In Vitro

OBSERVA CÓMO CRECEN LAS PLANTAS DURANTE MESES SIN NINGÚN CUIDADO

Mr. Sandman

Mantén tu cultivo in vitro sin esfuerzo

Una vez se ha empezado con el cultivo in vitro, los mantenimientos y cuidados que necesitarán las plantas serán mínimos. En este artículo veremos cómo se trabaja en condiciones de esterilidad para garantizar el correcto desarrollo de nuestras genéticas, así como la evolución que tienen dentro de los botes de cultivo. No hay que desesperarse por el lento crecimiento de las plantas, ya que garantizará su juventud durante más tiempo y nos permitirá tener madres durante muchos años.

En el artículo del número anterior se trató de hacer una introducción rápida al concepto de cultivo in vitro, a cómo preparar los medios de cultivo necesarios para que crezcan las plantas

y la esterilización de todo el material necesario (incluyendo las semillas y los esquejes). Cuando todos estos procesos se han realizado correctamente, y no han aparecido contaminaciones de hongos ni bacterias, solo nos queda ver cómo empiezan a germinar y enraizar. Dado que los esquejes no necesitan ningún mantenimiento (puesto que irán enraizando y creciendo posteriormente), nos centraremos en las semillas para favorecer su óptimo desarrollo.

Para estudiar el cultivo in vitro se partió de nueve semillas, tres de ellas no germinaron y las otras seis empezaron a abrirse a los diez días. El periodo de germinación puede variar en tanta medida que las últimas en abrirse lo hicieron veinte días después. Cuando se abren, se empieza a ver el crecimiento de la raíz principal, al estar tan hidratadas por la humedad que existe dentro de los botes, la testa o cubierta de la semilla se suele des-

prender pasados unos días, dejando la plántula tumbada en el medio de cultivo.

Todos aquellos que se inicien en estas técnicas notarán que el crecimiento de las plantas es sorprendentemente lento; no hay que preocuparse, es lo normal. Precisamente por eso, esta es la mejor técnica para conservar y mantener nuestras genéticas, ya que al cabo de varios años la planta seguirá siendo joven. En este momento, las plantas solo tienen los cotiledones, y sus primeras hojas no empezarán a cre-

cer hasta pasado mucho tiempo. Están totalmente blancas porque no son capaces de hacer la fotosíntesis bajo estas condiciones de elevada humedad, se alimentarán exclusivamente de los nutrientes que existan en el medio de cultivo.

Es la mejor técnica para conservar y mantener nuestras genéticas, ya que al cabo de varios años la planta seguirá siendo joven

Trabajando en nuestra cámara estéril

Como su evolución va muy despacio, es conveniente ayudarlas un poco. Puede pasar mucho tiempo hasta que la raíz tenga el tamaño adecuado para poder doblarse e introducirse por sí misma en el medio de cultivo, así que nosotros realizaremos este paso. Como tendremos que abrir los botes, habrá que llevar a cabo el proceso en el interior de la fiambrera creada en el artículo anterior, es decir, en condiciones de esterilidad. El procedimiento es muy sencillo y nos permitirá seguir practicando esta metodología para que las contaminaciones se reduzcan casi a cero.

Lo que nos hace falta son nuestros botes, papel de cocina, unas pinzas largas que nos permitan coger las plantas y manejarlas con facilidad y un pulverizador con alcohol al 70%. Se introduce todo en la fiambrera, la cerramos y nos ponemos los guantes. Ahora hay que pulverizar toda la fiambrera (y los guantes) con el alcohol, y limpiarlo con papel de cocina para que no se acumule en el suelo del recipiente. De hecho, con este papel, empapado ahora en alcohol, se limpiarán tanto la superficie de los botes como las pinzas. Antes de empezar con el siguiente paso, dejamos que transcurran 5-10 minutos. Para estar más seguro de la esterilización, antes de meter las pinzas en el interior, me gusta bañarlas en alcohol y quemarlas. Nada más apagarse la llama, las introduzco en la fiambrera y procedo como se ha descrito anteriormente. Hay que tener en cuenta que vamos a introducir las pinzas con todos los botes, así que cualquier contaminación aquí supondría estropear todo el trabajo realizado hasta la fecha. En los laboratorios se trabaja en cámaras con corrientes de aire para evitar que entren esporas de cualquier tipo, y las pinzas están siempre sumergidas en alcohol; antes de usarlas, se exponen a una llama para quemarlas y tenerlas siempre limpias. Esto no se puede hacer en nuestro caso, ya que pulverizar con alcohol en un lugar cerrado implica que no se evaporará con facilidad, y podremos incendiar toda la fiambrera con nuestras manos dentro, por lo que es crucial no tener ninguna llama. Cabe destacar que el alcohol adecuado para todo este proceso es al 70%, ya que esteriliza mejor que el de 96%. Por lo tanto, tendremos que rebajarlo siempre con agua destilada.

Ahora ya tenemos, en teoría, todo el material esterilizado y podemos continuar. Cogemos el primer bote, lo abrimos y dejamos la tapa apoyada boca arriba encima de otro bote para que no se quede en el suelo. La dejaremos boca arriba porque así no exponemos la cara interna a lugares que puedan tener alguna contaminación. El paso siguiente será introducir con cuidado las pinzas, coger la planta y clavarla literalmente en el medio de cultivo; hay que tener mucho cuidado porque los cotiledones y el tallo se pueden romper con facilidad. Al terminar, se cierra el bote cogiendo la tapa por los laterales, evitando tocar la cara interna. Procederemos de la misma forma para el resto de los botes. En algunas ocasiones, la cubierta de la semilla no se desprende de la planta al germinar, así que se la quitaremos ayudándonos de las pinzas. Se puede hacer antes o después de poner la planta en el medio de cultivo; aquí es importante tener cuidado de no introducir los dedos en el bote, ni rozar los bordes del mismo, para evitar contaminaciones.

Parece un procedimiento simple, pero requiere cierta práctica, por lo que se

Antes de empezar hay que pulverizar con alcohol al 70%.

Plántulas con cinco días después de germinar.

En los laboratorios se trabaja con una cámara de flujo laminar. Los botes se dejarán en el mismo lugar que las madres.

recomienda ensayar el método antes de llevarlo a cabo con nuestros botes. De esta forma, comprobaremos si las pinzas tienen el tamaño adecuado, que los guantes nos permiten traba-

jar con comodidad, que la visibilidad desde fuera es la adecuada y, además, habremos aprendido dónde dejar las tapas y cómo proceder adecuadamente. Cuando empecemos con los botes que

contienen nuestras plantas y cerremos la fiambrera, ya no podremos abrirla hasta finalizar el proceso. Si se nos ha olvidado algo y debemos abrirla, habrá que volver a empezar desde cero.

Las únicas condiciones externas que les pueden afectar serán la temperatura y la luz

Detalle de la raíz insertada en el medio de cultivo.

Condiciones de crecimiento

des. De hecho, clavarlas en los sustratos una vez germinadas será el único tiempo que haya que dedicarles. Las plantas están en un lugar cerrado y con un medio de cultivo que les per-

mite nutrirse durante varios meses. Las únicas condiciones externas que les pueden afectar serán la temperatura y la luz. Como el nivel óptimo de ambas es el mismo que las condiciones normales de crecimiento para nuestras madres o esquejes, la mejor forma de conservar nuestros botes, sin ningún gasto extra es ponerlos en la zona de crecimiento que tengamos en casa: temperatura de 20-25ºC y fotoperiodo 18/6. Como la fotosíntesis se reduce tanto en estas plantas, la intensidad lumínica no va a plantearnos problemas. Es más, lo mejor es que no estén expuestas directamente a la luz: se dejarán en los rincones más alejados, de modo que, a ser posible, reciban la luz de forma indirecta. Para estas plantas lo importante es el fotoperiodo correcto, no la cantidad de luz existente, por lo que si no disponemos de una sección para madres pueden dejarse en cualquier lugar cerrado (no hace falta renovación del aire) con un fluorescente o bombilla de bajo consumo no superior a 50W.

Una finalizado este proceso, lo único que hay que hacer es ver cómo crecen, puesto que no requerirán más cuidados. El tiempo que podrán mantenerse en estos botes depende de la cantidad de medio de cultivo empleado, pero lo mejor será cambiarlos cuando las raíces hayan colonizado todo el sustrato. Como el crecimiento es tan lento, esto no ocurrirá hasta pasados dos o tres meses como mínimo, así que durante todo este tiempo no será necesario hacer nada más. Cuando llegue este momento, se trasplantarán a botes nuevos.

Después de los 15 días, como media, que han tardado en germinar, pasarán otros 10-15 hasta que las plantas ten-

gan una raíz lo suficientemente grande como para realizar el paso anterior: estamos hablando de un mes transcurrido y las plantas no tienen más de 2 cm de alto. A partir de aquí, el crecimiento no se acelera: seguiremos notando su lenta progresión, así como la carencia de color verde. Pueden pasar otras tres semanas hasta que empecemos a ver el primer par de hojas reales, y serán tan pequeñas que no supondrá un cambio muy importante en su aspecto. A los casi dos meses desde el inicio de este proceso, las plantas tienen el tamaño de una semilla con una semana de crecimiento normal, lo que corrobora el particular desarrollo del cannabis en el cultivo in vitro.

Hay que destacar que la esterilización con lejía que se realizó para introducir las plantas en los botes puede influir en el aspecto de las plántulas. Si la concentración fue superior o se aplicó durante más tiempo del recomendado, las plantas estarán tan afectadas que será difícil que empiecen a adoptar su color verde característico. Con bajas concentraciones se pueden contaminar

más fácilmente, pero aquellas que no se hayan contaminado empezarán a tener un mejor aspecto inicial, crecerán un poco más rápido y empezarán a ponerse verdes una vez abierta la semilla. Este factor también cambia dependiendo de la variedad utilizada, así que la mejor recomendación es experimentar todo lo posible: probar con diferentes tiempos de esterilización, distintas variedades o diversos medios de cultivo para optimizar este proceso a los requerimientos de cada cual. Cuando se trabaja con semillas, es más difícil que se contaminen,

así que si las plantas no germinan bien se tendrá que reducir la concentración de lejía utilizada.

Conclusiones finales

Pese a que el sistema in vitro no es muy utilizado por la poca información que existe al respecto, resulta evidente que lo único estrictamente necesario es perderle el miedo. Lo más importante es tener material suficiente para poder experimentar al principio, y la paciencia y las ganas necesarias para llevar a cabo un sistema que necesita mucho tiempo para que las plantas se desarrollen. Cuando se aprende a trabajar en la fiambrera y se optimizan los procesos más tediosos (como esterilizar todos los materiales a utilizar o crear los medios de cultivo), ya no tendremos que trabajar más. Pasarán meses sin realizar ningún tipo de mantenimiento, y tendremos todas nuestras variedades en un espacio muy reducido y con un coste económico económico casi nulo. De hecho, al principio cuesta hacerse a la idea de que pasarán semanas sin que nuestras plantas nos necesiten y que transcurra un mes sin observar muchos cambios en su crecimiento.

Con las nociones de cultivo in vitro vistas hasta la fecha, se puede empezar y experimentar un sistema completamente diferente al habitual, que no está encaminado a la producción pero tiene otras muchas utilidades. Recomendable para todos aquellos que les guste este mundo y quieran probar cosas diferentes.

Evolución del crecimiento con 20 días (A), 35 (B) y 50 (C).