Pipette – Swiss Laboratory Medicine, Nr. 6-2018, Die Analyse der Darmflora | Analyse du microbiote

Offizielles Organ der SULM Schweizerische Union für Labormedizin | Organe officiel de l’USML Union Suisse de Médecine de Laboratoire | www.sulm.ch | Nr. 6, Dezember 2018

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Die Analyse der Darmflora | Analyse du microbiote Mikrobiota-Analyse in einem diagnostischen Labor: Definitionen, Anwendungen und Qualitätsaspekte Lactose digestion and the implications on the gut microbiota Microbiote et médecine forensique: une nouvelle évidence?

Sur les traces d’Hannibal News Congrès annuel de la Société suisse de microbiologie (SSM) 2018

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Simplicity meets Excellence

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P I P E T T E – S W I S S L A B O R AT O R Y M E D I C I N E | WWW. S U L M . C H

Analyse der Darmflora Während die Mehrzahl der Arbeiten über Mikrobiota ursprünglich aus der Grundlagenforschung stammte, hat die MikrobiotaAnalyse nun in der medizinisch-diagnostischen Mikrobiologie Einzug gehalten. In diesem Kontext erläutert der erste Artikel dieser Sonderausgabe den Begriff Metagenomik und beschreibt die Bedeutung der qualitativen Aspekte, um durch Einsatz dieser neuen Technologien zuverlässige Ergebnisse liefern zu können. Der zweite Artikel befasst sich mit dem Nutzen der Mikrobiota-Analyse von Stuhlproben zur Untersuchung des Laktosestoffwechsels.

Diese Analyse dient als gutes Beispiel für die möglichen zukünftigen medizinischen Anwendungsmöglichkeiten und zeigt auf, dass sich die Mikrobiologie – eine hauptsächlich zur Diagnose ansteckender Krankheiten eingesetzte Disziplin – auf zahlreiche andere Disziplinen erstreckt. So kommen bestimmte Anwendungen der MikrobiotaAnalyse auch in der forensischen Medizin zum Tragen; diese fasst Dr. Scherz in seinem Artikel zusammen. Der folgende Artikel (Bertelli et al.) beschreibt den Nutzen der Hochdurchsatz-Mikrobiotaanalyse und der Gencode-Nachweisanalyse für die Antibiotikaresistenz durch die Shotgun-­ Metagenomik-Methode. Er zeigt auf eindrückliche Weise den Zusammenhang zwischen den in Trinkwasseraufbereitungsanlagen eingesetzten Behandlungen (Chlorierung, Ozonisierung usw.) und der Antibiotikaresistenz auf. Der von Pilar ­Junier und Kollegen ebenfalls zum Thema Antibiotikaresistenz verfasste Artikel zeigt den engen Zusammenhang zwischen der Antibiotikaverschreibung und dem in unserer Umwelt vorhandenen Resistom auf und beschreibt, wie die jüngere Vergangenheit mithilfe der Sedimentanalyse untersucht werden kann. Abschliessend tauchen wir

EDITORIAL

NR. 6 | DEZEMBER 2018

noch weiter in die Vergangenheit ein und diskutieren den Nutzen der MikrobiomAnalyse in der Archäologie – hier folgen wir den Spuren Hannibals und seiner Elefantenarmee. Deborah Bühlmann, die Zeichnerin des Magazins «pipette», liess sich von ­diesem fünften Artikel in einem wunderbaren Anachronismus zu ihrer K ­ arikatur inspirieren; sie zeigt Mikrobiologen, die ­einem Elefanten der Hannibal-Armee hinterherlaufen, um die wertvollen, aktuell häufig für die Mikrobiota-Analyse eingesetzten Stuhlproben einzusammeln. Wir hoffen, dass diese Sonderausgabe zum Thema Mikrobiota sowohl für in diesem Bereich tätige Wissenschaftler als auch zur Weiterbildung an Labormedizin und speziell dem Fach Mikrobiologie interessierter Leser von Interesse ist.

Prof. Gilbert Greub, MD-PHD

Analyse du microbiote Bien qu’initialement la plupart des travaux sur le microbiote ont émané du secteur de la recherche fondamentale, l’analyse du microbiote est arrivée en microbiologie médicale diagnostique. C’est dans ce contexte que le premier article de ce numéro spécial précise ce qu’est la métagénomique et décrit l’importance des approches qualité afin de rendre des résultats fiables en utilisant ces nouvelles technologies.

Le deuxième article de ce numéro spécial décrit l’utilité de l’analyse du microbiote des selles pour étudier le métabolisme du lactose. C’est un bon exemple de possibles applications médicales futures et démontre que la microbiologie, d’une discipline principalement au service du diagnostic des maladies infectieuses s’étant à de nombreuses autres disciplines. Ainsi, certaines applications

de l’analyse du microbiote voient le jour également en médecine forensique, qui sont résumées dans l’article rédigé par le Docteur Scherz.

Le article suivant (Bertelli et al) démontre l’utilité de l’analyse à haut débit du microbiote ainsi que l’analyse de la présence de gènes codant pour la résistance aux antibiotiques par l’approche de métagénomique shotgun. Il démontre avec élégance la relation entre les traitements des usines d’eau potable (par chloration, ozonation, …) et la résistance aux antibiotiques.

L’article rédigé par Pilar Junier et collaborateurs, également sur les résistances aux antibiotiques, démontre l’important lien entre les prescriptions d’antibiotiques et le résistome présent dans notre environnement et il démontre comment il est possible d’étudier le passé récent par l’analyse de sédiments.

Enfin nous glissons encore plus loin dans le passé pour discuter de l’utilité de l’analyse du microbiome en archéologie, en l’occurrence pour suivre les traces d’Hannibal et de son armée d’éléphants.

C’est d’ailleurs ce cinquième article qui a inspiré Deborah Bühlmann, illustratrice du journal «pipette», qui dans un superbe anachronisme a caricaturé des microbiologistes courant derrière un éléphant de l’armée d’Hannibal pour récupérer les précieux échantillons de selles, dorénavant couramment utilisés pour l’analyse du microbiote.

Nous espérons que ce numéro spécial sur le microbiote sera utile à la fois pour les chercheurs travaillant dans ce domaine mais également pour la formation continue de toute personne intéressée en médecine de laboratoire et plus particulièrement en microbiologie.

Prof. Gilbert Greub, MD-PHD

SULM – Schweizerische Union für Labormedizin | USML – Union Suisse de Médecine de Laboratoire Angeschlossene Fachgesellschaften BAG CSCQ FAMH FMH H+ KHM labmed MQ pharmaSuisse SGED

Bundesamt für Gesundheit – Abteilung KU Schweizerisches Zentrum für Qualitätskontrolle Die medizinischen Laboratorien der Schweiz Verbindung der Schweizer Ärztinnen und Ärzte Die Spitäler der Schweiz Kollegium für Hausarztmedizin Schweizerischer Berufsverband der Biomedizinischen Analytikerinnen und Analytiker Verein für medizinische Qualitätskontrolle Schweizerischer Apothekerverband Schweizerische Gesellschaft für Endokrinologie und Diabetologie

SGKC/SSCC SGM SGMG SGRM SSAI/SGAI SGH/SSH SVA SVDI

Schweizerische Gesellschaft für Klinische Chemie Schweizerische Gesellschaft für Mikrobiologie Schweizerische Gesellschaft für Medizinische Genetik Schweizerische Gesellschaft für Rechtsmedizin Schweizerische Gesellschaft für Allergologie und Immunologie Schweizerische Gesellschaft für Hämatologie Schweizerischer Verband Medizinischer PraxisAssistentinnen Schweizerischer Verband der Diagnosticaund Diagnostica-Geräte-Industrie

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Prof. Dr. Gilbert Greub, Redaktionskomitee / Comité de rédaction «pipette»

real time PCR Die Zusammensetzung der Darmflora kann die menschliche Gesundheit beeinflussen und wird mit unterschiedlichen Erkrankungen assoziiert, wie z.B. chronisch-entzündliche Darmerkrankungen, metabolisches Syndrom und Fettleibigkeit.

R-Biopharm bietet dazu verschiedene real time PCR Kits an: RIDA®GENE Gut Balance zum direkten qualitativen und quantitativen Nachweis und zur Differenzierung von Bacteroidesund Cluster XIVa-DNA aus humanen Stuhlproben.

RIDA®GENE Akkermansia muciniphila zum direkten qualitativen und quantitativen Nachweis von Akkermansia muciniphila DNA in humanen Stuhlproben.

RIDA®GENE Faecalibacterium prausnitzii zum direkten qualitativen und quantitativen Nachweis von Faecalibacterium prausnitzii DNA in humanen Stuhlproben.

RUWAG Handels AG Bielstrasse 52 2544 Bettlach Tel. 032 644 27 27 ruwag@ruwag.ch www.ruwag.ch

Il devient de plus en plus évident que la composition du microbiote intestinal affecte la santé humaine et est associée à différentes maladies, notamment les maladies inflammatoires de l'intestin, le syndrome métabolique et l'obésité.

A ce sujet, la société R-Biopharm propose différents kits PCR : RIDA®GENE Gut Balance est une PCR en temps réel pour la détection qualitative et quantitative de l'ADN de Bacteroides et du Cluster XIVa dans des échantillons de selles humaines.

RIDA®GENE Akkermansia muciniphila est une PCR en temps réel pour la détection qualitative et quantitative de l'ADN de Akkermansia muciniphila dans des échantillons de selles humaines.

RIDA®GENE Faecalibacterium prausnitzii est une PCR en temps réel pour la détection qualitative et quantitative de l'ADN de Faecalibacterium prausnitzii dans des échantillons de selles humaines.

Seegene’s

High multiplex real-time PCR products All MDx assays in one platform All-in-One system enables to process multiple molecular diagnostic assays in one consolidated platform Allplex™ Respiratory Panel 1

7

Allplex™ Respiratory Panel 2

7

Allplex™ Respiratory Panel 3

5

4

Allplex™ Tropical Fever Virus Assay

Allplex™ Respiratory Panel 4

7

5

Allplex™ Tropical Fever Parasite Assay

4

Allplex™ Dengue Typing Assay

7

Allplex™ Bacterial Vaginosis Assay

4

Allplex™ CT/NG/MG/TV Assay

Anyplex™ II MTB/MDR Detection

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7

Allplex™ MG-DR Assay

7

Allplex™ Vaginitis Screening Assay

5

Anyplex™ II STI-5 Detection

7

Anyplex™ II STI-7 Detection

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Anyplex™ CT/NG Real-time Detection

Anyplex™ MERS-CoV Real-time Detection

2

Anyplex™ II Detection MTB/MDR/XDR De

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Anyplex™ FluA/B Typing Real-time Detection

3

Anyplex™ MTB/NTM TB/NTM Real-time Detection

6

Allplex™ GI-Parasite Assay

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Allplex™ GI-Helminthiasis Assay

9

Allplex™ H. pylori-ClaR Detection

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39 Tuberculosis Targets

13 Tropical Fever Targets

8 Dermatosis Targets

11Hospital Acquired Infection Targets 1

8

Allplex™ Entero-DR Assay

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Allplex™ MRSA Assay

7

Allplex™ Meningitis-V1 Assay

5

Allplex™ Meningitis-V2 Assay

6

Allplex™ Meningitis-B Assay

18 Meningitis Targets

Oncology Target

Anyplex™ BRAF V600E Real-time Detection

2

W men’s Wo ’ Health & STI Targets ’s 62 Women’s

38 Gastrointestinal Infection Targets

Allplex™ GI-Bacteria(II) Assay

Allplex™ Genital ulcer Assay

2 14

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7 14

Anyplex™ II MTB/XDR Detection

Allplex™ GI-Bacteria(I) Assay

Allplex™ STI Essential Assay

Allplex™ Candidiasis Assay

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7 7

Anyplex™ II RB5 Detection

Allplex™ GI-Virus Assay

Anyplex™ II HPV HR Detection

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Allplex™ MTB/XDRe Detection

Anyplex™ II RV16 Detection

Allplex™ GI-EB Screening Assay

Anyplex™ II HPV28 Detection

Allplex™ MTB/MDRe Detection

Anyplex™ MTB/NTMe Real-time Detection

28 Respiratory Infection Targets

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6 Genetics Targets

6 Anyplex™ II Thrombosis SNP Panel Assay

BÜHLMANN Laboratories AG · CH – 4124 Schönenbuch/Basel Phone: +41 61 487 12 12 · Fax: +41 61 487 12 34 E-mail: info@buhlmannlabs.ch · www.buhlmannlabs.ch

8 Allplex™ Dermatophyte Infection Assay

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NR. 6 | DEZEMBER 2018

IMPRESSUM pipette, offizielles Publikationsorgan der SULM / Organe officiel de l’USML 14. Jahrgang, Nr. 6/2018, erscheint 2018 6-mal, ISSN 1661-09 Herausgeber | Editeur SULM – Schweizerische Union für Labormedizin c/o Prof. A. R. Huber Institut für Labormedizin Kantonsspital Aarau AG CH-5001 Aarau Tel. 062 838 53 02 andreas.huber@ksa.ch www.sulm.ch

Richtlinien für Autoren | Instructions pour les auteurs www.sulm.ch/pipette

Redaktionskomitee | Comité de rédaction Prof. Dr. Andreas R. Huber Dr. Roman Fried Dr. Jeroen S. Goede Prof. Dr. Gilbert Greub Dr. Stephan Regenass Prof. Dr. Lorenz Risch Marianne Schenk Dr. Véronique Viette

Herstellung | Production Stämpfli AG Wölflistrasse 1 Postfach 3001 Bern Telefon: 031 300 66 66

Redaktion | Rédaction Esther Meyle (em) pipette@sulm.ch

Verlag | Editeur Stämpfli AG Wölflistrasse 1 Postfach 3001 Bern Telefon: 031 300 66 66

Inserate | Annonces Stämpfli AG Vanessa Jost, Anzeigenleiterin Wölflistrasse 1, Postfach 3001 Bern Telefon: 031 300 63 87 E-Mail vanessa.jost@staempfli.com

Redaktionsadresse | Adresse de la rédaction wortbild gmbh Gestaltung & Kommunikation Niklaus von Flüe-Strasse 41 4059 Basel Telefon: 061 331 31 44 pipette@sulm.ch

Abonnemente | Abonnements www.sulm.ch/pipette/abonnement info@sulm.ch Einzelpreis CHF 20.– Jahresabo CHF 80.–

Cover © Frida Bünzli

Nächste Ausgabe | Prochain numéro Essen und Ernährung | Alimentation et nutrition 27. Februar 2019

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Inhalt · Sommaire 3 EDITORIAL

Analyse du microbiote | Die Analyse der Darmflora

6 E D U C AT I O N

Mikrobiota-Analyse in einem diagnostischen Labor: Definitionen, Anwendungen und Qualitätsaspekte | Analyse du microbiote dans un laboratoire diagnostic: définitions, applications et aspects qualité 1 0 E D U C A T I O N

Lactose digestion and the implications on the gut microbiota | Laktoseverdauung und die Auswirkungen auf die Darmflora 1 2 E D U C AT I O N

Microbiote et médecine forensique: une nouvelle évidence? | Mikrobiota und forensische Medizin: ein neues Beweismittel?

1 4 E D U C AT I O N

De l’eau potable aux eaux usées: microbiote et antibiorésistance? | Vom Trinkwasser zum Abwasser: Mikrobiota und Antibiotikaresistenz 1 6 E D U C AT I O N

Le microbiote du sédiment: une approche novatrice pour tracer la consommation passée d’antibiotiques | Sedimentmikrobiota: neuartiger Ansatz zur Rückverfolgung der Antibiotikaeinnahme in der Vergangenheit 1 8 E D U C AT I O N

Sur les traces d’Hannibal | Auf den Spuren von Hannibal 20 MARKETPLACE 21 NEWS

Congrès annuel de la Société suisse de microbiologie (SSM) 2018

22 NEWS

KROBS: un jeu innovant sur les microbes | KROBS: ein innovatives Spiel über Mikroben

Auflage | Tirage 8000 Exemplare

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Continuous Medical Education CME Ziel der vier bis sieben thematisch aufeinander abgestimmten Weiterbildungsartikel je «pipette» ist die ­Förderung und Weiterentwicklung der Labormedizin C auf der Grundlage aktueller wissenschaftlicher ErLE C S kenntnisse. Die Redaktion arbeitet unabhängig, das Heft EDU finanziert sich durch Inserate und nicht gebundene Fördergelder, es werden keine finanziellen Interessen verfolgt.

Folgende Firma leistet in dieser Ausgabe einen nicht zweckgebundenen Beitrag: Roche Diagnostics Schweiz AG. Firmen, die die Weiterbildung in der «pipette» unterstützen möchten, melden sich unter: pipette@sulm.ch.

Continuous Medical Education CME L’objectif des quatre à sept articles de formation continue organisés par thème pour chaque «pipette» consiste à promouvoir et former la médecine de laboratoire sur la base des connaissances scientifiques actuelles.

La rédaction travaille de façon indépendante, la publication est financée par les annonces et les subventions indépendantes, sans aucun intérêt financier. L’entreprise suivante apporte à cette édition une contribution bénévole: Roche Diagnostics Schweiz AG. Les entreprises qui souhaitent soutenir la formation continue de «pipette» sont priées de contacter: pipette@sulm.ch.

A G E N D A

www.sulm.ch/aktuell/agenda – Termine zu Kongressen, Tagungen und Versammlungen – Dates des congrès, conférences et réunions P I P E T T E O N L I N E

www.sulm.ch/pipette – Lesen Sie die «pipette» online als E-Paper, im Browser oder auf dem Tablet. Alle Artikel können im «pipette»-Archiv als PDF heruntergeladen werden.

– Lire la «pipette» en ligne comme e-paper, dans le navigateur ou sur la tablette. Tous les articles de la «pipette» peuvent être téléchargés en format PDF.

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NR. 6 | DEZEMBER 2018

Gilbert Greub 1 , Marta Rosikiewicz 1 und Claire Bertelli 1

Mikrobiota-Analyse in einem diagnostischen Labor: Definitionen, Anwendungen und Qualitätsaspekte Während der vergangenen zehn Jahre wurden in diagnostischen Labors zahlreiche neue Technologien eingeführt, mit deren Hilfe schneller mehr Informationen gewonnen werden können. Neben der ­Methode MALDI-TOF, die 2009 in die meisten Labors Einzug hielt, und der Automatisierung, die sich schrittweise von serologischen auf molekularbiologische und klassische mikrobiologische Labors (Mikroskopie und Kultur) ausweitete, hat die Ankunft der Hochdurchsatzsequenzierung ebenfalls dazu geführt, dass mehr Informationen aus der mikrobiologischen Zusammensetzung eines gegebenen Bereichs auf ausreichend schnelle und zuverlässige Weise gewonnen werden können, was sie zu einem leistungsfähigen Werkzeug der Diagnostik macht. Wir haben seit Beginn des Jahres 2012 in Lausanne die Bakteriengenomik sowie die Mikrobiota-Analyse entwickelt und konnten unser Labor für die Bakteriengenomik und Metagenomik dieses Jahr akkreditieren lassen. Die Bemühungen um die Akkreditierung haben es uns ermöglicht, die Anwendungen der Hochdurchsatzsequenzierung in der Diagnostik zu präzisieren und Protokolle äusserst genau zu definieren.

Definitionen Zur Hochdurchsatzsequenzierung der mikrobiellen Diversität stehen unter­ schiedliche Analysemethoden zur Ver­ fügung. Einfacher ausgedrückt gibt es zwei Haupttypen der Hochdurchsatz­ sequenzierung für die Analyse der mi­ krobiellen Zusammensetzung: mit und ohne Amplifikation durch PCR (Ta­ belle 1).

In diesem Artikel konzentrieren wir uns auf die Mikrobiota-Analyse auf Basis der Amplifikation durch PCR, die auch Post-PCR-Metagenomik oder einfach Mikrobiota-Analyse heisst. Der Begriff Metagenomik sollte der Ampli­ fikation der gesamten in einer gegebe­ nen Probe vorhandenen Genome vor­ behalten sein, die auch direkte oder Shotgun-Metagenomik genannt wird.

Hauptanwendungen von Analysen der mikrobiellen Diversität in der klinischen Mikrobiologie In der Vergangenheit zielte die Mikro­ biologie hauptsächlich darauf ab, ­das Vorhandensein pathogener Mikroben in einer klinischen Probe nachzuwei­ sen, um so den auslösenden Erreger einer Infektion zu bestimmen. Dies ist eine der am häufigsten eingesetz­ ten Anwendungen, da es möglich ist, anhand der Mikrobiota-­ Analyse auf

1 Institut de Microbiologie, CHUV, Lausanne

Grundlage von Amplikons, die durch auf die 16S ribosomale RNA abzie­ lende PCR gewonnen wurden, das Prinzip der Eubakterien-PCR auch auf nicht physiologisch sterile Proben an­ zuwenden, was bislang ein komplexes Verfahren darstellte. In der Tat war bei einer Mischflora ein Schritt zur Amp­ likonklonierung erforderlich, um die Gesamtheit der mikrobiellen Diversität beobachten zu können. Dieser Klonie­ rungsschritt war aber dem Einsatz in der wissenschaftlichen Forschung vor­ behalten. Die Mikrobiota-Analyse un­ ter Verwendung verschiedener, spezifi­ scherer PCR, die auf konservierte, un­ terscheidende Gene (z. B. rpoB, gltA) abzielen, wird sich in d ­ iagnostischen

Labors weiterentwickeln und schritt­ weise die klassische EubakterienPCR ablösen, an die sich eine Sanger-­ Sequenzierung anschliesst.

Die übrigen Anwendungen der klini­ schen Metagenomik verändern die Wahrnehmung unserer Spezialisierung vollkommen, da es sich bei unseren Kunden nicht mehr nur um Ärzte han­ delt, die sich mit Infektionen befassen (Intensivmediziner, Notärzte, Kinder­ ärzte, Infektiologen …), sondern auch um Spezialisten, die in der Haupt­ sache mit nicht infektiösen Krankhei­ ten konfrontiert sind (Endokrinologen, ­Diabetologen, Dermatologen …). In der Tat könnte die Analyse der Mikrobiota im Verdauungsapparat beispielsweise

Tabelle 1: Analyse der mikrobiellen Diversität durch Hochdurchsatzsequenzierung (Metagenomik im weiteren Sinn).

Mit PCR-Amplifikation

Ohne PCR-Amplifikation

Profiling von Mikroben

Direkte Metagenomik

= Post-PCR-Metagenomik

Shotgun-Metagenomik Metagenomik (im engeren Sinn)

Ergebnisse beschränken sich auf die mikrobielle Zusammensetzung

Es sind Informationen zur mikro­ biellen Vielfalt verfügbar, aber auch ­ zu metabolischen Fähigkeiten, zum Resistom und zum Virulom der in ­ der Probe vorhandenen Mikroben

Auf Bakterien begrenzt

Einschliesslich Informationen zum Vorkommen bzw. Fehlen von Bakte­ rien, Viren, Pilzen und Parasiten

Schnelle Ergebnisse, kostengünstige Analyse

Teuer, komplexe Analyse

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Analyse du microbiote dans un laboratoire diagnostic: définitions, applications et aspects qualité

Le séquençage à haut débit est une révolution récente dans la microbiologie diagnostique qui permet d’entrevoir de nombreuses nouvelles applications dont l’analyse du microbiote par séquençage de gènes conservés. Ces nouvelles technologies nous permettent d’avoir plus de données plus rapidement, mais représentent une révolution technologique qui nécessite l’adaptation des compétences de nos micro­ biologistes cliniques et de nos équipes. Afin d’avoir les bioinformaticiens nécessaires à l’analyse fine des données, nous avons initié il y a quelques années à Lausanne un cycle d’enseignement de l’analyse microbiologique des données issus du séquençage de nouvelles générations, et ce dans le cadre de travaux pratiques dispensés au niveau Master à l’école de biologie (4). Cet enseignement, d’ailleurs couronné du «Biology teaching award de la Faculté de Biologie et Médecine», a porté ses fruits et nous permet aujourd’hui d’avoir la masse critique de bioinformaticiens. Nous avons par ailleurs passablement travaillé sur les aspects formels en préparant des ­directives et procédures dans notre système de documents d’accréditation (système v-doc) et ce pour les différentes étapes clefs.

Abbildung 1: Bioinformatischer Pipelinetypeffekt angewendet auf das Clustering der Mikrobiota von Sequenzierungsproben aus Stuhlproben gesunder Personen. Jede Farbe steht für die Probe einer bestimmten Person. Zu beachten ist, dass die Mikrobiota einer Person relativ konstant ist (wenn weder eine Behandlung mit Antibiotika noch ein grösserer Eingriff vorliegt). Mit dem «Usearch»-Ansatz gruppieren sich die Proben einer Person gemäss den Erwartungen. Die Informatikpipeline, die standardmässig von Illumina vorgeschlagen wird, lässt eine Beobachtung dieser Gruppierung nicht zu.

bei der Behandlung von Patienten, die unter Obesitas und/oder Typ-2-Diabe­ tes leiden, hilfreich sein (1). Die Ana­ lyse der Mikrobiota der Haut könnte Dermatologen bei der genaueren Be­ stimmung der Physio­pathologie gewis­ ser Krankheiten wie der atopischen Dermatitis oder Psoriasis unterstützen und bei neuen Therapieansätzen hilf­ reich sein. Ebenso könnte die Analyse der Mikrobiota der Haut nützlich sein, wenn es darum geht, bei Patienten mit umfangreichen Verbrennungen die die Haut besiedelnden Keime zu identifi­ zieren, und eine Hilfe bei der Wahl der empirischen Therapie darstellen, wenn klinische und paraklinische Anzeichen nicht kontrollierter Infektionen auftre­ ten. Ebenso könnte die Analyse der Plazenta und/oder ­eines vaginalen Ab­ strichs im Falle einer Fehlgeburt dem Geburtshelfer dabei helfen, den even­ tuellen ursächlichen Erreger der Fehl­ geburt zu ermitteln und so erneute Fehlgeburten zu vermeiden. Auch könnte die Analyse der Mikrobiota des Verdauungstrakts Onkologen Hinweise darauf liefern, wie sich Chemothera­ pien und die neuen, heute eingesetz­ ten Immuntherapien auf unsere Darm­ flora niederschlagen. Wie in einem Ar­ tikel dieser Ausgabe beschrieben (2), ist die Identifizierung einzelner Perso­ nen anhand ihrer Speichelzusammen­ setzung eine neuartige Anwendung in der Krimi­nologie, welche die Ent­

nahme von schlecht erhaltenen Proben am Tatort eines Verbrechens ermög­ licht (angesichts der besseren Haltbar­ keit der DNA von Bakterien im Ver­ gleich zur menschlichen DNA, insbe­ sondere von grampositiven Bakterien).

Eine weitere Anwendung der Mikro­ biota-Analyse in der Kriminologie ist die Feststellung, ob bei einem im Was­ ser gefundenen Leichnam Tod durch Ertrinken vorliegt oder ob die Leiche erst nach dem Tod im Wasser versenkt wurde (etwa zur Vertuschung e­ines Verbrechens).

Wie die oben genannten Beispiele zei­ gen, ist das Anwendungsfeld der Mikro­ biota-Analyse in der klinischen Mikro­ biologie weit und wird sich in den kommenden Jahren noch weiter aus­ dehnen. Daher gilt es hier, die Analy­ semethoden zu definieren, die ausrei­ chend zuverlässig und reproduzierbar sind und deren Interpretation einfach genug ist, sodass sie in der Routine­ diagnostik angeboten werden können.­ In diesem Zusammenhang ist es un­ erlässlich, dass diese verschiedenen künftigen Anwendungen den Bereich der wissenschaftlichen Forschung ver­ lassen und Schritt für Schritt von kli­ nischen Mikrobiologen umgesetzt wer­ den, die sich bei ihrem Tätigkeitsan­ satz auch Gedanken zu qualitativen Aspekten vor, während und nach der Analyse machen.

Qualitative Aspekte Im Rahmen einer kürzlich in Lausanne durchgeführten Studie wurden von­ 14 Teilnehmern jeweils neun Stuhl­ proben seriell untersucht. Die Teilneh­ mer hatten gewisse Ernährungsvor­ schriften zu beachten und erhielten mit ­Probiotika versetzte Joghurt- oder Sauer­ milchprodukte im Cross-overVerfahren mit Wash-out-Phasen (3).

Tabelle 2: Wichtige Schritte bei Analysen der Mikrobiota

No

Schritte

1

Testindikation

2

Probenahme (Probentyp, ­Entnahmemodalitäten, ­Lagerung, Fristen)

3

DNA-Extraktion

4

Amplifikation durch PCR (Zielgen …)

5

Sequenzierungstyp (Illumina, PacBio …)

6

Bioinformatikanalysen (Pipelinetyp, Datenbank …)

7

Technische Validierung der erhaltenen Sequenzen

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Biomedizinische Validierung und Interpretation der Er­ gebnisse

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QIAGEN vs MN isolation kit (OTU abundance)

1

log10(OTU abundance) MN 2 3 4

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Die signifikante Anzahl an Proben, die von jeweils denselben Probanden stammten, machte es uns möglich, den Einfluss unterschiedlicher bioinforma­ tischer Pipelines auf die Zuverlässig­ keit der Ergebnisse zu untersuchen.

Wie in Abbildung 1 dargestellt, ermög­ lichte uns eine der Pipelines das präzise Cluster­ing der Proben nach Studienteil­ nehmern (jeder Teilnehmer wird durch eine andere Farbe dargestellt). Eine an­ dere Pipeline jedoch, und zwar die von phylum Illumina standardmässig vorgeschla­ Actinobacteria Bacteroidetes gene, erlaubte nur eine weniger gute Cyanobacteria Unterscheidung der unterschiedlichen Firmicutes Fusobacteria Proben nach Teilnehmern. Zwar ist es Proteobacteria schwierig, ohne Richtwerte Schluss­ Saccharibacteria unknown folgerungen zu ziehen, jedoch zeigt diese einfache Analyse trotz allem den 0 1 2 3 4 5 bedeutenden Einfluss des angewen­ log10(OTU abundance) QIAGEN deten bioinformatischen Werkzeugs.­ So müssen mikrobiologische Diagnos­ tiklabors genaue Pipelinegrenzwerte Abbildung 3: Vergleich der Menge an verschiedenen Mikroben nach zwei DNAerarbeiten und die Nachverfolgbar­ Extraktions­typen. Die Überlegenheit des Macherey-Nagel-Kits zur Extraktion keit der verwendeten Pipeline sicher­ der DNA von Firmi­cutes (rote Dreiecke) und Actinobacteriae (blaue Quadrate) ­ im Vergleich zum Qiagen-­Kit ist signifikant (mehr als ein Log Unterschied). stellen. Unter Verwendung der Stuhl­ proben von drei Probanden (005, 013 und 009) aus derselben Studie (3) konnten wir zudem den grossen Ein­ fluss von Datenbanken zeigen (Abbil­ dung 2), die für die Klassifizierung der erhaltenen 16S-Sequenzen einge­ setzt wurden. Wie aber Abbildung 3 deutlich zeigt, beeinflusst nicht nur die bioinformatische Analyse die Ergeb­ nisse massgeblich, dasselbe gilt bei­ spielsweise auch für die DNA-Extrak­ tion. Das Macherey-Nagel-Kit erweist sich für die ­ Extraktion der DNA von Firmicutes und Actinobacteriae als wesentlich besser geeignet als das ­ ­Qiagen-Kit. 0

8

Schlussfolgerungen Die Hochdurchsatzsequenzierung stellt eine aktuelle Revolution in der diag­ nostischen Mikrobiologie dar, mit der sich zahlreiche neue Anwendungen auftun, darunter die Mikrobiota-Ana­ lyse durch Sequenzierung von konser­ vierten Genen. Diese neuen Technolo­ gien ermöglichen uns eine schnellere und umfangreichere Datenerhebung, stellen aber auch eine technologische Revolution dar, die eine Anpassung der Kompetenzen unserer klinischen Mikro­biologen und unserer Teams er­ fordert. Um auf die für eine Feinana­ lyse unserer Daten notwendigen Bio­

Abbildung 2: Die mikrobielle Diversität v­ on drei Personen wurde mithilfe dreier verschiedener Datenbanken analysiert: Greengens99, Silva99 und Illumina. Die Ergebnisse weichen sehr stark voneinander ab und zeigen den enormen Einfluss der verwendeten Datenbank auf die Analyse­ergebnisse der mikrobiellen Diversität.

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informatiker zurückgreifen zu können, haben wir vor einigen Jahren in Lau­ sanne einen Unterrichtszyklus zum Thema mikrobiologische Analyse von Daten aus Sequenzierungen der neuen Generation eingeführt, der im Rahmen praktischer Arbeiten auf Masterniveau an der biologischen Fakultät vermittelt wird (4). Dieser Unterricht, an dessen Ende der Abschluss «Biology Teaching Award der Fakultät für Biologie und Medizin» steht, hat bereits Früchte getragen und dafür gesorgt, dass wir heute über die kritische Masse an Bio­ informatikerinnen und Bioinformati­

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kern verfügen. Wir haben uns zudem recht intensiv mit den formalen Aspek­ ten beschäftigt und innerhalb unse­ res Systems der Akkreditierungsdoku­ mente (V-doc-System) Richtlinien und Verfahren ausgearbeitet, und zwar für die verschiedenen Schritte, die in Ta­ belle 2 aufgelistet sind.

Korrespondenz Gilbert.Greub@chuv.ch

La version française de l'article se trouve en ligne sur www.sulm.ch/pipette

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Diagnostische und klinische Kompetenz aus einer Hand ®

Das ZLM St. Gallen gehört zu den führenden medizinisch-diagnostischen Laboratorien der Schweiz. Unsere rund 180 Mitarbeiterinnen und Mitarbeiter führen Routine- und Spezialanalysen in der Klinischen Chemie, Hämatologie, Hämostaseologie, Mikrobiologie, Immunologie, Molekularbiologie, Genetik und Veterinärdiagnostik durch. Zu unseren Auftraggebern zählen das Zentrumsspital Kantonsspital St. Gallen mit seinen 3 Standorten, die Spitäler aller Spitalregionen des Kantons St. Gallen, niedergelassene Ärztinnen und Ärzte sowie andere nationale und internationale Spitäler und Universitäten. Unsere Labordiagnostik ist hochgradig automatisiert und vernetzt.

Referenzen 1. Somm E, Henry H, Bruce SJ, Aeby S, Rosi­kiewicz M, Sykiotis GP, Asrih M, ­ Jornayvaz FR, Denechaud PD, Albrecht U, Mohammadi M, Dwyer A, Acierno JS Jr, Schoonjans K, Fajas L, Greub G, Pitteloud N. ß-Klotho d ­ eficiency protects against obesity through a crosstalk between liver, microbiota, and brown adipose tissue. JCI Insight. 2017 Apr 20;2(8). pii: 91809.

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Kathryn J Burton 1

Lactose digestion and the implications on the gut microbiota Lactose digestion in humans depends upon the activity of the enzyme lactase. In adults, lactose ­maldigestion is often present due to a physiological decline in lactase expression in late childhood. Lactose maldigestion can lead to symptoms of lactose intolerance due to the presence of un­ digested lactose in the colon and the products of its fermentation by gut bacteria. Adaptive changes in the colonic microbiota are associated with decreased lactose intolerance.

The digestion of lactose, a disaccharide that is present in abundance in mam­ malian milk, takes place at the brush border of the small intestine where the sugar is hydrolysed into galactose and glucose by a ß-D-galactosidase en­ zyme, lactase (or lactase-phlorizin hy­ drolase). While at birth, lactase is usu­ ally produced at high concentrations, the activity of intestinal lactase in late childhood declines and, despite con­ tinued dietary intake of lactose, lactose digestion may ensue (primary hypo­ lactasia). However, several highly con­ served single nucleotide mutations in the promoter region of the lactase gene (LCT) (for example DNA variant C/T13901) are associated with a con­tinued lactase activity in adults (lactase per­ sistence) [1]. The global prevalence of lactose maldigestion is estimated at 67 % although this is highly variable by region with estimates from 4 to 98 % across northern and southern Euro­ pean countries [2]. Diagnosis of lac­ tose maldigestion can be performed using various clinical tests including genetic assessment of lactose persist­ ence, direct and indirect assessments of lactase activity [3, 4]. While indi­ viduals with lactose maldigestion may be asymptomatic, lactose intolerance is diagnosed in the presence of gastro­ intestinal symptoms (such as bloating and diarrhoea). These symptoms may be attributed to osmotically active un­ digested lactose or may be caused by certain gases (such as H2, CO2 or CH4) that are produced during fermentation of lactose by colonic bacteria.

1 Kathryn J Burton RD, PhD, Researcher Human Nutrition, Sensory Analysis and Flavour Group, Agroscope, 3003 Bern

Interactions between colonic ­bacteria and lactose Despite the association between lactose fermentation in the colon and symp­ toms of lactose intolerance, an adap­ tive functional role of colonic bacteria in the metabolism of lactose for indi­ viduals with lactose maldigestion has been described [5]. Indeed such adap­ tation underpins the dietary guidelines that permit a continued exposure to lactose at lower quantities (according to gastrointestinal tolerance) [6] and may explain in part why many individ­ uals with lactose maldigestion do not experience gastrointestinal symptoms indicative of lactose intolerance after lactose intake. Colonic adaptation to lactose presence was characterised by Hertzler and Savaiano in 1996 as an increase in faecal content of ß-galac­ tosidase, lower systemic production of hydrogen, and improved gastrointes­ tinal symptoms after lactose intake [5].

These effects were hypothesised by the authors to reflect a shift in the micro­ biota composition to favour bacteria able to express ß-galactosidase. Vari­ ous in vivo and in vitro studies have since confirmed that lactose adminis­ tration to the colon does indeed lead to a shift in the microbial populations, in particular with increases in bifido­ bacteria [7–10] and lactobacilli popu­ lations [9, 10]. In a four-stage semicontinuous system that modelled re­ gions of the colon, Makivuokko et al. observed that the microbial changes in response to lactose exposure were accompanied by an increase of short chain fatty acids and consequently a lowered pH, an environmental change that was proposed as one mechanism driving the transient change in bac­ terial populations. The specificity of these microbial changes to maldiges­

tion of lactose has been confirmed in two recent intervention studies that demonstrated that the microbiota composition was modulated differen­ tially depending on whether subjects could digest lactose [7, 8]. Notably, milk supplementation was associated with significant increases in actino­ bacteria, Bifidobacterium, Anaerostipe, and Blautia, and a significant decrease in Megamonas but these associations were only observed in the lactose mal­ digesters group [8]. There are several lines of evidence including the bifido­ genic effects described here that justify the suggestion that lactose, in popula­ tions with lactose maldigestion, could be considered a prebiotic (a substrate that is “selectively utilized by host mi­ croorganisms to confer a health ben­ efit” [11]), but this claim is not yet substantiated. The potential for addi­ tional negative health consequences of continued exposure to lactose in those with lactose maldigestion was dis­ cussed in a controversial article on the systemic consequences of lactose intol­ erance [12]; however, the mechanistic evidence to associate such symptoms with lactose intake is currently lacking.

Dietary interventions in lactose ­intolerance and the gut microbiota The total exclusion of lactose from the diet of individuals with lactose mal­ digestion is generally not advised [6], however, it may be considered as part of a wider dietary intervention that eliminates foods that are associated with intolerances. Interestingly, one such intervention led to significant changes in the gut microbiota, includ­ ing decreases in bifidobacteria [13]. In line with dietary guidelines to reduce quantities of lactose ingested in the diet, the capacity of certain bacteria to

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Laktoseverdauung und die Auswir­ kungen auf die Darmflora metabolise lactose can be exploited ex vivo in dairy fermentation. In particu­ lar, yoghurt which is fermented by Lac­ tobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus and Streptococcus thermophilus has a lower lactose content and has been confirmed by EFSA as a product which can improve lactose digestion for indi­ viduals with lactose maldigestion [14].

This effect may be mediated in part by the activity of ß-galactosidase pro­ duced by yoghurt cultures in the small intestine [15]. For these bene­ ficial qualities, yoghurt cultures are recog­ nised as probiotics, live microorgan­ isms that promote the health of the host when administered in adequate quantities [16]. While other probiotic strains have shown some promise for improving lactose tolerance (particu­ larly those strains with ß-galactosidase activity) [17], no other health claims have been substantiated by EFSA to date.

The concept of manipulating the mi­ crobiota composition to improve lac­ tose tolerance has also been explored with prebiotic supplementation. In particular, a recent study showed that a prebiotic formulation of short-chain galacto-oligosaccharides could induce

significant changes of the microbiota composition (with relative increases in Bifidobacterium, Faecalibacterium and Lactobacillus) that were accom­ panied by improved clinical toler­ ance of lactose [18]. The same prebi­ otic is currently being investigated by phase 3 clinical trials for its clinical use in lactose intolerance (ClinicalTri­ als.gov ID: NCT03597516).

Conclusions The gut microbiota is increasingly rec­ ognised as playing a role in the modu­ lation of various states of health and disease [19]. The aforementioned diet­ ary strategies that may be used to man­ age lactose maldigestion (i.e. adapta­ tion of lactose intake, and use of preprobiotics) may lead to a modulation of the microbiota; however, the impact of changing the microbiota of popu­ lations with lactose maldigestion on health outcomes is unclear. Further in­ vestigation in this field is warranted to help better elucidate associations be­ tween diet, disease and an intermedi­ ary role of the microbiota.

Die Laktoseverdauung beim Menschen ist von der ­Aktivität des Enzyms Laktase abhängig. Bei Erwachsenen liegt häufig eine Laktose-Maldigestion aufgrund einer physiologischen Abnahme der Laktase-Expression in der späten Kindheit vor. Eine derartige Störung der Laktoseverdauung kann aufgrund von im Darm vorhandener, unverdauter Laktose und den Produkten ihrer Fermentierung durch Darmbakterien Symptome einer Laktoseunverträglichkeit hervorrufen. A ­ daptive Veränderungen der Darmflora werden mit einer herabgesetzten Laktoseintoleranz assoziiert. Bakterien ­können über ihre Rolle bei der Laktoseverdauung im Darm hinaus auch in Milchprodukten zur «Vorverdauung» der Laktose eingesetzt werden und so die Unverträglichkeitssymptome verringern. Andere ernährungsbasierte Ansätze wie beispielsweise Präbiotika und Probiotika wurden auf ihre Fähigkeit zur Modulierung der Darmflora und der damit verbundenen verbesserten Laktoseverdauung hin untersucht. Die Vorzüge einer solchen Modulierung der Darmflora als Lösung für die Laktose-Maldigestion liegen zwar auf der Hand, allerdings müssen die Auswirkungen derartiger Strategien auf die Gesundheit noch untersucht werden.

Correspondence kathryn.burton@agroscope.admin.ch

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Valentin Scherz 1 , Claire Bertelli 1 , Cristian Palmiere 2 , Franco Taroni 3 , Gilbert Greub 1

Microbiote et médecine forensique: une nouvelle évidence?

L’analyse du microbiote par des techniques de séquençage est en plein essor essentiellement à des fins de recherche, mais les applications diagnostiques impactant positivement la prise en charge du patient restent à développer et à valider. Le Laboratoire de génomique et métagénomique de l’Institut de microbiologie de l’Université de Lausanne au CHUV collabore sur deux nouvelles applications avec l’Ecole des sciences criminelles de l’Université de Lausanne et le Centre universitaire romand de médecine légale (CURML).

L’analyse du microbiote, c’est-à-dire de – Des aspects qualités restent irréso­ tous les microbes d’un milieu donné, lus, liés notamment à la sensibilité par des méthodes basées sur le séquen­ de la méthode à toute contamina­ çage de l’ADN est un concept datant tion [3]. En l’absence de standard des années 1980. L’avènement de mé­ établi, les méthodes et les para­ thodes de séquençage dites de nouvelle mètres utilisés varient, influençant génération (next-generation sequen­ dramatiquement les résultats obte­ cing, NGS) après 2005 a généralisé leur nus. usage en recherche, permettant l’ana­ – Les coûts d’analyse sont en diminu­ lyse à ce jour de centaines de milliers tion mais restent importants. Le trai­ tement et l’interprétation des don­ nées générées nécessitent aussi des infrastructures et des compétences particulières [4].

Dans ce contexte, notre recherche translationnelle vise à implémenter ces technologies pour certaines applica­ tions de routine. Pour ce faire, nous nous sommes associés au CURML et d’échantillons de milieux naturels, ani­ à l’Ecole des sciences criminelles de maux et humains [1]. Différents fac­ l’Université de Lausanne afin de déve­ teurs expliquent pourquoi, malgré le lopper des applications en médecine grand intérêt pour ce type d’analyses, légale et en criminologie. les applications cliniques se font at­ tendre: Médecine légale: support du – Des études ont pu montrer de nom­ ­diagnostic de noyade breuses associations entre maladies Lorsqu’un cadavre est retrouvé im­ et microbiote (obésité, asthme, in­ mergé dans l’eau, les médecins légistes fection à C. difficile). Toutefois, les sont chargés d’évaluer si le décès est résultats sont par ailleurs souvent compatible avec une noyade, ou s’il inconsistants entre les études. De pourrait être consécutif à une autre plus, les preuves de causalité comme cause. Pour ce faire, ces spécialistes celles des bénéfices pour les patients peuvent se reposer sur des observa­ manquent encore [2]. tions cliniques et paracliniques. L’exa­ men paraclinique classiquement évo­ qué est la recherche de diatomées. Ces microalgues unicellulaires sont abon­ 1 Institut de microbiologie, Université de Lausanne dantes dans les eaux et possèdent une et Centre hospitalier universitaire Vaudois (CHUV), paroi cellulaire particulière; les ren­ Bugnon 48, 1011 Lausanne 2 Centre universitaire de médecine légale (CURML), dant résistantes. Leur mise en évidence Université de Lausanne et Centre hospitalier par microscopie dans des prélèvements universitaire Vaudois, ch. de la Vulliette 4, d’organes internes (foie, rate) traités à 1000 Lausanne 3 IEcole des sciences criminelles, Faculté de droit, l’acide témoigne d’une circulation car­ des sciences criminelles et d’administration dio-vasculaire active au moment du publique, Université de Lausanne, quartier passage d’eau dans les voies respira­ UNIL-Sorge, 1015 Lausanne

«L’analyse du microbiote ­pourrait avoir plusieurs autres applications dans le cadre ­médico-légal.»

toires. Cependant, la valeur prédictive imparfaite de ce test motive le dévelop­ pement de méthodes alternatives. La comparaison des bactéries retrouvées dans les organes internes de la victime avec celles de l’eau a été proposée [5].

Cette approche se base sur le même principe que la recherche des diato­ mées mais peut offrir une meilleure sensibilité due à la taille 10 à 100 fois inférieure des bactéries et leur aptitude à se reproduire. Les études publiées re­ posent sur la culture [6], des analyses par des qPCR ciblées [7] et une ana­ lyse du microbiote par métagénomique 16S [8]. Nous avons favorisé cette der­ nière approche qui doit permettre une faible limite de détection et une iden­ tification taxonomique au niveau du genre, voire de l’espèce. Dans notre laboratoire, les premiers résultats ob­ tenus par cette approche sont encou­ rageants. En effet, certaines espèces typiques des milieux aquatiques sont retrouvées dans l’eau ou le poumon de la victime ainsi que dans la rate ou le foie, suggérant la noyade. Toutefois, les techniques devront être optimisées et les divers biomarqueurs de noyade identifiés devront être validés.

Sciences criminelles: identification de suspects L’identification par méthode génétique en médecine légale se fait classique­ ment par amplification et analyse par PCR du polymorphisme des microsa­ tellites du génome. Le profil obtenu sur la scène de crime est comparé aux bases de données ou aux profils des suspects. Cette approche a cepen­ dant des limites: certains échantillons s’y prêtent mal et l’ADN humain dé­ posé peut être insuffisant, mixte ou dégradé, si bien que ce test reste par­

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Mikrobiota und forensische Medizin: ein neues Beweismittel? fois infructueux (9). Une approche par analyse du microbiote pourrait com­ plémenter l’analyse ADN de l’hôte.

En effet, le microbiote de différentes niches corporelles a été décrit comme largement unique à l’individu et rela­ tivement stable dans le temps, for­ mant une sorte d’empreinte person­ nelle [9]. Cette capacité d’identification du microbiote est soutenue par plu­ sieurs études préliminaires où les es­ pèces bactériennes retrouvées sur des objets comme un clavier d’ordinateur ont permis de rétablir les paires entre individus et objets touchés [10]. Cette analyse pourrait aussi aider à établir les faits, par exemple en offrant des in­ formations sur les zones anatomiques en contact avec la victime [9].

Notre équipe a publié une étude d’épreuve de principe (proof of prin­ ciple) où il a été possible de discri­ miner les échantillons salivaires de deux individus sans lien d’apparente­ ment [11]. Cette publication s’inscrit dans le cadre d’une thèse de doctorat en sciences criminelles de notre uni­ versité [12]. Cette hypothèse est actuel­ lement approfondie dans le cadre d’un travail de recherche soutenu par le Fonds national suisse de la recherche scientifique (FNS), qui vise à valider l’approche sur 40 paires de jumeaux monozygotes. Cette expérience vise à la fois le cas le plus difficile, puisque

les jumeaux monozygotes ont un mi­ crobiote plus similaire entre eux que d’autres individus [13] et la validation d’une des applications. En effet, la mé­ thode classique d’analyse de microsa­ tellites ne permet pas de différencier les jumeaux monozygotes, et les mé­ thodes alternatives (recherche de rare variant génétique, analyses de l’épi­ génome) restent expérimentales, com­ plexes et coûteuses [14,15].

Conclusions En plus des deux exemples d’applica­ tions présentés ici, l’analyse du micro­ biote pourrait avoir plusieurs autres applications dans le cadre médicolégal. Ce type d’analyse pourrait par exemple contribuer à la détermina­ tion de la cause du décès dans les cas d’infections ou à la datation de la mort [16]. Les approches par séquen­ çage ont aussi leurs rôles dans l’inves­ tigation de menaces comme le bioter­ rorisme, les fraudes et la transmission ou la mise en circulation volontaire d’agents infectieux [16].

Malgré l’enthousiasme de la commu­ nauté scientifique pour «cet autre moi» qu’est le microbiote et la géné­ ralisation des techniques de séquen­ çage, son analyse ne se fait pas encore en routine clinique. Les premières ap­ plications viendront-elles de la méde­ cine légale ou des sciences criminelles?­

Die Mikrobiota wird in zahlreichen Studien untersucht.

Es soll dabei ein Zusammenhang zwischen dem Vorhandensein von bestimmten Bakterien bzw. deren Anzahl und einer gewissen klinischen Darstellung nachgewiesen werden. Die routinemässige Anwendung dieser Analysen in mikrobiologischen Labors ist jedoch noch sehr begrenzt. Unser Team für Genomik und ­ Metagenomik am Institut für Mikrobiologie der Universität Lausanne im CHUV (Universitätsspital Lausanne) hat sich mit Spezialisten der Rechtsmedizin und der Kriminalwissenschaften zusammengetan, um gemeinsam zwei neue Anwendungsgebiete zu ent­ wickeln. Dabei handelt es sich darum, die Diagnose von Todesfällen durch Ertrinken zu stützen und eine Methode anzubieten, um Menschen anhand biologischer Spuren voneinander zu unterscheiden. Dieser zweite Ansatz könnte sich bei der Unterscheidung eineiiger Zwillinge als nützlich erweisen, da sie auf der Grundlage menschlicher DNA nur sehr schwer zu ­unterscheiden sind.

Les contraintes et les exigences de qua­ lité étant similaires, les travaux de re­ cherche et développement consentis pour les applications présentées ici ser­ viront à la mise en place de tests per­ formants et fiables pour la médecine clinique lorsque les indications auront été précisées et que l’utilité de ces tests aura pu être établie pour certaines in­ dications spécifiques.

Correspondance Gilbert.Greub@chuv.ch

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Claire Bertelli 1 , Gilbert Greub 1

De l’eau potable aux eaux usées: microbiote et antibiorésistance La métagénomique permet d’étudier les communautés microbiennes colonisant les systèmes de distribution d’eau potable ou de traitements des eaux usées, offrant de nouvelles perspectives pour assurer à la population une eau de qualité dans les robinets, les lacs et les rivières.

Les systèmes industriels de potabili­ sation visent à produire une eau de qualité et sûre pour la consomma­ tion courante de la population, tan­ dis que les usines de traitement des eaux usées veillent à diminuer la quan­ tité de bactéries fécales et éliminer au maximum des composants chimiques qui s’y trouvent. Toutefois, ces proces­

«Certains traitements à l’eau semblent plus efficaces que d’autres pour réduire la résistance aux antibiotiques, couramment utilisée en médecine humaine et vétérinaire.» sus industriels sont colonisés par de nombreux micro-organismes, parfois même utilisés pour le traitement de l’eau. Leur composition et leurs carac­ téristiques sont scrutées finement à l’aide des dernières technologies afin de garantir une eau potable de qualité et une eau de lacs et de rivières de qua­ lité acceptable. Une croissance exces­ sive dans les réseaux de distribution d’eau potable peut causer des effets indésirables tels que turbidité de l’eau, goût et odeur désagréables, corrosion ou obstruction des tuyaux.

des eaux. Par exemple, nous avons ré­ cemment étudié l’influence d’un arrêt du système de chloration de l’eau dans les réservoirs de deux villes, en surveil­ lant la quantité de bactéries et les es­ pèces bactériennes présentes dans ces réseaux de distribution d’eau potable (Bertelli et al., 2018). Nous avons pu observer une faible augmentation du nombre de bactéries dans le réseau d’eau, dans un seul endroit parmi les trois étudiés, mais nous avons surtout mis en évidence une augmentation de la diversité des bactéries dans les ré­ seaux à faible concentration de chlore.

Dans les deux villes, la qualité de l’eau est restée excellente, sans augmenta­ tion des bactéries pouvant causer des maladies. Déjà adopté par plusieurs pays, tels que le Danemark et la Hol­ lande, l’absence de chloration d’eau d’origine souterraine dans le réseau de distribution d’eau ne pose pas de pro­ blème majeur (Hambsch et al., 2007).

Une réduction de la chloration, telle qu’étudiée dans ce projet, permettrait de distribuer une eau de qualité, en ré­ pondant à une des principales plaintes des consommateurs: l’odeur et le goût de chlore de l’eau dans certaines villes.

Quel traitement de l’eau est le plus efficace?

Très précise, la métagénomique permet de mettre en évidence les caractéris­ tiques du microbiote, comme l’exis­ tence de gènes codant pour des résis­ A la recherche de l’eau de qualité De nombreux chercheurs se sont tour­ tances aux antibiotiques (Walsh, 2017). nés vers la métagénomique, portée par Il a été suggéré que la chloration de les méthodes actuelles de séquençage à l’eau augmenterait la proportion de haut débit, afin de mettre en évidence bactéries résistantes aux antibiotiques la composition du microbiote et les dans l’eau (Shi et al., 2013). Nous étu­ changements qui suivent une pertur­ dions actuellement l’impact des diffé­ bation dans le système de traitement rents traitements des eaux, usées ou potables, sur la présence d’antibio­ tiques dans le microbiote dans trois 1 Institut de microbiologie, Université de Lausanne ­ pays européens. Certains traitements et Centre hospitalier universitaire vaudois (CHUV), des eaux apparaissent plus efficaces Bugnon 48, 1011 Lausanne

que d’autres pour diminuer les résis­ tances aux antibiotiques communé­ ment utilisés dans la médecine hu­ maine et vétérinaire, laissant princi­ palement des systèmes de résistance non spécifiques par pompe à efflux qui sont communs dans le microbiote environnemental. Récemment, la pré­ sence de gènes de résistance aux an­ tibiotiques, aux métaux lourds et aux biocides a été étudiée dans les usines de traitements des eaux suisses (Ju et al., 2018). Selon l’étude, si globalement la prévalence de gènes codant pour ces résistances diffère peu entre cantons, le traitement de l’eau change drasti­ quement le type de résistances obser­ vées. Finalement, une étude par mé­ tagénomique des gènes de résistance à la tétracycline et aux sulfonamidés, deux antibiotiques parmi les plus utili­ sés en Suisse (Federal Office of Public Health and Federal Food S ­ afety and Veterinary, 2016), dans le lac Léman a suggéré qu’un petit nombre d’espèces du sporobiote pourrait être un vecteur

Définitions Microbiote: ensemble de micro-­ organismes vivant dans un envi­ ronnement donné Métagénomique: étude du matériel génétique de l’ensemble des es­ pèces vivant dans un environne­ ment donné Lyse: destruction de la cellule, ici la bactérie, par un processus phy­ sique ou chimique permettant de relâcher l’ADN et les autres com­ posants cellulaires Sporobiote: fraction de la commu­ nauté bactérienne résistant à un procédé d’extraction du matériel génétique par lyse suffisant pour la majorité des bactéries.

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Vom Trinkwasser zum Abwasser: Mikrobiota und Antibiotikaresistenz References Bertelli, C., Courtois, S., Rosikiewicz, M., Piriou, P., Aeby, S., Robert, S., et al. (2018). Reduced C ­ hlorine in Drinking Water Distribution Systems Impacts Bacterial Biodiversity in Biofilms. Front. M ­ icrobiol. 9, 2520.

10.3389/fmicb.2018.02520.

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Hambsch, B., Böckle, K., and van Lieverloo, J. H. M. (2007). Incidence of faecal contaminations in ­chlorinated and non-chlorinated distribution systems of neighbouring European countries. J. Water Health 5 Suppl 1, 119–30. doi:10.2166/wh.2007.143.

Ju, F., Beck, K., Yin, X., Maccagnan, A., McArdell, C. S., Singer, H. P., et al. (2018). Wastewater t­reatment plant resistomes are shaped by bacterial composition, genetic exchange, and upregulated expression in the effluent microbiomes. ISME J., 1. doi:10.1038/s41396-018-0277-8.

Paul C, Bayrychenko Z, Junier T, Filippidou S, Beck K, Bueche M, Greub G, Bürgmann H, Junier P. Dissemination of antibiotic resistance genes associated with the sporobiota in sediments impacted by ­wastewater. PeerJ. 2018 Jun 20;6:e4989.

Shi, P., Jia, S., Zhang, X.-X., Zhang, T., Cheng, S., and Li, A. (2013). Metagenomic insights into c ­ hlorination effects on microbial antibiotic resistance in drinking water. Water Res. 47, 111–120. doi:10.1016/j.­ watres.2012.09.046.

Walsh, F. (2017). «Functional Metagenomics and Antimicrobial Resistance», in Functional M ­ etagenomics: Tools and Applications, eds. T. Charles, M. Liles, and A. Sessitsch (Cham: Springer I­nternational Publishing), 243–253. doi:10.1007/978-3-319-61510-3_14.

dans la dispersion à long terme de ces résistances (Paul et al, 2018).

L’application de la métagénomique pour étudier ces processus industriels de traitement de l’eau peut permettre, à terme, d’optimiser les stratégies afin de fournir à la population une eau de meilleure qualité, correspondant aux normes de sécurité en vigueur.

De plus, l’étude des communautés mi­

crobiennes et de leur composition en gènes de résistance aux antibiotiques permettra de mieux comprendre les mécanismes leur permettant de rester présent et de se disperser sur de lon­ gues périodes.

Industrielle Wasseraufbereitungssysteme zielen darauf ab, qualitativ hochwertiges Trinkwasser herzustellen, das die Bevölkerung tagtäglich sicher trinken kann. Abwasseraufbereitungsanlagen versuchen hingegen, die Menge an Fäkalbakterien zu reduzieren und chemische Stoffe im Abwasser weitestgehend zu eliminieren. In diesen industriellen Verfahren kommen ­jedoch zahlreiche Mikroorganismen zum Einsatz, die gelegentlich sogar zur Wasserbehandlung angewendet werden. Ihre Zusammensetzung und ihre Eigenschaften werden mithilfe neuester Technologien gründlich untersucht, um hochwertiges Trinkwasser zu garantieren und das ­ Wasser in Seen und Flüssen auf eine akzeptable Qualität zu bringen. Die Anwendung der Meta­ genomik bei der Untersuchung dieser industriellen Verfahren zur Wasseraufbereitung kann letztlich eine Optimierung der Strategien ermöglichen, sodass der Bevölkerung ein Trinkwasser von besserer Qualität zur Verfügung g ­ estellt werden kann, das den geltenden S ­ icherheitsnormen entspricht. Zudem erlaubt die Untersuchung von mikrobiellen Gemeinschaften und d ­ eren Zusammensetzung an antibiotikaresistenten ­Genen ein besseres Verständnis der Mechanismen, die es ­ihnen ermöglichen, bestehen zu bleiben und sich über lange Zeiträume weiter auszubreiten.

Correspondance Gilbert.Greub@chuv.ch

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Pilar Junier 1 , Christophe Paul 1 , Thomas Junier 1, 2

Le microbiote du sédiment: une approche novatrice pour tracer la c ­ onsommation ­passée d’antibiotiques La découverte des antibiotiques comme moyen de lutte contre les infections bactériennes fait ­partie des grands succès médicaux du XXe siècle. La pénicilline a été d’une telle importance pour ­l’humanité qu’elle a conduit à l’octroi de deux Prix Nobel, d’abord à l’équipe responsable de sa ­production (1945, Prix Nobel de médecine), ensuite à la chimiste ayant élucidé sa structure (1964, Prix Nobel de chimie).

Grace aux antibiotiques …

la science. Nous pouvons encore au­ jourd’hui en tirer de nombreux en­ seignements: l’importance des décou­ vertes inattendues et celle de la com­ munication avec le grand public dans le domaine scientifique, le rôle des interactions biologiques dans l’émer­ gence de phénomènes complexes, la valeur ajoutée du travail interdiscipli­ naire, la place centrale de l’écologie chimique dans l’intégration des diffé­ rents niveaux biologiques, ou encore celle de la sélection naturelle dans l’évolution microbienne, entre autres.

Pour toutes ces raisons, la recherche de solutions à la crise actuelle des an­ tibiotiques pourrait bénéficier d’un re­ gard critique et intégratif sur le passé.

La résistance à un antibiotique peut apparaître spontanément, mais il est généralement accepté qu’une telle ré­ sistance engendre un coût évolutif im­ portant pour l’organisme. Par consé­ nace sur l’avenir de l’humanité, d’au­ quent, une augmentation de la fré­ tant plus que la mise sur le marché de quence des résistances est associée à nouveaux agents thérapeutiques s’est une forte pression de sélection, par fortement ralentie ces dernières an­ exemple via l’augmentation de l’utilisa­ nées. La résistance croissante des orga­ tion d’un antibiotique donné (Bengts­ nismes soulève également la question son-Palme et al. 2018). On s'attend par de leur dissémination et leur destin en­ conséquent à une augmentation de la vironnemental; les transferts entre mi­ fréquence des gènes de résistance dé­ crobiome humain et environnements tectés tant dans les milieux hospitaliers naturels et réciproquement, et les que naturels, liée à l’historique d’uti­ échanges de gènes entre organismes lisation. De nombreux indices confir­ pathogènes et environnementaux. ment une telle augmentation dans les milieux hospitaliers, mais ils sont plus Profiter du passé rares dans le cas des milieux naturels.

L’histoire de la découverte de la péni­ Etudier l’effet de l’utilisation des anti­ cilline est un exemple fascinant pour biotiques sur le réservoir environne­ mental de gènes de résistance au cours du temps pose un certain nombre de 1 Laboratoire de microbiologie, Université de problèmes méthodologiques. L’étude Neuchâtel des communautés bactériennes envi­ 2 Vital-IT, Institut suisse de bioinformatique D’importantes avancées dans divers traitements médicaux ont été ren­ dues possibles grâce aux antibiotiques (Marti et al. 2014). Malheureusement, ce succès est actuellement éclipsé par l’augmentation de la fréquence des micro-organismes résistants aux trai­ tements. L’émergence et la multipli­ cation d’organismes résistants à la plupart des agents thérapeutiques cou­ ramment utilisés fait planer une me­

«Un inventaire incluant des ­marqueurs pour différentes ­classes d’antibiotiques permettrait de mieux évaluer le ­réservoir environnemental de gènes de résistance.»

ronnementales inclut des méthodes métagénomiques, c’est-à-dire en ana­ lysant le matériel génétique (ADN) ex­ trait d’échantillons environnementaux.

Dans le cas d’échantillons anciens, un des problèmes principaux consiste à trouver des échantillons naturels da­ tables suffisamment bien conservés, ayant subi un minimum de modifi­ cations/dégradation suite à leur for­ mation. Ces conditions sont remplies par exemple par deux séries de sols récoltés au Pays-Bas et au Danemark sur plusieurs années. Ces sols ont per­ mis de mettre en évidence une corré­ lation entre l’utilisation passée d’anti­ biotiques et l’augmentation de la fré­ quence des gènes de résistance, dans deux études indépendantes (Graham et al. 2016; Knapp et al. 2010).

La recherche aux archives ­naturelles Récemment, nous avons utilisé des carottes de sédiments pour démon­ trer comment ces archives naturelles peuvent contribuer à l’étude passée des résistances aux antibiotiques. Les sé­ diments se forment par couches suc­ cessives (dépôt de matière minérale­ et ­ organique). Ils constituent des ar­ chives environnementales chronolo­ giques ans lesquelles s’accumulent des marqueurs chimiques et biologiques qui peuvent par la suite être récupé­ rés et analysés (Thevenon et al. 2012).

L’utilisation de sédiments n’est pas sans faille car ces signaux biologiques ne se préservent pas de la même façon pour tous les organismes. Pour cette raison, des études actuelles ciblent l’ADN extrait à partir de structures de survie (spores) produites par certaines

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bactéries, structures résistantes à la dégradation favorisant leur préserva­ tion (Wunderlin et al. 2014a; Wunder­ lin et al. 2016; Wunderlin et al. 2014b).

La fréquence de gènes de résistance a été mesurée à partir de l’ADN extrait de ces spores. Avec cette méthode, l’ana­ lyse de sédiments du lac Léman, datant de 1920 à 2015, a mis en évidence une corrélation entre l’utilisation médicale de deux antibiotiques (la tétracycline et la sulfonamide) et la fréquence de gènes conférant la résistance à chacun de ces antibiotiques. De plus, un lien entre l’augmentation de la fréquence des gènes de résistance et des change­ ments dans la structure des commu­ nautés microbiennes a pu être établi (Madueno et al. 2018). L’augmentation de la fréquence du marqueur tet(W), un déterminant conférant la résistance à la tétracycline, a pu être reliée à une augmentation de l’abondance relative des firmicutes, un groupe de bactéries parmi les plus abondantes du micro­ biome humain (Browne et al. 2016).

Un tel lien suggère un fort impact an­ thropique et soutient la thèse d’un lien entre consommation d’antibiotiques et augmentation du réservoir environne­ mental de gènes de résistance.

tions micro­­biennes indésirables (Tay­ lor et al. 2011). La grande diversité des espèces bactériennes et fongiques les produisant, ainsi que leur implication dans la communication intra- et inter­ spécifique (Goh et al. 2002), suggèrent que ces molécules ont un rôle très im­ portant dans l’évolution des commu­ nautés microbiennes (Martinez 2008).

De nombreuses questions restent en­ core ouvertes. Un lien a pu être établi entre l’utilisation d’antibiotique en mé­ dicine humaine, la fréquence de gènes de résistance, et la structure de la com­ munauté bactérienne, dans un lac su­ bissant une forte pression anthro­ pique. Mais qu’en est-il des milieux naturels moins affectés par les activités humaines? A l’heure actuelle, nos re­ cherches se sont limitées à deux gènes de résistance, mais un inventaire in­ cluant des marqueurs pour différentes classes d’antibiotiques, ou fait à partir de la reconstruction de génomes envi­ ronnementaux, permettrait de mieux évaluer le réservoir environnemental de gènes de résistance. Finalement, l’impact écologique de ces structures de survie, dont l’activité métabolique est réduite, ainsi que leur rôle dans la dissémination et la transmission des gènes de résistance, restent à déter­ Gardez un œil sur la grande image miner. Ce point devrait être abordé Une vision écologique du rôle des par des expériences de ressuscitation anti­ biotiques nous offre aujourd’hui (ou réactivation) et d’évolution en une représentation plus complexe de ­laboratoire. ces mo­ lécules que comme simples Correspondance agents d’anéantissement des popula­ Pilar.Junier@unine.ch

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Sedimentmikrobiota: neuartiger Ansatz zur Rückverfolgung der Antibiotikaeinnahme in der Vergangenheit

Die Entdeckung von Antibiotika und deren Verwendung im Kampf gegen Infektionskrankheiten stellt e ­ inen ­ der bedeutendsten Erfolge in der Geschichte der medizinischen Mikrobiologie dar. Bedauerlicherweise hat der teilweise missbräuchliche und gedankenlose Einsatz, insbesondere in der Lebensmittelindustrie und zu präventiven Zwecken, unausweichlich zur Herausbildung resistenter Mikroorganismen geführt. Seit Beginn ­ der Verwendung von Antibiotika hat die Verbindung zwischen Medizin und Natur zu einer «evolutionären Erfahrung» geführt, mit der niemand gerechnet hatte.

Eine Untersuchung der Ergebnisse aus dieser Erfahrung der Vergangenheit könnte zur Entwicklung und Umsetzung einer globalen Strategie beitragen, mit der künftig der Einsatz von Antibiotika besser in den Griff zu bekommen ist.

Bibliographie Bengtsson-Palme J, Kristiansson E, Larsson DGJ (2018) Environmental ­factors influencing the development and spread of antibiotic resistance. FEMS Microbiol Rev 42(1) doi:10.1093/femsre/fux053 Browne HP, Forster SC, Anonye BO, Kumar N, Neville BA, Stares MD, G ­ oulding D, Lawley TD (2016) Culturing of 'unculturable' human micro­biota reveals novel taxa and extensive sporulation. Nature 533(7604):543-6 doi:10.1038/nature17645 Goh EB, Yim G, Tsui W, McClure J, Surette MG, Davies J (2002) Transcriptional modulation of bacterial gene expression by subinhibitory concentrations of antibiotics. Proc Natl Acad Sci U S A 99(26):17025–30 doi:10.1073/ pnas.252607699 Graham DW, Knapp CW, Christensen BT, McCluskey S, Dolfing J (2016) ­Appearance of -lactam Resistance Genes in Agricultural Soils and Clinical Isolates over the 20th Century. Scientific Reports 6:21550 doi:10.1038/srep21550 Knapp CW, Dolfing J, Ehlert PAI, Graham DW (2010) Evidence of Increasing Antibiotic ß-Resistance Gene Abundances in Archived Soils since 1940. ­Environmental Science & Technology 44(2):580–587 doi:10.1021/es901221x Madueno L, Paul C, Junier T, Bayrychenko Z, Filippidou S, Beck K, Greub G, Burgmann H, Junier P (2018) A historical legacy of antibiotic utilization on bacterial seed banks in sediments. PeerJ 6:e4197 doi:10.7717/peerj.4197 Marti E, Variatza E, Balcazar JL (2014) The role of aquatic ecosystems as ­reservoirs of antibiotic resistance. Trends Microbiol 22(1):36–41 doi:10.1016/ j.tim.2013.11.001

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Martinez JL (2008) Antibiotics and antibiotic resistance genes in natural ­environments. Science 321(5887):365-7 doi:10.1126/science.1159483 Taylor NG, Verner-Jeffreys DW, Baker-Austin C (2011) Aquatic systems: ­maintaining, mixing and mobilising antimicrobial resistance? Trends Ecol Evol 26(6):278–84 doi:10.1016/j.tree.2011.03.004 Thevenon F, Adatte T, Wildi W, Pote J (2012) Antibiotic resistant bacteria/ genes dissemination in lacustrine sediments highly increased following c ­ ultural eutrophication of Lake Geneva (Switzerland). Chemosphere 86(5):468–76 doi:10.1016/j.chemosphere.2011.09.048 Wunderlin T, Corella J, Junier T, Bueche M, Loizeau J-L, Girardclos Sp, Junier P (2014a) Endospore-forming bacteria as new proxies to assess ­impact of eutrophication in Lake Geneva (Switzerland-France). Aquat Sci 76(1):103–116 doi:10.1007/s00027-013-0329-0 Wunderlin T, Junier T, Paul C, Jeanneret N, Junier P (2016) Physical Isolation of Endospores from Environmental Samples by Targeted Lysis of Vegetative Cells. J Vis Exp(107) doi:10.3791/53411 Wunderlin T, Junier T, Roussel-Delif L, Jeanneret N, Junier P (2014b) ­Endospore-enriched sequencing approach reveals unprecedented diversity of Firmicutes in sediments. Environ Microbiol Rep 6(6):631-9

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Gilbert Greub 1

Sur les traces d’Hannibal En 218 avant J.-C., Hannibal de Carthage était à la tête de l’armée punique et a envahi l’Italie à p ­ artir du bassin du Rhône en traversant les Alpes avec des milliers de chevaux, beaucoup d’éléphants­ et un nombre considérable de soldats (réf. 1). Cependant, la route qu’a empruntée Hannibal de­ Carthage reste peu claire.

Le col de la Traversette Certains historiens ont suggéré qu’Hanni­ bal est passé par la Suisse au niveau du col du St-Bernard. Le col du MontCenis ou le col Clapier ont également été envisagés. D’autres historiens ont considérés qu’Hannibal aurait pu tra­ verser le col au niveau de la Traver­ sette, qui est un col de relativement basse altitude (~2800 m). Des indices historiques sont compatibles avec cette hypothèse, dont notamment (i) la no­ tion qu’Hannibal n’avait que peu de temps pour traverser les Alpes avant l’hiver et ne serait donc pas passé trop au nord, (ii) que ses soldats ont bi­ vouaqué près du col sur un sol gelé et (iii) que des chutes de pierres obs­ truaient partiellement leur chemin, li­ mitant l’avancement de l’armée d’Han­ nibal (1). Dans un article que je résume ci-dessous, Mahaney et ses collègues ont identifié une large zone relative­ ment plate et herbeuse, 425 mètres audessous du col de la Traversette. Cette zone herbeuse permettait de nourrir les chevaux. De plus, cet endroit comp­ tait aussi un vaste point d’eau pour abreuver les soldats, les chevaux et les éléphants.

avec une abondance de matière fécale puisque cet acide biliaire se retrouve dans les selles des mammifères). De plus, entre 40 et 50 cm de profondeur, les analyses effectuées par Mahaney et collaborateurs démontraient égale­ ment un pic de certains pollens de plantes inhabituelles à cette altitude (Cyperaceae), pic qui pourrait s’expli­ quer par le fait que de nombreux che­ vaux ont brouté des herbes chargées de pollen, entraînant une certaine ac­ cumulation de pollen à l’endroit où ces équidés ont déféqué.

Afin de confirmer leur hypothèse, Ma­ haney et collaborateurs ont effectué des analyses de métagénomique au ni­ veau des différents échantillons de sol.

A nouveau, un pic significatif de firmi­ cutes et de clostridia fut observé dans la carotte présente entre 40 et 45 cm de profondeur. Les firmicutes se trou­ vaient également en quantité significa­ tive dans les zones plus profondes.

Interprétation des résultats La présence à la fois de taux élevé de biomarqueurs fécaux (acide désoxy­ cholique) et l’abondance de gènes co­ dant pour l’ARN 16S des bactéries de la classe des Clostridia suggère que les sédiments étudiés par Mahaney et ses collaborateurs contenaient effecti­ vement une large quantité de matière ­fécale environ 40 cm sous terre. C’est un excellent exemple d’une analyse de microbiologie qui permet d’appuyer des hypothèses basées sur des faits his­ toriques et sur des analyses d’autres biomarqueurs.

Cependant, cet article mérite quelques commentaires. Tout d’abord, avec les années, l’ADN peut se dégrader consi­ dérablement, ce qui peut expliquer la forte proportion d’ADN de firmicutes et de bacteroïdes dans les couches profondes (entre 40 et 55 cm). Il au­ rait pu être intéressant de faire cette analyse du microbiote avec plusieurs

Analyse du sol et analyses ­métagénomiques Mahaney et ses collaborateurs ont pré­ levés des échantillons du sol à diffé­ rentes profondeurs (chaque 10 cm de 5 à 55 cm de profondeur). Ces échan­ tillons ont été datés au carbone 14, et la période correspondant à la traver­ sée des Alpes par l’armée d’Hannibal de Carthage, 218 années avant J.-C., correspondait à environ 40 cm de pro­ fondeur. Une analyse plus poussée a montré un pic d’acide désoxycholique à 40 cm de profondeur (compatible Figure 1. Caricature de la mode actuelle d’analyser le «microbiote des selles». Outre

1 Institut de microbiologie, Université de Lausanne et Centre hospitalier universitaire vaudois (CHUV), Bugnon 48, 1011 Lausanne

une ­critique du «tout métagénomique», cette caricature de Debra Bühlmann souligne à la fois l’opportunité offerte par les matières fécales comme approximation de la composition microbienne au niveau intestinal et l’importance d’utiliser sur certains échantillons ­précieux d’autres techniques d’investigation microbiologiques, dont la m ­ icroscopie ou la culturomique.

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types d’extractions différents, ainsi qu’avec une approche extrayant spé­ cifiquement l’ADN de bactéries spo­ rulées, afin de pouvoir préciser la ro­ bustesse de ces résultats d’analyses de microbiote dans les sédiments. D’autre part, l’analyse de fragments courts du gène 16S ne permet pas d’identifier les bactéries au niveau de l’espèce, voire même au niveau du genre. Ainsi, bien qu’il est probable que l’hypothèse des auteurs soit correcte et que ces clostri­ dies soient en effet des bactéries d’ori­ gine digestive et du genre Clostridium, de nombreuses bactéries de la famille des Clostridiaceae ne sont pas forcé­ ment associées au tractus digestifs des mammifères et pourraient s’être accu­ mulées à ce niveau pour d’autres rai­ sons.

Comme le montre le tableau 1, la fa­ mille des Clostridiaceae comprend de nombreux genres bactériens. De plus, la présence de la famille des Clostri­ diaceae ne donne pas de certitude quant à l’origine fécale de ces bac­ téries, puisque certains membres du genre Clostridium (tel que Clostridium tetanii) sont des germes telluriques. Au vu de la masse d’analyses effectuées dans ce projet, ainsi que de l’intérêt des historiens et du grand public pour cette thématique, il est dommage que les analyses ­ microbiologiques n’aient

Clostridiaceae Alkaliphilus Anaerosalibacter Anaerosolibacter Anoxynatronum Brassicibacter Butyricicoccus Caldanaerocella Caldisalinibacter Caloramator Caloranaerobacter Caminicella Candidatus Arthromitus Cellulosibacter Clostridiisalibacter Clostridium Fervidicella Fonticella Geosporobacter Haloimpatiens

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pas inclus des gènes plus discriminants (gltA, rpoB, …) afin de préciser au ni­ veau du genre et de l’espèce les bacté­ ries retrouvées à cet endroit, à 40 cm de profondeur. D’autre part, il aurait été intéressant que l’analyse métagéno­ mique présentée dans cet article ne se limite pas à une analyse taxonomique basée sur le 16S mais qu’elle présente également une analyse de la propor­ tion des bactéries présentes aux diffé­ rentes couches selon (i) leur écologie (bactéries du tube digestif des mam­ mifères ou bactéries du sol) et (ii) leur rapport à leurs relations à l’oxygène (bactéries anaérobes ou non). E ­ nfin, il aurait pu être intéressant de décrire le microbiote retrouvé à 40 cm de pro­ fondeur par rapport à ses compétences biochimiques globales (résistance aux selles biliaires, capacité de fermenta­ tion, présence de catalase, de supe­ roxide dismutase, d’uréase, …). Ainsi une analyse de métagénomique shot­ gun de ces échantillons aurait été par­ ticulièrement intéressante.

analyse du microbiote effectuée par des spécialistes d’une autre discipline, qui rapportent leurs données (i) sans une connaissance poussée des limites des méthodes appliquées (par exemple, les effets majeurs des bases de don­ nées, des pipelines bio-informatiques utilisées et des méthodes d’extraction telles que décrites par Greub, Rosi­ kiewicz et Bertelli dans un autre article de ce numéro spécial [2]), (ii) parfois sans s’associer avec des microbiolo­ gistes et (iii) par conséquent sans es­ sayer de comprendre ces communau­ tés microbiennes également en termes écologique et métabolique.

A l’avenir, les nouvelles techniques de séquençage à haut débit offrent des op­ portunités uniques à la communauté des microbiologistes, mais il est im­ portant que les chercheurs de tous azi­ muts qui courent derrière le nouveau «graal», l’analyse des selles par séquen­ çage à haut débit (Figure 1), soient ­aidés de microbiologistes, afin de tirer le meilleur parti d’échantillons souvent précieux.

Conclusion Pour conclure, l’étude de Mahaney et Correspondance Gilbert.Greub@chuv.ch collaborateurs, passionnante en termes d’archéométrie et d’impact historique, aurait bénéficié du regard d’un micro­ biologiste. De manière plus générale, cet article est un bon exemple d’une

Hathewaya Hungatella Keratinibaculum Lactonifactor Linmingia Lutispora Natronincola Oceanirhabdus Oxobacter Proteiniclasticum Salimesophilobacter Sarcina Sporosalibacterium Thermobrachium Thermohalobacter Thermotalea Tindallia Youngiibacter unclassified Clostridiaceae

References

www.ncbi.org

Tableau 1. Membres de la famille des Clostridiaceae. Notez la grande biodiversité qui inclut des espèces telluriques (sol), des espèces associées à des environnements aquatiques et des espèces typiquement associées à la flore fécale. Liste obtenue du site «taxonomy» du NCBI.

1. W. C. Mahaney, C. C. R. Allen, P. Pentlavalli, A. Kulakova, J. M. Young, R. W. Dirszowsky, A. West, B. Kelleher, S. Jordan, C. Pulleyblank, S. O'Reilly, B. T. Murphy, K. Lasberg, P. Somelar, M. Garneau, S. A. Finkelstein, M. K. Sobol, V. Kalm, P. J. M. Costa, R. G. V. Hancock, K. M. Hart, P. Tricart, R. W. Barendregt, T. E. Bunch, M. W. Milner. Biostratigraphic Evidence Relating to the Age‐ Old Question of Hannibal's Invasion of Italy, II: Chemical Biomarkers and Microbial Signatures. Archaemotry 2017; 59 (1): 179– 190.

2. Greub G, Rosikiewicz M et Bertelli C. Analyse du microbiote dans un laboratoire diagnostic: définition, application et aspect qualité. Pipettes 2018, november, this issue.

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Gilbert Greub 1 , Stefan Kunz 1

Congrès annuel de la Société suisse de microbiologie (SSM) 2018 Le congrès de la Société suisse de microbiologie a eu lieu du 28 au 30 août 2018. Ce congrès ­co­organisé par Stefan Kunz et Gilbert Greub avec l’aide de Sabine Gisler et Nicole Giacomini de Meeting.com a été une superbe opportunité d’échanger entre collègues microbiologistes, et avec d’autres scientifiques de domaines proches. Ce fut aussi l’occasion de découvrir de nouvelles technologies permettant de détecter et/ou d’identifier des microbes et de discuter leur possible impact clinique. De plus, les participants au meeting ont pu échanger sur de récentes découvertes permettant de mieux comprendre la biologie des microbes et leur évolution ainsi que l’impact sur la bio­ logie des micro-organismes.

Le premier jour de meeting, dédié à des sujets propres à chacune des cinq sec­ tions scientifiques de la Société suisse de microbiologie (microbiologie de l’en­ vironnement, biologie des procaryotes, microbiologie médicale, mycologie, viro­ logie), a représenté une opportu­ nité unique pour les étudiants en thèse de science de présenter leurs travaux.

Après ce symposium scientifique satel­ lite qui a eu lieu en parallèle dans cinq auditoires, et qui était sponsorisé par l’Académie suisse des sciences natu­ relles (SCNAT), le congrès de la SSM a officiellement débuté par l’assemblée gé­ nérale. Ensuite, une session «communi­ cation grand public» sous la forme d’un concours «Engage your audience» pour étudiant-e-s en thèse de sciences a eu lieu. Quatre é­tudiants-e-s ont présenté leur projet de thèse, tous avec brio et en moins de 180 secondes. Les lauréats de ce concours (Inès Cordeiro Filipe, Florian Tagini, Stefano Léo et Virginie Grosboillot) figurent en photo ci-des­ sus avec les principaux organisateurs de cette session, Massimo Caine, Karl Per­ ron et les membres du jury, Darcy Chris­ ten, Marc Creus et Victor Cid. Notons la générosité de BioMérieux, que nous re­ mercions par ces lignes et qui a financé les prix de ce concours «communica­ tion grand public» en plus des trois prix posters. Ensuite, pendant les deux jours suivants, des sujets aux frontières de ces différentes sections ont été dévelop­ pés, incluant, par exemple, la biologie cellulaire, les bactériophages, l’immu­ nité innée et adaptative, l’évolution mi­

1 Institut de microbiologie, Université de Lausanne et Centre hospitalier universitaire vaudois (CHUV), Bugnon 48, 1011 Lausanne

crobienne, la génomique bactérienne, la métagénomique, la qualité de l’eau, les vecteurs et infections zoonotiques, la pathologie microbienne, la pathoge­ nèse, … Parmi les 45 oratrices et ora­ teurs invités, mentionnons par exemple Sandra Jeudy (Marseille) et ses travaux sur de nouveaux virus géants, Steven Ball (Lille) et son intérêt pour le glyco­ gène et l’histoire évolutive des enzymes microbiennes impliquées dans la bio­ synthèse des sucres. Que de souvenirs!

Mentionnons aussi la séance de com­ munication grand public qui a permis aux participants de découvrir quelques projets suisses, ainsi que les projets dé­ veloppés en Espagne et présentés avec passion par Victor Cid (Madrid); notam­ ment la culture microbienne faite par des écoliers ou les contes pour enfants rédigés par des microbiologistes espa­ gnols et réunis dans un recueil. Outre les orateurs invités, les oraux sélection­ nés à partir des «abstracts» furent l’oc­ casion d’observer le dynamisme de la recherche en microbiologie en Suisse.

Pour la première fois, certains de ces oraux furent primés (Nina Vesiel en microbiologie clinique, Philip Vkov­ ski en virologie, Marion Müller en my­ cologie, Diago Tavares en microbiolo­ gie de l’environnement et Erik Bakke­

ren dans le domaine de la biologie des procayrotes). Cependant, avec plus de­ 200 soumissions de résumés de projets originaux, certains ont dû être présen­ tés sous format poster, ce qui a permis à leur auteur de participer au concours du meilleur poster; trois prix (sponsori­ sés par BioMérieux) ont été remis, res­ pectivement à Noémie Matthey, Mar­ tin Schäfer et Christophe Paul. Outre les sessions scientifiques, le congrès de la SSM fut aussi l’occasion de décou­ vrir de nouveaux outils présentés par­ 25 firmes différentes, sur des stands par­ fois impressionnants en taille et présen­ tant les technologies les plus récentes utilisées en microbiologie diagnostic ou dans le domaine de la recherche fonda­ mentale. Merci aux firmes présentes.

L’assemblée annuelle de la Société suisse de microbiologie fut agrémen­ tée de la visite du Musée olympique, privatisé en soirée et ouvert spécifique­ ment pour les congressistes. La soirée se poursuivit au musée olympique avec un apéritif et le repas de gala.

En résumé, un congrès passionnant, qui nous fait attendre avec impatience sa version 2019, organisée par Hubert Hilbi à Zurich les 3 et 4 septembre 2019.

Correspondance Gilbert.Greub@chuv.ch

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ED N EW UC SA T I O N

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Gilbert Greub 1 , Carole Kebbi 1

KROBS: un jeu innovant sur les microbes Jouer est un moment unique de partage et d’interaction qui pour la plupart d’entre nous nous­ rappelle les moments magiques de notre enfance. En effet, les jeux sont largement présents dans l’univers des enfants, leur permettant de se développer à la fois en termes de compétences et de savoir-être.

Le jeu KROBS est un jeu innovant per­ mettant de développer la conscience du grand public sur certains p ­ athogènes et bien qu’accessible aux enfants dès 8 ans, il plaît aussi aux adultes et sert d’ailleurs de soutien à l’enseignement à l’école supérieure de la santé et à l’école de médecine.

Ce jeu a été créé dans le but d’une part de générer l’intérêt de tous pour ce thème et d’autre part pour trans­ mettre un certain nombre de messa­ ges préventifs incluant, par exemple, lors de balades dans les hautes her­ bes, le port de pantalons longs dans les chaussettes afin de réduire les risques d’exposition aux tiques. A ce jeu mo­ derne et drôle, nous avons intégré des codes QR qui permettent de rediriger les joueurs, s’ils le souhaitent, sur un

site internet pour y obtenir des infor­ mations détaillées sur les 20 microbes présentés dans le jeu.

Ce jeu est basé sur le principe sim­ ple que dans la vie, il faut faire tou­ tes sortes d’activités pour vivre heu­ reux, dont par exemple voyager, se promener en forêt, prendre un bon repas, faire une activité sportive (ski nautique, par exemple), se baigner ou prendre une douche. Certaines de ces activités peuvent induire un risque tel que la malaria lors d’un voyage, l’acquisition de la maladie de Lyme par l’exposition aux tiques lors des bala­ des en forêt ou l’exposition à des légio­ nelles ou des mycobactéries atypiques lors d’expositions à de l’eau. Le but du jeu consiste pour les joueurs à réaliser un maximum d’activités, pouvant pour

certaines les exposer à différents mi­ crobes. Lors de ces activités considé­ rées «à risque» dans le jeu, les autres joueurs peuvent infliger une morsure de tique ou une toxi-infection alimen­ taire, voire une infection par un agent de zoonose à son adversaire.

Apprendre en jouant Ainsi, en jouant avec le jeu KROBS et en ayant du plaisir, les joueurs vont se retrouver dans diverses situations de la vie quotidienne et apprendre les com­ portements dénués de risques et ceux les exposant à certains pathogènes. Les différents modes de transmission dont les morsures de tiques, les contacts avec les animaux, l’exposition aux aérosols, l’exposition alimentaire et l’exposition à des arthropodes vecteurs lors de vo­

Figure 1. Le jeu KROBS. Ce jeu pour deux à quatre joueurs peut être joué dès l’âge de 8 ans et dure environ 15 minutes. Notez en haut les cartes activités qui permettent aux joueurs d’accumuler des points et les rapprocher de la victoire et en bas les cartes maladies qui mentionnent le nombre de jetons temps (semaines) pendant lesquelles le joueur restera malade. Ici l’exemple des microbes de la forêt (cartes vertes, transmises par les tiques), des microbes de l’eau (cartes bleues) et des zoonoses (cartes brunes). Sur ces cartes maladies, les modalités de transmission, le nom de la bactérie en cause et son apparence sont représentés.

1 Institut de microbiologie, Université de Lausanne et Centre hospitalier universitaire vaudois (CHUV), Bugnon 48, 1011 Lausanne

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KROBS: ein innovatives Spiel über Mikroben yages sont représentés dans le jeu par des couleurs spécifiques. Pour chaque modalité de transmission, nous avons identifié, arbitrairement, quatre micro­ bes, principalement des bactéries mais parfois également des virus ou des pa­ rasites.

Des informations complémentaires sur les 20 microbes présentés dans le jeu permettent d’en apprendre plus sur les réservoirs, les risques d’infection, les modalités préventives, les symp­ tômes et les traitements éventuels de ces microbes grâce à des codes QR im­ primés sur les cartes, qui redirigent ­directement aux pages spécifiques du site internet www.krobs.ch. L’un des avantages de fournir cette information scientifique sur un site web est la ca­ pacité d’adaptation chaque fois que de nouvelles données sont disponibles, et également le fait de ne pas surcharger le jeu afin qu’il reste ludique simple­ et accessible aux enfants dès l’âge de­ 8 ans. Ainsi Krobs est un jeu qui de­ vrait permettre de transmettre des in­ formations sur des microbes patho­ gènes et des messages de prévention.

Ce jeu et son site internet dédié a été développé par l’un des éditeurs du

journal «pipette», le professeur Greub, directeur de l’Institut de Microbiologie de l’Université de Lausanne. Pour ce projet, initié en 2015, il a eu l’aide de trois spécialistes de la création de jeu: Malcolm Braff, Bruno Cathala et Sé­ bastien Pauchon. Par ailleurs, le pro­ fesseur Greub a bénéficié des illus­ trations de Vincent Dutrait, un des­ sinateur spécialiste des illustrations ludiques, ainsi que de l’appui scienti­ fique de Carole Kebbi.

Correspondance Gilbert.Greub@chuv.ch

Spielen ist ein einzigartiger Moment des Austauschs und der Interaktion, der die meisten von uns an ihre magischen Momente der Kindheit erinnert. In der Welt der Kinder sind Spiele weit verbreitet, sie lehren uns Reaktionsfähigkeit und Geschwindigkeit oder fördern strategische Aspekte und bringen neues Wissen ein.

In gleicher Weise werden durch die Einhaltung der Regeln und durch den gegenseitigen Respekt zwi­ schen den Spielern die Vermittlung wichtiger Werte wie Loyalität, Ehrlichkeit oder Solidarität gefördert.

KROBS ist ein innovatives Spiel, das für bestimmte Krankheitserreger sensibilisiert und den Unterricht an Gesundheitsschulen unterstützt. Das Spiel wurde entwickelt, um das Interesse an diesem spannenden und wichtigen Thema zu wecken. Spielerisch lernt man, dass beispielsweise das Tragen langer Hosen und Socken während Spaziergängen im hohen Gras das ­Risiko einer Zeckenexposition verringert. Die integrierten QR-Codes geben auf Wunsch detaillierte Informationen zu den 20 im Spiel vorgestellten Mikroben sowie zu deren Risiken und darüber, wie man sich am besten davor schützen kann. Ziel des Spiels ist es, dass die Spieler ein Maximum an Aktivitäten ausführen. Bei jenen Aktionen, die im Spiel als «gefährdet» betrachtet werden, können andere Spieler einem Gegner einen Zeckenbiss oder eine Lebensmittelvergiftung zufügen.

Die Spielenden finden sich in verschiedenen Situationen des Alltags wieder und lernen so das risikofreie Verhalten auf spielerische Art und Weise.

Figure 2. Exemples de cartes avec les maladies acquises lors de voyages en zones endémiques et transmises par les moustiques ou d'autres anthropodes; le jaune symbolise le soleil des vacances: (i) en haut: les cartes «activités sans risque» montrent certains conseils préventifs tels que de dormir sous une moustiquaire, de porter des habits à manches longues ou d’utiliser un répulsif. Les voyages dans le désert ou au Groenland sont également sans risque par rapport aux piqures de moustique. (ii) en bas de la figure: si le joueur prend un risque en voyageant dans une zone d’endémie (avions), l’un de ses adversaires peut lui infliger une maladie en jouant la carte illustrant l­es quatre microbes associés aux voyages. Le joueur ainsi attaqué devra tirer de la pile maladie une carte «maladie des voyages» caractérisée par le thermomètre sur fond jaune. Au verso de cette carte, il découvrira qu’il a été infecté par le Plasmodium falciparum en soirée via une piqûre de moustique et qu’il est malade pour trois semaines (3 jetons temps rouge). ­Notez que le dos des cartes KROBS et des cartes maladies possèdent des codes QR qui permettent de retrouver facilement la page correspondant à la mesure préventive ou aux microbes en question sur le site dédié www.krobs.ch.

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