Teadus kliinilise tööga käsikäes

Selles rubriigis tutvustame Regionaalhaigla töötajate teadustöid ja -projekte.

Onkoloog dr Anu Planken ja laborispetsialist Birgit Truumees.

Regionaalhaigla onkoloogia- ja hematoloogiakliinikus on kliiniline ja siirdemeditsiiniline teadustöö hästi juurdunud ning onkoloogidel suur huvi teadus-arendustöö vastu. Alljärgnevalt kirjutab onkoloog Anu Planken lähemalt kasvajate ja närvisüsteemi vaheliste seoste uurimisest ning uute vähivastaste bioloogiliste ravimkandidaatide arendamisest.

Dr Anu Planken, onkoloog ja vanemteadur

Pärast Tartu Ülikooli arstiteaduskonna lõpetamist oli mul sügavam huvi neuroloogia vastu. Kuna olin juba üliõpilasena tegelenud teadustööga neurofüsioloogia laboris, tundus loogiline jätkata õpinguid doktorantuuris neurobioloogia valdkonnas Helsingi Ülikooli biotehnoloogia instituudis prof Mart Saarma juhendamisel.

Minu teadustöö keskendus Parkinsoni tõve molekulaarsete protsesside iseloomustamisele ning uudsete haigust modifitseerivate ravimite väljatöötamisele. Tegemist oli peamiselt prekliinilise laboratoorse tööga ning aastal 2012 kaitsesin doktoritöö „Role of GDNF and its cross-talk with other growth-factors in the dopaminergic system“.

Pärast kaitsmist pöördusin tagasi Eestisse ning asusin tööle Vähiuuringute Tehnoloogia Arenduskeskuses (VTAK) kliiniliste uuringute juhina. Kuna VTAK-is olid käimas siirdemeditsiinilised uuringud koostöös onkoloogidega Regionaalhaiglast, tekkis mul sügavam huvi onkoloogia valdkonna vastu – sel erialal on muutused äärmiselt kiired ning minu teadustööl võib olla reaalne väljund kasvajate diagnostikas ja ravis. Tegelesin aktiivselt ka teadustööga onkoloogia residentuuri vältel ning alates 2019. aasta sügisest jätkan karjääri arst-teadlasena, pühendudes pool ajast kliinilisele tööle onkoloogina ning teise poole ajast akadeemilisele ja teadus-arendustööle vanemteadurina Tartu Ülikoolis ja biotehnoloogia ettevõttes Icosagen. TEADUS

ajal on kasvajate bioloogias hakatud tähtsustama tuumori mikrokeskkonna mõju kasvajate arengule, kuna lisaks kasvajarakkudele esinevad kasvajakoes ka strooma kom ponendid, nagu veresooned, närvid ja immuunsüsteemi rakud, mis interakteerudes mõjutavad kasvajarakkude paljunemist ja levikut. Mikrokeskkonna mõjust lähtuvalt on teostatud ulatuslikult uuringuid, mõistmaks angioge neesi ja immuunregulatsiooni rolli kasvajates. Tänapäeva onkoloogias on kliinilises praktikas kasutusel mitu siht märklaudravimit nimetatud protsesside modifitseerimiseks, kuid puuduvad põhjalikud uuringud, mis käsitleksid närvisüsteemi rolli kasvajate tekkes ja arengus, ning puu duvad ravimid, mis oleksid suunatud selliste protsesside mõjutamise vastu (vt ka joonis 1). Närvisüsteemi rolli kasvajate arengus tuntakse küll juba aastast 1940, kui publitseeriti esimesed tööd, mis näitasid, et kasvajate denervatsioonil on kasvajavastane efekt. Vaa tamata sellele on vähe uuringuid, mis käsitleksid molekulaarseid mehhanisme, mis mõjutavad kasvaja- ja närvisüsteemi vahelisi interaktsioone. Sellest kontekstist lähtuvalt on välja pakutud, et vähirakud mõjutavad otseselt närve ja indutseerivad innervatsiooni läbi neuriitide väljakasvu tuumori suunas (protsess, mida tuntakse kui neo-neurogenees) ning samal ajal sekreteerivad neuronid ja gliiara kud tuumori kasvu, invasiooni ja migratsiooni stimuleerivaid molekule, mis soodustavad kasvaja levikut mööda närve (protsess, mida tuntakse kui perineuraalne inva sioon, PNI). Histoloogias loetakse kasvajaid PNI positiivseteks, kui 33% närvist on ümbritsetud kasvajarakkude poolt, ning aina enam hakatakse tähtsustama seda marke rit kui halva prognoosi näitajat enamiku levinud kasvajate puhul, nagu pea-kaela-, pankrease-, kolorektaal-, rinnaja prostatakasvajad.

Neurotroofsed faktorid (NTF) on sekreteeritavad biomolekulid, mida tuntakse närvisüsteemi arengu ja homöostaasi faktoritena, kuid esmased tulemused vii tavad asjaolule, et neil faktoreil võib olla ka keskne roll kasvajate neurobioloogias. On publitseeritud esmaseid 

Tuumori veresooned Strooma

Närvid Tuumor Tuumori lümfisooned

Tekst: Anu Planken Fotod: Aivar Kullamaa

1. NEUROTROOFSETE TEGURITE ROLL NÄRVISÜSTEEMI JA KASVAJA VAHELISTES INTERAKTSIOONIDES Lähtuvalt oma teadustaustast olen soovinud integreerida aastatepikkust kogemust neurobioloogias onkoloogia vald konnaga ning minu jaoks kõige inspireerivam uuring käsitleb kasvajate ja närvisüsteemi vahelisi seoseid.

Kasvajate molekulaarsed mehhanismid on kompleks sed ning paljusid bioloogilisi protsesse peetakse keskseteks kasvajate patogeneesis (nn hallmarks of cancer). Viimasel

CAF – kasvaja fibroblastid

Transport verevoolu kaudu ECM

Transport veresoone - seina kaudu

Kudede- vaheline transport Lümfidrenaaž

Joonis 1. Tuumori mikrokeskkond, kus traditsiooniliselt on tähtsustatud veresoonte, lümfisoonte ja immuunsüsteemi rolli, kuid närvide mõju kasvajatele on jäänud tagaplaanile. Meie uuringu eesmärk on iseloomustada närvide rolli kasvajate tekkes ja arengus, ning võimaluse korral arendada uudseid ravimeid, mis oleksid suunatud protsessi mõjutamiseks.

uuringuid, kus on käsitletud klassikaliste neurotroofsete faktorite rolli kasvajates, näiteks on näidatud, et nii pankrease-, rinna- kui ka sapiteedekasvajad üleekspres seerivad neurotroofseid faktoreid ning nimetatud valkudel on kemoatraktiivne mõju kasvajarakkudele. Lisaks on leitud, et nimetatud faktorite türosiinkinaasi retsepto rite (n.RET, MET, NTRK) mutatsioonidel on keskne roll eri kasvajate nn „driver“-mutatsioonidena. Lisaks eespool loetletud klassikalistele kasvufaktoritele iseloomustati 15 aastat tagasi kolme uudset neurotroofset faktorit: kasvu diferentseerumise faktor 15 (GDF15), mesentsephaalse test astrotsüütidest pärinev neurotroofne faktor (MANF) ja tserebraalne dopamiini neurotroofne faktor (CDNF). Need uudsed neurotroofsed faktorid on neuroloogilisest aspek tist relevantsed, kuna hoiavad elus keskaju dopamiini neuroneid ja käituvad neuroprotektiivselt Parkinsoni tõve mudelites, kuid meie esmased uuringud on näidanud, et neil võib olla roll ka kasvajate proliferatsioonis, metasta seerumises ja ravimresistentsuse tekkes ning lisaks ka kasvajatest indutseeritud anoreksia ja kahheksia puhul.

Selleks, et uurida neurotroofsete faktorite rolli kasva jate puhul, oleme käivitanud põhjaliku uuringu koostöös Regionaalhaigla onkoloogia- ja hematoloogiakliiniku, patoloogiakeskuse ning Tallinna Tehnikaülikooli ja Tartu Ülikooli teadlastega. Eesmärk on esimest korda iseloomus tada neurotroofsete faktorite võimalikku esinemist ja rolli inimeste kasvajatel. Selle siirdemeditsiinilise uuringu ees märk on selgitada, kas ja kuidas need faktorid mõjutavad kasvajate teket ja arengut ning kas faktorite mõjutamisel võiks olla kasvajavastane terapeutiline väljund. Kasuta des rahvusvahelistest geeniekspressiooni andmebaasidest saadud infot, oleme määranud bioinformaatilise analüüsi abil erinevate neurotroofsete faktorite tasemed tuhande test kasvajaproovidest eri kasvajatüüpide puhul (vt joonis 2). Lisaks oleme teinud geeni ekspressiooni mõõtmisi Regionaalhaiglas kogutud 200 kolorektaal-, rinnakasvaja ja melanoomiproovidest ning hetkel käib põhjalik immu nohistokeemiline analüüs nende faktorite valgutasemete iseloomustamiseks kasvajakudedes (vt joonis 3). Immuno

Onkoloog dr Anu Planken, patoloog dr Katrin Lepik ja laborispetsialist Birgit Truumees peavad teadusest lugu. histokeemilised analüüsid toimuvad Regionaalhaigla patoloogi dr Katrin Lepiku ja laborispetsialisti Birgit Truumehe osalusel ning antud teadustööle tuginedes on neil hiljem võimalik kaitsta ka enda doktoritööd. Lisaks profileerime ka melanoomi ja kolorektaalkasvajate seerumeid neurot roofsete faktorite tasemete suhtes ning uuringu põhjal on Tallinna Tehnikaülikooli magistrandil Kristel Ratasel plaanis kaitsta 2020. aasta suvel oma magistritöö. Esma sed tulemused toetavad meie hüpoteesi, et neurotroofsetel teguritel on oma roll kasvajate patogeneesis, ning see annab aluse edasisteks uuringuteks ja võimalike uudsete ravimite arendamiseks.

2. UUTE VÄHIVASTASTE BIOLOOGILISTE RAVIMITE ARENDAMINE Teine suuremahuline uuring keskendub uudsete vähivastaste bioloogiliste ravimkandidaatide arendamisele. Uuring toimub koostöös Regionaalhaigla, Tartu Ülikooli tehnoloogia instituudi ning biotehnoloogia ettevõttega

Joonis 2. Mesentsephaalsetest astrotsüütidest pärineva neurotroofse faktori geeni ekspressioonitasemete võrdlus erinevate vähipaikmete puhul (märgitud punasega) ning normaalkudedes (märgitud rohelisega).

Joonis 3. Mesentsephaalsetest astrotsüütidest pärineva neurotroofse faktori valgu ekspressioon rinnakasvajate kudedes.

ICOSAGEN. Uuringu sisuks on uudsete onkoloogiliste ravimkandidaatide selekteerimine, bioloogiliste antikehade tootmine ja valideerimine prekliinilistel loomamudelitel.

Projekti esimeses faasis oleme teinud põhjaliku bioin formaatilise analüüsi, kasutades vähirakuliinide genoomi editeerimise tehnoloogia (CRISPR-Cas9) süsteemil põhine vaid andmeid, mille põhjal oleme koostanud vähivastaste sihtmärkide nimekirja (179 membraanvalku). Uuringu eesmärk on arendada nimetatud valguliste sihtmärkide vastu antagonistlikke bioloogilisi ravimeid. Kasutades Tartu Ülikooli teadlaste väljatöötatud ja optimeeritud anti kehade tootmise tehnoloogiaid (Hybrifree, VLP), oleme alustanud bioloogiliste ravimite lähtemolekulide (kimäärsete antikehade) arendamisega. Selleks oleme määratlenud vähivormid, mille vastu antikehapõhist bioloogilist ravi on võimalik ja vajalik arendada (kaasa arvatud pankrease-, soole-, rinna- ja kopsuvähk), ning selekteerinud siht märkmolekulid, mis on ekspresseeritud rakupinnal. Peamised märklauad, mida mõjutama asume, on transformeeriva kasvufaktori beeta (TGF-β) signaaliraja molekulid, türosiinkinaasi retseptorid ning kasvajaprotsessides olu lised G-proteiinid. Kuna antud lähtemolekulide ravimiarendus on olnud raskendatud just antikehade arenduslike aspektide tõttu, on meil võimalik uudse Hybrifree ja VLP tehnoloogiaga toota bioloogiliselt äärmiselt aktiivseid ning kehaomaseid antikehasid, millel võiks olla suur kliiniline TEADUS

efektiivsus ning vähe kõrvaltoimeid.

Hetkel käib antikehade tootmine ning kanade-küü likute immuniseerimise etapp. Arendatud molekulide puhul verifitseerime esmalt nende soovitava bioloogilise aktiivsuse ja testime in vitro ning in vivo kasvajate loomamudelites. Võimaluse korral plaanime esimest korda Eestis ka sobivate kandidaatidega edasiarendusi faas I ( first-inman ) kliiniliste uuringute tasemeni ning plaanime nende läbiviimist Regionaalhaiglas (joonis 4).

3. RAHVUSVAHELISED KOOSTÖÖPROJEKTID Oma kliinilises praktikas olen spetsialiseerumas peamiselt seedetrakti kasvajatele ning koos keemiaravikeskuse juhataja ja minu kliinilise mentori dr Anneli Elmega oleme aktiivselt käivitamas ning läbi viimas uuringuid ka gastrointestinaalkasvajate valdkonnas, neist olulisemad kolo rektaalvähi ja maovähi epidemioloogilised, molekulaarsed ning mikrobioomi uuringud. Onkoloogia- ja hematoloo giakliinikus on käimas ka rahvusvahelisi uuringuid, neist olulisimad on koostööprojektid EORTC-ga ( European Organisation for Research and Treatment of Cancer ), mis on üks peamisi akadeemilisi ja kliinilisi uuringuid tegevaid organisatsioone onkoloogia valdkonnas Euroopas. EORTC SPECTA projektiga on juba eelnevalt kopsuvähi vald konnas liitunud dr Kersti Oselin ning käimas on ulatuslik metastaatilise kopsuvähiga patsientide kasvajakudede molekulaarse profileerimise uuring. Alates 2020. aastast on meil võimalus liituda nii SPECTA kui ka lisauuringuga – IMMUCAN, kolorektaalvähi kasvajate kontekstis. Uuringu eesmärk on üleeuroopaline platvorm, kuhu kogutakse eri kasvajapaigetega patsientide kliinilised, diagnostili sed ja kasvajate DNA sekveneerimise andmed, mida saavad kõik EORTC liikmed kasutada ka isiklikuks teadustööks. IMMUCAN-i uuringu raames lisandub uuringule ka immuunprofileerimine, et saada lisainformatsiooni tuu mori immunobioloogiast ja mikrokeskkonnast.

EORTC grupist lähtunud konsortsiumiga andsime äsja sisse ka Marie Sklodowska-Curie Innovative Training Networksi (ITN) taotluse, mis keskendub maokasvajate raviresistentsuse tekkemehhanismide uurimisele ja uud sete ravivõimaluste väljatöötamisele. Projekti raames on eesmärk kaasata ka rahvusvahelisi doktorante ning koos töös Tartu Ülikooli arstiteaduskonnaga on plaanis ka Eestis koolitada nelja aasta jooksul üks välisdoktorant.

Kandidaatide hindamine Sihtmärkide kinnitamine Antigeenide disain ja valmistamine Immuniseerimine ja pos Ab puulid Bioloogilise aktiivsuse määramine

CBA adapteerimine/valmistamine, loomamudeli võimalused?

Joonis 4. Uute vähivastastel antikehadel baseeruvate bioloogiliste ravimite arendusprotsessi kirjeldus. (MAB – monoklonaalsed antikehad, CBA – Cell Based Assay). Soovitud omadustega MAb-id

FAAS I “First-in-man” KLIINILINE UURING