Efeitos da Radiação Ultravioleta by Sandra de Andrade

Universidade Federal do Rio de Janeiro Programa de pós-graduação em Ciências Morfológicas

Efeitos da radiação ultravioleta ultravioleta no pedúnculo óptico do caranguejo Neohelice granulata: um possível papel protetor da melatonina Msc. Marcelo Alves Vargas Orientadora: Dra. Silvana Allodi Coorientador: Dr. Luiz E. Maia Nery Direitos reservados e registrados para Marcelo Alves Vargas

INTRODUÇÃO

Raios gama

Rádio microondas

Raios X Radiação Ultravioleta

infravermelho Luz visível

INTRODUÇÃO

UVR

UVA 320 a 400 nm

UVB 290 a 320 nm

UVC 200 a 290 nm

INTRODUÇÃO

Efeitos do UV sobre os organismos

CFCs

BrFCs

INTRODUÇÃO

Radiação UV

Pele

INTRODUÇÃO

Pele Imunossupressão Redução no número de células de Langerhans Fotoenvelhecimento

Mutação no DNA Câncer Bronzeamento Produção de ROS

INTRODUÇÃO

Olhos Catarata Fotoqueratite

Pterígio Melanoma

INTRODUÇÃO

Catarata Opacidade do cristalino Bachem, 1956

INTRODUÇÃO

Fotoqueratite

INTRODUÇÃO

Pterígio

INTRODUÇÃO

Melanoma

INTRODUÇÃO Danos Morfológicos

INTRODUÇÃO

Fatores

Radiação UV

INTRODUÇÃO

O Oxigênio é indispensável para a vida de muitos organismos

Oxigênio

ATP

Citocromo oxidase Energia

O2 + e- ↔ O2- Ânion superóxido O2- + e- + 2H+ ↔ H2O2 Peróxido de Hidrogênio H2O2 + e- + H+ ↔ H2O + ·OH Radical Hidroxila ·OH + e- + H+ ↔ H2O

INTRODUÇÃO

O Ferro também tem uma ação formadora de ROS

Fe3+ + O2 - ↔ Fe2+ + O2 Fe2+ + H2O2 ↔ Fe3+ + OH- + ·OH Reação de Fenton O2- + H2O2 ↔ O2 + OH- + ·OH

INTRODUÇÃO

A radiação UV também tem uma ação formadora de ROS Radiação UV

Bilgihan et al., 2001; Brubacker et al., 2000; Ringvold, 1997, 1998; Ringvold et al., 2000;

INTRODUÇÃO

As células animais possuem um sistema de defesa antioxidante São considerados 3 níveis de proteção contra as ROS

prevenção na formação de ROS;

captura das ROS por meio de radicais livres ou de enzimas antioxidantes;

reparo dos componentes celulares danificados

INTRODUÇÃO

Sistema de Defesa Antioxidante

Enzimático

Não-Enzimático

INTRODUÇÃO

Sistema de Defesa Antioxidante

Superóxido Dismutase GST O2 -

Catalase

Glutationa Peroxidase H2O2

Glutationa

INTRODUÇÃO

Sistema de Defesa Antioxidante não enzimático

β-carotenos

Glutationa α-tocoferol

Ácido Ascórbico

Vitamina E

Vitamina C

INTRODUÇÃO

MELATONINA

Boi

Xenopus

INTRODUÇÃO

PINEAL

INTRODUÇÃO

Processo de síntese de melatonina

Acetyl-CoA

Em alguns animais é a HIOMT NAT A ENZIM CHAV

CoA+SH CH3

INTRODUÇÃO

Receptores da melatonina São membros da superfamília de receptores acoplados a proteína G Mel

Mel

INTRODUÇÃO

Receptores de melatonina

Mel 1a

Mel 1c

MT 1

Mel 1b

MT 3 MT 2 Mamíferos

INTRODUÇÃO

A existência de subtipos pode conferir certas vantagens

regulação diferenciada da expressão de receptores em diferentes períodos;

especificidade celular e tecidual;

seletividade na sinalização intracelular;

INTRODUÇÃO

Melatonina extra-pineal

Produção de melatonina

Cérebro Pele

Retina Trato Gastrointestinal

INTRODUÇÃO

Melatonina no sistema visual Existem evidências consistentes mostrando que os fotorreceptores são os locais de produção de melatonina Imunorreação para melatonina já foi positiva na camada nuclear externa da retina, RNAm da HOIMT e a sua forma protéica já foram encontrados nos fotorreceptores da retina de galinha RNAm da NAT já foi expresso nos fotorreceptores da retina de mamíferos, e sua atividade é aumentada em culturas de células fotorreceptoras da retina; Ritmo cíclico da atividade da NAT permanece mesmo depois da retina ser lesionada; RNAm da enzima triptofano hidroxilase também é encontrado nos reservados e registrados fotorreceptores da retinaDireitos depara Xenopus e de galinha Marcelo Alves Vargas

INTRODUÇÃO

Fotorreceptores da retina dos anfíbios continuam produzindo melatonina no escuro, mesmo depois da separação da camada nuclear interna da retina O gene da HIOMT é seletivamente expresso nos fotorreceptores da retina, o gene promotor da HIOMT Otx2 foi localizado na retina além da glândula pineal

INTRODUÇÃO

Melatonina no sistema visual Formação da Melatonina

Camada de células ganglionares

Camada nuclear interna

Cristalino Corpo ciliar

INTRODUÇÃO

Melatonina no sistema visual

Os receptores ?

Homem Macaco

Coelho

Galinha

Xenopus

INTRODUÇÃO

Melatonina no sistema visual

Qual a provável função da melatonina ?

INTRODUÇÃO

Melatonina no sistema visual

A melatonina como antioxidante

H2O2

O2-

·OH

OONO

INTRODUÇÃO

A melatonina modula as enzimas

Atividade da GPx Atividade da SOD Cérebro de ratos

Tecidos de galinha

Genes da SOD

GSH Glutamato cisteina ligase

INTRODUÇÃO

A melatonina parece ter uma ação ambígua

Wolfler et al., 2001 COLOCAR O AUTOR

Células leucêmicas

Concentrações

1 mM a 1 mM GSH

0,1 a 10,0 µM

Antioxidante

1 mM a 10 mM

Prooxidante

Células hepáticas

INTRODUÇÃO

A melatonina em artropodes

Artropodes

Insetos

Miriápodes Aracnídeos

Crustáceos

INTRODUÇÃO

A melatonina em artropodes

Insetos

Locusta migratória

Musca autumnalis

INTRODUÇÃO

A melatonina em artropodes

Crustáceos

Pedúnculo ocular

Hemolinfa músculo

cabeça

Lobos ópticos

INTRODUÇÃO

A melatonina em crustáceos Função da melatonina ela aumentou a taxa de regeneração de apêndices do caranguejo U. pugilator nos eritróforos do camarão de água-doce Macrobrachium potiuna, ela diminuiu significativamente a resposta ao hormônio concentrador de pigmentos vermelhos

ela modulou o ritmo circadiano dos níveis de glicose e lactato na hemolinfa do caran U. pugilator a atividade locomotora do caranguejo U. pugilator aumentou após injeção de melatonina a melatonina não causou efeito na dispersão pigmentar em cromatóforos do caranguejo Neohelice granulata. Direitos reservados e registrados para Marcelo Alves Vargas

INTRODUÇÃO

A melatonina em Crustáceos

Procambarus clarkii

Uca pugilator

INTRODUÇÃO

A melatonina em Crustáceos

Pico de forma bifásico de 12h 12C:12E Escuro cte Neohelice granulata

INTRODUÇÃO

A melatonina em Crustáceos Melatonina como antioxidante

Na capacidade antioxidante total

Consumo de O2

Melatonina atue

ROS

Portanto é necessário investigar a função da melatonina em crustáceos

reservados e registrados Brânquias deDireitos Neohelice Granulata para Marcelo Alves Vargas

INTRODUÇÃO

Justificativa para este trabalho de tese

CFCs

Diminuindo a camada de ozônio

BrFCs

Incidência da radiação UV

Vertebrados Melatonina como antioxidante Sistema Visual

Crustáceos

OBJETIVO

Objetivos Gerais

Este trabalho tem por objetivos gerais investigar os efeitos da radiação ultravioleta sobre o pedúnculo óptico do caranguejo Neohelice granulata e o possível papel protetor da melatonina, como um modulador do estresse oxidativo.

MATERIAIS E MĂ&#x2030;TODOS

MATERIAIS E MÉTODOS

Aclimatação Aclimatados por 10 dias

Salinidade 20

Temperatura 20ºC

Comitê Nacional do MeioDireitos Ambiente (IBAMA n documento 1.637.714) reservados e registrados para Marcelo Alves Vargas

MATERIAIS E MĂ&#x2030;TODOS

FotoperĂodo

Escuro constante

12C:12E

Claro constante

MATERIAIS E MÉTODOS

Exposição a Radiação Ultravioleta

Foto da radiação

12:00 h 30 min

1,575 J/cm2

1,294 J/cm2

MATERIAIS E MÉTODOS

Exposição a Radiação Ultravioleta

Foto do controle

MATERIAIS E MÉTODOS

Papel protetor da melatonina

Mel (0,02 pmol/animal) Vol .100 µL

Mel (2 pmol/animal)

Mel (200 pmol/animal)

15 min antes da exposição

Controle

Solução Fisiológica constante

MATERIAIS E MÉTODOS

Produção de espécies reativas de oxigênio FOTO do VICTOR

Homogenizados Centrifugados por 2X (2000 g e 10000g) 4ºC por 20 e 45 min H2DCF-DA 2’,7’-diclrofluoresceína-diacetato

H2DCF-DA

ROS 488 e 525 nm

MATERIAIS E Mร TODOS

Anรกlise da capacidade antioxidante contra radicais peroxila

Homogenizados

FOTO VICTOR

Centrifugados por 2X (2000 g e 10000g) 4ยบC por 20 e 45 min ABAP H2DCF-DA H2DCF-DA

ROS 488 e 525 nm

MATERIAIS E MÉTODOS

Atividade da catalase

Homogenizados

FOTO ESPECTROFOTÔMETRO

Centrifugados 9000 g, 4ºC por 10 min Beutler; 1975

MATERIAIS E MÉTODOS

Peroxidação Lipídica

Homogenizados

FOTO VICTOR

Centrifugados 1000 g , 4ºC por 10 min Hermes-Lima et al., 1995; Monserrat et al., 2003

MATERIAIS E MÉTODOS

Análise Histológica Coletados e dissecados às 12:00h Paraformaldeído a 4% por 4h Desidratados em concentrações crescentes de etanol O material foi impregnado e emblocado em parafina Micrótomo cortes 12 µm Lâminas gelatinizadas Direitos reservados e registrados Corados com hematoxilina e eosina para Marcelo Alves Vargas

MATERIAIS E MÉTODOS Imunohistoquímica Cortes obtidos conforme anteriormente

Lavadas PBS

Incubados com H2O2 30% Lavados PBS

Incubadas com o anticorpo secundário (Anti-coelho, biotinilado, Sigma, USA)

Bloqueada com BSA

Lavadas novamente em PBS

Lavadas PBS Incubadas com o anticorpo primário (anti-melatonina produzido em cabra para coelho; Sigma, USA) Durante a noite a 4°C

Incubados com o complexo de estreptavidina Lavado em PBS Incubado com solução de DAB

MATERIAIS E MÉTODOS

Análise estatística A análise estatística foi feita pela análise de variância (ANOVA) seguido pelo teste de Newman-Keuls (a=0,05). A análise de normalidade e a homocidastecidade das amostras foram feitas previamente. Transformações matemáticas foram realizadas quando necessário (Zar, 1984). Os resultados de todos os experimentos foram expressos em percentagem comparados com os controles

RESULTADOS Efeito do metabolismo no metabolismo oxidativo

Controle (média ± erro padrão) aclimatados em fotoperíodo a 12C:12E (n=5), claro constante (n=5) e escuro constante (n=5) às 12:00h Tratamento

12L:12E

Claro Constante

Escuro Constante

Produção de ROS FU.(g de proteína)-1

1887.62 ± 417.25a

2176.00 ± 89.51a

606.76 ± 100.87b

LPO CHP.(g de peso úmido)-1

130.78 ± 8.48a

102.75 ± 6.32b

41.11 ± 9.35c

0.0046 ± 0.00032a

0.048 ± 0.008b

0.059 ± 0.009b

24.98 ± 2.83a

43.66 ± 11.11a

ACAP Atividade da Catalase U CAT.(mg de proteína)-

27.04 ± 1.81a

MATERIAIS E MÉTODOS Efeito do fotoperíodo na exposição a radiação ultravioleta

ROS (Área) % relativa do grupo controle

Produção de ROS

300

150

200

100

200 150

100 50

C TR

0 U

VB U

ROS (Área) % relativa do grupo controle

250

0 TR

VB U

VA U

ROS (Área) % relativa do grupo controle

200

MATERIAIS E MÉTODOS Efeito do fotoperíodo na exposição a radiação ultravioleta

100 75 50 25

50 25

C TR

125 100 75 50 25

U VB

U VA

0 C TR

ACAP % relative to control gruop

U VA

100

U VB

125

U VA

ACAP % relativa do grupo controle

150

C TR

ACAP % relativa do grupo controle

Capacidade antioxidante contra os radicais peroxila

MATERIAIS E MÉTODOS Efeito do fotoperíodo na exposição a radiação ultravioleta

100 50

250 200 150

b a

100 50

C TR

U VB

150

100

U VB

UV A

0 CT R

Atividade da catalase % relativa do grupo controle

U VA

300

U VB

c 350

U VA

200 150

Atividade da catalase % relativa do grupo controle

250

C TR

Atividade da catalase % relativa do grupo controle

Atividade da catalase

MATERIAIS E MÉTODOS Efeito do fotoperíodo na exposição a radiação ultravioleta

75 50 25

100 50 0 C TR

U VB

400

300

200 100

U VB

UV A

0 CT R

LPO % relativa do grupo controle

U VA

150

U VB

100

200

U VA

LPO % relativa do grupo controle

125

C TR

LPO % relativa do grupo controle

Peroxidação lipídica

MATERIAIS E MÉTODOS Papel protetor da melatonina

___________________ Mel (pmol/crab)

250 200

100 50

0 2

B U F S

% relativa do grupo controle

ROS (Área)

2 0 0

C T S

20 0

0, 0 2

_______________________ Mel (pmol/crab)

150

C T

100

0 ,0 2

100

150

U V

200

150

250

ROS (Área)

200

% relativa do grupo controle

250

ROS (Área)

% relativa do grupo controle

Produção de ROS

__________________ Mel (pmol/crab)

MATERIAIS E MĂ&#x2030;TODOS Papel protetor da melatonina

150

100

0 0 2

,0 0

V U F S

F S

0 C T

% relativa do grupo controle

0 0

2 ,0 0

C T F

__________________ Mel (pmol/crab)

_______________________ Mel (pmol/crab)

ACAP

20 0

2 0, 0

a b

0 F

a 100

U V

100

150

ACAP

p>0.05

% relativa do grupo controle

150

ACAP % relativa do grupo controle

Capacidade antioxidante contra os radicais peroxila

__________________ Mel (pmol/crab)

MATERIAIS E MĂ&#x2030;TODOS Papel protetor da melatonina

1500

1000

500 200

150 100 50

20 0

F S

0, 02

B U V

0 20

C T S

___________________ Mel (pmol/crab)

C T

LPO

,0 2

_______________________ Mel (pmol/crab) % relativa do grupo controle

100

20 0

2 0, 0

150

b ab

U V

100

200

LPO

150

% relativa do grupo controle

p>0.05

200

LPO % relativa do grupo controle

Atividade da catalase

__________________ Mel (pmol/crab)

MATERIAIS E MÉTODOS Papel protetor da melatonina

F S

200

100

0 2 0

F S

U V B

,0 2

0 0

2 ,0 0

C T

b b

C T

Atividade da catalase

__________________ Mel (pmol/crab)

250

150

_______________________ Mel (pmol/crab) % relativa do grupo controle

100

0, 02

150

U V

100

b 200

150

250

Atividade da catalase

p>0.05

% relativa do grupo controle

200

Atividade da catalase % relativa do grupo controle

Peroxidação lipídica

__________________ Mel (pmol/crab)

MATERIAIS E MÉTODOS A

R FE

R E

Análise Histológica

L G EM

F Z

I M

R E

D R E

F Z

Figura 9. Corte longitudinal dos pedúnculos oculares do caranguejo Neohelice granulata corados com hematoxilina e eosina. (A) Menor aumento dos pedúnculos oculares mostrando a retina (RE), zona fasciculata (ZF), lamina ganglionaris (LG), medula externa (EM) e medula interna (IM). O retângulo mostra a região onde foram obtidas as figuras com maior aumento dos pedúnculos dos animais aclimatados em 12C:12E (B), luz constante (C), e escuro constante (D) fixados às Direitos reservados e registrados 12:00 h. Os asteriscos representam a membrana basal. As setas nos insertos mostram os pigmentos da retina. escala barrars: A – 500 µm; B to D - 20 µm; insertospara – 50Marcelo µm. Alves Vargas

MATERIAIS E MÉTODOS RE ZF

LG ME M I

Figura 10. Corte longitudinal dos pedúnculos oculares do caranguejo Neohelice granulata. (A) Pedúnculo ocular corado com hematoxilina e eosina mostrando a retina (RE), zona fasciculata (ZF), lamina ganglionaris (LG), medula externa (ME) e medula interna (MI). (B) Controle negativo, (C), Controle positivo com marcação na glândula pineal de rato, (D) Marcação para melatonina na lamina ganglionaris do pedúnculo ocular do caranguejo Neohelice granulata, (E) Maior aumento mostrando marcação na medula externa e medula interna do pedúnculo ocular do caranguejo Neohelice granulata, (F) Direitos Maior aumento na retina marcação para melatonina na retina e zona reservados e mostrando registrados fasciculata. As barras representam: A - 500 µm; B – 100 µm; C – 80 µm; D -100 µm; E e F 50 µm.

para Marcelo Alves Vargas

DISCUSSÃO

O fotoperíodo tem um papel muito importante nas funções metabólicas (Hardeland et al., 2008)

Alteram o seu status oxidativo

Quando seu ritmo claro/escuro é mexido, os animais podem ficar suscetíveis ao estresse oxidativo (Fanjul-Moles et al., 2003, 2009; Prieto-Sagredo et al., 2000). Direitos reservados e registrados para Marcelo Alves Vargas

DISCUSSÃO

A capacidada da radiação UV em produzir substâncias nocivas é bem conhecida

A radiação UV induz o estresse oxidativo através da geração de ROS (Lassen et al., 2008)

Radiação UV

ROS

Estresse oxidativo Wenk et al., 2001

DISCUSSÃO

Aumentou a produção de ROS Cte

Este fato se assemelha ao encontrado nos cristalinos de mamíferos, pois a radiação UV (UVA e UVB) aumentou a produção de ROS (Andley and Clark, 1989; Linetsky and Ortwerth, 1995, 1997; Linetsky et al., 1996; Babu et al., 1995; Spector et al., 1995), e em culturas de células epiteliais da córnea (Shimmura et al., 1996). Direitos reservados e registrados para Marcelo Alves Vargas

DISCUSSﾃグ

Radiaﾃｧﾃ｣o UV

ROS

ROS ROS

ROS

(Lassen et al., 2008).

DISCUSSÃO

Aumentou a peroxidação lipídica Cte Cte

Córneas

Antioxidantes GSH

3 vezes níveis de LPO Rogers et al., 2004

DISCUSSﾃグ

Catalase

H2O2

H2O2 + O2

sistema visual de mamﾃｭferos

Atalla et al., 1987; Kenney et al., 2005; Miguel et al., 2003

Crustﾃ｡ceos

Miguel et al., 2005; Miguel et al., 2007

DISCUSSﾃグ

Atividade da catalase Cejkova et al., 2000

corneas

DISCUSSÃO

atividade da catalase depois da irradiação com UVA e UVB

atividade da catalase UVB não mostraram diferenças significativas

DISCUSSﾃグ

A dose de radiaﾃｧﾃ｣o UV

Nﾃｭveis de Catalase

Acumulo excessivo de ROS

DISCUSSﾃグ

Tan et al., 1993

ﾂｷOH

scavenger de radicais livres

DISCUSSﾃグ

Nﾃｭveis baixos Maciel et al., 2008

DISCUSSﾃグ

NEOHELICE GRANULATA

Respostas

MELATONINA

DISCUSSﾃグ Melatonina UVB

Culturas de cﾃｳrneas

ROS

DISCUSSÃO NEOHELICE GRANULATA

Prooxidante MELATONINA 200 pmol/caranguejo UVA

MELATONINA reservados e registrados e O’Steen, 1992 Bubenik andDireitos Purtill, 1980; Wiechmann para Marcelo Alves Vargas

Retina

DISCUSSÃO ACAP

UVB

UVA

MELATONINA

2 pmol/caranguejo

Melhora no ACAP

ACAP menor

DISCUSSﾃグ

MELATONINA

Cristalino

Nﾃｭveis LPO

Sugere que a melatonina ﾃｩ capaz de minimizar os efeitos do UV

DISCUSSﾃグ

Duval et al., 2001; Yamaguchi et al., 2006

cefalotﾃｳrax

Pereiﾃｳpodos do caranguejo

DISCUSSﾃグ

constante se mostraram dispersos na zona fasciculada

se mostraram dispersos na retina e agregados na zona fasciculata

DISCUSSﾃグ

Crustﾃ｡ceos

Carcinus maenas Vivien-Roels e Pﾃｩvet, 1986

Macrobrachium rosenbergii Withyachumnarnkul et al., 1992a,b

Penaeus monodon Withyachumnarnkul et al., 1995

DISCUSSﾃグ

Procambarus clarkii

Astacus fluviatilis

Agapito et al., 1995; Balzer et al., 1997

Meyer-Rochow, 2001

Saduria entomon Meyer-Rochow, 2001

DISCUSSﾃグ

Euphausia superba

Uca pugilator

Pape et al., 2008

Tilden et al., 1997, 2001

DISCUSSÃO

O pedúnculo de Neohelice granulata com RIA

Músculo com HPLC-MS

Maciel et al., 2008

Geihs et al., 2009

Presença da melatonina, utilizando imunohistoquímica mostram marcação positiva para melatonina em praticamente todos os tipos celulares presentes no pedúnculo ocular, sugerindo que estes tipos celulares são Direitos reservados e registrados capazes de produzi-la. para Marcelo Alves Vargas

CONCLUSÕES Os nossos resultados mostraram que :

1. O desvio do ritmo claro/escuro para condições constantes é determinante para o favorecimento dos danos oxidativos induzidos pela radiação UV. Este fato fez com que houvesse um aumento na produção de ROS e nos níveis de LPO, uma modulação na atividade da catalase e uma diminuição no ACAP após a exposição à radiação UV.

2. A melatonina se apresentou com uma poderosa ação antioxidante, pois ela diminuiu a produção de ROS, manteve os níveis de ACAP, melhorou a atividade da catalase e diminuiu os níveis de LPO após a exposição à radiação UV.

CONCLUSÕES

3. A dispersão pigmentar foi um fator importante no combate aos danos induzidos pela radiação UV, porém ele não foi tão eficiente nos pedúnculos do caranguejo Neohelice granulata, porque os animais aclimatados ao claro constante, mesmo apresentando uma dispersão pigmentar, mostraram danos depois da exposição à radiação UV.

4. A melatonina foi revelada em praticamente todos os tipos celulares presentes nos pedúnculos ópticos, indicando que todos estes tipos celulares a produzem, visto que ela não é estocada. Assim, pode-se concluir que a manutenção do fotoperíodo claro/escuro é importante para a luta contra os possíveis danos desencadeados pela radiação UV e que a melatonina é um forte antioxidante no combate a esses danos. Direitos reservados e registrados para Marcelo Alves Vargas

AGRADECIMENTOS