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Artículo original | Original Article ESTUDIO DE BOCAVIRUS HUMANO 1 EN ADULTOS CON INFECCIÓN DEL TRACTO RESPIRATORIO SUPERIOR E INDIVIDUOS SANOS DE CÓRDOBA, ARGENTINA Human bocavirus 1 study in adults with acute respiratory infection and in healthy individuals of Cordoba, Argentina
RIVADERA, SABRINA X; PASTRANA, LUCIANO N; GHIETTO, LUCIA M; ADAMO, MARÍA P. Instituto De Virología “Dr. José María Vanella”, Facultad de Ciencias Médicas, Universidad Nacional de Córdoba. Enfermera Gordillo S/N, Ciudad Universitaria. CP 5016 Córdoba, Argentina. RESUMEN El Bocavirus Humano 1 (HBoV1) es un agente ubicuo de infección respiratoria aguda (IRA) alta y baja principalmente en niños, aunque también se ha encontrado en población adulta sintomática con prevalencia variable entre 0,8 y 6%. Con el objetivo de explorar la presencia de HBoV en adultos de Córdoba, Argentina, se analizaron muestras de secreciones respiratorias obtenidas por hisopado nasal de individuos mayores de 14 años de edad con y sin enfermedad respiratoria aguda (n=33 y n=36, respectivamente), colectadas en las semanas epidemiológicas 4 a 48, 2013. De las muestras clínicas se extrajeron ácidos nucleicos y se realizó la detección del genoma viral por PCR, visualizando los productos de PCR mediante electroforesis en gel de poliacrilamida teñido con nitrato de plata. Todas las muestras resultaron negativas en el grupo de pacientes y en el grupo control. Estos datos preliminares pueden indicar la menor incidencia de HBoV en adultos en comparación con población pediátrica. Además de la menor prevalencia en adultos, también debe considerarse la circulación variable del virus, la cual ha sido demostrada en población pediátrica, con una presencia constante todos los años y brotes periódicos de mayor magnitud. A fin de corroborar la menor participación del virus en la patología respiratoria en adultos, se justifican futuros estudios que incluyan una muestra de estudio ampliada Palabras clave: bocavirus, adultos, pacientes, control. ABSTRACT Human Bocavirus 1 (HBoV1) is a ubiquitous agent that can cause upper and lower acute respiratory infection (ARI) mainly in children. It has also been found in symptomatic adults with a variable prevalence of 0.8% to 6%. In order to explore the presence of HBoV in adults of Córdoba, Argentina, we tested respiratory specimens (nasal swabs) from patients with ARI (n=33) and healthy individuals (control group, n=36), collected during epidemiological weeks 4 to 48, 2013. Nucleic acids were extracted from the clinical specimens and the viral genome was determined by PCR and silver stained-polyacrylamide gel electrophoresis. All samples were negative in the group of patients and in the control group. These preliminary data can indicate the lower incidence of HBoV in adults in comparison with pediatric population. In addition to the lower prevalence in adults, it should also be considered the variable circulation of the virus, which has been demonstrated among children, with a constant presence every year and periodic outbreaks of greater magnitude. Thus, to corroborate the lower participation of the virus in the respiratory pathology in adults future studies including expanded study sample are justified. Keywords: bocavirus, adults, patients, control. Correspondencia: Adamo María P. Instituto De Virología “Dr. José María Vanella”, Facultad de Ciencias Médicas, Universidad Nacional de Córdoba. Enfermera Gordillo S/N, Ciudad Universitaria. CP 5016 Córdoba, Argentina | Correo Electrónico: mpadamo@fcm.unc.edu.ar
Fecha de recepción: 08/08/16 Fecha de aprobación: 27/09/16 Fecha de publicación: 25/11/16
Autor (es). Acceso abierto 2016. Este artículo se distribuye bajo los términos de Creative Commons Attribution 4.0 International License (http://creativecommons.org/licenses/ by/4.0/), que permite el uso sin restricciones, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre y cuando otorgue un crédito apropiado al autor original y al origen, proporcione un enlace a La licencia de Creative Commons, e indicar si se realizaron cambios. La exención de Dedicación de dominio público de Creative Commons (http:// creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/) se aplica a los datos facilitados en este artículo, a menos que se indique lo contrario.
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INTRODUCCIÓN La infección respiratoria aguda (IRA) representa una de las principales causas de atención médica en todo el mundo, tanto en la consulta ambulatoria como en la internación, siendo la IRA baja la primera causa de mortalidad en niños en países en vías de desarrollo (1). Los virus son los agentes predominantes en la IRA (2), y entre ellos se investiga al bocavirus humano 1 (HBoV1), un parvovirus descripto por primera vez en el año 2005 (3). Usualmente se encuentra al HBoV1 en segundo o tercer lugar en frecuencia de detecciones en niños con IRA baja (bronquiolitis, neumonía), aunque las prevalencias reportadas son ampliamente variables (1 a 33%), según la serie de casos estudiada (4,5). Se lo considera un virus frecuente en niños pequeños -particularmente lactantesy numerosos estudios sólo o principalmente reportan su detección en pre-escolares (5–8), sin embargo también se ha detectado la presencia de HBoV1 en secreciones del tracto respiratorio de adultos sintomáticos (enfermedad tipo influenza, síndrome agudo respiratorio severo) (9–13). Por otra parte, se ha reportado la detección del virus en saliva y secreciones respiratorias de niños asintomáticos (5,7,8,14) y en otros tejidos y suero de individuos sin síntomas de IRA (15–17). En este contexto, con respecto a la participación de HBoV1 como agente causal independiente en la patología respiratoria se postula que, dado el potencial de HBoV1 para establecer infecciones persistentes (18), la carga viral elevada en el tracto respiratorio se relaciona con la producción de enfermedad, mientras que en individuos infectados asintomáticos se detectaría baja carga viral asociada a excreción de virus en portadores sanos (19–22). Sumado a lo anterior, la detección de HBoV1 en materia fecal de individuos sanos, tanto niños como adultos (23) indica la excreción viral y la posible participación de la vía fecal–oral en la transmisión del virus en un ciclo natural que involucra portadores sanos. Sin embargo, aún no se ha reportado la presencia de HBoV1 en el tracto respiratorio de adultos asintomáticos, siendo esta información relevante para completar el escenario en el por ahora se construye la hipótesis sobre el rol etiológico de HBoV1 en la enfermedad respiratoria aguda. Por ello, el objetivo de este trabajo fue investigar la presencia de HBoV1 en tracto respiratorio de individuos adultos con y sin signos/síntomas de IRA. MATERIALES Y MÉTODOS Diseño Estudio retrospectivo, observacional, descriptivo. Población de estudio y recolección de muestra Se estudiaron 69 individuos, 36 sanos (sin signos/ síntomas de IRA al momento de extracción de la muestra de secreción respiratoria ni al menos en 2 semanas previas) y 33 pacientes ambulatorios con IRA alta (síntomas de la vía respiratoria superior –fosas nasales y faringe), todos mayores de 14 años. El reclutamiento de los participantes se realizó en zona sur de la Ciudad de Córdoba, con un rango etario similar en ambos grupos, entre las semanas epidemiológicas 1 y 52 del año 2013. Los pacientes fueron
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invitados a participar durante la consulta espontánea en centros de salud, en tanto los individuos sanos se reclutaron en el contexto de charlas de difusión en el contexto de un programa de extensión universitaria. En ambos casos la muestra de cada participante estuvo acompañada con los respectivos datos epidemiológicos y clínicos recopilados en un formulario ad-hoc. El protocolo fue aprobado por el CIEIS del Niño y el Adulto del Polo Hospitalario Córdoba y los participantes firmaron consentimiento informado. Las muestras respiratorias fueron obtenidas por hisopado nasal (ambas narinas), refrigeradas y procesadas para extracción de ácidos nucleicos dentro de las 24h. Los hisopos colocados en 1 ml de PBS estéril con perlas de vidrio fueron agitados en vórtex durante 30 seg, luego de lo cual se recuperó una fracción de 100 µl de esta suspensión para extracción de ácidos nucleicos y detección de HBoV1 por PCR. Extracción de Ácidos Nucleicos Se utilizó la técnica con buffer de guanidina y sílica (24) adaptada a secreciones respiratorias (25,26). Brevemente, a 100 ml de la suspensión de la muestra respiratoria se le agregó 200 µl de buffer de lisis (0.1 M Tris pH 6.4, 37 mM EDTA pH 8.0, 2.2% Triton X-100, y 12 g tiocianato de guanidina / 10 ml solución) y 10 µl de sílica hidratada, se mezcló en vórtex 5 seg y se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente. La sílica es recuperada por precipitación mediante centrifugación, lavada 2 veces con etanol 70% y una con acetona, seguido de un proceso de secado a 56º C durante 15 minutos, luego de lo cual se resuspende en 25 µl de buffer Tris-EDTA (10 : 1, pH 8.0), 15 min a 56º C. Los ácidos nucleicos son recuperados en el sobrenadante mediante centrifugación a 16.000g por 2,5 min y almacenados a -20ºC hasta los ensayos de PCR. Detección del genoma HBoV1 El genoma del HBoV1 se detectó mediante PCR, empleando 2 µl de extracto preparado como se indica en el apartado anterior. Los primers utilizados fueron 5-GAGCTCTGTAAGTACTATTAC y 5-CTCTGTGTTGACTGAATACAG, correspondientes un fragmento de NP1 ubicado entre los nucleótidos 2351 a 2371 y 2704 a 2684, respectivamente, del genoma HBoV1 con número de acceso en GenBanck NC_007455. La reacción se realizó con 0,2 mM desoxinucleótidos (mezcla equimolecular de A, T. G, y C), 0,2 µM de cada primer, 2,5 mM MgCl2, y 0,02 U/µL Taq DNA polimerasa. Las condiciones de ciclado fueron las siguientes: 94ºC 30 seg, 48ºC 30 seg y 72ºC 1 minuto (35 ciclos seguido de una etapa final de extensión a 72ºC por 10 minutos. Cada ensayo se realizó incluyendo los controles positivo y negativo correspondientes. Visualización de productos de PCR Los productos de PCR se visualizaron mediante electroforesis en geles de poliacrilamida al 10%, teñidos con nitrato de plata. La banda esperada del amplicón se localizó a la altura de los 354 pb. Análisis de datos Test exacto de Fisher; significancia p<0.05
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RESULTADOS Descripción de la población de estudio Las muestras se recolectaron a lo largo del año 2013, 76% durante los meses fríos (otoño, invierno y principio de primavera). El rango etario de ambos grupos, pacientes con IRA e individuos sanos, fue similar (Fig. 1): de 14 a 70 años en el grupo de pacientes (edad promedio: 34,96 ± 16,51 años, mediana: 37 años) y de 21 a 72 años de edad en el grupo de individuos sanos (edad promedio de 36,54 ± 14,96). La distribución por sexo fue 18 mujeres (55%) / 15 varones (45%) en el grupo de pacientes y 23 mujeres (64%) /13 varones (36%) en el grupo de asintomáticos (diferencias no significativas (p = 0.43 y p = 0.92, respectivamente). Los síntomas predominantes en los pacientes se muestran en la Tabla 1. En el grupo de asintomáticos, como dato relevante 25% (9/36) reconoció hábitos tóxicos de tabaquismo y 30,5% (11/36) manifestó tener en su contexto social personas con hábitos de tabaquismo. Detección de HBoV No se detectó la presencia del genoma viral en ningún paciente ni entre los individuos asintomáticos.
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Individuos sintomaticos
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Individuos asintomaticos
Fig. 1. Distribución etaria del total de muestras recolectadas durante el año 2013.
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Tabla 1. Características clínicas y epidemiológicas de los 33 pacientes estudiados durante el 2013. CARACTERISTICAS EPIDEMIOLOGICAS Edad (años) Sexo (F/M) Contacto con sintomático CARACTERISTICAS CLÍNICAS Pródromo (días) Primer síntoma Rinitis y rinorrea Decaimiento Tos Fiebre Mialgia y alergia Broncoespasmo Odinofagia Afonía Cefalea y rinitis Dolor articular Diarrea Otros Signos y síntomas Fiebre Vómitos Diarrea Rinitis Tos Sibilancias Rash Apneas Disnea Otros Tratamiento con antibiótico Comorbilidades Diabetes Alergias HTA Obesidad
Nº de pacientes (%) 34,96 ± 16,51 18/15 19 (57,57) 3,33 ± 2,28 6 (18,18) 3 (9,09) 5 (15,15) 3 (9,09) 1 (3,03) 1 (3,03) 6 (18,18) 1 (3,03) 2 (6,06) 1 (3,03) 1 (3,03) 3 (9,09) 14 (42,42) 0 (0,0) 2 (6,06) 33 (100) 29 (87,87) 2 (6,06) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 3 (9,09) 5 (15,15) 4 (12,12) 1 (3,03) 2 (6,06) 1 (3,03)
Factor de riesgo Fumador
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DISCUSIÓN En el presente trabajo hemos abordado el estudio de HBoV1 en el tracto respiratorio de adultos asintomáticos y con infección respiratoria aguda alta. La evidencia indica que el virus no estaría presente en adultos, ya que no se lo detectó en las muestras analizadas. No obstante, la ausencia de detección de HBoV1 en la población estudiada constituye un set de datos preliminares que pueden indicar la menor incidencia de HBoV1 en adultos en comparación con población pediátrica. Para confirmar y profundizar este aspecto será necesario ampliar el tamaño muestral de la población blanco. Como alternativa, podría considerarse el uso de técnicas de mayor sensibilidad, como la PCR en tiempo real o PCR cuantitativa. Además de la menor prevalencia en adultos, también debe considerarse la circulación variable del virus, la cual ha sido demostrada en población pediátrica de nuestro medio, con presencia constante todos los años y brotes periódicos de mayor magnitud (27). Si bien inicialmente la mayoría de los estudios sobre bocavirus se han enfocado en niños, al presente las evidencias indican que la infección por HBoV1 no se restringe a niños ni a la vía respiratoria. Se ha descripto la asociación entre la infección por HBoV1 y las enfermedad respiratoria aguda en adultos, con características clínicas similares a las que se asocian a infección por otros virus respiratorios (8,10–13). Sin embargo aún no se ha detectado la presencia de HBoV1 en el tracto respiratorio de adultos sanos, a diferencia de lo que ocurre en niños (5–7,14). El abordaje para la detección del virus en el tracto respiratorio en adultos enfermos y sanos tiene importancia para proveer información que sustente la hipótesis sobre la infección por HBoV1 –tanto tipo de infección en humanos como su historia natural. Actualmente, los datos permiten suponer que tanto la vía respiratoria como la vía fecal-oral estarían involucradas en mantener el ciclo de transmisión de HBoV1 en la naturaleza (23,28). En este escenario, epitelios del trato respiratorio e intestinal, además de otros tejidos, serían sitios de replicación y/o acantonamiento del virus (5,7,15,29), donde podría persistir sin ocasionar síntomas. Por todo lo anterior, a fin de corroborar la menor participación del virus en la patología respiratoria en adultos, se justifican futuros estudios que incluyan una muestra de estudio de mayor tamaño, extendida por un período de varios años, así como la utilización de técnicas diagnósticas alternativas (de mayor sensibilidad). La posibilidad de estudios futuros en adultos con comorbilidades que afecten las vías respiratorias y el parénquima pulmonar y que comprometan la inmunidad (diabetes, HIV, trasplantados, enfermos renales crónicos) plantean asimismo un nuevo horizonte de investigación para el HBoV1. AGRADECIMIENTOS Secretaría de Ciencia y Tecnología (SeCyT) de la Universidad Nacional de Córdoba y Fundación A. J. Roemmer
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