Revista InnovAgro N°4 by Facultad RRNN UC Temuco

LA EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA EN MIRTÁCEAS

Inoculación conjunta con HMA y solubilizador de P Análisis de evidencia en delitos ambientales Efecto del cultivo in vitro de fluido ruminal Hortalizas IV Gama, alternativa para La Araucanía

Dirección: Dr. Alejandro Velásquez B. Comité Editor: Dr. Gabriel Vivallo P. Dr. Rodrigo Arias I. Dr. Marcelo Toneatti B. Dra. Claudia Castillo R. Dra. Ximena Araneda D. Dra. Gina Leonelli C. Dr. Jaime Solano S. Dr. Marcelo Rodríguez B. Dr. Orlando Andrade V. Recepción de trabajos, revisión y 1ª selección: MSc. Ricardo Tighe N. Ing. Agr. Armin Cuevas R. Diseño, diagramación y edición: Ing. Agr. Armin Cuevas R. Publicación electrónica y página web: Ing. Agr. Armin Cuevas R. Secretaria: Srta. Rocío Burgos Universidad Católica de Temuco, Escuela de Agronomía. Rudecindo Ortega 02950, Edificio Cincuentenario, 3er piso. Fono: 45-205521, 45-205534. Edición Digital Chile, Temuco, Diciembre 2013.

Índice Editorial.........................................................................................................................................5 Cooperativa Mapuche Ankün se abre en la industria alimentaria.................................................6 Control de Nosema ceranae a través de un producto bioestimulante............................................8 Apoyo a la formación de redes internacionales entre centros de investigación.............................9 Publicaciones Agronomía UC Temuco.........................................................................................13 La embriogénesis somática en mirtáceas............................................................................14

Inoculación conjunta con hongos micorrícicos arbusculares y un solubilizador de fósforo en lechuga..............................................................................................21 Análisis de evidencia en delitos ambientales de robo de madera, mediante marcadores microsatelitales....................................................................................25 Efecto del cultivo in vitro de fluido ruminal sobre el perfil zimográfico de extractos enzimáticos..............................................................................................31 Hortalizas IV Gama, una alternativa para la Región de La Araucanía...................34

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EDITORIAL

PALABRAS DEL DIRECTOR CARRERA DE AGRONOMÍA El actual escenario de globalización e integración de bienes y servicios, del cual se puede citar la invitación extendida a Chile para integrar la Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económico (OCDE), tendrá entre otras implicancias la apertura profesional. Lo anterior, sumado a los desafíos relacionados con el cambio climático transformarán en nodos críticos la disponibilidad de agua, suelo de uso agrícola, y la sustentabilidad en sus dimensiones ambiental, social y económica. Según el análisis de expertos se proyectan cambios sustanciales en el paisaje agropecuario del centro sur del país, lo que llevará ineludiblemente al desplazamiento e inserción de sistemas productivos. Todo lo anterior, requiere de un fuerte componente de ciencia y tecnología para la generación y adaptabilidad de sistemas de producción agroalimentarios. Este marco, que puede ser visualizado de diferentes prismas, constituye la base de reflexión sobre la que debe ser planteado el perfil de egreso académico profesional de un Ingeniero Agrónomo, que permita contribuir a la resolución efectiva de problemas y abordar con sólidas competencias los desafíos del mañana. En este contexto, la formación profesional predominante en Europa, Estados Unidos y otros países desarrollados, se sustenta en modelos educativos basados en competencias; es decir, entrenar el saber, saber hacer y saber ser de forma integrada, abordando la dimensión específica o disciplinar, denominadas competencias duras, y lo actitudinal y relacional denominadas competencias blandas. Nuestra institución y unidad académica han escuchado la demanda y coloca a disposición la formación como un valor, que permite ser agregado a un individuo que logra sobre sí mismo la internación de resultados de aprendizaje, que tiene su inicio en las competencias básicas, aquellos elementos de entrada a la universidad que permiten transitar por la “ruta educativa” de forma exitosa, siendo posible su articulación desde la formación técnica, profesional y de postgrado. Este valor agregado es variable, pues está en función del nivel inicial, que en conjunto y considerando elementos que van más allá de lo disciplinar, puede entenderse como el perfil de ingreso, caracterizado actualmente por una alta diversidad en el aula. La demanda de profesionales competentes, por una parte, y las características del perfil de ingreso de estudiantes para ser formados como Ingenieros Agrónomos, por otra, supone un gran desafío. Lo anterior ha implicado la reforma curricular, pasando de mallas curriculares a itinerarios formativos que otorgan mayor flexibilidad en el tránsito universitario; así mismo, los docentes se han visto envueltos en un cambio de paradigma en la formación, donde hoy el profesor es un mediador que construye conocimiento junto a los estudiantes; este cambio ha implicado el uso frecuente de estrategias activas, metodologías pedagógicas que permitan lograr aprendizajes significativos de forma eficiente, apoyado por entornos virtuales y recursos humanos complementarios que fortalecen la formación integral. Nuestra unidad académica ha tomado el Aprendizaje Basado en Problemas (ABP), y el Aprendizaje y Servicio (AS) como estrategias que están presentes en cada uno de los cinco años de formación profesional, permitiendo el aprendizaje por descubrimiento, el análisis crítico y la vinculación social con un entorno real productivo y a la vez, vulnerable. Finalmente, cabe señalar la relevancia de la integración de la formación profesional a procesos de generación de información, dados actualmente por el desarrollo de ciencia y tecnología aplicada, que tributen en el corto o mediano plazo a la generación de soluciones científico-tecnológicas para el sector privado. Precisamente, en esta edición, INNOVAGRO presenta una serie de artículos que van en esta dirección y que espero sean de interés al lector, pues constituye parte del quehacer integrado de la Escuela de Agronomía. MSc. Ricardo M. Tighe Neira Director Carrera Agronomía UC Temuco

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Cooperativa Mapuche Ankün se abre en la industria alimentaria

on el fin de dotar de un valor agregado y potenciar las características propias del huerto Mapuche, plantas aromáticas y merkén de diversas comunidades de la región se han abierto paso en el mundo agroindustrial. Bajo el alero de la Escuela de Agronomía de la UC Temuco y la Fundación para la Innovación Agraria (FIA) del Ministerio de Agricultura, un grupo de 21 productores Mapuche de las comunas de Angol, Purén, Lumaco, Los Sauces, Cholchol y Nueva Imperial formaron la Cooperativa Ankün, la cual se especializa en la elaboración de productos deshidratados: cilantro, merkén, perejil, chaskú, condimento para carnes y condimentos para ensaladas, los que son parte de la oferta gourmet que ofrece esta cooperativa, los que son comercializados en dos formatos: sobres y frascos. 6 | INNOVAGRO | www.agronomiauct.cl

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Control de Nosema ceranae a través de un producto bioestimulante

s lo que pretende realizar el proyecto Fondef IDeA dirigido por la Dra. Ximena Araneda donde la investigación está centrada principalmente en evaluar la respuesta inmune de la abeja Apis mellifera afectada con el patógeno Nosema ceranae bajo condiciones de tratamientos con compuestos naturales con actividad biológica.

Como solución se pretende evaluar compuestos naturales tales como: potenciadores del crecimiento (prebióticos), aceites esenciales, ácidos grasos EPA/ DHA, glucanos inmunoestimulantes que puedan ser utilizados a través de dietas causando un efecto beneficioso en la abeja melífera mejorando su respuesta inmune.

Nosema ceranae es el agente causal de una enfermedad que ha sido identificada recientemente en Chile y que preocupa al mundo científico siendo considerada una amenaza para la apicultura mundial; por ello los estudios se han focalizado en el reconocimiento y descripción de este parásito. Sin embargo, se hace necesario investigar además sus formas de control de manera de tener a disposición productos farmacológicos que no dañen la salud de la abeja y que además, no dejen residuos en la miel y que sean inocuos para el hombre.

A partir de esta información será posible la formulación y desarrollo de un prototipo bioestimulante con propiedades inmunológicas con el conocimiento de la composición nutricional y funcional de los compuestos naturales que lo constituyen.

La gran virulencia que presenta esta enfermedad hace necesario investigar y desarrollar nuevos productos que aporten al sistema inmunológico individual de Apis mellifera el cual se ve fuertemente disminuido frente al ataque del patógeno.

El proyecto contribuirá con nuevas informaciones y conocimientos en ciencia básica y aplicada que beneficiarán el rubro apícola nacional e internacional, contribuyendo al desarrollo de una apicultura más inocua, sustentable y competitiva.

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Apoyo a la formación de redes internacionales entre centros de investigación

ntre el 10 y 21 de junio de 2013 los académicos Dr. Rodrigo Arias, Dr. Mauricio Silva y Dr. Alejandro Velásquez realizaron una visita al Departamento de Producción Animal de la Universidad de Nebraska, y la estación del USDA-ARS Meat Animal Research Center, ambas localizadas en el estado de Nebraska en Estados Unidos, en el marco del proyecto RED 120052 para el apoyo a la formación de redes internacionales entre centros de investigación. El objetivo de esta estadía corta fue establecer una red de trabajo colaborativo internacional de investigación en ganado bovino de carne para mejorar la eficiencia y productividad del sector ganadero chileno. Para ello, el proyecto se estructuró en tres ejes: 1) Pasantía de investigadores de la UC Temuco en USA; 2) visita a Chile de investigadores norteamericanos; y 3) establecimiento de convenio de redes internacionales entre centros de investigación. 1) Resumen pasantía en el Departamento de Producción Animal de la Universidad de Nebraska.

Ésta se desarrolló ente el 10 y 14 de junio de 2013. En la ocasión se realizaron reuniones de trabajo con: PhD Galen E. Erickson, PhD Terry J. Klopfenstein, PhD Jim C. MacDonald, PhD Paul Kononoff, y PhD Andrea Cupp. Entre las actividades relevantes efectuadas destaca el trabajo en el laboratorio de fisiología reproductiva a cargo de la Dra. Andrea Cupp junto a su equipo de investigación. En éste, el Dr. Silva tuvo la oportunidad de revisar técnicas moleculares para el estudio de fisiología reproductiva, desarrollo gonadal y mortalidad embrionaria en bovinos de carne. Los doctores Arias y Velásquez tuvieron talleres con el Dr. Galen Erickson en el tema de la eficiencia de uso del N en rumiantes, así como en metodologías de análisis, y en elaboración de dietas para reducir la excreción de nutrientes al ambiente, particularmente N y P. Además, se realizó otro taller sobre digestibilidad in situ de compuestos nitrogenados y proteína metabolizable junto a los doctores Klopfenstein y MacDonald. 9 | INNOVAGRO | www.agronomiauct.cl

En la oportunidad se acordó realizar algunas actividades conjuntas en los tópicos de interés como son las técnicas de medición de proteína degradable y no degradable ruminal (UIP y DIP) en forrajes. A lo anterior se suma la entrega de protocolos de análisis de digestibilidad y bromatología, así como también software para cálculo de requerimientos, evaluación de raciones y respuesta animal. Se destaca también la visita a los laboratorios de metabolismo ubicados en el mismo edificio dentro del campus, el cual cuenta con animales fistulados ruminal e intestinalmente, alojados en una moderna y adecuada infraestructura. En estas dependencias se observaron ensayos sobre digestibilidad de proteína in vitro e in situ (pradera natural y destilados secos de maíz). Se observó también la determinación de digestibilidad in vitro a través de la emisión de gases con equipos Ankom y una investigación sobre contenido de grasa en leche, AGV y digestibilidad gastro-intestinal en vacas lecheras. Finalmente, se realizó una visita al campo experimental, aproximadamente a 40 minutos de Lincoln. En esta, se destaca la investigación sobre digestibilidad in situ y consumo de MS bajo condiciones de pastoreo, utilizando la metodología de vaciamiento de rumen. Otro ensayo de interés fue el de la medición de la tasa de producción de metano bajo distintos manejos nutricionales, utilizando los comederos “Calan” y un sistema de captura de aire de bajo costo. La última actividad fue la reunión sostenida con el representante de asuntos internacionales de la Facultad de Recursos Naturales de la Universidad de Nebraska, Dr. Mark Doye, para establecer un convenio de colaboración internacional entre los centros de investigación, el cual fue firmado durante los últimos días de diciembre de 2013.

2) Pasantía en U.S. Meat Animal Research Center (USDA) Clay Center, Nebraska. Se desarrolló entre el 17 y 21 de junio, sosteniendo reuniones de trabajo con: Dra. Tammi Brown-Brandl, Cattle Heat Stress, Dra. Kristin Hales, Animal Nutrition; Dr. Bob Cushman, Animal Reproduction; Dr. Roger Eigenberg y Dr. Bryan Woodbury, Waste Management; Dr. Larry Kuehn, Genetics & Breeding; Dr. Tommy Wheelery, Meat Safety & Quality research; y Dra. Carol Chikto-Mckown, Animal Health. Cada uno de estos investigadores realizó una presentación sobre los distintos programas en los que se está trabajando. Posteriormente, se realizaron visitas a terreno y trabajos de campo. Entre las actividades observadas destaca la medición de metano entérico bajo digestibilidad in vitro en la cual se evaluaba el efecto de distintas dietas con alimentos locales. También, se destaca la infraestructura y equipamiento para ensayos de consumo individual de alimento, ganancia de peso y eficiencia de conversión. Esto permite estudiar el consumo residual de alimento y establecer su relación con la eficiencia y comportamiento animal. Se visitó en terreno las dependencias para el estudio de comportamiento y estrés animal a causa del clima, observando ensayos con medidas de mitigación para el estrés por calor como la utilización de distintos tipos y diseños de sombra, mediciones de jadeo y tasa de respiración. Además, se tuvo la oportunidad de instalar y retirar dispositivos para medir la temperatura vaginal en vaquillas en engorda. Otra interesante actividad, en la cual se participó, fue el recuento de folículos antrales y calificación del tracto reproductivo a través del monitoreo por ultrasonido y tacto en vaquillas. Esto último, como una herramienta para seleccionar vaquillas de reemplazo. Al igual que en la primera pasantía, se iniciaron las gestiones para establecer la firma de un acuerdo de colaboración internacional. Finalmente, los académicos de la UC Temuco realizaron presentaciones de sus trabajos ante investigadores de ambas instituciones. Estas fueron: “Thermal comfort risks on cattle production systems in Chile” (PhD Rodrigo Arias); “Ovulation-inducing factor in seminal plasma of llamas: mechanism of action and biological effects” (Dr. Mauricio Silva); y “Ruminal protein degradability prediction by enzymatyc extracts of rumen origin” (Dr. Alejandro Velásquez).

Jornadas Agron贸micas UC Temuco

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Publicaciones AgronomĂa UC Temuco

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LA EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA EN MIRTÁCEAS

Dr. Marcelo Rodríguez B. Escuela de Agronomía, Facultad de Recursos Naturales, Universidad Católica de Temuco. Rudecindo Ortega 02950. Temuco. Email: marodrig@uct.cl; fono: 45-2205536. INTRODUCCIÓN La embriogénesis somática representa la vía más avanzada de propagación clonal que utiliza las técnicas de cultivo de tejidos vegetales. Los avances actuales en biotecnología genómica están teniendo un gran impacto en el uso de material selecto en muchos programas de mejoramiento vegetal. La embriogénesis somática está contribuyendo a la producción clonal de plantas transgénicas de alta productividad, con calidad de madera mejorada, plantas medicinales y ornamentales (Canhoto et al., 1996). Entre las primeras Mirtáceas que se han logrado obtener embriogénesis somática están Eucalyptus citriodora (Muralidharan et al., 1989), E. grandis (Watt et al., 1991), Eugenia jambos, E. malaccensis (Litz, 1984a), Myrciaria cauliflora (Litz, 1984b), Myrtus communis (Parra y Amo-Marco, 1998; Canhoto et al., 1999) y Psidium guajava (Vilchez et al., 2002). Esta vía de regeneración consiste en la obtención de semillas somáticas, que tienen su origen en células somáticas de la planta donante, las cuales se reprograman y siguen un patrón de desarrollo idéntico al del embrión de origen zigótico. Al no ser la célula inicial producto de un proceso de recombinación y fusión de gametos, se conserva íntegramente el genotipo de la planta donante; por lo tanto, la embriogénesis somática se considera una propagación vegetativa y el método más promisorio de micropropagación (Merkle y Dean, 2000; Sutton, 2002, Celestino et al., 2005). Adicionalmente a la micropropagación, la embriogénesis somática también se ha revelado como una vía de regeneración en crioconservación (Janeiro et al., 1996; Engelmann et al., 1997) y transformación (Peña y Séguin, 2001), también utilizada para estudios de embriogénesis y genómica funcional (Von Arnold et al., 2002; Campbell et al., 2003). La embriogénesis somática presenta un elevado potencial de multiplicación, por la factibilidad de hacer cultivos en biorreactores, la opción de aplicar técnicas de encapsulación para fabricar semillas sintéticas y la posibilidad de utilizar los cultivos embriogénicos como dianas adecuadas para la transformación genética. Se han publicado protocolos para la obtención de cultivos embriogénicos y su crioconservación en la mayoría de las especies forestales con interés comercial. Uno de los problemas puede ser la inducción de cambios epigénicos e inestabilidad genética debido en parte a cambios en la metilación del DNA; sin embargo, Parra y Amo-Marco (1998) no observaron cambios significativos al analizar por HPLC el ADN de plantas de Myrtus communis generadas por embriogénesis somática. Conclusiones similares obtuvieron Pinto et al. (2004) al hacer un análisis citométrico del flujo de ADN de embriones somáticos de E. globulus. 14 | INNOVAGRO | www.agronomiauct.cl

En la embriogénesis somática se reconocen las fases de inducción, multiplicación, maduración y conversión. La inducción es el proceso por el que las células del explanto cambian su patrón de expresión y generan los embriones somáticos iniciales. Generalmente está condicionado por la presencia de reguladores del crecimiento en el medio de cultivo, fundamentalmente auxinas y citoquininas, pero se puede desencadenar, si el explanto es inmaduro, en ausencia de los mismos. También, se han descrito otros factores como los aminoácidos, myo-inositol y la presencia de glutamina (Quiroz-Figueroa et al., 2006). Se ha observado que la adición de L-aspargina, L-glutamina y L-arginina mejoró la inducción de embriones somáticos en embriones zigóticos inmaduros de Feijo sellowiana (Dal Vesco y Guerra, 2001; Cangahuala-Inocente et al., 2007). Los medios más utilizados son MS, B5 y Lpm, siendo el MS donde se han obtenido la mayor cantidad de embriogénesis somática exitosa en Mirtáceas (Pinto et al., 2008). En la mayoría de las especies la embriogénesis somática se obtiene a partir de embriones zigóticos inmaduros. Por ello, una de las limitaciones más importantes por el momento, es que se ha logrado en muy pocas especies la formación de embriones somáticos en tejidos procedentes de individuos adultos y, por tanto, con posibilidades de ser seleccionados con fiabilidad (Quiroz-Figueroa et al., 2006). Para solventar este inconveniente, la estrategia que se sigue es producir líneas embriogénicas a partir de semillas procedentes de cruzamientos controlados, y crioconservar las mismas mientras se evalúan algunas plantas procedentes de las mismas en diferentes lugares de ensayo. El material crioconservado mantiene todo su potencial propagativo hasta completar la fase de evaluación (Gonzalez-Arnao, 2008). Sin embargo, paulatinamente están empezando a publicarse trabajos que indican la posibilidad de obtener embriogénesis somática de tejidos no embrionarios, como los tejidos florales, al respecto Stefanello et al. (2005) indujeron callos embriogénicos en F. sellowina a partir de estambres, pétalos y ovarios, los cuales se utilizaron para la obtención de células en suspensión, las que posteriormente en medio gelificados sin hormonas generaron embriones somáticos y finalmente, plántulas. Por otra parte, Chandra et al. (2004), utilizaron como explantes mesocarpos de frutos inmaduros de P. guajava. La inducción de embriones puede ocurrir de manera directa o a partir de callos embriogénicos. Nugent et al. (2001) observaron regeneración directa a partir de cotiledones de E. globulus en un MS suplementado con 100 µM de IBA. Uno de los aspectos fundamentales en la respuesta morfogénica es la influencia del componente genético sobre las mismas, así se ha comprobado en varias especies, que en la inducción de embriogénesis somática, existe una influencia importante del componente aditivo de la varianza genética (Park et al., 1993; 1994), lo que permitiría efectuar una mejora genética sobre este carácter. Los embriones somáticos se multiplican por embriogénesis secundaria, lo que genera un proceso recurrente. Esta ha sido reportada en F. sellowiana (Cruz et al., 1990), E. citriodora (Muralidharan et al., 1989) y E. globulus (Pinto et al., 2008). En general, la capacidad de multiplicación clonal mediante embriogénesis recurrente es muy elevada, aparentemente ilimitada en el tiempo y libre de condicionantes estacionales, lo que proporciona un inmenso potencial multiplicativo a esta técnica. La principal dificultad se encuentra en la producción sincrónica de embriones de calidad, que den lugar a plantas vigorosas como lo hacen los embriones zigóticos maduros (Raemakers et al., 1995). Una vez inducida la embriogénesis somática, los embriones entran en un proceso cíclico de clonación embriónica, que no requiere en muchos casos la presencia de reguladores del crecimiento. Al respecto, Parra y Amo-Marco (1998) obtuvieron embriogénesis somática secundaria a partir de embriones somáticos primarios generados de semilla inmadura de M. comunis en un MS/2 sin reguladores de crecimiento. 15 | INNOVAGRO | www.agronomiauct.cl

En muchas angiospermas, sobre todo cuando los embriones llegan a alcanzar un estado de diferenciación cotiledonar, este proceso de embriogénesis recurrente se suele basar en la proliferación de la caliptra del embrión somático primario que genera, tras una meristematización en múltiples zonas de su superficie, unos desarrollos embriogénicos secundarios de tipo multicelular (Puigderrajols et al., 1996). Sin embargo, la embriogénesis repetitiva puede también tener lugar en otras fases del desarrollo embriogénico, considerándose la más adecuada para la proliferación en medio líquido, la que tiene lugar en forma de masas preembriogénicas (PEMs) (Merkle, 1995). Se ha señalado que la presencia de distintos tipos de azúcares, tales como fructosa (Carraway y Merkle, 1997) y maltosa (Reidiboym-Talleux et al., 1998), pueden tener una influencia marcada sobre el proceso de maduración, al igual que la presencia de hidrolizado de caseína (Yantcheva et al., 1998; Martínez et al., 2004). Todas estas sustancias pueden ser determinantes en este proceso, el cual confiere a las semillas somáticas la capacidad de almacenamiento de sustancias de reserva y la resistencia a la desecación (Lipavská y Konrádova, 2004). Pescador et al. (2008), analizaron el contenido de carbohidratos solubles en embriones somáticos cotiledonares de F. sellowiana encontrando bajos niveles de glucosa y fructosa. Durante la formación del embrión los niveles de carbohidratos solubles difieren entre embriones zigóticos y somáticos, encontrando las mayores diferencias en los contenidos de fructosa los cuales disminuyen en los embriones somáticos y se incrementan en los zigóticos. Respecto a la sucrosa, ésta se mantiene sin variación en las distintas fases del embrión, siendo muy superior en los embriones zigóticos. Los contenidos totales de azúcares solubles disminuyen tanto en el embrión zigótico como somático, siendo siempre menores en los embriones somáticos tanto en la fase globular, corazón, torpedo y cotiledonar. Se ha observado que el posible estrés causado por la ausencia de elementos nutritivos (inanición) puede ejercer un efecto regulador en el desarrollo de los embriones somáticos (Fernández-Guijarro et al., 1994). Con esta base, entre otras, funciona una técnica, la inmersión temporal, de importante desarrollo en los últimos años. Esta técnica ha mostrado grandes posibilidades para regular el desarrollo, en medio líquido, de embriones somáticos de diferentes especies, sincronizando cultivos, impidiendo la aparición de embriogénesis secundaria y estimulando la maduración (Cabasson et al., 1997; Etienne et al., 1997). Desde un punto de vista práctico, el proceso de embriogénesis recurrente en medio sólido es muy laborioso, debido a la necesidad de efectuar repicados frecuentes, aunque puede servir para producir un relativamente pequeño número de plantas que se necesitan para llevar a cabo ensayos clonales. Sin embargo, la producción de plantas clónicas por embriogénesis somática con fines operativos, tiene que pasar por el desarrollo del cultivo en medio líquido y la utilización de biorreactores. El estudio del efecto de los nutrientes sobre los explantos cultivados in vitro está adquiriendo, cada vez más, una importancia capital por su influencia no sólo sobre el crecimiento sino también sobre las respuestas morfogénicas, hasta el punto de que en determinadas circunstancias pueden sustituir a los reguladores del crecimiento (Preece, 1995; Ramage y Williams, 2002). Por otra parte, el cultivo en medio líquido presenta indudables ventajas sobre el medio semisólido: hay una mayor disponibilidad de los nutrientes y se difunden mejor los metabolitos excretados por los tejidos. Además, debido a la ausencia de la interferencia del gelificante, se pueden medir con más facilidad y en forma contínua variaciones en el pH, conductividad, iones, etc; al tiempo que se puede reemplazar por medio fresco con más facilidad. Por ello, se considera como la base necesaria para establecer biorreactores en los que se pueda automatizar el cultivo; sin embargo, el cultivo en medio líquido presenta problemas como las dificultades de aireación y la inducción de fenómenos de vitrificación en los tejidos. La técnica de inmersión temporal puede resolver dichos problemas y constituirse en la base del desarrollo de futuros biorreactores. Además, se ha comprobado, como se ha mencionado anteriormente, que diferentes frecuencias de inmersión, con el estrés ayuno-nutrición que propician, tienen también efectos de regulación morfogénica, particularmente en embriogénesis somática (Etienne y Berthouly, 2002). 16 | INNOVAGRO | www.agronomiauct.cl

Por ello, los sistemas de cultivo en medio líquido utilizando técnicas de inmersión temporal, se están revelando como muy útiles de cara a la promoción y el control del proceso recurrente, permitiendo el escalado de los cultivos embriogénicos en condiciones de automatización. Morfológicamente los embriones somáticos no difieren de los zigóticos, ambos pasan por las etapas globular, corazón, torpedo y cotiledonar; sin embargo, los embriones somáticos normalmente no presentan una estructura que los conectan o nutren llamada suspensor. Recientes estudios indican que este tipo de órgano se encuentra presente en algunos embriones somáticos. Al respecto, Correia y Canhoto (2010) encontraron la presencia de suspensor en el 67% de embriones somáticos de F. sellowiana y que su formación no está afectada por la composición del medio de cultivo. Por último, los embriones maduros han de germinar (conversión) para lograr las plantas que se transfieran a suelo. No obstante, para que la embriogénesis tenga una aplicación masiva, es necesario poder preservarlos, lo que resulta difícil, ya que no poseen las protecciones típicas de una semilla y la carencia de endosperma; por lo cual, se ha recurrido a la encapsulación del embrión con algún medio de cultivo lo que se conoce como semilla sintética. Cangahuala-Inocente et al. (2004) lograron la conversión de embriones somáticos de F. sellowiana en un medio Lp suplementado con 0,5 µM de BAP y 1 µM de Ga3 más 1,5 g de carbón activo. Los embriones pregerminados fueron encapsulados en etapa de torpedo en alginato de sodio, germinando a los 30 días. Cuadro 1. Resumen de trabajos de embriogénesis somática en Mirtáceas. Especie Explante Medio + PGR (μM)

Feijoa sellowiana Myrtus communis Myrtus communis

Eucalyptus nitens Feijoa sellowiana Feijoa sellowiana

Eucalyptus globulus Psidium guajava L.

Eucalyptus globulus Eucalyptus grandis Feijoa sellowiana

Embrión zigótico inmaduro Embrión zigótico inmaduro

Inducción Desarrollo de callo embriogénesis embriogénico somatica

Germinación

MS + 4,52 2,4-D

Canhoto et al. (1996)

½ MS + 0,45 2,4-D

Embrión zigótico maduro

Embrión MS + 5,37 ANA zigótico maduro + 2,22 BAP Embrión LPm + 20 2,4-D zigótico maduro Embrión zigótico maduro Cotiledón

Parra y Amo Marco (1998) MS + 2,26 2,4-D

LPm + 10 2,4-D MS + 100 IB

Embrión zigótico inmaduro

½ MS + 4,52 2,4-D

Hojas

B5 + 0,45 TDZ

Cotiledón

Maduración

MS + 26,85 ANA

Embrión LPm + 20 2,4-D zigótico maduro

Referencia

Canhoto et al. (1999)

Bandyopadhyay y Hamill (2000)

½ MS + 0,5 BAP

Guerra et al. (2001)

Dal Vesco y Guerra (2001) Nugent et al. (2001)

Vilchez et al. (2002) MS

Pinto et al. (2002)

Martinez et al. (2004) CangahualaInocente et al. (2004)

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Eucalyptus globulus

Embrión zigótico maduro

Feijoa sellowiana

Estambres Pétalos Ovarios

Eucalyptus globulus Feijoa sellowiana Feijoa sellowiana Eucalyptus globulus Feijoa sellowiana Eucalyptus camaldulensis

MS + 16,11 ANA LPm + 10 Picloram + 1 Kin

B5 + 4,44 BAP + 2,60 ANA

LPm + 5 Picloram + 1 Kin

Embrión LPm + 20 2,4-D zigótico maduro Embrión zigótico maduro Embrión MS + 16,11 zigótico maduro ANA

LPm + 1 Picloram + 0,5 Kin

LPm

Stefanello et al. (2005) Gómez et al. (2006)

LPm + 0,5 BAP + 1 GA3 MS + 2,4 KIN + 5,7 GA3

Pinto et al. (2004) Pinto et al. (2008)

CangahualaInocente et al. (2007) Reis et al. (2008)

Pinto et al. (2008)

Cotiledón

MS + 4,5 2,4-D

Correia y Canhoto (2010)

Embrión MS + 10,74 zigótico maduro ANA

MS + 4,44 BAP + 0,54 ANA

Prakash y Gurumurthi (2010)

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INOCULACIÓN CONJUNTA CON HONGOS MICORRÍCICOS ARBUSCULARES Y UN SOLUBILIZADOR DE FÓSFORO EN LECHUGA

Dra. Claudia G. Castillo 1, 2, 3, Patricia G. Saldaña 1, Gina Leonelli 1, Alfredo Morales 3 1 Escuela de Agronomía, Facultad de Recursos Naturales, Universidad Católica de Temuco. Rudecindo Ortega 02950. Temuco. 2 NIPA, Universidad Católica de Temuco. 3 BIOREN, Universidad de La Frontera. E-mail: ccastill@uct.cl; fono: 45-2205541.

INTRODUCCIÓN Actualmente, entre las hortalizas de hoja de mayor consumo nacional destaca la lechuga (Lactuca sativa L.), apreciada por su alto contenido de vitaminas, sensible al déficit hídrico y a variaciones de temperatura, por lo que existe un cierto riesgo en su producción. Esta hortaliza es muy dependiente de los hongos micorrícicos arbusculares (HMA), microorganismos del suelo que viven simbióticamente con la mayoría de las plantas terrestres. Debido a los efectos beneficiosos que presentan los HMA como “biofertilizantes” y “bioprotectores” de los cultivos, el manejo apropiado de la simbiosis puede reducir significativamente la aplicación de agroquímicos, aspectos clave en una producción sostenible con beneficios ecológicos y económicos, especialmente para la horto-fruticultura. Los máximos beneficios que se pueden obtener por la inoculación con hongos, sean simbiontes o de vida libre, se alcanzan utilizando especies eficientes obtenidas por una cuidadosa selección de combinaciones planta-hongo-sustrato altamente compatibles (Barea, 2008). La investigación actual sobre el uso de HMA se enfoca al desarrollo de tecnologías para producción de cultivos de calidad en diferentes sistemas y especialmente, en los de valor hortícola (Ruiz-Lozano et al., 1996). La inoculación con HMA en almácigo de lechuga, tiene la capacidad de conferir mayor vigor a las plantas mejorando su establecimiento y respuesta al desarrollo en el sitio definitivo e influyendo en el peso fresco del follaje (Tapia-Goné et al., 2010). El objetivo de esta investigación fue estudiar el efecto de la inoculación de dos hongos micorrícicos arbusculares (Claroideoglomus claroideum y Glomus intraradices) y un hongo solubilizador de fósforo (Penicillium albidum) en lechuga (Lactuca sativa L.) crecida en un Andisol de la Región de La Araucanía en condiciones estériles y no estériles. MATERIALES Y MÉTODOS El ensayo se realizó en los invernaderos y sombreadero de la Escuela de Agronomía, Campus Norte de la Universidad Católica de Temuco. Se utilizó un Andisol serie Temuco perteneciente a la localidad de Lautaro (pH = 5,7; P disponible = 8 mg kg-1) mezclado con arena, vermiculita y compost en proporción 4,5:4,0:0,5:1,0 conteniendo HMA nativos (U) y otro esterilizado a vapor fluente durante una hora por tres días consecutivos (S).

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Como inóculo HMA se utilizaron dos morfotipos: a) un inóculo nativo Claroideoglomus claroideum (Gc) que se aisló desde suelos rizosféricos cultivados con hortalizas (Castillo et al., 2009) y b) un inóculo comercial, Glomus intraradices (Gi). Ambos inóculos poseían un potencial micorrícico equivalente a 10.000 esporas por 100 gramos de suelo seco. El hongo solubilizador de P correspondió a Penicillium albidum, aislado desde suelos de la región y reproducido por Morales et al. (2007). Para el ensayo se utilizaron semillas de un ecotipo local de lechuga que forma un corazón interno y simultáneamente conserva el desarrollo de las hojas exteriores las que se colorean de un color morado oscuro. Las semillas se desinfectaron con agua a 45°C, se dejaron reposar a temperatura ambiente durante 24 h y finalmente, se colocaron en una cámara de germinación por 2 a 3 días. Las variables experimentales utilizadas fueron seis: los dos inóculos HMA (Gc y Gi), el hongo solubilizador (Pa) y mezclas de hongos (M1: GcPa; M2: GiPa; M3: GcGiPa), más un control (C) no inoculado, en el Andisol estéril (S) y no estéril (U), donde cada tratamiento incluyó 15 repeticiones. El almácigo en speedling duró dos meses y luego, los plantines se trasplantaron a contenedores de un litro de capacidad donde permanecieron por un período de tres meses. A la cosecha, se evaluaron parámetros de la planta como peso fresco aéreo y radical; y del hongo: porcentaje de colonización HMA en las raíces (Phillips & Hayman, 1970; Giovanetti & Mosse, 1980) y número de esporas en la mezcla de suelo (Sieverding, 1991) natural y estéril inoculado. Para el tratamiento estadístico de los datos se verificó normalidad y posteriormente, se realizó un análisis de varianza usando ANDEVA de una vía, seguido por el test de Duncan de rango múltiple (p<0,05), utilizándose el software SPSS para Windows vs. 15.0. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Al inocular individualmente los microorganismos al Andisol estéril, el mayor peso fresco de lechuga se obtuvo en los tratamientos Gc y Pa, presentando la inoculación con Gi el menor rendimiento (Figura 1). Las mezclas de hongos mejoraron significativamente las respuestas, especialmente PaGc (M1), similar a lo encontrado en el suelo no estéril.

Figura 1. Peso fresco total en plantas de lechuga inoculadas con hongos micorrícicos arbusculares y un solubilizador de P a la cosecha. C: control; Gc: Claroideoglomus claroideum; Gi: Glomus intraradices; Pa: Penicillium albidum; M1: GcPa; M2: GiPa; M3: GcGiPa. S: Andisol estéril; U: Andisol no estéril. En cada columna, letras distintas indican diferencias significativas según prueba de Duncan (p<0,05). 22 | INNOVAGRO | www.agronomiauct.cl

Root colonization (%)

Una mayor masa fresca de lechuga podría estar relacionada con una colonización más elevada de las raíces, la que en S, para el tratamiento M1 alcanzó un porcentaje superior al 50% (Figura 2). En la mezcla de suelo no estéril, sólo se encontraron diferencias significativas entre M2 y M3 con C. C

20 c

ab ab

M2 a

M3 a

Figura 2. Colonización fúngica en lechuga inoculada con hongos micorrícicos arbusculares y un solubilizador de P a la cosecha. C: control; Gc: Claroideoglomus claroideum; Gi: Glomus intraradices; Pa: Penicillium albidum; M1: GcPa; M2: GiPa; M3: GcGiPa. S: Andisol estéril; U: Andisol no estéril. En cada columna, letras distintas indican diferencias significativas según prueba de Duncan (p<0,05). En S, el mayor número de esporas HMA se encontró en el tratamiento inoculado con Gi. En U, la inoculación individual no produjo diferencias en la cantidad de propágulos, pero la mejor respuesta se obtuvo con la inoculación conjunta de los tres microorganismos, observándose un efecto potenciador del hongo solubilizador al interactuar con Gi (Cuadro 1). Cuadro 1. Número de esporas en mezcla de suelo cultivado con lechuga inoculada con un hongo solubilizador de P y HMA a la cosecha. C: control; Gc: Claroideoglomus claroideum; Gi: Glomus intraradices; Pa: Penicillium albidum; M1: GcPa; M2: GiPa; M3: GcGiPa. S: Andisol estéril; U: Andisol no estéril. En cada columna, letras distintas indican diferencias significativas según prueba de Duncan (p<0,05).

En nuestro país existen numerosos antecedentes sobre el efecto positivo de los HMA sobre el crecimiento y desarrollo de cultivos de importancia económica (Fernández et al., 1997); sin embargo, sobre el efecto beneficioso de la inoculación con P. albidum y HMA en lechuga, los resultados presentados en este trabajo son los primeros antecedentes que se disponen.

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CONCLUSIONES En la mezcla del Andisol estéril, con la triple inoculación del hongo solubilizador y los dos hongos micorrícicos arbusculares se obtuvieron los mayores rendimientos de lechuga mientras que, en la mezcla de suelo natural conteniendo los HMA nativos las mejores respuestas de la hortaliza se encontraron en el tratamiento con doble inoculación P. albidum y C. claroideum. LITERATURA CITADA Barea, JM. 2008. Interés y aplicación de las micorrizas en horto-fruticultura. Congreso Mundial del Aguacate. Resúmenes. A-128. P. 306-307. Castillo, C.G., Sotomayor, L., Ortiz, C., Leonelli, G., Borie, F., Rubio, R. 2009. Efecto de los hongos micorrícicos arbusculares en un cultivo ecológico de ají Cacho de Cabra. Chilean J. Agric. Res. 69: 79-87. Fernández, F., Ortiz, O., Martínez, A., Costales, A., Llonín, D. 1997. The effect of commercial arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) inoculants on rice in different types of soils. Cultivos Tropicales 18: 5-9. Giovanetti, M., Mosse, B. 1980. An evaluation of techniques for measuring vesicular-arbuscular mycorrhizal infection in roots. New Phytol. 489-500. Morales, A., Alvear, M., Valenzuela, E., Rubio, R., Borie, F. 2007. Effect of inoculation with Penicillium albidum, a phosphate-solubilizing fungus, on the growth of Trifolium pratense cropped in a volcanic soil. J. Basic Microbiol. 47: 275-280. Phillips, J., Hayman, D. 1970. Improved procedures for clearing roots and staining parasitic and vesiculararbuscular mycorrhizal fungi for rapid assessment of infection. Trans. British Mycol. Soc. 55: 158-161. Ruiz-Lozano, J.M., Azcón, R., Palma, J.M. 1996. Superoxide dismutase activity in arbuscular mycorrhizal Lactuca sativa plants subjected to drought stress. New Phytol. 134: 327-333. Tapia-Goné, J., Ferrera-Cerrato, R., Varela-Fregoso, L., Rodríguez-Ortiz, JC., Soria-Colunga, JC. 2010. Infectividad y efectividad de hongos micorrízicos arbusculares nativos de suelos salinos en el cultivo de lechuga. Rev. Mex. Mic. 31: 69-74. Sieverding, E. 1991. Vesicular-arbuscular mycorrhiza management in tropical agrosystems in Deutsche. 371 p. Gesellschaft fúr Technische Zusammenarbeit (GTZ), GmbH, Eschborn, Germany.

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ANÁLISIS DE EVIDENCIA EN DELITOS DE ROBO DE MADERA, MEDIANTE MARCADORES MICROSATELITALES ANALYSIS OF EVIDENCE IN ENVIRONMENTAL CRIMES OF THEFT OF WOOD, USING MICROSATELLITE MARKERS

Dr. Solano S., J.1;Anabalon, L.3; Donoso, G.2; Romero, M.3; Esse, C.2; Vivallo, G.1; Francois, A.3; Díaz, R.3; Betancour, O.4; Ortloff, A.4; Peña, P.4: Figueroa, A.5: Lizama, C.5 y de la Fuente, J. C.5. Escuela de Agronomía1; Escuela de Ciencias Forestales2; Escuela de Ciencias Ambientales3, Escuela de Medicina Veterinaria4, Universidad Católica de Temuco. Lacrim Temuco, Policía De Investigaciones de Chile5. FONDEF D11I1024. 25-11-2013.

INTRODUCTION Theft of timber Economical forest sector crimes are those crimes related to plantations of introduced tree species and forests of native species be they timber theft, firewood theft and illegal logging log among others. In this group of offenses, also incorporate those economic crimes related to counterfeiting of wooden furniture, sold them, timber transportation and the development or manufacture of wooden furniture that does not match the standardized advertising. In this context, between 2004 and 2010 figures from the National Forest Service (CONAF) show that environmental crimes involving forest products totaled 495 cases reported and are mainly related to the illegal logging of native timber. Moreover, the Public Ministry to get at least a weekly complaint for the crime of theft or theft of timber from forest land, which in the analysis by species affects 64% at pine (Pinus radiata) and 32% at eucalyptus (Eucalyptus sp.). The current problem is that there is a significant number of crimes not charged conclude, because of the lack of evidence to support in judicial proceedings. The main obstacle to this is the inability of routine and rapid implementation of evidence in remnant traces botanical identification. Molecular markers: Forestry applications Microsatellite markers have been developed for some of the main plantation forest tree species, such as Pinus sylvestris (Kostia et al., 1995), Pinus radiata (Smith and Devey, 1994), and Quercus (Dow et al.,1995). Kirst et al., (2005) recently reported the development, genetic characterization, and linkage mapping of 70 SSR loci in Eucalyptus grandis and Eucalyptus urophylla and showed their excellent potential for mapping and individual identification (Brondani et al., 2002). Other applications are reported in Quercus and different species of the genus Nothofagus (Azpilicueta et al., 2004). Rojas et al. (2010), selection made using microsatellite Eucalyptus globulus drought tolerant with 10 SSR markers, of which three belong to the EMCRC series and seven to the EMBRA series. The results showed that both sets were able to clearly differentiate between different clones of Eucalyptus from crosses between drought resistant material and material of high productivity. Microsatellite markers are powerful tools commonly used for genotyping of forest species. Nevertheless, their use is still expensive and time-consuming because it relies on laborious gel-based techniques or because it generates large data files of difficult interpretation when based on fluorescent detection (Lehouque et al., 2008). These authors, developed computer software that performs the allele calling directly from the output electropherogram files, allowing a fully automated analysis of the collected data. 25 | INNOVAGRO | www.agronomiauct.cl

The system is based on the simultaneous amplification of nine highly polymorphic microsatellite markers in a multiple fragments on a capillary sequencer and allow genotyping of Eucalyptus globulus, Eucalyptus nitens and hybrids. Lehouque et al. (2008), report that microsatellites were selected based on their transferability between Eucalyptus species and their polymorphism was tested in eleven different Eucalyptus globulus races and provenances: they display an average of 12 alleles per locus in 55 samples. For the combination of the nine loci, the exclusion power in a sample of Eucalyptus breeding population was superior to 99,85%. Preliminary, studies show that the selected multiplex primers also amplify in other Eucalyptus species and their hybrids. This system allows reliable genotyping with the advantage of assaying a large number of markers in parallel, thus making it fast and cost-effective. Finkeldey et al. (2010), indicated that most appropriate molecular method to trace the origin kargely depends on the species and the knowledge about spatial distribution patterns of genetic diversity. For example, isozymes have been used to check the origin of beech (Fagus sylvatica) reproductive material, phylogeographic variation patterns of cpDNA haplotypes in European oaks (Quercus spp.). In France, chloroplast DNA isolated from oak wood has been used to identify false declarations on the origin of wood used for the production of barrels for wineries in France (Deguilloux et al., 2004). On the other hand, molecular markers are used to identify logs of the endangered tropical tree genus Intsia. Hypervariable microsatellite markers are used to genetically fingerprint the rootstock of harvested trees and to establish the genetic identify between rootstocks and harvest logs (Wong et al., 2009). Kirst et al. (2005) reports the genetic analysis of 192 unrelated individuals of an elite breeding population of Eucalyptus grandis with a selected set of six highly polymorphic microsatellite markers developed for species of the genus Eucalyptus. A full characterization of this set of six loci was carried out generating allele frequency distributions that were used to estimate parameters of genetic information content of these loci, including expected heterozygosity, polymorphism information content (PIC), power of exclusion, and probability of identity. The number of detected alleles per locus ranged from 6 to 33, with an average of 19.86. The average expected heterozygosity was 0.86 and the average PIC was 0.83. Using only three loci, it was possible to discriminate all 192 individuals. The overall probability of identity considering all six EMBRA microsatellite markers combined was lower than 1 in 2 billion. An analysis of the sample size necessary to estimate expected heterozygosity with minimum variance indicated that at least 64 individuals have to be genotyped to characterize this parameter with adequate accuracy for most microsatellites in Eucalyptus. The high degree of multiallelism and the clear and simple codominant Mendelian inheritance of the set of microsatellites used provide an extremely powerful system for the unique identification of Eucalyptus individuals for fingerprinting purposes and parentage testing. On the other hand, in forensic studies, trace fragments of leaves and pollen can be used as evidence. Historically, identification of botanical trace is based on morphological and histological analysis. With PCR and DNA sequencing possibility within databases (GenBank) via molecular taxonomy, it is possible to identify plants in different plant species. The NCBI (National Center for Biotechnology Information) contains thousands of plant DNA sequences which are useful for such identifications. These include nuclear genes ITS1 loci, ITS2 (internal transcribed spacer region) and genes encoding chloroplast ribulose 1,5 bis phosphate carboxylase (rbcL), ATP synthase Beta (atpB), and NADH dehydrogenase subunit 5 (ndhF). The most used loci corresponds to the rbcL gene, approximately 1400 base pairs in length, moderately conserved among different species and that has been reported by about 6500 plant species (Gernandt et al., 2005). On the other hand, Yao et al. (2010), report on identification efficiency when using ITS2 regions to distinguish between closely related species in different families of plants and animals using the method BLAST1. For 106 eucalyptus species identification, the success rate was 61.5% for ITS2. Based on the above, the aim of this study evidence analyzing a wood theft crimes by microsatellite marker.

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MATERIALS AND METHODS Plant material For the molecular analysis was available eucalyptus samples seized and samples from a eucalyptus plantation, which represent the possible site of origin. The first, was available buckler logs seized (Figure 1 a, b), while the second was available morphological organs such as leaves, stems, dowel increase and buckler stumps remaining trees (Figure 1 c, d).

Figure 1. Types of evidence: a) buckler logs seized b) seized buckler eucalyptus c) shield remaining tree d) slug of increased planting site.

DNA extraction The DNA was extracted from fresh leaves, stems, dowel increase of remaining trees shields and shields of seized logs. In dowel increase of shields and remaining trees of the forest, the samples were taken from the growth rings located in the transition from sapwood and heartwood. 100-300 mg of frozen tissue was ground in a mortar under liquid nitrogen condition. Genomic DNA was isolated by DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen) following manufacturer’s instructions. The pellet was resuspended in 200 μL of AE buffer of Kit. The quality of DNA was evaluated by agarose gel electrophoresis (1%), using standard DNA marker DL 15000 bp. The concentration of DNA was quantified using a digital Spectrophotometers (marc Thermo Spectronic GENESYSTM 10) based on 260 nm absorbance. DNA quality was inferred by 260/280 nm ratio. The concentration of the DNA was adjusted to 300 ng mL-1, with addition of sterile deionised water. Genotyping: PCR amplification for microsatellite markers Genotyping was carried through microsatellite markers (Table 1) of the EMCRC series (Steane et al., 2001; Azipilicueta et al., 2004). These markers are characterized as being highly specific allele discriminating (Steane et al., 2001). PCR were performed for individual loci EMCRC 9, EMCRC 10 and EMCRC 11. The PCR reaction was performed in a total volume of 15 μL, which contained 0,2 mM dNTPs, 0,2 μM of pimer (3’- 5’) and (5’-3’), 1X amplification buffer PCR, 1,0 mM MgCl2, 1 U taq DNA polymerase and DNA template 20 ɳg. In this case we used a multigene thermocycler, where the program included an initial cycle of 4 min at 95°C, followed by 40 cycles of 1 m 95°C, 30 s 55°C, 30 s 72°C and a final extension 10 minutes at 72°C.

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Table 1. General description of SSRs used in genetic characterization. Locus

EMCRC 9

EMBL Accesions no.

Cloned repeat

AJ401144

(TG)14

Primer sequences

fwd CTGGGCTGTGCATCTCTGAAA

Product size range (bp)

Ta (°C)

Mg2+ (mM)

Heterozygosity

286-342

1.0

0.31

0.79

312-344

1.0

0.57

0.88

221-255

1.0

0.81

0.91

rev GACCCGGTCAACTCCTCAAGA EMCRC 10

AJ401145

(GT)19(GA)9

fwd GCTTGGTCGGGTAGGAA rev TCGGGTTCATGTCCTTATTGT

EMCRC 11

AJ401146

(TC)10(AC)10

Source: Steane, et al. (2001).

fwd AACTGACTGTGGATTTGAAGC rev GTGAGTCATTATTTGGCAACC

Electrophoresis of PCR products Individual PCR products were visualized on a polyacrylamide gel 10%, in 1x TBE buffer at 100 V for 3 hours, stained with ethidium bromide. Polyacrylamide gels were obtained by polymerizing 120 mL of a stock solution of 10% polyacrylamide (19:1 acrylamide: bisacrylamide, TrispH8) prepared in advance and stored in darkness at 4°C .The polymerization was carried out by adding 330 μL of 10% ammonium persulfate and 33 μL of Temed (C6H16N2) catalyst and initiator of the reaction. RESULTS AND DISCUSSION Genotyping and analysis of genetic profiles For monoplex with EMCRC 9 and EMCRC 11 locus, a total of 2 genotypes were identified. For locus EMCRC 9 (Figure 2), the sample 4, from foliage planting possible origin, presents a very different genetic profile at sample 5, which corresponds to sample stem seizure procedure. It is also different to sample 7, which shield from log procedure seizure. On the other hand, the second locus studied (EMCRC 11), was less informative and less discriminating between the genotypes in evaluation. These results are consistent with the results observed in the dendrochronological analysis (data not shown), which showed a growth pattern of the samples from the representative of a commercial forest plantation very uniform, regular age and estimated age of 8 years. Meanwhile, the study of the growth rings of the seized samples shows heterogeneous patterns of growth and the presence of individuals of different ages (uneven ages). These results are agreed with Kirst et al., (2005). They reports for 192 unrelated individuals of an elite breeding population of Eucalyptus grandis with a set of six highly polymorphic microsatellite markers. A number of detected alleles for these authors per locus were among 6 to 33, with an average of 19.86 alleles. Foremore, Lehouque et al. (2008), report that microsatellites were selected based on their transferability between Eucalyptus species and their polymorphism was tested in eleven different Eucalyptus globulus races and provenances. They display an average of 12 alleles per locus in 55 samples. On the other hand, Rojas et al. (2010), that 10 SSRs markers (3 of EMCRC series and 7 of EMBRA series) show both were able to clearly differentiate between different clones of Eucalyptus from crosses between resistant to drought and high productivity material. Finally, it can be concluded from the analysis of the seized timber and its possible origin, the presence of high heterogeneity of logs and shields, presenting age and growth patterns very different to that observed in the shields from the plantation site, which has been ratified and is in agreement with the genetic profiles obtained with microsatellite markers. 28 | INNOVAGRO | www.agronomiauct.cl

1: Marker fragment size (50 bp), 2: positive control (Eucalyptus globulus), 3: Figure 2. a) PCR-EMCRC 9: Absence of amplification, 4: Sample foliage source origin; 5: Sample seized stem (suspicious) 6: Absence of amplification, 7: Sample seized, buckler log (Suspicious) 8: negative control, b) PCR-EMCRC 11: 9: positive control (Eucalyptus globulus) 10: Positive control (Eucalyptus nitens) 11: Sample foliage source origin, 12: Absence of amplification, 13: Sample seized, buckler log (Suspicious) 14: Sample seized, buckler log (suspect). Acknowledgement We thank D11I1024 FONDEF project entitled, “Forensic Botany in Criminal Investigation”. REFERENCES Azpilicueta, M.M., Caaron, H., Bodénés, C., and Gallo, L.A. 2004. SSR markers for analysing South American Nothofagus species. Silvae Genetica 53(5-6): 240-243. Brondani RPV, Brondani C, and Grattapaglia D, 2002. Towards a genuswide reference linkage map for Eucalyptus based exclusively on highly informative microsatellite markers. Mol Gen Genomics 267:338– 347. Deguilloux, M., Pemonge, M., and Petit, R. 2004. DNA-based control of oak wood geographic origin in the context of the cooperage industry. Ann. For. Sci. 61:97-104. Dow BD, Ashley MV, and Howe HF, 1995. Characterization of highly variable (GA/CT) n microsatellites in the bur oak, Quercus macrocarpa. Theor Appl Genet 91:137–141. Finkeldey, R., Leinemmann, L. and Gailing, O. 2010. Molecular genetic tools to infer the origin of forest plant and wood. Appl. Microbiol Biotechnol. 85:1251-1258. Doi 10.1007s00253-009-2328-6. Gernandt, D.S., Lopez, G.G., Garcia, S.O. Liston, A. 2005. Phylogeny and classification of Pinus. Taxon 54: 29-42. Kirst, M. Cordeiro, C. M., Rezende, G. D. S. P., and Grattapaglia, D. 2005. Power of microsatellite markers for fingerprinting and parentage analysis in Eucalyptus grandis breeding populations. Journal of Heredity 96(2):161–166. doi:10.1093/jhered/esi023. Kostia S, Varvio SL, Vakkari P, and Pulkkinen P, 1995. Microsatellite sequences in a conifer, Pinus sylvestris. Genome 38:1244–1248. Lee, A.B. and Cooper, T.A. (1995) An improved direct PCR screen of bacterial colonies: wooden toothpicks inhibit PCR amplification. BioTechniques 18; 225-226. Lehouque, G., Sanhueza, R., Melo, F. 2008. Development of multitaag: an automated genotyping system for Eucalyptus species using multiplex amplification of microsatellite markers. Boletín informativo del CIDEU 6-7:25-34. Rojas, P., B. Gutierrez. C. Muñoz, M. Molina, O. Ortiz, L. Koch, A. Bello, M. Pino., C. Muñoz, H. Prieto, G.Sellez, P. Hinrinchsen y M. Reyes. 2010. Generación y producción de plantas de Eucaliptus globulus tolerantes a la sequía. En: V Congreso Chileno de Ciencias Forestales. Universidad Católica de Temuco. 220 p. 29 | INNOVAGRO | www.agronomiauct.cl

Steane, D.A., Vaillancourt, R.E., Russell, J., Powell, W., Marshall, D., and Potts, B.M. 2001. Development and characterisation of microsatellite loci in Eucalyptus globulus (Myrtaceae). Silvae Genetica 50(2): 89-91. Wong, K., Tan, W and Chew, F. 2009. Identification and characterization of microsatellite loci in Instia palembanica (Leguminosae), a valuable tropical timber species. Mol. Ecol. Resour. 9:360-364. Yao, H., Song, J., Liu, C., Luo, K., Han, J., Li, Y., Pang, X., Xu, H., Zhu, Y., Xiao, P., Chen, S. 2010. Use of ITS2 Region as the Universal DNA Barcode for Plants and Animals. PloS One. 5(10):e13102.

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EFECTO DEL CULTIVO IN VITRO DE FLUIDO RUMINAL SOBRE EL PERFIL ZIMOGRÁFICO DE EXTRACTOS ENZIMÁTICOS EFFECT OF IN VITRO RUMEN FLUID CULTURE ON ZYMOGRAFIC PROFILE OF ENZYMATIC EXTRACTS

Dr. Alejandro Velásquez B.1 1 Área de Producción Animal, Escuela de Agronomía. Núcleo de Investigación en Producción Alimentaria. Facultad de Recursos Naturales, Universidad Católica de Temuco. Rudecindo Ortega 02950. Temuco. Email: avelasquez@uct.cl INTRODUCCIÓN Los zimogramas de actividad proteolítica constituyen una valiosa información en los estudios de degradación de proteína in vitro a través de extractos enzimáticos. Estos permiten estimar los pesos moleculares de las proteasas, su variabilidad y concentración según zona de degradación del sustrato proteico. Este tipo de caracterización permite conocer la conformación de extractos enzimáticos de origen ruminal. No obstante, la cuantificación matemática de actividad enzimática se ve limitada en un zimograma, debido a que éste no permite medir exactamente la magnitud de masa de sustrato proteico degradado por unidad de tiempo. Por otro lado, el cultivo de fluido ruminal (FR) tiene un efecto positivo sobre el potencial proteolítico de extractos enzimáticos que éste puede generar (Velásquez y Pichard, 2008). En efecto, la preincubación de FR podría incrementar la concentración y variabilidad enzimática, debido a que los microorganismos ruminales incrementarían su masa en este proceso. Entonces, se sugiere que el cultivo in vitro de FR afectaría la caracterización zimográfica de las proteasas de dichos extractos. En consecuencia, el objetivo de esta investigación fue evaluar el efecto de la preincubación in vitro de FR sobre el perfil zimográfico de proteasas de origen ruminal. MATERIALES Y MÉTODOS Se generaron extractos enzimáticos a partir de FR cultivado in vitro con sustratos inductores hacia una actividad preferentemente proteolítica, amilolítica y fibrolítica, además de un control (FR sin cultivar). Como donantes de FR se utilizaron dos vacas adultas fistuladas al rumen. La extracción de enzimas se efectuó en base a repetidas centrifugaciones, sonicación (rompimiento celular por ultrasonido) de la masa microbiana y precipitación de las enzimas con sulfato de amonio (Karadzic et al., 2004). Se dializó el precipitado y se liofilizó para su conservación. Seguida de esta purificación, a los extractos enzimáticos se les realizó zimograma de actividad proteolítica. Para este propósito, se usó gelatina como sustrato de degradación (6 mg mL-1). El procedimiento para separar las proteasas fue a través de SDS-PAGE (Hames, 1998), seguido por una incubación por una hora a temperatura ambiente (18°C) con 2,5% Triton X-100. Los geles fueron incubados por 6h a 39,5°C en un buffer (pH 7) compuesto por 6,1 gL-1 de Tris (50 mM), 11,69 gL-1 de NaCl (0,2 M) y 0.55 gL-1 de CaCl2 (5 mM). Estos fueron teñidos con Coomassie blue por una hora. Los rangos de los pesos moleculares de cada banda fueron estimados en base a un patrón estándar de proteína. La evaluación de las zonas de actividad proteolítica (decoloración de la gelatina), fue medida por densitometría (Scion Image), mediante escaneo de los zimogramas. Los datos fueron sometidos a un análisis de varianza, bajo un diseño completamente aleatorizado. Se realizaron tres zimogramas (repeticiones). Las medias de tratamiento fueron comparadas mediante procedimiento de Tukey (P<0,05). 31 | INNOVAGRO | www.agronomiauct.cl

RESULTADOS Y DISCUSIÓN Los zimogramas mostraron en todos los extractos enzimáticos seis zonas de hidrólisis, con una clara concentración de proteasas en la zona de alto peso molecular (Figura 1). La distribución zimográfica de estas enzimas, en términos generales, fue muy similar entre los tratamientos y el control. Sin embargo, las zonas de proteolisis fueron más amplias y de mayor intensidad (P<0,01) en los extractos enzimáticos de preincubación que en el control (Cuadro 1). Estas observaciones permiten señalar que el cultivo in vitro de FR tiene el potencial para generar extractos enzimáticos con una mayor concentración de proteasas. No obstante, la distribución observada en los perfiles de los zimogramas, sugieren que no existirían diferencias en los tipos de peptidasas, en cuanto a sus pesos moleculares, que poseerían los extractos enzimáticos. Figura 1. Zimograma de actividad proteolítica de los extractos enzimáticos. *Preincubación: proteolítico (P), amilolítico (A), fibrolítico (F) y control (C). **Zona de actividad enzimática.

Cuadro 1. Efecto de la preincubación de fluido ruminal sobre la densitometría de actividad proteolítica. *Zona de actividad enzimática. ** Preincubación: Proteolítico (P), amilolítico (A), fibrolítico (F) y control (C). Letras distintas dentro de línea indican diferencias significativas (Tukey, P<0,05). Extracto enzimático Intensidad de las bandas zimográficas ZE* PM (square pixels) kDa P** A F C era 1 117-130 3173a 3130a 2998a 2132b da 2 85-95 982b 988b 1275a 1286a 3ra 61-63 322a 318a 324a 207b ta 4 40-41 301a 297a 300a 255b ta 5 35-37 517a 501a 510a 457b ta 6 24-27 521a 517a 508a 466b CONCLUSIONES Los zimogramas mostraron que los extractos enzimáticos preparados a partir de fluido ruminal cultivado in vitro poseen una mayor concentración de proteasas, comparado con aquellos obtenidos desde fluido ruminal fresco. Sin embargo, todos los extractos presentaron perfiles de peso molecular de sus peptidasas muy similares. La mayor concentración de enzimas fue detectada en el rango de alto peso molecular.

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LITERATURA CITADA HAMES, B.D. 1998. Gel Electrophoresis of Proteins. A Practical Approach. School of Biochemistry and Molecular Biology. University pf Leeds, Leeds LS2 9JT, UK. 1:1-104. KARADZIC, I., MASUI, A. and N. FUJIWARA. 2004. Purification and Characterization of a Protease from Pseudomonas aeruginosa Grown in Cutting Oil. Journal of Bioscience and Bioengineering. 98, (3): 145152. VELÁSQUEZ, A. and G. PICHARD. 2008. Effect of rumen fluid preincubation on in vitro proteolytic activity of enzymatic extracts from rumen microorganisms. Thesis Doc. Departamento de Ciencias Animales, Facultad de Agronomía e Ingeniería Forestal. Pontificia Universidad Católica de Chile. Santiago, Chile. 2:16-36.

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HORTALIZAS IV GAMA, UNA ALTERNATIVA PARA LA REGIÓN DE LA ARAUCANÍA

Dra. Gina Leonelli C., Ricardo Tighe Neira, Christián Díaz Becerra y Armin Cuevas Riquelme. Escuela de Agronomía, Facultad de Recursos Naturales, Universidad Católica de Temuco. Rudecindo Ortega 02950. Temuco. Email: ginalc@uct.cl; fono: 45-553901. RESUMEN Los productores hortícolas de la Región de La Araucanía presentan como principales fortalezas la experiencia de más de 20 años en el rubro hortícola, existiendo un interés en producir con calidad, inocuidad y valor agregado. Estas cualidades les permiten desarrollar alternativas como hortalizas de IV gama que es el desafío y el futuro para potenciar el valor salud de los productos hortícolas, ya que son productos listos para consumir en fresco sin procesamiento o tratamientos térmicos. Palabras Claves: IV gama, hortalizas, valor salud, nutricional, ensalada. INTRODUCCIÓN La calidad nutricional y el valor salud de los vegetales se ve ampliamente modificada al ser procesados, debido a la pérdida de vitaminas y ácidos esenciales, además la formación de otros compuestos, los que pueden llegar a ser tóxicos como los compuestos neoformados. Durante el procesamiento o cocción de los alimentos, no siempre se conservan los nutrientes, la degradación de los nutrientes es proporcional a la temperatura de procesado, además del tiempo que se procesen, por esto las prácticas culinarias no siempre son sanas, ya que no se conoce el punto óptimo de procesado, para así evitar la pérdida excesiva de nutrientes (Leonelli, 2011). Es por esto que los vegetales se han dividido en distintos grupos dependiendo de su grado de procesamiento y presentación al consumidor (Valero, 2008). Donde se distinguen los siguientes grupos: -Primera gama: Hortalizas frescas y otros productos conservados mediante métodos tradicionales como la deshidratación, salazón y fermentación. No han sido sometidos a ningún proceso térmico, sólo la refrigeración. -Segunda gama: Incluye a las conservas que han sido sometidas a un tratamiento térmico que garantiza una mayor vida útil del producto. El tratamiento que se aplica en estos casos suele ser la esterilización que se diferencian sobre todo en la intensidad del tratamiento. -Tercera gama: Se incluyen en este grupo las hortalizas congeladas. Que precisan una cocción antes de consumir (arvejas, porotos verdes, maíz, entre otras) (Guanche, 2010). -Cuarta gama: Son hortalizas lavadas, peladas, cortadas y envasadas en condiciones especiales (atmósferas modificadas o controladas) y listas para su consumo (por ejemplo, ensaladas variadas). Deben conservarse entre 3 y 4ºC hasta que son consumidas (Furche y Martínez, 2011). -Quinta Gama: Se refiere a los productos elaborados o cocinados y envasados (salsas de hortalizas, sofritos) o a una mezcla de cocinados, que necesitan calentarse para su consumo. Platos preparados, pizza, lasañas, entre otros (Blázquez y Díaz, 2008). 34 | INNOVAGRO | www.agronomiauct.cl

En cuanto a la tecnología de IV Gama, fue creada para satisfacer la actual tendencia mundial de consumir comida natural y rica en nutrientes. Además, esta tiene como potencialidades su presentación, lo innecesario de aplicar un tratamiento antes de consumir ni siquiera el lavado ya que se someten a un estricto proceso de higienización, la conservación de todas las propiedades del producto fresco y la posibilidad de contar con variedades que se encuentran en la primera gama (Loyola et al., 2007). Además, la IV gama asegura la calidad e inocuidad de los alimentos. En la mayoría de los casos estos productos se presentan en envases como bolsas, bandejas, y suelen tener una vida útil de unos siete días, lo cual se logra mediante la mantención de una cadena de frío. De lo contrario, las principales alteraciones que sufren estos productos son la oxidación, deshidratación, acumulación de líquido o fermentación (Bravo y Horta, 2010). En los productos de IV gama, las ensaladas resultan ser el segmento más desarrollado. Actualmente, las hortalizas dejaron de ser la ensalada o relleno en las comidas, pasando a ser alimentos básicos escenciales para la salud y alimentación humana. Por ello, para realizar ensaladas de colores y sabores variados existe una importante apuesta por las mini hortalizas, multihoja y las hortalizas orientales como complemento para su IV gama (AVACU – CECU, 2008). Lechuga multihoja Este es un nuevo tipo de lechuga con muchas pequeñas hojas, que parten de un tallo común. Con un solo corte, todas las hojas se desprenden y permanecen uniformes y permite ensaladas muy atractivas. Las ventajas de este nuevo tipo de cultivo en alta densidad son muy destacables, ya que se consigue un mayor rendimiento del producto, con un aprovechamiento cercano al 90%. En el momento de cosecha, la planta sólo necesita un corte, por lo que se evita un importante grado de oxidación de la hoja. El cultivo en multihoja permite además el desarrollo de muchos nuevos tipos de hojas (Figura 1). El color diverso y las mezclas de diferentes ingredientes, los componentes de “babyleaf” (hojas enteras, brotes tiernos), hojas de espinaca, “wild rocket”, son parte de ese ejercicio de diversificación que se está llevando a cabo y se constituye en una alternativa para las hortalizas de la Región de La Araucanía, con la posibilidad de incorporar ecotipos locales de especies hortícolas ancestrales como el berro, placa, mastuerzo, yuyo, vinagrillo, culle, lahue, tomino, chaskú, nalca, entre otras. La diversidad de lechugas en los diferentes colores verdes, verde fresco y rojo permiten identificar y diversificar los formatos y los sabores. Esto da una idea del fuerte crecimiento que está experimentando la IV gama al buscar una innovación en estos productos para ofrecer contrastes de sabor en las ensaladas (Alonso, 2007).

Figura 1. Variedades de hortalizas multihojas para IV gama. A) lechuga, B) espinaca, C) rúcula, D) malva 35 | INNOVAGRO | www.agronomiauct.cl

Lechuga hoja japonesa Nuevos conceptos de hoja y una gran variedad de texturas crujientes, de diferentes tamaños y colores, permiten hacer más atractivas y naturales las bolsas de ensaladas. Los procesadores buscan hortalizas orientales y crean ensaladas de esta tipología. Pero las innovaciones van más allá y juegan con los cinco sentidos: se buscan aromas al abrir la bolsa, sabores crujientes, colores que entren por la vista, entre otras (IICA, 2007). Mini hortalizas Comprende otras hortalizas mínimamente procesadas tales como zanahoria, betarraga rallada, diferentes tipos de lechuga, repollo, pimiento, apio, zapallo trozado, hojas de acelga, espinacas enteras o cortadas, inflorescencias de brócoli, coliflor, mezclas de hortalizas de hojas para ensaladas, trozos de verduras para preparar sopas, papas en bastones o rejillas, champiñones fileteados (Viña y Chaves, 2003). Además, los brotes constituyen una parte muy importante en el desarrollo y la innovación de estos productos (Floristán, 2009). De igual forma, se incluyen algunas especies exóticas de origen oriental como el Yu Choi, Gai Lan, Chingay Choi, Baby Bok Choi, Kale, Leek, entre otras. Dentro de la IV gama se desarrollan las mini hortalizas también conocidas como hortalizas “baby” o enanas, constituyen componentes esenciales de las dietas alimenticias (Suarez, 2008). Según Bardon et al. (2012) actualmente en el mercado se imponen nuevas variedades y productos con el fin de diversificar la oferta. Las mini hortalizas se destacan por presentar una imagen tierna y delicada, un sabor más dulce, una textura firme y una coloración variada y brillante como se observa en la Figura 2.

Figura 2. Minihortalizas para la IV gama: A) pimientos mini, B) cebollas mini, C) mini pepinos, D) repollos, E) variedades mini de brócoli y coliflor, F) alcachofas, G) mini zanahorias. Hortalizas orientales Destaca dentro de las hortalizas orientales, su bajo contenido en grasa, colesterol y sodio siendo a la vez una fuente de vitamina A, B, C, proteínas, calcio y potasio. Estas hortalizas tienen un gran potencial de adaptación a las condiciones climáticas y de suelo, así como gran valor nutritivo que las hace muy atractivas (OEIDRUS, 2009). La producción y comercialización de vegetales orientales constituye una innovadora línea en la producción con un potencial de crecimiento gracias a las demandas de mercados internacionales (IICA, 2007). Los vegetales orientales involucran varias especies de hortalizas (Figura 3). Se caracterizan por iniciar su producción en un corto tiempo y se cosechan de manera continua durante la etapa de producción. 36 | INNOVAGRO | www.agronomiauct.cl

Figura 3. Cultivos orientales, A) bok choy (Brassica rapa), B) chard (Beta vulgaris var. cicla), C) leek (Allium ampeloprasum), D) kale (Brassica oleracea grupo acephala), E) yu choy (Brassica rapa F.) tatsoi, G) mizuna. Hortalizas Combinadas Existe dentro de la IV gama el desarrollo de hortalizas combinadas, estos son productos como las ensaladas listas para consumir o para preparar. Se trabajan diferentes variedades de lechuga; especialmente, lechuga iceberg junto con otros tipos de hortalizas como zanahoria, perejil, cortes de cebolla, acelgas, espinacas, canónigos, achicoria, rúcula, lombarda, entre otras (AVACU – CECU, 2008). Otras combinaciones presentes en el mercado nacional, (Figura 4) son las ensaladas toscana, que comprende una mezcla de zanahoria, repollo morado y lechuga; napolitana que es mezcla de repollo blanco y zanahoria; cuatro estaciones mezcla de lechuga y radicchio; y la combinación “summer mix” una mezcla de diferentes variedades de lechugas y vegetales.

Figura 4. Combinaciones de hortalizas listas para su consumo. A) ensalada napolitana, B) ensalada toscana, C) “summer mix”, D) ensalada cuatro estaciones. Otras combinaciones en IV gama son mezclas de hortalizas y brotes lista para ser cocinadas. Acá encontramos: “base wok”, combinaciones de diente de dragón y cebollin; “wok chop suey”, que es una combinación de diente de dragón, cebollín, brócoli, coliflor y zanahoria; “wok thai”, combinación de diente de dragón, puerro, zanahoria y zapallo italiano. Por otra parte, en el mercado se están ofreciendo diferentes tipos de cortes en productos frescos como es en el caso de la zanahoria, con presentaciones en rodajas, bastones, chips y corte juliana. CONCLUSIONES 1.- En los productos de IV gama, las ensaladas resultan ser el segmento más desarrollado, dejando de ser el relleno en las comidas y pasando a ser alimentos básicos, esenciales para la salud y alimentación humana. 2.- Para realizar ensaladas frescas de colores y sabores variados existe una importante apuesta por las minihortalizas, multihojas, hortalizas orientales, brotes nuevos y combinaciones de hortalizas listas para su consumo. 3.- La IV gama en hortalizas también está ofreciendo diferentes tipos de cortes en productos frescos con presentaciones en trozos de verduras para preparar sopas, en rodajas, bastones, rejillas, fileteadas, chips, corte juliana entre otros como componentes esenciales de las dietas alimenticias con gran valor nutritivo. 37 | INNOVAGRO | www.agronomiauct.cl

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