Descripción de la técnica 2
Obtención de la muestra: 2 Cultivo: 3
Cosecha celular: 3
Preparación de las laminillas: 3 Tinción (bandeo cromosómico): 3
Reconocimiento cromosómico: 5
Referencias 8 Libros 8 Papers 9 Videos 9 Links de interés 9
La citogenética es el campo de la genética que estudia los cromosomas, su número, estructura, función y comportamiento Las técnicas para el estudio de la citogenética se clasifican en citogenética clásica o convencional que utiliza bandeo de cromatina y citogenética molecular donde se pueden diferenciar la hibridación in situ fluorescente (FISH), hibridación in situ fluorescente multicolor (M FISH o SKY) y la hibridación genómica comparada (CGH)
La Citogenética estudia las enfermedades y condiciones relacionadas con anormalidades numéricas y/o estructurales de los cromosomas La información brindada por el laboratorio citogenético es fundamental tanto para la genética clínica como para el estudio de los procesos oncohematológicos y algunos tumores sólidos Las alteraciones numéricas consisten en la ganancia y/o pérdida de uno o varios cromosomas y las anomalías estructurales, a los cambios en la estructura de uno o varios cromosomas (deleciones, duplicaciones, inversiones, traslocaciones, otras)
Son varios los métodos desarrollados para el análisis del cariotipo Habitualmente, este estudio se realiza sobre cromosomas en el estado de prometafase o metafase donde además de su estructura se puede evidenciar su número, sin embargo, las técnicas moleculares son aplicables también a cromosomas en interfase
Toda célula viva nucleada cultivable puede servir para realizar estudios citogenéticos convencionales (fibroblastos, médula ósea, líquido amniótico, biopsias, etc.), sin embargo, el método original y más sencillo de obtención de cromosomas parte de leucocitos Las técnicas de hibridación, además, pueden ser aplicadas en tejidos fijados como es el caso de muestras parafinadas fijadas en formol.
Los estudios cromosómicos, incluso hasta el presente, todavía plantean un desafío técnico particular en cada laboratorio Dado que los resultados de la preparación cromosómica son tan impredecibles que ninguna técnica garantiza que funcione de manera consistente Por lo tanto, cada laboratorio debe adoptar una ligera variación del protocolo operativo estándar, una estandarización in situ
La metodología parte de un cultivo celular en medios enriquecidos con posterior bloqueo del ciclo celular mediante la adición de sustancias citotóxicas y resuspensión celular con soluciones hipotónicas La fijación mediante solución alcohol ácida hace que la estructura cromosómica se mantenga íntegra para su extensión en laminilla, secado y desnaturalización como preparación final previa al bandeo o tinción y observación al microscopio.
Obtención de la muestra:
Pueden obtenerse metafases de células normales o neoplásicas de diferentes tipos de tejidos que incluyen: líquido amniótico, vellosidades coriónicas, sangre periférica, médula ósea, muestra de biopsia de ganglio linfático por aspiración con aguja fina, sección de ganglio linfático, tejido fresco tumoral y derrame pleural, peritoneal, ascítico, etc Las muestras deben recolectarse antes de cualquier tratamiento antibiótico o quimioterápico. El tiempo y las condiciones de envío de la muestra al laboratorio son cruciales, lo que puede afectar la viabilidad celular y su actividad proliferativa Las muestras no deben congelarse ni almacenarse a 4°C más de 24 h. Las muestras de sangre periférica (4 a 10 ml), médula ósea (1 a 2 ml) o derrames de cualquier cosa se recolectan en tubos heparinizados con litio. Las muestras de biopsia y cortes de ganglios linfáticos (0,5 cm × 0,5 cm) deben colocarse en medio de transporte con heparina (5 ml), en condiciones estériles La preparación celular y los cultivos celulares deben manipularse en condiciones estériles, utilizando preferiblemente una cabina de flujo laminar y una sala separada para el cultivo celular
La duración del cultivo depende del tipo de células y el propósito del estudio Por lo general, para el cariotipo convencional, la médula ósea se cultiva durante 24h, los linfocitos por 72h y las células de tejidos sólidos durante 3 a 5 días, el líquido amniótico durante 24 a 72h Todos los cultivos se deben incubar en incubadoras humedecidas a 37°C con 5% de CO2, sobre todo para tejidos sólidos
Para obtener un número suficiente de metafases para el análisis, se recomienda utilizar inhibidores del huso mitótico, como la colchicina o su análogo colcemid, que bloquea las células que se dividen entre metafase y anafase Se agrega antes de la recolección celular durante 1 a 1,5 h En general, el tiempo de incubación es proporcional al índice mitótico, la incubación prolongada da como resultado un acortamiento cromático El pretratamiento hipotónico promueve el ingreso de agua a la célula y ayuda a degradar los eritrocitos
La suspensión celular se deja caer por goteo sobre una placa de vidrio o laminilla utilizando una pipeta con el fin de obtener metafases espaciadas y cromosomas separados Se deja secar la preparación por uno o dos días y se procede al bandeo
El objetivo es teñir a los cromosomas en bandas pálidas y oscuras alternativamente, definiendo grandes regiones cromosómicas llamadas isocoros El bandeo se basa en la organización estructural del genoma, reflejando variaciones tales como composición de bases, grado de condensación y conformación de la cromatina, secuencias repetitivas y no transcritas, etc
Los patrones de bandas de cada cromosoma son prácticamente idénticos en todas las células de una especie y los expertos en citogenética tienen la capacidad de clasificarlos según sus características, número y posición de las bandas Se pueden llegar a apreciar hasta 850 bandas en un cromosoma dependiendo de la resolución microscópica alcanzada, las bandas principales se subdividen sucesivamente en subbandas y sub sub bandas
Para el bandeo de cromosomas se emplean diversos métodos de tinción del ADN con colorantes específicos de los cuales el bandeo G y R son los más utilizados:
a) Bandeo G: Es la técnica más utilizada Se basa en la desnaturalización controlada de las proteínas cromosómicas con tripsina y posterior tinción con Giemsa (de ahí su nombre). Cada par de cromosomas muestra patrones característicos de coloración, con bandas oscuras (G positivas o bandas G) y bandas claras (G negativas). Las bandas positivas poseen proteínas ricas en puentes disulfuro ( S S ) y las regiones negativas presentan proteínas ricas en grupos sulfidrilos ( SH). Se ha observado que la unión del Giemsa es más fuerte en regiones de ADN ricas en pares A T (55 60% del total) Esta técnica de bandeo es la mejor para visualizar tanto número como cambios en la estructura como translocaciones, deleciones, inversiones y amplificaciones
b) Bandeo R: Se basa en un tratamiento de los cromosomas con calor en un medio ácido (para desnaturalizar el DNA rico en AT), antes de la tinción con Giemsa Resultan así bandas oscuras (bandas R) que coinciden con las bandas G claras (el nombre deriva de este patrón reverso). Existe una variante de esta técnica utilizando olivomicina, un fluorocromo con afinidad por los pares GC. Así, las bandas R, al contrario de las G, contienen DNA rico en GC (50 60%), de baja condensación, que se replica en etapas tempranas de la fase S y es transcripcionalmente activo
El bandeo R puede no ser tan bueno para observar daños estructurales, pero sirve mucho para detectar daños terminales en los cromosomas aplicando calor intenso antes de la tinción (llamado también bandeo T telomérico)
c) Bandeo Q: Los cromosomas se tiñen con un compuesto fluorescente, como mostaza de quinacrina (hidrocloruro de quinacrina), 4’,6 diamidino 2 fenilindol (DAPI) o Hoechst 33258, los cuales se intercalan en el DNA bicatenario Es dependiente de microscopia de fluorescencia y de mayor infraestructura e inversión Aparece un patrón específico de bandas brillantes (bandas Q o Q positivas), que se corresponden casi exactamente con las bandas G
d) Métodos cromógenos especiales: utilizados para situaciones particulares Bandeo C: tiñe regiones heterocromáticas presentes en el brazo largo del cromosoma Y, y cerca de los centrómeros de los cromosomas 1, 9 y 16, es útil para definir las inversiones pericéntricas de estos cromosomas y estudiar el cromosoma Y Tinción NOR: para la región organizadora del nucléolo, que contiene los genes de los rRNA 18S y 28S
Bandeo de profase y prometafase, o de alta resolución, sobre cromosomas detenidos en una etapa temprana de la mitosis, con un estado relativamente descondensado Una resolución de 350 500 bandas corresponden a un cromosoma en metafase final y en profase se puede conseguir hasta 850 bandas
Resumen de la técnica de citogenética convencional con bandeo G Tomado de Herráez, Á (2012) Biología Molecular e Ingeniería Genética Elsevier Health Sciences, (p 91)
Los cromosomas están ordenados en un cariotipo basado en la posición del centrómero, patrón de bandas y longitud del brazo de los cromosomas Los números de cromosomas se designan de forma decreciente según su tamaño, a excepción del cromosoma 21 que es más pequeño que el 22. La ubicación del centrómero es una característica clave en la morfología cromosómica, así se dividen en cromosomas metacéntricos cuando la ubicación centromérica está cerca de la mitad del cromosoma con una proporción de brazo corto a brazo largo de 1: 1 a 1: 1 3; cromosomas submetacéntricos cuando el centrómero está más cerca de un extremo del cromosoma que el otro con una proporción de brazo corto a brazo largo de 1: 1 3 1: 7; y cromosomas acrocéntricos con una ubicación centromérica cerca del final del cromosoma con una relación de brazo corto a brazo largo> 1: 7, en estos cromosomas (a excepción del Y) existe también una constricción secundaria, que separa los satélites de la porción proximal del brazo corto. Las regiones y bandas se numeran consecutivamente a partir del centrómero hacia afuera a lo largo de cada brazo cromosómico Los símbolos p y q se utilizan para designar los brazos cortos y largos de cada cromosoma respectivamente. En conjunto, entre su tamaño y ubicación centromérica, los cromosomas se clasifican en 7 grupos (A,B,C,D,E,F,G)
Clasificación de los cromosomas humanos por ubicación centromérica, tamaño y grupo Tomado de Herráez, Á (2012) Biología Molecular e Ingeniería Genética Elsevier Health Sciences, (p 90)
Dependiendo de la aplicación del estudio citogenético, es importante analizar un amplio número de metafases (no menos de 20) ya que tanto la morfología cromosómica, así como la aparición de clonas minoritarias (mosaicismos) puede ser un desafío
Densidad esperada de células y metafases (magnificación 125x) Tomado de Wan, T S (2017) Cancer Cytogenetics Springer New York,(p 39)
Representación de un cariotipo masculino humano. Bandas G e Idiograma. Tomado de Wan, T. S. (2017). Cancer Cytogenetics Springer New York,(p 67)
Herráez, Á (2012) Biología Molecular e Ingeniería Genética Elsevier Health Sciences Capítulo 7
https://www elsevier com/books/texto ilustrado e interactivo de biologia molecular e ingenieria geneti ca/herraez sanchez/978 84 8086 647 7
Wan, T S (2017) Cancer Cytogenetics Springer New York Capítulos 1, 4, 6, 7
https://link springer com/book/10 1007%2F978 1 4939 6703 2
Bazaga, D A , Valentín, R M L , de León Rodríguez, A , & Sagrado, M G Influencia de las alteraciones citogenéticas en el crecimiento de los cultivos de líquidos amnióticos https://genotipia.com/wp content/uploads/2020/11/GMG AI010 Arrabal Bazaga 04112020web.pdf
Ribeiro, I P , Melo, J B , & Carreira, I M (2019) Cytogenetics and Cytogenomics Evaluation in Cancer International journal of molecular sciences, 20(19), 4711.
https://pdfs semanticscholar org/e80f/395cd8c7567394babbe2e91a7b716888a324 pdf
Nomenclatura de las anomalías cromosómicas estructurales 2018 Claudia Ipucha https://youtu be/XNJ3p2SiWz8
Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and Haematology: Información sobre anomalías citogenéticas en cáncer http://atlasgeneticsoncology org/