, la dinámica de síntesis de proteína microbiana. 67 | INNOVAGRO | www.agronomiauct.cl
ENZIMA
REACCIÓN NADH
NAD-glutamato dehidrogenasa
! -Oxoglutarato
NAD
Transaminasas piridoxalfosfato
Glutamato
SÍNTESIS AMINOÁCIDOS
NH3
Km (amonio mM)
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PROTEÍNA MICROBIAL
Principal medio de asimilación de amonio
Figura 2. Mecanismo de asimilación de amonio por microorganismos ruminales, señalando la constante de afinidad enzima-sustrato (Km) y las enzimas involucradas en este proceso (Asplund, 1994). Bajo otro aspecto, se ha demostrado que la actividad proteolítica de los microorganismos puede ser sometida a una sustrato-inducción in vitro, enriqueciendo por ejemplo, los medios de cultivo de fluido ruminal con sustratos proteicos y energéticos, estimulando de esta forma la síntesis y secreción de peptidasas y carbohidrasas microbiales en forma específica, según sea el nicho ecológico que presenten los microorganismos inducidos (Hungate, 1966; Velásquez y Pichard, 2010). Este fenómeno, por extensión, sucede también in vivo. Diferentes tipos de dietas tendrían un efecto sobre la biodiversidad microbiológica del rumen. Se ha sugerido que un plano de alimentación rico en fibra (FDN), estimularía la actividad enzimática de consorcios microbiales celulolíticos (Bacteroides succinógenes; Ruminococcus albus; Fibrobacter succinogenes; Ruminococcus flavefaciens o Butyrivibrio fibrisolvens). Luego, esta condición favorecería la vía Piruvato-Acetyl-CoA-Acetato o PiruvatoAcetyl-CoA-Aceto-acetil-CoA-Butirato, en desmedro de la vía Piruvato-Lactato-Acrilato-Propionato. Estos cambios en la biodiversidad microbiológica, y como consecuencia en el balance de los ácidos grasos volátiles, puede influir, por ejemplo, en el contenido porcentual de grasa en la leche (aumento a mayor producción de ácido acético), o en el estatus y perfil proteolítico del ecosistema ruminal (Asplund, 1994; Van Soest, 1994). Luego, las dietas deberán ser lo suficientemente balanceadas en fibra, energía y fuentes nitrogenadas para poder mantener un steady state ruminal en forma más permanente (Kaswari et al., 2007). Otro fenómeno ecológico que se presenta en el rumen, es la interacción trófica conocida como cross-feeding, la cual se observa normalmente entre diversos grupos de microorganismos del rumen. Este hecho involucra, por ejemplo, que bacterias que crecen activamente utilizando aminoácidos o amonio, no son proteolíticas, pero sí fibrolíticas (Ruminococcus albus), proveyendo de esqueletos carbonados a aquellas proteolíticas que liberan aminoácidos o amonio al medio ruminal. Un caso notable de cross-feeding es observado entre Fibrobacter succinogenes y Selenomonas ruminantium, donde la primera degrada la celulosa en presencia de CO2, generando celobiosa, succinato, acetato y formato. A su vez, el succinato es fermentado secundariamente por Selenomonas sp., generando propionato, acetato y CO2, este último, requerido por Fibrobacter sp. (Van Soest, 1994). 68 | INNOVAGRO | www.agronomiauct.cl
Se ha establecido que la extensión y tasa de los eventos hidrolíticos de los sustratos alimenticios en el rumen dependen del balance y disponibilidad de ATP, el cual es utilizado normalmente para la síntesis de proteína, excreción de enzimas, colonización y adherencia microbial en las partículas alimenticias, y también, para el crecimiento y división celular. En efecto, si la tasa de degradación proteica excede a la capacidad de síntesis de proteína microbiana, asociada a una baja fermentación de carbohidratos en el tiempo preciso (insuficiente energía fermentable ruminal), se acumulará amonio en el medio y en los microbios, siendo afectado negativamente el crecimiento poblacional de los consorcios microbianos, implicando una menor producción de biomasa celular. Esta situación conducirá a un detrimento en la síntesis total de proteína, trayendo como consecuencia una disminución de la actividad proteolítica y de la eficiencia de utilización del N a nivel ruminal (Chamberlain y Choung, 1995; Van Duinkerken et al., 2005). Cuando la condición nutricional es inversa, existiendo un exceso de energía disponible con un déficit de N, los microorganismos almacenan estas potenciales fuentes energéticas estratégicamente para un uso posterior, a través de inclusiones carbonadas en los protoplasmas. La ulterior utilización de estas fuentes de energía, en presencia de N, demandará una síntesis extra de carbohidrasas, con el consecuente gasto de ATP involucrado en la síntesis de estas enzimas (Figura 3).
Figura 3. Factores y eficiencia de la síntesis de proteína microbial en el rumen, indicando la importancia de la energía metabolizable fermentable ruminal (FME); proteína degradable ruminal (PDR), donde A, B, Kd y Kp, representan la fracción de N soluble no precipitable con TCA (Nitrógeno No Proteico), fracción nitrogenada enzimáticamente digerible, tasa de proteolisis y tasa de escape ruminal de fracciones nitrogenadas, respectivamente; sincronización energía/N; velocidad de paso (escape) de partículas; consumo de alimento y factores ambientales en el ecosistema ruminal (Sniffen et al., 1992; Velásquez, 2008). Bajo otro aspecto, es interesante destacar desde un punto de vista cinético, que el proceso de degradación de las proteínas tiene especial importancia en tiempos tempranos postingesta (1-6 h), debido a la rápida disponibilidad de los compuestos nitrogenados que presentan la mayoría de los forrajes y suplementos proteicos. 69 | INNOVAGRO | www.agronomiauct.cl
Para el caso de los forrajes frescos se debe considerar, además, la activación de proteasas endógenas del vegetal al momento de su corte, y también, la posterior inducción de estas enzimas en el medio ruminal, como una respuesta al efecto de la temperatura y la condición anaerobia del rumen. Como resultado de este aumento de la actividad de peptidasas endógenas sobre las propias proteínas del vegetal, se produciría un incremento en la concentración de N en el medio, momento en que las proteasas y carbohidrasas microbianas aún no han iniciado su actividad hidrolítica, tiempo de retraso (lag), generando una marcada asincronía energía/N (Zhu et al., 1999; Kaswari et al., 2007; Riasi et al., 2008). LITERATURA CITADA Asplund, J.M. 1994. Principles of Protein Nutrition of Ruminants. Animal Science Research Center. University of Missouri. Columbia. USA. CRC Press. 5:71-111. Broderick, G.A. 1987. Determination of protein degradation rates using a rumen in vitro system containing inhibitors of microbial nitrogen metabolism. Br. J. of Nutr. 58:463-475. Broderick, G.A., P. Udén, M.L. Murphy and A. Lapins. 2004. Sources of variation in rates of in vitro ruminal protein degradation. J. Dairy Sci. 87:1345-1359. Bull, L.S. 2001. Ruminant Protein Nutrition-Basic and Application. Animal and Poultry Waste Management Center. XXVI Reunión Anual. Sochipa. 207-215. Calsamiglia, S., M.D. Stern and B.A. Crooker. 1992. Effects of diets formulated to contain different amounts of rumen non-degradable protein on microbial fermentation and nutrient flow from a continuos culture system. Anim. Feed Sci. Tech. 39:239-252. Chamberlain, D.G. and J.J. Choung. 1995. The importance of rate of ruminal fermentation of energy sourges in diets for dairy cows. Recent Advances in Animal Nutrition. 1:3-27. Encinias, A.M., G.P. Lardy, J.L. Leupp, H.B. Encinias, L.P. Reynolds and J.S. Caton. 2005. Efficacy of using a combination of rendered protein products as an undegradable intake protein supplement for lactating, winter-calving, beef cows fed bromegrass hay. J.Anim. Sci. 83:187-195. Givens, D.I., E. Owen, R.F.E. Oxford and H.M. Omed. 2000. Forage Evaluation In Ruminant Nutrition. UK Biddles Ltd, Guildford and King’s Lynn. pp:480. Hristov, A.N., C.E. Basel, A. Melgar, A.E. Foley, J.K. Ropp, C.W. Hunt and J. Tricarico. 2008. Effect of exogenous polysaccharide-degrading enzyme preparations on ruminal fermentation and digestibility of nutrients in dairy cows. Animal Feed Science andTechnology. 145: 182–193. Hungate, R.E. 1966. The rumen and its microbes. Academic Press, N.Y. Kaswari, T., P. Lebzien, G. Flachowsky and U. Meulen. 2007. Studies on the relationship between the synchronization index and the microbial protein synthesis in the rumen of dairy cows. Animal Feed Science and Technology. 139 : 1–22. Kornegay, E.T. 1996. Nutrient Management of Food Animals to Enhance and Protect the Environment. Lewis Publishers. 11: 151-165. Mustafa, A.F., D.A. Christensen and J.J. McKinnon. 2001. Ruminal degradability of neutral detergent insoluble protein of selected protein sources. Can. J. Anim. Sci. 81:601-603. Nocek, J.E. and A.L.Grant. 1987. Characterization of in situ nitrogen and fiber digestion and bacterial nitrogen contamination of hay crop forages preserved at different dry matter percentages. J. Anim. Sci. 64:552564. Orskov, E.R. 1992. Protein Nutrition in Ruminants. 2º E. Academic Press. The Rowett Research Institute Aberdeen. P:171. Pawelek, D.L., J.P. Muir, B.D. Lambert and R.D. Wittie. 2008. In sacco rumen disappearance of condensed tannins, fiber, and nitrogen from herbaceous native Texas legumes in goats. Animal Feed Science and Technology. 142: 1–16. 70 | INNOVAGRO | www.agronomiauct.cl
Riasi, A., M.D. Mesgaran, M.D. Stern and M.J. Ruiz. 2008. Chemical composition, in situ ruminal degradability and post-ruminal disappearance of dry matter and crude protein from the halophytic plants Kochia scoparia, Atriplex dimorphostegia, Suaeda arcuata and Gamanthus gamacarpus. Animal Feed Science and Technology. 141: 209–219. Robinson, P.H., J.G. Fadel and M. Ivan. 1996. Critical evaluation of diaminopimelic acid and ribonucleic acid as markers to estimate rumen pools and duodenal flows of bacterial and protozoal nitrogen. Can. J. Anim. Sci. 76:587-597. Roe, M.B., L.E. Chase and C.J. Sniffen. 1991. Comparison of in vitro techniques to the in situ technique for estimation of ruminal degradation of protein. J. Dairy Sci. 74:1632-1640. Russell, J.B., J.D. O’Connor, D.G. Fox, P.J. Van Soest and C.J. Sniffen. 1992. A net carbohydrate and protein system for evaluating cattle diets: I. Ruminal Fermentation. J. Anim. Sci. 70:3551-3561. Shannak, S., K.H. Südekum and A. Susenbeth. 2000. Estimating ruminal crude protein degradation with in situ and chemical fractionation procedures. Anim. Feed Sci. Tech. 85:195-214. Sniffen, C.J., J.D. O’Connor, P.J. Van Soest, D.G. Fox and J.B. Russell. 1992. A net carbohydrate and protein system for evaluating cattle diets: II. Carbohydrate and protein availability. J. Anim. Sci. 70:3562-3577. Stern, M.D., G.A. Varga, J.H. Clark, J. Firkins, J.T. Huber and D.L. Palmquist. 1994. Evaluation of chemical and physical properties of feeds that affect metabolism in the rumen. J. Dairy Science. 77:2762-2786. Stern, M.D., A. Bach and S. Calsamiglia. 1997. Alternative techniques for measuring nutrient digestion in ruminants. J. Anim. Sci. 75:2256-2276. Van Duinkerken, G., G. André, M.C.J. Smits, G.J. Monteny and L.B.J. Sebek. 2005. Effect of rumen degradable protein balance and forage type on bulk milk urea concentration and emission of ammonia from dairy cow houses. J. Dairy Sci. 88:1099-1112. Van Soest, P.J. 1994. Nutritional Ecology of the Ruminant. Cornell University. USA. P. 374. Velásquez, A. 2008. New method for the measurement of protein breakdown with ruminal enzyme extracts. Tesis Doctoral. Pontificia Universidad Católica de Chile. Velásquez, A. and G. Pichard. 2010. Effects of rumen fluid pre-incubation on in vitro proteolytic activity of enzymatic extracts from rumen microorganisms. Animal Feed Science and Tech. 162: 75-82. Yan, T and R.E. Agnew. 2004. Prediction of nutritive values in grass silages: II. Degradability of nitrogen and dry matter using digestibility, chemical composition, and fermentation data. J. Anim. Sci. 82:1380-1391. Zhu, W., A.H. Kingston-Smith, D. Troncoso, R.J. Merry, D.R. Davies, G. Pichard, H. Thomas and M.K. Theodorou. 1999. Evidence of a role for plant proteases in the degradation of herbage proteins in the rumen of grazing cattle. J. Dairy Sci. 82:2651-2658.
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EFECTO DE UN HIDROLIZADO DE PESCADO SOBRE LA PRODUCCIÓN DE BIOMASA Y CONCENTRACIÓN DE POLIFENOLES TOTALES EN PLÁNTULAS DE AJÍ (Capsicum annuum L.). Ricardo Tighe Neira1, Gina Leonelli Cantergiani1, Armin Cuevas Riquelme1 y Joaquín Yiancamán Gatica1. 1 Escuela de Agronomía, Facultad de Recursos Naturales, Universidad Católica de Temuco. Rudecindo Ortega 02950. Temuco. Email: rtighe@uct.cl; fono: 45-553901. INTRODUCCIÓN La fertilización foliar corresponde a la nutrición a través de las hojas. Este sistema se ha convertido en una práctica común, ya que corrige las deficiencias nutricionales de las plantas, favorece el buen desarrollo de los cultivos, mejora el rendimiento y calidad del producto; sin embargo, no substituye a la fertilización tradicional (Fregoni, 1986). Durante siglos se han usado principalmente dos fuentes de fertilizantes naturales, los extractos vegetales y los hidrolizados de pescado y algas (HP). Los primeros, se utilizan como alternativa de productos naturales que inciden en el crecimiento, desarrollo y composición de las plantas, su función puede estar relacionada con grupos fito-hormonales endógenos que actúan como retardantes del crecimiento, inductores de floración, promotores de madurez y estimuladores de la producción de biomasa, entre otros López (2003) y Russo et al., (1995). Por otra parte, los HP constituyen una segunda alternativa de productos naturales que contienen una amplia variedad de minerales, carbohidratos y vitaminas, cuyas aplicaciones contribuyen al aumento del vigor, la salud y el rendimiento de los cultivos (SAG, 2009). De acuerdo a lo señalado por Mitchell y Chassy (2009) los nutrientes de las plantas se clasifican en metabolitos primarios (grasas, carbohidratos, aminoácidos y azúcares simples) y metabolitos secundarios (ácidos fenólicos, flavonoides, alcaloides y terpenoides), existiendo normalmente una relación equilibrada de ambos. En cultivos convencionales los metabolitos primarios son maximizados debido a la optimización de las prácticas tradicionales de cultivo. Diversos autores confirman lo anterior, señalando además, que los vegetales bajo condiciones de estrés desarrollan fitoquímicos producto del metabolismo secundario (Edreva et al., 2008) tales como polifenoles, los que se definen como un conjunto heterogéneo de moléculas que comparten la característica de poseer en su estructura varios grupos bencénicos sustituidos por funciones hidroxílicas. La síntesis de estos metabolitos depende de la etapa de desarrollo de la planta y sus niveles constitutivos se incrementan frente a estrés abiótico o biótico (Sepúlveda et al., 2003). Son importantes para la fisiología de las plantas, ya que contribuyen a la resistencia de estas ante microorganismos e insectos, también ayudan a protegerlas en su continua exposición a ambientes con radiaciones ultravioletas y temperaturas altas (Gutiérrez, 2002). García et al., (2005) señalan que las concentraciones de polifenoles totales se ven afectadas por los niveles de fertilización, variedad, época y el clima, así como también de la conservación del material vegetal. Además, son considerados benéficos para la salud humana debido a su caráter de antioxidante (Zhao et al., 2007). En base a lo expuesto, el propósito del presente estudio es evaluar el efecto de distintas dosis de un hidrolizado de pescado comercial sobre variables productivas y concentración de polifenoles totales en plántulas de ají (Capsicum annuum L.).
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MATERIALES Y MÉTODOS El ensayo se llevó a cabo en el campus norte de la Universidad Católica de Temuco, bajo condiciones de invernadero donde se establecieron plántulas de ají (Capsicum annuum L.) cv. Cacho de cabra en contenedores de 1000 cm3, constituyendo la unidad experimental. El HP evaluado contenía un 2% de N y 5% de P2O5, fue aplicado en cuatro dosis conformando los tratamientos del experimento (Cuadro 1). Cuadro 1. Tratamientos del experimento, dosis de producto y agua equivalente por hectárea. Tratamiento T1 T2 T3 T4 T5
HP dosis 1 HP dosis 2 HP dosis 3 HP dosis 4 Testigo (agua destilada)
Dosis HP (L ha-1) 2 4 6 8 0
Agua (L ha-1) 398 396 394 392 400
El producto dosificado se asperjó sobre las plántulas a los 53 y 63 días después de la emergencia (DDE) entre 5 y 7 cm de altura y dos hojas verdaderas, en un volumen total de 3,6 mL por planta, por medio de un aspersor manual de 500 mL. Las evaluaciones correspondieron a muestras destructivas de las plántulas a los 53 DDE (día 0, inicio ensayo), 63 DDE (día 10) y 73 DDE (día 20). Una vez tomadas las muestras se determinó MS parcial a 60ºC por 48 horas a la fracción radicular y aérea en estufa de secado con aire forzado (Binder FD, 5-300ºC). Finalmente, las plántulas deshidratadas se molturaron en un molino eléctrico (Cyclotec 1093 Sample Mill) y se guardaron en bolsas plásticas para determinar concentración de polifenoles totales. Para ello se utilizó el método de FolinCiocalteau, descrito por Georgé et al., (2005), los resultados se expresaron en mg equivalentes ácido gálico (mgEAG 100 g-1) base materia seca (BMS). El diseño experimental fue completamente al azar con cinco tratamientos incluido el testigo y siete repeticiones. Las variables de respuesta fueron sometidas a un análisis de varianza (ANDEVA) y prueba de comparación múltiple de Tukey (p≤0,05), utilizando el software JMP 5.0®. RESULTADOS Y DISCUSIÓN La distribución de la producción de MS indica alta homogeneidad (p>0,05) al día 53 DDE (Figura 1). No existen diferencias (p>0,05) en la producción de MS de raíz (Figura 1A), excepto a los 73 DDE donde el testigo presenta valores significativamente mayores (p≤0,05). En la producción de MS de la fracción aérea (Figura 1B) se aprecian diferencias significativas (p≤0,05) en el testigo a los 73 DDE, respecto de T3. Finalmente, en materia seca total (Figura 1C) se repite la diferencia (p≤0,05) en favor del testigo sobre T3.
Figura 1. Materia Seca (g) de plántulas de C. annuum. A) sistema radicular, B) sistema aéreo y C) total. Letras distintas en columnas de igual tono indican diferencias estadísticamente significativas para la prueba de Tukey (p≤0,05). 73 | INNOVAGRO | www.agronomiauct.cl
Los resultados no concuerdan con lo observado por Canales (2000) quien afirma que la aplicación de fertilizantes preparados con extractos de algas marinas en plantas de C. annuum incrementan la producción de biomasa en un 26,6%, y que al ser aplicados en forma conjunta en el follaje y suelo tienen los mejores rendimientos. Por otra parte, Bula-Meyer (2000) señala que este tipo de fertilizantes tiene distinto efecto dependiendo de la cantidad y momento de aplicación, y que además, depende de la época de recolección de las algas, su estado fenológico y su forma de aplicación, por lo que es posible la respuesta encontrada sea atribuible a un efecto de este tipo. La evolución del contenido de MS de raíz para cada tratamiento en el tiempo, independiente de la dosis, no sigue la misma tendencia creciente que en las hojas, lo anterior se puede deber a un efecto localizado del producto. Este efecto diferencial ha sido observado en aplicaciones de bioestimulantes orgánicos en otras especies (Russo et al., 1995). En términos de concentración de MS es posible destacar el valor del testigo (T5) que a los 53 y 73 DDE no difiere estadísticamente (p>0,05) de los demás tratamientos (Cuadro 2), lo que no sugiere la presencia de bioestimulación por efecto del HP, puesto que los valores más altos se encuentran en las dosis más baja e intermedia del producto y ambas no difieren (p>0,05) del testigo. Cuadro 2. Porcentaje de Materia Seca total de plantas de C. annuum. Tratamientos T1 T2 T3 T4 T5
53 16,2 ± 0,015 b 22,5 ± 0,032 a 20,4 ± 0,014 ab 20,3 ± 0,015 ab 20,5 ± 0,012 ab
DDE 63 23,3 ± 0,008 ab 19,5 ± 0,007 c 22,1 ± 0,001 abc 20,4 ± 0,008 bc 24,8 ± 0,009 a
73 21,9 ± 0,004 a 20,3 ± 0,004 b 21,9 ± 0,004 ab 21,2 ± 0,003 b 23,4 ± 0,006 ab
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadísticamente significativas para la prueba de Tukey (p≤0,05). A diferencia de la homogeneidad inicial en la producción de MS, en altura se aprecian variaciones en el inicio de las mediciones (Figura 2), puesto que las plántulas que constituyeron T1 fueron estadísticamente más altas (p≤0,05) que T2 y T3. Situación que cambia a los 63 DDE de evaluación, dado que T1 presentó menores valores (p≤0,05). A los 73 DDE T1 posee mayor altura (p≤0,05) que los demás tratamientos. A partir de ello, se puede inferir un efecto de la menor dosis (T1) sobre la altura. Resultados de este tipo son atribuibles al efecto directo del HP. Al respecto, Ramos (2000) encontró respuesta en la dosis más baja y la más alta para este parámetro en aplicación de ácidos húmicos sobre otra especie.
Figura 2. Altura (cm) de plántulas de ají para cada tratamiento. Letras distintas en columnas de igual tono indican diferencias estadísticamente significativas para la prueba de Tukey (p≤0,05). En relación a la concentración de polifenoles totales, la condición inicial (53 DDE) muestra (Figura 3) diferencias significativas (p≤0,05) para T3 y T4 sobre los demás tratamientos con valores superiores a 550 mg EAG equivalente a un 33% en promedio a los encontrados a los 63 y 73 DDE de evaluación, los que se encuentran en el orden de los 2100 mg EAG. Esto señala indirectamente la activación del metabolismo secundario de las plantas, producto de un estrés biótico o abiótico (Sepúlveda et al., 2003) previo a la aplicación de los tratamientos. En las aplicaciones sucesivas se observan valores inferiores a la condición inicial, lo que es esperable puesto que el HP genera un efecto bioestimulante, disminuyendo una posible condición de estrés reflejada en la concentración de polifenoles totales. A los 63 DDE se evidencia un efecto estadísticamente menor (p≤0,05) de la dosis mayor (T4) sobre el testigo. 74 | INNOVAGRO | www.agronomiauct.cl
Figura 3. Concentración (mg EAG 100g-1 BMS) de polifenoles totales en plántulas de C. annuum. Letras distintas en columnas de igual tono indican diferencias estadísticamente significativas para la prueba de Tukey (p≤0,05). CONCLUSIÓN No existe efecto de las diferentes dosis del hidrolizado de pescado sobre la producción de MS, sí en altura y concentración de polifenoles totales. No se evidencian efectos claros de bioestimulación como consecuencia por el producto aplicado; sin embargo, se observa un efecto supresor del estrés, reflejado en la concentración de polifenoles totales. LITERATURA CITADA Bula-Meyer, G. 2000. Las macroalgas marinas en la agronomía y el uso potencial del Sargassum flotante en la producción de fertilizantes en el archipiélago de San Andrés y Providencia, Colombia. Revista del Instituto de Investigaciones Tropicales 1(1):91-103. Canales, B. 2000. Enzimas-algas: posibilidades de su uso para estimular la producción agrícola y mejorar los suelos. Terra 17(3):271-276. Edreva, A., Velikova, V., Tsonev, T., Dagnon, S., Gürel, A., Aktas, L., and Gesheva. E. 2008. Stress protective role of secondary metabolites: diversity of functions and mechanism. General and Applied Plant Physiology 34 (1-2): 67-78. Fregoni, M., 1986. Some aspects of epigean nutrition of grapevines. p. 205-211. In Alexander, A. (Ed.). Foliar fertilization. Proceedings of the First International Symposium of Foliar Fertilization by Schering Agrochemical Division, Berlin, Alemania. García, D., Medina, M., y Ojeda, F. 2005. Efecto de la fertilización orgánica, la variedad y la época en el perfil polifenólico de Morus alba L. Revista Avances en Investigación Agropecuaria 9(2):69-85. Georgé, S., Brat, P. Alter, P., y Amiot, M. 2005. Rapid determination of polyphenols and vitamina C in plantderived products. Journal of Agricultural and Food Chemistry 53(5):1370-1373. Gutiérrez, A. 2002. Vino, polifenoles y protección a la salud. Revista Cubana de Alimentación y Nutrición 16(2):134-41. López, H. 2003. Efecto de bioestimulantes en cultivos de papa (Solanum tuberosum) en la zona central de Chile. Resumenes 54º Congreso Agronómico. Simiente 73(3-4):15-61 pp. Mitchell, A., and Chassy, A. 2009. Atioxidants and the Nutritional Quality of Organic Agriculture. Annual meeting of the American Advancement of Science in Chicago. pp. 12-16. SAG. 2009. Sistema nacional de certificación de productos orgánicos agrícolas. 115 p. Servicio Agrícola y Ganadero. Gobierno de Chile Ministerio de Agricultura, Santiago, Chile. Sepúlveda, G., Porta, H., y Rocha, M. 2003. La participación de los metabolitos secundarios en la defensa de las plantas. Revista Mexicana de Fitopatología 21(3):355-363. Ramos, R. 2000. Aplicación de sustancias húmicas comerciales como productos de acción bioestimulantes. Efectos frente al estrés salino. Tesis Doctoral. 335 p. Russo, R., Lugo, J., Arreola, O. 1995. Efecto de un bioestimulante húmico extraído del raquis de banano (pinzote) sobre el crecimiento de plántulas de banano (musa aaa subgrupo “cavendish” don ‘gran enano’). 75 | INNOVAGRO | www.agronomiauct.cl
ASPECTOS FISIOLÓGICOS, BIOQUÍMICOS Y MOLECULARES DE LA TOXICIDAD POR ALUMINIO (Al3+) EN ARÁNDANOS CULTIVADOS EN EL SUR DE CHILE Claudio Inostroza-Blancheteau1,2, Marjorie Reyes-Díaz3,4, Miren Alberdi3,4 1 Núcleo de Investigación de Producción Alimentaria, 2Escuela de Agronomía, Facultad de Recursos Naturales, Universidad Católica de Temuco, Av. Rudecindo Ortega 02950, Temuco. 3Departamento de Química y Recursos Naturales, Facultad de Ingeniería, Ciencias y Administración, Universidad de La Frontera, Av. Francisco Salazar 01145, Temuco. 4Center of Plant, Soil Interaction and Natural Resources Biotechnology, BIOREN-UFRO, Universidad de La Frontera, Temuco.
INTRODUCCIóN La toxicidad por aluminio (Al), es uno de los principales factores que limitan la productividad de especies cultivadas en suelos ácidos alrededor del mundo (Ryan et al., 2011). Cuando el pH es inferior a 5,0 las formas tóxicas de aluminio (Al3+) son solubilizadas en la solución del suelo inhibiendo el crecimiento y la función de las raíces (Figura 1), lo que repercute posteriormente en el rendimiento y calidad de los cultivos (Kochian et al., 2005; Inostroza-Blancheteau et al., 2008). Por otro lado, se ha observado que a nivel fisiológico el Al puede provocar alteraciones a nivel celular, afectando las membranas lipídicas, induciendo desórdenes enzimáticos, así como también perturbaciones en la biosíntesis de los ácidos nucleicos como ADN nuclear y ARNm (Achary et al., 2010; Inostroza-Blancheteau et al., 2012). Además se ha discutido el efecto de la interacción Al-Calcio (Ca), donde se ha observado una perturbación en el Ca2+ citoplasmático, sugiriendo que Al afecta la homeostasis (Al3++Ca2+) de Ca debido a un incremento de la actividad del Ca2+ en el citoplasma (Rengel and Zhang, 2003). Aluminio interactúa con los lípidos de membrana, afectando el metabolismo y causando una rigidificación de la membrana plasmática (Yamamoto et al., 2001). Esto induciría estrés oxidativo a nivel celular por el incremento de las especies reactivas de oxigeno (EROS) (Yamamoto et al., 2003; Inostroza-Blancheteau et al., 2012), lo que podría causar muerte celular programada vía transducción de señales activada por EROS en las células de la raíz (Pan et al., 2001). Por otro lado, se ha observado que a nivel fisiológico la toxicidad por Al afecta negativamente la fotosíntesis neta, el desempeño fotoquímico del fotosistema II, la conductancia estomática, la transpiración, entre otros parámetros (Reyes-Díaz et al., 2009; 2010; Inostroza-Blancheteau et al., 2011a; Mukhopadyay et al., 2012). Sin embargo, las plantas han desarrollo sofisticados sistemas para hacer frente a la toxicidad y el estrés oxidativo inducido por Al (Kochian et al., 2002). Aunque muchas especies de plantas son sensibles a esta toxicidad, la variación genética en la resistencia a Al ha sido reportada en muchas especies (Kumari et al., 2008). La resistencia a Al puede clasificarse en dos tipos de mecanismos: uno basado en la exclusión del Al en la rizósfera, y otro basado en la tolerancia una vez que Al ha ingresado al citoplasma celular (Kochian et al., 2004). También, el sistema antioxidante, cobra real importancia al contrarrestar el estrés oxidativo inducido por Al (Tabaldi et al., 2009; Panda and Matsumoto, 2010).
Figura 1. Efecto de la toxicidad por Al sobre el crecimiento total (A) y de raíz (B) del cultivar Bluegold en comparación a plantas no tratadas con Al (control). El cultivar fue crecido durante 20 d en solución hidropónica no suplementada y suplementada con 100 μM de aluminio como cloruro de aluminio (AlCl3) a pH 4.5. 76 | INNOVAGRO | www.agronomiauct.cl
El arándano alto (Vaccinium corymbosum L.) es una importante especie a nivel mundial que posee altos contenidos en antioxidantes que son beneficiosos para la salud humana (Prior et al.,1998; Ehlenfeldt and Prior, 2001). En Chile, esta especie fue introducida en la década de los 90, con muy buenos resultados adaptativos. Actualmente, la superficie cultivada de arándano alto en nuestro país supera las doce mil hectáreas, actividad que se concentra en la zona centro-sur y sur de Chile, caracterizada por poseer suelos ácidos derivados de cenizas volcánicas recientes (Andisoles), que limitan significativamente el crecimiento y producción de los cultivos (Mora et al., 2006). Aunque el arándano alto se adapta bien a los suelos ácidos (Ireland and Wilk, 2006), poco se conoce sobre los posibles mecanismos y respuestas fisiológicas, bioquímicas y moleculares a la interacción entre un sustrato ácido y la toxicidad por Al en arándano. En la presente revisión nosotros discutimos sobre los recientes avances asociados a los posibles mecanismos y efectos de la toxicidad por Al en arándanos cultivados en el sur de Chile. ACUMULACIÓN Y DISTRIBUCIÓN DEL Al EN PLANTAS CON ESPECIAL MENCIÓN DEL ARÁNDANO Los mecanismos de resistencia a Al, ya sea resistencia por exclusión o tolerancia por acumulación son mediados por procesos de transporte o acumulación en diversas especies (Klug et al., 2011). El Al libre ejerce directamente su efecto tóxico en las raíces de las plantas. En muchos casos es poco absorbido o translocado a la parte aérea, excepto por algunas especies tales como Hydrangea macrophylla, Fagopyrum esculentum y Melastoma malabathricum que pueden ser consideradas acumuladoras. Estas especies son capaces de acumular altas concentraciones de Al (> 3000 mg kg-1 DW) en las hojas, formando complejos Al-aniones orgánicos como mecanismo de tolerancia y quelando el Al en diferentes tejidos (principalmente en la vacuola de las hojas) (Zheng et al., 1998; Barceló and Poschenrieder, 2002; Jones and Ryan, 2003). Especies como Richeria grandis, Melastoma malabathricum y Vaccinium macrocarpon, que se adaptan a suelos ácidos acumulan más de 1000 mg kg-1 DW en las raíces y las hojas (Cuenca et al., 1990; Osaki et al., 1997; Watanabe et al., 1998). En el caso de arándano, estudios recientes muestran una acumulación diferencial de Al en hojas y raíces de los cultivares Brigitta, Legacy y Bluegold crecidos en Chile (> 1000 mg kg-1 DW), encontrándose la mayor acumulación en hojas del cultivar Brigitta (Reyes-Díaz et al., 2009). Otro estudio realizado por los mismos autores en raíces teñidas con hematoxilina (reactivo que evidencia la acumulación de Al) demostró una alta acumulación de Al a las 24 y 48 h de tratamiento en el cultivar Bluegold sin manifestación de recuperación (24 h sin Al) (Figura 2A). Por el contrario, los cultivares Brigitta (Figura 2B) y Legacy (Figura 2C) sólo acumularon Al en los primeros milímetros del ápice radical recuperándose posteriormente. La mayor acumulación de Al en hojas está directamente asociada con la tolerancia a este elemento, lo que coincide con lo descrito para cultivares de Soghum bicolor (Gonçalves et al., 1996).
Figura 2. Acumulación de Al en raíces de tres cultivares de arándano crecidos en solución hidropónica durante 48 h y su posterior recuperación a las 24 h sin Al. La tinción fue realizada con hematoxilina. A: cultivar Bluegold, B: cultivar Brigitta y C: cultivar Legacy. 77 | INNOVAGRO | www.agronomiauct.cl
Por otro lado, cuando las plantas de Fagopyrum esculentum son expuestas a Al, oxalato es rápidamente secretado de los ápices radicales de esta especies (Zheng et al., 1998). En recientes investigaciones tendientes a dilucidar el mecanismo de resistencia a Al y/o manganeso (Mn2+) en V. corymbosum se evaluó la exudación de aniones orgánicos (oxalacetato, citrato, malato y succinato) en los cultivares Brigitta, Legacy y Bluegold. Los resultados mostraron diferencias significativas en los ácidos orgánicos exudados desde las raíces que dependieron de la concentración del catión y del cultivar. En los cultivares Legacy y Brigitta el ácido orgánico mayormente exudado fue oxalacetato seguido de citrato, mientras que Bluegold mostró los niveles mas bajos de ácidos orgánicos en el tratamiento con Mn2+ tóxico (Millaleo et al., 2011). Malato y succinato no mostraron una clara tendencia en V. corymbosum. Tres de estos cuatro aniones orgánicos son capaces de formar complejos con Al, con el siguiente orden de efectividad: citrato>oxalacetato>malato (Jones y Ryan, 2003). Esto estaría directamente asociado con el nivel de tolerancia a metales en las diferentes especies de plantas. PRINCIPALES EFECTOS DE LA TOXICIDAD POR Al EN ARÁNDANO Comparativamente existe menos información sobre los efectos del Al en las hojas que en las raíces. En hojas, la toxicidad por Al induce malformaciones en los cloroplastos, aún cuando no se detecta altas concentraciones de Al en este organelo, indicando efectos indirectos sobre el funcionamiento de los cloroplastos (Moustakas et al., 1995). Varios estudios en distintas especies indican una disminución en el contenido de clorofila total y de la fotosíntesis acompañada de una inhibición parcial del transporte de electrones en el fotosistema II (PSII) en respuesta al Al (Chen et al., 2005a; 2005b; Peixoto et al., 2002; Pereira et al., 2000). Es sabido que las alteraciones del aparato fotosintético por efecto del estrés afectan el metabolismo y productividad de muchos cultivos (Rao and Cramer, 2003). Estudios realizados en arándano bajo tratamientos con Al de tiempo corto indican que los parámetros fotoquímicos disminuyen fuertemente en Bluegold (hasta un 98% de inhibición) y en Lagacy (hasta un 80%) sin una recuperación total. Por el contrario, Brigitta mostró un mejor desempeño fotoquímico (Reyes-Díaz et al., 2009). Por otro lado, en experimentos de tiempo largo (20 d), Bluegold mostró un decrecimiento significativo en la eficiencia fotoquímica efectiva del PSII y del transporte de electrones (ETR), el que fue más bajo que en Legacy en los tratamientos con Al (Reyes-Díaz et al., 2010). Este decrecimiento se reflejó también en el crecimiento total del cultivar Bluegold (Figura 1A). En raíces, el síntoma más evidente de la toxicidad por Al es la rápida inhibición de su crecimiento que puede ocurrir dentro de los primeros 60 minutos en algunas especies como Triticum aestivum (Delhaize et al., 1993; 1995). Sin embargo, en V. corymbosum, este fenómeno es algo más difícil de determinar. No obstante, hemos podido determinar la tasa relativa de crecimiento en arándano alto, en cultivares sometido a estrés por Al y bajo condiciones ácidas por 20 d en solución hidropónica, donde se observa que a medida que aumenta la concentración de Al disminuye significativamente la tasa de crecimiento relativo de la raíz en el cultivar Bluegold, mostrando su sensibilidad a este elemento (Reyes-Díaz et al., 2010) (Figura 3). Otra importante evidencia del efecto tóxico del Al en las raíces de arándano fue recientemente publicado por InostrozaBlancheteau et al. (2011a), donde a través de estudios de cortes histológicos utilizando cultivares de tolerancia contrastante al Al se analizaron las alteraciones estructurales bajo una misma condición de estrés (100 µM AlCl3), observándose que el genotipo resistente a Al (cultivar Brigitta), no exhibe notables modificaciones anatómicas después del tratamiento con Al, comparado con el control y con el cultivar sensible (Bluegold).
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Figura 3. Cambios en la tasa de crecimiento relativo en cultivares de arándano alto sometidas a dosis crecientes de aluminio bajo condiciones de acidez por 20 d. Las letras minúsculas indican diferencias significativas entre los diferentes tratamientos de Al. Los asteriscos indican diferencias significativas entre los cultivares (Tukey test HSD, con P≤0.05). La fuerte interacción del Al con la membrana plasmática es debida mayoritariamente a la carga negativa de los fosfolípidos (Jones y Kochian, 1997). Esta unión causa rigidificación de la membrana, traduciéndose en una menor fluidez de ésta, lo que finalmente afecta su metabolismo (Oteiza, 1994). La peroxidación de lípidos de membrana es considerada un temprano síntoma en plantas sometidas a estrés por Al, siendo muy buen indicador de estrés oxidativo como fue descrito en raíces de Pisum sativum por Yamamoto et al. (2001) y Yamamoto et al. (2003). Este fenómeno ha sido investigado en V. corymbosum, en hojas y raíces de los cultivares Legacy y Bluegold, por 20 d de tratamiento, en Bluegold se observó un incremento de alrededor de 7 veces de la peroxidación lipídica de la raíces comparado con el control en todos los tratamientos de Al (Reyes-Díaz et al., 2010). En estudios realizados con Brigitta, Legacy y Bluegold, se observó el mismo efecto, sin embargo, al aplicar sulfato de calcio a la solución, la peroxidación de lípidos de membrana disminuyó significativamente en hojas y raíces en los tres cultivares (Reyes-Díaz et al., 2011). En la actualidad, es ampliamente aceptado que el Al induce estrés oxidativo, por la inducción de EROS, lo que también podría contribuir a la inhibición del crecimiento radical (Tamás et al., 2004), para mitigar el daño oxidativo, iniciado por EROS. Como se enunció más arriba, las plantas poseen sofisticados sistemas antioxidantes enzimáticos y no enzimáticos (InostrozaBlancheteau et al., 2012). El sistema enzimático involucra enzimas tales como superoxido dismutasa (SOD), ascorbato peroxidasa (APX), glutatión S-transferasa (GST) y Catalasa (CAT). En arándano alto (cultivar Brigitta) el sistema antioxidante es tempranamente inducido ante el estrés por Al, incrementándose la actividad SOD alrededor de 4 veces en hojas después de 2 h de tratamiento, contrariamente a lo ocurrido con Bluegold (Inostroza-Blancheteau et al., 2011a). En las raíces la actividad SOD, fue similar en ambos cultivares, con un incremento de sólo 1,7 veces después de la 6 h de tratamiento y que disminuyó gradualmente hasta las 48 h. En este mismo estudio la actividad CAT, presentó un comportamiento similar a SOD en hojas y un incremento significativo a las 24 h de tratamiento en raíces de arándano. En relación a los componentes no enzimáticos, la actividad antioxidante total en un tratamiento largo de exposición a Al en raíces de V. corymbosum, se observó un alta capacidad antioxidante en el cultivar Legacy, comparado con el control a los 7 d de tratamiento con Al y una casi nula respuesta de la actividad antioxidante en Bluegold (Reyes-Díaz et al., 2010). Recientemente se ha reportado la capacidad antioxidante del fruto de diferentes estados de madurez de estos cultivares, observándose una excepcionalmente alta capacidad antioxidante comparado con el Hemisferio Norte (Ribera et al., 2010). En la actualidad es bien reconocida la cualidad antioxidante de los frutos de arándano. Sin embargo, se ha demostrado que la actividad antioxidante en las hojas puede ser 3 veces superior a la encontrada en los frutos (Kim and Um, 2011), esto le brinda propiedades protectoras excepcionales a esta especie frutícola.
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EFECTOS DEL Al SOBRE EL TRANSCRITOMA DE ARÁNDANO ALTO Muchos esfuerzos a través del mejoramiento tradicional del arándano alto han sido realizados sobre el desarrollo de cultivares con una amplia adaptación climática, como por ejemplo: sobre el incremento de la tolerancia al frío, adaptación a crecer en suelos con pH más altos, resistencia a enfermedades y aumento en la calidad de los frutos son algunas de la aproximaciones que se han realizado en esta especie (Rowland et al., 2012). El desarrollo de herramientas moleculares podría facilitar más rápidamente el mejoramiento de esta especie. Algunos avances se han realizado para secuenciar el transcriptoma, definido como el estudio del conjunto de los ácidos ribonucleicos (ARNs), de arándano alto principalmente asociado a la tolerancia al frío, debido al daño que se produce en los brotes florales y posteriormente en la flor (Walworth et al. 2012). En experimentos con cultivares aclimatados y no aclimatados al frío se han generado más de 1500 ESTs, del inglés “Expressed Sequence Tag” (Dhanaraj et al., 2007), que son secuencias expresadas bajo una determinada condición. Posteriormente, a través de hibridación subtractiva se identificaron más de 500 genes asociados con la aclimatación al frío (Naik et al., 2007). Así como también se esta avanzando con la identificación de marcadores moleculares asociados con la tolerancia al frio en arándano alto para generar un mapa genético y mapear lo QTL asociados a esta condición (Rowland et al., 2003). Recientemente, Li et al. (2012), utilizando perfiles de transcriptoma comparativa identificaron 92 genes expresados diferencialmente, que podrían regular el metabolismo y el contenidos de antocianos en los frutos de arándano. Estudios recientes asociados a la evaluación del efecto del estrés por Al sobre el transcriptoma de arándano alto han sido conducidos en genotipos de arándanos contrastantes a la tolerancia a Al (Brigitta, resistente y Bluegold sensible). Utilizando “cDNA-amplified fragment length polymorphism” (cDNA-AFLP), se pudieron identificar mas de 70 TDFs (Fragmentos derivados de Transcritos), agrupados en 8 categorías funcionales (Figura 4) (Inostroza-Blancheteau et al., 2011b). En la categoría de respuesta a estrés se identificaron algunos genes asociados a estrés oxidativo como glutatión S-transferasa (GST), aldehído deshidrogenasa (ALDH). Estos genes en otros estudios han conferido resistencia a la toxicidad por Al como es el caso de la GST en maíz (Cançado et al., 2005). La ALDH ha sido reportada para conferir resistencia a diversos estreses abióticos (Kotchoni et al., 2010).
Figura 4. Distribución de los fragmentos derivados de transcritos (TDFs) expresados diferencialmente bajo estrés por aluminio en arándano alto. Un total de 70 clones (fragmentos de cDNA-AFLP) fueron agrupados en ocho categorías funcionales y clasificados sobre la base de su homología con las secuencias depositadas en las bases de datos.
La sobre-expresión de ALDH en plantas transgénicas de Arabidopsis thaliana incrementó la tolerancia a NaCl y a metales pasados como Cu2+ y Cd2+. Esto se explica por la disminución de la peroxidación de lípidos derivados de aldehídos reactivos comparados con el tipo silvestre (Sunkar et al., 2003). La expresión de estos genes ha sido evaluada en hojas y raíces de arándano alto sometidas estrés por Al, en los cultivares Brigitta y Bluegold, observándose una mayor expresión de estos genes en las hojas de Brigitta (resistente a Al) (Inostroza-Blancheteau et al., 2011a). Por otro lado, en este mismo estudio se evaluó la actividad antioxidante total en ambos tejidos y cultivares encontrándose dos veces más actividad en las hojas que en raíces, sugiriendose que uno de los posibles mecanismos para hacer frente a la toxicidad por Al en arándano alto, seria la activación de la maquinaria antioxidante a nivel aéreo. Sin embargo, mas esfuerzos a nivel molecular son requeridos, ya que los actuales no son suficientes para un mejor entendimiento de los mecanismos moleculares asociados a la tolerancia a Al en arándano. 80 | INNOVAGRO | www.agronomiauct.cl
CONCLUSIONES Se ha logrado determinar una respuesta diferencial a la toxicidad por Al en los arándanos cultivados en el sur de Chile. Éstos se han basado principalmente en estudios fisiológicos, histológicos y bioquímicos, ya sea en periodos cortos o largos de tratamiento con Al. Se determinó que el cultivar Brigitta es resistente y el cultivar Bluegold, sensible a la toxicidad por Al. Por otro lado, se comprobó que a pesar de que la especie V. corymbosum, se desarrolla muy bien en suelos ácidos, el efecto tóxico del Al soluble bajo estas condiciones produce una disminución de la tasa de crecimiento relativo a nivel radicular, así como también fue demostrado el daño en las células de la epidermis y endodermis de los ápices radicales en los cultivares. A nivel molecular, en arándano alto se han identificados nuevos genes inducidos por Al, algunos de respuesta a estrés. Estos genes podrían explicar el mecanismo de resistencia a la toxicidad por Al en arándano y podrían ser usados en estudio posteriores como genes candidatos para la resistencia a Al en plantas leñosas. De acuerdo a los estudios que se han llevado a cabo, el arándano alto expuesto a estrés por Al, incrementa la actividad de sistema antioxidante, principalmente a nivel aéreo. Por otro lado, y de acuerdo a los niveles de Al encontrado en las raíces y hojas de esta especie, así como también la exudación de ácidos orgánicos como oxalato y citrato (ácidos orgánicos altamente quelantes) podemos sugerir que V. corymbosum no activa sólo un mecanismo específico para contrarrestar la toxicidad por Al sino más bien activa varios mecanismos al igual como se ha descrito para otras especies leñosas. AGRADECIMIENTOS Estas investigaciones realizadas en arándano alto han sido financiadas por Fruit Consortium, 07Genoma01, the Millennium Nucleus for Plant Functional Genomics (P06-009-F), y los proyectos FONDECYT N° 11080231 y 1080372. REFERENCIAS Achary VMM, Panda BB (2010) Aluminium-induce DNA damage and adaptive response to genotoxic stress in plant cells are mediated through reactive oxygen intermediates. Mutagenesis 25:201-209. Barceló J, Poschenrieder C (2002) Fast root growth responses, root exudates, and internal detoxification as clues to the mechanisms of aluminium toxicity and resistance: a review. Environmental and Experimental Botany 48:75-92. Cançado GMA, De Rosa Jr VE, Fernández JH, Maron LG, Jorge RA, Menossi M (2005) Glutathione S-transferase and aluminum toxicity in maize. Functional Plant Biology 32: 1045-1055. Chen LS, Qi YP, Liu XH (2005b) Effects of aluminum on light energy utilization and photoprotective systems in citrus leaves. Annals of Botany 96:35-41. Chen LS, Qi YP, Smith BR, Liu XH (2005a) Aluminum-induced decrease in CO2 in citrus seedlings is unaccompanied by decreased activities of key enzymes involved in CO2 assimilation. Tree Physiology 25:317-324. Cuenca G, Herrera R, Medina E (1990) Aluminum tolerance in tres of a tropical cloud forest. Plant and Soil 125:169-175. Delhaize E, Ryan P (1995) Aluminum Toxicity and Tolerance in Plants. Plant Physiology 107:315-321. Delhaize E, Ryan PR, Randall PJ (1993) Aluminum tolerance in wheat (Triticum aestivum L.). II. Aluminumstimulated excretion of malic acid from root apices. Plant Physiology 103:695-702. Dhanaraj AL, Alkharouf NW, Beard HS, Chouikha IB, Matthews BF, Wei H, Arora R, Rowland LJ (2007) Major differences observed in transcript profiles of blueberry during cold acclimation under field and cold room conditions. Planta 225:735-751. Ehlenfeldt MK, Prior RL (2001) Oxygen radical absorbance capacity (ORAC) and phenolic and anthocyanin concentrations in fruit and leaf tissues of highbush blueberry. Journal of Agricultural and Food Chemistry 49:2222-2227. 81 | INNOVAGRO | www.agronomiauct.cl
Gonçalves JFC, Cambraia J, Sant’Anna R, Pacheco S (1996) Aluminum and zinc effects on the metabolism of ribonucleic acid in two sorghum cultivars. Brazilian Journal of Plant Physiology 8:81-86. Inostroza-Blancheteau C, Rengel Z, Alberdi M, Mora ML, Aquea F, Arce-Johnson P, Reyes-Díaz M (2012) Molecular and physiological strategies to increase aluminum resistance in plants. Molecular Biology Reports 39:2069-2079. Inostroza-Blancheteau C., Reyes-Díaz M., Aquea F., Nunes-Nesi A., Alberdi M., Arce-Johnson P. (2011a) Biochemical and molecular changes in response to aluminium-stress in highbush blueberry (Vaccinium corymbosum L.). Plant Physiology Biochemistry 49:1005-1012. Inostroza-Blancheteau C., Aquea F., Reyes-Díaz M., Alberdi M., Arce-Johnson P (2011b) Identification of aluminum-regulated genes by cDNA-AFLP analysis ofroots in two contrasting genotypes of highbush blueberry (Vaccinium corymbosum L.). Molecular Biotechnology 49:32-41. Inostroza-Blancheteau C, Soto B, Ulloa P, Aquea F, Reyes-Díaz M (2008) Resistance mechanisms of aluminum (Al3+) phytotoxicity in cereals: physiological, genetic and molecular bases. Journal Soil Science and Plant Nutrition 8:57-71. Ireland G and P Wilk (2006) Blueberry production in northern NSW. Primefact 195.10 Oct. 2012.<http://www. dpi.nsw.gov.au/__data/assets/pdf_file/0005/90356/Blueberry production-in-northern-NSW.pdf>. Jones DL, Kochian LV (1997) Aluminum interactions with plasma membrane lipids and enzyme metal binding sites and its potential role in Al cytotoxicity. FEBS Letters 400:51-57. Jones DL, Ryan PR (2003) Aluminum toxicity. Nutrition, pp. 656-664. Kim SM, Um BH (2011) Evaluation of the antioxidant activity of phenolic compounds among blueberry cultivars by HPLC-ESI/MS and on-line HPLC-ABTS system.Journal of Medicinal Plants Research 5:5008-5016. Klug B, Specht A, Horst WJ (2011) Aluminium localization in root tips of the aluminium accumulating plant species buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench). Journal of Experimental Botany 62:5453-5462. Kochian LV, Hoekenga OA, Piñeros MA (2004) How do crop plats tolerance acid soils? Mechanisms of aluminum tolerance and phosphorous efficiency. Annual Review in Plant Biology 55:459-93. Kochian LV, Pence NS, Letham DLD, Pineros MA, Magalhaes JV, Hoekenga OA, Garvin DF (2002) Mechanisms of metal resistance in plants: aluminum and heavy metals. Plant and Soil 247: 109-119. Kochian LV, Piñeros MA, Hoekenga OA (2005) The physiology, genetics and molecular biology of plant aluminum resistance and toxicity. Plant and Soil 274:175-195. Kotchoni SO, Jimenez-Lopez JC, Gao D, Edwards V, Gachomo EW, Margam VM, Seufferheld MJ (2010) Modeling-dependent protein characterization of the rice aldehyde dehydrogenase (ALDH) superfamily reveals distinct functional and structural features. PLoS ONE 5:11516. Kumari M, Taylor GJ, Deyholos MK (2008) Transcriptomic responses to aluminum stress in roots of Arabidopsis thaliana. Molecular Genetics and Genomics 279:339-357. Li X, Sun H, Pei J, Dong Y, Wang F, Chen H, Sun Y, Wang N, Li H, Li Y (2012) De novo sequencing and comparative analysis of the blueberry transcriptome to discover putative genes related to antioxidants. Gene 511:54-61. Millaleo M, Reyes-Diaz M, Alberdi M (2011) Exudation of organic acids in blueberry cultivars subjected to Mn excess. In 3rd International Workshop, Advances in Science and Technology of Bioresources. November 2-4, Universidad de La Frontera, Pucón, Chile, pp 78. Mora ML, Alfaro MA, Jarvis SC, Demanet R, Cartes P (2006) Soil aluminium availability and animal metabolism. Soil Use and Management 22:95-101. Moustakas M, Ouzounidou G, Eleftherios PE, Lannoye R (1995) Aluminum effect on photosynthesis and elemental uptake in an aluminum-tolerant and non-tolerant wheat cultivar. Journal of Plant Nutrition 18:669-683.
82 | INNOVAGRO | www.agronomiauct.cl
Mukhopadyay M, Bantawa P, Das A, Sarkar B, Bera B, Ghosh P, Mondal TK (2012) Changes of growth, photosynthesis and alteration of leaf antioxidative defence system of tea [Camellia sinensis (L.) O. Kuntze] seedlings under aluminum stress. Biometals DOI 10.1007/s10534-012-9576-0 Naik D, Dhanaraj AL, Arora R, Rowland LJ (2007) Identification of genes associated with cold acclimation in blueberry (Vaccinium corymbosum L.) using a subtractive hybridization approach. Plant Science 173:213-222. Osaki M, Watanabe T, Tadano T (1997) Beneffical effects of aluminum on growth of plant adapted to low pH soil. Soil Science and Plant Nutrition 43:551-563. Oteiza PI (1994) A mechanism for the stimulatory effect of aluminum on iron-induced lipid peroxidation. Archives of Biochemistry and Biophysics 308:374-379. Pan JW, Zhu MY, Chen H (2001) Aluminum-induced cell death in root-tip cells of barley. Environmental and Experimental Botany 46:71-79. Panda SK, Matsumoto H (2010) Changes in antioxidant gene expression and induction of oxidative stress in pea (Pisum sativum L.) under Al stress. Biometals 23:753-762. Peixoto PHP, Da Matta FM, Cambraia J (2002) Responses of the photosynthetic apparatus to aluminum stress in two sorghum cultivars. Journal of Plant Nutrition 25:821-832. Pereira WE, de Siqueira DL, Martínez CA, Puiatti M (2000) Gas exchange and chlorophyll fluorescence in four citrus rootstocks under aluminum stress. Journal of Plant Physiology 157:513-520. Prior RL, Cao G, Martin A, Sofic E, McEwen J, O’Brien C, Lischner N, Ehlenfeldt M, Kalt W, Krewer G, Mainland M (1998) Antioxidant capacity is influenced by total phenolic and anthocyanin content, maturity, and variety of Vaccinium species. Journal of Agricultural and Food Chemistry 46:2686-2693. Rao IM, Cramer GR (2003) Plant nutrition and crop improvement in adverse soil conditions, p. 270–303. In: M.J. Chrispeels and D.E. Sadava (eds.). Plant, genes and crop biotechnology. 2nd ed. Jones and Bartlett, Sudbury, MA. Rengel Z, Zhang WH (2003) Role of dynamics of intracellular calcium in aluminium-toxicity syndrome. New Phytologist 159:295-314. Reyes-Díaz M, Alberdi M, Mora ML (2009) Short-term aluminum stress differentially affects the photochemical efficiency of photosystem II in highbush blueberry genotypes. Journal of the American Society Horticultural Science 134:14-21. Reyes-Díaz M, Inostroza-Blancheteau C, Millaleo R, Cruces E, Wulff-Zottele C, Alberdi M, Mora ML (2010) Long-term aluminium exposure effects on physiological and biochemical features of highbush blueberry cultivars. Journal of the American Society Horticultural Science 135:1-11. Reyes-Díaz M, Meriño-Gergichevich C, Alarcón E, Alberdi M, Horst WJ (2011) Calcium sulfate ameliorates the effect of aluminum toxicity differentially in genotypes of highbush blueberry (Vaccinium corymbosum L.). Journal Soil Science and Plant Nutrition 11:59-78. Ribera AE, Reyes-Díaz M, Alberdi M, Zuñiga GE, Mora ML (2009) Antioxidant compounds in skin and pulp of fruits change among genotypes and maturity stages in Highbush blueberry (Vaccinium corymbosum L.) grown in southern Chile. Journal of Soil Science and Plant Nutrition 10:509-536. Rowland LJ, Alkharouf N, Darwish O, Ogden EL, Polashock JJ, Bassil NV, Main D (2012) Generation and analysis of blueberry transcriptome sequences from leaves, developing fruit, and flower buds from cold acclimation through deacclimation. BMC Plant Biology 2012:12:46. Rowland LJ, Mehra S, Dhanaraj A, Ogden EL, Arora R (2003) In: Proc. XXVI IHC-Biotechnology in Hort. Crop Improvement. Eds. F.A. Hammerschlag and P. Saxena, Acta Hort. 625, ISHS, pp 59-69. Ryan PR, Tyerman SD, Sasaki T, Furuichi T, Yamamoto Y, Zhang WH, Delhaize E (2011) The identification of aluminium resistance genes provides opportunities for enhancing crop production on acid soils. Journal of Experimental Botany 62:9-20. Sunkar R, Bartels D, Kirch H (2003) Overexpression of a stress-inducible aldehyde dehydrogenase gene from Arabidopsis thaliana in transgenic plants improves stress tolerance, Plant Journal 35:452-464. 83 | INNOVAGRO | www.agronomiauct.cl
Tabaldi LA, Cargnelutti D, Gonçalves JF, Pereira LB, Castro GY, Maldaner J, Rauber R, Rossato LV, Bisognin DA, Schetinger MRC, Nicoloso FT (2009) Oxidative stress is an early symptom triggered by aluminum in Al-sensitive potato plantlets. Chemosphere 76:1402-1409. Tamás L, Simonovicová M, Huttová J, Mistrík I (2004) Aluminium stimulated hydrogen peroxide production of germinating barley seeds. Environmental and Experimental Botany 51:281-288. Walworth AE, Rowland LJ, Polashock JJ, Hancock JF, Song GQ (2012) Overexpression of a blueberry-derived CBF gene enhances cold tolerance in a southern highbush blueberry cultivar. Molecular Breeding 30:1313-1323. Watanabe T, Osaki M, Yoshihara T, Tadano T (1998) Distribution and chemical speciation of aluminum in the Al-accumulator plant, Melastoma malabathricum L. Plant and Soil 201:165-173. Yamamoto Y, Kobayashi Y, Devi SR, Rikiishi S, Matsumoto H (2003) Oxidative stress triggered by aluminum in plant roots. Plant Soil 255:239-243. Yamamoto Y, Kobayashi Y, Matsumoto H (2001) Lipid peroxidation is an early symptom triggered by aluminum, but not the primary cause of elongation inhibition in pea roots. Plant Physiology 125:199-208. Zheng SJ, Ma J, Matsumoto H (1998) High aluminum resistance in buckwheat. I. Al-induced specific secretion of oxalic acid from root tips. Plant Physiology 117:745-751.
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