Cultivo in vitro

EXPERIMENTO CON AGUA OXIGENADA Cultivo in Vitro sin condiciones estériles

Debido a que el principal problema del cultivo in Vitro es la contaminación por hongos y bacterias, profesionalmente se utilizan métodos para conseguir la asepsia tanto del material vegetal como de el medio de cultivo y recipientes. Estos métodos requieren una inversión inicial relativamente grande por lo que, antes de introducirnos en sistemas más profesionales, realizaremos un experimento que, si da resultado, puede ser un método muy interesante para su utilización en el ámbito casero debido a su reducido coste ya que evitaría en cierta medida el uso de condiciones estériles para su ejecución. Bud Spencer

Un medio de cultivo de base acuosa como el utilizado en el cultivo de plantas in Vitro, rico en carbohidratos procedentes de la sacarosa (azúcar común) y del agar (cuando éste es utilizado para solidificar

el medio), aminoácidos, vitaminas y que además contiene minerales esenciales, es un medio perfecto para la proliferación de microorganismos. El aire que respiramos está cargado de esporas de estos microorganismos, e incluso de microorganismos adheridos a las partículas sólidas en suspensión como el polvo o en partículas líquidas como las producidas por los estornudos. Si dejamos medio de cultivo en una placa de Petri abierta al aire libre, en pocos días observaremos como las colonias de bacterias y mohos afloran en la superficie del mismo, aumentando su tamaño con el tiempo, mientras consumen los nutrientes de los que está compuesto. Por lo tanto, a la hora de iniciar un cultivo con esta técnica, es obligatorio tomar medidas para que las contaminaciones no arruinen todo nuestro trabajo y esfuerzo.

El agua oxigenada o peróxido de hidrógeno (H2O2) es un producto conocido desde hace tiempo por su poder desinfectante. Este poder es debido a que en disolución libera el radical peróxido, una forma reactiva de oxígeno que ataca varios componentes orgánicos, como pueden ser el material genético y las membranas celulares, dañándolos por oxidación. Gracias a esto, en una concentración suficiente, es capaz de de matar

bacterias, endosporas bacterianas, levaduras y esporas de hongos.

Sin embargo, los hongos, los animales y las plantas son capaces de producir peroxidasas, unas enzimas que descomponen este radical en formas no dañinas, por lo que si la concentración del mismo no es tan alta como para desbordar la capacidad de producción de estas enzimas, sus células no se verán afectadas. Esta propiedad nos es de gran utilidad ya que, añadiendo agua oxigenada al medio de cultivo, podemos evitar parte del material que se utiliza habitualmente para asegurar la asepsia (cámaras estériles, cámaras de flujo laminar equipadas con costosos filtros HEPA, equipos de microfiltración o equipos de luz ultravioleta).

No obstante, existen algunas bacterias resistentes capaces de producir peroxidasas, por lo que si hay una concentración muy elevada de las mismas o de células de moho (recordemos que los hongos son resistentes) serán capaces

de colonizar nuestro medio, aunque sea a una velocidad muy reducida, compitiendo por los recursos e incluso infectando el material vegetal introducido en el mismo. Es por ello que no debemos abandonar la asepsia totalmente y desinfectar todo el material antes de comenzar. Además intentaremos trabajar en un ambiente lo más limpio posible, como una cocina, ya que su suelo y pareces son fáciles de limpiar y no contiene alfombras u otros objetos de materiales porosos que retienen el polvo y la suciedad. También tendremos cuidado de no utilizar una concentración de peroxido tan alta que ponga en peligro la supervivencia de nuestro material vegetal.

Preparación del medio de cultivo

Para la preparación del medio de cultivo utilizaremos los siguientes elementos: - Un matraz Erlenmeyer de boca ancha. - Dos vasos de precipitados. - 6 tarros de conserva. - Agua desmineralizada. - 10 g de azúcar. - 2,1 g de agar. - Agua oxigenada. - Fertilizante de crecimiento (Sensi Grow de Advanced Nutrients). - Extracto de levadura (Organic-B de

Advanced Nutrients). - Sosa cáustica (NaOH) y ácido (pHDown). - Una jeringuilla de insulina sin aguja. - Un medidor de pH. - Una báscula de precisión.

En lugar de un matraz se puede utilizar cualquier otro recipiente de vidrio lo suficientemente grande. Igualmente podemos sustituir los vasos de precipitados por vasos corrientes (siempre que tengamos algún instrumento para medir el volumen, como una jarra medidora o una probeta).

Tanto el agua desmineralizada como la sosa son fáciles de encontrar en cualquier supermercado. El agar, que es un polisacárido extraído de la pared celular de algunas algas, suele encontrarse en herbolarios, tiendas de dietética o tiendas especializadas en productos químicos.

Una vez hayamos conseguido el material necesario, procederemos a llenar el matraz con agua desmineralizada hasta aproximadamente la mitad del volumen final que vayamos a utilizar, es decir, unos 150 ml, ya que prepararemos 300 ml de medio. Luego introducimos el azúcar y agitamos el recipiente con movimientos circulares hasta su completa disolución. A continuación, añadimos 0,1 ml de cada

Material necesario para la preparación del medio. Material necesario para la preparación del medio.

Medio repartido entre los recipientes de cultivo.

uno de los botes del fertilizante (A+B) con la ayuda de la jeringuilla, agitamos, añadimos también 2,5 ml extracto de levadura y agitamos nuevamente.

Posteriormente, añadimos agua destilada hasta alcanzar los 300 ml. Este proceso se hace en otro recipiente que permita la medida del volumen del líquido, normalmente una probeta, pero como no disponemos de una, lo hacemos en

un vaso de precipitados llenándolo hasta los 250 ml, vertemos la disolución en el matraz, añadimos otros 50 ml y agitamos. Este procedimiento no es el más exacto, pero para un experimento de esta índole es suficiente.

En uno de los vasos, preparamos una solución de 4 g de sosa en 100 ml de agua desmineralizada. Con la ayuda de algunas gotas de esta solución ajustamos el pH del medio entre un valor de 5,7 y 5,8, utilizando el pHDown en caso necesario. Habremos calibrado el medidor previamente para que la lectura sea lo más fiable posible.

Introducimos el agar en el matraz, lo ponemos en una olla con agua del grifo y lo llevamos a ebullición durante 15 minutos, agitándolo de vez en cuando para homogeneizar la mezcla. Es recomendable utilizar un trapo para no quemarse las manos y tapar la boca del matraz con papel de plata para evitar la evaporación. Probablemente el agar no se disuelva del todo, pero no es algo de lo que debamos preocuparnos, ya que se terminará de hacerlo durante la esterilización. Lo más importante es que esté homogéneamente repartido en la solución.

Vertemos 50 ml del medio preparado en 5 recipientes de cultivo. Los 50 ml restantes los verteremos en otro recipiente que no esterilizaremos ni utilizaremos para cultivar, pero en el sí añadiremos agua oxigenada para ver si se contamina. En este caso se han utilizado tarros de conserva, pero se puede utilizar cualquier recipiente similar.

Cerramos los tarros ligeramente y los introducimos en una olla a presión junto a un litro de agua de grifo, la ponemos a calentar y una vez empiece a salir vapor de forma abundante esperamos durante 20 minutos. Quitamos la olla del fuego, extraemos el vapor remanente antes de abrirla y la dejamos reposar unos minutos para evitar quemaduras. Sacamos los recipientes y los dejamos enfriar a temperatura ambiente durante otros 20 minutos.

Cuando podamos sostener el recipiente sin quemarnos, es hora de introducir

0,35 ml de agua oxigenada por tarro con la ayuda de una jeringuilla recién abierta, procurando abrir el tarro lo menos posible. En este momento el agar está a punto de solidificarse, por lo que agitaremos despacio con movimientos circulares en ambos sentidos y con cuidado de no formar burbujas. Cerramos fuertemente y dejamos enfriar a temperatura ambiente. Una vez el medio se haya solidificado, se puede guardar en la nevera durante varios días.

Medio repartido entre los recipientes de cultivo.

Explantos en la solución de lejía.

Inicio del cultivo

Para comenzar con el cultivo utilizaremos: - 4 vasos de precipitados. - 2 varillas de vidrio. - 3 placas de Petri. - Agua oxigenada 10 vol. (3% H202). - Alcohol 96º. - Agua desmineralizada. - Un pulverizador. - Unas pinzas largas. - Unas tijeras limpias. - Lejía comercial (con una concentración de 40 g de cloro activo por litro). - Lavavajillas concentrado. - Una jeringuilla de insulina sin aguja. - Un mechero. - Una o varias plantas madres capaces de proveer 10 puntas en crecimiento.

Como el alcohol de 70º es mucho más caro que el de 96º, fabricaremos el nuestro añadiendo 27 ml de agua desmineralizada a 73 ml de este último. Lo introducimos en el pulverizador, ya que es una forma muy cómoda de distribuirlo posteriormente sobre las superficies a desinfectar.

Preparamos 3 vasos con 200 ml de agua desmineralizada y los cerramos con papel de aluminio y una goma elástica, esterilizándolos en una olla a presión durante 20 minutos y dejándolos enfriar hasta que alcancen la temperatura ambiente. Al mismo tiempo esterilizaremos las placas de Petri, otro vaso, las varillas y las pinzas.

Preparamos una solución de hipoclorito sódico (NaClO) vertiendo 1,9 ml de lejía, en 100 ml de agua desmineralizada. Posteriormente completamos hasta los 200 ml, añadimos 2 gotas de lavavajillas concentrado y removemos suavemente con una de las varillas.

Trabajaremos en la cocina, debajo de la campana extractora encendida a máxilas manos y los antebrazos con alcohol de 70º antes de comenzar a trabajar (si tenemos la piel sensible podemos utilizar guantes de látex o vinilo). Además utilizaremos una mascarilla para evitar las partículas de nuestro propio aliento o las producidas por un posible estornudo indeseado.

Cortamos 10 segmentos apicales de nuestra planta madre preferida, recortándoles las hojas algo más de la mitad. Es recomendable que los segmentos no tengan más de tres nudos y que no sean demasiado largos.

Introducimos los explantos en la solución de lejía durante 10 minutos, removiendo de vez en cuando con la varilla.

Añadimos 0,7 ml de agua oxigenada a uno de los vasos de agua estéril e introducimos los explantos durante 5 minutos, removiendo de vez en cuando con la otra varilla esterilizada previamente con alcohol 96º y flameándola con mucho cuidado. Repetimos el mismo proceso con los dos vasos restantes, dejando los segmentos en el último.

Abrimos una de las placas y ponemos sus dos partes boca arriba. Esterilizamos las pinzas con alcohol de 96º y las flameamos como hemos hecho anteriormente con la varilla. Sacamos con ellas dos explantos del vaso de agua estéril y los dejamos en una de las partes de la placa junto con las pinzas para que no se contaminen. Esterilizamos las tijeras con alcohol 96º y las flameamos. Con ayuda de las pinzas y las tijeras, recortamos las hojas aún más, sobre todo la mas baja para que luego no toque el medio. También cortamos el extremo inferior y todas las partes dañadas por la lejía.

Abrimos uno de los botes e introducimos los dos explantos con las pinzas, clavándolos en el medio solidificado.

Explantos introducidos en el medio de cultivo.

ma potencia para reducir los contaminantes aéreos en la medida de lo posible. También habremos limpiado cuidadosamente con alcohol 70º todas las superficies del entorno de trabajo, como la placa vitrocerámica y las paredes. Igualmente nos ducharemos, nos pondremos ropa limpia y nos lavaremos Flameamos la boca, la tapa del tarro y lo cerramos fuertemente. A continuación repetimos el proceso con los tarros y partes de placa restantes.