Pipette – Swiss Laboratory Medicine, Nr. 5-2016 | Mikrobiologie by SULM – Swiss Union of Laboratory Medicine

Offizielles Organ der SULM Schweizerische Union für Labormedizin | Organe officiel de l’USML Union Suisse de Médecine de Laboratoire | www.sulm.ch | Nr. 5, Oktober 2016

S W I S S

L A B O R A T O R Y

M E D I C I N E

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Mikrobiologie | Microbiologie Weiterentwicklung der MALDI-TOF-Massenspektrometrie in der Klinischen Mikrobiologie Diagnostic moléculaire: avantages des tests «home-made» Biosicherheit und Labor-Biosecurity in Diagnostiklaboratorien L’inexorable développement de la multirésistance aux antibiotiques Métagénomique clinique News Die Herausforderung pädiatrische Labormedizin

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Mikrobiologie: neue Technologien und neue Herausforderungen Die MALDI-TOF-Methode hat die Analysen zur Identifizierung von Mikroorganismen durch die Verringerung der Kosten und der Dauer bis zum Ergebnis revolutioniert [1, 2] und somit die Untersuchungen und die Wahl der Therapie beeinflusst [2, 3]. In der Schweiz konnte sich MALDI-TOF allerdings nur rasch etablieren, weil nichtkommerzielle Tests entwickelt wurden. Auch im Hinblick auf Molekültests ist es notwendig, hauseigene Tests zu entwickeln, welche die geeignete Effizienz, Qualität und Flexibilität bieten [4, 5]. Einige dieser Tests werden zudem zum Nachweis von Pathogenen mit hoher Virulenz eingesetzt, etwa von B. anthracis [6, 7]. Die Massnahmen zur Biosicherheit beschränken sich in den Diagnoselabors jedoch nicht nur auf Proben, die bioterroristisch relevante Substanzen enthalten könnten, sondern betreffen auch die tägliche Arbeit mit den zahlreichen infektiösen Proben und die multiresistenten Pathogene [6]. Die Resistenz gegenüber Antibiotika nimmt unausweichlich zu [8] und ist Gegenstand der Tätigkeit des «Swiss Antibiotic Committee» [9]. Die Zunahme der Antibiotikaresistenzen kann ebenfalls indirekt durch metagenomische [10] oder genomische Analysen [11] überwacht werden. Mithilfe dieser Sequenzierungsmethoden mit hohem Durchsatz können

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auch allfällige Virulenzfaktoren erfasst werden, die zuvor durch die Untersuchung der Wirt-Pathogen-Beziehung, etwa im Maus- oder Amöbenmodell, identifiziert wurden. Das Amöbenmodell ist einerseits interessant, weil dadurch weniger Mäuse eingesetzt werden müssen (Abb. 1), und andererseits, weil sich in den phagozytären Amöben die Virulenz bestimmter Bakterien entwickelt hat [13]. Prof. Gilbert Greub, MD-PhD

La microbiologie: nouvelles technologies et nouveaux défis Le MALDI-TOF a révolutionné l’identification microbienne, en réduisant les coûts et le temps jusqu’au rendu du résultat [1, 2], influençant les investigations et les choix thérapeutiques [2, 3]. Cependant, le MALDI-TOF n’a pu rapidement s’implanter en Suisse que grâce à la possibilité de développer des tests diagnostiques non commerciaux. De même pour les tests moléculaires, il est essentiel de développer des tests maisons qui offrent efficience, qualité et flexibilité [4, 5]. Certains de ces tests sont d’ailleurs utilisés pour la détection de pathogènes très virulents, tels que B. anthracis [6, 7]. Mais la gestion biosécurité dans les laboratoires diagnostiques ne se limite pas aux seuls échantillons

EDITORIAL

suspects de contenir des agents de bioterrorisme; elle concerne aussi l’activité quotidienne, sa masse d’échantillons infectieux, et les pathogènes multi-résistants [6]. Et l’augmentation de la résistance aux antibiotiques est inexorable [8] et justifie pleinement l’action du «Swiss Antibiotic Committee» [9]. L’augmentation de la résistance aux antibiotiques peut être aussi indirectement surveillée par des analyses de métagénomique [10] ou de génomique [11]. Ces techniques de séquençage à haut débit permettent aussi de détecter d’éventuels facteurs de virulence, préalablement identifiés par l’étude de la relation hôtepathogène dans des modèles murins ou amibiens par ex. Ce modèle amibien est attrayant d’une part pour réduire l’utilisation de souris (Fig. 1) et d’autre part puisque l’amibe représente le phagocyte dans lequel la virulence de certaines bactéries s’est développée [13]. Prof. Gilbert Greub, MD-PhD

Figure 1: L’utilisation de modèles non–mammifères tels que Dictyostelium ou Acanthamoeba permet de générer des informations utiles sur des facteurs de virulence importants et représente ainsi une excellente alternative au modèle murin, pour le plus grand bonheur des rongeurs (dessin de Debra Bühlmann). Références Vous trouverez la liste des références sur le site: www.sulm.ch/f/pipette → Numéro actuel (no 5-2016).

Abbildung 1: Durch den Einsatz von Nicht-Säugetier-Modellen, etwa Dictyostelium oder Acanthamoeba, können nützliche Informationen über Virulenzfaktoren gewonnen werden. Sie sind somit eine hervorragende Alternative zum Mausmodell und ermöglichen die Schonung dieser Nagetiere (Zeichnung: Debra Bühlmann).

Prof. Gilbert Greub Präsident SGM-SSM Gastredaktor des Themenheftes «Mikrobiologie»

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IMPRESSUM pipette, offizielles Publikationsorgan der SULM / Organe officiel de l’USML 12. Jahrgang, Nr. 5/2016, Erscheint 2016 6-mal, ISSN 1661-09 Herausgeber | Editeur SULM – Schweizerische Union für Labormedizin c/o Prof. A. R. Huber Institut für Labormedizin Kantonsspital Aarau AG CH-5001 Aarau Tel. 062 838 53 02 andreas.huber@ksa.ch www.sulm.ch

Richtlinien für Autoren | Instructions pour les auteurs www.sulm.ch/pipette

Redaktionskomitee | Comité de rédaction Prof. Dr. Andreas R. Huber Dr. Roman Fried Dr. Jeroen S. Goede Dr. Stephan Regenass Prof. Dr. Lorenz Risch PD Dr. Michel Rossier Marianne Schenk Dr. Véronique Viette

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Nächste Ausgabe | Prochain numéro 30. November 2016

ECDO UN CTAETN IO TN S

Inhalt · Sommaire 3 EDITORIAL

Mikrobiologie: neue Technologien und neue Herausforderungen | La microbiologie: nouvelles technologies et nouveaux défis

6 E D U C AT I O N

Weiterentwicklung der MALDI-TOF-Massenspektrometrie in der Klinischen Mikrobiologie | Poursuite du développement de la spectrométrie de masse MALDI-TOF en microbiologie clinique

7 E D U C AT I O N

Diagnostic moléculaire: avantages des tests «home-made» | Molekulardiagnostik: Vorteile «selbstgemachter» Tests

1 0 E D U C AT I O N

Biosicherheit und Labor-Biosecurity in Diagnostiklaboratorien

1 2 E D U C AT I O N

L’inexorable développement de la multirésistance aux antibiotiques | Die unvermeidliche Entwicklung multiresistenter Bakterien

1 3 E D U C AT I O N

Schweizerisches Antibiogramm-Komitee – SAC: Aufgaben in der Vergangenheit und in der Zukunft

1 5 E D U C AT I O N

Métagénomique clinique

1 7 E D U C AT I O N

Application de la génomique bactérienne en microbiologie diagnostique

1 9 E D U C AT I O N

Aux sources de la virulence: amibes prédatrices et bactéries pathogènes

20 MARKETPLACE 22 NEWS

Die Herausforderung pädiatrische Labormedizin

Auflage | Tirage 15 000 Exemplare

Continuous Medical Education CME Ziel der vier bis sechs thematisch aufeinander abgestimmten Fort- und Weiterbildungsartikel je «pipette» ist die Förderung und Weiterbildung der LabormediC zin auf der Grundlage aktueller wissenschaftlicher ErLE C S kenntnisse. Die Redaktion arbeitet unabhängig, das Heft EDU finanziert sich durch Inserate und nichtgebundene Fördergelder, es werden keine finanziellen Interessen verfolgt. Folgende Firmen leisten in dieser Ausgabe einen nicht zweckgebundenen Beitrag: Alexion Pharma GmbH, IFLM Aarau, Roche Diagnostics Schweiz AG. Firmen, welche die Weiterbildung der «pipette» unterstützen möchten, melden sich unter: pipette@sulm.ch Continuous Medical Education CME L’objectif des quatre à six articles de formation continue organisés par thèmes pour chaque «pipette» consiste à promouvoir et former la médecine de laboratoire sur la base des connaissances scientifiques actuelles. La rédaction travaille de façon indépendante, la publication est financée par les annonces et les subventions indépendantes, sans aucun intérêt financier. Les entreprises suivantes apportent à cette édition une contribution bénévole: Alexion Pharma GmbH, IFLM Aarau, Roche Diagnostics Schweiz AG. Les entreprises qui souhaitent soutenir la formation continue de «pipette» sont priées de contacter: pipette@sulm.ch

A G E N D A

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E D U C AT I O N

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Christian Gehringer 1,2,3 und Adrian Egli 1,2

Weiterentwicklung der MALDI-TOF-Massenspektrometrie in der Klinischen Mikrobiologie Die rasche Identifikation von Bakterien und Pilzen führt zu einem deutlich verbesserten Patientenmanagement, da antibiotische und antifungale Therapien schneller angepasst werden können [1]. Die Erstellung von charakteristischen Massenspektren zur Keimidentifikation mittels der Matrix-Assisted Laser Desorption / Ionization – Time-of-Flight-Massenspektrometrie (kurz MALDI-TOF-MS) hat die klinische Mikrobiologie revolutioniert und viele Prozesse beschleunigt. Gegenüber der biochemischen oder molekulardiagnostischen Identifikation ist diese deutlich schneller, zuverlässiger und günstiger [2]. Als Methode im mikrobiologischen Labor hat sie sich als Standard innert weniger Jahre durchgesetzt und ist nicht mehr wegzudenken [3]. Die MALDI-TOF-MS Technologie zur Identifikation ist in vielen Laboratorien sogar ein kritisches Element geworden, und Defekte am Massenspektrometer können deshalb zu kritischen Verzögerungen im klinischen Alltag führen. Abbildung 1 zeigt den typischen Arbeitsablauf der MALDI-TOF-MS Identifikationsmethodik. Für die zuverlässige Identifikation von Isolaten werden die erhaltenen Massenspektren innerhalb von Sekunden mit Datenbanken verglichen, welche tausende von Spezies-spezifischen Spektren enthalten. Wichtige Herausforderungen sind im Moment vor allem im Bereich dieser Datenbanken und der Bioinformatik zu erkennen: Bei bestimmten Komplexen, z.B. dem Enterobacter cloacae-Komplex, kann eine Spezies-Identifikation nicht zuverlässig durchgeführt werden, vermutlich da zu wenige Spektren der einzelnen Keime abgebildet sind [4]. Methodische Herausforderungen an die Probenaufbereitung stellen sich z. B. 1 Klinische Mikrobiologie, Universitätsspital Basel, Basel 2 Applied Microbiology Research, Universität Basel, Basel 3 Innere Medizin, Universitätsspital Basel, Basel

bei Mykobakterium spp. in Bezug auf die Biosicherheit [5] oder z.B. bei Candida spp. aufgrund der robusten Wandeigenschaften [6]. Schliesslich führt die Abhängigkeit einer kulturellen Anreicherung zu den grössten Verzögerungen im diagnostischen Prozess mit MALDI-TOF-MS. In den letzten Jahren wurde jedoch eine Vielzahl an Materialien und Methoden entwickelt, um diese Schwächen zu überwinden. So sind z.B. nicht-kommerzielle Datenbanken und Softwaretools zur Analyse verfügbar [7]. Ebenfalls wurden technische Protokolle zur Probenvorbereitung publiziert: Die Identifikation direkt aus positiven Blutkulturen wird in vielen Laboratorien bereits in der Routine durchgeführt. Ebenfalls ist eine Identifikation direkt aus dem Urin [8] oder Liquor [9] möglich. Die Proteinprofile – zum grössten Teil ribosomale Proteine – werden vorwiegend für die Identifikation verwendet, aber in diesen Profilen liegen weitere funktionelle Informationen verborgen, welche sich uns langsam erschliessen.

Identifikation direkt aus positiven Blutkulturen Die direkte Identifikation von Bakterien aus positiven Blutkulturen ist zirka 24 h schneller als traditionelle kulturbasierte Methoden [10] mit anschliessendem MALDI-TOF-MS zur Identifikation. Falls eine biochemische Identifikation verwendet wird, vergehen von der Probenabnahme bis zur Keimidentifikation rund 72 h. Eine Reihe von Methoden steht zur Verfügung um aus der positiven Blutkultur – und den darin enthaltenen angereicherten Bakterien – eine genügende Menge für die zuverlässige Identifikation zu sammeln [2]. Die Identifikationsrate ist meist für Gram-positive Erreger etwas tiefer, was möglicherweise an den Eigenschaften der Zellwand liegt. Durch die zunehmende Standardisierung gelingt eine Identifikation heute jedoch in >90% der Proben [11]. Erste Studien konnten zahlreiche Vor-

teile der MALDI-TOF-MS basierten Identifikation von positiven Blutkulturen im Gegensatz zur konventionellen Identifikation aufzeigen [2, 12, 13].

Identifikation direkt aus dem Urin Ähnlich wie bei Blutkulturen bestehen für Urinproben unterschiedliche Protokolle zur Aufarbeitung und anschlies senden Identifikation mittels MALDITOF-MS zur Verfügung [14]. Eine Keimzahl von 105/ml Urin ist für eine Identifikation in zirka 90 % der Fälle genügend [8]. Eine Kombination mit der Durchflusszytometrie scheint sinnvoll, um die Chancen einer Keimbestimmung zu erhöhen [8]. Besondere Herausforderungen bei Urinproben sind Defensine, welche die Identifikation stören können [15], und Mischinfektionen, welche neuartige bioinformatische Algorithmen benötigen.

Resistenzbestimmung Bei der Resistenzbestimmung mittels MALDI-TOF-MS können vier grundlegende Methoden unterschieden werden: (i) Identifikation von resistenten Klonen basierend auf typischen Massenspektren z.B. für Methicillin-resistente Staphylococus areus und Vancomycinresistente Enterococcus faecium [16, 17]; (ii) Spaltung von Betalaktamringen mit bakteriellen Enzymen und Messung des Spaltprodukts im Massenspektrometer [18]; (iii) Hemmung des Wachstums von Bakterien und entsprechende Reduktion des Spektrums [19]; und (iv) direkter Nachweis eines Resistenzmechanismus, z.B. Porenverlust oder Betalaktamasen im interplasmatischen Raum [20, 21]. In Konkurrenz mit isothermalen Systemen, welche eine zunehmende Breite an Genen nachweisen können [22], wird sich die MALDI-TOF-MS Methodik durch relativ zeitaufwendige bzw. manuell intensive Protokolle zunächst wahrscheinlich nicht durchsetzen können. Vielversprechend scheint jedoch die Weiterentwicklung der direkten Detektion von mit Antibiotikaresistenzen assoziierten Proteinen aus Isolaten.

aufgebracht, zusammen mit einer Matrix-Lösung fixiert und anschliessend die Fluggeschwindkeit der ionisierten Proteinbestandteile gemessen. Die Flugzeit P I P E T T E – S W I S S L A B O R AT O R Y M E D I C I N E | WWW. S U L M . C H NR. 5 | OKTOBER 2016 korreliert mit der Masse und diese wird mit den Einträgen in einer Datenbank abgeglichen. Die Identifikation erfolgt innert Kürze.

Abbildung 1: Arbeitsablauf der Matrix-Assisted Laser Desorption / Ionization – Time-of-Flight Massenspektrometrie (MALDI-TOF-MS) Identifikation. Kulturell angereicherte Bakterien oder Pilze werden auf ein Target aufgebracht, zusammen mit einer Matrix-Lösung fixiert, und anschliessend wird die Fluggeschwindkeit der ionisierten Proteinbestandteile gemessen. Die Flugzeit korreliert mit der Masse, und diese wird mit den Einträgen in einer Datenbank abgeglichen. Die Identifikation erfolgt innert Kürze.

Typisierung

Zusammenfassend zeigt sich eine grosse Die Ähnlichkeitsanalyse mittels klassi- Vielzahl an möglichen Anwendungen scher Methoden wie Puls-Feld-Gelelek- und Erweiterungen der MALDI-TOFtrophorese und auch neuer Methoden MS-Technologie, welche über die klaswie des «whole genome sequencing» sische Identifikation hinaus reicht. Die sind zeitaufwendig und teuer. Ein Ver- Harmonisierung der verschiedenen Progleich der Massenspektren bei Isola- tokolle wird in Zukunft wichtig sein, ten gleicher Spezies erlaubt eine raum den Qualitätsansprüchen gerecht zu sche Zuordnung von möglichen klo- werden. Die Detektion direkt aus Patiennalen und nicht-klonalen Isolaten. tenmaterial wird entweder via AnreicheInsbesondere bei unterschiedlichen rungsprotokolle oder sensitivere Geräte Spektren kann eine Zugehörigkeit un- technisch bald zuverlässig möglich sein. ter gleichen Kulturbedingungen prak- Ebenfalls scheint die direkte Identifikatisch ausgeschlossen werden [23, 24]. tion von Resistenzen mit neuen bioinforPipette: MALDI-TOF in derhier Klinischen Gehringer und Egli, 2016 Neue Methoden sind auch in Ent-Mikrobiologie, matischen Algorithmen greifbar.

E D U C AT I O N

Poursuite du développement de la spectrométrie de masse MALDI-TOF en microbiologie clinique En cas de maladie infectieuse, l’identification rapide des bactéries et champignons permet une adaptation précoce de l’antibiothérapie. Les méthodes d’identification biochimiques sont coûteuses, chronophages et retardent ainsi l’identification. Les méthodes d’identification relevant du diagnostic moléculaire sont certes plus rapides, mais elles possèdent un spectre diagnostique relativement limité. Il y a quelques années, l’identification au moyen de la spectrométrie de masse MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption / Ionization – Time-of-Flight) a comblé ces importantes lacunes en matière de diagnostic microbiologique. Depuis lors, l’identification au moyen de la spectrométrie de masse MALDI-TOF est devenue la méthode standard en microbiologie moderne. De manière générale, cette technologie se trouve toutefois encore au début de son développement, et son potentiel est loin d’être épuisé: la mise en évidence de germes à partir d’hémocultures positives ou directement à partir d’échantillons urinaires, la détermination des résistances et le typage en cas de flambées sont d’autres applications en développement permanent. Cet article de revue a pour objectif de résumer et discuter les principales tendances en matière de spectrométrie de masse MALDI-TOF. Referenzen Online unter: www.sulm.ch/d/pipette → Aktuelle Ausgabe (Nr. 5-2016).

wicklung, z.B. der Phyloproteomics- Korrespondenz: PD Dr. med. Dr. phil. Adrian Egli Adrian.Egli@usb.ch Ansatz [25]. Gilbert Greub et Katia Jaton 1

Diagnostic moléculaire: avantages des tests «home-made» Le développement «home-made» des tests de diagnostic moléculaire permet d’accroitre considérablement la flexibilité de ce type de diagnostic et ainsi de s’adapter rapidement aux nouvelles connaissances, aux pathogènes émergents, aux nouvelles souches (tel que le mutant suédois) et à d’éventuelles épidémies.

Les applications des tests de diagnostic moléculaire, pour la détection des bactéries à croissance fastidieuse, des bactéries intracellulaires, des virus, des levures, des champignons filamenteux et de divers parasites, ont 1 Prof. Gilbert Greub et Dr Katia Jaton, Institut de microbiologie, Centre Hospitalier Vaudois (CHUV), Lausanne

augmenté de manière drastique ces dernières années. Ces tests moléculaires, particulièrement la PCR, sont également utiles pour (i) la détection de toxines ou d’autres facteurs de virulence, ainsi que pour la détection rapide de gènes codant (ii) pour la résistance aux antibiotiques et/ou de mutations conférant une résistance aux

antimicrobiens (iii), pour le diagnostic lors de cultures négatives en raison d’antibiothérapies préalables par exemple et enfin (iv) pour le typage. Actuellement, malgré le développement de nombreux tests moléculaires commerciaux, et selon une étude effectuée par le groupe européen du diag nostic moléculaire (ESGMD),

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47% des laboratoires interviewés utilisent des tests «home-made». Ces tests moléculaires sont généralement développés par des approches standardisées [1, 2, 3], incluant une série d’étapes de validation (tableau 1). Au vue des pressions économiques actuelles et des besoins cliniques importants en terme de diversité de tests diagnostiques moléculaires, il paraît essentiel d’avoir la possibilité de développer des tests « faits maison » puisque ceux-ci présentent de nombreux avantages par rapport aux tests commerciaux, avantages listés dans le tableau 2.

Avantage des PCRs «home-made» Comme en témoigne notre plateforme de diagnostique moléculaire développée à Lausanne, grâce à la capacité de développer des tests similaires en terme de cycles de température pour une grande variété de pathogènes, nous avons pu automatiser en plaque de 384 puits l’analyse par PCR de plus de 90 paramètres différents, incluant des bactéries, virus, parasites et champignons [2]. Ainsi avec ce portfolio de tests PCR «home-made» et grâce au développement de l’automatisation en parallèle, nous pouvons avec les mêmes automates et sur une même et unique plaque de PCR détecter plusieurs fois par jour divers pathogènes [2]. Au contraire, il est actuellement impossible d’avoir toutes les PCRs nécessaires à nos cliniciens avec une seule ligne de tests commerciaux puisque ceux-ci proposent en général un nombre de cibles limité soit, Paramètres généralement inclus dans la validation d’un test moléculaire «home-made»

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quelques agents causant un syndrome particulier (pneumonie, urétrite, …) ou différents types de pathogènes d’un même groupe (par exemple uniquement des virus). Ces choix sont souvent dictés plus par des patentes et par des décisions du producteur, et/ou de son «medical advisor» que par les besoins réels des médecins cliniciens. Un avantage majeur est la flexibilité qu’apportent ces tests «maison». En effet, pouvoir être réactif et flexible est particulièrement important lors d’épidémies comme par exemple celle du syndrome hémolytique et urémique en Allemagne. Une PCR «maison» spécifique de la souche O104:H4 d’Escherichia coli a pu être mise à disposition 6 jours après l’obtention des séquences de son génome [4]. De même, cette flexibilité, liée à la possibilité d’automatiser ces tests, a permis d’augmenter le débit d’analyse lors d’un problème local soudain. Ainsi dans le contexte d’une épidémie locale de fièvre Q dans la région du Lavaux [5], nous avons dû tester sur une période de 5 semaines en plein été près de 2400 dons de sang de manière prospective et réactive [6]. Seul un haut niveau d’automatisation de nos tests PCRs «home-made» a permis de faire face à cette augmentation majeure du nombre de tests en cette période de vacances. De même, lors de découverte de nouveaux pathogènes émergeants tels que Waddlia chondrophila, probablement impliqué comme agent de fausses couches [7, 8], nous avons pu développer rapidement un test fiable selon nos procédures R&D [9].

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Un autre avantage majeur est le coût réduit pour le laboratoire [10] des PCRs «home-made». En effet, actuellement le coût des réactifs de base c’est-à-dire les amorces, les sondes, le mélange réactionnel et l’enzyme, a largement diminué. Ceci a permis d’augmenter le nombre de cibles pour certains pathogènes importants pour lesquels des polymorphismes peuvent être observés au niveau des gènes de certains pathogènes, tel le méningocoque, avec des conséquences dramatiques sur la spécificité du test [11]. Ainsi, à Lausanne, nous avons – sur la base de l’analyse de plusieurs génomes de souches de Neisseria meningitidis – développé plusieurs cibles moléculaires afin d’accroitre par redondance la qualité du diagnostic en terme de sensibilité et de spécificité [12]. Un autre avantage des tests «maison» est le multiplexage que l’on peut adapter à une situation clinique donnée. Ainsi, certains tests commerciaux imposent le multiplexage Chlamydia trachomatis et Neisseria gonorrhoeae ce qui peut, dans certaines situations, s’avérer problématique. En effet, lorsqu’il s’agit par exemple d’un nouveau-né pour lequel une analyse PCR Chlamydia trachomatis a été prescrite dans un contexte de suspicion de pneumonie à Chlamydia trachomatis et pour lequel une PCR pour Neisseria gonorrhoeae se positive dans les sécrétions nasopharyngées de cet enfant: ce résultat pose la question de (i) la signification clinique (possible faux positif dû à la présence d’une Neisseria commensale de l’oropharynx)

Avantages des tests «home-made»

Désavantages des tests commerciaux

Efficience de la PCR

Meilleure définition du 99e percentile de la population de référence, utilisé comme valeur limite

Dosage non standardisé, impliquant des valeurs limites différentes d’une méthode à l’autre

Linéarité de la PCR

Flexibilité accrue

Absence de flexibilité

Range quantitatif

Multiplexage possible

Multiplexage contrôlé par le fabriquant

Sensibilité et spécificité analytique

Niveau de qualité précisément connu, dépendant du niveau d’exigence lors du développement du test

Qualité inconstante, nécessitant une validation interne avant la mise en routine

Coût réduit

Coût élevé

Cible connue

Pas de connaissance précise de la zone ciblée d’ADN

Une seule ligne d’appareils pour l’ensemble des tests PCR

Nécessité de plusieurs automates différents (plusieurs flux d’analyses différents)

Haut débit d’analyse sur une plateforme unique

Débit parfois limité (variable selon les caractéristiques du système commercial)

Répétabilité intra- et intersérie (précision) Détection des cibles avec des quantités inégales de différents pathogènes Fiabilité clinique (sensibilité et spécificité, valeurs prédictives positives et valeurs prédictives négatives) Tableau 1

Tableau 2

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Molekulardiagnostik: Vorteile «selbstgemachter» Tests mais également pose des questions (ii) d’ordre éthique par le fait d’avoir testé la présence d’un pathogène non recherché par le clinicien. Par contre, une approche syndromique réfléchie, par multiplexage ciblant différents microorganismes fréquemment retrouvés dans une situation clinique donnée, est possible lorsque l’on a un large portfolio de PCR «home-made»: tout peut être adapté en fonction de la situation clinique (enfant, adulte, immunosupprimés, greffés…) et, en discutant avec le microbiologiste, le clinicien peut orienter les tests à effectuer. Certes, un résultat fortuit peut être indicatif mais ses conséquences restent très aléatoires. Dans ce contexte, la quantification est également un élément important pour l’interprétation des résultats surtout dans l’approche syndromique car sans quantification comment interpréter des résultats de sécrétions nasopharyngées révélant la présence d’acides nucléiques de plusieurs virus pouvant être impliqués dans des bronchites chez un hôte immunocompromis? Mais cette quantification nécessite de créer pour chaque pathogène une droite de régression, dont le coût est significatif. Ce coût reste acceptable avec les PCRs «home-made» mais rarement avec les systèmes commerciaux proposés actuellement.

tentes délivrant ce label. L’exemple de l’épidémie d’une souche mutante suédoise de Chlamydia trachomatis survenue en 2006 montre l’importance du choix de la cible. Cette souche présentait une délétion d’environ 400 paires de base dans le plasmide cryptique de Chlamydia et n’était donc pas détecté par la plupart des tests commerciaux disponibles alors [13, 14]. A cette époque, en Suisse, la seule PCR capable de détecter cette souche mutante était notre PCR «maison» qui ciblait d’autres zones du même plasmide [10]. Notons que deux fabricants différents ciblaient alors la même zone du plasmide cryptique. Ainsi, lorsqu’un résultat négatif était remis en cause sur la base d’une suspicion clinique, l’analyse à l’aide de l’autre test commercial infirmait à tort la réalité d’une infection Chlamydia. Même si cette problématique est actuellement résolue pour Chlamydia, elle montre l’utilité d’avoir une connaissance précise des cibles utilisées, même pour des tests commerciaux. De même, une PCR commerciale ciblant une cassette portant le gène de résistance plutôt que le gène lui-même a présenté une spécificité basse [15]. Par ailleurs, avec les tests multiplexés commerciaux, on a souvent ce que l’on a besoin, mais également ce que l’on ne veut pas. A titre d’exemple, le test commercial Unyvero, qui proDésavantages des tests pose toute une série de possibles pacommerciaux thogènes respiratoires, n’est d’une Un des grands désavantages des part pas exhaustif et d’autre part nous tests commerciaux consiste en l’ab- contraint de tester certains agents sence de connaissances précises de non impliqués dans le syndrome dont la qualité intrinsèque du test puisque souffre le patient (par exemple: agents l’ensemble du développement et des de pneumonies communautaires lors contrôles permettant d’apporter un de pneumonies nosocomiales et récilabel C.E. n’est généralement pas dé- proquement). Dans ces cas là, il est voilé au public et qu’il faut accep- vraiment paradoxal que nous faster cette «boîte noire» de validation, sions plus confiance à nos partenaires estampillée par les autorités compé- commerciaux qui nous proposent

Die Verwendung molekularbiologischer Diagnosetests hat in den letzten Jahren drastisch zugenommen, etwa zum Nachweis von Bakterien mit langsamem Wachstum, intrazellulären Bakterien, Viren, Hefen, filamentösen Pilzen und verschiedenen Parasiten. Diese molekularbiologischen Tests, vor allem das PCR-Verfahren, können zudem eingesetzt werden, um (i) Toxine und andere Virulenzfaktoren nachzuweisen, ausserdem zur raschen Detektion von (ii) Antibiotikaresistenzgenen oder Mutationen, die zur Resistenz gegen antimikrobielle Substanzen führen (iii), zur Diagnosestellung im Falle negativer Kulturen (etwa aufgrund vorangegangener Antibiotikatherapie) und schliesslich (iv) zur Typisierung. Obwohl zahlreiche kommerzielle Molekulartests entwickelt wurden und im Handel erhältlich sind, verwenden laut einer Untersuchung der Europäischen Studiengruppe für Molekulardiagnostik (ESGMD) derzeit 47% der befragten Laboratorien «selbstgemachte» Tests.

des «boîtes noires» qu’à nos collègues qui proposent des tests ouverts et flexibles.

Conclusions En conclusion, les tests moléculaires sont utiles et indispensables. Cependant, malgré l’augmentation de la diversité des tests disponibles commercialement, il ne sera pas possible de proposer l’ensemble des outils moléculaires nécessaires en clinique uniquement sur la base de tests commerciaux. Il est donc indispensable d’éviter une escalade régulatrice telle qu’elle s’est développée aux EtatsUnis, vu l’impact négatif d’une régulation trop stricte sur le développement de nouveaux tests ou technologies et leur implémentation dans les laboratoires de diagnostic moderne. Correspondance: Gilbert.Greub@chuv.ch Références Vous trouverez la liste des références sur le site: www.sulm.ch/f/pipette → Numéro actuel (no 5-2016).

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Denis Grandgirard 1 und Kathrin Summermatter 2

Biosicherheit und Labor-Biosecurity in Diagnostiklaboratorien Biosicherheit beschreibt die Gesamtheit der Sicherheitsmassnahmen (technisch, organisatorisch, personell), welche den Menschen und die Umwelt vor einer unbeabsichtigten Exposition oder Freisetzung schützen [1]. Labor-Biosecurity beschreibt alle Massnahmen, welche getroffen werden, um biologisches Material zu schützen, sei es vor unberechtigtem Zugang, vor Diebstahl, Missbrauch oder absichtlicher Freisetzung [2].

Biosicherheit und Biosecurity in human- und veterinärmedizinischen mikrobiologischen Diagnostiklaboratorien Mikrobiologische Diagnostiklaboratorien erbringen Analysen zur Detektion und Charakterisierung von pathogenen Erregern in klinischen Proben. Zur Minimierung des Risikos einer unbeabsichtigten Exposition der Mitarbeitenden oder einer Freisetzung von Mikroorganismen sind sie verpflichtet, die gesetzlichen Anforderungen bezüglich Biosicherheitsvorgaben zu erfüllen. Die diesbezügliche Risikoanalyse berücksichtigt im Wesentlichen zwei Faktoren: einerseits die spezifischen Eigenschaften der biologischen Agenzien (Gruppe 1– 4) und andererseits die durchgeführten Tätigkeiten (Klasse 1– 4) [3]. Dabei darf man sich nicht ausschliesslich auf die Arbeitsschritte der analytischen Methoden fokussieren. Insbesondere gilt es auch die vorgelagerten präanalytischen Abläufe wie Probenentnahme, Probentransport und -annahme sowie eine allfällige Aufteilung des Probenmaterials und die vielfältigen nachgelagerten Prozesse wie Asservierung, Lagerung, Inaktivierung oder Vernichtung zu beachten. Gerade in mikrobiologischen Diagnostiklaboratorien kommt der erregerspezifischen Risikoermittlung und -bewertung als Grundlage für die Umsetzung der Massnahmen zur Sicherstellung der Biosicherheit eine enorm wichtige Bedeutung zu. Im Gegensatz zu Forschungsinstitutionen oder industriellen Laboratorien ist in Diagnostiklaborato1 2

Dr. Denis Grandgirard, Biosicherheitsbeauftragter, Institut für Infektionskrankheiten, Universität Bern Dr. Kathrin Summermatter, Stellvertretende Direktorin, Leiterin Sicherheit Institut für Virologie und Immunologie, Bundesamt für Lebensmittelsicherheit und Veterinärwesen

rien das Risikopotential des zu untersuchenden klinischen Probenmaterials unbekannt, und es wird mit einem breiten Spektrum an bekannten wie auch noch unbekannten «emerging agents»Erregern wie Bakterien, Viren, Pilzen und Parasiten gearbeitet. Meistens werden aus klinischen Proben Mikroorganismen der Gruppe 2 oder 3, d.h. Organismen, deren Vorkommen ein geringes oder mässiges Risiko darstellt, mittels Untersuchungen/ Tätigkeiten der Klasse 2 nachgewiesen. Müssen Pathogene der Gruppe 3 angereichert werden (zum Beispiel mittels in vitro-Kulturen), ist diese Tätigkeit generell der Klasse 3 zuzuordnen. Insbesondere gilt es die kritischen Punkte in Arbeitsabläufen zu eruieren, wie beispielsweise Arbeitsschritte, die mit einem Risiko der Aerosolbildung behaftet sind. So erfordert zum Beispiel der Nachweis von aerogen übertragbaren Mikroorganismen aus klinischen Probenmaterialien des unteren Respirationstraktes wie Sputum oder Bronchoalveoläre Lavage spezifische Sicherheitsmassnahmen wie das Arbeiten in einer mikrobiologischen Sicherheitswerkbank und die Verwendung von biologischen Sicherheitszentrifugen [4]. Die Entwicklung und Anwendung schneller und sensitiver Methoden, wie beispielsweise molekularbiologische Verfahren, die keine Anreicherung des Pathogen erfordern, erlauben nicht nur eine zeitnahe Diagnosestellung, sondern bringen gleichzeitig hinsichtlich der biologischen Sicherheit deutliche Vorteile. Die Klinische Mikrobiologie erbringt als Abteilung des Institutes für Infektionskrankheiten der Universität Bern (IFIK) [5] mikrobiologische Laboranalytik für die Diagnostik, Epidemiologie und Prävention von Infektionskrank-

heiten. Das diagnostische Spektrum umfasst alle Fachrichtungen der Mikrobiologie (Bakteriologie, Mykobakteriologie, Mykologie, Parasitologie, Virologie und Infektionsserologie) und erlaubt eine umfassende mikrobiologische Patientenversorgung und spitalhygienische Untersuchungen. Als universitärer Dienstleistungserbringer arbeiten wir eng mit den universitären Kliniken der Inselgruppe, aber auch mit weiteren Spitälern und Arztpraxen zusammen und engagieren uns in Forschung und Lehre. Durch die zunehmende Reisetätigkeit der Bevölkerung, die weltweite Migration, aber auch wegen der geographischen Ausbreitung von Vektoren werden wir zudem zunehmend mit neuen, bzw. importierten Erregern, wie Ebola-, SARS-, MERS-, oder ZIKA-Viren, konfrontiert. Medizinische Diagnostiklaboratorien müssen sich dieser Herausforderung stellen, indem sie eine kontinuierliche Neubeurteilung und Auswertung der Risiken vornehmen und eine entsprechende Adaptierung der verschiedenen Massnahmen in die Wege leiten. Zudem gilt es festzuhalten, dass bei Verdacht auf das Vorhandensein von Mikroorganismen der Gruppe 4, deren Vorkommen ein hohes Risiko darstellt wie beispielsweise das EbolaVirus, klinische Proben nur in spezialisierten Hochsicherheitslaboratorien analysiert werden dürfen. In diesen Fällen arbeiteten wir mit dem biologischen Hochsicherheitslabor des Labors Spiez zusammen. Korrespondenz: Denis.Grandgirard@ifik.unibe.ch

Labor-Biosecurity Obwohl Biosicherheit und Labor-Biosecurity eng miteinander verbunden

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sind und viele Biosicherheitsmassnahmen auch die Biosecurity-Anforderungen erfüllen, gibt es einige zusätzliche Aspekte, welche insbesondere bei Arbeiten mit humanpathogenen Erregern oder hochansteckenden Tierseuchen zu treffen sind. Zusätzlich kann eine Institution biologisches Material besitzen, welches sehr wertvoll und daher schützenswert ist. Biosecurity Massnahmen sollten basierend auf einer Risikobewertung getroffen werden. Dabei wird als Erstes bestimmt, welches biologische Material (z.B. Virusstämme von Maul- und Klauenseuche), welche sensitiven Informationen oder auch welche sicherheitsrelevanten Installationen und Gerätschaften es zu schützen gilt. Als Nächstes stellt sich die Frage der Bedrohung resp. der Gefährdung der Umwelt oder der Bevölkerung und welche Personen, Gruppierungen usw. ein Interesse daran haben könnten, Schaden anzurichten. Sicher gilt es hier auch das politische Umfeld zu berücksichtigten, welches sich schliesslich auf die Eintretenswahrscheinlichkeit auswirken kann. In der Schweiz ist es noch nie zu einem solchen Ereignis gekommen. Als Letztes gilt es dann Massnahmen zu treffen, welche verhindern, dass biologisches Material aus einer Institution entwendet und missbraucht wird. Massnahmen werden je nach Risiko in den verschiedenen Bereichen getroffen. So gilt es bauliche und technische Massnahmen zu treffen, so dass ein unerlaubter Zugang und ein Entwenden von biologischen Material verhindert werden kann.

Personen, welche mit Erregern umgehen, sollten vertrauenswürdig und im Umgang mit diesen Erregern geschult sein. In einigen Ländern wird eine Personensicherheitsüberprüfung durchgeführt, aufgrund deren dann über den Zugang zum biologischen Material entschieden wird. In jedem Fall ist eine gute Personalpolitik mit motivierten Mitarbeitenden im Betrieb sicherzustellen, so dass es zu keinen Biosecurity-Verstössen durch instituteigenes Personal kommt. Eine Institution, welche mit biologischen Materialien umgeht, trägt die Verantwortung dafür. Es ist daher unerlässlich zu wissen, wann, wo, welches Material in welchen Mengen resp. Konzentrationen gelagert resp. gehandhabt wird. Ein Inventar sollte aktuell sein und regelmässig überprüft werden. Dies ist auch für die tägliche Arbeit in einem Labor notwendig. Informationen über die Lagerung von hochpathogenen Erregern, über den Zugang und über die verschiedenen Laborprozesse gelten in Hochsicherheitslaboratorien als sensitive Information. Es sollte durch eine Institution klar festgelegt werden, wer auf welche Information wie und wann zugreifen und sie allenfalls verändern resp. löschen könnte. In einem Diagnostiklabor wäre es beispielsweise verheerend, wenn Daten zu Patientenproben absichtlich manipuliert würden. Im ITBereich gibt es hier verschiedene Lösungen, welche nicht nur in Hochsicherheitslaboratorien zum Einsatz kommen. Für den Transport von biologischen Materialien gibt es internationale Vor-

Service Center      

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schriften, welche auch in der Schweiz gültig sind. Für hochpathogene Erreger im Human- wie im Tierbereich (sogenannte Kategorie-A-Organismen [6]) gelten strengere Vorschriften als für den Versand von diagnostischem Material, sofern dieses als Kulturen verschickt werden. Anforderungen an die Ausbildung, die Verpackung und den Versand sind klar definiert. Auch hier muss sichergestellt werden, dass das biologische Material während des Transports nicht entwendet und missbraucht wird. Da am Institut für Virologie und Immunologie (IVI) [7], dem nationalen Tierseuchenreferenzlabor, mit hochansteckenden Tierseuchen gearbeitet wird, bilden Biosicherheit und LaborBiosecurity eine umfassende Einheit. Dabei bildet die Risikobewertung sowohl in der Biosicherheit wie in der Biosecurity die Grundlage. Für alle Arbeiten mit hochansteckenden Tierseuchen steht dem IVI ein Hochsicherheitslabor der höchsten Biosicherheitsstufe zur Verfügung (BSL4 im Veterinärbereich oder BSL3Ag im internationalen Umfeld). Bei all diesen Massnahmen ist festzuhalten, dass sie im Vergleich zum Risiko verhältnismässig sind und ein sicheres Umfeld schaffen, um weiterhin eine rasche und zuverlässige Diagnostik zu ermöglichen. Korrespondenz: kathrin.summermatter@ivi.admin.ch

Referenzen Online unter: www.sulm.ch/d/pipette → Aktuelle Ausgabe (Nr. 5-2016).

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Patrice Nordmann 1,2 et Gilbert Greub 2

L’inexorable développement de la multirésistance aux antibiotiques La résistance aux antibiotiques actuellement concerne essentiellement les bactéries à Gram négatif et notamment les entérobactéries ( Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae …). Les déterminants de multirésistance aux antibiotiques s’accumulent désormais; β-lactamases à spectre élargi qui inactivent notamment les céphalosporines, carbapénémases qui inactivent virtuellement tous les types de ß-lactamines, très récemment résistance plasmidique aux polymyxines.

La résistance aux antibiotiques est désormais reconnue sur le plan international comme l’un des enjeux majeurs en Santé publique. Que ce soient par exemple l’OMS, le Fonds Monétaire International, le CDC et la MaisonBlanche aux USA, l’ECDC en Europe ou l’Office de Santé Publique en Suisse, toutes les institutions publiques ont désormais écrits rapports et plan d’action sur ce sujet. On estime déjà que 5 –10% des patients hospitalisés aux USA et en Europe développent une infection nosocomiale entraînant plus ou moins directement 50 000 morts annuellement liés à des bactéries multirésistantes. Cette population cible ne fait que s’accroitre notamment dans les pays industrialisés du fait du vieillissement de la population (immunodépression, hospitalisation en constante croissance). Les principales espèces pathogènes en clinique demeurent les bactéries à Gram positif (staphylocoques, pneumocoques, entérocoques) et les bactéries à Gram négatif (entérobactéries, Pseudomonas, Acinetobacter). Bien que de nombreux traits de résistance aient été décrits chez les bactéries à Gram positif avec notamment la diffusion des résistances aux β-lactamines chez les staphylocoques dorés communautaires, les résistances chez les bactéries à Gram positif demeurent stables, voir en diminution très nette pour les staphylocoques résistants à la méthicilline en milieu hospitalier. Cette évolution est liée en partie à l’efficacité de mesures d’hygiène mais également 1 2

Unité Résistances Emergentes aux Antibiotiques, Microbiologie, Département de Médecine; Unité de Recherche Associé INSERM (LEA, Paris, France), Université de Fribourg, Suisse Institut de Microbiologie, Centre Hospitalier et Universitaire, Université de Lausanne, Suisse

à l’évolution naturelle de l’épidémiologie des maladies infectieuses dont les facteurs demeurent très largement inconnus. L’industrie pharmaceutique d’autre part a mis au point ces dernières années de nombreux antibiotiques efficaces vis-à-vis des bactéries à Gram positif dont la structure de paroi plus simple que celle des bactéries à Gram négatif a facilité leur développement. Ainsi, le problème des résistances chez les Gram positif peut être considéré comme contenu. Le domaine prioritaire par rapport à la résistance aux antibiotiques concerne désormais quasi exclusivement les bactéries à Gram négatif et tout particulièrement les entérobactéries (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae…). Ces entérobactéries sont les bactéries qui, en nombre d’infections, sont les plus importantes pour l’espèce humaine responsable à la fois d’infections nosocomiales et communautaires ce qui facilite la diffusion des résistances aux antibiotiques. Ainsi, E. coli par exemple représente la cause principale d’infections urinaires et également l’agent le plus fréquemment documenté lors de bactériémie. Parmi les traits de résistance les plus récents et/ou les plus importants, on relève les β-lactamases à spectre élargi (BLSE), les carbapénémases et plus récemment la résistance plasmidique aux polymyxines. Les BLSE qui hydrolysent notamment les céphalosporines et qui sont cliniquement importantes actuellement (CTX-M) ont diffusé d’abord dans le communautaire chez E. coli dans les années 2000 puis ont été transmises notamment chez Klebsiella pneumoniae en milieu hospitalier. La gravité de ces BLSE tient à leur diffusion croissante car le réser-

voir communautaire est incontrôlable. A titre d’exemple dans les années 2000 à Lausanne leur prévalence était estimée à 0.2 – 0.5% chez E. coli pour atteindre en 2016 de l’ordre de 5 – 8%. Ces souches productrices de BLSE sont multirésistantes aux antibiotiques notamment aux quinolones et à certains aminosides. Quelque soient les programmes de contrôle de l’antibiothérapie dans la mesure où leur réservoir est international et communautaire, la prévalence de souches BLSE va s’accroitre pour atteindre un niveau d’équilibre dont on ne connaît pas le chiffre; 30, 40, 50, 80%? Cette évolution risque de modifier très fortement la prise en charge d’infections aussi banales que les infections urinaires. Cependant, la mise au point de nouvelles associations de β-lactamines / inhibiteurs de β-lactamines permet d’envisager de nouveaux traitements de ces infections à bactéries BLSE. Les carbapénémases correspondent à l’évolution la plus aboutie dans le domaine de la résistance aux β-lactamines puisque ces enzymes peuvent inactiver tous types de β-lactamines. Le réservoir des carbapénémases est pour certaines typiquement communautaire (OXA-48, NDM) alors que pour d’autres (KPC) il est nosocomial. La prévalence des souches productrices de carbapénémases demeure bien plus faible que celle des BLSE puisque l’on rapporte par exemple dans la plupart des pays européens un nombre de souches positives et non un taux de prévalence. Mais cette situation évoluera également à la hausse. A titre d’exemple et d’exception, en Italie on estime que le taux de prévalence de K. pneumoniae productrices de KPC atteint déjà 50 à 60%. Les possibilités de traitement

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Die unvermeidliche Entwicklung multiresistenter Bakterien d’infections à souches productrices de carbapénémases sont limitées notamment à l’association ceftazidime-avibactam introduite récemment pour le traitement uniquement de certains infections à bactéries exprimant une carbapénémase de type KPC ou OXA-48 mais rien n’apparaît envisageable dans un avenir immédiat pour le traitement d’infections à souches NDM pour lesquelles l’association ceftazidime-avibactam est inefficace. La diffusion de la très grande majorité des souches productrices de BLSE ou de carbapénémases en médecine humaine n’a aucun lien avec l’usage des antibiotiques chez l’animal. Cependant, la diffusion des carbapénémases entraîne une utilisation nouvelle d’anciens antibiotiques, les polymyxines (colistine, polymyxine B) dont l’usage était limité au monde vétérinaire. Jusqu’en 2015, il n’avait été rapporté que des résistances chromosomiques à ces antibiotiques. Puis en 2015, en Chine la résistance plasmidique aux polymyxines (MCR-1) a été identifiée essentiellement chez E. coli surtout à

partir de souches de l’environnement et du monde animal et plus faiblement en médecine humaine. Depuis cette date, de très nombreux articles font état de la diffusion de souches (essentiellement E. coli) majoritairement dans le monde animal. Certaines de ces souches MCR-1 expriment non seulement une BLSE mais également une carbapénémase. La résistance à tous les antibiotiques se rapproche donc à grands pas. Tout indique que l’usage des polymyxines chez l’animal est le facteur majeur de la sélection de cette nouvelle résistance. Il s’agit du meilleur exemple de l’interconnection de la résistance aux antibiotiques chez l’homme et chez l’animal. Que peut être fait désormais pour limiter la diffusion des ces résistances? En milieu hospitalier favoriser les programmes d’hygiène et d’isolement des patients colonisés. Soutenir les projets permettant l’identification de nouveaux gènes de résistance et permettant de préciser leur mode de diffusion. Favoriser le développement et l’implémentation de nouveaux tests

Die Antibiotikaresistenzen betreffen zurzeit vor allem gramnegative Bakterien und besonders die Enterobakterien (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae usw.). Die auslösenden Faktoren einer Multiresistenz sind nunmehr oftmals nachzuweisen: β-Laktamasen mit erweitertem Spektrum, die insbesondere Cephalosporine inaktivieren, Carbapenemasen, die so gut wie alle Arten von β-Lactam-Antibiotika spalten können, und seit kurzem auch Resistenzplasmide gegen Polymyxine.

de diagnostic rapide de la multirésistance pour adapter au mieux et au plus vite l’antibiothérapie. Soutenir les programmes de mises au point de nouvelles antibiothérapies et avant tout ceux qui impliquent de nouvelles structures chimiques. Correspondance: Prof. Patrice Nordmann, Patrice.Nordmann@unifr.ch

Reinhard Zbinden 1

Schweizerisches Antibiogramm-Komitee – SAC: Aufgaben in der Vergangenheit und in der Zukunft Die Schweizerische Gesellschaft für Mikrobiologie (SGM) hat im Rahmen der europäischen Harmonisierungsbemühungen bereits im Jahr 2009 den schweizerischen mikrobiologischen Laboratorien empfohlen, ab dem Jahre 2011 für die Durchführung und Interpretation der Antibiogramme die Richtlinien von EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing, www.eucast.org) zu übernehmen. Wie in anderen Ländern wurde auch in der Schweiz zur Unterstützung der Einführung der EUCAST-Richtlinien ein nationales Antibiogramm-Komitee geschaffen. Dieses Schweizerische Antibiogramm-Komitee wird in Zukunft weiterhin mit den Expertenlaboratorien die mikrobiologischen Laboratorien bei der korrekten Erfassung der Carbapenem-Resistenz unterstützen.

Das wichtigste Argument für den Wechsel von den vorher während 30 Jahren angewandten amerikanischen Richtlinien (Clinical and Laboratory Standards Institute – CLSI, früher National Committee for Clinical Labo1 Prof. Dr. med. et lic. phil. II Reinhard Zbinden, Vorsitzender SAC und der SGM-Arbeitsgruppe für externe Qualitätskontrolle

ratory Standards – NCCLS) zu den EUCAST-Richtlinien war, dass sich die CLSI-Richtlinien von 2010 sehr stark an die EUCAST-Richtlinien angenähert haben. Zur Unterstützung der Einführung der EUCAST-Richtlinien wurde die SGM-Arbeitsgruppe für die externe mikrobiologische Qualitätskontrolle (Vorsitzender bis 2012:

Prof. Dr. med. J. Bille) mit Vertretern der Schweizerischen Gesellschaften für Infektiologie und Spitalhygiene, Swissnoso (Nationales Zentrum für Infektionsprävention) und Anresis (Schweizerisches Zentrum für Antibiotikaresistenzen) zum Schweizerischen Komitee für das Antibiogramm (Swiss Antibiogram Committee – SAC)

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erweitert, welches in den letzten 6 Jahren 15-mal getagt hatte. Die Hauptaufgabe des SAC war in den letzten 6 Jahren die Unterstützung der Laboratorien bei der Einführung von EUCAST und die Information an die Kollegen der Infektiologie. Insbesondere ist das Konzept des ECOFFs (Epidemiological Cutoff) zur Abgrenzung der nichtresistenten Wildtyppopulation von den – gegenüber einem bestimmten Antibiotikum – resistenten Bakterien für die Mikrobiologen in dieser Form neu gewesen. In den verschiedenen Weiterbildungen wurden die methodischen Veränderungen erklärt und in einer dreisprachigen Einführung die EUCAST- und CLSI-Richtlinien einander gegenübergestellt. In einer gemeinsamen Jahrestagung und im Rahmen der jährlichen Tagungen des «Club de pathologie infectieuse» konnten wir spezielle mikrobiologisch technische Fragen wie auch die klinischen Auswirkungen der neuen Richtlinien mit den Infektiologen diskutieren. Auf Wunsch der Schweizerischen Gesellschaft für Infektiologie haben die mikrobiologischen Laboratorien immer auch die Resistenzmechanismen angegeben, obwohl an sich nach EUCAST – aber auch nach CLSI – die Suche der Resistenzmechanismen nur aus epidemiologischen Gründen vorgeschlagen wurde

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und die Antibiogramme wie abgelesen berichtet (reported as measured) werden sollten. EUCAST hat aber Richtlinien zur Verfügung gestellt, nach denen Resistenzmechanismen und spezifische Resistenzen gesucht werden können; zusätzlich wurden Expertenregeln mit einer Sammlung von Expertenwissen über natürliche Resistenzen, aussergewöhnliche Resistenz-Phänotypen und Interpretationsregeln publiziert. Einige Resistenzmechanismen wie die Carbapenem-Resistenz bei Enterobacteriaceae oder die Vancomycin-Resistenz bei Enterokokken und Staphylokokken sind schwierig zu erfassen. Deshalb hat SAC ein Netz von Expertenlaboratorien aufgebaut, welche Spitallaboratorien und Privatlaboratorien bei der korrekten Bestimmung der Resistenzmechanismen unterstützt hat. In den letzten Jahren war die genaue Erfassung der Carbapenemase-Bildner bei Enterobacteriaceae von zentraler Bedeutung, da die Spitalhygiene diese Resistenzen so gut wie möglich bekämpfte. Die Expertenlaboratorien des SAC haben 2013–2015 konsequent die Carbapenemasen bei Enterobacteriaceae Anresis mitgeteilt (Tab. 1 mit Daten von 2013 und 2014). Im Jahre 2015 konnten von den Expertenlaboratorien bereits über 140 Isolate gemeldet wer-

2013 (n = 72)

2014 (n = 82)

KPC (n = 22) Klebsiella pneumoniae (18) Enterobacter cloacae (2) Escherichia coli (2)

KPC (n = 34) K. pneumoniae (32) E. coli (2)

OXA-48 (n = 31) K. pneumoniae (16) E. coli (10) E. cloacae (4) Salmonella sp. (1)

OXA-48 (n = 32) K. pneumoniae (20) E. coli (10) Enterobacter sp. (2)

NDM (n = 10) K. pneumoniae (6) E. cloacae (1) E. coli (1) Providencia sp. (2)

NDM (n = 12) K. pneumoniae (7) Providencia stuartii (2) Proteus mirabilis (2) C. freundii (1)

VIM (n = 9) E. cloacae (3) E. coli (2) K. pneumoniae (2) Andere Enterobacteriaceae (2)

VIM (n = 4) C. freundii (2) Klebsiella sp. (2)

Tabelle 1: Von den SAC-Expertenlaboratorien an Anresis gemeldete Carbapenemasebildendende Enterobacteriaceae.

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den, wobei die Hälfte der Meldungen auf die zunehmenden OXA-48 beruhte. Ab 2016 ist die Meldung von Carbapenemase-bildenden Enterobacteriaceae an das BAG für alle Laboratorien obligatorisch, wobei die Expertenlaboratorien des SAC weiterhin die Laboratorien unterstützen. Die Hauptaufgabe von SAC wird es in Zukunft sein, die Qualität des Nachweises von Carbapenemase-bildenden Enterobacteriaceae zu verbessern, wobei auch die kommerziellen Resistenzprüfungssysteme verstärkt unter die Lupe genommen werden müssen. Die Analyse von quantitativen Resistenzprüfungen (Hemmhöfe oder MHK) unter Berücksichtigung von ECOFFs soll die Zuverlässigkeit der Resistenzprüfung verbessern. Die Carbapenem-Resistenz bei Enterobacteriaceae beruht auch auf der Hyperproduktion von ESBL und/oder AmpC in Kombination mit Porinverlusten. Leider wird dieser Resistenzmechanismus durch die übermässige Gabe von Carbapenemen gefördert und ist bedeutend häufiger als die meistens importierten Carbapenemasen. Das SAC muss im Rahmen der verschiedenen Projekte von StAR (Strategie on Antibiotic Resistance) des Bundes für die korrekte Bestimmung der Resistenzen zu sorgen. Es wird immer wieder neue Herausforderungen geben (z.B. plasmidische Colistin-Resistenz), welche im Rahmen von Weiterbildungen, aber auch im Rahmen der externen Qualitätskontrolle den Laboratorien mitgeteilt werden sollten. Neben den Resistenzproblemen werden aber in Zukunft wieder vermehrt Fragen der externen Qualitätskontrolle (z.B. kulturfreie Teste wie Multiplex-PCR) von der Arbeitsgruppe bearbeitet werden müssen, weil sich auch die rechtliche Situation der kleinen Spitallaboratorien mit der neuen Verordnung über mikrobiologische Laboratorien (818.101.32) seit dem 1. Januar 2016 verändert hat. Korrespondenz: rzbinden@imm.uzh.ch

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Etienne Ruppé 1 , Jacques Schrenzel 1,2

Métagénomique clinique Le diagnostic des infections bactériennes repose sur la culture d’échantillons cliniques (urines, crachats, sang, plaies …). Ce processus, pratiquement inchangé depuis l’époque de Pasteur à la fin du XIXe siècle, présente deux désavantages majeurs. Le premier est qu’il ne permet de détecter que les bactéries qui peuvent être cultivées dans les conditions habituelles d’un laboratoire. Si la plupart des bactéries pathogènes le peuvent, certaines ont besoin d’être dans un environnement très particulier (comme une anaérobiose stricte) pour se multiplier. Le second désavantage est la lenteur du processus. Après avoir ensemencé un échantillon sur une boîte de Pétri contenant un milieu gélosé, il faut attendre au moins 24h pour déterminer si des bactéries pathogènes sont présentes. Si c’est le cas, il faudra de nouveau attendre 24h pour savoir à quels antibiotiques ces bactéries pathogènes sont sensibles. En l’état, le diagnostic d’une infection bactérienne prend au moins 48h, et cela n’a pas changé depuis des décennies. De plus, certaines bactéries comme Mycobacterium tuberculosis (la bactérie responsable de de la tuberculose) ont besoin de plusieurs jours voire de plusieurs semaines pour être détectées sur les milieux de culture. On peut enfin convenir d’un troisième désavantage qui est la difficulté d’automatisation du processus de diagnostic bactériologique en raison de sa complexité (diversité des échantillons et des bactéries possiblement présentes).

Bien entendu, un patient suspect d’infection bactérienne ne peut rester sans antibiotique pendant les 48 heures minimales et nécessaires à l’établissement du diagnostic définitif, d’autant plus que l’infection est grave. Il est bien établi que plus l’on attend avant de donner un antibiotique efficace à un patient infecté, plus l’infection a des risques de s’aggraver [1]. Dans la pratique courante, un traitement antibiotique est donné au patient sans attendre les résultats du laboratoire. Ce traitement dit «probabiliste» est choisi pour être assez puissant contre les bactéries habituellement responsables de l’infection traitée. Après obtention des résultats définitifs, ce traitement peut être réévalué, souvent pour être plus ciblé [2]. Mais devant la montée de la résistance aux antibiotiques, il arrive que les bactéries responsables de l’infection soient résistantes au traitement probabiliste. Le problème est qu’on ne le découvre qu’au bout de 48h, et que pendant ce temps le patient n’a pas été traité efficacement. Devant une suspicion d’infection bactérienne, il est ainsi crucial pour les 1 Laboratoire de Recherche Génomique, Service des Maladies Infectieuses, Hôpitaux Universitaires de Genève, rue Gabrielle-Perret Gentil 4, 1205 Genève, Suisse 2 Laboratoire de Bactériologie, Service de Médecine de Laboratoire, Département de Génétique et de Médecine de Laboratoire, rue Gabrielle-Perret-Gentil 4, 1205 Genève, Suisse

médecins de connaître le plus rapidement possible quelles sont les bactéries pathogènes présentes et leur sensibilité aux antibiotiques afin de donner au patient le traitement le plus approprié. Durant la dernière décennie, de nombreux tests dits «rapides» sont apparus et ont tenté de relever ce défi [3 – 5], mais aucun n’a encore démontré un impact significatif sur l’optimisation rapide du traitement antibiotique. Pourtant, une solution existe peutêtre. Plutôt que de compter sur la culture des bactéries, pourquoi ne pas tirer les informations nécessaires à l’établissement d’un traitement antibiotique efficace directement à partir de leur ADN? Le métagénome d’un échantillon (soit l’ensemble des génomes des organismes présents) contient en effet toutes les informations nécessaires: quelle(s) est/sont la/les bactérie(s) pathogène(s), et à quels antibiotiques elle(s) est/sont résistante(s). Si cette idée de métagénomique clinique [6] n’est pas nouvelle [7– 9], elle nécessitait une révolution technologique pour être explorée. Au milieu des années 2000 sont apparues de nouvelles technologies de séquençage de l’ADN, bien plus efficaces en termes de débit que la méthode classique décrite par Sanger. Dix ans après, ces technologies sont devenues plus abordables et plus rapides. Ainsi, il est aujourd’hui envisageable de se passer de la culture des échantillons

cliniques ou tout du moins de lui adjoindre une méthode complémentaire basée sur le séquençage. Si le concept est séduisant, il n’en demeure pas moins de nombreux obstacles à sa mise en pratique. Tout d’abord, les échantillons cliniques prélevés dans le cadre d’infections bactériennes contiennent le plus souvent une forte concentration de leucocytes, dont le génome est environ 1000 fois plus grand que celui des bactéries. Ainsi, la première étape limitante pour la métagénomique clinique est l’impérieuse nécessité d’obtenir suffisamment d’ADN bactérien pour permettre la préparation de librairies de qualité en vue du séquençage, mais également de diminuer massivement la concentration en ADN humain dont le séquençage est inutile dans ce cadre. Des méthodes sont disponibles [10] mais leur évaluation dans le cadre de la méta-génomique clinique est nécessaire. Ensuite, la complexité des données bio-informatiques à gérer pour un microbiologiste nécessite que l’exploitation des données soit la plus automatisée possible et que son interface soit userfriendly, ce qui n’est pas le cas aujourd’hui même si des plate-formes de ce type se développent [11]. L’assignation taxonomique des séquences (c.-àd. leur regroupement par espèces bactériennes), leur assemblage, l’identification des gènes de résistance et/ou des mutations chromosomiques asso-

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ciés à la résistance aux antibiotiques, et enfin l’établissement d’un lien entre déterminant de résistance et de la bactérie hôte sont autant d’obstacles supplémentaires à lever. Enfin, si le temps de réalisation (du prélèvement à l’obtention de résultats exploitables pour le microbiologiste) tend à diminuer, il est aujourd’hui encore comparable à celui de la culture, avec un coût bien plus important. Cependant, la compétition soutenue entre les fabricants de séquenceurs devrait encore réduire les coûts, comme cela fut le cas durant la dernière décennie. Aujourd’hui, c’est une révolution qui couve dans les laboratoires de bactériologie. Aujourd’hui, la métagénomique clinique est probablement la méthode la plus à même de remplacer ou appuyer les méthodes conventionnelles basées sur la culture afin d’optimiser le diagnostic bactériologique et le traitement antibiotique. Correspondance: Etienne.Ruppe@hcuge.ch

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Références 1 Kollef MH, Sherman G, Ward S, Fraser VJ. Inadequate antimicrobial treatment of infections: a risk factor for hospital mortality among critically ill patients. Chest 1999;115(2):462–74. 2 Weiss E, Zahar J-R, Lesprit P, Ruppe E, Leone M, Chastre J, et al. Elaboration of a consensual definition of de-escalation allowing a ranking of β-lactams. Clin Microbiol Infect Off Publ Eur Soc Clin Microbiol Infect Dis 2015;21(7):649.e1–10. 3 Cherkaoui A, Hibbs J, Emonet S, Tangomo M, Girard M, Francois P, et al. Comparison of two matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry methods with conventional phenotypic identification for routine identification of bacteria to the species level. J Clin Microbiol 2010;48(4):1169 –75. 4 Huttner A, Emonet S, Harbarth S, Renzi G, Kaiser L, Schrenzel J. Polymerase-chain reaction/electrospray ionization-mass spectrometry for the detection of bacteria and fungi in bronchoalveolar lavage fluids: a prospective observational study. Clin Microbiol Infect Off Publ Eur Soc Clin Microbiol Infect Dis 2014;20(12):O1059 – 66. 5 Le Dorze M, Gault N, Foucrier A, Ruppé E, Mourvillier B, Woerther PL, et al. Performance and impact of a rapid method combining mass spectrometry and direct antimicrobial susceptibility testing on treatment adequacy of patients with ventilator-associated pneumonia. Clin Microbiol Infect Off Publ Eur Soc Clin Microbiol Infect Dis 2015;21(5):468.e1– 6. 6 Ruppé E, Baud D, Schicklin S, Guigon G, Schrenzel J. Clinical metagenomics for the management of hospital- and healthcare-acquired pneumonia. Future Microbiol 2016. 7 Al Masalma M, Lonjon M, Richet H, Dufour H, Roche P-H, Drancourt M, et al. Metagenomic analysis of brain abscesses identifies specific bacterial associations. Clin Infect Dis Off Publ Infect Dis Soc Am 2012;54(2):202–10. 8 Didelot X, Bowden R, Wilson DJ, Peto TEA, Crook DW. Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing. Nat Rev Genet 2012;13(9):601–12. 9 Hasman H, Saputra D, Sicheritz-Ponten T, Lund O, Svendsen CA, Frimodt-Møller N, et al. Rapid wholegenome sequencing for detection and characterization of microorganisms directly from clinical samples. J Clin Microbiol 2014;52(1):139 – 46. 10 Thoendel M, Jeraldo PR, Greenwood-Quaintance KE, Yao JZ, Chia N, Hanssen AD, et al. Comparison of microbial DNA enrichment tools for metagenomic whole genome sequencing. J Microbiol Methods 2016;127:141– 5. 11 Flygare S, Simmon K, Miller C, Qiao Y, Kennedy B, Di Sera T, et al. Taxonomer: an interactive metagenomics analysis portal for universal pathogen detection and host mRNA expression profiling. Genome Biol 2016;17(1):111.

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Sébastien Aeby, Florian Tagini et Gilbert Greub 1

Application de la génomique bactérienne en microbiologie diagnostique Pourquoi séquencer un génome? Depuis 1995, date des deux premiers génomes bactériens, le séquençage de génome a eu comme but principal d’enrichir nos connaissances sur les bactéries, notamment sur des organismes modèles tels que Escherichia coli [1] et Bacillus subtilis [2]. Dans cette période, l’obtention d’informations complètes sur les génomes microbiens a également permis de mieux comprendre leur métabolisme [3] ou d’étudier l’évolution des microbes. Ainsi, par exemple, Rickettsia prowazekii [4] et Mycobacterium leprae [5] ont démontré une évolution réductive de leur génomes alors que le séquençage d’un second génome d’Escherichia coli a permis par comparaison avec le premier publié de montrer l’importance des transferts horizontaux chez ces entérobactéries [6]. Cette importante plasticité du génome d’E. coli explique vraisemblablement les nombreux pathovars retrouvés (EIEC, EHEC, ETEC). Toujours en recherche, la génomique bactérienne a également permis de nombreux développements, dont la recherche de nouvelles protéines candidates pour des vaccins, par exemple pour Neisseria meningitidis [7].

A Lausanne, nous avons largement utilisé ces dernières années les outils de génomique pour mieux comprendre les bactéries apparentées aux chlamydiae [8 –10]. De manière globale, la disponibilité de nouvelles technologies telles que le 454 Life Sciences sequencing dès 2005 puis les techniques Illumina, Ion torrent et Oxford Nanopore technology ont permis d’accroitre l’output du séquençage et réduire les coûts. Ceci a permis d’implémenter le séquençage de génome bactérien en microbiologie médicale, dans le but de mieux définir les cibles diagnostiques nécessaires, par exemple pour développer les tests ELISA [8] ou pour identifier des cibles moléculaires [11]. La détection de toxines et/ou de facteurs de virulence est également l’un des objectifs poursuivi en génomique bactérienne [12, 13]. Enfin, l’application principale de la génomique est bien entendu le typage moléculaire à but épidémiologique [14, 15].

à-dire leur communication ainsi que leur éventuelle confirmation par des expériences en laboratoire. Notons que l’étape de «gap closure» représente plus de 80% des efforts d’un projet de génomique. Ainsi, dans un but d’application médicale il est particulièrement intéressant d’utiliser un génome sans effectuer cette étape, afin de réduire les coûts et les efforts jusqu’à l’obtention de l’information utile. En 2009, nous avons proposé le concept de «dirty genome» aussi appelé «draft genome» ou génome incomplet [8]. Dans ce travail, nous avons démontré que non seulement plus de 90% des séquences sont disponibles en l’absence de la phase de «gap closure» mais également que plus de 90% des protéines peuvent être identifiées par spectromètre de masse et par comparaison des spectres obtenus expérimentalement au spectre théorique basé sur les séquences protéiques dérivées des «dirty génomes». De plus, les 5 à 10% d’informations Comment séquencer un génome non disponibles sont principalement bactérien? liées à des séquences répétées telles Les étapes d’un projet de génomique que les transposases, les opérons riboincluent 6 phases principales: (i) le somiques et les «hot spot» de recombichoix de l’espèce et/ou de l’échantil- naison (RHS). Depuis 2009, ce type de lon à séquencer, (ii) l’extraction d’ADN, «dirty genome» est fréquemment uti(iii) le séquençage proprement dit, (iv) lisé et représente plus de 500 génomes l’assemblage des séquences obtenues, annuels. (v) la fermeture des trous («gap closure» en anglais) l’annotation et enfin Le «dirty genome» et son applica(vi) l’exploitation des données c’est- tion à des épidémies Comme mentionné dans un article récent [13], le génome incomplet de la 1 Institut de Microbiologie, Centre Hospitalier et Universitaire, Université de Lausanne, Suisse souche de Parachlamydia à l’origine

d’une infection respiratoire a une couverture de 94% lorsqu’on le compare à la séquence complète et assemblée ultérieurement. De même, lorsque nous avons comparé la souche de Vibrio cholerae causant l’épidémie de choléra à Haïti en 2010 [16], nous avons observé que ces séquences incomplètes représentaient 96% de l’ensemble du génome publié ultérieurement. Enfin, la souche Escherichia coli 0104:H4 responsable de l’épidémie de syndrome hémolytique et urémique en Allemagne en 2011 avait une couverture de 97% par rapport à un génome publié ultérieurement [13]. Cette épidémie a montré d’une part qu’il était possible d’obtenir une séquence génomique sans «gap closure» en 3 jours et qu’une PCR spécifique de souches était déjà disponible 8 jours plus tard [17]. La disponibilité rapide du génome de ce pathogène majeur et épidémique a démontré non seulement l’utilité de la génomique pour développer des outils moléculaires diagnostiques spécifiques [18] mais également pour apporter des informations significatives sur les facteurs de virulence (virulome) et sur les gènes codant pour la résistance (résistome) de la souche incriminée [17]. L’application des outils modernes de génomique lors de cette épidémie nous a permis de justifier le développement d’un laboratoire diagnostique de génomique d’importance médicale à Lausanne, laboratoire dont l’activité a débuté dès le 1er février 2012 grâce à un financement institutionnel. →

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Le laboratoire de génomique d’importance médicale Le laboratoire diagnostique de génomique est localisé à l’institut de microbiologie et possède l’ensemble des équipements nécessaires au séquençage de génomes bactériens (Fragment Analyser, MiSeq, séquenceur capillaire, automate d’extraction Qiagen). Ce laboratoire diagnostique dirigé actuellement par le professeur Greub compte un technicien en analyses biomédicales et 3 bio-informaticiens. Cette plateforme propose non seulement l’analyse de génomes mais également de métagénomes. Ainsi, ces deux dernières années, environ 200 génomes bactériens ont été séquencés annuellement et la biodiversité présente dans près de 200 échantillons a été analysée par métagénomique des amplicons de PCR ciblant la sous-unité 16S du ribosome. Pour l’instant, les demandes d’analyse de métagénomique représentent principalement des analyses de selles (rôle des microbes dans l’obésité, maladies inflammatoires de l’intestin), de frottis

de peau (colonisation des plaies chez les brûlés par les microbes), échantillons respiratoires (rôle des microbes dans l’asthme par exemple) et frottis cervicaux vaginaux (rôle des microbes dans les fausses couches). Les applications de génomique regroupent principalement les investigations épidémiologiques intra-hospitalières et extra-hospitalières, l’analyse du virulome, l’analyse du résistome et la mise en évidence de certaines cibles diagnostiques pour le développement de PCR et/ou de test ELISA (table 1). En conclusion, notre laboratoire de diagnostic de génome d'importance médicale, dont l'activité croît exponentiellement, est fonctionnel, fiable et utile. Cependant, afin que cette activité puisse être pérenne, il est essentiel qu’outre le nouveau professeur de génomique en cours de recrutement, nous puissions également avoir suffisamment de bioinformaticiens bien formés en analyse de génomique. Pour répondre à ce besoin, nous avons la chance à Lausanne, d’avoir développé dès septembre 2010

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un cours pratique intitulé «Sequence a genome». Ces travaux pratiques, qui ont permis à l'ensemble des 10 enseignants impliqués à l'époque d'obtenir le prix «Excellence award for teaching in biology », ont également rendu possible la publication en parallèle de certains résultats portant sur le génome d’Estrella lausannensis [22].

Conclusion Le séquençage de génome incomplet «dirty» va se développer dans la décade à venir dans la plupart des centres médicaux universitaires afin de: −− pouvoir développer des outils diagnostiques basés sur des informations complètes et substantielles −− pouvoir mieux comprendre la pathogenèse microbienne en identifiant les facteurs de virulence en temps réel alors que le patient est encore hospitalisé pour une infection due à un pathogène donné −− guider les épidémiologistes que ce soit pour des épidémies intra ou extra-hospitalières

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Application de la génomique bactérienne

Nombre de génomes séquencés

Références

Epidémie d’entérocoques résistants à la Vancomycine

118

Blanc et al. (en préparation)

Epidémies d’infections dues à Pseudomonas aeruginosa

30 en 2014 et 25 en 2016

Blanc et al. [19]

Nombre accrue d’infections à Staphylococcus aureus PVL positives chez des migrants

Jaton et al. [20]

Investigations de bactérémies dues à Bifibobacterum chez des nouveau-nés

Bertelli et al. [21]

Virulence d’une souche de Staphylococcus aureus associé à un syndrome de choc toxique

Pillonel et al. (en préparation)

Souche hypervirulente de Streptococcus pyogenes

Tagini et al. (en préparation)

Virulence de Mycobacterium kansasii

Tagini et al. (en préparation)

Virulence de Fusobacterium necrophorum

Non publié

Résistome d’Acinetobacter baumannii

Diene et al. (en préparation)

Résistome de Klebsiella pneumoniae

Pillonel et al. (en préparation)

Polymorphisme de Neisseria meningitidis dans le but du développement diagnostique

Diene et al. [11]

Tableau 1: Exemples d’application de projet de génomique bactérienne effectué à Lausanne (liste non exhaustive).

−− pouvoir déterminer la sensibilité aux antibiotiques indirectement par l’analyse génomique pour les organismes fastidieux ou intracellulaires obligatoires −− pouvoir préciser les mécanismes de résistance aux antibiotiques notamment pour des souches épidémiques.

Ainsi, la génomique d'importance médicale permettra d'apporter rapidement plus de données au microbiologiste clinique. Références Correspondance: Gilbert.Greub@chuv.ch

Vous trouverez la liste des références sur le site: www.sulm.ch/f/pipette → Numéro actuel (no 5-2016).

Gilbert Greub 1 et Pierre Cosson 2

Aux sources de la virulence: amibes prédatrices et bactéries pathogènes Au commencement étaient les bactéries. Puis, les amibes sont apparues et les ont mangées. Seules les plus résistantes ont survécu, en développant des mécanismes qui leur permettent d’échapper à leurs prédateurs, et parfois d’infecter un être humain. Etudier les interactions entre bactéries et amibes, c’est se focaliser sur une situation expérimentalement plus simple à analyser qu’un patient ou un animal infecté. C’est aussi se placer à l’origine de la virulence bactérienne. C’est enfin imaginer que de nouveaux traitements des maladies infectieuses peuvent être découverts en étudiant comment les bactéries échappent à leurs prédateurs naturels.

Les amibes libres: biodiversité et rôle pathogène

eau, sol et air, là où se développent les bactéries: surface des eaux staLe terme d’amibes libres regroupe gnantes, berges, rhizosphère. Elles se plus de onze mille espèces différentes retrouvent également en nombre imde protistes. Ces cellules se caracté- portant dans tous les biofilms se déverisent par leur capacité à changer de loppant sur les parois et surfaces (i) forme pour ramper sur une surface des tuyaux des réseaux d’eaux, (ii) des ou pour avaler leurs proies: les bacté- réservoirs, (iii) des humidificateurs, ries. Les amibes se concentrent plus et (iv) des systèmes de climatisation, particulièrement aux interfaces entre ainsi qu’au niveau des tours aéro-réfrigérantes [1, 2]. Généralement, sous forme amiboïde 1 Institut de microbiologie, Université de Lausanne 2 Département de morphologie, Université de Genève appelée «trophozoïte», certaines

amibes telles que Acanthamoeba ont la capacité de s’enkyster lors de situations défavorables (sécheresse, température extrême, pH acide, exposition au chlore ou à d’autres biocides). D’autres, comme Dictyostelium discoideum, peuvent former par agrégation des structures multicellulaires résistantes permettant une dissémination aérienne. En raison de cette biologie développementale très complexe, l’amibe du genre Dictyostelium a particulièrement été étudiée et de nom-

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breux outils ont été développés permettant de générer des mutants spécifiques. Notons que la plupart des amibes libres sont non pathogènes pour l’homme. En effet, seules les amibes libres du genre Acanthamoeba, Naegleria et Balamuthia ont été décrites comme des agents pathogènes chez l’être humain, pouvant causer des atteintes du système nerveux central et, pour Acanthamoeba, également des ulcères cutanés chez des patients immunocompromis.

Biodiversité et rôle pathogène des bactéries résistantes aux amibes Constamment exposées aux amibes prédatrices, de nombreuses bactéries ont acquis au fil des millénaires de coévolution la capacité à résister à ces phagocytes professionnels. Rentrent dans cette liste presque toutes les bactéries qui, dans l’environnement, rencontrent fréquemment des amibes. Ces bactéries résistantes aux amibes incluent principalement les Bradyrhizobiaceae, les légionnelles, les mycobactéries, certaines entérobactéries (Klebsiella), des bacilles non fermentatifs (Pseudomonas), ainsi que des bactéries apparentées aux Chlamydia (Parachlamydia et Waddlia par exemple) [3, 4]. Si les Bradyrhizobiaceae sont principalement des bactéries environnementales non pathogènes présentes dans l’eau (Afipia, Bosea) ou associés aux racines des plantes (Rhizobium, Bradyrhizobium), les légionelles, les mycobactéries, les klebsielles, les pseudomonas et les bactéries apparentées aux chlamydias représentent des agents pathogènes opportunistes pour les mammifères [3]. Ainsi, les légionelles sont des agents de pneumonies survenant parfois de manière épidémique lors d’une exposition à une charge bactérienne élevée dans le réseau d’eau (pommeau de douche, robinets), ou dans les systèmes de climatisation, humidificateurs ou tour aéroréfrigérantes [4, 5]. Les mycobactéries atypiques résistantes aux amibes (Mycobacterium avium et Mycobacterium kansasii par exemple) sont reconnues comme agents d’infection principalement chez les hôtes immunocompromis [6]. Klebsiella pneumoniae et Pseudomonas aeruginosa sont eux des

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agents fréquents d’infections nosocomiales. Enfin, les bactéries apparentées aux chlamydias sont des pathogènes humains émergents reconnus comme possibles agents d’infections respiratoires (Parachlamydia) et de fausses couches (Waddlia) [7–9].

Les amibes comme niche évolutive Une légionelle fortuitement aspirée dans un poumon humain se retrouve soudain immergée dans un environnement riche en nourriture mais soigneusement protégé. En effet, les macrophages alvéolaires, cellules principales de la défense immunitaire innée au niveau du poumon ingèrent et détruisent les bactéries. Hélas, longuement exposées aux amibes, les légionelles ont développé des facteurs de virulence leur permettant de résister aux phagocytes professionnels (que sont les amibes) et même de se diviser à l’intérieur de ces cellules [3, 10]. Il a d’ailleurs été démontré que les mêmes gènes permettent aux légionelles de résister à la fois aux amibes libres et aux macrophages humains [11, 12]. Ainsi les amibes libres sont une véritable niche évolutive (i) pour la sélection de facteurs de virulence, (ii) pour l’adaptation à la survie au sein des macrophages, et (iii) pour finalement conférer à la bactérie la capacité à infecter un patient [3, 4]. Une amibe c’est d’une part un cousin pas si lointain de nos macrophages, et d’autre part un terrain d’entraînement voire un incubateur pour des bactéries infectieuses. Ainsi, les amibes libres jouent également un rôle significatif de réservoir et de niche réplicative pour différentes bactéries. Ce rôle de réservoir a été démontré pour les légionelles par une étude effectuée au CHUV sur 200 échantillons d’eau provenant des robinets de l’hôpital; les échantillons positifs pour des amibes contenaient également des légionelles dans 33% des situations contre 3% pour les échantillons dépourvus d’amibes (p<0,001) [13]. Les amibes jouent aussi un rôle protecteur lorsqu’elles sont enkystées, permettant la survie des légionelles, des mycobactéries et des bactéries apparentées aux chlamydias en présence de dose parfois importante de chlore ou d’autres biocides [14].

Les amibes comme outils Faciles à manipuler en laboratoire, cibles des bactéries pathogènes, les amibes sont aussi des outils à la disposition des chercheurs. Ainsi, les amibes sont utilisées comme des cellules phagocytiques modèles, plus faciles à étudier que des macrophages [15 –18]. Ce modèle permet d’explorer les mécanismes mal connus qui assurent l’ingestion et la destruction des bactéries. Les amibes sont également un excellent outil pour découvrir les mécanismes permettant aux bactéries pathogènes de résister aux cellules phagocytiques [19, 20]. Mieux, l’utilisation de ces protozoaires permet de découvrir de nouveaux agents antimicrobiens capables de neutraliser la virulence bactérienne [21, 22]. Enfin les amibes sont un incubateur naturel pour des pathogènes encore inconnus et un outil de culture cellulaire [18, 23]. En sélectionnant des bactéries capables de se répliquer dans les amibes, de nombreuses nouvelles espèces bactériennes ont été découvertes [24 –26], et représentent autant de pathogènes potentiels à surveiller.

Conclusion: Des souris et des amibes Pour étudier les infections bactériennes, il faut pouvoir offrir à une bactérie l’occasion d’infecter un hôte. Il est courant d’utiliser des animaux de laboratoire à cette fin, mais ces expériences sont complexes, délicates, et éthiquement problématiques. Dans de nombreux cas, les amibes Dictyostelium ou Acanthamoeba offrent une alternative simple et robuste à l’utilisation d’animaux. Les découvertes des dix dernières années indiquent de plus que cette alternative est scientifiquement pertinente: la confrontation entre amibes et bactéries n’est pas une création artificielle en laboratoire, c’est une situation naturelle. L’étudier c’est se pencher sur l’origine des maladies. Correspondance: Gilbert.Greub@chuv.ch

Références Vous trouverez la liste des références sur le site: www.sulm.ch/f/pipette → Numéro actuel (no 5-2016).

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Martin Hersberger 1

Die Herausforderung pädiatrische Labormedizin Die pädiatrische Labormedizin fristet ein Nischendasein in der Labormedizin. Dies mag an der kleinen Anzahl von pädiatrischen Laboruntersuchungen im Vergleich zu Laboruntersuchungen bei Erwachsenen liegen, ist aber auch bedingt durch die speziellen Herausforderungen der pädiatrischen Labormedizin.

Die Herausforderungen beginnen bei den kleinen Blutentnahmeröhrchen, die oft kapilläres Blut enthalten und nicht von Präanalytikstrassen abgearbeitet werden können. Wenn man bedenkt, dass ein Frühgeborenes von rund 1000 g ein Blutvolumen von etwa 80 ml aufweist, versteht man die Zurückhaltung der Klinker bei der Blutentnahme. In der pädiatrischen Labormedizin wird deshalb manuell jeder Tropfen Plasma für die Laboruntersu1 Prof. Dr. Martin Hersberger, Leiter Abteilung Klinische Chemie und Biochemie, Universitäts Kinderspital Zürich

chungen gewonnen, um eine sich ansonsten rasch anbahnende Erythrozytentransfusion zu vermeiden. Eine weitere Herausforderung sind die angeborenen Krankheiten, die selten vorkommen, aber durch ihre Vielzahl trotzdem zu zahlreichen pädiatrischen Patienten führen. Das grosse Gebiet der seltenen angeborenen Stoffwechselkrankheiten, Endokrinopathien und Immundefekte betrifft fast ausschliesslich pädiatrische Populationen. Bei diesen Krankheiten spielt die pädiatrische Labormedizin sowohl bei der Diagnose als auch bei der Verlaufskont-

rolle eine wichtige Rolle. Zum Beispiel bietet die pädiatrische Labormedizin bei Verdacht auf eine angeborene Stoffwechselkrankheit verschiedene Untersuchungen des Metaboloms an, die bei Auffälligkeiten im Profil zu einer Verdachtsdiagnose führen, die in spezialisierten Stoffwechselzentren, mittels Enzym- und Gendiagnostik, weiter abgeklärt werden kann. Ein funktionierendes Netzwerk zwischen den pädiatrischen Laboratorien und den spezialisierten Stoffwechselzentren ermöglicht heute die Diagnose vieler verschiedener Stoffwechselkrankheiten.

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Unterstützt werden diese Netzwerke durch die Orphanet-Initiative (www. orpha.net), auf deren Website nach angeborenen Krankheiten gesucht werden kann. Neben Erklärungen zu den spezifischen Krankheiten findet man dort auch Angaben zu diagnostischen Untersuchungen und Verweise auf spezialisierte pädiatrische Laboratorien, welche diese anbieten. Doch auch diese Zusammenstellung angeborener Krankheiten ist nicht vollständig, denn in der Literatur werden wöchentlich neue angeborene Krankheiten beschrieben. Dies zwingt die pädiatrische Labormedizin dazu, ihre metabolischen Profile regelmässig anzupassen, um auch diese neu beschriebenen Krankheiten erfassen zu können. Es ist davon auszugehen, dass sich der Bedarf für diese Laboruntersuchungen zukünftig auch auf erwachsene Patienten erweitern wird, denn immer mehr pädiatrische Patienten mit angeborenen Krankheiten vollziehen die Transition in die Erwachsenenmedizin und bedürfen weiterer Verlaufskontrollen. Neue Medikamente und optimierte Therapien verbessern die Lebenserwartung von Kindern mit angeborenen Krankheiten stetig.

E D U C ANTEI W ON S

NR. 5 | OKTOBER 2016

phatase während der Wachstumsphasen, oder an die Veränderungen der Sexualhormone während der Pubertät, die uns bei der Interpretation der Analysenresultate herausfordern. Adäquate Referenzintervalle für die verschiedenen pädiatrischen Altersbereiche würden uns bei der Interpretation solcher Laboruntersuchungen unterstützen. Doch bis vor einigen Jahren wurden die pädiatrischen Referenzintervalle mehrheitlich aus älteren Publikationen übernommen, die mit zum Teil veralteten und nicht mehr verwendeten Messmethoden erstellt wurden. Seit einigen Jahren bestehen nun aber verschiedene Arbeitsgruppen innerhalb der International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (IFCC), in Nordeuropa und in Kanada, welche sich mit der Erstellung von pädiatrischen Referenzintervallen beschäftigen. In Deutschland wurden Referenzintervalle für die wichtigsten klinisch-chemischen und hämatologischen Laboruntersuchungen mit der vom Robert-Koch-Institut durchgeführten Kinder- und Jugend-Gesundheitsstudie (www.kiggs-studie.de) erstellt, und die kanadische CALIPER-Studie (www.sickkids.ca/caliperproject) hat Referenzintervalle für eine erweiterte Kinder sind nicht kleine Liste von Laboruntersuchungen verErwachsene öffentlicht. Diese Studien erlauben es Doch auch Kinder ohne angeborene uns nun, angeborene Krankheiten, wie Krankheiten sind nicht kleine Erwach- die familiäre Hypophosphatasie oder sene, sondern haben eine vom Erwach- Hypoalphalipoproteinämie, mit rousenen unterschiedliche Physiologie, tinemässig durchgeführten Laborundie sich zudem über die verschiede- tersuchungen zu entdecken, weil wir nen Entwicklungsphasen, vom Neuge- auch den unteren Bereich der Referenborenen über das Kleinkind bis zum zintervalle definiert haben. Adoleszenten und jungen Erwachse- Diese und weitere Initiativen im Benen, verändert. Denken wir nur an die reich pädiatrische Labormedizin werVeränderungen der Alkalischen Phos- den in der «Task Force on Pediatric

Laboratory Medicine» der IFCC koordiniert und weiterentwickelt. Diese Task Force organisiert auch den «Internationalen Kongress für Pädiatrische Labormedizin» (ICPLM), welcher alle drei Jahre als Satelliten-Meeting

Ein funktionierendes Netzwerk zwischen den pädiatrischen Laboratorien und den spezialisierten Stoffwechselzentren ermöglicht heute die Diagnose vieler verschiedener Stoffwechselkrankheiten. der IFCC stattfindet. Das nächste Mal wird der ICPLM vom 20. bis 22. Oktober 2017, unmittelbar vor der IFCC WorldLab, in Durban (Südafrika) stattfinden.

Wissenstransfer Solche Kongresse in pädiatrischer Labormedizin erlauben den benötigten Austausch zwischen den Fachpersonen in pädiatrischer Labormedizin und ermöglichen deren klinische und wissenschaftliche Weiterbildung. Des Weiteren ermöglichen diese Kongresse aber auch Fachpersonen, die sich nicht auf pädiatrische Labormedizin spezialisiert haben, einen Einblick in das Gebiet und den Austausch mit Fachpersonen in diesem Gebiet. Korrespondenz: Martin.Hersberger@kispi.uzh.ch

Literatur Kann unter den im Text aufgeführten LINKS oder beim Autor bezogen werden.

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